JP2003521930A - 第VII因子または第VIIa因子様分子 - Google Patents

第VII因子または第VIIa因子様分子

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アンデルセン,キム・ヴィルブール
ぺダーセン,アンデルス・ヒェルホルト
ボルネス,クラウス
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マキシゲン・エイピーエス
マキシゲン・ホールディングス・リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規第VII因子(FVII)または第VIIa因子(FVIIa)ポリペプチドコンジュゲート、それらの製剤および治療、特に各種凝固関連障害の治療を目的とした使用に関する。これら新規ポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドに共有結合した少なくとも1つの非ポリペプチド部分を含み、この場合前記ポリペプチドのアミノ酸配列は野生型FVIIまたはFVIIaのアミノ酸配列と、前記非ポリペプチド部分に関する結合基を含む少なくとも1アミノ酸残基が導入され、あるいは除去される点で異なっている。本発明のコンジュゲートは市販されているrFVIIaと比較し、長い機能的インビボ半減期および/または長い血漿半減期、および/または高い生物利用度および/または低い蛋白質分解感受性を含む1またはそれ以上の改善された特性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の分野】
本発明は新規な第VII因子(FVII)または第VIIa因子(FVIIa
)ポリペプチドコンジュゲート、それらの調製、および治療における使用、特に
各種の血液凝固関連疾患の治療に関する。
【0002】
【発明の背景】
血液凝固は結果としてフィブリン凝塊を生じせしめる各種血液成分(または因
子)の複雑な相互作用から成るプロセスである。一般に、凝固”カスケード”と
よばれるプロセスに関与する血液成分は、プロ酵素または酵素原(チモーゲン)
、即ち活性化因子の作用によって活性型に変換される酵素的に不活性な蛋白質で
ある。これら凝固因子の一つがFVIIである。 FVIIは肝臓で合成され、そして血液中に分子量53kDaの単鎖型糖蛋白
質として分泌されるビタミンK依存型血漿蛋白質である(BrozeとMaje
rus、J. Biol. Chem. 1980; 225:1242−12
47)。FVII酵素原は単一部位R152−I153が蛋白質分解的に開裂さ
れることで活性型に変換され、単一のジスルフィド架橋結合により結合された2
本鎖体となる。組織因子と複合体を形成したFVIIa(FVIIa複合体)は
、第IX因子および第X因子の両方をそれぞれ活性型に変換することができ、そ
れに続いて急速なトロンビン生成およびフィブリン形成をもたらす反応が起こる
(OsterudとRapaport、Proc Natl Acad Sci
USA 1977;5260−5264)。
【0003】 FVIIは分子のN末端域に10カ所のγ−カルボキシグルタミン酸残基を生
成するビタミンK依存型カルボキシル化を含む翻訳後修飾を受ける。即ち、配列
番号1の残基番号6、7、14、16、19、20、25、26、29および3
5が、FVIIの活性にとって重要なGlaドメイン内のγ−カルボキシグルタ
ミン酸残基である。その他の翻訳後修飾としては、それぞれ位置145および3
22に天然に生ずる2カ所のN−グリコシル化部位およびそれぞれ位置52およ
び60に天然に生ずる2カ所のO−グリコシル化部位への糖成分の結合が挙げら
れる。 ヒトFVII(hFVII)をコードする遺伝子は第13染色体のq34−q
ter9にマッピングされている(de Grouchyら、Hum Gene
t 1984;66:230−233)。それは9個のエクソンを含み、12.
8Kbにまたがっている(O’Haraら、Proc Natl Acad S
ci USA 1987;84:5158−5162)。FVIIの遺伝子構成
および蛋白質構造は他のビタミンK依存型プロ凝固蛋白質のそれらに類似してお
り、エクソン1aおよび1bはシグナル配列を;エクソン2はプロペプチドとG
laドメインを;エクソン3は短い疎水性域を;エクソン4と5は上皮増殖因子
様ドメインを;そしてエクソン6ないし8はセリンプロテアーゼ触媒ドメインを
コードしている(Yoshitakeら、Biochemistry 1985
;24:3736−3750)。 hFVIIaについて(Pikeら、PNAS.USA., 1999;96
:8925−30およびKemball−Cookら、J.Struct.Bi
ol, 1999;127:213−223)、X線結晶学的方法による可溶性
組織因子と複合体を形成しているhFVIIa(Bannerら、Nature
、1996;380:41およびZhangら、J.Mol.Bio,1999
;285:2089)に関する、そしてhFVIIの小型断片(Muranyi
ら、Biochemistry、1998;37:10605およびKaoら、
Biochemistry、1999;38:7097)について、実験的三次
元構造が報告されている。
【0004】 比較的少数のFVIIの蛋白質工学変種が報告されている(Dickinso
nとRuf、J Bio Chem, 1997;272:19875−198
79、Kemball−Cookら、J Biol Chem, 1998;2
73:8516−8521、Bharadwajら、J Biol Chem,
1996;271:30685−30691、Rufら、Biochemis
try、1999;38:1957−1966)。 BHKまたはその他哺乳動物細胞でのFVII発現(第WO92/15686
号、第WO91/11514号および第WO88/10295号)および真核生
物細胞でのFVIIとkex2エンドプロテアーゼの共発現(第WO00/28
065号)に関する報告がある。 ヒト組換え体FVIIaの市販製剤はNovoSevenRとして販売されて
いる。NovoSevenRは血友病AまたはB患者の出血症状の治療に適用さ
れる。NovoSevenRは、出血症状に対する有効かつ信頼性の高い治療を
目的とした唯一の市販rFVIIaである。 アルギニン152および/またはイソロイシン153が修飾されている不活性
型FVIIが第WO91/1154号に報告されている。これらのアミノ酸は活
性化部位に局在している。第WO96/12800号は、セリンプロテアーゼ阻
害剤によるFVIIaの不活性化を記載しており、α−アミノ酸基I153位置
でのFVIIaのカルバミル化による不活性化がPetersenら、Eur
J Biochem, 1999;261:124−129により記載されてい
る。この不活性型は、組織因子の結合と凝固活性の阻害に関し、野生型FVII
またはFVIIaと競合することができる。不活性型FVIIaは、敗血症、心
筋梗塞または血栓発作のリスクが高い患者等、血液凝固能低下状態にある患者の
治療への利用が提案されている。
【0005】 血流中のrFVIIaの半減期は2.3時間であるとFDA参照番号96−0
597である「NovoSevenR承認の根拠の要約」に報告されている。所
望の治療または予防効果を達成するには、比較的高い投与量と頻繁な投与が必要
とされている。結果として投与量を適切に管理することが困難となっており、そ
して頻繁に静脈投与の必要性が患者の生活を制限している。 現行のrFVIIa治療のかかえる別の問題は、蛋白質分解に関してこの分子
が比較的不安定であることである。蛋白質分解は、凍結乾燥製剤とは異なり溶液
製剤を調製する際に大きな障害となる。安定した溶解性製剤を得る利点は、患者
治療が容易であること、そして緊急時に即時に対応でき、その結果救命につなが
る可能性があることである。主な蛋白質分解部位に部位指定型突然変異を誘導し
て蛋白質分解を防止する試みが第WO88/10295号に開示されている。 より長い血中半減期を持つ分子では、投与の必要回数は少なくなるだろう。現
行FVIIaの頻回投与の問題、および治療薬FVIIaレベルをより最適化す
ること、さらに高い治療効果が得られる可能性を考えると、明らかに改良型FV
IIまたはFVIIa様分子が望まれている。 蛋白質の血中半減期を延長する方法の一つは、蛋白質の腎臓クリアランスを減
らすことである。これは蛋白質を、蛋白質に低腎臓クリアランス性を付与する化
学成分にコンジュゲートさせることで達成される。 さらに蛋白質に化学成分を結合すること、または蛋白質分解に曝されるアミノ
酸を置換することにより、蛋白質分解酵素を分解対象となる蛋白質と接触するこ
とを効果的に遮断してもよい。ポリエチレングリコール(PEG)は治療様蛋白
質製剤の調製に使用されているこの様な化学成分の一つである。 第WO98/32466号は、多くの他蛋白質と共にFVIIがPEG化でき
ることを示唆しているが、その観点に関してそれ以上の情報を含んでいない。
【0006】
【発明の要旨】
本出願は、上記の1またはそれを越える望ましい利点を提供する改良されたF
VIIおよびFVIIa分子、特に組換え体hFVIIおよびhFVIIa分子
を開示する。即ち本発明のコンジュゲートは市販rFVIIaに比し、機能性イ
ンビボ半減期の延長および/または血漿半減期の延長、そして生物利用性の増加
および/または蛋白質分解的崩壊に対する感受性の低下を含む1またはそれ以上
の改良特性を有する。その結果発明のコンジュゲートによる医療処置は、現行の
rFVIIa化合物よりも注射の間隔がより長くなる等、多く利点をもたらす。 従って第1の側面では、発明はポリペプチドに共有結合した少なくとも1種類
の非ポリペプチド部分を含んでなるコンジュゲートであって、そのポリペプチド
のアミノ酸配列が、前記非ポリペプチド部分のための結合基を含む少なくとも1
つのアミノ酸残基を導入されるかまたは除かれている点で、配列番号1に示され
る野生型FVIIまたはFVIIaの配列と異なるコンジュゲートに関する。 別の側面では、本発明は、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、非ポリペプチ
ド部分に関する連結基を含む少なくとも1つのアミノ酸残基が導入されているか
または除かれている点で、配列番号1に示される野生型FVIIまたはhFVI
Iaと異なるポリペプチドに関する。この様な新規FVIIポリペプチドは治療
、診断またはその他目的等に有用であると考えられるが、本発明のコンジュゲー
トの調製のための中間生成物として特に興味深い。 別の側面では、本発明は、本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたは本発
明のコンジュゲートのポリペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列;本発
明のヌクレオチド配列を備えた発現ベクトル;本発明のヌクレオチド配列または
本発明の発現ベクターを含む宿主細胞に関する。 さらに別の側面では、本発明は、本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物、
およびそのようなコンジュゲートの調製方法及び使用方法に関する。
【0007】 [発明の詳細な説明]定義 本出願および本発明の文脈では、以下の定義が適用される: 用語”コンジュゲート(コンジュゲート体)”(または”コンジュゲート化し
たポリペプチド”と言い換えることができる)は、ポリマー分子、脂肪親和性化
合物、糖成分または有機誘導化物質(organic derivatizing agents)のような
1またはそれ以上の非ポリペプチド部分に1またはそれ以上のポリペプチドが共
有結合することで形成された異種(複合体またはキメラという意味における)分
子を意味する。好ましくは、コンジュゲートは関連濃度および条件では可溶性で
あり、即ち血液等の生理学的液体中では可溶性である。本発明のコンジュゲート
化ポリペプチド例はグリコシル化および/またはPEG化ポリペプチドを包含す
る。 用語”共有結合”は、ポリペプチドおよび非ポリペプチド部分が互いに直接共
有結合しているか、または架橋体、スペーサーまたは単数あるいは複数の結合成
分を介して間接的に相互に共有結合していることを意味する。 用語”非コンジュゲート化ポリペプチド”は、コンジュゲートのポリペプチド
部分に関して用いられる。 ここで使用される場合、用語”非ポリペプチド部分”は、本発明のポリペプチ
ドの結合基にコンジュゲートできる分子を意味する。この様な分子の好適例には
、ポリマー分子、糖成分、脂肪親和性化合物または有機誘導化物質が含まれる。
本発明のコンジュゲートとの関係で使用される場合、非ポリペプチド部分は、コ
ンジュゲートのポリペプチド部分に、そのポリペプチドの結合基を介して結合さ
れると理解されるだろう。上記の如く、非ポリペプチド部分は結合基に直接共有
結合されても、または架橋体、スペーサー、または単数あるいは複数の結合成分
といった介在成分を介し、結合基に間接的に共有結合されても良い。
【0008】 ”ポリマー分子”は、2またはそれ以上のモノマーの共有結合により形成され
る分子であって、ポリマーがヒトアルブミンまたはその他の豊富な漿蛋白質であ
る場合を除いて、モノマーがアミノ酸残基ではない分子である。用語”ポリマー
”は用語”ポリマー分子”と互換的である。この用語はインビトログリコシル化
により結合された炭水化物分子、即ち、随意に架橋結合剤を使用して、ポリペプ
チドの結合基に炭水化物分子を共有結合させることを伴うインビトロで正常的に
実施される合成的グリコシル化により結合された炭水化物分子を包含する。 N−またはO−グリコシル化(更に下で記載する様な)の様なインビボグリコ
シル化により結合された炭水化物分子は、ここでは”糖成分”と呼ばれる。コン
ジュゲート中のポリマー分子または糖成分といった非ポリペプチド部分の数が明
示されている場合を除き、本発明で使用されるコンジュゲートまたはその他のも
のに含まれる”非ポリペプチド部分”と呼ばれるものはいずれも、1またはそれ
以上のポリマー分子または糖成分等のような非ポリペプチド部分を参照すべきも
のである。
【0009】 用語”結合基”は、ポリペプチドの官能基、特にポリマー分子、脂肪親和性分
子、糖成分または有機誘導化物質の様な非ポリペプチド部分を結合することがで
きる、そのアミノ酸残基または炭水化物を指す。有用な結合基およびそれらの適
合非ポリペプチド部分を下表に示す。
【0010】
【表1】
【0011】 インビボのN−グリコシル化の場合、用語”結合基”は通例外の意味で用いら
れ、N−グリコシル化部位を含むアミノ酸残基を表している(配列N−X−S/
T/C、ここでのXはプロリン以外の何れかのアミノ酸残基であり、Nはアスパ
ラギン、そしてS/T/Cはセリン、スレオニンまたはシステインのいずれかで
あり、好ましくはセリンまたはスレオニンであり、最適にはスレオニンである)
。N−グリコシル化部位のアスパラギン残基は、グリコシル化の際に糖成分が結
合される部位の一つであるが、この様な結合は他のアミノ酸残基のN−グリコシ
ル化部位が存在しない限りは成立しない。 従って非ポリペプチド部分が糖成分であり且つそのコンジュゲーションがN−
グリコシル化により行われる場合、目的のポリペプチドのアミノ酸配列の変更と
関連づけて使用される”非ポリペプチド部分のための結合基を含んでなるアミノ
酸残基”という用語は、N−グリコシル化部位を構成する1またはそれ以上のア
ミノ酸残基が、機能的なN−グリコシル化部位がアミノ酸配列内に導入されてい
るかまたは前記配列より除かれている様式で変更されるものであることを意味す
る。
【0012】 本出願では、アミノ酸名および原子名(例えばCA、CB、CD、CG、SG
、NZ、N、O、C等)は、IUPAC命名規約(アミノ酸およびペプチドに関
するIUPAC 命名規約および符号(Nomenclature and S
ymbolism for Amino Acids and Peptide
s)(残基名、原子名等)、Eur.J.Biochem.、138、9−37
(1984)およびそれらに関するEur.J.Biochem.,152、1
(1985)記載の補正に基づく蛋白質データバンク(Protein Dat
aBank)(PDB)(www.pdb.org))で定義された通りに用い
られる。 用語”アミノ酸残基”はアラニン(AlaまたはA)、システイン(Cysま
たはC)、アスパラギン酸(AspまたはD)、グルタミン酸(GluまたはE
)、フェニルアラニン(PheまたはF)、グリシン(GlyまたはG)、ヒス
チジン(HisまたはH)、イソロイシン(IleまたはI)、リジン(Lys
またはK)、ロイシン(LeuまたはL)、メチオニン(MetまたはM)、ア
スパラギン(AsnまたはN)、プロリン(ProまたはP)、グルタミン(G
lnまたはQ)、アルギニン(ArgまたはR)、セリン(SerまたはS)、
スレオニン(ThrまたはT)、バリン(ValまたはV)、トリプトファン(
TrpまたはW)およびチロシン(TyrまたはY)残基より成るグループに含
まれるアミノ酸残基を示すものである。
【0013】 アミノ酸位置を指定する際使用される命名方法を以下例示する:G124とは
、配列番号1に示すアミノ酸配列において位置124がグリシン残基で占められ
ていることを示す。G124Rとは、位置124のグリシン残基がアルギニン残
基により置換されたことを意味する。あるいは置換は”/”を用い、例えばK3
2D/Eのように表され、これは位置32のリジンがアスパラギン酸またはグル
タミン酸のいずれかにより置換されたアミノ酸配列を意味する。複数の置換は”
+”を使い、例えばK143N+N145S/Tの様に表し、これは位置143
のリジン残基のアスパラギンによる置換、および位置145のアスパラギン残基
のセリンまたはスレオニン残基による置換を含むアミノ酸配列を意味している。
G124の後にアラニン残基が挿入される様な、追加のアミノ酸残基の挿入はG
124GAで表される。アミノ酸残基の欠失は星印で表される。たとえば位置1
24のグリシンの欠失はG124*で表される。特記ない限り、ここで行うアミ
ノ酸の番号付けは、配列番号1に示す野生型FVII/FVIIaのアミノ酸配
列に対するものである。 特定の突然変異体(mutant)と結びつけて使用される場合、用語”異なる”は
、明記されたアミノ酸の違いとは別の追加的違いも含むことを意味する。例えば
非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基を除去および/または導
入することに加え、FVIIまたはFVIIaポリペプチドはこの様なアミノ酸
残基の導入および/または除去とは関係のない別の置換を含んでもよい。即ち、
ここに開示した非ポリペプチド部分に関する結合部位の除去および/または導入
を目的とするアミノ酸の変更に加え、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、
望まれる場合には結合部位の導入または除去に関連させる必要のない別の変更、
即ち置換、挿入または欠失を含むことができる。例えば、これらは1またはそれ
以上のアミノ酸残基によるN−および/またはC−末端の切断、またはN−およ
び/またはC−末端への1またはそれ以上の余分な残基の付加、例えばN−末端
へのメチオニン残基の付加、ならびに”保存的アミノ酸置換”、即ち同様の特性
を持ったアミノ酸群内、例えば小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩
基性アミノ酸、疎水性アミノ酸および芳香族アミノ酸群内で行われる置換を含ん
でもよい。
【0014】
【表2】
【0015】 用語”変異”および”置換”はここでは互換的に使用される。 用語”核酸配列”は、2またはそれ以上のヌクレオチド分子の連続ストレッチ
を示すものである。ヌクレオチド配列はゲノミック、cDNA、RNA、半合成
、合成由来、またはその組換え体である。 用語”ポリメラーゼチェインリアクション”または”PCR”は一般的には米
国特許第4,683,195号に記載されているインビトロでの所望ヌクレオチ
ド配列増幅法を表す。一般にPCR法は、鋳型核酸に好ましくハイブリダイゼー
ションできるオリゴヌクレオチドプライマーを使った、プライマー延長合成のサ
イクルの繰り返しを含む。 ”細胞”、”宿主細胞”、”細胞株”および”細胞培養”は、ここでは互換的
に用いられ、この様な用語は全て、細胞を増殖し、または培養した結果生じる子
孫を含むと理解すべきである。”形質転換”および”トランスフェクション”は
互換的に使用され、細胞内にDNAを導入する工程を示す。 ”機能的に連結した”とは、2またはそれ以上のヌクレオチド配列が、酵素的
ライゲーションまたはその他方法により、配列の正常な機能が行われることがで
きる形に相互に配置され、共有結合することを表している。例えば、もしポリペ
プチドがポリペプチドの分泌に関わる前駆蛋白質として発現される場合には、プ
レ配列または分泌リーダーをコードするヌクレオチド配列がポリペプチドをコー
ドしているヌクレオチド配列に機能的に連結される:プロモーターまたはエンハ
ンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合、それはコーディング配列に機能的に連
