JP2003500003A - 低いアレルゲン性のタンパク質変異型 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、下記の工程を含んでなる、親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパク質変異型を選択する方法に関する：ランダムペプチド表示パッケージライブラリーを注目のタンパク質に対して発生させた抗体でスクリーニングし、抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列または抗体結合性ペプチドをコードするDNA配列を配列決定し、反応性ペプチド配列の配列アライメントによりタンパク質のエピトープパターンを同定し、親タンパク質の一次三次元構造上にエピトープパターンを局在化し、エピトープアミノ酸から5Å内に位置するアミノ酸を含むエピトープ領域を定め、新しいエピトープパターンを構築または現存するエピトープパターンを再生するアミノ酸置換を排除するため出現するエピトープデータベースを使用して、タンパク質機能を損傷しないで、親タンパク質をコードするDNA配列の突然変異を遺伝子操作することによって、局在化エピトープパターン、または親タンパク質のエピトープ領域を定めるアミノ酸を変化させ、突然変異したDNA配列を適当な宿主の中に導入し、前記宿主を培養し、タンパク質変異型を発現させ、そして対照として親タンパク質を使用してタンパク質変異型の免疫原性を評価する。本発明は、さらに、タンパク質変異型およびその使用、ならびに前記タンパク質変異型を製造する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパク質変異
型を選択する方法、タンパク質変異型の使用およびその使用、ならびにタンパク
質変異型を製造する方法に関する。

【０００２】 発明の背景 種々の産業、家庭および薬剤において使用するための、増加する数の酵素を包
含するタンパク質が工業的に製造されている。タンパク質であるために、タンパ
ク質変異型は人間および動物において、アレルギー応答において、免疫学的応答
を刺激するようである。

【０００３】 本発明の関係において、用語アレルギー応答、アレルギー、アレルゲン性のお
よびアレルゲン性はそれらの通常の定義に従い使用する、すなわち、抗原が低い
頻度でIgG₄であり、最も高い頻度でIgEである、免疫応答による反応およびこの
免疫応答による疾患を記載するために使用される。アレルギー疾患は、じんま疹
、枯草熱、ぜん息、およびアトピー性皮膚炎を包含する。アレルギー疾患はアナ
フィラキシーショックを進行することさえある。

【０００４】 したがって、罹病性個体におけるアレルギーの予防は大きい重要性を有する研
究領域である。応用に依存して、個体は吸入、皮膚および眼との直接的接触、ま
たは注射によって感作される。アレルギー応答の背後にある一般的メカニズムは
、感作期および症候期に分割される。感作期は、アレルゲンに対する個体の最初
の暴露を包含する。この事象は特異的Tリンパ球およびBリンパ球を活性化し、ア
レルゲン特異的免疫グロブリンE（IgE）抗体の産生に導く。これらのIgE抗体は
、症候期の開始において、究極的にアレルゲンの捕捉およびTリンパ球に対する
提示を促進する。この期は、同一であるか、あるいは類似する抗原に対する第2
暴露により開始される。特異的IgE抗体は、なかでも、マスト細胞および好塩基
球上の特異的IgEレセプターに結合し、同時に、アレルゲンを捕捉する。このプ
ロセスのポリクローナル特質はIgEレセプターの架橋およびクラスターを生じ、
引き続いてマスト細胞および好塩基球を活性化する。この活性化は、アレルギー
の症候期の初期ならびに後期の反応に関係する種々の化学的メディエイタの放出
を誘発する。

【０００５】 本発明の関係において、抗体は通常通りで表され、すなわち、免疫グロブリン
EはIgEおよびその他である。

【０００６】 ポリペプチドおよびタンパク質の免疫原性を減少する種々の試みがなされてき
ている。エピトープの小さい変化は抗体に対する結合に影響を与えることがある
ことが見出された。これはこのようなエピトープの重要性の低下、エピトープの
高いアフィニティーから低いアフィニティーへの変換、またはエピトープの喪失
、すなわち、エピトープが免疫原性応答を誘発するために十分に抗体に結合でき
なくさせること、さえももたらすことがある。

【０００７】 WO 92／10755において、より少ない免疫原性変異型が得られるようにタンパ
ク質を修飾する方法が記載されている。親酵素それ自体に比較して親酵素に対す
る抗体の結合を減少させるランダムに構築されたタンパク質変異型が、アレルゲ
ン性による動物モデルにおいての測定のために選択されている。最後に、免疫原
性の減少がエピトープの真の排除または抗体に対するアフィニティーの減少のた
めであるかどうかを評価する。このアプローチの欠点は「手探り法」特性であり
、この特性はこのプロセスを時間を要しかつ費用のかかるものとする。さらに、
エピトープについて情報は提供されておらず、これが意味するように、1つのタ
ンパク質について得られた情報は他の製造に適用することができない。なぜなら
、関係する制限された数の動物はエピトープパターンの同定を可能としないから
である。

【０００８】 発明の要約 本発明は、下記の工程を含んでなる、親タンパク質に比較して減少した免疫原
性を有するタンパク質変異型を選択する方法に関する： ランダムペプチド表示パッケージライブラリーを注目のタンパク質に対して発
生させた抗体でスクリーニングし、 抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列または抗体結合性ペプチドをコードするDN
A配列を配列決定し、 反応性ペプチド配列の配列アライメントによりエピトープパターンを同定し、 親タンパク質の一次および三次元構造上にエピトープパターンを局在化し、 エピトープアミノ酸から5Å内に位置するアミノ酸を含むエピトープ領域を定
め、 新しいエピトープパターンを構築または現存するエピトープパターンを再生す
るアミノ酸置換を排除するための出現するエピトープデータベースを使用して、
タンパク質機能を損傷しないで、親タンパク質をコードするDNA配列の突然変異
を遺伝子操作することによって、局在化エピトープパターン、または親タンパク
質のエピトープ領域を定めるアミノ酸を変化させ、 突然変異したDNA配列を適当な宿主の中に導入し、前記宿主を培養し、タンパ
ク質変異型を発現させ、そして 対照として親タンパク質を使用してタンパク質変異型の免疫原性を評価する。

【０００９】 本発明の第2面は、親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパ
ク質変異型である。タンパク質変異型のアミノ酸配列は、本発明の少なくとも1
つのエピトープパターンに関して親タンパク質のアミノ酸配列と異なり、タンパ
ク質変異型の免疫原性は親タンパク質の免疫原性と比較して減少している。好ま
しくは、タンパク質変異型の免疫原性は、親タンパク質の免疫原性よりも少なく
とも10分の1低く、好ましくは親タンパク質の免疫原性よりも少なくとも25分の1
低い。特にパーソナルケア製品において使用するタンパク質について、免疫原性
は親タンパク質の免疫原性よりも好ましくは100分の1低く、より好ましくは200
分の1低く、なおより好ましくは500分の1低い。さらに、食物製品および薬剤に
ついて、免疫原性は親タンパク質の免疫原性よりも好ましくは100分の1低い。通
常、免疫原性の最大50,000分の1の減少はタンパク質応用のすべての目的につい
て十分である。これに関して、IgE応答に集中して抗体応答を誘発させるタンパ
ク質の潜在的能力により、免疫原性を評価する。

【００１０】 前述の免疫原性の減少は、検討下の変異型と比較した、種々の投与量の親タン
パク質を使用して得られた反応速度において観測された差により定められる。こ
の研究において、エピトープがガイドするタンパク質操作の効果は、検討下のタ
ンパク質の単一投与量を使用する反応速度の研究により評価する。

【００１１】 タンパク質変異型の免疫原性を動物試験において測定し、ここで動物をタンパ
ク質変異型で免疫化し、免疫応答を測定する。本発明によれば、免疫原性は親タ
ンパク質の免疫原性に比較して少なくとも100分の1、好ましくは200分の1、好ま
しくは500分の1減少される。

【００１２】 しかしながら、本発明は、競合ELISAにおける性能が動物試験において測定さ
れる免疫原性応答に密接に相関することを証明した。

【００１３】 タンパク質の免疫原性の有効な減少を得るために、タンパク質変異型の免疫原
性は、親タンパク質の免疫原性を100％に設定したとき、競合ELISAにおける性能
により測定して、親タンパク質の免疫原性の少なくとも75％未満、好ましくは50
％未満に減少させなくてはならない。免疫原性が親タンパク質の免疫原性の50％
未満であるとき、タンパク質変異型は実際には非アレルゲン性である、すなわち
、IgE応答は動物試験において測定不可能である。

【００１４】 本発明のそれ以上の面は、上に定義したタンパク質変異型を含んでなる組成物
、ならびに産業的応用、例えば、パーソナルケア製品（例えば、シャンプー；セ
ッケン；皮膚、手および顔のローション；皮膚、手および顔のクリーム；毛髪染
料；歯磨き）、食物（例えば、パン焼き産業）、洗浄剤の処方物の製造、および
薬剤の製造のための組成物の使用である。

【００１５】 なお他の面は、上に定義したタンパク質変異型をコードするDNA分子である。 それ以上の面は、前述のDNA分子を含んでなるベクターならびに前記DNA分子を
含んでなる宿主細胞である。 他の面は、親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパク質変異
型を製造する方法である。

【００１６】 発明の詳細な説明 親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパク質変異型とは、1
またはそれ以上のアミノ酸が親タンパク質と異なり、これによりタンパク質変異
型の免疫原性が減少している、タンパク質変異型を意味する。免疫原性の減少は
、IgE応答を誘発するタンパク質変異型の能力を試験することによって確証する
ことができる。

【００１７】 本発明の関係において、タンパク質という用語は、オリゴペプチド、ポリペプ
チドならびにタンパク質それ自体を包含することを意図する。

【００１８】 表示パッケージは、例えば、細菌ウイルスに由来するものであることができる
。好ましい表示パッケージはファージ表示系であることができる。ファージ表示
系において、所望のアミノ酸配列をコードする配列を、ファージの表面上で表示
されたタンパク質をコードするファージ遺伝子の中に組込む。こうして、ファー
ジはハイブリッドタンパク質をつくり、その表面上に表示し、ここでハイブリッ
ドタンパク質は特異的ターゲット因子と相互作用することができる。各ファージ
が決定された長さの1つの特異的配列が与えられると、平均ファージ表示ライブ
ラリーは10⁸〜10¹²の異なるランダム配列を発現することができる。組込まれた
配列がエピトープであるとき、ターゲット因子は、例えば、エピトープ特異的抗
体であることができる。こうして、各々がそれらの1つのハイブリッドタンパク
質を発現する、多数のファージの塊りから特異的ファージを選択することが可能
である。

【００１９】 好ましい態様において、組込まれたペプチドの長いは9アミノ酸である。

【００２０】 表示パッケージと反応させるために使用する抗体は、同定されたエピトープが
IgEエピトープであること、すなわち、エピトープがIgEを誘導しかつIgEに結合
すること、を保証するために、IgE抗体であることが好ましい。好ましい態様に
おいて、抗体はポリクローナル抗体、必要に応じて単一特異性抗体である。

【００２１】 用語「単一特異性抗体」は、ある種のエピトープパターンに対するそれらの特
異性に従い単離されたポリクローナル抗体を意味する。このような単一特異性抗
体は1つのエピトープパターンに結合するだけであるが、最もしばしば多数の抗
体産生細胞により産生され、同様なエピトープパターン認識し、これによりポリ
クローナルである。

【００２２】 本発明の目的に対して、タンパク質のエピトープについてより広い知識を得る
ために、ポリクローナル抗体は好ましい。

【００２３】 さらに、抗体IgEは通常血清の中に非常に低い濃度で見出される。正常の血清I
gE抗体濃度は、12g／lの正常の血清IgG濃度に比較して、10^-3g／l以下である。
したがって、実際には、インタクトタンパク質上のすべての可能なエピトープパ
ターンを包含するモノクローナル抗体のライブラリーを得ることは非常に困難で
ある。しかしながら、このタンパク質に対して発生させた血清からIgE抗体をア
フィニティー精製した後、本発明に適当なポリクローナルまたはモノクローナル
IgE抗体を得ることが可能である。

【００２４】 一般に、抗体により認識されかつ結合されたタンパク質の部分、すなわち、エ
ピトープは線状または構造的であることができる。線状エピトープとは、エピト
ープのアミノ酸が一次タンパク質構造物の中に並んで配置されていることを意味
する。構造的エピトープは、タンパク質の三次元構造が形成される後まで、出現
しないことにおいて、線状エピトープと異なる。構造的エピトープは、タンパク
質の一次構造の様々な部分からのアミノ酸配列から構成されており、タンパク質
配列のフォルディングが二次および／または三次構造を形成した後、はじめて一
緒にされ、これにより連続的エピトープ表面を形成する。エピトープパターンま
たはエピトープモチーフとは、エピトープが線状または構造的であるかどうかに
かかわらず、タンパク質のエピトープ構築表面を意味する。エピトープのいくつ
か（高いアフィニティーのエピトープ）は、結合アフィニティーに関して、他の
エピトープ（低いアフィニティー）よりも重要である。

【００２５】 タンパク質は2以上のエピトープを有することができる。理論的モデルから、3
0,000ダルトンの分子サイズを有するタンパク質はその表面上に6つまでのエピト
ープ領域を担持することができると推定される。しかしながら、実際のエピトー
プの総数は非常に大きいにちがいない。例えば、5マーを最小エピトープサイズ
として考えると、9マーのアミノ酸配列は少なくとも5つの異なるモノクローナル
抗体への結合を提供する。

【００２６】 IgG1抗体結合性エピトープのいくつかはIgE抗体に結合せず、逆もまた同じで
あることが見出された。したがって、エピトープは特定の抗体クラスに対して多
少特異的であることがある。

【００２７】 IgEエピトープの80％以上は構造的エピトープであると考えられ、ここでエピ
トープはタンパク質の加熱、洗浄剤の使用または変性を意味する他の手法の間に
破壊されることがある。この百分率は異なるタンパク質について変化することが
ある。結局、IgEエピトープを同定するために、全タンパク質をカバーするオー
バーラップペプチドフラグメントを使用することができない。しかしながら、表
示パッケージにおいて小さいアミノ酸配列を使用することによって、発現された
オリゴペプチドの配列のランダム特性のために、線状エピトープならびに構造的
エピトープを同定できることを、本発明者らは発見した。

【００２８】 次いで表示パッケージ上に提示されかつ抗体により同定されたペプチドを配列
決定するか、あるいはそれらの配列を対応するDNA配列の翻訳により誘導する。
両方の配列は遺伝子工学の当業者に知られている技術により得られる。

【００２９】 抗体が結合したペプチドの配列を比較することによって、エピトープパターン
を同定する。引き続いて、同定されたパターンを親タンパク質の一次ならびに三
次元構造上に局在化し、究極的に問題のタンパク質上に局在化する。エピトープ
パターン内で、いくつかのアミノ酸は高度に保存的であり、アンカーアミノ酸と
呼ばれる。アンカーアミノ酸は、単一特異性抗体が結合したすべてのペプチドの
中で何度も認められ、エピトープパターンを定める。

【００３０】 表示パッケージにより提示されるペプチドのアミノ酸配列は、同定すべきエピ
トープの有意な部分を表すために十分に長いことが非常に重要である。本発明の
好ましい態様において、ペプチド表示パッケージライブラリーのペプチドは5〜2
5アミノ酸、好ましくは少なくとも8つのアミノ酸、例えば、9つのアミノ酸を有
するオリゴペプチドである。パッケージライブラリーのコンプレキシティーは、
すべての可能なエピトープを適当に表示するための表示パッケージの数であり、
同定すべきエピトープの推定された長さに基づいて、例えば、下記式により、計
算することができる： パッケージ数＝20ⁿ、ここでnはエピトープ中の残基の数である。

【００３１】 モデルの構造の構築に必要な典型的な作業は次の通りである：三次元構造が存
在する相同配列のアライメント、構造的に保存された領域（SCRs）の定義、SCRs
の座標の割り当て、可変領域を置換する構造データベース中の構造的フラグメン
ト／ループについての検索、これらの領域への座標の割り当て、およびエネルギ
ー最小化による構造的改善。既知の三次元構造に対して大きいインサート（≧3
残基）を含有する領域はモデル化することが非常に困難であることが知られてお
り、そして構造の予測は注意して考察しなくてはならない。

【００３２】 注目のポリペプチドの三次元構造、または既知の構造に対する相同性に基づい
た構造のモデルが得られると、この構造は後述する方法を実行するための本質的
前提条件として働く。

【００３３】 1またはそれ以上のエピトープが同定されたとき、親タンパク質をコードするD
NA配列の突然変異および／または遺伝子操作により親タンパク質の同定されたエ
ピトープパターンを変化させることによって、減少した免疫原性を示すタンパク
質変異型を産生することができる。

【００３４】 同定されたエピトープは、エピトープ領域の少なくとも1つのアミノ酸を置換
することによって変化させることができる。好ましい態様において、少なくとも
1つのアンカーアミノ酸を変化させる。この変化はしばしばサイズ、親水性、お
よび／または極性が異なるアミノ酸への置換、例えば、小さいアミノ酸／大きい
アミノ酸、親水性アミノ酸／疎水性アミノ酸、極性アミノ酸／非極性アミノ酸お
よび塩基性アミノ酸／酸性アミノ酸であることができる。

【００３５】 他の変化はエピトープの少なくとも1つのアミノ酸の付加または欠失、好まし
くはアンカーアミノ酸の欠失であることができる。さらに、エピトープパターン
はいくつかのアミノ酸の置換、および欠失／他のアミノ酸の付加により変化させ
ることができる。

【００３６】 エピトープ領域におけるアミノ酸への引き続く共有結合接合のための置換／挿 入 どのアミノ酸を置換および／または挿入するかは、原理的には、適用すべきカ
ップリング化学に依存する。共有結合生物接合体を製造する化学は、下記の文献
に記載されている：″Bioconjugate Techniques″、Hermanson、G. T.（1996
）、Academic Press，Inc．、これは引用することによって本明細書の一部とさ
れる。

【００３７】 活性化ポリマーをエピトープ領域中のアミノ酸に接合することが好ましい。

【００３８】 保存的置換はポリペプチド構造に対する置換の衝撃を制限することを保証する
ので、ポリペプチドを接合しなくてはならないとき、ポリペプチドの中に保存的
置換をつくることが好ましい。

【００３９】 追加のアミノ基を供する場合において、これはアルギニンをリシンに置換する
ことによって実施することができ、両方の残基は正に帯電しているが、遊離アミ
ノ基を有するリシンのみが結合させる基として適当である。

【００４０】 追加のカルボン酸基を供する場合において、保存的置換は、例えば、アスパラ
ギン／アスパラギン酸またはグルタミン／グルタミン酸の置換であることができ
る。これらの残基は互いにサイズおよび形状が類似するが、ただしカルボン酸基
は酸性残基上に存在する。

【００４１】 SH基を供する場合において、保存的置換はトレオニンまたはセリンをシステイ
ンに置換することによって実施することができる。

【００４２】 ポリマーの活性化 注目のポリペプチドと接合すべきポリマー分子が活性でない場合、ポリマー分
子を適当な技術により活性化しなくてはならない。本発明によれば、ポリマー分
子をポリペプチドにリンカーを介してカップリングさせることが考えられる。適
当なリンカーは当業者によく知られている。

【００４３】 ポリマー分子の活性化ならびにポリペプチドの接合の方法および化学は、文献
に相当に記載されている。ポリマー分子の活性化に普通に使用されている方法は
、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロ
ヒドリン、ジビニルスルホン、カーボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリク
ロロトリアジン、およびその他で官能基を活性化することを包含する（下記の文
献を参照のこと：R. F. Taylor、（1991）、″Protein immobilisation．Fun
damenntal and applications″、Marcel Dekker、N. Y.；S. S. Wong、（
1992）、″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″、CRC Press、Boca Raton；G. T. Hermanson他、（1993）、″Immobilized Affin
ity Ligand Techniques″、Academic Press、N. Y.）。これらの方法のいく
つかは不溶性ポリマーの活性化に関するが、また、可溶性ポリマーの活性化、例
えば、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、ハロゲン化スルホニル、ジビニル
スルホン、カーボジイミドおよびその他に適用可能である。ポリマー上のアミノ
、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリルで
ある官能基およびタンパク質上の選択された結合基は、i) ポリマーの活性化、i
i) 接合、およびiii) 残基活性基のブロッキングから成る、活性化および接合化
学を選択するとき考慮しなくてはならない。

【００４４】 下記において、多数の適当なポリマー活性化法を簡単に記載する。しかしなが
ら、他の方法もまた使用できることを理解すべきである。

【００４５】 ポリペプチドの遊離酸性基へのポリマー分子のカップリングは、ジイミド、例
えば、アミノ−PEGまたはヒドラジノ−PEG（Pollak他、（1976）、J. Am. Che
m. Soc.、98、289−291）またはジアゾアセテート／アミド（Wong他、（1992）
、″Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking″、CRC Press
）の助けにより実施することができる。

【００４６】 ヒドロキシ基へのポリマー分子のカップリングは、水中で実施しなくてはなら
ないので、一般に非常に困難である。通常、ヒドロキシル基との反応よりも加水
分解が優勢を占める。

【００４７】 遊離スルフヒドリル基へのポリマー分子のカップリングを、特別の基、例えば
、マレイミドまたはオルト−ピリジルジサルファイドと反応させることができる
。また、ビニルスルホン（米国特許第5,414,135号、（1995）、Snow他）はスル
フヒドリル基よりも好ましいが、記載した他の基のように選択的ではない。

【００４８】 ポリペプチド鎖中のアクセス可能なアルギニン残基は、2つの隣接カルボニル
基を含んでなる基によりターゲットとされることがある。

【００４９】 また、リシンのアミノ基に対して求電子的に活性化されたPEGをカップリング
させることを包含する技術は有用であることがある。アルコールについて多数の
有用な離脱基はアミン結合を生ずる。例えば、アルキルサルフェート、例えば、
トレシレート（Nilsson他、（1984）、Methods in Enzymology Vol. 104、J
acoby、W. B.、編、Academic Press：Orlando、pp. 56−66；Nilsson他、（1
987）、Methods in Enzymology Vol. 135、Mosbach、K.、編、Academic Pr
ess：Orlando、pp. 65−79；Scouten他、（1987）、Methods in Enzymology Vol. 135、Mosbach、K.、編、Academic Press：Orlando、1987、pp. 79−84
；Crossland他、（1971）、J. Am. Chem. Soc.、1971、93、pp. 4217−4219
）、メシレート（Harris、（1985）、上掲；Harris、（1984）、J. Polym. Sc
i. Polym. Chem.、編、22、pp. 341−352）、アリールスルホネート、例えば
、トシレート、およびパラ−ニトロベンゼンスルホネートを使用することができ
る。

【００５０】 有機スルホニルクロライド、例えば、トレシルクロライドは、多数のポリマー
、例えば、PEG中のヒドロキシ基をすぐれた離脱基（スルホネート）に効果的に
変換し、これらの離脱基は、ポリペプチド中の求核基、例えば、アミノ基と反応
するとき、ポリマーとポリペプチドとの間で安定な結合を形成することができる
。高い複合化収率に加えて、反応条件は一般的に温和（中性またはわずかにアル
キル性pH、変性を回避しかつ活性をほとんど、あるいはまったく損失しないため
に）であり、そしてポリペプチドに対する非破壊的要件を満足する。

【００５１】 トシレートはメシレートよりも反応性であるが、また、不安定であり、PEG、
ジオキサン、および硫酸に分解する（Zalipsky、（1995）、Bioconjgate Chem.
、6、150−165）。また、エポキシドはアミン結合を形成するために使用するこ
とができるが、前述の基よりも反応性が非常に低い。

【００５２】 PEGをホスゲンでクロロホルメートに変換すると、リシンに対するカルバメー
ト結合が形成する。このテーマは塩素をN−ヒドロキシスクシンイミド（米国特
許第5,122,614号、（1992）；Zalipsky、（1992）、Biotechnol. Applied Bio
chem.、15、pp. 100−114；Monfardini、（1995）、Bioconjgate Chem.、6、6
2−69）、イミダゾール（Allen他、（1991）、Carbohydr. Res.、213、pp. 30
9−319）、パラ−ニトロフェノール、DMAP（EP 632 082 A1、（1993）、Looz
e、Y.）およびその他で置換する変法においてある役割を演ずることができる。
通常、クロロホルメートを所望の離脱基と反応させることによって、誘導体を製
造する。

【００５３】 さらに、イソシアネートおよびイソチオシアネートを使用して、それぞれ、尿
素およびチオ尿素を生成することができる。

【００５４】 前述したのと同一の離脱基および環状イミドスロンを使用して、PEG酸からア
ミドを得ることができる（米国特許第5,349,001号、（1994）、Greenwald他）。
これらの化合物の反応性は非常に高いが、加水分解を加速することができる。

【００５５】 コハク酸無水物との反応から生成したPEGスクシネートを使用することもでき
る。これにより構成されたエステル基は、加水分解に対していっそう感受性であ
る複合体を生成する（米国特許第5,122,614号（1992）、Zalipsky）。この基はN
−ヒドロキシスクシンイミドで活性化することができる。 さらに、特別のリンカーを導入することができる。最も古いのは塩化シアヌル
である（Abuchowski他、（1977）、J. Biol. Chem.、252、3578−3581；米国
特許第4,179,337号、（1979）、Davis他；Shafer他、（1986）、J. Polym. Sc
i. Polym. Chem.、編、24、375−378）。

【００５６】 芳香族アミンへのPEGのカップリングおよび引き続くジアゾ化により、非常に
反応性のジアゾニウム塩が生成し、この塩を現場でペプチドと反応させることが
できる。また、PEGのアズラクトン誘導体の反応によりアミド結合を形成し（米
国特許第5,321,095号、（1994）、Greenwald、R. B.）こうして追加のアミド結
合を導入することができる。

【００５７】 いくつかのペプチドは多数のリシンを含まないので、2以上のPEGを同一リシン
に結合させることは好都合であることがある。これは、例えば、1,3−ジアミノ
−2−プロパノールを使用して実施することができる。

【００５８】 PEGをまた酵素のアミノ基にカルバメート結合で結合することができる（WO 9
5／11924、Greenwald他）。リシン残基をバックボーンとして使用することもで
きる。

【００５９】 実施例において使用するカップリング技術は、WO 90／13590（Enzon）に記載
されているN−スクシニミジルカーボネート接合技術である。

【００６０】 共有結合接合のための置換および／または挿入変法に対するポリマー分子の接
合。 動物モデルにおいて評価して、免疫応答が減少したポリペプチド接合体を提供
する置換および／または挿入のみが、本発明の概念の範囲内に入る。実行した1
またはそれ以上の突然変異は、この分野においてよく知られている技術、例えば
、部位特異的突然変異により実行することができる（例えば、下記の文献を参照
のこと：Sanger他（1989）、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、Col
d Spring Harbor、NY）。

【００６１】 ヌクレオチド置換の一般的記載は、例えば、Ford他、1991、Protein Express
ion and Purification、2、95−107。

【００６２】 遺伝子工学の当業者に知られている任意の適当な技術により、前述のDNA配列
を製造することができる。DNA配列を適当な宿主の中に導入し、宿主を培養し、
タンパク質変異型を発現させる。

【００６３】 エピトープを排除するためにタンパク質を操作することに関連するリスクは、
新しいエピトープをつくるか、あるいは現存するエピトープを複製させることに
ある。このリスクを減少するために、所定の位置において計画した突然変異を注
目のタンパク質の三次構造上に載せ、出現するアミノ酸配列をエピトープデータ
ベースに通す。本発明は、リスク突然変異をこの手順により同定し、可能な突然
変異の数／位置を減少させることができることを証明する。

【００６４】 B細胞およびT細胞のエピトープを取り囲むアミノ酸は抗体またはT細胞のレセ
プターをリガンドに結合させることができることは、十分に確立された事実であ
る。この可能性を予測するために、注目のタンパク質の三次元構造上にエピトー
プ領域を定めた。

【００６５】 1またはそれ以上のエピトープの変化は、特定のタンパク質の機能性を妨害ま
たは損なうことがないことが非常に重要である。したがって、変化はタンパク質
の二次構造を有意に変化させてはならない。コンピューターモデル化により、1
またはそれ以上のエピトープにおいてなされた変化がタンパク質の機能性を実質
的に妨害するかどうかを評価することが可能である。用語「機能性」とは、タン
パク質の正常機能、例えば、酵素活性、熱安定性、化学的安定性、およびグルコ
シル化を意味する。 本発明の好ましい態様において、2以上のアミノ酸残基を置換し、付加しまた
は欠失させ、これらのアミノ酸は異なるエピトープ領域の中に位置することが好
ましい。その場合において、特に小さい数の突然変異についてさえ、突然変異の
可能な組合わせの数は非常に大きくなるので、抗原性、免疫原性および／または
アレルゲン性が減少する間、タンパク質の機能性がどのように十分に維持される
かを推測的に評価することが困難であることがある。その場合において、各々が
導入された1またはそれ以上の変化したアミノ酸を有する多様化突然変異のライ
ブラリーを確立し、そしてすぐれた機能保持を示すと同時に抗原性のすぐれた減
少を示す変異型を選択することは好都合であろう。プロテアーゼの場合において
、分泌された変異型を酵素活性および抗原結合性についてアッセイすることによ
って、プロテアーゼを試験することができる（例えば、競合ELISA）（実験の節
において後述するように）。本発明のこれらの態様の範囲はまったくプロテアー
ゼに限定されず、プロテアーゼは単なる例として働くだけである。当業者に知ら
れているある範囲の技術により、多様化されたライブラリーを確立することがで
きる（Reetz MT、Jaeger KE、Biocatalysis−from Disocvery to Applicat
ion、Fessner WD編、Vol. 200、pp. 31−57（1999）；Stemmer、Nature、Vol
. 370、pp. 389−391、1994；ZhaoおよびArnold、Proc. Natl'l. Acad. Sc
i. USA、Vol. 94、pp. 7997−8000、1997；またはYano他、Proc. Natl'l.
Acad. Sci. USA、Vol. 95、pp. 5511−5515，1998）。より好ましい態様に
おいて、置換は下記の工程を含んでなる方法により発見される：1）ある範囲の
置換、付加、および／または欠失をいくつかのエピトープ領域を包含して列挙す
る、2）例えば、ランダム突然変異誘発により、アミノ酸配列中のこれらの変化
のランダム化サブセットをターゲット遺伝子の中に導入する、ライブラリーを設
計する、3）ライブラリーを発現させ、そして好ましい変異型を選択する。最も
好ましい態様において、この方法にスクリーニングの第1ラウンドからのヒット
のスクリーニングおよび／またはファミリーシャフリングの追加のラウンド（J. E. Ness他、Nature Biotechnology、Vol. 17、pp. 893−896、1999）およ
び／または遺伝的手段（例えば、WO 92／10755に開示されている手段）により
アレルゲン性を減少させる他の方法との組合わせを補充する。

【００６６】 本発明の他の目的は、親タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタン
パク質変異型であり、ここでタンパク質変異型の免疫原性が親タンパク質の免疫
原性に比較して抑制されるように、タンパク質変異型のアミノ酸配列は、親タン
パク質1またはそれ以上のアミノ酸に関して、親タンパク質のアミノ酸配列と異
なる。

【００６７】 減少した免疫原性は、動物試験においてIgE応答を誘発するタンパク質変異型
の能力を試験することによって確証することができる。試験動物は任意の適当な
動物であることができる。好ましくは、試験動物はラット、例えば、ブラウン・
ノールウェイ（Brown Norway）ラット、またはマウス、例えば、BaBallb／c、B
DF1およびCB6F1系統であることができる。

【００６８】 動物の試験は後述するように実施することができる。 試験動物において免疫原性を測定することに関係する方法を後述する。実施例
において、試験動物はブラウン・ノールウェイ・ラットである。

【００６９】 材料： タンパク質変異型の分子 ELISA試薬： セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ブタ抗ウサギIg（Dako、DK、P217、希
釈 1：1000）。 ラット抗マウスIgE（Serotec MCA419；希釈 1：100）。 マウス抗ラットIgE（Serotec MCA193；希釈 1：200）。 ビオチン標識化マウス抗ラットIgG1モノクローナル抗体（Zymed 03−9140；
希釈 1：1000）。 ビオチン標識化ラット抗マウスIgG1モノクローナル抗体（Serotec MCA336B；
希釈 1：2000）。 ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Kirkegard & Perr
y 14−30−00；希釈 1：1000）。

【００７０】 緩衝液および溶液： − PBS（pH7.2（1リットル）） NaCl 8.00g KCl 0.20g K₂HPO₄ 1.04g KH₂PO₄ 0.32g − 洗浄緩衝液 PBS、0.05％（v／v）Tween 20 − ブロッキング緩衝液 PBS、2％（w／v）スキムミルク粉末 − 希釈緩衝液 PBS、0.05％（v／v）Tween 20、0.5％（w／v）スキムミル
ク粉末 − クエン酸塩緩衝液（0.1M、pH5.0−5.2（1リットル）） クエン酸ナトリウム 20.0g クエン酸 6.30g − 停止溶液（DMG−緩衝液） − ホウ酸ナトリウム、ホウ砂（Sigma） − 3,3−ジメチルグルタル酸（Sigma） − CaCl₂（Sigma） − Tween 20：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Merck カタ
ログNo. 822184） − N−ヒドロキシスクシンイミド（Fluka art. 56480） − ホスゲン（Fluka art. 79380） − ラクトース（Merck 7656） − PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）（Sigma） − スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−パラニ
トロアニリド（Suc−AAPF−pNP）Sigma no. S−7388、Mw 624.6g／mol。 − mPEG（Fluka）