結されている;リボソーム結合部位が翻訳を促進する位置に配置されている場合
、それはコーディング配列に機能的に連結されている。一般に”機能的に連結し
た”とは、連結しているヌクレオチド配列が隣接していること、そして分泌リー
ダーの場合には隣接し且つ読み枠内に存在することを意味する。連結は通常の制
限部位でのライゲーションにより行われる。そのような部位がない場合には、合
成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、標準的な組換え体DNA法
と結びつけ使用される。
【0016】 用語”導入する”は、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残基
の導入すること、特に既存アミノ酸残基の置換、または追加のアミノ酸残基の挿
入により導入することを意味する。 用語”除去する”とは、非ポリペプチド部分のための結合基を含むアミノ酸残
基を除去すること、特に除去対象となるアミノ酸残基を別のアミノ酸により置換
すること、または追加のアミノ酸残基を欠失することにより除去することを意味
する。 用語”FVII”または”FVIIポリペプチド”は単鎖型で提供されるFV
II分子を意味する。 用語”FVIIa”または”FVIIaポリペプチド”とは、活性化された2
本鎖型で提供されるFVIIa分子を意味し、この場合1本鎖型のR152−I
153間のペプチド結合は切断される。ここでは配列番号1のアミノ酸配列を用
いFVIIaのアミノ酸配列を記載するが、その場合は一方鎖のアミノ酸が残基
1−152を含み、他方の鎖がアミノ酸残基153−406を含むと理解される
だろう。 用語”rFVII”または”rFVIIa”は、それぞれ組換え体技術で生成
されたFVIIおよびFVIIa分子を表す。 用語”hFVII”または”hFVIIa”は野生型ヒトFVIIおよびFV
IIaをそれぞれ表す。 用語”触媒部位”は、FVIIポリペプチドのS344、D242、およびH
193より成る触媒性のトライアッド(3つ組構造)を意味する。
【0017】 用語”活性FVIIa”、”活性FVIIaポリペプチド”、”活性FVII
aコンジュゲート”または”活性コンジュゲート”とは、野生型hFVIIaの
触媒活性の少なくとも10%を有するFVIIaポリペプチドまたはコンジュゲ
ートを表すのに用いられる。ここで用いる場合、触媒活性は触媒活性測定法と題
する節に記載のアッセイ、または低レベル触媒活性測定法と題したアッセイ(本
明細書の材料と方法の節を参照)により、好ましく測定されるだろう。好ましく
は上記アッセイで試験された時、活性コンジュゲートは野生型hFVIIaの触
媒活性の少なくとも15%、例えば少なくとも20%、例えば少なくとも25%
、より好ましくは少なくとも30%、例えば少なくとも40%を、最適には例え
ば少なくとも50%、例えば少なくとも60%を有する。 好ましくは、活性コンジュゲートは組織因子に結合し、さらに血漿第X因子お
よび/または第IX因子を活性化することができる。即ち好適実施態様では、活
性FVIIaポリペプチドまたはそのコンジュゲートは、野生型FVIIaに比
し少なくとも25%の凝固活性、例えば野生型FVIIaに比べ少なくとも50
%の凝固活性を、例えば野生型FVIIに比較し少なくとも75%の凝固活性を
有する。即ち活性FVIIaポリペプチドまたはそのコンジュゲートの凝固活性
は、好ましくは野生型FVIIaに比べ25−200%の範囲内にある。具体的
には、FVIIaポリペプチドまたはコンジュゲートは野生型FVIIaと比較
して30−150%の範囲の凝固活性を、例えば野生型FVIIaと比較して3
0−100%の範囲の凝固活性を持つ。凝固活性は以下材料と方法の節に詳細論
ずる、当技術分野既知の方法により決定されるだろう。しかし特に好適には、凝
固活性は”凝固活性測定法”と題する節記載の方法(材料と方法の節を参照)に
従い決定される。
【0018】 用語”免疫原性”は、特定物質と関連づけて使用される場合、免疫系からの反
応を誘導する物質の能力を示している。免疫反応は細胞または抗体介在反応であ
り得る(免疫反応の詳細な定義については例えばRoitt:Essentia
l Immunology(第8版、Blackwell)を参照)。一般に、
抗体反応性の低下は、免疫原性の低下を表すだろう。免疫原性の低下は、例えば
インビボまたはインビトロにて、当技術分野既知の好適方法を用い決定されるだ
ろう。 用語”不活性FVIIa”、”不活性FVIIaポリペプチド”、”不活性F
VIIaコンジュゲート”または”不活性コンジュゲート”は、野生型hFVI
Iaの触媒活性の10%未満のFVIIaポリペプチドまたはコンジュゲートを
意味するのに用いられる。ここで用いる場合、触媒活性は、触媒活性測定方法と
題する節に記載のアッセイ、または低レベル触媒活性を測定する方法と題したア
ッセイ(本書材料と方法の節を参照)により好ましく決定されるだろう。好まし
くは上記アッセイで試験された時、活性コンジュゲートは野生型hFVIIa触
媒活性の8%未満、例えば6%未満、例えば5%未満、より好ましくは4%未満
、例えば3%未満、最適には例えば2%未満、例えば1%未満である。
【0019】 典型的には、不活性コンジュゲートは野生型hFVIIaに比べ有意に低いイ
ンビトロまたはインビボ凝固活性を有する。不活性FVIIまたはFVIIaポ
リペプチドまたはコンジュゲートは、組織因子結合に関し野生型FVIIまたは
FVIIaと競合でき、それにより凝固活性を阻害することができるだろう。好
ましくは不活性FVIIまたはFVIIaポリペプチドまたはコンジュゲートは
野生型hFVIIまたはhFVIIaに比べ1%未満の凝固活性を有する。より
好ましくは不活性FVIIまたはFVIIaポリペプチドまたはコンジュゲート
は、野生型hFVIIまたはhFVIIaに比べ0.05%未満の凝固活性を有
する。最適には不活性FVIIまたはFVIIaポリペプチドまたはコンジュゲ
ートは、野生型hFVIIまたはhFVIIaに比べ0.01%未満の凝固活性
を有する。上記同様にして、凝固活性は以下の材料と方法の節で詳細論じられる
様な当技術分野既知の方法により決定することができるが、好ましくは”凝固活
性測定法”と題する節に記載の方法により決定される。 用語”機能的(functional)インビボ半減期”とは通常の意味で用いられてお
り、即ちポリペプチドまたはコンジュゲートの生物活性の50%が体内/標的器
官内にまだ存在している時間、またはポリペプチドまたはコンジュゲートの活性
が初期値の50%である時間を意味する。機能的インビボ半減期を決定する代替
として、”血清半減期”、即ち排除される前にポリペプチドまたはコンジュゲー
ト分子の50%が血漿または血流中を循環している時間を決定してもよい。血清
半減期の決定は、機能的インビボ半減期を決定する場合よりも簡単であることが
多く、血清半減期の大きさは機能的インビボ半減期の大きさを通常よく表す。あ
るいは血清半減期という語は”血漿半減期”、”血中半減期”、”血清クリアラ
ンス”、”血漿クリアランス”および”クリアランス半減期”を包含する。ポリ
ペプチドまたはコンジュゲートは、細網内皮系(RES)、腎臓、脾臓または肝
臓の作用により、組織因子、SEC受容体またはその他受容体介在排除、または
特異的あるいは非特異的蛋白質分解の1またはそれ以上により排除される。通常
、クリアランスはサイズ(子球体濾過に関するカットオフに対する)、電荷、結
合した炭水化物鎖、およびその蛋白質に対する細胞受容体の存在に依存する。保
持する機能性は、一般には凝固前駆体、蛋白質分解または受容体結合活性より選
択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は、以下の材料と方法の節で
詳細論ずる様に、当分野既知の好適方法により決定される。
【0020】 機能的インビボ半減期または血漿半減期に関して使用される”増加した”とい
う用語は、コンジュゲートまたはポリペプチドの関連半減期が、比較可能な条件
下に於いて測定されて非コンジュゲート型rFVIIa(例えばNovoSev
en(登録商標))の様な参照分子と比べて統計上有意に増加していることを表
すのに用いられる。例えば、関連半減期は少なくとも約25%、例えば少なくと
も約50%、例えば少なくとも約100%、150%、200%、250%、3
00%、500%または1000%増加するだろう。 用語”腎臓クリアランス”は、腎臓によって行われるクリアランス、例えば子
球体濾過、尿細管排出、または尿細管細胞内での分解によるクリアランスを表す
、一般的な意味に用いられる。腎臓クリアランスはサイズ(直径)、流体力学的
容積、対称性、形状/硬度、および電荷を含むコンジュゲートの物理特性に依存
する。一般的には、約67kDaの分子量が腎臓クリアランスのカットオフ値と
考えられている。腎臓クリアランスは好適アッセイ、例えば確立されたインビボ
アッセイにより決定される。典型的には、腎臓クリアランスは標識(例えば放射
線標識、または蛍光標識)ポリペプチドコンジュゲートを患者に投与し、患者よ
り採集した尿中の標識活性を測定することで決定される。腎臓クリアランスの低
下は、対応する参照ポリペプチド、例えば対応する非コンジュゲート化ポリペプ
チド、非コンジュゲート型の対応する野生型ポリペプチド、またはその他のコン
ジュゲート化ポリペプチド(例えば本発明によらないコンジュゲート化ポリペプ
チド)に対し、比較可能な条件下に決定される。好ましくは、コンジュゲートの
腎臓クリアランス速度は関連参照ポリペプチドと比べ少なくとも50%、好まし
くは少なくとも75%、そして最適には少なくとも90%低下する。 本発明のコンジュゲートの蛋白質分解への感受性低下を示す能力は最も重要で
ある;分解産物を含む組成物は、典型的には、コンジュゲートが全く分解されな
いか又はそのごく一部だけが分解される組成物に比べて、特異的活性が低いだろ
う。さらに、投与される組成物中に含まれる非生理学的分解産物は、患者の免疫
系の引き金をひくことになるかもしれない。
【0021】 用語”蛋白質分解への感受性低下”とは、主そして、コンジュゲートは、比較
可能な条件の下に非コンジュゲート化野生型FVIIaに比べた場合、蛋白質分
解への低い感受性を有することを意味している。好ましくは、蛋白質分解は少な
くとも10%、例えば少なくとも25%(例えば10−25%)、より好ましく
は少なくとも35%、例えば少なくとも50%(例えば10−50%、例えば2
5−50%)、よりさらに好ましくは少なくとも60%、例えば少なくとも75
%、さらには少なくとも90%低下する。より好ましくは、蛋白質分解は100
%低下する。即ち、好ましくは、本発明のコンジュゲートは、野生型FVIIa
ほどまでに蛋白質分解を被ることがなく、つまり、非コンジュゲート化野生型F
VIIaに比べて、本発明のコンジュゲートの蛋白質分解は、好ましくは10−
100%、例えば25−100%、より好ましくは50−100%、最適には7
5−100%低下する。 本発明者は、コンジュゲートが蛋白質切断に対し低感受性であるか(低自己分
解性)否かを評価するのに使用できる、好適な予備的インビトロ試験を開発した
。即ち、本発明の好適実施態様では、本発明のコンジュゲートは、蛋白質分解感
受性低下測定法と題する節に記載の方法で決定された時、触媒活性測定法と題す
る節に記載の方法で決定された時、または低レベル触媒活性を測定する方法と題
する節記載の方法により決定された場合(本明細書の材料と方法の節を参照)、
野生型FVIIaに比べ蛋白質分解(上記定義による)への低い感受性を有する
。 用語”親FVII”または”親ポリペプチド”は、本発明により変更される元
の分子を示している。典型的な親FVIIは、配列番号1に示すアミノ酸配列を
持つhFVIIまたはhFVIIa(rFVIIa(NovoSevenRを含
む)である。 用語”変異体(variant)”は、親ポリペプチドと1またはそれ以上アミノ酸
残基が異なる、一般的には1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14または15アミノ酸残基が異なっているポリペプチドである。
【0022】本発明のコンジュゲート 本発明のコンジュゲートは、改良されたFVIIまたはFVIIa分子の開発
に関する一般的に新しいストラテジーの成果である。より具体的には、非ポリペ
プチド部分に関する結合基を含むアミノ酸残基を排除し且つ/または導入するこ
とによって、そのポリペプチドは、選択された非ポリペプチド部分へのコンジュ
ゲーションに対しその分子がより感受性になり、そのコンジュゲーションパター
ンが最適化され(例えばFVIIまたはFVIIa分子表面上の非ポリペプチド
部分の分布および数が確実に最適化され、コンジュゲート化が意図された結合基
のみがその分子中に確実に存在するようにすること)、それによって、FVII
活性を有するか又は有さず、そして更には今日入手可能なFVIIおよびFVI
Ia分子に比べて1又はそれを越える改良された特性を有する新規なコンジュゲ
ート分子を得ることに特異的に適合させることが可能になる。例えば、選択した
非ポリペプチドに対する結合基を含むアミノ酸残基の総数が最適化レベルまで増
加、または減少する場合、そのコンジュゲートの腎臓クリアランスは、典型的に
は、コンジュゲーションの結果生ずる分子の形、サイズ、および/又は電荷の変
化に起因して大きく低下する。 本発明の好適な実施態様では、FVIIまたはFVIIaの1を越えるアミノ
酸残基が変更され、例えばこの変更は選択した非ポリペプチド部分に関する結合
基を含むアミノ酸残基の排除および導入を包含する。ポリペプチドはこのアミノ
酸残基の排除および/または導入に加えて、非ポリペプチド部分に関する結合基
を含むアミノ酸残基の除去および/または導入に関係しないその他の置換または
グリコシレーションを含んでも良い。さらにポリペプチドは、ポリペプチドの触
媒部位を阻害するために例えばセリンプロテアーゼ阻害剤に取り付けてもよい。 排除されるか又は導入される、非ポリペプチド部分に関する結合基を含むアミ
ノ酸残基は、選択した非ポリペプチド部分の性質に基づき、そして多くの場合に
はポリペプチドと非ポリペプチド部分間のコンジュゲーションが達成される方法
に基づき選択される。例えば非ポリペプチド部分がポリエチレングリコールまた
はポリアルキレンオキサイド誘導分子である場合、結合基を含むアミノ酸残基は
リジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジンおよびチロシ
ンより成るグループから選択され、好ましくはシステインおよびリジンであり、
特にはリジンである。
【0023】 本発明に従い非ポリペプチド部分の結合基がFVIIまたはFVIIaポリペ
プチド内に導入され、またはそれらより除去される場合、修飾されるポリペプチ
ドの位置は常にポリペプチドの表面に好ましく配置され、好ましくは、25%、
より好ましくは50%より多い側鎖が溶媒に露出するアミノ酸により占められる
。この様な位置は本明細書の材料と方法に記した様に、ヒトFVIIまたはFV
IIaの3D構造の分析を基にして特定されている。さらにこの位置は組織因子
結合部位領域および/または活性部位領域外に位置するFVII分子の一部より
好ましく選択される。これら領域は以下記す材料と方法の節に特定されている。
しかし、特定状況下で、例えば不活性コンジュゲートが望まれる場合には、その
様な領域内または近傍に修飾が行うことが好都合であることを強調しなければな
らない。例えば、非ポリペプチド部分に関する1またはそれ以上の結合基、例え
ばインビボN−グリコシレーション部位のための結合基は、FVII分子の活性
部位領域内にまたは活性部位結合裂溝リッジで好都合に挿入される。活性部位領
域および活性部位結合裂溝のリッジは本明細書の材料と方法の節に規定されてお
り、そして以下の残基より構成される:
【0024】 I153、Q167、V168、L169、L170、L171、Q176、L
177、C178、G179、G180、T181、V188、V189、S1
90、A191、A192、H193、C194、F195、D196、K19
7、I198、W201、V228、I229、I230、P231、S232
、T233、Y234、V235、P236、G237、T238、T239、
N240、H241、D242、I243、A244、L245、L246、V
281、S282、G283、W284、G285、Q286、T293、T3
24、E325、Y326、M327、F328、D338、S339、C34
0、K341、G342、D343、S344、G345、G346、P347
、H348、L358、T359、G360、I361、V362、S363、
W364、G365、C368、V376、Y377、T378、R379、V
380、Q382、Y383、W386、L387、L400およびF405(
活性部位);およびN173、A175、K199、N200、N203、D2
89、R290、G291、A292、P321およびT370(活性部位結合
裂溝のリッジ)。
【0025】 結語基の最適分布を決定するために、FVIIまたはFVIIa分子の表面に
位置するアミノ酸残基間の距離がポリペプチドの3D構造を基に計算される。よ
り具体的には、この様な結合基を含むアミノ酸残基のCB間の距離、または官能
基の一つ(リジンのNZ、アスパラギン酸のCG、グルタミン酸のCD、システ
インのSG)と結合基を含む他アミノ酸のCBとの間の距離が決定される。グリ
シンの場合、CBの代わりにCAが用いられる。本発明のコンジュゲートのFV
IIまたはFVIIaポリペプチド部分では、異種コンジュゲーションを避ける
、または軽減するために前記距離は好ましくは8Åより大きく、特には10Åよ
り大きい。 結合基が除去される例では、その様な結合基を含み、そして上記位置を占めて
いる関連アミノ酸残基は、問題の非ポリペプチド部分に関する結合基を含まない
別のアミノ酸残基により好ましく置換される。通常除去されるアミノ酸残基は、
コンジュゲーションが不都合であるアミノ酸残基、例えばポリペプチド機能部位
またはその近傍に配置するアミノ酸残基である(この様な部位をコンジュゲート
化すると、受容体認識が障害されるために、得られたコンジュゲートのFVII
またはFVIIa活性の不活性化または低下が起こる)。この関係に於いて用語
“機能部位”は、FVIIまたはFVIIaの機能または性能に必須、あるいは
別な形で関係している1またはそれ以上のアミノ酸残基を表す。この様なアミノ
酸残基は機能部位の一部である。機能部位は当分野既知の方法により決定でき、
FVIIa−組織因子複合体の構造分析により好ましく同定される(Banne
rら、Nature 1996;380:41−46参照)。 結合基導入例では、この様な基を含むアミノ酸残基がこの位置に導入され、好
ましくはこの位置を占めるアミノ酸残基の置換により導入される。
【0026】 FVIIまたはFVIIaポリペプチド内に存在し、コンジュゲーションに利
用できる結合基の正確な数は、コンジュゲーションにより得ることが望まれる効
果に依存する。目的の効果は、例えばコンジュゲーションの性質および強さに依
存する(例えば非ポリペプチド部分の個性、ポリペプチドにコンジュゲートする
ことが望まれる、または可能である非ポリペプチド部分にあって、コンジュゲー
ションすべきまたはコンジュゲーションを回避すべき成分の数)。 機能的インビボ半減期は、コンジュゲートの分子量に依存しており、従って半
減期延長に必要とされる結合基の数は問題の非ポリペプチド部分の分子量に依存
する。実施態様の一つでは、本発明のコンジュゲートは例えばLaemmli、
U.K.,Nature227巻(1970)、p680−85によるSDS−
PAGEで測定したときに、少なくとも67kDaの分子量を有し、特には少な
くとも70kDaの分子量を有している。FVIIは約53kDaの分子量を有
するため、所望効果を得るには更に10−20kDaが必要とされる。これは、
例えば2−4個の10kDaのPEG分子をコンジュゲートさせること、または
ここに記載の別の方法により提供される。 親分死の構造および機能が大きく損なわれるのを回避するために、一般にコン
ジュゲートポリペプチド部分は配列番号1と90%より高い同一性を有し、好ま
しくは95%より高い、例えば96%より高い同一性を揺する。具体的にはコン
ジュゲートのポリペプチド部分は典型的には配列番号1と97%より高い、例え
ば98%より高く、99%より高い、99.25%より高い、99.25%より
高い、または99.5%より高い同一性を有するだろう。
【0027】 アミノ酸配列相同性/同一性は、ClustalWプログラム、1.8バージ
ョン、1999年6月をデフォルトパラメータで(Thompsonら、199
4、ClustralW:Improving the sensitivit
y of progressive multiple sequence a
lignment through sequence weighting,
position−specific gap penalties and
weight matrix choice, Nucleic Acids
Research, 22:4673−4680)利用するか、PFAMファ
ミリーデータベース4.0バージョン(http://pfam.wustl.