【００７１】 着色基質： OPD：o−フェニレン−ジアミン（Kementec カタログNo. 4260） 試験動物： 雌Balb／Cマウス（約20g）、（Bomholdtgaard Ry、デンマーク国、から購入
した）。 装置： XCEL II（Novex） ELISAリーダー（UVmax、Molecular Devices） HPLC（Waters） PELC（Pharmacia） Superdex−75カラム、Mono−Q、Mono S（Pharmacia、SW、から） SLT：Fotometer（SLT LabInstrumentsから） サイズ排除クロマトグラフ（Spherogel TSK−G2000 SW） サイズ排除クロマトグラフ（Superdex 200、Pharmacia、SW） アミコン・セル（Amicon Cell）

【００７２】 方法 Balb／Cマウスの皮下（SC）免疫化 分子のSC投与のために、0.05mlの分子の溶液を沈着させる。 試験動物は10匹のグループのBalb／Cマウスである。開始時の体重は20gより大
きい。

【００７３】 Balb／Cマウスの相対濃度を測定するELISA手順 3層サンドイッチELISAを使用して、特定のIgE血清抗体の相対濃度を測定する
。 1） ELISAプレートを10mgのラット抗マウスIgE緩衝液1（50μl／ウェル）で
被覆する。4℃において一夜インキュベートする。 2） プレートを空にし、ブロッキング緩衝液で室温において少なくとも30分
間ブロックする（200μl／ウェル）。おだやかに震盪する。プレートを洗浄緩衝
液で3回洗浄する。 3） マウス血清（50μl／ウェル）とインキュベートし、未希釈から出発し、
2倍希釈で続ける。いくつかのウェルを緩衝液4のみにする（ブランク）。室温に
おいて30分間インキュベートする。おだやかに震盪する。プレートを洗浄緩衝液
で3回洗浄する。 4） 酵素を希釈緩衝液で適当なタンパク質濃度に希釈する。50μl／ウェルを
室温において30分間インキュベートする。おだやかに震盪する。プレートを洗浄
緩衝液で3回洗浄する。 5） 結合した抗体を検出するために希釈緩衝液中で特異的ポリクローナル抗
酵素抗血清（pIg）を希釈する。50μl／ウェルを室温において30分間インキュベ
ートする。おだやかに震盪する。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄する。 6） 希釈緩衝液中でセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合化抗pIg抗体を希釈
する。50μl／ウェルを室温において30分間インキュベートする。おだやかに震
盪する。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄する。 7） 基質緩衝液中で0.6mgのODP／ml＋0.4μlのH₂O₂／mlを混合する。使用直
前に溶液を調製する。50μl／ウェルを10分間インキュベートする。 8） 反応を停止するために、50μlの停止溶液／ウェルを添加する。 9） 対照として620nmを使用して492nmにおいてプレートを読む。

【００７４】 分子量の測定 標準法に従い4〜20％のSDSポリアクリルアミドゲル（Novex）を使用して、タ
ンパク質を電気泳動により分離する。銀染色によりタンパク質を検出する。Nove
xからのMark−12（登録商標）の広い範囲の分子量標準の移動度に関して、分子
量を測定した。

【００７５】 プロテアーゼ活性 Suc−Ala−Ala−Pro−Phe−pNaの分析： プロテアーゼはペプチドとp−ニトロアニリンとの間の結合を切断して、405nm
において吸収する可視黄色を生成する。 緩衝液： 例えば、ブリットン（Britton）およびロビンソン（Robinson）緩
衝液 pH8.3 基質： 100mgのSuc−AAPF−pNaを1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）中に溶
解する。この溶液の100μlをブリットンおよびロビンソン緩衝液で10mlに希釈す
る。

【００７６】 分析： 基質およびプロテアーゼ溶液を混合し、時間およびABS_405nm／分の関数として
吸収を405nmにおいてモニターする。温度をコントロールすべきである（プロテ
アーゼに依存して20〜50℃）。これは試料中のプロテアーゼ活性の測度である。

【００７７】 親タンパク質は任意のタンパク質、例えば、任意の天然に存在するタンパク質
ならびにそれらの任意の変異型、必要に応じて問題のよりよい機能性を得るため
に変異型であることができる。

【００７８】 薬学上のポリペプチド 用語「薬学上のポリペプチド」は、ヒトおよび／または動物の体の循環系の中
に導入したとき生理学的に活性である、ペプチド、例えば、ペプチドホルモン、
タンパク質および／または酵素を包含するポリペプチドとして定義される。

【００７９】 薬学上のポリペプチドは、循環系の中に導入されるとき、潜在的に免疫原性で
ある。

【００８０】 本発明に従い意図される「薬学上のポリペプチド」の例は、インスリン、ACTH
、グルカゴン、ソマトスタチン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素性ホルモン
、ソマトメジン、エリトロポイエチン、黄体化ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモ
ン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、レラキシン、イ
ンターフェロン、トロンボポイエチン（TPO）およびプロラクチンを包含する。

【００８１】 しかしながら、タンパク質は好ましくは産業、家庭および／または薬剤、例え
ば、タンパク質はパーソナルケア製品（例えば、シャンプー；セッケン；皮膚、
手および顔のローション；皮膚、手および顔のクリーム；毛髪色素；歯磨き）、
食物（例えば、パン焼き産業）、洗浄剤および薬剤において使用するタンパク質
において使用される。 本発明の1つの態様において、タンパク質は、酵素、例えば、グルコシルヒド
ロラーゼ、カルボヒドラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フ
ィターゼ、多糖リアーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスグルタミナーゼおよ
びグルコースイソメラーゼ、特に下記の酵素である。

【００８２】 親プロテアーゼ 親プロテアーゼ（すなわち、International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E. C. 3.
4で分類される酵素）は、このグループの範囲内のプロテアーゼを包含する。 例は酵素分類（E. C.）番号で分類されるものから選択されたプロテアーゼを
包含する： 3.4.11（すなわち、いわゆるアミノペプチダーゼ）、例えば、3.4.11.5（プロ
リルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.9（X−プロアミノペプチダーゼ）、3.4.11.
10（細菌ロイシルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.12（好熱性アミノペプチダー
ゼ）、3.4.11.15（リシルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.17（トリプトファニル
アミノペプチダーゼ）、3.4.11.18（メチオニルアミノペプチダーゼ）； 3.4.21（すなわち、いわゆるセリンエンドペプチダーゼ）、例えば、3.4.21.1
（キモトリプシン）、3.4.21.4（トリプシン）、3.4.21.25（ククミシン）、3.4
.21.32（ブラキウリン）、3.4.21.48（セレビシン）および3.4.21.62（スブチリ
シン）； 3.4.22（すなわち、いわゆるシステインエンドペプチダーゼ）、例えば、3.4.
22.2（パパイン）、3.4.22.3（フィカイン）、3.4.22.6（キモパパイン）、3.4.
22.7（アスクレパイン）、3.4.22.14（アクチニダイン）、3.4.22.30（カリカイ
ン）および3.4.22.31（アナナイン）； 3.4.23（すなわち、いわゆるアスパラギン酸エンドペプチダーゼ）、例えば、
3.4.23.1（ペプシンA）、3.4.23.18（アスペルギロペプシンI）、3.4.23.20（ペ
ニシロペプシン）および3.4.23.25（サッカロペプシン）；および 3.4.24（すなわち、いわゆるメタロエンドペプチダーゼ）、例えば、3.4.24.2
8（バシロリシン）。

【００８３】 関係するスブチリシンの例は、スブチリシンBPN'、スブチリシンアミロサッカ
リチカス、スブチリシン168、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチ
リシンカルスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン309、スブチリシン147、テ
ルミターゼ、アクアリシン、バシルスPB92プロテアーゼ、プロテイナーゼK、プ
ロテアーゼTW7、およびプロテアーゼTW3を包含する。

【００８４】 このような容易に入手可能な商用プロテアーゼの特定の例は、Esperase（登録
商標）、Alcalqse（登録商標）、Neutrase（登録商標）、Dyrazym（登録商標）
、Savinase（登録商標）、Pyrase（登録商標）、膵臓トリプシンNOVO（PTN）、B
io−Feed（商標）Pro、Clear−Lens Proを包含する（すべての酵素はNovo Nor
disk A／Sから入手可能である）。

【００８５】 他の商用プロテアーゼの例は、Maxtase（登録商標）、Maxacal（登録商標）、
Maxapem（登録商標）（Gist−Brocades N. V.から入手可能である）、Opticle
an（登録商標）（Solvay et Cieから入手可能である）およびPurafect（登録
商標）（Genencor Internationalから入手可能である）を包含する。

【００８６】 また、プロテアーゼ変異型は親プロテアーゼとして意図されることを理解すべ
きである。このようなプロテアーゼ変異型の例は下記の文献に開示されている：
EP 130,756（Genentech）、EP 214,435（Henkel）、WO 87／04461（Amgen）
、WO 87／05050（Genex）、EP 251,446 （Genencor）、EP 260,105 （Gene
ncor）、Thomas他、（1985）、Nature、318、pp. 375−376、Thomas他、（1987
）、J. Mol. Biol.、193、pp. 803−813、Russel他、（1987）、Nature、328
、pp. 496−500、WO 88/08028（Genex）、WO 88／08033（Amgen）、WO 89／
06279（Novo Nordisk A／S）、WO 91／00345（Novo Nordisk A／S）、EP
525,610（Solvay）およびWO 94／02618（Gist−Brocades N. V.）。

【００８７】 プロテアーゼの活性は、下記の文献に記載されているように、測定することが
できる：″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984、Verlag Chemi
e、Weinheim、Vol. 5。

【００８８】 親リパーゼ 親リパーゼ（すなわち、International Union of Biochemistry and Mol
ecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E. C. 3.1.1
で分類される酵素）は、このグループの範囲内のリパーゼを包含する。

【００８９】 例は酵素分類（E. C.）番号で分類されるものから選択されたリパーゼを包含
する： 3.1.1（すなわち、いわゆるカルボン酸エステルヒドロラーゼ）、例えば、（3
.1.1.3）トリアシルグリセロールリパーゼ、（3.1.1.4.）ホスホルリパーゼA₂。 リパーゼの例は、下記の微生物に由来するリパーゼを包含する。示した特許刊
行物は引用することによって本明細書の一部とされる。： フミコラ（Humicola）、例えば、フミコラ・ブレビスポラ（H. brevispora）
、フミコラ・ラヌギニノサ（H. lanuginosa）、フミコラ・ブレビス（H. brev
is）var. thermoideaおよびフミコラ・インソレンス（H. insolens）（米国特
許第4,810,414号）。 シュードモナス（Pseudomonas）、例えば、シュードモナス・フラギ（Ps. fr
agi）、シュードモナス・スタッツエリ（Ps. stutzeri）、シュードモナス・セ
パシア（Ps. cepacia）およびシュードモナス・フルオレセンス（Ps. fluores
cens）（WO 89／04361）、またはシュードモナス・プランタリイ（Ps. planta
rii）またはシュードモナス・グラジオリ（Ps. gladioli）（米国特許第4,950,
417号（Solvay enzymes））またはシュードモナス・アルカリゲネス（Ps. alc
aligenes）およびシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ps. pseudoalcal
igenes）（EP 218,272）またはシュードモナス・メンドシナ（Ps. mendocina
）（WO 88／09367；米国特許第5,389,536号）。

【００９０】 フザリウム（Fusarium）、例えば、フザリウム・オキシスポラム（F. oxyspo
rum）（EP 130,064）またはフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pi
si）（WO 90／09446）。 ムコル（Mucor）（また、Rhizomucorと呼ばれる），例えば、ムコル・ミエヘ
イ（M. miehei）（EP 238,023）。 クロモバクテリウム（Chromobacterium）（特にC. viscosum）。 アスペルギルス（Aspergillus）（特にA. niger）。

【００９１】 カンジダ（Candida）、例えば、カンジダ・シリンドラセ（C. cylindracea）
（また、C. rugosaと呼ばれる）またはカンジダ・アンタルクチカ（C. antarc
tica）（WO 88／02775）またはカンジダ・アンタルクチカ（C. antarctica）
リパーゼAまたはB（WO 94／01541およびWO 89／02916）。 ゲオトリクム（Geotricum）、例えば、ゲオトリクム・カンジヅム（G. candi
dum）（Schimada他、（1989）、J. Biochem.、106、383−388）。 ペニシリウム（Penicillium）、例えば、ペニシリウム・カメムベルチイ（P. camembertii）（Yamaguchi他、（1991）、Gene、103、61−67）。 リゾプス(Rhizopus)、例えば、リゾプス・デレマル（R. delemar）（Hass他
、（1991）、Gene、109、107−113）またはリゾプス・ニベウス（R. niveus）
（Kugimiya他、（1992）Biosci. Biotech. Biochem.、56、716−719）または
リゾプス・オリゼ（R. oryzae）。

【００９２】 バシラス（Bacillus）、例えば、枯草菌（B. subtilis）（Dartois他、（199
3）Biochimica et Biophysica Acta、1131、253−260）またはバシラス・ス
テアロサーモフィラス（B. stearothermophilus）（JP 64／7744992）または
バシラス・プミラス（B. pumilus）（WO 91／16422）。

【００９３】 容易に入手可能な商用リパーゼの特定の例は、Lipolase（登録商標）、Lipola
se（商標） Ultra、Lipozyme（登録商標）、Platase（登録商標）、Novozym（
登録商標） 435、Lecitase（登録商標）を包含する（すべての酵素はNovo Nor
disk A／Sから入手可能である）。 他のリパーゼの例は次の通りである：Lumafast（商標）、シュードモナス・メ
ンドシアン（Ps. mendocian）（Genencor Int. Inc. から）；Lipomax（商
標）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ps. pseudoalcaligenes）リ
パーゼ（Gist Brocades／Genencor Int. Inc. から）；フザリウム・ソラニ
（Fusarium solani）リパーゼ（クチナーゼ）（Unileverから）；バシラス（Ba
cillus）種リパーゼ（Solvay enzymesから）。他のリパーゼは他の会社から入
手可能である。

【００９４】 また、リパーゼ変異型は親酵素として意図されることを理解すべきである。こ
のような変異型の例は、例えば、WO 93／01285およびWO 95／22615に記載され
ている。

【００９５】 リパーゼの活性は、下記の文献に記載されているように、測定することができ
る：″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984、Verlag Chemie、W
einheim、Vol. 4またはAF 95／5 GB（Novo Nordisk A／Sからの報告書から
入手可能である）。

【００９６】 親オキシドレダクターゼ 親オキシドレダクターゼ（すなわち、International Union of Biochemist
ry and Molecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E. C. 1で分類される酵素）は、このグループの範囲内のオキシドレダクターゼ
を包含する。 例は酵素分類（E. C.）番号で分類されるものから選択されたオキシドレダク
ターゼを包含する： グリセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ＿NAD＋＿（1.1.1.8）、グ
リセロール−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ＿NAD（P）⁺＿（1.1.1.94）、グ
リセロール−3−ホスフェート1−デヒドロゲナーゼ＿NADP＿（1.1.1.94）、グル
コースオキシダーゼ（1.1.3.4）、ヘキソースオキシダーゼ（1.1.3.5）、カテコ
ールオキシダーゼ（1.1.3.14）、ビリルビンオキシダーゼ（1.3.3.5）、アラニ
ンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.1）、グルタメートデヒドロゲナーゼ（1.4.1.2）、
グルタメートデヒドロゲナーゼ＿NAD（P）⁺＿（1.4.1.3）、グルタメートデヒド
ロゲナーゼ＿NADP⁺＿（1.4.1.4）、L−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.1.5）、
セリンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.7）、バリンデヒドロゲナーゼ＿NADP⁺＿（1.4.
1.8）、ロイシンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.9）、グリシンデヒドロゲナーゼ（1.
4.1.10）、L−アミノ酸オキシダーゼ（1.4.3.2）、D−アミノ酸オキシダーゼ（1
.4.3.3）、L−グルタミン酸塩オキシダーゼ（1.4.3.11）、タンパク質−リシン6
−オキシダーゼ（1.4.3.13）、L−リシンオキシダーゼ（1.4.3.14）、L−アスパ
ラギン酸塩オキシダーゼ（1.4.3.16）、D−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.99.
1）、タンパク質ジサルファイドレダクターゼ（1.6.4.4）、チオレドキシンレダ
クターゼ（1.6.4.5）、タンパク質ジサルファイドレダクターゼ（グルタチオン
）（1.8.4.2）、ラッカーゼ（1.10.3.2）、カタラーゼ（1.11.1.6）、ペルオキ
シダーゼ（1.11.1.7）、リポオキシゲナーゼ（1.13.11.12）、スーパーオキシド
ジスムターゼ（1.15.1.1）。