edu/)(Nucleic Acids Res.1999年7月1;27(
1):260−2)よりGENDEDOC2.5バージョン(Nicholas
、K.B.,Nicholas H.B.Jr.,およびDeerfield,
D.W.II.1997 GeneDoc:Analysis and Vis
ualization of Genetic Variation、EMBN
EW、NEWS 4:14;Nicholas、K.B.およびNichola
s H.B.Jr.1997 GeneDoc:Analysis and V
isualization of Genetic Variation)を使
い、アラインメントした配列から簡便に決定される。
【0028】 換言すれば、本発明により変更されるアミノ酸残基の総数(配列番号1に示す
アミノ酸配列と比較した場合)は、典型的は15を越えない。好ましくは、本発
明のコンジュゲートのFVIIまたはFVIIaポリペプチド部分、または本発
明のポリペプチドは配列番号1に示すアミノ酸配列と1−15アミノ酸残基が異
なり、典型的には配列番号1に示すアミノ酸配列とは1−10または2−10の
アミノ酸残基が異なり、例えば1−8または2−8アミノ酸残基、例えば3−7
または4−6アミノ酸残基が異なる。即ち、一般には本発明のコンジュゲートの
ポリペプチド部分またはポリペプチドは配列番号1に示すアミノ酸配列とは最大
15アミノ酸残基(例えば15アミノ酸残基)、最大14アミノ酸残基(例えば
14アミノ酸残基)、最大13アミノ酸残基(例えば13アミノ酸残基)、最大
12アミノ酸残基(例えば12アミノ酸残基)、最大11アミノ酸残基(例えば
11アミノ酸残基)、最大10アミノ酸残基(例えば10アミノ酸残基)、最大
9アミノ酸残基(例えば9アミノ酸残基)、最大8アミノ酸残基(例えば8アミ
ノ酸残基)、最大7アミノ酸残基(例えば7アミノ酸残基)、最大6アミノ酸残
基(例えば6アミノ酸残基)、最大5アミノ酸残基(例えば5アミノ酸残基)、
最大4アミノ酸残基(例えば4アミノ酸残基)、最大3アミノ酸残基(例えば3
アミノ酸残基)、最大2アミノ酸残基(例えば2アミノ酸残基)異なるアミノ酸
配列を含む。
【0029】 同様に本発明のコンジュゲートは典型的には、例えば1−15非ポリペプチド
部分、典型的には1−10非ポリペプチド部分または2−10非ポリペプチド部
分、例えば1−8または2−8非ポリペプチド部分、例えば1−6、1−4、3
−7または4−6非ポリペプチド部分を含む。 好ましくは本発明のコンジュゲートは以下の改良された特性を1またはそれ以上
有する:rFVIIa(例えばNovoSevenR)に比べ長い機能的インビ
ボ半減期、長い血漿半減期、低い腎臓クリアランスおよび低い蛋白質分解に対す
る感受性。 たとえば第WO/10295号よりFVII/FVIIaの蛋白質分解は主に分
子の各種蛋白質分解部位、即ち位置K32、K38、I42、Y44、K143
、R290、R315、K341、R392、R396およびR402(または
位置K32−D33、K38−L39、I42−S43、Y44−S45、K1
43−R144、R290−G291、R315−K316、K341−K34
2、R392−R393、R396−R397およびR402−A403の間)
で起こることが分かる。即ち、例えば機能的インビボ半減期を延長するための、
長い血漿半減期を得る、あるいは蛋白質分解に対する感受性を低下させることに
関する好適ストラテジーは、親蛋白質の蛋白質分解部位、および/またはその近
傍の1またはそれ以上を、それら部位またはその近傍に非ポリペプチド部分を導
入することによって、親蛋白質を修飾することである。即ち本発明の好適実施態
様では、結合基は上記指定位置の1またはそれ以上に、または蛋白質分解に直接
関係する位置に対する位置−4、−3、−2、−1、1、2、3、4に、好まし
くは位置−2、−1、1、2、例えば−1、1に導入される。
【0030】 より具体的には、非天然型のインビボグリコシル化部位、特には非天然型イン
ビボN−グリコシル化部位(詳細以下参照)が28−48、139−147、2
86−294、311−319、338−345および388−406より成る
グループから選択される位置に導入されることが好ましい。特には、インビボN
−グリコシル化部位(詳細以下参照)の様なインビボグリコシル化部位が30−
34、36−46、141−144、288−292、313−317、341
−343、390−398および400−404より成るグループから選択され
る位置に導入されることが好ましい。より好ましくは、インビボN−グリコシル
化部位(詳細以下参照)の様なインビボグリコシル化部位が31−33(例えば
31、32、または33)、37−39(例えば位置37、38または39)、
41−46(例えば位置41、42、43、44、45または46)、142−
144(例えば位置142、143または144)、289−291(例えば位
置289、290または291)、314−316(例えば位置314、315
または316)、341−342(例えば位置341、342または343)、
391−393(例えば391、392または393)、395−397(例え
ば位置395、396または397)および401−403(例えば位置401
、402または403)より成るグループから選択される位置に導入される。こ
の導入は置換により好ましく行われる。
【0031】非ポリペプチド部分が結合基としてリジンを有する本発明のコンジュゲート 本発明の関心の実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてリジンを有
し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペプチドに供給結合された非ポリペプチ
ド部分を少なくとも1つ含むコンジュゲートであり、この場合ポリペプチドのア
ミノ酸配列は配列番号1に示す野生型FVIIまたはFVIIaの配列と、少な
くとも1つのリジン残基が導入され、または除去されている点で異なっている。 FVII/FVIIaは17個のリジン残基を含んでいる。3個のリジン残基
(K18、K62およびK85)は組織因子結合ドメイン内に位置しており、2
個のリジン残基(K197およびK341)が活性部位領域内に位置している。 親ポリペプチド内のリジン残基量が比較的高いことから、非ポリペプチド部分
への過剰なコンジュゲーションを避けるために、少なくとも1つのリジン残基が
好ましく除去すべきであり、具体的にはリジン残基の非リジン残基による置換に
より除去すべきであると考えられる。
【0032】 即ちコンジュゲートのFVIIまたはFVIIaポリペプチド部分のアミノ酸
配列は、少なくとも1つのリジン残基、例えば1−15個のリジン残基、具体的
には1−10個、1−6個、または2−4個のリジン残基が、好ましくは置換に
より除去されている点で配列番号1に示す配列と異なっている。例えば、好まし
くは置換により除去されるリジン残基は、K18、K32、K38、K62、K
85、K109、K137、K143、K148、K157、K161、K19
7、K199、K316、K337、K341、K389およびその組み合わせ
より成るグループから選択される。具体的には、組織因子結合部位および/また
は活性部位領域の一部を構成する1またはそれ以上のリジン残基、即ちK18、
K62、K85、K197、K341またはその組み合わせの残基が除去される
のが好ましい。リジン残基は、他アミノ酸残基と置換することもできるが、好ま
しくはR、Q、NまたはH,より好ましくはRと置換される。
【0033】 コンジュゲートのFVIIまたはFVIIaポリペプチド部分のアミノ酸配列
は、少なくとも1つのリジン残基、例えば1−15個のリジン残基、具体的には
1−10個、1−6個、または2−4個のリジン残基が、好ましくは置換により
導入されている点で配列番号1に示す配列と異なっている。親分視内の所定位置
に導入されるリジン残基の少なくとも1つは、上記リジン残基の除去の少なくと
も1つと組み合わされることが特に好ましいことが理解されるだろう。即ち、本
発明の好適実施態様では、コンジュゲートのFVIIまたはFVIIaポリペプ
チド部分のアミノ酸配列は、少なくとも1個のリジン残基が除去され、少なくと
も1個のリジン残基が導入されている点で、配列番号1に示された配列と異なる
【0034】 リジン残基が導入される位置の例には、上記蛋白質分解部位またはその近傍が
包含されるが、これらに限定されるものではない。即ち、好適実施態様では、リ
ジン残基による非リジン残基の置換は、I42K、Y44K、L288K、D2
89K、R290K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S3
14K、R315K、V317K、L390K、M391K、R392K、S3
93K、E394K、P395K、R396K、P397K、G398K、V3
99K、L400K、L401K、R402K、A403K、P404K、F4
05Kおよびその組み合わせより成るグループから選択され、好ましくはR29
0K、R315K、R392K、R396K、R402Kおよびその組み合わせ
より成るグループから選択される。
【0035】 本発明のこの観点によるコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、既知コンジ
ュゲーション方法を利用する場合に結合基となるリジンを有する分子であるが、
非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分子は
”ポリマー分子へのコンジュゲーション”と題する節に記載されているいずれか
の分子でよいが、好ましくは直鎖型、または分岐型ポリエチレングリコールまた
はその他ポリアルキレンオキサイドより成るグループから選択される。好適ポリ
マー分子の例は、例えばシェアウォーターポリマーズ社(Shearwater
Polymers、Inc)のSS−PEG、NPC−PEG、アルデヒド−
PEG、mPEG−SPA、mPEG−SCM、mPEG−BTC、エンゾン社
(Enzon、Inc)のSC−PEG、米国特許第5、880、255号記載
のトレシル化mPEG、またはオキシカルボニル−オキシ−N−ジカルボキシイ
ミド−PEG(米国特許第5、122、614号)である。 即ちリジン残基へのコンジュゲーションに関しては、非ポリペプチド部分は約
5ないし約20kDa、例えば約5ないし約10kDa、例えば約5kDaまた
は約10kDaの分子量を有する。 本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換はいずれかのアミノ酸の変化、好
ましくはグリコシル化部位の導入および/または除去を含む、具体的なアミノ酸
修飾を開示している本書他節に規定されている置換と組み合わせることができる
ことが理解されるだろう。
【0036】 非ポリペプチド部分が結合基としてシステインを有する本発明のコンジュゲー
ト 本発明の関心の実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてシステインを
有し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペプチドに供給結合された非ポリペプ
チド部分を少なくとも1つ含むコンジュゲートであり、この場合ポリペプチドの
アミノ酸配列は配列番号1に示す野生型FVIIまたはFVIIaの配列と、少
なくとも1つのシステイン残基が導入され、または除去されている点で異なって
いる。
【0037】 FVII/FVIIaは24個のシステイン残基を有し、以下のシステイン暗
記間にジスルフィド結合が確立されている:C17とC22、C50とC61,
C55とC70、C72とC81、C91とC102、C98とC112、C1
14とC127、C135とC262、C159とC164、C178とC19
4、C310とC329およびC340とC368。 さらに関心の実施態様では、FVIIまたはFVIIaポリペプチドのアミノ
酸配列は、すくなくとも1個のシステイン残基、例えば1−15個のシステイン
残基、具体的には1−10個、1−6個または2−4個のシステイン残基が、好
ましくは置換により、導入されている点で配列番号1に示す配列と異なっている
【0038】 システイン残基が導入される位置の例は、上記蛋白質分解部位またはその近傍
の位置を含むが、これらに限定されない。 即ち、本発明の関心の実施態様では、好ましくは置換により導入されるリジン
残基は、I30C、K32C、D33C、A34C、T37C、K38C、W4
1C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C、K143C、
R144C、L288C、D289C、R290C、G291C、A292C、
S314C、R315C、K316C、V317C、L390C、M391C、
R392C、S393C、E394C、P395C、R396C、P397C、
G398C、V399C、L401C、R402C、A403C、P404Cお
よびその組み合わせより成るグループから選択され、特にK32C、Y44C、
K143C、R290C、R315C、K341C、R392C、R396C、
R402Cおよびその組み合わせより選択される。
【0039】 本発明のさらに関心の実施態様では、システイン残基は、少なくともその側鎖
の25%が表面に露出しているスレオニンまたはセリン残基により占められてい
る野生型hFVII中の位置に導入される。例えばFVIIまたはFVIIaポ
リペプチドではシステイン残基は、好ましくは置換によりS12、S23、S4
3、S52、S53、S60、S67、T83、S103、T106、T108
、S111、S119、S126、T128、T130、S147、T185、
S214、S222、S232、T233、T238、T239、T255、T
267、T293、T307、S320、T324、S333、S336、T3
70およびT393より成るグループより選択される少なくとも1つの位置に導
入される。さらにより好ましくは、システイン残基は、その位置がS12、S2
3、S43,S45、S52、S53、S60、S67、S103、S111、
S119、S126、S147、S214、S222、S232、S320、S
333、S336およびS393より成るグループから選択される、S残基を含
むhFVIIの少なくとも1つの位置に導入される。
【0040】 別の実施態様では、システイン残基は、少なくともその側鎖の50%が表面に
露出しているスレオニンまたはセリン残基により占められている野生型hFVI
I中の位置に導入される。例えばFVIIまたはFVIIaポリペプチドではシ
ステイン残基は、好ましくは置換によりS23、S43、S52、S53、S6
0、S67、T106、T108、S111、S119、S147、S214、
T238、T267およびT293より成るグループより選択される少なくとも
1つの位置に導入され、より好ましくはS23、S43、S52、S53、S6
0、S67、S111、S119、S147およびS214より成るグループか
ら選択された位置に導入される。
【0041】 さらに別の実施態様では、システイン残基は上記位置のいずれかより選択され
た少なくとも1つの位置にあって、活性部位領域内に配置されていない位置に導
入される。好ましくは、その位置はTまたはS残基により占められている。例え
ばFVIIポリペプチドは、S12、S23、S43,S45、S52、S53
、S60、S67、T83、S103、T106、T108、S111、S11
9、S126、T128、T130、S147、T185、S214、S222
、T255,T267、T307、S320、S333、S336、T370お
よびS393(その側鎖の25%より多い部分が表面に露出している)より成る
グループから選択された、特にはS12、S23、S43,S45、S52、S
53、S60、S67、S103、S111、S119、S126、S147、
S214、S222、S320、S333、S336およびS393(S残基で
占められている)より成るグループから選択される、そしてより好ましくはS2
3、S43、S52、S53、S60、S67、T106、T108、S111
、S119、S147、S214およびT267(その側鎖の50%より多い部
分が表面に露出している)より成るグループ、特にはS23、S43、S52、
S53、S60、S67、S111、S147およびS214(S残基で占めら
れている)より成るグループから選択される少なくとも1つの部位に導入された
システインを含む。
【0042】 さらに別の実施態様では、システインは上記の何れかより選択され、そして組
織結合部位領域に位置しない少なくとも1つの位置に導入される。好ましくは、
その位置はTまたはS残基により占められている。例えばFVIIポリペプチド
は、S12、S23、S43,S45、S52、S53、S67、T83、S1
03、T106、T108、S111、S119、S126、T128、T13
0、S147、T185、S214、S222、S232、T233,T238
、T239、T255,T267、T293、S329、T324、S333、
S336、T370およびS393(その側鎖の25%より多い部分が表面に露
出している)より成るグループから選択された、特にはS12、S23、S45
、S52、S53、S67、S103、S111、S119、S126、S14
7、S214、S222、S232、S320、S333、S336およびS3
93(S残基で占められている)より成るグループから選択され、そしてより好
ましくはS23、S52、S53、S67、T106、T108、S111、S
119、S147、S214、T238、T267およびT293(その側鎖の
50%より多い部分が表面に露出している)より成るグループ、特にはS23、
S52、S53、S67、S111、S119、S147およびS214(S残
基で占められている)より成るグループから選択される少なくとも1つの部位に
導入されたシステインを含む。
【0043】 よりさらに別の実施態様では、システインは上記掲載の何れかより選択され、
そして組織結合部位領域または活性部位領域に位置しない少なくとも1つの位置
に導入される。好ましくは、その位置はTまたはS残基により占められている。
例えばFVIIポリペプチドは、S12、S23、S45、S52、S53、S
67、T83、S103、T106、T108、S111、S119、S126
、T128、T130、S147、T185、S214、S222、T255,
T267、S320、S333、S336、T370およびS393(その側鎖
の25%より多い部分が表面に露出している)より成るグループから選択された
、特にはS12、S23、S45、S52、S53、S67、S103、S11
1、S119、S126、S147、S214、S222、S320、S333
、S336およびS393(S残基で占められている)より成るグループから選
択され、そしてより好ましくはS23、S52、S53、S67、T106、T
108、S111、S119、S147、S214およびT267(その側鎖の
50%より多い部分が表面に露出している)より成るグループ、特にはS23、
S52、S53、S67、S111、S119、S147およびS214(S残
基で占められている)より成るグループから選択される少なくとも1つの部位に
導入されたシステインを含む。
【0044】 本発明のこの観点によるコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、既知コンジ
ュゲーション方法を利用する場合に結合基となるシステインを有する分子である
が、非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。このポリマー分
子は”ポリマー分子へのコンジュゲーション”と題する節に記載されているいず
れかの分子でよいが、好ましくは直鎖型、または分岐型ポリエチレングリコール
またはその他ポリアルキレンオキサイドより成るグループから選択される。特に
関心の実施態様では、ポリマー分子はVS−PEGの様なPEGである。ポリペ
プチドとポリマー間のコンジュゲーションは、好適方法、例えば”ポリマー分子
へのコンジュゲーション”と題する節に記載されている様に、例えば1段階法、
または前記の節に参照されている段階的方法を用い達成されるだろう。FVII
またはFVIIaポリペプチドがただ1個のコンジュゲート性システイン残基を
含む場合、それは約5ないし約20kDa、例えば約10kDaないし約20k
Da、例えば約5kDa、約10kDa、約12kDa、約15kDa、または
約20kDaの分子量を有する非ポリペプチドと直接に、または低分子ポリマー
(WO99/55377に開示の様な)を介し間接的に好ましくコンジュゲート
される。コンジュゲートが2またはそれより多いコンジュゲート性システイン残
基を含む場合、一般的には各非ポリペプチド部分は約5ないし約10kDaの、
例えば約5kDaまたは約10kDaの分子量を持つ。 本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、いずれかのアミノ酸の変化、
好ましくはグリコシル化部位の導入および/または除去を含む、具体的なアミノ
酸修飾を開示している本書他節に規定されている置換と組み合わせることができ
ることが理解されるだろう。
【0045】非ポリペプチド分子が結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸を有する 分子である本発明のコンジュゲート 本発明のさらに別の関心実施態様では、非ポリペプチド部分は結合基としてア
スパラギン酸またはグルタミン酸を有し、即ち本発明のコンジュゲートはポリペ
プチドに共有結合した非ポリペプチド部分を少なくとも1種含むコンジュゲート
であり、この場合ポリペプチドのアミノ酸配列は少なくとも1個のアスパラギン
酸残基および/または少なくとも1個のグルタミン酸残基が導入されているか、
または除去されている点で配列番号1に示す野生型FVIIまたはFVIIaの
配列と異なっている。 別関心実施態様では、FVIIまたはFVIIaポリペプチドのアミノ酸配列
は、少なくとも1個のアミノ酸残基および/またはグルタミン酸残基、例えば1
−15個のアスパラギン酸残基および/または少なくとも1個、特には1−10
個の、1−6個の、または2−4個のアスパラギン酸残基および/またはグルタ
ミン酸残基が、好ましくは置換により導入されている点で配列番号1に示すアミ
ノ酸配列と異なっている。 アスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基が導入される位置の例としては、
上記の蛋白質分解部位、またはその近傍が挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。
【0046】 即ち、本発明の関心実施態様では、好ましくは置換により導入されるアスパラ
ギン酸および/またはグルタミン酸残基は、I30D/E、K32D/E、A3
4D/E、T37D/E、K38D/E、W41D/E、Y44D/E、S45
D/E、D46C、L141D/E、E142D/E、K143D/E、R14
4D/E、L288D/E、R290D/E、G291D/E、A292D/E
、Q313D/E、S314D/E、R315D/E、K316D/E、V31
7D/E、L390D/E、M391D/E、R392D/E、S393D/E
、P395D/E、R396D/E、E397D/E、G398D/E、V39
9D/E、L401D/E、R402D/E、A402D/E、A403D/E
、P404D/Eおよびその組み合わせより成るグループから選択され、特には
K32D/E、Y44D/E、K143D/E、R290D/E、R315D/
E、K341D/E、R392D/E、R396D/E、R402D/Eおよび
その組み合わせより成るグループから選択される。
【0047】 上記置換に加え、上記実施態様によるコンジュゲートのポリペプチドは、少な
くとも1個のアスパラギン酸残基、および/または少なくとも1種類のグルタミ
ン酸残基の、好ましくは置換による除去を含んでもよい。 親ポリペプチドのリジン残基量が比較的多いことから、非ポリペプチド部分へ
の過剰なコンジュゲーションを回避するためには、少なくとも1個のアスパラギ
ン酸またはグルタミン酸残基が、特には置換により好ましく排除されるべきであ
る。
【0048】 即ち実施態様の一つでは、本発明のコンジュゲートのFVIIまたはFVII
aポリペプチド部分のアミノ酸配列は、少なくとも1個のアミノ酸残基および/
またはグルタミン酸残基、例えば1−15個のアスパラギン酸残基および/また
は少なくとも1個、特には1−10個の、1−6個の、または2−4個のアスパ
ラギン酸残基またはグルタミン酸残基が、好ましくは置換により導入されている
点で配列番号1に示すアミノ酸配列と異なっている。例えば、好ましくは置換に
より除去されるアスパラギン酸およびグルタミン酸残基は、D33、D46、D
48、E77、E82、D86、D87、E94、E99、D104、E116
、D123、E132、E142、E163、D196、E210、D212、
E215、D217、D219、E220、D256、E265、E270、D
289、E296、D309、D319、E325、D334、D338、D3
43、E385、E394およびその組み合わせより成るグループから選択され
る。
【0049】 親分子の所定位置に導入されるアスパラギン酸またはグルタミン酸の少なくと
も1つは、上記のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基の除去の少なくとも1
つと組み合わされと特に好ましいことが理解されるだろう。即ち、本発明の好適
実施態様では、コンジュゲートのFVIIまたはFVIIaポリペプチド部分の
アミノ酸配列は、少なくとも1個のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が、
好ましくは置換により除去され、そして少なくとも1個のアスパラギン酸または
グルタミン酸残基が置換により導入される点で、配列番号1に示す配列と異なっ
ている。 結合基としてアスパラギン酸またはグルタミン酸基を持つ、本発明のこの側面
による標識体の非ポリペプチド部分は、この様な性質を有する非ポリペプチド部
分であればよいが、ここでは非ポリペプチド部分はポリマー分子または有機誘導
剤、特にポリマー分子であり、そしてコンジュゲートは例えばSakaneとP
ardridge、Pharmaceutical Research、Vol
.14、No.8、1997、pp1085−1091記載の様に調製されるこ
とが好ましい。 本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、いずれかのアミノ酸の変化、
好ましくはグリコシル化部位の導入および/または除去を含む、具体的なアミノ
酸修飾を開示している本書他節に規定される置換と組み合わせることができるこ
とが理解されるだろう。
【0050】非ポリペプチド分子が糖成分である本発明のコンジュゲート 本発明のさらに関心実施態様では、グリコシル化部位、特にインビボグリコシ
ル化部位の様な糖成分に関する結合基が挿入および/または除去されている。 好ましくは、本発明のコンジュゲートは少なくとも1個のポリペプチドに共有結
合した糖成分を含み、そのポリペプチドのアミノ酸配列が少なくとも1個の非天
然型グリコシル化部位が導入されており、そして/または少なくとも1個の天然
型グリコシル化部位が除去されている点で配列番号1に示す野生型FVIIまた
はFVIIaのアミノ酸配列と異なっているコンジュゲートである。具体的には
、非天然型グリコシル化部位が導入されるか、または非天然型グリコシル化部位
が天然型グリコシル化部位の除去と組み合わせ導入されている。導入されたグリ
コシル化部位は、O−グリコシル化部位またはN−グリコシル化部位であろう。
好ましくは、グリコシル化部位はインビボO−グリコシル化部位、またはインビ
ボN−グリコシル化部位であり、特にはインビボN−グリコシル化部位である。 この関係で使用される場合、用語“天然型グリコシル化部位”は位置N145
、N322、S52およびS60のグリコシル化部位をカバーする。同様に、用
語“天然型インビボO−グリコシル化部位”は、N145およびN322を含む
【0051】 典型的には、FVIIまたはFVIIaポリペプチドのアミノ酸配列は、少な
くとも1個の非天然型FVIIまたはFVIIaポリペプチドのアミノ酸配列は
、少なくとも1個の非天然型グリコシル化部位(例えば少なくとも1個の非天延
型インビボN−グリコシル化部位)、例えば1−15個の非天然型グリコシル化
部位(例えば1−15個の非天然型インビボN−グリコシル化部位)、具体的に
は1−10個、1−6個、または2−4個の非天然型グリコシル化部位(例えば
1−10個、1−6個、または2−4個のインビボ非天然型グリコシル化部位)
が、好ましくは置換により導入されている点で、配列番号1に示すアミノ酸配列
と異なる。 コンジュゲートのポリペプチドが1または複数のグリコシル化部位を含んでい
るコンジュゲートを調製するには、ポリペプチドはグリコシル化部位に糖成分(
オリゴ糖)を結合できる宿主細胞内にて発現されるか、またはインビトログリコ
シル化にかけなければならない。グリコシル化宿主細胞の例は、“糖成分への結
合”と題する以下の節に示されている。
【0052】 この側面の関心実施態様では、インビボグリコシル化部位は分子表面に露出し
た、好ましくは側鎖の25%より多くが溶媒に曝される、特に好ましくは側鎖の
50%より多くが溶媒に曝されるアミノ酸残基により占められている親FVII
またはFVIIa分子の位置に導入される(これらの位置は本書方法の節に規定
されている)。次に、N−グリコシル化部位は前記部位のN−残基が前記位置に
配置される様に導入される。同様に、O−グリコシル化部位は、それら位置を形
成するSまたはT残基が前記位置に配置される用に導入される。この様な位置の
例にはK32S/T、142S/T、Y44S/T、K143S/T、R290
S/T、R315S/T、K341S/T、R392S/T、R396S/T、
R402S/Tおよびその組み合わせが含まれる。
【0053】 N−グリコシル化部位に関しては、インビボグリコシル化部位は部位形成に1
個の突然変異だけが必要とされる位置に導入される(即ち機能的グリコシル化部
位の形成に必要な他アミノ酸残基は既に分子内に存在している)。 換言すれば本発明のコンジュゲートは、ポリペプチドのアミノ酸配列が、少な
くとも1個の天然型N−X−X‘配列が、N−X’−SまたはN−X‘−T配列
により置換され、前記X’がP以外のアミノ酸であり、XがSおよびT以外のア
ミノ酸でる点で、配列番号1と異なっているコンジュゲートである。 同様に本発明のコンジュゲートは、好ましくはポリペプチドのアミノ酸配列が
、配列番号1にある少なくとも1個の天然型X−X‘−SまたはX−X’−T配
列が、N−X’−SまたはN−X‘−T配列により置換され、前記X’がP以外
のアミノ酸であり、XがN以外のアミノ酸でる点で、配列番号1と異なっている
コンジュゲートである。
【0054】 インビボN−グリコシル化部位を形成するこの様な置換の具体例としては、F
4S/T、P10N、Q21N、W41N、S43N、A51N、G58N、L
65N、G59S/T、E82S/T、N95S/T、G97S/T、Y101
N、D104N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126
N、T128N、A175S/T、G179N、I186S/T、V188N、
R202S/T、I205S/T、D212N、E220N、I230N、P2
31N、P236N、G237N、V253N、E265N、T267N、E2
70N、R277N、L280N、G291N、P303S/T、L305N、
Q312N、G318N、G331N、D334N、K337N、G342N、
H348N、R353N、Y357N、I361N、V376N、R379N、
M391Nおよびその組み合わせより成るグループから選択された置換が挙げら
れる。好ましくは、置換はF4S/T、P10N、Q21N、W41N、A51
N、G58N、G59S/T、N95S/T、G97S/T、Y101N、D1
04N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126N、T1
28N、A175S/T、I186S/T、V188N、R202S/T、I2
05S/T、D212N、E220N、V253N、E265N、T267N、
E270N、L280N、G291N、P303S/T、G318N、G331
N、D334N、K337N、R353N、Y357N、M391Nおよびその
組み合わせより成るグループから選択される。
【0055】 あるいはインビボグリコシル化部位は、リジン残基またはアルギニン残基に占
められている位置に、好ましくはリジン残基に占められている位置に、具体的に
はN−グリコシル化部位のN−残基またはO−グリコシル化部位のSまたはT残
基がリジン残基と置換する形で導入される。 別の形で表現すれば、本発明のコンジュゲートは、好ましくは、ポリペプチド
のアミノ酸配列が、配列番号1に天然に存在している、K−X‘−X配列または
R−X‘−X配列、好ましくはK−X’−X配列の少なくとも1個がN−X‘−
SまたはN−X’−T配列により置換され、前記X‘がP以外のアミノ酸であり
、XがSおよびT以外のアミノ酸である点で配列番号1と異なっているコンジュ
ゲートである。
【0056】 インビボN−グリコシル化部位を作り出すこの様な置換例は、K32N+A3
4S/T、K38N+F40S/T、K62N+Q64S/T、K85N+D8
7S/T、K137N+P139S/T、K143N+N145S/T、K14
8N+Q149S/T、K161N+E163S/T、K197N+K199S
/T、K199N+W201S/T、K316N+G318S/T、K337N
、K341N+D343S/T、K389N+M391S/Tおよびその組み合
わせより成るグループから選択される例を含む。 上記グリコシル化の側面に関するさらに関心の実施態様では、グリコシル化部
位、特にN−グリコシル化部位が上記蛋白質分解の位置、または近傍に導入され
るだろう(“本発明のコンジュゲート”と題する節参照)。
【0057】 即ち、インビボN−グリコシル化部位を作り出すこの様な置換の具体例として
は、K32N+A34S/T、F31N+D33S/T、I30N+K32S/
T、A34N+R36S/T、K38N+F40S/T、T37N+L39S/
T、R36N+K38S/T、L39N+W41S/T、F40N+I42S/
T、W41N、I42N+Y44S/T、S43N、Y44N+D46S/T、
S45N+G47S/T、D46N+D48S/T、G47N+Q49S/T、
K143N+N145S/T、E142N+R144S/T、L141N+K1
43S/T、I140N+E142S/T、R144N+A146S/T、A1
46N+K148S/T、S147N+P149S/T、R290N+A292
S/T、D289N+G291S/T、L288N+R290S/T、L287
N+D289S/T、G291N、A292N+A294S/T、T293N+
L295S/T、R315N+V317S/T、S314N+K316S/T、
Q313N+R315S/T、Q312N、K316N+G318S/T、V3
17N+D319S/T、G318N、K341N+D343S/T、S339
N+K341S/T、G342N、D343N+G345S/T、R392N+
E394S/T、M391N、L390N+R392S/T、K389N+M3
91S/T、S393N+P395S/T、E394N+R396S/T、P3
95N+P397S/T、R396N+G398S/T、P397N+V399
S/T、G398N+L400S/T、V399N+L401S/T、L400
N+R402S/T、L401N+A403S/T、R402N+P404S/
T、A403N+F405S/T、P404N+P406S/Tおよび例えばK
143N+N145S/T+R315N+V317S/Tの様なその組み合わせ
より成るグループから選択される置換を含む。好ましくは、置換はK32N+A
34S/T、K38N+F40S/T、Y44N+D46S/T、K143N+
N145S/T、R290N+A292S/T、R315N+V317S/T、
K341N+D343S/T、R392N+E394S/T、R396N+G3
98S/T、R402N+P404S/Tおよび、例えばK143N+N145
S/T+R315N+V317S/Tの様なそれらの組み合わせより成るグルー
プから選択される。より好ましくは、置換はK32N+A34T、K38N+F
40T、Y44N+D46T、K143N+N145T、R290N+A292
T、R315N+V317T、341N+D343T、R392N+E394T
、R396N+G398T、R402N+P404TおよびK143N+N14
5T+R315N+V317Tの様な、それらの組み合わせから成るグループよ
り選択される。
【0058】 本発明のよりさらに関心の実施態様では、インビボグリコシル化部位は、ここ
に規定される組織因子結合部分を形成しない、または活性部位領域と活性部位結
合裂溝のリッジを形成しない位置に導入されるのが好ましい。この様なグリコシ
ル化変異体は一次的には前記規定の活性コンジュゲートに分類されると考えられ
る。 即ちこの様なインビボN−グリコシル化部位を形成する具体的置換例は、K3
2N+A34S/T、I30N+K32S/T、A34N+R36S/T、K3
8N+F40S/T、T37N+L39S/T、W41N、Y44N+D46S
/T、S45N+G47S/T、D46N+D48S/T、G47N+Q49S
/T、K143N+N145S/T、E142N+R144S/T、L141N
+K143S/T、I140N+E142S/T、R144N+A146S/T
、A146N+K148S/T、S147N+P149S/T、L288N+R
290S/T、L287N+D289S/T、R315N+V317S/T、S
314N+K316S/T、K316N+G318S/T、V317N+D31
9S/T、G318N、R392N+E394S/T、M391N、L390N
+R392S/T、K389N+M391S/T、S393N+P395S/T
、E394N+R396S/T、P395N+P397S/T、R396N+G
398S/T、P397N+V399S/T、G398N+L400S/T、V
399N+L401S/T、L401N+A403S/T、R402N+P40
4S/T、A403N+F405S/T、P404N+P406S/Tおよび例
えばK143N+N145S/T+R315N+V317S/Tの様なその組み
合わせより成るグループから選択される置換を含む。好ましくは、置換はK32
N+A34S/T、K38N+F40S/T、Y44N+D46S/T、K14
3N+N145S/T、R315N+V317S/T、R392N+E394S
/T、R396N+G398S/T、R402N+P404S/Tおよび、例え
ばK143N+N145S/T+R315N+V317S/Tの様なそれらの組
み合わせより成るグループから選択される。より好ましくは、置換はK32N+
A34T、K38N+F40T、Y44N+D46T、K143N+N145T
、R315N+V317T、R392N+E394T、R396N+G398T
、R402N+P404TおよびK143N+N145T+R315N+V31
7Tの様な、それらの組み合わせから成るグループより選択される。
【0059】 本発明のよりさらに関心の実施態様では、インビボグリコシル化部位は、ここ
に規定される組織因子結合部分を形成しないが、活性部位領域と活性部位結合裂
溝のリッジを形成する位置に導入されるのが好ましい。この様なグリコシル化変
異体は一次的には前記規定の不活性コンジュゲートに分類されると考えられる。
即ちこの様なインビボN−グリコシル化部位を形成する具体的置換例は、I15
3N+G155S/T、Q167N+L169S/T、V168N+L170S
/T、L169N+L171S/T、L170N+V172S/T、L171N
+N173S/T、A175S/T、A175N+L170S/T、L177N
+G179S/T、G179N、G180N+L182S/T、T181N+I
183S/T、V188N、V189N+A191S/T、S190N+A19
2S/T、A191N+H193S/T、H193N+F195S/T、F19
5N+K197S/T、D196N+I198S/T、K197N+K199S
/T、I198N+N200S/T、K199N+W201S/T、W201N
+N203S/T、R202S/T、I205S/T、V228N+I230S
/T、I229N+P231S/T、I230N、P231N、S232N+Y
234S/T、T233N+V235S/T、Y234N+P236S/T、V
235N+G237S/T、P236N、G237N、T238N+N240S
/T、T239N+H241S/T、H241N+I243S/T、D242S
/T、I243N+L245S/T、A244N+L246S/T、L245N
+R247S/T、L246N+L246S/T、V281N+G283S/T
、S282N+W284S/T、G283N+G285S/T、W284N+Q
286S/T、G285N+L287S/T、Q286N+L288S/T、D
289N+G291S/T、R290N+A292S/T、G291N、A29
2N+A294S/T、T293N+L295S/T、T321N+I323S
/T、T324N+Y326S/T、E325N+M327S/T、Y326N
+F327S/T、F328N+A330S/T、S339N+K341S/T
、K341N+D343S/T、G342N+S344S/T、D343N+G
345S/T、S344N+G346S/T、G345N+P347S/T、P
347N+A349S/T、H348N、L358N+G360S/T、T35
9N+I361S/T、G360N+V362S/T、I361N、V362N
+W364S/T、S363N+G365S/T、W364N+Q366S/T
、G365N+G367S/T、T370N+G372S/T、V376N、Y
377N+R379S/T、T378N+V380S/T、R379N、V38
0N+Q382S/T、Q382N+I384S/T、Y383N+E385S
/T、W386N+Q388S/T、L387N+K389S/T、L400N
+R402S/Tおよびその組み合わせより成るグループから選択される置換を
含む。好ましくは、置換はD289N+G291S/T、R290N+A292
S/T、G291N、A292N+A294S/T、T293N+L295S/
T、S339N+K341S/T、K341N+D343S/T、G342N+
S344S/T、D343N+G345S/Tおよびその組み合わせより成るグ
ループから選択される。より好ましくは、置換はD289N+G291T、R2
90N+A292T、G291N、A292N+A294T、T293N+L2
95T、S339N+K341T、K341N+D343T、G342N+S3
44T、D343N+G345Tおよびその組み合わせより成るグループから選
択される。
【0060】 糖成分に加え、本節記載の本発明の側面によるコンジュゲートは、本出願書記
載の如く、コンジュゲートのポリペプチド部分に存在する1またそれ以上の結合
基にコンジュゲートする追加の非ポリペプチド部分、特にポリマーを含んでも良
い。 本節に規定されるアミノ酸の変化、特に置換は、具体的なアミノ酸の変化を開示
している本書他節規定のアミノ酸の変化、特に置換と組み合わせることができる
ことが理解されるだろう。 例えば、置換R315N+V317Tおよび/またはK143N+N145T
を含む変異の様な、少なくとも1カ所のグリコシル化部位が導入され、そして/
または除去された本節開示のグリコシル化変異体は、さらにPEGの様なポリマ
ー分子、またはその他非ポリペプチド部分とコンジュゲートさせてもよい。この
目的に関しては、コンジュゲーションはFVIIまたはFVIIaポリペプチド
に存在している結合基を利用し達成するか、または結合基を具体的には合計1−
6個、特には3−4個、または1、2、3、4、5あるいは6個の結合基がコン
ジュゲーションに利用できる様に導入および/または除去してもよい。 好ましくはFVIIまたはFVIIaポリペプチドが2カ所のグリコシル化部
位を含んでいる本発明のコンジュゲートでは、非ポリペプチド部分の数および分
子量は、非ポリペプチド部分により加えられる合計分子量が5−25kDaの範
囲、例えば10−25kDa、特には約5kDa、約12kDa、約15kDa
または約20kDaである用に選ばれる。
【0061】不活性コンジュゲート 本発明のコンジュゲートは、配列番号1のR152、I153、S344、D
242およびH193より成るグループから選択された位置を占める少なくとも
1つのアミノ酸残基を除去することで不活性化される。この除去は、上記アミノ
酸残基の1またはそれ以上を置換、または欠失することで実行される。好ましく
は、この除去は置換、特には保存的置換により実施される。従ってここで使用さ
れる不活性型FVIIまたはFVIIaポリペプチドは、以下の置換を1または
それ以上含む:Xがいずれかのアミノ酸残基、好ましくは保存的置換を生ずるい
ずれかのアミノ酸残基であるR152X、I153X、S344X、D242X
またはH193X。例えば不活性型FVIIまたはFVIIaポリペプチドは、
Xがリジン以外のいずれかのアミノ酸残基である(リジンはプロテアーゼ切断部
位を形成する)突然変異R152Xを含む。その他具体的置換例としてはI15
3A/V/L;S344T/A/G/Y;D242E/Aおよび/またはH19
3R/Aが挙げられる。
【0062】 あるいは、活性型FVIIまたはFVIIaポリペプチドは、α−アミノ基I
153をカルバミル化すること、またはポリペプチドをセリンプロテアーゼ阻害
剤と複合体化することで不活性化することができる。好適セリンプロテアーゼ阻
害剤は、例えば有機リン酸化合物、スルファニルフルオリド、ペプチドハロメチ
ルケトンより成るグループから選択され、好ましくはダンシル−Phe−Pro
−Arg−クロルメチルケトン、デンシル−Glu−Glu−Argクロルメチ
ルケトン、ダンシル−Phe−Phe−ArgクロルメチルケトンまたはPhe
−Phe−Argクロルメチルケトンまたはアザペプチドである。 コンジュゲートはまた、続くグリコシル化がコンジュゲートを不活性化する用に
選択された位置に少なくとも1カ所のグリコシル化部位を導入することで、不活
性化してもよい。 上記“非ポリペプチド部分が糖成分である本発明のコンジュゲート”と題する
節の最終部分に説明されている様に、この様なグリコシル化部位はここに規定さ
れる組織因子の一部を形成しないが、活性部位領域および活性部位結合裂溝のリ
ッジ部分を形成する位置に導入されることが好ましい。好適置換の具体例は、上
記“非ポリペプチド部分が糖成分である本発明のコンジュゲート”と題する節“
に示されている。
【0063】本発明コンジュゲートの非ポリペプチド部分 上記詳細示した通り、本発明のコンジュゲートの非ポリペプチド部分は、ポリ
マー分子、親油性化合物、糖成分(インビボグリコシレーションを経て)および
有機誘導化作用物質より成るグループから好ましく選択される。これら作用物質
は全て、コンジュゲートのポリペプチド部分に望まれる特性を付与し、特に長い
機能的インビボ半減期および/または長い血漿半減期を与える。コンジュゲート
のポリペプチド部分は一般的には1種類の非ポリペプチド部分とのみコンジュゲ
ートされるが、2またはそれ以上の種類の非ポリペプチド部分、例えばポリマー
分子と糖成分、親油基と糖成分、有機誘導化作用物質と糖成分、親油基とポリマ
ー分子等とコンジュゲートしてもよい。2またはそれ以上の種類の非ポリペプチ
ド部分へのコンジュゲートは同時または連続的に実施されるだろう。
【0064】本発明のコンジュゲートの調製方法 次節“親油性化合物へのコンジュゲート”、“ポリマー分子へのコンジュゲー
ト”、“糖成分へのコンジュゲート”および“有機誘導化作用物質へのコンジュ
ゲート”では、具体的種類の非ポリペプチド部分へのコンジュゲートが記載され
ている。一般的には、本発明のポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドの
発生を誘導する条件の下に適当な宿主細胞を培養すること、およびポリペプチド
を回収することにより生成されるが、この場合a)ポリペプチドは少なくとも1
カ所のN−またはO−グリコシル化部位を有し、そして宿主細胞はインビボグリ
コシル化ができる真核生物宿主細胞であり、そして/またはb)ポリペプチドは
インビトロで非ポリペプチド部分にコンジュゲートされる。 コンジュゲートは結合された非ポリペプチド部分の数、生成された分子の大き
さおよび形状(例えばそれらが直鎖状か分岐状か)、およびポリペプチド中の結
合部位に関し最適な分子が生成されるよう設計されなければならない。使用され
る非ポリペプチド部分の分子量は、例えば達成すべき所望作用に基づき選択され
る。例えば、コンジュゲートの主目的が高分子量のコンジュゲートを達成するこ
とであれば(例えば腎臓クリアランスを下げるために)、通常可能な限り少数の
高分子型非ポリペプチド部分をコンジュゲートさせ、所望分子量を得ることが望
ましい。高いシールディングが望まれる場合、それは十分な数の低分子型非ポリ
ペプチド部分(例えば分子量が約300Daないし約5kDa、例えば分子量が
300Daないし2kDaのもの)を用い、ポリペプチドの全て、または殆ど全
てのプロテアーゼ切断部位またはその他脆弱部位を効果的にシールドすることで
得られる。
【0065】脂肪親和性化合物のコンジュゲート ポリペプチドおよび脂肪親和性化合物は直接またはリンカーを利用し、相互に
コンジュゲートされる。脂肪親和性化合物は飽和型または不飽和型脂肪酸、脂肪
酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミン、カロテノイドまたはス
テロイドの様な天然化合物、または1またはそれ以上のアルキル、アリール、ア
ルケニルまたはその他複数の不飽和型化合物を有する炭素酸、アルコール、アミ
ンおよびスルホン酸の様な合成化合物である。随意リンカーを使用する、ポリペ
プチドおよび脂肪親和性化合物間のコンジュゲートは、当分野既知の方法、例え
ばPeptide Synthesis、John Wiley、New Yo
rk、1976にBodanszkyにより記載さた、およびWO96/125
05に記載の方法に従い行われる。
【0066】ポリペプチドのN−末端にポリマー分子をコンジュゲートさせることを含む、ポ リマー分子へのコンジュゲート ポリペプチドにコンジュゲートされるポリマー分子は、典型的には分子量が約
300−100,000Daの範囲、例えば約500−20,000Da,より
好ましくは約500−15,000Da、さらにより好ましくは約2−12Kd
aの範囲、例えば約3−10kDaの範囲にある天然または合成ホモポリマーま
たはヘテロポリマーの様な好適ポリマーである。ここで用語”約”が特定の分子
量と結びつけられて用いられる場合、語”約”はおおよその平均分子量を示して
おり、そのポリマー標本にはある分子量分布が通常あるという事実を反映してい
る。 ホモポリマーの例にはポリオール(即ちポリ−OH)、ポリアミン(即ちポリ
−NH2)およびポリカルボン酸(即ちポリ−COOH)が含まれる。ヘテロポ
リマーは、例えばヒドロキシル基とアミン基のように異なる結合基を含むポリマ
ーである。
【0067】 好適ポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール(PEG)やポリプロピ
レングリコール(PPG)の様なポリアルキレングリコール(PAG)を含むポ
リアルキレンオキサイド(PAO)、分岐型PEGs、ポリ−ビニルアルコール
(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリ−(ビニルプロピリドン)、ポリエチ
レン−コ−無水マレイン酸、カルボキシメチル−デキストランを含むデキストラ
ン、または免疫原性を下げること、および/または機能的インビボ半減期および
/または血清半減期を上昇させることに適したその他バイオポリマーが含まれる
。ポリマー分子のその他の例はヒトアルブミン、またはその他豊富な血漿蛋白質
である。一般にポリアルキレングリコール誘導ポリマーは生体適合性の無毒、無
抗原性、無免疫原性であり、様々な水溶特性を有し、生物から容易に排泄される
。 PEGは例えばデキストランの様な多糖類に比べると架橋結合する可能性のあ
る反応基がごく僅かであることから、好適なポリマー分子である。具体的には単
官能性PEG、例えばメトキシポリエチレングリコール(mPEG)は、その結
合化学が比較的単純(ポリペプチドの結合基とコンジュゲートできる反応基が1
つのみ)であることから、興味深い。従って、架橋形成のリスクが無くなり、生
じるポリペプチドコンジュゲートはより均一であり、ポリマー分子とポリペプチ
ドとの反応はより簡単に制御される。
【0068】 ポリペプチドへのポリマー分子の共有結合させるために、ポリマー分子のヒド
ロキシル末端基は活性型にならねばならず、即ち反応性官能基(例としては1次
アミノ基、ヒドラジド(HZ)、チオール、琥珀酸エステル(SUC)、スクシ
ンイミジル琥珀酸エステル(SS)、スクシンイミジルスクシナミド(SSA)
、スクシンイミジルプロプリオネート(SPA)、スクシンイミジカルボキシメ
チレート(SCM)、ベンゾトリアゾール炭酸エステル(BTC)、N−ヒドロ
キシスクシンイミド(NHS)、アルデヒド、ニトロフェニルカルボン酸エステ
ル(NPC)およびトレシレート(TRES)が挙げられる)が提供されなけれ
ばならない。好適活性型ポリマー分子は、例えばShearwater Pol
ymers、Inc.,Huntsville、AL、米国またはPolyMA
SC Pharmaceuticals plc、英国より市販されている。 あるいはポリマー分子は当業界既知の通常の方法、例えばWO90/13540
に開示の方法により活性化することができる。本発明に使用できる活性化直鎖ま
たは分岐型ポリマー分子の具体例は、Shearwater Polymers
、Inc.1997および2000年版カタログ(参照されここに取り込まれて
いるFunctionalized Biocompatible Polym
ers for Research and pharmaceutical、
Polyethylene Glycol and Derivatives)
に記載されている。活性化PEGポリマーの具体例としては、次の直鎖型PEG
sが挙げられる:NHS−PEG(例えばSPA−PEG、SSPA−PEG、
SBA−PEG、SS−PEG、SSA−PEG、SC−PEG、SG−PEG
およびSCM−PEG)およびNOR−PEG、BTC−PEG、EPOX−P
EG、NCO−PEG、NPC−PEG、CDI−PEG、ALD−PEG、T
RES−PEG、VS−PEG、IODO−PEGおよびMAL−PEG、なら
びに例えばPEG2−NESや共に参照されここに取り込まれている米国特許第
5,932,462号および米国特許第5,643、575号に記載の分岐型P
EGが挙げられる。さらに参照されここに取り込まれている次の公開物も有益な
ポリマー分子および/またはPEG化化学を開示している:米国特許第5,82
4,778号、米国特許第5,476,653号、WO97/32607号、欧
州特許第229、108号、欧州特許第402,378号、米国特許第4,90
2、502号、米国特許第5,281,698号、米国特許第5,122,61
4号、米国特許第5,219,564号、WO92/16555、WO94/0
4193、WO94/14758、WO94/17039、WO94/1824
7、WO94/28024、WO95/00162、WO95/11924、W
O95/13090、WO95/33490、WO95/33490、WO96
/00080、WO97/18832、WO98/41562、WO98/48
837、WO99/32134、WO99/32139、WO99/32140
、WO96/40791、WO98/32466、WO95/06058、欧州
特許第439 508号、WO97/03106、WO96/21469、WO
95/13312、欧州特許第921 131号、米国特許第5、736、62
5号、WO98/05363、欧州特許第809 996号、米国特許第5,6
29,384号、WO96/41813、WO96/07670、米国特許第5
,473,034号、米国特許第5,516,673号、欧州特許第605,9
63号、米国特許第5,382,657号、欧州特許第510 356号、欧州
特許第400 472号、欧州特許第183 503号および欧州特許第154
316号。
【0069】 ポリペプチドおよび活性化ポリマー分子のコンジュゲートは、例えば次の参考
資料(ポリマー分子の活性化に関する好適方法も記載している)に開示されてい
る様な通常の方法を用い、行われる:R.F.Taylor、(1991)、“
蛋白質固定化。基礎と応用(Protein immobilisation.