【００９７】 前記グルコースオキシダーゼはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger
）から誘導することができる。 前記ラッカーゼは、ポリポルス・ピンスチツス（Polyporus pinsitus）、ミ
セリオフトラ・テルモフィラ（Myceliophtora thermophila）、コプリヌス・シ
ネレウス（Coprinus cinereus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solan
i）、リゾクトニア・プラチコラ（Rhizoctonia praticola）、シタリジウム・
テルモフィルム（Scytalidium thermophilum）およびルス・ヴェルニシフェラ
（Rhus vernicifera）から誘導することができる。

【００９８】 ビリルビンオキシダーゼは、ミロテケシウム・ヴェルカリア（Myrothechecium verrucaria）から誘導することができる。 ペルオキシダーゼは、例えば、大豆、セイヨウワサビ（Hoseradis）またはコ
プリヌス・シネレウス（Coprinus cinereus）から誘導することができる。 タンパク質ジサルファイドレダクターゼは、DK特許出願No.768／93、265／94
および264／94（Novo Nordisk A／S）（これらは引用することによって本明細
書の一部とされる）に記載されている任意のものであることができ、下記のもの
を包含する：ウシ由来のタンパク質ジサルファイドレダクターゼ、アスペルギル
ス・オリゼ（Aspergillus oryzae）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergill
us niger）に由来するタンパク質ジサルファイドレダクターゼ、および大腸菌
（Escherichia coli）に由来するDsbAまたはDsbC。

【００９９】 容易に入手可能な商用オキシドレダクターゼの特定の例は、Gluzyme（商標）
（Novo Nordisk A／Sから入手可能な酵素）を包含する。しかしながら、他の
オキシドレダクターゼは他から入手可能である。また、オキシドレダクターゼの
変異型は親酵素として意図されることを理解すべきである。

【０１００】 オキシドレダクターゼの活性は、下記の文献に記載されているように、測定す
ることができる：″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984、Verla
g Chemie、Weinheim、Vol. 3。

【０１０１】 親カルボヒドラーゼ 親カルボヒドラーゼは、特に5および6員環構造の炭水化物鎖を破壊することが
できるすべての酵素（すなわち、International Union of Biochemistry an
d Molecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E. C.
3.2（グルコシダーゼ）で分類される酵素）として定義することができる。また
、炭水化物、例えば、6員環構造の炭水化物、例えば、D−グルコースを、例えば
、5員環構造の炭水化物、例えば、D−フルクトースに異性化することができる酵
素は、本発明による炭水化物のグループに包含される。

【０１０２】 例は酵素分類（E. C.）番号で分類されるものから選択されたカルボヒドラー
ゼを包含する： α−アミラーゼ（3.2.1.1）、β−アミラーゼ（3.2.1.2）、グリカン1,4−α
−グルコシダーゼ（3.2.1.3）、セルラーゼ（3.2.1.4）、エンド−1,3（4）−β
−グルカナーゼ（3.2.1.6）、エンド−1,3（4）−β−キシラナーゼ（3.2.1.8）
、デキシトラナーゼ（3.2.1.11）、キチナーゼ（3.2.1.14）、ポリガラクツロナ
ーゼ（3.2.1.15）、リゾチーム（3.2.1.17）、β−グルコシダーゼ（3.2.1.21）
、α−ガラクトシダーゼ（3.2.1.22）、β−ガラクトシダーゼ（3.2.1.23）、ア
ミロ−1,6−グルコシダーゼ（3.2.1.33）、キシラン1,4−β−キシロシダーゼ（
3.2.1.37）、グルカンエンド−1,3−β−D−グルコシダーゼ（3.2.1.39）、α−
デキストリンエンド−1,6−グルコシダーゼ（3.2.1.41）、スクロースα−グル
コシダーゼ（3.2.1.48）、グルカンエンド−1,3−α−グルコシダーゼ（3.2.1.5
9）、グルカン1,4−β−グルコシダーゼ（3.2.1.74）、グルカンエンド−1,6−
β−グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド−1,5−α−アラビノシダ
ーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ（3.2.1.108）、キトナナーゼ（3.2.1.132）およ
びキシロースイソメラーゼ（5.3.1.5）。

【０１０３】 関係するカルボヒドラーゼの例は下記のものを包含する：トリコデルマ・ハル
ジアナム（Trichoderma harzianum）に由来するα−1,3−グルカナーゼ；ペシ
ロミセス（Paecilomyces）に由来するα−1,6−グルカナーゼ；枯草菌（Bacillu
s subtilis）に由来するβ−グルカナーゼ；フミコラ・インソレンス（Humicol
a insolens）に由来するβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergi
llus niger）に由来するβ−グルカナーゼ；トリコデルマ（Trichoderma）に由
来するβ−グルカナーゼ；エルスコヴィア・キサンチネオリチカ（Oerskovia x
anthineolytica）に由来するβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspe
rgillus niger）に由来するエキソ−1,4−α−D−グルコシダーゼ（グルコアミ
ラーゼ）；枯草菌（Bacillus subtilis）に由来するα−アミラーゼ；バシラス
・アミロリクファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）に由来するα−ア
ミラーゼ；バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus acidopullulyticus
）に由来するα−アミラーゼ；アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae
）に由来するα−アミラーゼ；非病原性微生物に由来するα−アミラーゼ；アス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に由来するα−ガラクトシダーゼ；
フミコラ・インソレンス（Humicola insolens）に由来するペントサナーゼ、キ
シラナーゼ、セルロビアーゼ、セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ；トリコデルマ・
リーセイ（Trichoderma reesei）に由来するセルラーゼ；非病原性カビに由来
するセルラーゼ；アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に由来するペ
クチナーゼ、セルラーゼ、アラビナーゼ、ヘミ−セルラーゼ；ペニシリウム・リ
ラシヌム（Penicillium lilacinum）に由来するデキシトラナーゼ；非病原性カ
ビに由来するエンド−グルカナーゼ；バシラス・アシドプルリチカス（Bacillus acidopullulyticus）に由来するプルラナーゼ；クルイベロマイセス・フラギ
リス（Kluyveromyces fragilis）に由来するβ−ガラクトシダーゼ；トリコデ
ルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）に由来するキシラナーゼ。

【０１０４】 容易に入手可能な商用オキシドレダクターゼの特定の例は下記のものを包含す
る： Alpha-Gal（商標）、Bio-Feed（商標） Alpha、Bio-Feed（商標） Beta、Bio-
Feed（商標） Plus、Bio-Feed（商標） Plus、Novozyme(登録商標） 188、Carez
yme（登録商標）、Cellu-clast（登録商標）、Cellusoft（登録商標）、Ceremyl
（登録商標）、Citrozym（商標）、Denimax（商標）、Dezyme（商標）、Dextroz
yme（商標）、Finizym（登録商標）、Fungamyl（商標）、Gamanase（商標）、Gl
ucanex（登録商標）、Lac-tozym（登録商標）、Maltogenase（商標）、Pentopan
（商標）、Pectinex（商標）、Promozyme（登録商標）、Pulp-zyme（商標）、No
vamyl（商標）、Termamyl（登録商標）、AMG(Amyloglucosidase Nove)、Mal-tog
enase（登録商標）、Sweetzyme（登録商標）、Aquazym（登録商標）Natalass（
登録商標）（すべての酵素はNovo Nordisk A/Sから入手可能である）。他のオキ
シドレダクターゼは他の会社から入手可能である。 また、カルボヒドラーゼの変異型は親酵素として意図されることを理解すべき
である。

【０１０５】 カルボヒドラーゼの活性は、下記の文献に記載されているように、測定するこ
とができる：″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984、Verlag C
hemie、Weinheim、Vol. 4。

【０１０６】 親トランスフェラーゼ 親トランスフェラーゼ（すなわち、International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E.
C. 2で分類される酵素）は、このグループの範囲内のトランスフェラーゼを包
含する。 親トランスフェラーゼはトランスフェラーゼのサブグループ中の任意のトラン
スフェラーゼであることができる：1炭素基を転移するトランスフェラーゼ（E. C. 2.1）；アルデヒドまたは残基転移するトランスフェラーゼ（E. C. 2.2
）；アシルトランスフェラーゼ（E. C. 2.3）；グルコシルトランスフェラー
ゼ（E. C. 2.4）；メチル以外のアルキルまたはアリール基を転移するトラン
スフェラーゼ（E. C. 2.5）；窒素基を転移するトランスフェラーゼ（2.6）。

【０１０７】 好ましい態様において、親トランスフェラーゼはトランスグルタミナーゼ E. C. 2.3.2.13（タンパク質−グルタミンμ−グルタミルトランスフェラーゼ）
である。

【０１０８】 トランスグルタミナーゼは、ペプチド結合グルタミン残基のガンマ−カルボキ
シアミド基がアシルドナーである、アシル転移反応を触媒することができる酵素
である。種々の化合物中の第一級アミノ基はアシルアクセプターとして機能し、
その結果ペプチド結合グルタミン酸のモノ置換ガンマ−アミドを形成する。ペプ
チド鎖中のリシン残基のイプシロン−アミノ基がアシルアクセプターとして働く
とき、トランスフェラーゼは分子内または分子間ガンマ−グルタミル−イプシロ
ン−リシル架橋を形成する。

【０１０９】 トランスグルタミナーゼの例は、係属中のDK特許出願No.990／94（Novo Nord
isk A／S）に記載されている。 親トランスグルタミナーゼは、ヒト、動物（例えば、ウシ）または微生物由来
であることができる。 このような親トランスグルタミナーゼの例は次の通りである：動物由来のトラ
ンスグルタミナーゼ、FXIIIa；フィサルム・ポリセファルム（Physarum polyce
phalum）に由来する微生物のトランスグルタミナーゼ（Klein他、Journal of
Bacteriology、Vol. 174、pp. 2599−2605）；ストレプトマイセス（Streptom
yces）、例えば、ストレプトマイセス・ラベンヅレ（Streptomyces lavendulae
）、ストレプトマイセス・リジクス（Streptomyces lydicus）（旧Streptomyce
s libani）およびストレプトヴェルチシリウム（Streptoverticillium）種、例
えば、ストレプトヴェルチシリウム・モバレンセ（Streptoverticillium mobar
aense）、ストレプトヴェルチシリウム・シンナモネウム（Streptoverticillium cinnamoneum）、およびストレプトヴェルチシリウム・グリセオカルネウム（S
treptoverticillium griseocarneum）種に由来するトランスグルタミナーゼ（M
otoki他、米国特許第5,156,956号；Andou他、米国特許第5,252,469号；Kaempfer
他、Journal of General Microbiology、Vol. 137、pp.1831−1892；Ochi他
、International Journal of Systematic Bacteriology、Vol. 44、pp. 2
85−292；Andou他、米国特許第5,252,469号；Williams他、Journal of Genera
l Microbiology、Vol. 129、pp.1743−1813）。

【０１１０】 また、トランスフェラーゼの変異型は親酵素として意図されることを理解すべ
きである。 トランスフェラーゼの活性は、下記の文献に記載されているように、測定する
ことができる：″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984、Verlag Chemie、Weinheim、Vol. 1−10。

【０１１１】 親フィターゼ 親フィターゼは、International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）の推奨（1992）に従う酵素分類番号 E. C. 3.1.3で分類
される酵素のグループの中に包含される。 フィターゼは、フィテートをイノシトールおよび無機リンに変換する反応を触
媒する微生物により産生される。

【０１１２】 フィターゼを産生する微生物は下記のものを包含する：細菌、例えば、枯草菌
（Bacillus subtilis）、バチルス・ナット（B. natto）およびシュードモナ
ス（Pseudomonas）；酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharom
yces cerevisiae）；および真菌、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergil
lus niger）；アスペルギルス・フィクウム（Aspergillus ficuum）、アスペ
ルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼ（Aspe
rgillus oryzae）、アラビドプシス・テレウス（Arabidopsis terreis）また
はアスペルギルス・ニヅランス（Aspergillus nidulans）、および種々の他の
アスペルギルス（Aspergillus）種。

【０１１３】 親フィターゼの例は、酵素分類（E. C.）番号で分類されたものから選択され
るフィターゼを包含する：3−フィターゼ（3.1.3.8）および6−フィターゼ（3.1
.3.26）。 フィターゼの活性は、″Methods of Enzymatic Analysis″、第3版、1984
、Verlag Chemie、Weinheim、Vol. 1−10に記載されているようにして測定で
きるか、あるいはEP−A1−0 420 358、実施例2Aに記載されている方法に従い
測定することができる。

【０１１４】 リアーゼ 適当なリアーゼは多糖リアーゼを包含する：ペクテートリアーゼ（4.2.2.2）
およびペクチンリアーゼ（4.2.2.10）、例えば、WO 99／27083に開示されてい
るバシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）からのリアーゼ。

【０１１５】 本発明の他の面は、少なくとも1種の本発明のタンパク質（ポリペプチド）ま
たは酵素を含んでなる組成物である。組成物は、パーソナルケア製品、例えば、
シャンプー、セッケン棒状製品、皮膚ローション、皮膚クリーム、毛髪染料、練
り歯磨き、家庭用品、農業用化学物質、パーソナルケア製品、例えば、クリーニ
ング調製物、例えば、コンタクトレンズ、化粧品、トワレ製品、口および皮膚の
薬剤、繊維材料処理用組成物、食物製造、例えば、パン焼き、および飼料用組成
物およびその他において通常使用される、他のペプチド、タンパク質または酵素
および／または成分を含むことができる。

【０１１６】 前記タンパク質（ポリペプチド）／酵素の例は、プロテアーゼ、リパーゼ、オ
キシドレダクターゼ、カルボヒドラーゼ、トランスフェラーゼ、例えば、トラン
スグルタミナーゼ、フィターゼおよび／または抗菌性ポリペプチドの活性を示す
酵素を包含する。これらの酵素は、活性が減少した複合体として存在することが
できる。

【０１１７】 さらに、本発明のタンパク質は典型的には洗浄組成物において使用することが
できる。それは非ダスチング粒体、安定化された液体、または保護された酵素の
形態で洗浄組成物の中に添加することができる。非ダスチング粒体は、例えば、
米国特許第4,106,991号および米国特許第4,661,452号（両方はNovo Industries A／S）に開示されているように製造することができ、そして必要に応じてこの
分野において知られている方法によりコーティングすることができる。ワックス
状コーティング材料の例は次の通りである：ポリ（エチレンオキシド）製品（ポ
リエチレングリコール、PEG）、平均分子量1000〜20000；16〜50エチレンオキシ
ド単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；エトキシル化脂肪族アルコール
、ここでアルコールは12〜20個の炭素原子を含有しそして15〜80エチレンオキシ
ド単位が存在する；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジ−およびトリ−グリ
セリド。流動床技術による適用に適当な薄膜形成コーティング材料の例は、特許
GB 1483591に記載されている。液状酵素調製物は、例えば、ポリオール、例え
ば、プロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸またはホウ酸を確立さ
れた方法に従い添加することによって安定化することができる。他の酵素安定剤
はこの分野においてよく知られている。保護された酵素は、EP 238,216に開示
されている方法に従い製造することができる。

【０１１８】 洗剤組成物は、任意の好都合な形態、例えば、粉末、粒体、ペーストまたは液
体であることができる。液状洗剤は水性であり、典型的には70％までの水および
0〜30％の有機溶媒、または非水性溶媒を含有する。

【０１１９】 洗剤組成物は、1または2以上の界面活性剤を含んでなり、各界面活性剤はアニ
オン性、非イオン性、カチオン性、または双性イオン性であることができる。洗
剤は通常0〜50％のアニオン界面活性剤、例えば、線状アルキルベンゼンスルホ
ン酸塩（LAS）、α−オレフィンスルホン酸塩（AOS）、アルキル硫酸塩（脂肪族
アルコール硫酸塩）（AS）、アルコールエトキシ硫酸塩（AEOSまたはAES）、第
二級アルカンスルホン酸塩（SAS）、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、
アルキル−またはアルケニル−コハク酸、またはセッケンを含有する。また、そ
れは0〜40％の非イオン界面活性剤、例えば、アルコールエトキシレート（AEOま
たはAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキ
シレート、アルキルグルコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル
化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、またはポリヒド
ロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、WO 92／06154に記載されているように
）を含有することができる。

【０１２０】 洗剤組成物は、追加的に、1または2以上の他の酵素、例えば、プロテアーゼ、
アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、オキシダ
ーゼ、およびさらに抗菌性ポリペプチドを含むことができる。

【０１２１】 洗剤は、1〜65％の洗浄性ビルダーまたは錯化剤、例えば、ゼオライト、二リ
ン酸塩、三リン酸塩、ホスホン酸塩、クエン酸塩、ニトリロトリ酢酸（NTA）、
エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢酸（DTMPA）、
アルキル−またはアルケニルコハク酸、可溶性ケイ酸塩または層状ケイ酸塩（例
えば、HoechstからのSKS−6）を含有することができる。洗剤は、また、アンビ
ルトであることができる、すなわち、洗浄性ビルダーを本質的に含まないことが
できる。