Fundametnal and applications)”、マクセルデ
ッカー(Marcel Dekker)、ニューヨーク(N.Y.),;S.S
.Wong、(1992)、“蛋白質のコンジュゲーションと架橋の化学(Ch
emistry of Protein Conjugation and C
rosslinking”、CRCプレス(Press)、フロリダ(Flor
ida)、米国(USA);G.T.Hermansonら、(1993)、“
固定化親和性リガンド技術(Immobilized Affinity Li
gand Techniques)”、アカデミックプレス(Academic
Press)、ニューヨーク(N.Y.))。当業者は使用する活性化法およ
び/またはコンジュゲート化学がポリペプチドの結合基(上記詳細の例)および
ポリマーの官能基(例えばアミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、
スルフィドリル、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルフォン、またはハ
ロ酢酸エステルの様な)に依存することに気付くだろう。PEG化はポリペプチ
ドのあらゆる利用可能な基(即ちポリペプチドの表面に露出している結合基)へ
のコンジュゲートを目的とするか、あるいは1またはそれ以上の特異的結合基、
例えば米国特許5,985,265号記載のN−末端アミノ基に向けられている
。さらに、コンジュゲートは1段階または段階的に行うことができる(例えばW
O99/55377号記載の様に)。
【0070】 PEG化は、結合するPEG分子の数、その様な分子の大きさおよび形状(例
えばそれらが直鎖状または分岐状か)、およびポリペプチド内での結合部位に関
し最適な分子を生成する様にデザインされる。使用するポリマーの分子量は、例
えば得ようとする所望効果に基づき選択される。例えば、コンジュゲートの主目
的が高分子量を持つコンジュゲートを得ることである場合には(例えば腎臓クリ
アランスを下げるために)、所望分子量を得るためには通常可能な限り小数の高
分子量のポリマーをコンジュゲートすることが望まれる。高いシールディングが
望まれる場合、それは十分な数の低分子型非ポリペプチド部分(例えば分子量が
約300Daないし約5kDaを持つもの)を用い、ポリペプチドの全て、また
は殆ど全てのプロテアーゼ切断部位またはその他脆弱部位を効果的にシールドす
ることで得られる。例えば2−8種類、例えば3−6種類のポリマーが用いられ
る。 蛋白質の単一結合基(例えばN−末端のアミノ基)にだけコンジュゲートさせ
る場合には、直鎖型または分岐型であるポリマー分子は高分子量、好ましくは約
10−25kDa、例えば約15−25kDa、例えば約20kDaの分子量を
持つことが好都合である。 一般に、ポリマーコンジュゲートは利用可能なポリマー結合基の多くがポリマ
ー分子と結合することを狙った条件の下に、実施される。これは、ポリペプチド
に対し好適なモル過剰量のポリマーを使うことで達成される。典型的には、ポリ
ペプチドに対する活性化ポリマー分子のモル比は約1000−1までであり、例
えば約200−1、または約100−1までである。しかし幾つかの例では、最
適反応を得るためのこの比率は若干低く、例えば約50−1、10−1、または
5−1である。
【0071】 本発明ではまた、リンカーを介しポリペプチドにポリマー分子を結合させるこ
とも想定される。好適リンカーは当業者周知である。高適例は塩化シアヌール酸
である(Abuchowskiら、(1977)、J.Biol.Chem.,
252、3578−3581;米国特許第4,179,337号;Shafer
ら、(1986)、J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.,
24,375−378)。 コンジュゲートに続き残存活性化ポリマー分子が当該分野既知の方法、例えば
一次アミンを反応混合液に加えることでブロックされ、そして得られた不活性化
ポリマー分子は好適方法により除かれる。 例えばポリペプチドのアミノ酸配列、使用する活性化PEG化合物の性質、お
よびポリペプチドに対するPEGのモル比を含む具体的なPEG化条件といった
条件に応じ多様な強さでPEG化することができ、そして一般には高度のPEG
化はポリペプチドに対するPEG比が高い場合に得られることが理解されるだろ
う。しかし特定のPEG化工程より生じたPEG化ポリペプチドは、一般にPE
G化の程度が若干異なるポリペプチドコンジュゲートが確率的に分布したものを
含む。 本発明の関心実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートは、配列番
号1に示す野生型FVIIまたはFVIIaポリペプチドのA1N末端に共有結
合したポリマーを含み、この場合前記ポリマー分子はポリペプチドに結合したポ
リマーポリペプチドのみである。好ましくは、この様なポリペプチドコンジュゲ
ートは、ポリペプチドのN−末端に結合した単一PEG分子を含み、その他PE
G分子は含まないコンジュゲートである。具体的には分子量が少なくとも約5k
Da、特には約10−25kDa、例えば約15−25kDa,例えば約20k
Daの直鎖型または分岐型PEG分子が好ましい。本実施態様によるポリペプチ
ドコンジュゲートは、さらにポリペプチドのN−結合またはO−結合グリコシル
化部位に結合した1またはそれ以上の糖成分、またはインビトログリコシル化に
より結合された糖成分を含む。
【0072】 本発明のさらに関心の実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートは
配列番号1に示す野生型FViiaポリペプチドのA1N−末端およびI153
N−末端に共有結合したポリマー分子を含み、この場合前記ポリマー分子はポリ
ペプチドに結合したポリマー分子のみである。好ましくはこの様なポリペプチド
コンジュゲートは、FVIIaの両N−末端に結合したPEG分子を含むが、他
のPEG分子は含まないコンジュゲートである。具体的には、分子量が少なくと
も約5kDa、特にはは約10−25kDa、例えば約15−25kDa,例え
ば約20kDaの直鎖型または分岐型PEG分子が好ましい。本実施態様による
ポリペプチドコンジュゲートは、さらにポリペプチドのN−結合またはO−結合
グリコシル化部位に結合した1またはそれ以上の糖成分、またはインビトログリ
コシル化により結合された糖成分を含む。 PEG分子の様なポリマー分子をポリペプチドのN−末端に選択的に結合させ
る好適方法の一つは、米国特許第5、985、265号に開示の方法である。こ
の方法は、還元性アルキル化(ポリペプチドのN−末端アミノ基を、NaCNB
3の様な還元剤存在下にアルデヒド−PEGの様なアルデヒド含有ポリペプチ
ドと反応させる)を含む。この方法はポリペプチドの誘導化に利用可能な異なる
タイプの一次アミノ基(リジン対N−末端)の示差的反応性を利用し、それによ
りアルデヒド−PEGの様なカルボニル基含有ポリマー分子でN−末端にあるポ
リペプチドを実質選択的に誘導化する。この反応は、リジン残基のε−アミノ基
間のpKa差とポリペプチドのN−末端残基のα−アミノ基とのpKa差が利用可
能なpHで実施される。この示差的反応性を実現するために、反応は一般に若干
酸性の条件で行われる。好適pH域の具体例としては、pH4.5−7、例えば
pH4.5−6、例えばpH5−6、特には約pH5が挙げられる。
【0073】 別の特異的実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートはPEG化に
利用可能なポリペプチド中の各リジン残基に結合したPEG分子、具体的には、
たとえば分子量約1−15kDa、典型的には約2−12kDa、例えば3−1
0kDa、例えば約5または6kDaの直鎖状または分岐状PEG分子を含む。
さらに別の実施態様では、本発明のポリペプチドコンジュゲートはPEG化に利
用可能なポリペプチド中の各リジン残基に加え、さらにポリペプチドのN−末端
アミノ酸残基に結合したPEG分子分子を含む。 ポリペプチドのアミノ酸残基への炭水化物成分(例えばデキストラン)のイン
ビトロ共有結合、例えば第WO87/05330号およびAplinら、CRC
Crit Rev.Biochem,pp.259−306、1981に記載
の様なインビトロ共有結合も利用される。炭水化物成分または蛋白質−およびペ
プチド−結合Gln残基へのインビトロ結合は、トランスグルタミナーゼ(TG
ase)により行うことができる。トランスグルタミナーゼは所謂架橋反応での
、ドナーアミン基の蛋白質−およびペプチド−結合Gln残基への転移を触媒す
る。ドナーアミン基は、Lys−残基中のε−アミノ基の様な蛋白質−またはペ
プチド結合であるか、または小または大有機分子の一部である。TGase触媒
架橋反応に於いてアミノドナーとして機能する小有機分子の例はプトレシン(1
,4−ジアミノブタン)である。TGase触媒架橋反応に於いてアミノドナー
として機能するより大型の有機分子の例は、アミン含有PEGである(Sato
ら、1996、Biochemistry 35、13072−13080)。
【0074】 一般にTGasesは高度に特異的な酵素であり、蛋白質表面に露出している
全てのGln−残基がアミノ含有物質へのTGase触媒架橋反応に関与するわ
けではない。これに対し、極僅かなGln−残基はそのままのかたちでTGas
e基質として機能するが、どのGln−残基が良好なTGase基質になるかを
制御している正確なパラメータは不明である。即ち、蛋白質をTGase触媒架
橋反応に反応できるようにするために、TGase基質として非常によく機能す
ることが知られているアミノ酸好配列のストレッチを好都合な位置に加える必要
があること多々ある。複数のアミノ酸配列が良好な天然TGase基質であるか
、またはそれを含むことが知られており、例えばサブスタンスP,エラフィン、
フィブリノーゲン、フィブロネクチン、α2−プラスミン阻害剤、α−カゼイン
、およびβ−カゼインがそれである。
【0075】糖成分への結合 1またはそれ以上のグリコシル化部位を含むFVII分子をインビボグリコシ
ル化するには、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列をグリコシル化
している真核生物発現宿主内に挿入しなければならない。発現宿主細胞は真菌(
糸状菌または酵母)、昆虫または動物細胞、あるいはトランスジェニック植物細
胞より選択される。実施態様の一つでは、宿主細胞はCHO細胞、BHK、また
はHEK、例えばHEK293細胞、またはSF9細胞の様な昆虫細胞、あるい
はS.cerevisiaeもしくはPichia pastorisの様な酵
母細胞、または以下記すいずれかの宿主細胞である。
【0076】有機誘導化作用物質への結合 ポリペプチドの共有修飾は、ポリペプチドの1またはそれ以上の結合基と有機
誘導化作用物質とを反応させることで行われる。好適誘導化作用物質および方法
は当該分野周知である。例えばシステイニル残基は、最も一般的にはクロロ酢酸
またはクロロアセトアミドの様なαハロアセテート(および対応するアミン類)
と反応し、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。シ
ステイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−(4−
イミドゾイル)プロピオン酸、クロロアセチルリン酸、N−アルキルマレイミド
、3−ニトロ−2−ピリジルジスルフィド、メチル2−ピリジルジスルフィド、
p−クロロマーキュリベンゾエート、2−塩化水銀−4−ニトロフェノール、ま
たはクロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾールと反応し、誘
導化される。ジエチルピロカーボネートが比較的ヒスチジル側鎖に特異的である
ことから、ヒスチジル残基はpH5.5−7.0にてジエチルピロカーボネート
と反応し誘導化される。パラ−ブロモフェンアシルブロマイドも有益である。反
応はpH6.0にて0.1Mカコジル酸ナトリウム中にて好ましく行われる。リ
ジンおよびアミノ末端残基は、コハク酸またはその他無水カルボン酸と反応させ
られる。これら作用物質による誘導化は、リシニル残基の電荷を逆転する効果を
持っている。その他α−アミノ−含有残基を誘導化するのに好適な試薬としては
、メチルピコリンイミド、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロ
ヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、O−メチルイソ尿素、2,4−ペン
タンジオンの様なイミドエステル、およびグリコしレートとのトランスアミナー
ゼ−触媒反応が含まれる。アルギニル残基は、1または複数の通常試薬、とりわ
けフェニルグリオキサール、2,3−ブタンジオン、1,2−シクロヘキサンジ
オン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導化
には、グアニジン官能基のpKaが高いことからアルカリ条件下で反応を行う必要
がある。
【0077】 さらにこれら試薬は、リジンの基ならびにアルギニングアニジド基と反応する
。カルボキシル側基(アスパチルまたはグルタミル)は、カルボジイミド(R−
N=C=N−R‘)との反応で選択的に修飾される(前記式中のRおよびR’は
、1−シクロヘキシル−3−(2−モルフォリニル−4−エチル)カルボジイミ
ドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4、4−ジメチルフェニル)カルボ
ジイミドのような異なるアルキルである)。さらにアスパチルまたはグルタミル
残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残
基に変換される。
【0078】官能部位のブロッキング 過剰なポリマーコンジュゲートは、非ポリペプチド部分がコンジュゲートする
ことで、ポリペプチドの活性の消失を招くことがあると報告されている。この問
題は、例えば官能部位に局在する結合基を除くこと、またはコンジュゲート前に
官能部位を可逆的にブロッキングし、コンジュゲート中官能部位を遮蔽すること
で解消できる。後者の考え方は、本発明の更なる実施態様を構成する(最初の方
策は例えば官能部位に近傍に配置されるリジン残基を除くことにより、上記にさ
らに例示されて)。より具体的には、第2の方策ではポリペプチドと非ポリペプ
チド部分間のコンジュゲートは、ポリペプチド官能部位が補助分子、例えばポリ
ペプチドの官能部位に結合できる組織因子、またはセリンプロテアーゼ阻害剤に
より遮蔽される条件下に実施される。 好ましくは、補助分子は受容体の様なポリペプチド官能基を特異的に認識する
分子、具体的には完全長または適当に切断された組織因子の様な組織因子、ある
いは1つが組織因子でありもう一方が触媒トライアッド周辺域(触媒トライアッ
ド内原子から10Åの範囲にあるアミノ酸として好ましく規定される)に結合し
、それを保護するペプチドまたはペプチド阻害剤である2分子である。 あるいは補助分子は抗体、特にはFVIIポリペプチドを認識するモノクロー
ナル抗体である。具体的には補助分子は、中和モノクローナル抗体である。 ポリペプチドはコンジュゲートする前に補助分子と相互作用させられる。これ
によりポリペプチドの官能部位は確実に遮蔽または保護され、その結果ポリマー
の様な非ポリペプチド部分による誘導化を受けなくなる。補助分子より溶出する
ことで、非ポリペプチド部分とポリペプチドとのコンジュゲートは、少なくとも
部分的に保存された官能部位を持つかたちで回収できる。 遮蔽された官能部位を持つポリペプチドをその後、ポリマー、脂肪親和性化合
物、糖成分、有機誘導化作用物質またはその他化合物とコンジュゲートさせるこ
とは、“..へのコンジュゲート”と題する上記節に記載されている一般的方法
により実施される。
【0079】 コンジュゲートからポリペプチド官能部位を遮蔽するために使用される補助分
子の性質とは無関係に、補助分子は分子の中に非ポリペプチド部分に関する結合
基を全く持たないか、または殆ど持たないことが望ましく、この様な基へのコン
ジュゲートは補助分子からのコンジュゲートポリペプチドの脱着を妨げる。こう
することでポリペプチドの非遮蔽部分にある結合基への選択的コンジュゲートが
得られ、コンジュゲートの反復サイクルに補助分子を再使用することが可能とな
る。例えば、非ポリペプチド部分が結合基としてリジンまたはN−末端アミノ酸
残基のイプシロンアミノ基を持つPEGの様なポリマー分子である場合には、補
助分子は本質的にイプシロンアミノ基を持たないことが望ましく、好ましくはい
ずれのイプシロンアミノ基も持たない。即ち、好適実施態様では、補助分子はポ
リペプチドの官能部位に結合できる蛋白質またはペプチドであり、前記蛋白質ま
たはポリペプチドは選択した非ポリペプチド部分に対しコンジュゲート可能な結
合基を持たない。
【0080】 さらなる実施態様では、補助分子はまずカラム充填物質、例えばセファデック
ス(Sephadex)またはアガロースビーズの様な固相、または反応容器の
様な表面に共有結合される。続いてポリペプチドが補助分子を有するカラム材料
に加えられ、当該分野既知の方法、例えば“..へのコンジュゲート”と題する
上記節に記載されている方法によりコンジュゲートが行われる。この作業によっ
て、溶出により補助分子からポリペプチドコンジュゲートを分離することができ
る。ポリペプチドコンジュゲートは、ポリペプチドの本質的な分解を招くことの
ない物理−化学的条件下に、通常の技術により溶出される。ポリペプチドコンジ
ュゲートを含む液相は、補助分子が共有結合し続ける固相から分離される。分離
はその他の方法でも行うことができる:例えば補助分子は、特定結合体(例えば
ストレプトアビジン)により認識可能な第2分子(例えばビオチン)により誘導
化されてもよい。特異的結合体が固相に結合され、それにより補助分子−第2分
子複合体は保持するがポリペプチドコンジュゲートは保持しない第2補助体−固
相カラムを通過させ、溶出することで補助分子−第2分子複合体からポリペプチ
ドコンジュゲートを分離することができる。ポリペプチドコンジュゲートは補助
分子より適当な様式で開放されるだろう。脱保護は、補助分子が結合しているF
VIIの官能部位から補助分子を解離させる条件を提供することで達成される。
例えば、ポリマーがコンジュゲートする抗体と抗イディオタイプ抗体との複合体
は、pHを酸性またはアルカリ性pHに調節することで解離することができる。
より好適な方法は、FVIIのCa2+特異的立体構造を認識する立体構造特異的
抗体を利用することであり、そして緩やかな条件下にEDTAで溶出することが
できる。
【0081】セリンプロテアーゼ阻害剤の結合 セリンプロテアーゼ阻害剤の結合は、第WO96/12800号記載の方法に
より実施できる。
【0082】タグ付きポリペプチドのコンジュゲート 別実施態様では、ポリペプチドはタグ、即ち典型的には1−30、例えば1−
20アミノ酸残基からなるアミノ酸配列またはストレッチとの融合蛋白質として
発現される。迅速かつ容易な精製が可能になることに加え、タグはタグ付きポリ
ペプチドと非ポリペプチド部分との間でコンジュゲートを行う上でも便利なツー
ルである。具体的には、タグはマイクロタイタープレートまたは磁性ビーズの様
なその他キャリアー内で、タグを介してタグ付きポリペプチドを固定しコンジュ
ゲートを達成するのに使用される。例えばマイクロタイタープレート内でタグ付
きポリペプチドへコンジュゲートさせる場合、タグ付きポリペプチドをマイクロ
タイタープレート内に培養ブロスから直接固定でき(原則的には精製なしに)、
コンジュゲートにかけることができるという利点がある。これにより工程の総段
階数(発現からコンジュゲートまで)を減らすことができる。さらに、タグはス
ペーサー分子としても機能し、コンジュゲート対象となる固定化ポリペプチドへ
の接近性も改善する。タグ付きポリペプチドを用いたコンジュゲートは、ここに
開示されたいずれかの非ポリペプチド部分に対するもの、例えばPEGの様なポ
リマー分子にたいするものである。 使用される具体的タグの性質は、タグがポリペプチドと共に発現可能であり、
好適表面またはキャリアー材料に固定化できる限りにおいては、重要ではない。
多くの好適タグが、例えばユニザイムラボラトリーズ(Unizyme Lab
oratories)、デンマーク(Denmark)より販売されている。例
えばタグは次の配列の何れかより成る:
【0083】 His−His−His−His−Hsi−His Met−Lys−His−His−His−His−Hsi−His Met−Lys−His−His−Ala−His−His−Gln−Hsi−
His Met−Lys−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−
Gln−His−Gln−His−Gln Met−Lys−His−Gln−His−Gln−His−Gln−His−
Gln−Hsi−Gln−His−Gln−Gln または以下の何れか: DQKLI SEEDL(Mol.Cell.Biol.5:3610−16,
1985記載のC末端タグ) DYKDDDDK(C−またはN−末端タグ) YPYDVPDYA