【０１２２】 洗剤は1または2以上のポリマーを含むことができる。例はカルボキシメチルセ
ルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール
（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレート、例えば、
ポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタアク
リレート／アクリル酸コポリマーを含むことができる。

【０１２３】 洗剤は漂白系を含有することができる。漂白系は、過酸生成漂白活性化剤、例
えば、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）またはノナノイルオキシベンゼ
ンスルホネート（NOBS）と組合わせることができるH₂O₂源、例えば、過ホウ酸塩
または過炭酸塩を含んでなることができる。あるいは、漂白系は、例えば、アミ
ド、イミド、またはスルホン型の、過酸化物を含んでなることができる。

【０１２４】 本発明のポリペプチドを含んでなる本発明の洗剤組成物は、慣用の安定剤、例
えば、ポリオール、例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール、糖また
は糖アルコール、乳酸またはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステルを使
用して安定化することができ、そして組成物を、例えば、WO 92／19709およびW
O 92／19708に記載されているように、配合することができる。

【０１２５】 洗剤は、また、他の慣用の洗剤成分、例えば、布帛コンディショナー、例えば
、粘土、泡増強剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、色
素、殺菌剤、蛍光増白剤、または香料を含有することができる。 pH（使用濃度において水溶液中の測定する）は通常中性またはアルカリ性、例
えば、7〜11の範囲であろう。

【０１２６】 皿洗浄組成物 さらに、本発明による修飾された酵素は、また、皿洗浄洗剤において使用する
ことができる。 皿洗浄洗剤組成物は、アニオン、非イオン、カチオン、両性またはこれらの型
の混合物であることができる界面活性剤を含んでなる。洗剤は0〜90％の非イオ
ン界面活性剤、例えば、低い〜非発泡性のエトキシル化プロポキシル化直鎖状ア
ルコールを含有するであろう。

【０１２７】 洗剤組成物は、無機型および／または有機型の洗剤ビルダー塩を含有すること
ができる。洗浄ビルダーは、リン含有型および非リン含有型に細分することがで
きる。洗剤組成物は通常1〜90％の洗浄ビルダーを含有する。

【０１２８】 リン含有無機アルカリ性洗浄ビルダーの例は、存在するとき、水溶性塩、特に
アルカリ金属ピロリン酸塩、オルトリン酸塩、およびポリリン酸塩を包含する。
リン含有有機アルカリ性洗浄ビルダーの例は、存在するとき、水溶性ホスホン酸
塩を包含する。非リン含有無機ビルダーの例は、存在するとき、水溶性アルカリ
金属炭酸塩、ホウ酸塩およびケイ酸塩ならびに種々の型の水不溶性結晶質または
非晶質アルミノケイ酸塩を包含し、それらのうちのゼオライトは最もよく知られ
ている代表例である。

【０１２９】 適当な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウムおよび置換アンモニ
ウムのクエン酸塩、コハク酸塩、マロン酸塩、脂肪酸スルホン酸塩、カルボキシ
メトキシコハク酸塩、ポリ酢酸アンモニウム、カルボン酸塩、ポリカルボン酸塩
、アミノポリカルボン酸塩、ポリアセチルカルボン酸塩およびポリヒドロキシス
ルホン酸塩を包含する。

【０１３０】 他の適当な有機ビルダーは、ビルダー特性を有することが知られている高分子
量のポリマーおよびコポリマー、例えば、適当なポリアクリル酸、ポリマレイン
酸およびポリアクリル酸／ポリメタクリル酸コポリマーおよびそれらの塩を包含
する。

【０１３１】 皿洗浄洗剤組成物は、塩素／臭素型または酸素型の漂白剤を含有することがで
きる。無機塩素／臭素型漂白剤の例は、リチウム、ナトリウムまたはカルシウム
の次亜塩素酸塩および次亜臭素酸塩ならびに塩素化リン酸三ナトリウムである。
有機塩素／臭素型漂白剤の例は、複素環式N−ブロモおよびN−クロロイミド、例
えば、トリクロロイソシアヌル酸、トリブロモイソシアヌル酸、ジブロモイソシ
アヌル酸およびジクロロイソシアヌル酸、および水可溶化カチオン、例えば、カ
リウムおよびナトリウムとのそれらの塩である。ヒダントイン化合物もまた適当
である。

【０１３２】 酸素の漂白剤は、例えば、無機過酸塩、好ましくは漂白前駆体との無機過酸塩
の形態においてまたはペルオキシ酸化合物として、好ましい。適当なペルオキシ
漂白化合物の典型的な例は、四水和物および一水和物の両方の、アルカリ金属過
ホウ酸塩、アルカリ金属過炭酸塩、過ケイ酸塩および過リン酸塩である。好まし
い活性化剤物質はTAEDおよびグリセロールトリ酢酸塩である。

【０１３３】 本発明の皿洗浄洗剤組成物は、酵素のための慣用の安定剤、例えば、ポリオー
ル、例えば、プロピレングリコール、糖または糖アルコール、乳酸、ホウ酸、ま
たはホウ酸誘導体、例えば、芳香族ホウ酸エステルを使用して安定化することが
できる。

【０１３４】 本発明の皿洗浄洗剤組成物は、また、他の慣用の洗剤成分、例えば、脱凝集剤
、充填物質、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、金属イオン封鎖剤、汚れ再付
着防止剤、脱水剤、色素、殺菌剤、蛍光剤および香料を含有することができる。 最後に、本発明の酵素は、慣用の皿洗浄洗剤において、例えば、下記の特許刊
行物のいずれかに記載されている任意の洗剤中で使用することができる： EP 518719、EP 518720、EP 518721、EP 516553、EP 516554、EP 516555、GB 220
0132、DE 3741617、DE 3727911、DE 4212166、DE 4137470、DE 3833047、WO 93/
17089、DE 4205071、WO 52/09680、WO 93/18129、WO 93/04153、WO 92/06157、W
O 92/08777、EP 429124、WO 93/21299、US 5141664、EP 561452、EP 561446、GB 2234980、WO 93/03129、EP 481547、EP 530870、EP 533239、EP 554943、EP 34
6137、US 5112518、EP 318204、EP 318279、EP 271155、EP 271156、EP 346136
、GB 2228945、CA 2006687、WO 93/25651、EP 530635、EP 414197、US 5240632
。

【０１３５】 パーソナルケア用途 また、本発明のタンパク質はパーソナルケア用途と組合わせて重要性を有する
。

【０１３６】 プロテアーゼ プロテアーゼは、コンタクトレンズのクリーニングのためのよく知られている
活性成分である。プロテアーゼはレンズ上のタンパク質性汚れを加水分解し、こ
れによりそれを可溶性とする。タンパク質汚れの除去は着用の快適さのために必
須である。

【０１３７】 プロテアーゼは、また、皮膚クリーニング製品において有効な成分であり、こ
こでプロテアーゼは死んだケラチン質皮膚細胞の上層を除去し、これにより皮膚
をより鮮やかにしかつ新鮮にする。 また、プロテアーゼは、特に義歯をクリーニングするための、口腔ケアー製品
において使用されるが、また、歯みがきにおいて使用される。 さらに、プロテアーゼはトイレ、バスおよびシャワーの製品、例えば、シャン
プー、コンディショナー、ローション、クリーム、セッケン棒状製品、トイレ製
品、および液状セッケンにおいて使用される。

【０１３８】 リパーゼ リパーゼは化粧品に使用するために活性成分として過剰の皮膚脂質を除去する
ための皮膚クリーニング製品および抗アクネ製品において、そしてバスおよびシ
ャワー製品、例えば、クリームおよびローションにおいて皮膚ケアーの活性成分
として適用することができる。 リパーゼは、また、毛髪表面から皮脂および他の脂肪物質を効果的に除去する
ためのクリーニング製品（例えば、シャンプー）において使用することができる
。また、リパーゼはコンタクトレンズをクリーニングする有効成分であり、ここ
でリパーゼはレンズ表面から脂質付着部を除去する。

【０１３９】 オキシドレダクターゼ パーソナルケア製品のための最も普通のオキシドレダクターゼは、オキシダー
ゼ（通常グルコースオキシダーゼ）および基質（例えば、グルコース）であり、
基質はH₂O₂の生成を保証し、次いでH₂O₂は、例えば、ペルオキシダーゼ（通常ラ
クトペルオキシダーゼ）によるSCN^-またはI^-の抗菌剤（SCNO^-酸化I₂）への酸化
を開始する。この酵素複合体は事実、例えば、乳および唾液から知られている。 それは口腔ケアー製品（口のすすぎ、歯みがき、チューインガム）において抗
菌系として商業的に利用されており、ここでそれをまたアミログルコシダーゼと
組合わせてグルコースを製造することができる。また、これらの系は保存のため
に化粧品において知られている。 オキシダーゼとペルオキシダーゼとの組合わせを含んでなる抗菌系は、コンタ
クトレンズのクリーニングにおいて知られている。 オキシドレダクターゼの他の応用は、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび
ラッカーゼを使用する酸化的毛髪染色である。 皮膚（および毛髪）の表面上に形成したフリーラジカルは、皮膚の老化プロセ
ス（毛髪の損傷）に関連することが知られている。フリーラジカルは、脂肪膜、
コラーゲンおよび細胞の破壊に導く連鎖反応を活性化する。フリーラジカル掃去
剤、例えば、スーパーオキシドジスムターゼを化粧品の中に添加することはよく
知られている（R. L. Goldemberg、DCI、Nov. 93，pp. 48−52）。 また、タンパク質ジサルファイドイソメラーゼ（PDI）もまたオキシドレダク
ターゼである。それは毛髪のウェービング（毛髪中のジサルファイド結合の還元
および再酸化）および損傷した毛髪の修復（ここで損傷は主として現存するジサ
ルファイド結合の還元である）のために利用することができる。

【０１４０】 カルボヒドラーゼ 歯の表面上に形成したプラークは主として多糖類から構成されている。多糖類
は歯および微生物の表面に粘着する。多糖類は主としてα−1,6結合グルコース
（デキストラン）およびα−1,3結合グルコース（ムタン）である。異なる型の
グルカナーゼ、例えば、ムタナーゼおよびデキストラナーゼの応用はプラークの
粘着性マトリックスの加水分解を促進し、機械的作用によるその除去を容易にす
る。 また、他の種類のバイオフィルム、例えば、水晶体ケースの中に形成したバイ
オフィルムはグルカナーゼの作用により除去可能である。

【０１４１】 食物および飼料 本発明による減少した免疫原性を有するそれ以上の複合酵素またはポリペプチ
ドは、食物および飼料の製造において好都合に使用することができる。

【０１４２】 プロテアーゼ コムギ粉中のグルテンは、ベーキングした食物において使用すべき穀粉の能力
に関係する必須成分である。タンパク質分解酵素は時にはドウのグルテン相を変
性するために必要であり、例えば、硬質コムギ粉をプロテアーゼで軟化すること
ができる。 Neutrase（登録商標）は商業的に入手可能な中性メタロプロテアーゼであり、
均一なドウ品質およびパンのテキスチャーを保証するために、また香味を改良す
るために使用することができる。グルテンタンパク質は適度にまたはより広範に
タンパク質に分解され、ここでドウの過度の軟化を回避するために厳密なコント
ロールが必要である。 また、プロテアーゼは乳のタンパク質を変性するために使用される。 チーズを製造するとき、乳中のカゼインを凝固するために、プロテアーゼ、例
えば、レンネットまたはキモシンを使用することができる。 醸造産業において、非モルト化穀物を使用して醸造するために、そして窒素含
量をコントロールするために、プロテアーゼを使用する。 動物飼料製品において、動物の消化系を拡張するために、プロテアーゼを使用
する。

【０１４３】 リパーゼ パン焼き産業におけるリパーゼの応用はむしろ新しい。リパーゼを添加すると
、ドウの性質が改良され、そしてより大きい体積、パン粉構造の改良およびより
白いパン粉においてパン製造品質が改良される。観察される効果は、ドウ混合の
間において、リパーゼがグルテンとある脂質の断片との間の相互作用を変化させ
るメカニズムにより説明することができる。これにより、グルテンの網状構造が
改良される。 青色ローンチーズ（例えば、Danablue）、ある種のイタリア型チーズ、および
バター−脂肪を含有する他の酪農製品の香味の発生は、乳脂肪が遊離脂肪酸に分
解することに依存する。このような製品の香味を発生させるために、リパーゼを
使用することができる。 油および脂肪を製造する産業において、例えば、望ましくない副生物の量を最
小にし、エステル交換による脂肪を変性し、そしてエステルを合成するために、
リパーゼを使用する。

【０１４４】 オキシドレダクターゼ 食物および飼料の製造において、本発明による減少した免疫原性を有する他の
オキシドレダクターゼを好都合に使用することができる。 いくつかのオキシドレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、リポキシゲナー
ゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびそれらの組合わせをパン焼きに使用す
る。伝統的には、パン・菓子類製造業者はアスコルビン酸および臭素酸カリウム
を添加してグルテンを強化する。いくつかのオキシドレダクターゼを使用して、
グルテンタンパク質中の遊離スルフヒドリル単位を酸化してドウ系中の臭素酸塩
を置換することができる。これにより、ジサルファイド結合が形成し、より大き
い耐性を有する、より強い、より弾性のドウが生ずる。 Gluzyme（商標）（Novo Nordisk A／S）は、臭素酸塩を置換するために使用
できるカタラーゼ活性を有する、グルコースオキシダーゼ調製物である。ドウの
強化は、機械的衝撃に対するより大きい抵抗、よりすぐれたオーブン弾性および
より大きいローフ体積として測定される。

【０１４５】 カルボヒドラーゼ 穀粉は変化する含量のアミラーゼを有して、パン焼き品質の差に導く。穀粉を
標準化するために、アミラーゼの添加が必要である。アミラーゼおよびペントサ
ナーゼは一般に糖に酵母発酵を提供し、パン体積を改良し、退化を遅延させ、ス
テーリング速度およびペントサンガムから生ずる粘着性を低下させる。カルボヒ
ドラーゼの例は後述する。 製品におけるゴム質を引き起こさないで2またはそれ以上の日数にわたってパ
ンの貯蔵寿命を延長するために、ある種のモルト発生アミラーゼを使用すること
ができる。澱粉分子の非還元性末端から、低分子量の糖およびデキストリンを切
断することによって、糊化澱粉を選択的に変性する。退化が起こる程度が少ない
方法において、澱粉は変性される。仕上げられた製品をゴム質とする、中間的長
さのデキストリンをつくらないで、産生された低分子量糖は焼かれた製品の水保
持容量を改良する。酵素はパン焼きの間に不活性化されるので、それはラベル上
に表示する必要がない加工助剤であると考えることができる。Novamylの過剰配
合をほとんど排除することができる。

【０１４６】 パン粉にすぐれた、均一な構造をさらに与える真菌α−アミラーゼにより、パ
ン体積を改良することができる。前記α−アミラーゼは、マルトース、デキスト
リンおよびグルコースを産生する内酵素である。穀物およびいくつかの細菌のα
−アミラーゼは、澱粉の糊化温度以上の温度において不活性化されるので、コム
ギのドウに添加したとき、小さいパン体積およびパン内部を粘着性とする。Fung
amylは熱不安定性であるという利点を有し、糊化温度よりすぐ下の温度において
不活性化される。

【０１４７】 多数のペントサナーゼおよびヘミ−セルラーゼ活性を含有する酵素調製物は、
ドウの取扱いおよび安定性を改良することができ、そして新鮮さ、パン粉構造お
よびパンの体積を改良する。 穀粉中のペントサン画分を加水分解することによって、穀粉は水結合能力の大
部分を喪失し、次いで水は澱粉およびグルテンのために利用可能となる。グルテ
ンはいっそう柔軟、拡張可能となり、そして澱粉はいっそう生ずる糊化する。ペ
ントサナーゼは乳化剤と組み合わせて、またはその代わりに使用することができ
る。

【０１４８】 さらに、カルボヒドラーゼは澱粉からシロップを製造するために使用され、ソ
フトドリンク、甘い物、食用獣肉製品、酪農製品、パン製品、アイスクリーム、
赤ん坊食物、ジャムおよびその他において広く使用されている。

【０１４９】 澱粉の変換は通常3工程で実施される。まず、α−アミラーゼを使用して、澱
粉を液化する。主としてオリゴ糖およびデキストリンから成る、マルトデキスト
リンが得られる。 次いでこの混合物をアミログルコシダーゼで処理して、オリゴ糖およびデキス
トリンをグルコースに加水分解する。このようにして、より甘い製品が得られる
。高マルトースのシロップを望む場合、β−アミラーゼ単独またはそれとプルラ
ナーゼ（枝切り酵素）との組合わせを使用することができる。 グルコース混合物を、フルクトースへの異性化により、さらに甘くすることが
できる。このために、固定化されたグルコースイソメラーゼを使用することがで
きる。