【0084】 上記タグに対する抗体は、例えばADI、エーブスラボアンドリサーチダイア
グノスティクス(Aves Lab and Research Diagno
stics)から販売されている。 続くポリペプチドからのタグの開裂は、市販の酵素を用い行うことができる。 本発明のポリペプチドまたは本発明のコンジュゲートの調製方法 本発明のポリペプチドまたは本発明のコンジュゲートのポリペプチド部分は、
随意グリコシル化型であり、当該分野既知の好適方法により産生される。この様
な方法としては、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を構築するこ
と、および好適形質転換またはトランスフェクション宿主で配列を発現させるこ
とが挙げられる。好ましくは、宿主細胞はほ乳動物細胞の様なガンマカルボキシ
ル化を行う宿主細胞である。しかし、本発明のポリペプチドは、効率的ではない
が、化学合成または化学合成の組み合わせ、あるいは化学合成と組換え体DNA
技術との組み合わせにより産生してもよい。
【0085】 本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードす
るヌクレオチド配列は、配列番号あに示すアミノ酸配列を持つhFVIIの様な
親FVIIをコードするヌクレオチド配列を単離するか、または合成することに
より構築し、次にヌクレオチド配列を関連アミノ酸残基が効果的に導入(即ち挿
入または置換)あるいは除去(即ち欠失または置換)できる様に変更してもよい
。 ヌクレオチド配列は通常の方法による部位指定突然変異誘導により好都合に変
更される。あるいはヌクレオチド配列は化学合成を利用し、例えばオリゴヌクレ
オチド合成装置を利用し調製され、この場合オリゴヌクレオチドは所望ポリペプ
チドのアミノ酸配列に基づきデザインされ、好ましくは組換え体ポリペプチドが
産生される宿主細胞にとって好ましいコドンが選択される。例えば所望ポリペプ
チドの部分をコードする複数の小ヌクレオチドがPCR、ライゲーション、また
はライゲーションチェインリアクション(LCR)(Barany、PNAS
88:189−193、1991)により合成され、組み立てられる。一般に個
々のオリゴヌクレオチドは相補的組み立てのための5’または3’オーバーハン
グを含んでいる。
【0086】 別のヌクレオチド配列修飾法は、高処理型スクリーニング、例えば米国特許第
5,093、257号に開示の相同的クロスオーバーを含む方法、および遺伝子
シャッフリング、即ち開始時のヌクレオチド配列と比較したとき複数のヌクレオ
チドの変更を有する新規ヌクレオチドを生ずる2またはそれ以上の相同的ヌクレ
オチド間の組み換えを含む方法がポリペプチド変異体を産生するのに利用できる
。遺伝子シャッフリング(DNAシャッフリングとしても知られている)は、ヌ
クレオチドのランダムな切断と組み立ての1またはそれ以上のサイクルと、それ
に続く所望特性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を選択するス
クリーニングとを含む。相同性をベースとした核酸シャッフリングを行うために
は、ヌクレオチド配列の関連部分が少なくとも50%同一であり、例えば少なく
とも60%同一、より好ましくは少なくとも70%同一、例えば少なくとも80
%同一であることが好ましい。組み換えはインビトロまたはインビボで行うこと
ができる。
【0087】 好適インビボ遺伝子シャッフリング法の例は、Stemmerら、(1994
)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA;91巻、pp.1074
7−10751;Stemmer(1994)、Nature、370巻、pp
.389−391;Smith(1994)、Nature、370巻、pp.
324−325;Zhaoら、Nat.Biotechnol.1998、Ma
r;16(3):258−61;Zhao HとArnold,FB、Nucl
eic Acid Research、1997、25巻、No.6 pp.1
307−1308;Shaoら、Nucleic Acids Researc
h 1998、Jan 15;26(2):pp.681−83;および第WO
95/17413号に開示されている。 好適インビボ遺伝子シャッフリング法の例は第WO97/07205号に開示
されている。インビトロまたはインビボ組換え体による核酸配列の突然変異に関
するその他方法は第WO97/20078号および米国特許第5、837、45
8号に開示されている。具体的シャッフリング技術の例には、”ファミリーシャ
ッフリング”、”合成シャッフリング”および”インシリコシャッフリング”が
含まれる。 ファミリーシャッフリング”は、異なる種に由来する相同遺伝子のファミリー
を1またはそれ以上のシャッフリングサイクルにかけ、続いてスクリーニングま
たは選別を行うことを含む。ファミリーシャッフリング”技術はCrameri
ら、(1998)、Nature、391巻、pp288−291;Chris
tiansら(1999)、Nature Biotechnology、17
巻、pp.259−264;Changら、(1999)、Nature Bi
otechnology、17巻、pp.793−797;およびNessら(
1999)、Nature Biotechnology、17巻、893−8
96に開示されている。
【0088】 合成シャッフリングは、例えば関心の相同遺伝子の配列アラインメントに基づ
き重複する合成オリゴヌクレオチドのライブラリーを提供することを含む。合成
により生成されたオリゴヌクレオチドは組み換えられ、得られた組換え体核酸配
列をスクリーニングし、必要に応じ更なるシャッフリングサイクルに用いる。合
成シャッフリング技術は第WO00/42561号に開示されている。 インシリコシャッフリングとは、コンピューターシステムを用い実行される、
またはモデル化され、それによって核酸を物理的に操作する必要を一部または全
て回避するDNAシャッフリング操作を意味する。インシリコシャッフリングの
技術は第WO00/42560号に開示されている。 組み立てた後(合成、部位指定突然変異誘導、またはその他の方法により)、
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は組換え体ベクターに挿入され、所
望の形質転換宿主細胞でのFVII発現に必要な制御配列に作動性に結合される
【0089】 もちろん、全てのベクターおよび発現制御配列が等しく良好に機能し、ここに
記したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するわけではない。全
ての宿主が同一発現システムと等しく、良好に機能することもない。しかし当業
者はこれらベクター、発現制御配列、および宿主を特段の実験なしに選択するだ
ろう。例えば、ベクターの選択では、ベクターは宿主内で複製し、または染色体
内に組み込まれなければならないことから、宿主に配慮すべきである。ベクター
のコピー数、そのコピー数を制御する能力およびベクターによりコードされたそ
の他蛋白質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮に入れるべきである。発現制
御配列の選択では、各種因子を考慮に入れるべきである。これら因子としては、
例えば配列の相対強度、その制御性、およびポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列との適合性、特には潜在的な二次構造が含まれる。宿主は選択したベク
ターとの適合性、ヌクレオチド配列によるコードされる産物の毒性、それらの分
泌特性、正確にポリペプチドが畳み込まれる能力、それらの発酵および培養条件
、そしてヌクレオチド配列によりコードされた産物の精製の容易度を考慮しなが
ら選択すべきである。 組換え体ベクターは自己複製型ベクター、即ち染色外単位として存在するベク
ターであり、その複製は染色体複製、例えばプラスミドに依存している。あるい
はこのベクターは、宿主細胞内に導入された場合、宿主細胞のゲノム内に組み込
まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製される。
【0090】 ベクターは好ましくは発現ベクターであり、本発明のポリペプチドをコードし
ているヌクレオチド配列はヌクレオチド配列の転写に必要な追加断片と作動性に
結合している。ベクターは典型的にはプラスミドまたはウイルスDNAより誘導
される。ここに記した宿主細胞内での発現に好適な複数の発現ベクターが市販さ
れ、あるいは文献中に記載されている。真核宿主に有益なベクターとしては、例
えばSV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイル
ス由来の発現制御配列を含むベクターが挙げられる。具体的ベクターは、例えば
pCDN3.1(+)Hyg(インビトロゲン(Invitrogen)、カー
ルスバッド(Carlsbad)、カリフォルニア(CA)、米国)およびpC
I−neo(ストラタジーン(Stratagene)、ラジョラ(La Jo
la)、カリフォルニア、米国)である。酵母に関する有益な発現ベクターは、
2μgのプラスミドとその誘導体、POT1ベクター(米国特許第4,931,
373号)、Okkels、Ann、New York Acad.Sci.7
82、202−207、1996に記載のpJS037ベクター、およびpPI
CZA、BまたはC(インビトロゲン社)を含む。昆虫細胞に関し有用なベクタ
ーとしては、pVL941、pBG311(Cateら、”ミューラー阻害物質
に関するウシおよびヒト遺伝子の単離と動物細胞に於けるヒト遺伝子の発現(I
solation of the Bovine and Human Gen
es for Mullerian Inhibiting Substanc
e And Expression of the Human Gene I
n Animal Cells)”、Cell、45、pp685−98(19
86)、pBluebac4.5およびpMelbac(共にインビトロゲン社
)が挙げられる。細菌宿主に関し有益な発現ベクターとしては、既知細菌プラス
ミド、例えばpBR322、pET3aおよびpET12a(共にノバゲン(N
ovagen)、ウイスコンシン(WI)、米国)を含む大腸菌由来プラスミド
、RP4の様な広宿主域プラスミド、例えばNM989の様なラムダファージお
よびM13の様なその他DNAファージに由来する各種誘導体、および繊維状単
鎖DNAファージの様なファージDNAが挙げられる。
【0091】 本発明での利用に適したその他ベクターとしては、増幅対象のポリペプチドを
コードしているヌクレオチド配列を複数コピーできるベクターを包含する。この
様なベクターは当該分野周知である。それらには、例えばDHFR増幅(例えば
Kaufman、米国特許第4,470,461号、KaufmanとShar
p、”モジュール型ジヒドロ葉酸還元酵素cDNA遺伝子の構築;効果的発現に
利用されるシグナルの分析(Construction Of A Modul
ar Dihydrafolate Reductase cDNA Gene
;Analysis Of Signals Utilized For Ef
ficient Expression”、Mol.Cell.Biol.,2
、っp。1304−19(1982))およびグルタミン合成酵素(”GS”)
増幅(例えば米国特許第5,112,464号および欧州特許第338、841
号参照)が含まれる。 組換え体ベクターはさらに、ベクターを問題の宿主細胞内で複製できるように
するDNA配列を含む。この様な配列の例(宿主細胞が哺乳動物細胞の場合)は
SV40の複製開始点である。宿主細胞が酵母細胞の場合、ベクターを複製でき
る様にする好適配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1−3および複製
開始点である。
【0092】 ベクターはさらに選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞内で欠失して
いるものである遺伝子、例えば時ヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)をコードして
いる遺伝子またはSchizosaccharomyces pombeTPI
遺伝子(P.R.Russell、Gene 40、1985、pp.125−
130に記載)、または薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイ
クリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレ
キセートに対する耐性を付与する遺伝子を含んでも良い。Saccharomy
ces cerecisiaeの場合、選択マーカーにはura3およびleu
2が含まれる。糸状菌の場合、選択マーカーとしてはamdS、pyrG、ar
cB、niaDおよびsCが挙げられる。 用語“制御配列”は、ここでは本発明のポリペプチドの発現に必要または有利
である全ての成分を包含するものと規定される。各制御配列はポリペプチドをコ
ードする核酸配列にとって本来のものでも、または外来性のものでもよい。この
様な制御配列には、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プ
ロモーター配列、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列お
よび転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最低でもコント
ロール配列はプロモーターを含む。 本発明では広範な発現制御配列が利用できる。この様な有益な発現コントロー
ル配列には、前記発現ベクターの構造遺伝子に関連した発現制御配列および前核
細胞または真核細胞、またはそれらのウイルスおよびその各種組み合わせの遺伝
子発現を制御することが知られている配列を含む。
【0093】 哺乳動物細胞での転写方向を指示するのに好適な制御配列の例は、SV40お
よびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス2主
要後期プロモーター、MT−1(メタロチオネイン遺伝子)プロモーター、ヒト
サイトメガロウイスル早期初期遺伝子(CMV)、ヒト延長因子1α(EF−1
α)プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショック蛋白質70プロモーター、
ラウス(Rous)肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトユビキチンC(
UbC)プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデ
ノウイルスElb領域ポリアデニル化シグナル、およびコザック(Kozak)
コンセンサス配列(Kozak、M.J Mol Biol 1987 Aug
20;196(4):947−50)を含む。 哺乳動物細胞での発現を改善するために、ポリペプチドをコードする5‘非翻
訳域に合成イントロンを挿入してもよい。合成イントロンの例はプラスミドpC
I−Neo由来の合成イントロン(プロメガ社(Promega Corpor
ation)、ウイスコンシン(WI)、米国より入手可能)である。
【0094】 昆虫細胞での転写方向付けに好適な制御配列の例には、ポリヘドリンプロモー
ター、P10プロモーター、Autographa californica多
角体病ウイルス塩基性蛋白質プロモーター、バキュロウイルス早期型初期遺伝子
Iプロモーターおよびバキュロウイスル39K遅延型後期遺伝子プロモーター、
およびSV40ポリアデニル化配列が含まれる。酵母宿主細胞での使用に好適な
制御配列の例には、酵母α接合系のプロモーター、酵母トリオースイソメラーゼ
(TPI)プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコール脱水素酵素のプロモ
ーター、ADH2−4cプロモーター、および誘導型GALプロモーターが含ま
れる。糸状菌宿主細胞での利用に好適な制御配列の例には、ADH3プロモータ
ーおよびターミネーター、Aspergillus oryzaeTAKAアミ
ラーゼトリオースリン酸イソメラーゼまたはアルカリプロテアーゼ、A.nig
erα−アミラーゼ、A.nigerまたはA.nidulansグルコアミラ
ーゼ、A.nidulansアセトアミダーゼ、Rhizomucor mie
heiアスパラギン酸プロテアーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子に由
来するプロモーター、TPI1ターミネーターおよびADH3ターミネーターが
含まれる。細菌性宿主細胞での使用に好適な制御配列の例には、lac系、tr
p系、TACまたはTRC系のプロモーター、およびラムダファージの主要プロ
モーター領域が含まれる。
【0095】 シグナルペプチドの有無は、例えば発現されるポリペプチドの産生に使用され
る宿主細胞(それが細胞内または細胞外ポリペプチドであるかは問わず)、およ
び分泌させることを望むかに依存するだろう。糸状菌での使用に関しては、単一
ペプチドはAspergillus sp.アミラーゼまたはグルコアミラーゼ
、Rhizomucor mieheiリパーゼまたはプロテアーゼ、もしくは
Hunicola lanuginosaリパーゼをコードする遺伝子から容易
に誘導できる。シグナルペプチドは、A.oryazeTAKAアミラーゼ、A
.niger中和α−アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼまたはA
.nigerグルコアミラーゼをコードしている遺伝子から好ましく誘導される
。昆虫細胞での使用に関しては、シグナルペプチドは昆虫遺伝子(第WO90/
05783号)、例えばLepidopteran manduca sext
aアジポキネティクホルモン前駆体(米国特許第5,023,328号)、ミツ
バチメリチン(インビトロゲン社(Invitrogen))、エクジステロイ
ドUDPグルコシルトランスフェラーゼ(egt)(Murphyら、Prot
ein Expression and Purification 4,34
9−357(1993)またはヒト膵臓リパーゼ(hpl)(Methods
in Enzymology 284、pp.262−272、1997)をコ
ードする遺伝子から好都合に誘導される。哺乳動物細胞での使用に適したシグナ
ルペプチドは、hFVIIまたはマウスIgカッパ軽鎖シグナルペプチド(Co
loma、M(1992)J.Imm.Methods 152:89−104
)のシグナルペプチドである。酵母細胞での使用に関しては、好適シグナルペプ
チドはS.cereviciae(米国特許4、870、008号)由来のα因
子シグナル、改良型カルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A.Val
lsら、Cell48、1987、pp.887−897)、酵母BAR1シグ
ナルペプチド(第WO87/02670号)、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ
3(YAP3)シグナルペプチド(M.Egel−Mitaniら、Yeast
6、1990,っp。127−137)および合成リーダー配列TA57(第
WO98/32867号)であることが見出されている。大腸菌細胞での使用に
関しては、好適シグナルペプチドはシグナルペプチドompAであることが見出
されている(欧州特許第581821号)。
【0096】 FVIIポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、部位指
定突然変異誘導法、PCR、またはその他方法のいずれにより調製さたかに関わ
らず、随意にシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。シグナル
ペプチドは、ポリペプチドが、ポリペプチドがその中で発現されている細胞から
分泌される場合に存在する。この様なシグナルペプチドは、存在する場合には、
ポリペプチドの発現に合わせ選択された細胞により認識されるものでなければな
らない。シグナルペプチドはポリペプチドに対し相同的(例えば一般的にhFV
IIと関連している)または異質的(即ちhFVII以外の供給源に由来する)
であるか、または宿主細胞に対し相同的または異質的であり、即ちシグナルペプ
チドは宿主細胞から正常に発現されるシグナルペプチドであるか、または宿主細
胞からは一般に発現されないシグナルペプチドである。従ってシグナルペプチド
は前核性、例えば大腸菌の様な最近に由来するものであるか、真核性、例えば哺
乳動物または昆虫、あるいは酵母細胞に由来するものである。
【0097】 好適宿主は本発明のコンジュゲートのポリペプチドまたはポリペプチド部分を
産生するのに用いられ、細菌、真菌(酵母を含む)、植物、昆虫、哺乳動物、ま
たはその他適当な動物細胞または細胞株、ならびにトランスジェニック動物また
は植物を含む。細菌宿主細胞の例としては、例えばB.brevsiまたはB.
subtililsの様なBacillus、PseudomonasまたはS
treptomaycesの様なグラム陽性細菌、またはE.coliの様なグ
ラム陰性細菌を含む。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラス
ト形質変換(例えばChangとCohen、1979、Molecular
General Genetics 168:111−115参照)により、コ
ンペテント細胞を使い(例えばYoungとSpizizin、1961、Jo
urnal of Bacteriology 81:823−829またはD
obnauとDavidoff−Abelson、1971、Journal
of Molecular Biology 56:209−221参照)、エ
レクトロポレーション(例えばShigekawaとDower、1988、B
iotechniques 6:742−751)または接合(例えばKoeh
lerとThrne、1987、Journal of Bacteriolo
gy 169:5771−5278参照)を用い実行される。好適糸状菌宿主細
胞例には、例えばA.orzae、A.nigerまたはA.nidulans
様なAspergillus、FusariumまたはTrichoderma
が含まれる。真菌細胞は、それ自体既知の方法によるプロトプラスト形成、プロ
とプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む工程により形質転換される。
Aspergillus宿主細胞の形質転換に好適な手段は欧州特許第238
023号および米国特許第5、679、543号に記載されている。Fusar
ium種を形質転換する好適方法はMalardierら、1989、Gene
78:147−156および第WO96/00787号に記載されている。好
適酵母宿主細胞例は、例えばS.cerevisiaeの様なSaccharo
myces、Schizosaccharomyces、Klyveromyc
es、P.pastorisまたはP.methanolicaの様なPich
ia、H.Polymorphaの様なHansenula、またはYarro
wiaを含む。酵母はBeckereとGuarente、Abelson、J
.N.とSimonmM.I.,編集、Guide to Yeast Gen
etics and Molecular Biology、Methods
in Enzymology、194巻、pp.182−187、アカデミック
プレス(Academic Press)、ニューヨーク(New York)
;itoら、1983、Journal of Bacteriology 1
53:163;Hinnenら、1978、Proceedings of t
he National Academy of Sciences USA
75:1920記載の方法;およびクローンテックラボラトリーズ社(Clon
tech Laboratories、Inc)、パロアルト(Palo Al
to)、カリフォルニア(CA)、米国により開示された方法(Yeastma
kerTMYeast Transformation Systemキットに関
する製品プロトコール)を用い形質転換される。好適昆虫宿主細胞例には、Sp
odoptera frugiperda(Sf9またはSf21)の様なLe
pidoptora細胞株、またはTrichoplusion ni細胞(H
igh Five)(米国特許第5,077,214号)が含まれる。昆虫細胞
の形質転換およびその中での異質ポリペプチドの産生は、インビトロゲン社貴社
に様に実施される。好適哺乳動物細胞の例にはチャイニーズハムスター卵巣(C
HO)細胞株(例えばCHO−K1;ATCC CCL−61)、ミドリサル細
胞株(COS)(例えばCOS1(ATCC CRL−1650)、COS7(
ATCC CRL−1651);マウス細胞(例えばNS/O)、ベイビーハム
スター腎臓(BHK)細胞株(例えばATCC CRL−1632またはATC
C CCL−10)およびヒト細胞(例えばHEK293(ATCC CRL−
1573))ならびに植物細胞組織培養体が含まれる。さらに別の好適細胞株が
当該分野既知であり、米国標準培養体コレクション(American Typ
e Culture Collection)、ロックビル(Rockvill
e)、メリーランド(Maryland)の様な好適寄託機関より入手できる。
またCHO細胞の様な哺乳動物細胞は、例えば米国特許第5,047、335号
記載の様にしてシアリルトランスフェラーゼ、例えば1,6−シアリルトランス
フェラーゼを発現し、改良されたFVIIまたはFVIIaポリペプチドを提供
する様に変更してもよい。
【0098】 分泌を増すために、本発明のポリペプチドをエンドプロテアーゼ、特にKex
2エンドプロテアーゼ(例えば第WO00/28065号記載の様な)の様なP
ACE(対塩基性アミノ酸変換酵素)(例えば米国特許第5,986、079号
を参照)と共に産生することは特に興味深い。 外来性DNAを哺乳動物宿主細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム介
在トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、DEAD−デキストラ
ン介在トランスフェクション法、リポソーム介在トランスフェクション法、ウイ
ルスベクター法、およびリポフェクタミン2000を用いたライフテクノロジー
ズ社(Life Technologies Ltd)、ペイスレイ(Pais
ley)、英国記載のトランスフェクション法が含まれる。これら方法は当該分
野周知であり、例えばAusbelら(編集)1996、Current Pr
otocols in Molecular Biology、ジョンウイリー
アンドソンズ社(John Wiley & Sons)、ニューヨーク(Ne
w York)、米国に記載されている。哺乳動物細胞の培養は確立された方法
、例えば(Animal Cell Biotechnology、Metho
ds and Protocols、Nigel Jenkins編集、199
9、ヒューマンプレスインク(Human Press Inc)、トトワ(T
otowa)、ニュージャージー(New Jersey)、米国およびHar
ruison MAとRae IF、General Techniques
of Cell Techniques of Cell Culture、ケ
ンブリッジユニバーシティープレス(Cambridge Universit
y Press) 1997)に開示されている方法により実施される。
【0099】 本発明の製造方法では、細胞は当分野既知の方法を用いたポリペプチド産生に
関し好適な栄養培地中に培養される。例えば、細胞は好適培地中にて、ポリペプ
チドを発現させ、そして/または単離することができる条件の下に、振盪フラス
コ培養、研究用または産業用ファーメンターによる小規模または大規模発酵(連
続式、バッチ式、フェド−バッチ式、または個体発酵式を含む)により培養され
る。培養は炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む好適栄養培地中にて、当分
野既知の方法を用い行われる。好適方法は商業的供給会社から入手することがで
き、または公開された組成に従い調製される(例えば米国標準株コレクションの
カタログ内)。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合には、ポリペプチド
は培地から直接回収できる。ポリペプチドが分泌されない場合には、それは細胞
溶解物から回収できる。
【0100】 得られたポリペプチドは、当該分野既知の方法により回収される。例えばポリ
ペプチドは遠心分離、濾過、抽出、スプレー乾燥、蒸発または沈殿を含むが、こ
れらに限定されない通常の方法により、栄養培地から回収される。 ポリペプチドは、クロマトグラフィー(例えばイオン交換、アフィニティー、
疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除式)、電気泳動法(例えば
調製等電点フォーカシング)、溶解度差(例えば硫安沈殿法)、SDS−PAG
Eまたは抽出(例えばProtein Purification、J,−C.
JansonとLars Ryden、編集、VCH出版、ニューヨーク、19
89参照) を含むが、これらに限定されない当該分野既知の各種方法により精
製される。 単鎖FVIIは、文献記載の様々な方法により精製され、2本鎖FVIIaに
活性化できる(BrozeとMajerus、1980、J.Biol.Che
m.255:1242−47およびHednerとKisiel、1983、J
.Clin.Invest.71:1836−41)。単鎖FVIIを精製する
ことができるその他方法は、米国特許第5,700,914号記載の様にZnイ
オンを精製中に取り込ませる方法である。 好適実施態様では、ポリペプチドは単鎖FVIIとして精製され、それはさら
にPEG化される。PEG化されたFVII単鎖ポリペプチドは固定化酵素(例
えば第IIa、IXa、Xa、およびXIIa因子)を用いるか、または陽荷電
型イオン交換マトリックス等を用いて自己活性化することで、活性化される。 FVIIをまず単鎖型に精製し、続いてPEG化(望まれる場合)し、そして最
後に上記方法の一つまたはPedersenら、1989、Biochemis
try 28:9331−36記載の様にして自己活性化することが好都合であ
る。活性化前にPEG化することの利点は、R152−I153の劈開により形
成される新たなアミノ末端のPEG化を回避することである。D242とI15
3のアミノ末端間の水素結合形成が活性にとって必要であることから、この新規
アミノ末端のPEG化は分子を不活性化するだろう。
【0101】本発明の医薬品組成物およびその利用 更なる側面では、本発明は組成物、特に本発明のポリペプチドまたはコンジュ
ゲート(上記の不活性型コンジュゲートを含む)および医薬品に許容されるキャ
リアーまたは賦形剤を含む医薬品組成物に関する。 本発明によるコンジュゲート、ポリペプチドまたは医薬品組成物は薬剤として
使用される。 好ましくはポリペプチドまたは(活性型)コンジュゲートは、哺乳動物に於け
るFVIIa/TF関連疾患または障害の治療または予防のための薬剤の製造に
利用される。例えば、ポリペプチドまたは(活性型)コンジュゲートは、例えば
血管に対する損傷に反応し血液凝固が不適当となる病気の患者の治療といった、
凝固形成の促進が望まれる病気の治療または予防に関する薬剤の製造に使用され
る。具体的にはポリペプチドまたは(活性型)コンジュゲートは血友病、FVI
IIおよびFIXに対する阻害剤による血友病、血小板減少症患者、グランツマ
ン血小板無力血小板放出障害および血小板貯蔵プール病の様な血小板障害症患者
、フォン・ヴィルブランド(von Willebrand)病患者、肝臓疾患
患者、または例えば外傷または大手術による重度の出血問題を持つ健康人、FV
IIaに対する阻害剤を生じたヒト、血友病の様な出血障害、および一般的に重
度の組織損傷を伴うその他例の治療に適した薬剤の製造に使用される。
【0102】 同様に、本発明の不活性型コンジュゲートは、哺乳動物に於けるFVIIa/
TF−関連疾患または障害の治療あるいは予防に適した薬剤の製造に使用される
。例えば本発明の不活性型コンジュゲートは、凝固形成の低下が望まれる病気の
治療または予防、例えば敗血症、深部静脈血栓症の患者や心筋梗塞または血栓発
作の危険がある患者、肺梗塞、急性冠動脈症候群(心筋梗塞および不安定型狭心
症)患者、心臓病および再狭窄に対する冠動脈予防措置を受けている患者、末梢
血管病の患者の様な、凝固亢進状態にある患者の予防または治療に関する薬剤の
製造に使用される。本発明の不活性型コンジュゲートはまた呼吸疾患、腫瘍増殖
および転移の治療に関する薬剤の製造にも使用される。 別の側面では、本発明のポリペプチド、(活性型)コンジュゲートまたは(活
性型)コンジュゲートを含む医薬組成物は、治療を必要とする哺乳動物にポリペ
プチド、コンジュゲートまたは組成物の有効量を投与することを含む、FVII
a/TF−関連疾患または障害(例えば上記の疾患または障害の1またはそれ以
上の)に罹った哺乳動物の治療に関する方法に使用できる。 同様に本発明の不活性型コンジュゲートまたは不活性型コンジュゲートを含む
医薬組成物は、治療を必要とする哺乳動物にこの様な不活性型コンジュゲートま
たは組成物の有効量を投与することを含む、FVIIa/TF−関連疾患または
障害(例えば上記の1またはそれ以上の疾患または障害)を持つ哺乳動物に関す
る治療法に使用される。
【0103】 本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは、患者に治療有効量、一般には
NovoSevenRの様なrFVIIを用いた治療で使用される量と同等量、
またはそれより高い用量投与される。ここでは”治療有効量”とは、投与対象の
条件に関連し望まれる効果を生じせしめるのに十分な投与量を意味する。正確な
投与量はその状況に依存し、そして当業者により既知技術を用い確認できるだろ
う。一般に投与量は治療対象となる状態あるいは適用の重傷度または広がりを防
止するか、または軽減できるものでなければならない。本発明のポリペプチド、
コンジュゲートまたは組成物の有効量が、とりわけ病気、投与量、投与スケジュ
ール、ポリペプチドまたはコンジュゲートあるいは組成物が単独で投与されるか
、あるいは他の治療薬とともに投与されるか否か、組成物の血漿半減期、および
患者の一般健康状態に依存する。好ましくは、本発明のポリペプチド、コンジュ
ゲートまたは組成物は有効量、特には凝固障害を正常化するのに十分な投与量投
与される。 本発明のポリペプチドは医薬品に許容されるキャリアーまたは賦形剤を含む組
成物の形で好ましく投与される。”医薬品に許容される”とは、投与された患者
に有害反応を起こさないキャリアーまたは賦形剤を意味する。この様な医薬品に
許容されるキャリアーおよび賦形剤は当業界周知である(例えばRemingt
on’s Pharmaceutical Science、18版、A.R.
Gennaro、編集、マック出版会社(Mack Publishing C
ompnay[1990];Pharmacetucial Forumlat
ion Development of Peptides and Prot
eins、S.FrokjaerとL.Hovgaard、編集、テイラーアン
ドフランシス(Taylor & Francis)[2000];およびHa
ndbook of Pharmaceutical Excipients、
3版、A.Kibbe編集、ファルマシューティカルプレス(Pharmace
utical Press)[2000]参照)。
【0104】 本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは周知の方法により医薬品組成物
に製剤化できる。好適な製剤は、E.W.MartinによるRemingto
n’s Pharmaceutical Scienceに記載されている(M
ack Publ.Co.,16版、1980)。 本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートは”そのまま”および/またはそ
の塩の形で使用できる。好適な塩には、アルカリ金属またはアルカリ土金属、例
えばナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに例
えば亜鉛塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの塩または
錯体は結晶構造体および/または無晶構造体として存在する。 本発明の医薬品組成物は単独、または他の治療薬と組み合わせ投与される。こ
れら薬剤は同一医薬品組成物の一部として取り込むか、または本発明のポリペプ
チドまたはコンジュゲートとは別に、同時あるいは別の治療スケジュールに従い
投与される。さらに、本発明のポリペプチド、コンジュゲートまたは医薬品組成
物は他の治療のアジュバントとして投与される。 本発明の目的に関する”患者”にはヒトおよびその他の哺乳動物が含まれる。
即ちこの方法はヒトの治療および獣医分野に応用できる。本発明のポリペプチド
またはコンジュゲートの医薬品組成物は様々な形状、例えば液体、ゲル、凍結乾
燥または圧縮固体の様な形状に製剤化される。好適形状は、具体的な治療適用に
依存し、そしてそれは当業者には明らかであろう。
【0105】 具体的には、本発明のポリペプチドまたはコンジュゲートの医薬品組成物は凍
結乾燥または安定した溶液形状に製剤化される。ポリペプチドまたはコンジュゲ
ートは当分野既知の各種方法により凍結乾燥される。ポリペプチドまたはコンジ
ュゲートは、蛋白質分解部位を除去または遮蔽することで安定な液体形状になる
。安定液体製剤を得る利点は、緊急時に患者へ素早く手当てできることであり、
これは救命に寄与する。好適形状は具体的な治療適用に依存し、そしてそれは当
業者に明らかであろう。 本発明の製剤の投与は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、経皮的、腹腔内、
筋肉内、肺内、膣内、直腸内、眼内、またはその他利用可能な方法を含む様々な
方法で行うことができるが、これらに限定されるものではない。製剤は一回大量
注射も可能であるが、ポンプまたは移植といった当分野周知の技術を用い、注入
により連続的に投与するこができる。幾つかの例では、製剤は溶液またはスプレ
ーの様な形で直接適用される。
【0106】非経口剤 医薬品組成物の好適例は非経口投与用に工夫された溶液である。多くの例では
、医薬品溶液製剤は緊急利用に適当な液体形状で提供されるが、この様な非経口
製剤はまた凍結または凍結乾燥形状でも提供される。凍結形状では組成物は使用
前に融解しなければならない。凍結乾燥形状は、凍結乾燥製剤がその溶液製剤に
比べ一般的はより安定であることが当業者により認識されていることから、広範
な保存条件における組成物中に含まれる活性化合物の安定性を高めるのにしばし
ば使用される。この様な凍結乾燥製剤は使用前に、注射用無菌水または滅菌生理
食塩水液の様な好適な医薬品に許容される希釈液を1またはそれ以上加えること
で再生される。 非経口投与例では、製剤は保管に備えて凍結乾燥製剤、または適当な場合には
所望純度を持つポリペプチドと一般に当分野で使用される1またはそれ以上の医
薬品に許容されるキャリアー、賦形剤または安定化剤(これらをまとめて”賦形
剤”と呼ばれる)、例えば緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張剤、非イオン性表面
活性剤または界面活性剤、および/または各種添加剤と混合することで水溶液と
して調製される。
【0107】 緩衝剤は生理的条件に近い範囲にpHを維持するのに役立つ。それらは典型的
には約2mMないし約50mMの範囲である。本発明での使用に好適な緩衝化剤
には、クエン酸緩衝液(例えばクエン酸1ナトリウム−クエン酸2ナトリウム混
合体、クエン酸−クエン酸3ナトリウム混合体、クエン酸−クエン酸1ナトリウ
ム混合体等)、琥珀酸緩衝液(例えば琥珀酸−琥珀酸1ナトリウム混合体、琥珀
酸−水酸化ナトリウム混合体、琥珀酸−琥珀酸2ナトリウム混合体等)、酒石酸
緩衝液(例えば酒石酸−酒石酸ナトリウム混合体、酒石酸−酒石酸カリウム混合
体、酒石酸−水酸化ナトリウム混合体等)、フマール酸緩衝液(例えばフマール
酸−フマール酸1ナトリウム混合体、フマール酸−フマール酸2ナトリウム混合
体、フマール酸1ナトリウム−フマール酸2ナトリウム混合体等)、グルコン酸
緩衝液(例えばグルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合体、グルコン酸−水酸化
ナトリウム混合体、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合体等)、シュウ酸緩衝
液(例えばシュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合体、シュウ酸−水酸化ナトリウム
混合体、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合体等)、乳酸緩衝液(例えば乳酸−乳
酸ナトリウム混合体、乳酸−水酸化ナトリウム混合体、乳酸−乳酸カリウム混合
体等)および酢酸緩衝液(例えば酢酸−酢酸ナトリウム混合体、酢酸−水酸化ナ
トリウム混合体等)の様な有機酸と無機酸の両方、およびその塩が含まれる。さ
らにリン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスの様なトリメチルアミン塩
も利用できるだろう。
【0108】 安定化剤とは、増量剤から、治療薬を可溶化し又は変性し、あるいは容器壁へ
の接着を防止するの役立つ添加物までを含む、多様な機能を持つ広範な賦形剤の
分類を表している。典型的な安定化剤は多水酸基糖アルコール(上記に列挙);
アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラ
ニン、オルニチン、L−ロイシン、2−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレ
オニン等のアミノ酸、乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソル
ビトール、キシリトール、リビトール、ミオイノシトール、ガラクチトール、グ
リセロール等、イノシトールとしてシクリトールを含む有機糖または糖アルコー
ル;ポリエチレングリコール;アミノ酸ポリマー;尿素、グルタチオン、チオク
ト酸、チオグリコール酸ナトリウム、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸
ナトリウムの様な硫黄含有還元剤;低分子ポリペプチド(即ち<10残基);ヒ
ト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンの様な
蛋白質;ポリビニルピロリドンの様な親水性ポリマー;キシロース、マンノース
、果糖およびグルコースの様な単糖;乳糖、マルトースおよびショ糖の様な2糖
類;ラフィノースの様な3糖類、およびデキストランの様な多糖類である。安定
化剤は活性蛋白質重量を元に、一般的には0.1ないし10,000重量部の範
囲で存在している。
【0109】 保存剤は微生物の増殖を抑制するために加えられ、一般には約0.2%−1%
(w/v)の量加えられる。本発明での使用に好適な保存剤にはフェノール、ベ
ンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オ
クタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物
(例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム)、塩化ヘキサメトニウム、
メチルまたはプロピルパラベンの様なアルキルパラベン、カテコール、レソルシ
ノール、シクロヘキサノールおよび3−ペンタノールが含まれる。 等張剤は、溶液組成物の等張性を確保するために加えられ、多価糖アルコール
、好ましくは3価もしくはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリス
リトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールが含
まれる。多価アルコールはその他成分の相対量を勘案しながら、0.1ないし2
5重量%、典型的には1%ないし5%の範囲の量存在できる。 非イオン性表面活性剤または界面活性剤(”湿潤剤”としても知られる)は、
治療作用物質の可溶化を助けるため、および治療ポリペプチドが攪拌時に凝集す
るのを防ぐために加えられ、さらにこれによりポリペプチドに変性を起こすこと
なく製剤を剪断面応力に曝らせるようになる。好適な非イオン性表面活性剤には
ポリソルベート(20、80等)、ポリオキサマー(184、188等)、Pl
uronicRポリオール、ポリキシエチレンソルビタンモノエーテル(Twe
enR−20、TweenR−80等)。
【0110】 その他賦形剤には、増量剤または充填剤(例えばデンプン)、キレート剤(例
えばEDTA)、酸化防止剤(例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE
)および補助溶媒が含まれる。 活性成分はまた、例えばコアセルベーション技術、または界面重合法により調
製された内、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ−(メチ
ルメタクリレート)マイクロカプセル内、コロイド薬物運搬システム(例えばリ
ポソーム、アルブミンマイクロスフェアー、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、
およびナノカプセル)またはマクロエマルジョンに封入される。この様な技術は
Remington’s Pharmaceutical Sciences、
上記に開示されている。 インビボ投与に使用される非経口製剤は無菌でなければならない。これは、例
えば無菌濾過膜を使った濾過により、容易に実施される。
【0111】持続型放出製剤 持続型放出製剤の例には、ポリペプチドまたはコンジュゲートを含む固形疎水
性ポリマーの半透過性マトリックス、フィルムまたはマイクロカプセルの様な好
適形状をしたマトリックスが含まれる。持続型放出マトリックスの例には、ポリ
エステル、ハイドロゲル(例えばポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート
)またはポリ(ビニルアルコール)、ポリアオクチド、L−グルタミン酸とエチ
ル−L−グルタミン酸エステルのコポリマー、非分解性エチレンビニルアセテー
ト、ProLeaseR技術またはLupron DepotR(乳酸−グリコー
ル酸コポリマーとロイプロリドアセテートより成る注射可能なマイクロスフェア
ー)の様な分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−D−(−)−3
−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコ
ール酸の様なポリマーは、100日またはそれ以上といった長期間分子を放出す
ることができるが、あるハイドロゲルは蛋白質をより短期間放出する。カプセル
封入されたポリペプチドが体内に長時間留まる場合、それらは37℃で湿気に曝
される結果変性または凝集し、その結果生物活性を失うか、免疫原性が変化する
可能性がある。これに関係するメカニズムに基づき安定化させる合理的な方策を
考案することができる。例えば凝集のメカニズムは、チオ−ジスルフィド相互交
換により分子間にS−S結合が形成されることであることが判明したならば、ス
ルフィドリル残基を変更すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、含有湿度を
制御すること、適当な添加物を利用すること、および特異的ポリマーマトリック
ス組成物を開発することで安定化することができるだろう。 本発明は、次の非限定実施例によりさらに記載される。
【0112】
【配列リスト】
配列番号1はhFVII蛋白質(γ−カルボキシル化残基を含む)を示す。 配列番号2はhFVII蛋白質をコードするcDNA配列を示す。 配列番号3はhFVII蛋白質(γ−カルボキシル化残基を含まない)を示す。
配列番号4は哺乳動物でのFVIIの発現に関する発現カセットを示す。 配列番号5はCBProEpr174プライマーを示す。 配列番号6はCBProEpr175プライマーを示す。 配列番号7はCBProEpr216プライマーを示す。 配列番号8はCBProEpr229プライマーを示す。 配列番号9はCBProEpr221プライマーを示す。 配列番号10はCBProEpr228プライマーを示す。 配列番号11はCBProEpr226プライマーを示す。
【0113】
【材料と方法】修飾されるアミノ酸の決定方法 接触可能表面積(ASA) コンピュータープログラムアクセス(Access)(B.LeeとF,M.