【０１５０】 糖産業において、サトウモロコシのジュースの中に存在する澱粉の分解を加速
することが普通に実施されている。これにより、生糖中の澱粉含量は減少し、精
製における濾過は促進される。 さらに、生糖ジュースおよびシロップ中のデキストリンを破壊するために、デ
キストラナーゼが使用される。 アルコール産業において、マッシュを蒸留するとき澱粉を薄くするために、α
−アミラーゼが好都合に使用される。 醸造産業において、付加的液化のためにα−アミラーゼが使用される。 酪農産業において、ラクトースの吸収不良に悩まされる人のために、低ラクト
ースの乳を製造するとき、β−ガラクトシダーゼ（ラクターゼ）を使用する。 ラクターゼ処理された乳から香味化乳ドリンクを製造するとき、製品の甘味を
減少させないで、糖の添加を減少することができる。 練乳の製造において、ラクターゼ処理によりラクトースの結晶化を回避するこ
とができ、こうしてラクトース結晶中のカゼイン凝固により引き起こされる増粘
のリスクは減少される。 ラクターゼ処理した乳（または乳漿）からアイスクリームを製造するとき、ラ
クトース結晶は形成せず、欠陥のある、乳糖結晶を含んだアイスクリームは生じ
ない。 さらに、キシラナーゼは、WO 94／21785（Novo Nordisk A／S）に記載され
ているように、多数の食物／飼料産業に応用において使用されることが知られて
いる。 動物飼料産業において、α−アミラーゼは澱粉の消化安定性を改良するために
穀物含有飼料に添加される。

【０１５１】 抗菌特性 ある種の溶菌酵素は、例えば、食用獣肉包装産業において屠殺体を洗浄するた
めに使用することができる（米国特許第5,354,681号、Novo Industries A／S
、参照）。

【０１５２】 トランスフェラーゼ 本発明による減少した免疫原性を有するトランスグルタミナーゼは、食物およ
び飼料の製造において好都合に使用することができる。 トランスグルタミナーゼはタンパク質を架橋する能力を有する。 タンパク質を含有する水性相をゲル化するために、この性質を使用することが
できる。これはスプレッドを製造するとき使用することができる（DK特許出願No
.1071／84、Novo Nordisk A／S 参照）。 トランスグルタミナーゼは、例えば、改良された性質、例えば、改良された味
、食い込み、口の触感およびより大きい体積を有するケーキの製造において使用
されるコムギ粉を変性することによって、穀粉のベーキング品質を改良するため
に使用される（JP 1−110147参照）。 ペースト型を製造するために、食物材料は、例えば、アイスクリーム、トッピ
ング、凍結デザート、マヨネーズおよび低脂肪スプレッドのような食物における
脂肪代替物として使用される（WO 93／22930、Novo Nordisk A／S 参照）。 さらに乳および乳様製品からヨーグルト、ムース、チーズ、プディング、オレ
ンジジュースのためのゲルを製造し、厚切り肉製品を結合し、食物タンパク質の
味およびきめを改良することについて（WO 94／21120およびWO 94／21129、No
vo Nordisk A／S 参照）。

【０１５３】 フィターゼ 本発明のフィターゼは、食物、例えば、朝食の穀物、ケーキ、甘い物、飲料、
パンまたはスープおよびその他、および動物飼料において好都合に使用すること
ができる。 フィターゼは野菜タンパク質源の中に存在するフィチン酸塩／フィチン酸中の
結合したリンを利用するか、あるいはフィチン酸複合体中の結合した栄養的に重
要な材料を利用するために使用することができる。 飼料を無機リンを補充することを回避するために、微生物のフィターゼは単胃
動物の飼料に添加することができる（米国特許第3,297,548号参照）。 さらに、大豆の加工においてフィターゼを使用することができる。大豆荒粉は
抗栄養機能性のフィチン酸塩を高いレベルで含有することがある。このようなフ
ィチン酸塩は、大豆荒粉の中に存在する必須材料をキレート化するので、このタ
ンパク質源を赤ん坊の食物および魚類、仔ウシおよび他の非反芻動物のための飼
料において使用するために不適当とする（EP 0 420 358参照）。 また、パン焼きの目的で、フィターゼを使用することができる。よりすぐれた
品質を有するパンは、コムギ粉およびその他およびフィターゼを含有するドウの
分割片をベーキングすることによって製造することができる（JP−0−3076529−
A参照）。 麹カビにおけるような高いフィターゼ活性は、精妙な酒の製造に使用されるこ
とが知られている（JP−0−6070749−A参照）。

【０１５４】 繊維材料の応用 プロテアーゼ プロテアーゼは絹の脱ガムおよび砂の洗浄に使用される。

【０１５５】 リパーゼ リパーゼは、繊維材料の仕上げの間に疎水性エステルを含有する脂肪材料（例
えば、トリグリセリド）を除去するために使用される（例えば、WO 93／13256
、Novo Nordisk A／S 参照）。

【０１５６】 オキシドレダクターゼ 繊維材料の漂白クリーンアップにおいて、カタラーゼは過剰の過酸化水素を除
去する働きすることができる。

【０１５７】 カルボヒドラーゼ セルロース分解酵素は、デニム被服において布帛の色密度の局存化変動を提供
するために、広く使用されている（酵素は「ストーン・ウォッシュ（stone was
h）」を促進した）。 また、セルロース分解酵素はバイオポリッシングプロセスにおいて使用される
。バイオポリッシングは、布帛の湿潤性を喪失させずないで、風合いおよび外観
に関して布帛の品質を改良する、糸表面の特別の処理である。バイオポリッシン
グは、例えば、WO 93／20278に記載されている方法を適用することによって得
られる。

【０１５８】 繊維材料の製織の間に、糸はかなりの機械的歪に暴露される。破断を防止する
ために、糸は通常ゼラチン質物質（糊剤）でコーティングすることによって強化
される。最も普通の糊剤は天然または変性された形態の澱粉である。こうして布
帛から糊剤を除去、いわゆる糊抜き、した後にのみ、均一な、耐久性の仕上げを
得ることができる。澱粉または変性澱粉を含有する糊剤で糊付けされた布帛の糊
抜きは、デンプン分解酵素を使用して、促進することが好ましい。

【０１５９】 口腔および皮膚の薬剤 プロテアーゼ 高度に精製されたプロテアーゼ（例えば、トリプシンおよびキモトリプシン）
の異なる組合わせは、例えば、炎症、浮腫および損傷を防除するために、経口的
に摂取される薬剤および皮膚の薬剤において使用される。

【０１６０】 皮革の製造 トランスフェラーゼ トランスグルタミナーゼは、硬化剤として作用することによって皮革カゼイン
仕上げするために使用されることが知られている（WO 94／13839、Novo Nordi
sk 参照）。

【０１６１】 硬質表面のクリーニング 酪農製品、食用獣肉製品、海産製品、飲料およびその他を製造するために使用
される装置はしばしば複雑な表面を有するので、硬質表面のクリーニングは、例
えば、食物工業においてしばしば困難である。酵素を含んでなるゲルおよび泡の
形態の界面活性剤組成物の使用は、硬質表面のクリーニングを促進しかつ改良す
ることが示された。このような界面活性剤組成物に好都合に添加できる酵素は、
特にプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼおよびセルラーゼである。

【０１６２】 酵素を含んでなる、このような硬質表面クリーニング組成物は、また、輸送セ
クター、例えば、車の洗浄および一般的容器の洗浄に好都合に使用することがで
きる。

【０１６３】 最後に、本発明は、ポリペプチドを含んでなる製品において本発明のタンパク
質または本発明の組成物を使用することに関する。 最初に、本発明の複合体または組成物は、パーソナルケア製品、例えば、毛髪
のケアー製品および毛髪の処理製品に好都合に使用することができる。これは、
シャンプー、バルサム、毛髪コンディショナー、毛髪ウェービング組成物、毛髪
染色組成物、毛髪トニック、毛髪リキッド、毛髪クリーム、シャンプー、毛髪リ
ンス、毛髪スプレーのような製品を包含する。 口腔ケアー製品、例えば、歯みがき、口腔洗浄液、チューインガムがさらに考
えられる。 また、皮膚ケアー製品および化粧品、例えば、皮膚クリーム、皮膚乳状液、ク
レンジングクリーム、クレンジングローション、クレンジング乳状液、コールド
クリーム、カラムセッケン、滋養エッセンス、皮膚ローション、乳状ローション
、カラミン、ハンドクリーム、粉末状セッケン、透明セッケン、サンオイル、サ
ンスクリーン、シェービングフォーム、シェービングクリーム、ベイビーオイル
リップスティック、リップクリーム、クリーム状ファンデーション、フェースパ
ウダー、粉末状アイシャドー、化粧粉、ファンデーション、メーキャップ基剤、
エッセンスパウダー、白色化パウダーが考えられる。 また、コンタクトレンズ衛生製品について、本発明の複合体を好都合に使用す
ることができる。このような製品はコンタクトレンズのためのクローニングおよ
び消毒製品を包含する。 洗浄、例えば、洗濯粉、セッケン、セッケン棒状製品および液体セッケンの使
用が考えられる。

【０１６４】 さらに、本発明は、タンパク質変異型を合成し、宿主細胞中で発現させる方法
に関する。これは次のようにして達成される。ポリペプチドを発現することがで
きる宿主細胞を適当な培地中で培養して、ポリペプチドを発現させ、培地の中に
分泌させ、次いで培地からポリペプチドを単離する。宿主細胞はタンパク質に大
規模産生に適し、タンパク質を発現することができ、発現により形質転換するこ
とができる任意の細胞であることができる。

【０１６５】 宿主細胞は、上に定義したDNA構築物を含んでなり、必要に応じて細胞は上に
定義したDNA構築物を含んでなる発現で形質転換することができる。宿主細胞は
任意の適当な細胞、例えば、細菌細胞、菌類細胞または哺乳動物細胞、または植
物細胞から選択される。

【０１６６】 宿主細胞 本発明は、また、本発明の核酸配列を含んでなる組換え宿主細胞に関する。組
換え宿主細胞は、ポリペプチドの組換え産生において好都合に使用される。用語
「宿主細胞」は、複製の間に起こる突然変異のために親細胞と同一ではない、親
細胞の任意の子孫を包含する。

【０１６７】 細胞を好ましくは本発明の核酸配列を含んでなるベクターで形質転換し、次い
でベクターを宿主染色体の中に組込む。「形質転換」は、本発明の核酸配列を含
んでなるベクターを宿主細胞の中に導入し、こうしてベクターは染色体組込み体
としてまたは自己増殖性染色体外ベクターとして維持される。核酸配列は宿主細
胞の中に安定に維持される可能性が大きいので、組込みは一般に好都合であると
考えられる。宿主染色体の組込みは、前述したように相同的または非相同的組換
えにより起こすことができる。

【０１６８】 宿主細胞の選択は、大きい程度に、ポリペプチドをコードする遺伝子およびそ
の源に依存する。

【０１６９】 宿主細胞は、単細胞微生物、例えば、原核生物、または非単細胞微生物、例え
ば、真核生物であることができる。有用な単細胞の細胞は細菌細胞、例えば、グ
ラム陽性細菌であり、これらは下記のものを包含するが、これらに限定されない
：バシラス（Bacillus）細胞、例えば、バシラス・アルカロフィルス（Bacillus
alkalophilus）、バシラス・アミロリクファシエンス（Bacillus amylolique
faciens）、バシラス・ブレビス（Bacillus brebis）、バシラス・サーキュラ
ンス（Bacillus circulans）、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagula
ns）、バシラス・ロータス（Bacillus lautus）、バシラス・レンツス（Bacill
us lentus）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バ
シラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バシラス・ステアロサーモフ
ィラス（Bacillus stearothermophilus）、枯草菌（Bacillus subtilis）、お
よびバシラス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）；またはストレ
プトマイセス（Streptomyces）細胞、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス
（Streptomyces lividans）またはストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyc
es murinus）、またはグラム陰性細菌、例えば、大腸菌（E. coli）およびシ
ュードモナス（Pseudomonas）種。好ましい態様において、細菌細胞は、バシラ
ス・レンツス（Bacillus lentus）、バシラス・リヘニフォルミス（Bacillus
licheniformis）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearotherm
ophilus）または枯草菌（Bacillus subtilis）である。細菌宿主細胞の形質転
換は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、下記の文献を参照のこと：Ch
angおよびCohen、1979、Molecular General Genetics 168：111−115）によ
り、コンピテント細胞（例えば、下記の文献を参照のこと：YoungおよびSpizizi
n、1961、Journal of Bacteriology 81：823−829、またはDubnarおよびDavi
doff−Abelson、1971、Journal of Molecular Biology 56：209−221）を使
用して、エレクトロポレーション（例えば、下記の文献を参照のこと：Shigekaw
aおよびDower、1988、Biotechniques 6：742−751）により、または接合（例え
ば、下記の文献を参照のこと：KoehlerおよびThorne、1987、Journal of Bact
eriology 169：5771−5278）により実行することができる。

【０１７０】 宿主細胞は、真核生物、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または菌
類細胞であることができる。有用な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵
巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎（BHK）細胞、COS細胞、または
任意の数の他の永久分裂能化細胞系統（例えば、American Type Culture Col
lectionから入手可能である）を包含する。

【０１７１】 好ましい態様において、宿主細胞は菌類細胞である。「菌類」は、本明細書に
おいて使用するとき、子嚢菌門（Ascomycota）、担子菌門（Basidiomycota）、
ツボカビ門（Chytridiomycota）、および接合菌門（Zygomycota）（下記の文献
において定義されている：Hawksworth他、Ainsworth and Bisby's Dictionar
y of The Fungi、第8版、1995、CAB International、Universtiy Press、
英国ケンブリッジ）ならびに卵菌門（Oomycota）（下記の文献に引用されている
：Hawksworth他、1995、上掲、p. 171）およびすべての栄養胞子性菌類（Hawks
worth他、1995、上掲）を包含する。子嚢菌門（Ascomycota）の代表的グループ
は、例えば、下記のものを包含する：ニューロスポラ（Neurospora）、エウペニ
シリウム（Eupenicillium）（＝ペニシリウム（Penicillium））、エメリセラ（
Emericella）（＝アスペルギルス（Aspergillus））、エウロチウム（Eurotium
）（＝アスペルギルス（Aspergillus））、および前述の真正酵母。担子菌門（B
asidiomycota）の例は、キノコ、錆菌類、およびクロホ菌。ツボカビ門（Chytri
diomycota）の代表的グループは、例えば、下記のものを包含する：アロマイセ
ス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Blastocladiella）、ケロモマイセス（
Coelomomyces）、および水生菌類。卵菌門（Oomycota）の代表的グループは、例
えば、下記のものを包含する：サプロレグニオマイセタス（Saprolegniomycetou
s）水生菌類、例えば、ワタカビ（Achlya）。栄養胞子性菌類の例は下記のもの
を包含する：アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）、
カンジダ（Candida）、およびアルテルナリア（Alternaria）。接合菌門（Zygom
ycota）の代表的グループは、例えば、リゾプス(Rhizopus)およびケカビ（Mucor
）を包含する。

【０１７２】 好ましい態様において、菌類宿主細胞は酵母細胞である。「酵母」は、本明細
書において使用するとき、子嚢胞子発生酵母（エンドミセタレス（Endomycetale
s））、担子胞子発生酵母、および不完全菌類（Fungi Imperfecti）（ブラスト
ミセテス（Blastomycetes））に属する酵母を包含する。子嚢胞子発生酵母は、
ファミリー、スペルモフトラセエ（Spermohpthoraceae）およびサッカロミセタ
セエ（Saccharomycetaceae）に分割される。後者は、4つのサブファミリー、シ
ゾサッカロミコイデス（Schizosaccharomycoides）（例えば、シゾサッカロマイ
セス（Schizosaccharomyces）属）、ナドソニオイデエ（Nadsonioideae）、リポ
ミコイデエ（Lipomycoideae）、およびサッカロミコイデエ（Saccharomycoideae
）（例えば、ピキア（Pichia）属、クルイベロマイセス（Kluyveromyces）属お
よびサッカロマイセス（Saccharomyces）属から構成される。担子胞子発生酵母
は、レウコスポリジム（Leucosporidim）属、ロドスポリジウム（Rodosporidim
）属、スポリジオボルス（Sopridiobolus）属、フィロバシジウム（Filobasidiu
m）属、およびフィロバシジエラ（Filobasidella）属を包含する。不完全菌類（
Fungi Imperfecti）に属する酵母は、2つのファミリー、スポロボロミセタセエ
（Sporobolomycetaceae）（例えば、ソロボロマイセス（Sorobolomyces）および
ブレラ（Bullera））およびクリプトコッカセエ（Cryptococcaceae）（例えば、
カンジダ（Candida）属）に分割される。酵母の分類は将来において変化するこ
とがあるので、本発明の目的に対して、酵母は下記の文献に記載されているよう
に定義すべきである：Biology and Activities of Yeast（Skinner、F. A.
，Passmore、S. M.、およびDavenport、R. R.、編、Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9、1980。酵母の生物学および酵母遺伝学はこの分
野においてよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Biochemistry and Genetics of Yeast、Bacil、M.、Horecker、B. J.、およびStopani、
A. O. M.、編者、第2版、1987；The Yeast、Rose、A. H.、およびHarrison
、J. S.、編者、第2版、1987；およびThe Molecular Biology of the Yea
st Saccharomyces、Strathern他、編者、1981）。

【０１７３】 より好ましい態様において、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）種、クル
イベロマイセス（Kluyveromyces）種、サッカロマイセス（Saccharomyces）種、
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）種、ピキア（Pichia）種、また
はヤロウィア（Yarrowia）種の細胞である。

【０１７４】 他の好ましい態様において、酵母宿主細胞は次の通りである：サッカロミセス
・ウペ（Saccharomyces uvae）、サッカロマイセス・クルイベリ（Saccharomyc
es kluyveri）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe
）、サッカロミセス・ウバラム（Saccharomyces uvarum）、クルイベロマイセ
ス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenu
la polymorpha）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノ
リカ（Pichia metanolica）、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ヤロ
ウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ（Candida）種、カン
ジダ・ウチリス（Candida utilis）、カンジダ・カカオイ（Candida cacoi）
、ゲオトリクム（Geotrichum）種、ゲオトリクム・フェルメンタンス（Geotrich
um fermentans）、好ましくはサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）。

【０１７５】 他の態様において、タンパク質変異型は、他の菌類、例えば、アスペルギルス
（Aspergillus）種、またはフミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）ま
たはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）の中から選択される細胞
において製造することができる。

【０１７６】 好ましい態様において、菌類宿主細胞は糸状菌類細胞である。「糸状菌類」は
、再分割エウミコタ（Eumycota）および卵菌門（Oomycota）のすべての糸状形態
を包含する（Hawksworth他、1995、上掲、に記載されているように）。糸状菌類
は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複雑な多
糖類から構成された栄養菌糸体により特徴づけられる。栄養成長は菌糸の伸長に
より、そして炭素異化は無条件的に好気性である。対照的に、酵母、例えば、サ
ッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）により栄養成長は
単細胞の葉状体の出芽により、そして炭素異化は発酵的であることができる。

【０１７７】 より好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞は下記の種の細胞であるが、こ
れらに限定されない：アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス（Asperg
illus）、フザリウム（Fusarium）、フミコラ（Humicola）、ケカビ（Mucor）、
ミセリオフトラ（Myceliophthora）、ニューロスポラ（Neurospora）、ペニシリ
ウム（Penicillium）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocl
adium）、およびトリコデルマ（Trichoderma）またはそれらのテレオモルフまた
は同義種。

【０１７８】 さらに、好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞はアスペルギルス（Asperg
illus）細胞である。

【０１７９】 なお他の好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞は、アクレモニウム（Acre
monium）細胞、フザリウム（Fusarium）細胞、フミコラ（Humicola）細胞、ケカ
ビ（Mucor）細胞、ミセリオフトラ（Myceliophthora）細胞、ニューロスポラ（N
eurospora）細胞、ペニシリウム（Penicillium）細胞、チエラビア（Thielavia
）細胞、トリポクラジウム（Tolypocladium）細胞またはトリコデルマ（Trichod
erma）細胞である。

【０１８０】 より好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ
（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フェチヅス（Aspergillus foeti
dus）、アスペルギルス・ジャポニカス（Aspergillus japonicus）、アスペル
ギルス・ニガー（Aspergillus niger）またはアスペルギルス・オリゼ（Asperg
illus oryzae）の細胞である。

【０１８１】 他の好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞は区分ジスカラー（Discolor）
（また、フザリウム（Fusarium）として知られている）のフザリウム（Fusarium
）細胞である。例えば、糸状菌類親細胞は、フザリウム・バクテリジオイデス（
Fusarium bacteridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）
、フザリウム・クルックウェレンセ（Fusarium crookwellense）、フザリウム
・クルモルム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミヌム（Fusarium graminum）、フザリウ
ム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusa
rium negundi）、フザリウム・レチクラツム（Fusarium reticulatum）、フザ
リウム・ロセウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシヌム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロウム（Fusarium culmorum）、フザリ
ウム・スルフレウム（Fusarium sulphureum）またはフザリウム・トリコテシオ
イデス（Fusarium trichtheciodes）の細胞であることができる。

【０１８２】 なお他の好ましい態様において、糸状菌類親細胞は、区分エレガンス（Elegan
s）のフザリウム（Fusarium）株、例えば、フザリウム・オキシスポラム（Fusar
ium oxysporum）である。

【０１８３】 さらに、他の好ましい態様において、糸状菌類宿主細胞は、フミコラ・インソ
レンス（Humicola insolens）、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa
）細胞、ムコル・ミエヘイ（Mucor miehei）細胞、ミセリオフトラ・セルモフ
ィルム（Myceliophthora thermophilum）細胞、ニューロスポラ・クラッサ（Ne
urospora crassa）細胞、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Penicillium purpu
rogenum）細胞、チエラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）細胞であ
る。

【０１８４】 他の好ましい態様において、トリコデルマ（Trichoderma）細胞は、トリコデ
ルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギイ（
Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Trichoderma
longibrachiatum）、トリコデルマ・リーシエ（Trichoderma reesie）またはト
リコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞である。

【０１８５】 菌類細胞は、それ自体知られている方法において、プロトプラストの形成、プ
ロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を包含する方法により形質転換す
ることができる。アスペルギルス（Aspergillus）宿主細胞を形質転換する適当
な手順は、EP 238,023およびYelton他、1984、Proceeding of the National
Academy of Science USA 81：1470−1474に記載されている。フザリウム
（Fusarium）種を形質転換する適当な方法は、Malardier他、1989、Gene 78：1
47−156または同時継続米国出願No.08／269,448に記載されている。酵母は下記
の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる：Beckerおよ
びGurente、In Abelson、Ｊ． N. およびSimon、M. I.、編者、Guide to
Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology、Vol. 194、pp.182−187、Academic Press，Inc．、New York；Ito他、1983、Jour
nal of Bacteriology 153：163；およびHinnen他、1978、Proceeding of t
he National Academy of Science USA 75：1920。哺乳動物細胞は、Graha
mおよびVan der Eb（1978、Virology 52：546）のリン酸カルシウム沈澱法を
使用する直接的吸収により形質転換することができる。

【０１８６】 なお他の態様において、宿主は植物細胞、例えば、ジャガイモ細胞から選択さ
れるか、あるいは宿主は動物細胞、例えば、昆虫細胞、例えば、スポドプテラ・
フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）Sf9およびSf21卵巣細胞およびトリコ
デルマ・ニ（Trichoderma ni）卵からのハイ・ファイブ・ライン（Higy Five Line）、または哺乳動物細胞、例えば、サルCV1およびCOS細胞、ネズミC127繊
維芽細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）から選択される。

【０１８７】 発現ベクターは組換えDNAの手順および引き続く宿主生物中の首尾よい発現に
付すべき任意のベクターであることができる。細胞の中に導入されると、ベクタ
ーは自律的に機能することができる。複製起点を使用すると、プラスミドは宿主
細胞に対して独立に複製することができる。あるいは、それは宿主細胞ゲノムの
中に組込み、宿主細胞ゲノムと一緒に複製させることができる。

【０１８８】 本発明の他の態様は、前述したようにタンパク質変異型を選択するために、ラ
ンダムペプチド表示パッケージライブラリー、例えば、ファージ表示系を使用す
ることに関する。

【０１８９】 実施例 実施例1 エピトープパターン 親タンパク質に対して発生させたIgG抗体を使用するランダムペプチド表示パ
ッケージライブラリーのスクリーニングは、下記のエピトープパターンを明らか
にした。 （＊）でマークした配列は、Cys−Cys架橋の関係において存在することができ
る。 太字： アンカーアミノ酸 イタリック： 保存的突然変異 表1： 1） 親タンパク質ラッカーゼ： エピトープパターン

【表１】 2） 親タンパク質JE-1（NATALASE）（アミラーゼ）： エピトープパターン

【表２】

【０１９０】 3） 親タンパク質Lipoprime： エピトープパターン

【表３】

【０１９１】 4） 親タンパク質PD498（プロテアーゼ） エピトープパターン

【表４】

【０１９２】 5） 親タンパク質Carezyme(＊) エピトープパターン

【表５】

【０１９３】 6） 親タンパク質Savinase エピトープパターン

【表６】

【０１９４】 実施例2 ファージ表示ライブラリーおよび三次元解析を使用するエピトープマッピング エピトープ配列およびエピトープパターンの同定 膜タンパク質の一部分としてランダムヘキサ−、ノナ−またはドデカペプチド
を発現する高い多様性のライブラリー（10¹²）を精製された特異的ウサギIgG、
および精製されたラットおよびマウスIgG1およびIgE抗に結合する能力について
スクリーニングした。先行技術に従い、ファージライブラリーが得られた（WO
9215679、引用することによって本明細書の一部とされる、参照）。

【０１９５】 リン酸塩緩衝液（PBS）中に溶解した関係するタンパク質（例えば、プロテア
ーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、オキシドレダクターゼ）の皮下、皮内または気管
内注射により、抗体をそれぞれの動物において発生させた。ブタ抗ウサギIgG、
マウス抗ラットIgG1またはIgE、またはラット抗マウスIgG1またはIgE抗体を負荷
した常磁性イムノビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、
免疫化動物の血清から、反応性抗体を精製した。

【０１９６】 それぞれのファージライブラリーをIgG、IgG1およびIgE抗体を被覆したビーズ
とインキュベートした。これらの常磁性ビーズを磁場に暴露することによって、
ウサギIgG、またはラットまたはマウスIgG1またはIgE抗体に対するアフィニティ
ーを有するオリゴペプチドを発現するファージを収集した。温和な酸処理による
か、あるいは無傷の酵素で溶離することによって、収集したファージを固定化さ
れた抗体から溶離した。単離されたファージを当業者に知られているように増幅
した。あるいは、固定化されたファージを感染のために大腸菌（E. coli）と直
接的にインキュベートした。簡単に述べると、F因子陽性大腸菌（E. coli）（
例えば、XL−1 Blue、JM101、TG1）をヘルパー−ファージ（例えば、M13K07）
の存在下にM13由来ベクターで感染させ、典型的にはグルコースまたはIPTG、お
よび選択のために適当な抗生物質を含有する2×YT中でインキュベートした。最
後に、細胞を遠心により除去した。この事象サイクルをそれぞれの細胞上清につ
いて、最小2×および最大5×反復した。選択ラウンド2、3、4および5後、感染し
た大腸菌（E. coli）の画分を選択的2×YT寒天平板上でインキュベートし、出
現するファージの特異性を免疫学的に評価した。こうして、ファージをニトロセ
ルロース（NC）膜に移した。各平板について、2つのNC−レプリカを作った。1つ
のレプリカを選択抗体とインキュベートし、他方の レプリカを選択抗体および
抗体をコンペティターとして得るために使用した免疫原とインキュベートした。
免疫原の存在下に存在しないプラークは特異的であると考え、前述の手順に従っ
て増幅させた。

【０１９７】 ポリエチレングリコールの存在下に遠心により、特異的ファージ−クローンを
細胞上清から単離した。DNAを単離した。すべて標準手順に従い、オリゴペプチ
ドをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、DNA配列を決定した。対応するオリ
ゴペプチドのアミノ酸配列をDNA配列から推定した。

【０１９８】 こうして、前述のタンパク質特異的抗体に対する特異性を有する多数のペプチ
ド配列が得られた。これらの配列をデータベースにおいて収集し、配列アライニ
ングにより解析してエピトープパターンを得た。保存的交換（例えば、アスパラ
ギン酸塩／グルタミン酸塩、リシン／アルギニン、セリン／トレオニン）を1つ
として考えた。これが示すように、抗体をそれに対して発生させたタンパク質に
ついて、大部分の配列はそれに特異的であった。しかしながら、2回の選択ラウ
ンドのみを通過したファージから、いくつかの交差反応性配列が得られた。それ
でも、22のエピトープパターンが同定された。 エピトープパターンを下記表2に示す。

【０１９９】 表2： エピトープ−データベースからの抽出

【表７】

【０２００】 この実施例において、エピトープS R S Aは4つの異なる酵素上に見出され
た（ラッカーゼ、菌類のリパーゼおよび2つの細菌のプロテアーゼ）。同様、エ
ピトープL ＞ G R S Sもまた異なる親タンパク質上に見出された。これが
証明するように、異なる構造、機能および微生物由来のタンパク質は1またはそ
れ以上のエピトープパターンを共有する。

【０２０１】 実施例3 タンパク質の三次元構造上のそれぞれのエピトープパターンおよびエピトープ 領域の局在化 適当なソフトウェア（例えば、Swiss Pdb Viewer、WebLite Viewer）を使
用して、注目のタンパク質の三次元構造上で、各エピトープを評価した。

【０２０２】 第1工程において、同定されたエピトープを酵素の三次元構造と適合させた。
特異的エピトープパターンを定める少なくとも3つのアミノ酸の配列は、タンパ
ク質の三次元構造上に局在化された。保存的突然変異（例えば、アスパラギン酸
塩／グルタミン酸塩、リシン／アルギニン、セリン／トレオニン）は、ファージ
表示がこのような交換が起こったことを証明したパターンについての1つとして
考えた。タンパク質構造により提供される可能な配列の中で、配列が一次配列と
合致するか、あるいはアミノ酸の構造的配列と合致したもののみを保存し、ここ
で各アミノ酸は次のものから5Åの距離以内に位置した。往々にして、ソフトウ
ェアプログラムにより提供されるようなアミノ酸側鎖の移動度を、満足すべきこ
の基準について考慮しなくてはならなかった。この工程は、典型的には0〜7の可
能なエピトープ／タンパク質を与えた。

【０２０３】 第2に、残りのアンカーアミノ酸ならびに可変アミノ酸、すなわち、パターン
を定めないが、ファージライブラリーのスクリーニングにより同定された個々の
配列の中に存在したアミノ酸を、工程1において局在化された種々のアミノ酸配
列の回りの領域において評価した。次のものから5Åの距離以内に位置したアミ
ノ酸のみが含められた。この工程は、典型的には0〜3の可能な候補を与えた。

【０２０４】 最後に、アクセス可能性の基準を導入した。基準は、アンカーアミノ酸の少な
くとも半分が＞30％アクセス可能である表面を有するということであった。典型
的には、＜2エピトープが保存された。

【０２０５】 こうして、多数のエピトープ配列が同定され、種々のタンパク質の表面上に局
在化された。配列アライメントにより示唆されるように、構造の解析により、わ
ずかの例外を除外して、エピトープのほとんどは酵素特異的であることが確証さ
れた。全体的に、同定されたエピトープの大部分は少なくとも部分的に構造的で
あった。しかしながら、いくつかはタンパク質（例えば、アミラーゼ）は主とし
て一次配列のエピトープを発現した。典型的には、エピトープは酵素の非常に離
散した領域において局在化され、そして異なるエピトープはしばしばアミノ酸（
ホットスポット）を共有した。

【０２０６】 取り囲む結合性配列は、結合プロセスに活性的に関与しないで、リガンドの結
合に影響を及ぼすことができることは普通の知られている。この知識に基づいて
、エピトープ−抗体の相互作用に対して潜在的立体的作用を有するアミノ酸によ
りカバーされる領域は、同定されたエピトープの回りに定められた。実際的に、
5Åの距離以内に位置したすべてのアミノ酸を含めた。隠れたアミノ酸は取り囲
む構造物に対して作用を有することができるので、アクセス可能性の基準を含め
なかった。

【０２０７】 異なる酵素のそれぞれのエピトープおよびエピトープ領域を示す三次元構造を
、第1図に示す。

【０２０８】 実施例4 減少した抗原性または免疫原性を有する酵素変異型の製造、選択、および評価 当業者に知られている技術（例えば、部位特異的突然変異誘発、エラープロー
ンPCR）を使用して、ホットスポットまたはエピトープを突然変異させた。 下に示す実施例において、部位特異的突然変異誘発により変異型を作った。エ
ピトープデータベースにおいて集められた情報に従い新しいエピトープを構築す
るまたは現存するエピトープを複製するアミノ酸交換（実施例1参照）は、突然
変異誘発プロセスにおいて回避された。

【０２０９】 骨格酵素に対して発生させた抗体の結合の減少について、酵素変異型をスクリ
ーニングした。確立されたアッセイ（例えば、競合ELISA、凝集アッセイ）によ
り、この抗体の結合を評価した。

【０２１０】 減少した抗体結合能力を有する変異型を、動物の研究においてさらに評価した
。

【０２１１】 50μlの0.9％（w／v）のNaCl（対照グループ）、または10μgのタンパク質を
含有する50μlの0.9％（w／v）のNaClで、マウスを毎週、20週間皮下的に免疫化
した。第2回の各免疫化後1週に、血液試料（100μl）を眼から収集した。血液凝
固、および遠心により、血清を得た。 マウスまたはラットIgG1またはIgEに対して特異的なELISAを使用して、特異的
IgG1およびIgEレベルを測定した。適当な統計学的方法を使用して、データの組
の間に差を解析した。

【０２１２】 A. マウスにおいてIgG1および／またはIgE応答に対して作用を有する、エピ
トープを定めるアミノ酸の部位特異的突然変異誘発 エピトープ： A172／A169 R170 A194 G193 N261 パターン： A R ＞ R ＞ A ＞ N 抗体： IgG1＋IgE バックボーン： サビナーゼ（Savinase）

【０２１３】 変異型は突然変異R170Fを担持した。 競合IgE ELISAにおいて、この変異型は抗サビナーゼ抗体についての競合にお
いて有効性が低く、サビナーゼ骨格に比較して15％低い終点阻害を与えた。 マウスの研究において、サビナーゼ骨格に比較して、特異的IgEレベルの80％
の減少が明らかにされた（p＜0.01）。IgG1レベルは有意に影響を受けなかった
。

【０２１４】 エピトープ： S216 E219 Y220 パターン： E Y ＞ M 抗体： IgG1 バックボーン： リポプライム（Lipoprime） 変異型は突然変異S216Wを担持した。 競合IgG ELISAにおいて、この変異型はリポラーゼ抗体についての競合におい
て有効性が低く、酵素骨格に比較して38％の終点阻害の減少を与えた。 マウス
の研究において、リポラーゼ骨格に比較して、特異的IgGレベルの69％の減少が
明らかにされた（p＜0.05）。IgEレベルは有意に影響を受けなかった。

【０２１５】 B. それぞれ、エピトープデータベースにより予測される、エピトープの重複 、および新しいエピトープの形成の例を伴う、エピトープの部位特異的突然変異 誘発 エピトープ： T143 N173 N140 E136 L135 パターン： S／T N N ＞ E L 抗体： IgG1 バックボーン： サビナーゼ 変異型は突然変異E136Rを担持した。 競合IgG ELISAにおいて、この変異型はサビナーゼ抗体についての競合におい
て有効性が低く、サビナーゼ骨格に比較して38％の終点阻害の減少を与えた。 マウスの研究において、サビナーゼ骨格に比較して、特異的IgG1レベルの劇的
増加が明らかにされた（p＜0.01）。IgEレベルは有意に影響を受けなかった。

【０２１６】 突然変異E136Rは、PD498上で以前に同定された、R Y P R／KパターンのIgG
1エピトープを確立する。明らかなように、この新しいエピトープは現存するエ
ピトープよりもマウスにおいていっそう抗原性であった。サビナーゼ骨格上のサ
ビナーゼに無関係なエピトープの導入は、競合ELISAの研究と動物の研究との間
において観測された不一致を説明することができた。

【０２１７】 この実施例において、抗PD498抗体を使用するファージライブラリーのスクリ
ーニングからもっぱら誘導された情報を使用して（表2のR Y P R／Kエピトー
プパターンを同定するために）サビナーゼについての遺伝子操作の実験結果を予
測することができ、ここでE136R突然変異はサビナーゼ表面上にPD498−エピトー
プをつくり、このサビナーゼ変異型の免疫原性の増加を導いた。これが証明する
ように、同定されたエピトープパターンを使用して、エピトープパターンの同定
に使用した1またはそれ以上の親タンパク質と異なるタンパク質における置換の
免疫原性に対する作用を予測することができる。

【０２１８】 C. それぞれ、マウスにおけるIgG1およびIgE抗体レベルに対して示差的作用
、およびIgG結合に対する阻害作用を有する、エピトープ領域を定めるアミノ酸
の部位特異的突然変異誘発 エピトープ： A172／A169 R170 A194 G193 N261 パターン： A R ＞ R ＞ A ＞ N 抗体： IgG1＋IgE 骨格： サビナーゼ エピトープ領域： P131、S132、A133、L135、E136、V139、A151、A152、S153
、G161、S162、I165、S166、Y167、P168、Y171、N173、A174、A176、Q191、Y192
、G195、L196、R247、S259、T260、L262、Y263、G264。

【０２１９】 変異型は突然変異Y167Iにより位置Y167において異なっていた。

【０２２０】 競合IgE ELISAにおいて、この変異型は抗サビナーゼ抗体についての競合にお
いて有効性が低く、サビナーゼ骨格に比較して8％低いの終点阻害を与えた。

【０２２１】 マウスの研究において、サビナーゼ骨格に比較して、特異的IgEレベルの75％
の減少が明らかにされた（p＜0.01）。対照的に、IgG1レベルは劇的に増加した
（p＜0.01）。

【０２２２】 エピトープ： T143 N173 N140 E136 L135 パターン： S／T N N ＞ E L 抗体： IgG1 骨格： サビナーゼ エピトープ領域： V10A、I107、A108、L111、E112、G115、S132、A133、T134
、Q137、A138、V139、S141、A142、S144、R145、G146、V147、V149、Y167、P168
、Y171、A172、A174、M175、N243、R247。

【０２２３】 変異型No.1はエピトープ位置（N140D）において突然変異されたが、変異型No.
2はN140（N140D）において突然変異されが、また、エピトープ領域の位置（A172
D）において突然変異された。

【０２２４】 競合IgG ELISAにおいて、サビナーゼに比較して、この変異型No.1は抗サビナ
ーゼ抗体についての競合において有効性が低かった。この変異型は、そのバック
ボーンに比較して21％低いの終点阻害を与えた。

【０２２５】 変異型No.2は、サビナーゼに比較して60％低く、そして変異型No.1に比較して
40％低い終点阻害を生じた。

【０２２６】 実施例5 活性化されたビス−PEG−1000とのサビナーゼ変異型E136Kの接合 4.9mgのサビナーゼ変異型を、ほぼ2mlの反応体積において、50mMのホウ酸ナト
リウムpH9.5中で12mgのN−スクシニミジルカーボネート活性化ビス−PEG−1000
とインキュベートした。周囲温度において磁気的に撹拌しかつ0.5MのNaOHの添加
によりpHを間隔9.0〜9.5に維持しながら、この反応を実施した。反応時間は2時
間であった。

【０２２７】 誘導体を精製し、50mMの基質、5mMのコハク酸無、150mMのNaCl、1mMのCaCl₂
pH6.0中で平衡化したSuperdex−75カラム（Pharmacia）上のサイズ排除クロマト
グラフィーにより、過剰の試薬を除去した。

【０２２８】 接合体を−20℃において、前述の緩衝液中で貯蔵した。 親発現ベクターに比較して、接合体のプロテアーゼ活性が保持された（pH9に
おいて基質としてジメチル−カゼインを使用して97％）。

【０２２９】 実施例6 競合ELISAを確立された手順に従い実行した。要約すると、96ウェルのELISAプ
レートを親タンパク質で被覆した。適切なブロッキングおよび洗浄後、種々の量
の変性タンパク質（コンペティター）の存在下に、被覆した抗原をウサギ抗酵素
ポリクローナル抗体とインキュベートした。

【０２３０】 セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識化ブタ抗ウサギ免疫グロブリンにより、
残留ウサギ抗血清の量を検出した。 エピトープ： T143 N173 N140 E136 L135 パターン： S／T N N ＞ E L 抗体： IgG1 骨格： サビナーゼ 突然変異： E136K 変性： ビス−NHS−PEG1000

【０２３１】 PEGイル化誘導体の非変性酵素についての競合ELISA。結果を第2図に示す。 このデータが示すように、誘導体（60％の終点阻害）は、親タンパク質（100
％の終点阻害）に比較して、酵素特異的免疫グロブリンに結合する能力が減少し
ていた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 4エピトープが位置しかつそれらの対応するエピトープ領域を有するサビナー
ゼ（Savinase）およびリポプライム（Lipoprime）の三次元構造を示す。

【図２】 競合ELISAのデータを示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１月１８日（２００１．１．１８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｑ 9/00 33/535 Ｇ０１Ｎ 33/53 33/573 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/535 5/00 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/48 (31)優先権主張番号 ＰＡ １９９９ ０１４１７ (32)優先日 平成11年10月４日(1999．10．4) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 エルンスト，ステフェン デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA07 CA03 DA01 DA02 DA05 DA12 GA11 GA25 HA01 HA11 HA20 4B050 CC04 EE01 GG01 4B065 AA01X AA58X AA72X AA87X AB01 AC14 BA01 BA16 CA27 CA41 CA43 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 CA53 DC02 DC22 DC23 DC25 DC26 NA06

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の工程を含んでなる、親タンパク質に比較して減少した
   免疫原性を有するタンパク質変異型を選択する方法： ランダムペプチド表示パッケージライブラリーを問題のタンパク質に対して発
   生させた抗体でスクリーニングし、 抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列または抗体結合性ペプチドをコードするDN
   A配列を配列決定し、 反応性ペプチド配列の配列アライメントによりエピトープパターンを同定し、 親タンパク質の一次および三次元構造上にエピトープパターンを局在化し、 エピトープアミノ酸から5Å内に位置するアミノ酸を含むエピトープ領域を定
   め、 新しいエピトープパターンを構築または現存するエピトープパターンを再生す
   るアミノ酸置換を排除するため出現するエピトープデータベースを使用して、タ
   ンパク質機能を損傷しないで、親タンパク質をコードするDNA配列の突然変異を
   遺伝子操作することによって、局在化エピトープパターン、または親タンパク質
   のエピトープ領域を定めるアミノ酸を変化させ、 突然変異したDNA配列を適当な宿主の中に導入し、前記宿主を培養し、タンパ
   ク質変異型を発現させ、そして 対照として親タンパク質を使用してタンパク質変異型の免疫原性を評価する。
2. 【請求項２】 タンパク質変異型が減少したアレルゲン性を有する、請求項
   1に記載の方法。
3. 【請求項３】 アレルゲン性を評価する前に抗原性および／または機能性を
   評価することによって、タンパク質変異型を選択する、前記請求項のいずれか一
   項に記載の方法。
4. 【請求項４】 ランダムペプチド表示パッケージライブラリーをスクリーニ
   ングするために、親タンパク質に対して発生させた抗体を使用する、前記請求項
   のいずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 ペプチド配列を親タンパク質の配列および三次元構造と比較
   することによって、親タンパク質のエピトープパターンを同定する、前記請求項
   のいずれか一項に記載の方法。
6. 【請求項６】 ペプチド配列をタンパク質の配列および三次元構造と比較す
   ることによって、親タンパク質のエピトープ領域を同定する、前記請求項のいず
   れか一項に記載の方法。
7. 【請求項７】 親タンパク質が酵素である、前記請求項のいずれか一項に記
   載の方法。
8. 【請求項８】 酵素がグルコシルヒドロラーゼ、カルボヒドラーゼ、ペルオ
   キシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、フィターゼ、多糖リアーゼ、オキシドレ
   ダクターゼ、トランスグルタミナーゼおよびグリコースイソメラーゼから成る群
   から選択される、請求項7に記載の方法。
9. 【請求項９】 抗体がIgGまたはIgE抗体である、前記請求項のいずれか一項
   に記載の方法。
10. 【請求項１０】 ペプチド表示パッケージライブラリーがファージ表示ライ
    ブラリーである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
11. 【請求項１１】 ペプチド表示パッケージライブラリーのペプチドが5〜25
    アミノ酸を有するオリゴペプチドである、前記請求項のいずれか一項に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 エピトープ領域の少なくとも1つのアミノ酸を置換するこ
    とによって、エピトープ領域を変化させる、前記請求項のいずれか一項に記載の
    方法。
13. 【請求項１３】 エピトープ領域の少なくとも1つのアミノ酸を付加または
    欠失することによって、エピトープ領域を変化させる、請求項1〜11のいずれか
    一項に記載の方法。
14. 【請求項１４】 エピトープパターンの少なくとも1つのアミノ酸を置換す
    ることによって、エピトープパターンを変化させる、請求項1〜11のいずれか一
    項に記載の方法。
15. 【請求項１５】 エピトープパターンの少なくとも1つのアミノ酸を付加ま
    たは欠失することによって、エピトープパターンを変化させる、請求項1〜11の
    いずれか一項に記載の方法。
16. 【請求項１６】 置換されたおよび／または挿入されたアミノ酸を活性化さ
    れた分子に対する共有結合接合のためのターゲットとするアミノ酸により、少な
    くとも1つのアミノ酸を置換および／または挿入することによって、エピトープ
    領域中のアミノ酸を変化させる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 置換および／または挿入がK、R、C、D、Eから成る群から
    選択される、請求項16に記載の方法。
18. 【請求項１８】 共有結合接合のための分子が活性化された合成または天然
    のポリマーから選択される、請求項16に記載の方法。
19. 【請求項１９】 活性化された合成ポリマーがポリエチレングリコールであ
    る、請求項18に記載の方法。
20. 【請求項２０】 免疫原性を競合ELISAにより測定する、前記請求項のいず
    れか一項に記載の方法。
21. 【請求項２１】 タンパク質変異型の免疫原性が親タンパク質の免疫原性の
    75％未満、好ましくは50％未満である、請求項20に記載の方法。
22. 【請求項２２】 タンパク質変異型の免疫原性が親タンパク質の免疫原性の
    75％未満であるように、タンパク質変異型のアミノ酸配列が、親タンパク質の少
    なくとも1つのエピトープ領域に対して、親タンパク質のアミノ酸配列と異なる
    、その野生型タンパク質に比較して減少した免疫原性を有するタンパク質変異型
    。
23. 【請求項２３】 エピトープ領域が野生型タンパク質に対して発生させた抗
    体に対して反応性の反応性ペプチド配列に対応するエピトープパターンに対応す
    る、請求項22に記載のタンパク質変異型。
24. 【請求項２４】 エピトープパターンがIgEエピトープパターンである、請
    求項22〜23のいずれか一項に記載のタンパク質変異型。
25. 【請求項２５】 エピトープのアンカーアミノ酸が置換または欠失されてい
    る、請求項22〜24のいずれか一項に記載のタンパク質変異型。
26. 【請求項２６】 免疫原性が親タンパク質の免疫原性の50％未満である、請
    求項22〜25のいずれか一項に記載のタンパク質変異型。
27. 【請求項２７】 エピトープ領域が下記のエピトープパターンのいずれから
    5Å以内に局在化されることによって野生型タンパク質構造に基づき定められる
    、請求項22〜26のいずれか一項に記載のタンパク質変異型：R Y P R／K、S
    G P R A G、P R／K S D P G、D P ＞ R D T G、A R ＞ R
    ＞ A ＞ N、N N ＞ E L、R／K R F A／S N ＞ E／D、E Y ＞ M
    、P ＞ P A P ＞ S、A K I D P R／K、A D S ＞ G Y P、S R S A、L ＞ G R S S。
28. 【請求項２８】 請求項22〜27のいずれか一項に記載のタンパク質変異型を
    含んでなる組成物。
29. 【請求項２９】 薬剤を製造するための、請求項28に記載の組成物の使用。
30. 【請求項３０】 産業的利用のための、請求項28に記載の組成物の使用。
31. 【請求項３１】 請求項22〜27のいずれか一項に記載のタンパク質変異型を
    コードするDNA配列を含んでなるDNA構築物。
32. 【請求項３２】 請求項31に記載のDNA構築物を含んでなる発現ベクター。
33. 【請求項３３】 ポリペプチドを発現することができかつ請求項31に記載の
    DNA構築物を含んでなる宿主細胞。
34. 【請求項３４】 ポリペプチドを発現することができかつ請求項32に記載の
    発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
35. 【請求項３５】 菌類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞であ
    る、請求項33または34に記載の宿主。
36. 【請求項３６】 下記の工程を含んでなる、親タンパク質に比較して減少し
    た免疫原性を有するタンパク質変異型を製造する方法： 適当な培地中で請求項30〜32のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養して、タ
    ンパク質を発現させ、培地の中に分泌させ、次いで タンパク質を培地から単離する。
37. 【請求項３７】 下記の工程を含んでなる、親タンパク質に比較して減少し
    た免疫原性を有するタンパク質変異型を選択するためのランダムペプチド表示パ
    ッケージライブラリーの使用： 親タンパク質に対して発生させた抗体でランダムペプチド表示パッケージライ
    ブラリーをスクリーニングし、 抗体結合性ペプチドのアミノ酸配列または抗体結合性ペプチドをコードするDN
    A配列を配列決定し、 ペプチド配列を親タンパク質の配列と比較することによって、親タンパク質の
    エピトープパターンを同定し、 タンパク質機能を損傷しないで、親タンパク質をコードするDNA配列の突然変
    異を遺伝子操作することによって、親タンパク質の同定されたエピトープパター
    ンを変化させ、 突然変異したDNA配列を適当な宿主の中に導入し、前記宿主を培養し、タンパ
    ク質変異型を発現させ、そして 対照として親タンパク質を使用してタンパク質変異型の免疫原性を評価する。