Richards、J.Mol.Biol.55:379−400(1971)
)バージョン2(c1983エール大学)を用い、構造中の個々の原子について
接触可能面積を計算した。この方法は一般には1.4Åのプローブサイズを使用
し、接触可能面積(ASA)をプローブ中心により形成される面積として規定す
る。計算の前に、全ての水分子と全ての水素原子を、蛋白質とは直接関係しない
他の原子と同様に座標セットから取り除かねばならない。
【0114】側鎖分画ASA 側鎖原子の分画ASAは、側鎖内にある原子のASAの合計を、延長したAl
a−x−Alaトリペプチド内のこの残基の側鎖原子のASAを表す値で除して
計算される(Hubbard、Campbell&Thornton(1991
)J.Mol.Biol.220,507−530参照)。この例では、CA原
子はグリシン残基の側鎖の一部であり、残りの残基にはないと考えられる。次表
は側鎖の標準100%ASAとして用いられる。
【0115】
【表3】
【0116】 構造中に検出されない残基は、それらが柔軟領域内に存在すると考えられるこ
とから、100%露出しているものとして規定される。位置6、7、14、16
、19、20,25、26、29および35にあるガンマ−カルボキシグルタミ
ン酸は全て100%露出しているものと規定される。原子間距離の決定 原子間の距離は、分子グラフィックソフトウエアー、例えばInsightI
IRv.98.0、MSI INCを用いて容易に決定できる。触媒部位領域 触媒部位領域は、触媒トライアッド(残基H193、D242、S344)内
にあるいずれかの原子の10Å内に少なくとも1個の原子を持つ残基として規定
される。組織因子結合部位の決定 受容体結合部位は、受容体結合によりそれらの接触可能面積が変化する残基を
全て含むものとして規定されている。これは少なくとも2種類のASA計算;即
ちリガンド/受容体複合体内の単離された状態のリガンドに関する計算と、完全
なリガンド/受容体複合体に関する計算により決定される。
【0117】
【FVIIおよびFVIIa特性の試験方法】機能的インビボ半減期の測定 インビボ生物学的半減期の測定は、文献に記載されている様々な方法で実施で
きる。rFVIIaまたはその変異体のインビボ半減期の測定に関するアッセイ
の例はFDA参照番号96−0597に記載されている。簡単に述べると、FV
II凝固活性はコンジュゲート、ポリペプチドまたは組成物の投与前、および投
与後24時間に採取された血漿について測定される。定常状態に於ける分布の見
かけ上の中央容積が測定され、中央クリアランス値が決定される。蛋白質分解に対する感受性低下の測定 コンジュゲート(100−750μg/ml、好ましくは600μg/ml)
、1.5mgCa2+/ml(塩化カルシウムとして)、マンニトール(30m
g/ml)、ポリソルベート80(0.1mg/ml)、塩化ナトリウム(3n
g/ml)およびグリシル−グリシン緩衝液(1.3mg/ml、pH5.5)
を含む組成物が調製される。 野生型rFVIIaを含む同様の組成物が調製される。 次に“凝固活性測定法”と題する節に記載、または“低レベル触媒活性測定法
”または“触媒活性測定法”と題する節に記載の様にして初期凝固活性、または
初期アミド溶解活性を決定する。 次に野生型rFVIIを含む組成物が初期凝固またはアミド溶解活性の少なく
とも25%、好ましくは少なくとも50%消失するまで、組成物を37℃でイン
キュベーションする。 次に、本発明のコンジュゲートを含む組成物の凝固またはアミド溶解活性を測
定する。 次に野生型rFVIIaと比較した場合の、本発明のコンジュゲートの蛋白質
分解に対する感受性低下をパーセンテージで表す。
【0118】蛋白質分解に対する感受性低下を測定する別の方法 蛋白質分解は米国特許第5,580、560号、蛋白質が自己蛋白質分解であ
る実施例5に記載のアッセイを用い測定できる。 さらに、蛋白質分解の低下は放射線標識されたサンプルを用い、血液サンプル
を採取してこれらをSDS−PAGEおよびオートラジオグラフィーにかけるこ
とで野生型およびコンジュゲートの蛋白質分解とを比較するインビボモデルで試
験できる。 蛋白質分解の決定に使用するアッセイの種類にかかわらず、“蛋白質分解の低
下”はクマシー染色されたSDS−PAGEゲルのゲルスキャニング、HPLC
で測定した時に、または以下記載の発色アッセイを用いて残った触媒活性を野生
型の活性と比較した時に、非コンジュゲート型野生型FVIIaにより得られた
ものに比べ切断が無視できない低下を示すこと意味する。
【0119】rFVIIおよびそのコンジュゲートの分子量の決定 コンジュゲート型または非コンジュゲート型rFVII、またはそのコンジュ
ゲートの分子量はSDS−PAGE、ゲル濾過、ウエスタンブロット、マトリッ
クス補助レーザー吸収マススペクトロメトリーまたは平衡遠心分離のいずれか、
例えばLaemmli、英国、Nature 227巻(1970)、pp.6
80−85によるSDS−PAGにより決定される。低レベル触媒活性測定法 FVII/FVIIaの希釈検体、および発酵溶液/コンディショニング培地
中のアミド溶解活性は、COASETRFVII(クロモゲニクス(Chrom
ogenix)、製品番号821900)を用い決定できる。アミド溶解活性は
、メーカー指示書に従い決定された。簡単に述べると、FXは過剰に存在してお
り、37℃においてFVIIaによってFXaに変換される。産生したFXaは
次に発色基質S2765(N−α−Cbo−D−Arg−Gly−Arg−pN
A)を加水分解し、発色団分子、波長405nmの光を吸収するパラ−ニトロ−
アニリン(pNA)の放出をもたらす。反応は酢酸を添加し停止される。サンプ
ル中のFVII/FVIIa量は、FVIIaより調製された標準曲線(アッセ
イ緩衝液中125pg/mlから1ng/mlの範囲)と比較し、決定される。
【0120】触媒活性測定法 小ペプチド基質を切断するコンジュゲートの能力は、発色基質S−2288(
D−Ile−Pro−Arg−p−ニトロアニリド)を用い測定できる。組換え
体FVIIaは0.1%BSAを含む0.1M Tris、0.1M NaCl
、5mM CaCl2、pH8.3で希釈される。反応はS−2288基質を1
mMまで添加し介しされ、37℃にて30分間インキュベーションした後に40
5nmの吸収が測定される。凝固活性測定法 FVIIa活性は、第WO92/15586号に実質記載されている標準的な
1段階凝固アッセイを用い測定される。簡単に述べると、試験サンプルは50m
M Tris(pH7.5)、0.1%BSAで希釈され、そして100μlが
100μlのFVII欠損血漿および10mMのCa++を含む200μlのトロ
ンボプラスチンCとインキュベーションされる。凝固時間が測定され、連続希釈
されたクエン酸加正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較される。抗凝固活性測定法 不活性型FVIIまたはFVIIaコンジュゲートの抗凝固活性は、上記1段
階凝固アッセイ(凝固活性測定法)を用い測定できるが、このとき不活性コンジ
ュゲートは限定量の脂質が再付加された(relipidated)組織因子を
巡り野生型FVIIと競合する。アッセイは実質的に参照されここに取り込まれ
ている第WO92/15686号、実施例3の記載に従い実施される。不活性コ
ンジュゲートの示す野生型FVII凝固時間延長能が記録され、抗凝固活性測定
値とされる。
【0121】
【実施例】
【実施例1】 Bannerら、J Mol Biol、1996;285:2089による
可溶性組織因子との複合体に於けるhFVIIのX線構造を本サンプルに用いる
。参考のために付けた残基の番号は配列通りでないことに注意。ここでは我々は
配列番号1に従った連続番号を用いている。位置6、7、14、16、19、2
0、25、26、29および35にあるガンマ−カルボキシグルタミン酸はここ
ではGLU(3文字略語)またはE(1文字略語)で表される。残基143−1
52は構造中に存在しない。
【0122】表面露出 方法に記載した非標準および/または消失残基の接近性に関する定義と合わせ
、FVII断片単独について分画ASA計算を行ったところ、以下の残基が25
%より多いそれらの側鎖が表面に露出していることされた:A1、N2、A3、
F4、L5、E6、E7、L8、R9、P10、S12、L13、E14、E1
6、K18、E19、E20、Q21、S23、F24、E25、E26、R2
8、E29、F31、K32、D33、A34、E35、R36、K38、L3
9、W41、I42、S43、S45、G47、D48、Q49、A51、S5
2、S53、Q56、G58、S60、K62、D63、Q64、L65、Q6
6、S67、I69、F71、L73、P74、A75、E77、G78、R7
9、E82、T83、H84、K85、D86、D87、Q88、L89、L9
0、V92、N93、E94、G97、E99、S103、D104、H105
、T106、G107、T108、K109、S111,R113、E116、
G117、S119、L120、L121、A122、D123、G124、V
125、S126、T128、P129、T130、V131、E132、I1
40、L141、E142、K143、R144、N145、A146、S14
7、K148、P149、Q150、G151、T152、G155、K157
、V158、P160、K161、E163、L171、N173、G174、
A175、N184、T185、I186、H193、K197、K199,N
200、R202、N203、I205、S214、E215、H216、D2
17、G218、D219、S222、R224、S232、T233、V23
5、P236、G237、T238、T239、N240、H249、Q250
、P251、V253、T255、D256、E265、R266、T267、
E270、R271、F275、V276、R277、F278、L280、L
287、L288、D289、R290、G291、A292、T293、L2
95、E296、N301、M306、T307、Q308、D309、L31
1、Q312、Q313、R315、R316、V317、G318、D319
、S320、P321、N322、T324、E325、Y326、Y332、
S333,D334、S336、K341、G342、H351、R353、G
354、Q366、G367、T370、V371、G372、R379、E3
85、Q388、K389、R392、S393、E394、P395、R39
6、P397、G398、V399、L400,L401、R402、P404
およびP406。
【0123】 以下の残基はそれらの50%より多い側鎖が表面に露出している:A1、A3
、F4、L5、E6、E7、L8、R9、P10、E14、E16、K18、E
19、E20、Q21、S23、E25、E26、R28、E29、K32、A
34、E35、R36、K38、L39、I42、S43、G47、D48、A
51、S52、S53、Q56、G58、S60、K62、L65、Q66、S
67、I69、F71、L73、P74、A75、E77、G78、R79、E
82、H84、K85、D86、D87、Q88、L89、L90、V92、N
93、E94、G97、T106、G107、T108、K109、S111、
E116、S119、L121、A122、D123、G124、V131、E
132、L141、E142、K143、R144、N145、A146、S1
47、K148、P149、Q150、G151、T152、G155、K15
7、P160、N173、G174、A175、K197、K199,N200
、R202、S214、E215、H216、G218、R224、V235、
P236、G237、T238、H249、Q250、V253、D256、T
267、F275、R277、F278、L288、D289、R290、G2
91、A292、T293、L295、N301、M306、Q308、D30
9、L311、Q312、Q313、R315、R316、G318、D319
、N322、E325、D334、K341、G354、G367、V371、
E385、K389、R392、E394、R396、P397、G398、R
402、P404およびP406。
【0124】組織因子結合部位 ASA計算を実施したところ、複合体ではヒトFVIIの次の残基はそれらの
ASAを変える:L13、K18、F31、E35、R36、L39、F40、
I42、S43、S60、K62、D63、L65、I69、C70、F71、
C72、L73、P74、F76、E77、G78、R79、E82、K85、
Q88、I90、V92、N93、E94、R271、A274、F275、V
276、R277、F278、R304、L305、M306、T307、Q3
08、D309、Q312、Q313、E325およびR379。
【0125】活性部位領域 活性部位領域は、触媒トライアッド(残基H193、D242、S344)中
の原子から10Åの距離内に少なくとも1個の原子を有する残基として定義され
ている:I153、Q167、V168、L169、L170、L171、Q1
76、L177、C178、G179、G180、T181、V188,V18
9、S190、A191、A192、H193、C194、F195、D196
、K197、I198、W201、V228、I229、I230、P231、
S232、T233,Y234、V235、P236、G237、T238、T
239、N240、H241、D242、I243、A244、L245、L2
46、V281、S282、G283、W284、G285、Q286、T29
3、T324、E325、Y326、M327、F328、D338、S339
、C340、K341、G342、D343、S344、G345、G346、
P347、H348、L358、T359、G360、I361、V363、S
363、W364、G365、C368、V376、Y377,T378、R3
79、V380、Q382、Y383、W386、L387、L400およびF
405。活性部位結合裂溝のリッジ 活性部位結合裂溝領域のリッジは、FVIIa構造1FAK.pdbを目視検
査し、次であると定義された:N173、A175、K199,N200、N2
03、D289、R290、G291、A292、P321およびT370。
【0126】
【実施例2】哺乳動物細胞でのヒト血液凝固VII因子の発現に適した発現カセットのデザイ 哺乳動物細胞での高発現を容易にするために、ヒト血液凝固VII因子をコー
ドする完全長cDNAの短型と、その本来の短シグナルペプチド(Hagenら
、1986、PNAS83:2412)とを包含する配列番号2に示すDNA配
列を合成した。まずATG開始コドンの前後をコザックコンセンサス配列(Ko
zak、M.J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):
947−50)により修飾し、ATG開始コドンの上流コンセンサス配列を完全
に一致させた。第2に元のヒト血液凝固因子cDNAのオープンリーディングフ
レームを、コドン使用に関する偏りを高度に発現するヒト遺伝子で頻繁に使用さ
れているコドンのものに合わせ、変更した。さらに、効果的に翻訳を停止させる
ことを目的として、オープンリーディングフレームの末端に2カ所翻訳停止コド
ンを挿入した。完全に合成的かつ発現に最適化されたヒトFVII遺伝子を、7
0−merのDNAオリゴヌクレオチドから組み立て、最後に5‘および3’末
端それぞれにBamHIとHindIII部位を挿入した末端プライマーを使い
、標準的PCRにより増幅し、以下の配列を得た(配列番号4):
【0127】 ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggc
tgccgtcttcgtcacccaggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctgga
agagctccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagaggaacagtgcagctttgaggaagcccgggagat
tttcaaagacgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcgcctccagccc
ttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggg
gcgcaattgcgaaacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactg
cagcgatcacacgggcacgaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtc
ctgcacgcccacggtggaatacccttgcgggaagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaacccca
gggccggatcgtcggcgggaaggtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtcaacgg
ggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagat
taagaattggcggaacctcatcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtc
ccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacctatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgct
ccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggacctttacgaa
cgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggggccagctgctcgaccggggcgctaccgct
ctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcccgcaaagtgggg
gactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatggctccaaggatagctgcaagggg
gactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccgggatcgtcagctggggccag
ggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctc
atgcggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaagctt
【0128】 未変性ヒト血液凝固VII因子に関する発現カセットを含む生成PCR産物の
クローニングに適したベクターを、pCINeo(プロメガ(Promega)
)のイントロン内にクローニングし調製した。PCI−Neo由来の合成イント
ロンは上記の標準的PCR条件と次のプライマーを使い増幅され: CBProFpr174:5'-AGCTGGCTAGCCACTGGGCAGGTAAGTATCA-3'および CBProFpr175:5'-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3' その結果322bpのPCR断片を得た。この断片はpCDNA3.1/Hy
gR(インビトロゲン(In Vitro Gen)より得た)にクローニング
する前にNheIおよびBamHIで切断され、PF#34を得た。 未変性ヒト血液凝固VII因子の発現カセットはPF#34のBamHIおよび
HindIII部位間にクローニングされ、プラスミドPF#226を得た。
【0129】
【実施例3】追加のインビボグリコシレーション部位を持ったヒト血液凝固VII因子の変異 形をコードした発現カッセットの構築 配列オーバーハング延長(SOE)PCRを用い、置換コドンを持った変異型
ヒト血液凝固因子オープンリーディングフレームを作製した。SOE−PCRで
は、FVIIオープンリーディングフレームのN−末端部分とC−末端部分の両
方がまず独立に一次PCRで増幅された。 例えばコドンR315とV317を、コドンN315とT317に変更するた
めには、次のプライマーを使い一次PCRを行う:
【0130】 CBProFpr216:5'-CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3‘と CBProFpr229:5'-GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3'、 および CBProFpr221:5'-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3'と CBProFpr228:5'-GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3'。
【0131】 一次PCR産物は次にまとめられ、末端プライマー(CBProFpr216とCBProFpr22
1)を加え、所望のR315N+V317TFVII変異体をコードする第2完
全長を得た。2次PCR産物はベクターPF#34内、BamHIとHindI
II部位間にクローニングしPF#249を得る前に、BamHIおよびHin
dIIIで切り詰められた。 さらに、導入された突然変異が発現プラスミド中の固有の制限エンドヌクレア
ーゼ部位に十分近い場合には、変異体遺伝子は単独PCR段階と、続くクローニ
ングとを包含する構築手順を用い構築される。例えばK143N+N145Tは
次のPCRプライマーを単一PCR反応中に使用し導入された:
【0132】 CBProFpr226:5'-CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3'および CBProFpr221:5'-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3'。
【0133】 PCR産物は次に制限エンドヌクレアーゼ部位XbaIとHindIIIを用
いてクローニングされた。 上記のストラテジーを用い、次のグリコシル化コンジュゲートを調製し、その
アミド溶解活性を低レベル触媒活性測定法と題する節に記載した様にして試験し
た。さらにコンジュゲートの幾つかを凝固活性測定法と題する節に記載の1段階
凝固アッセイにかけた。得られた結果を下表に示す。
【0134】
【表4】
【0135】
【実施例4】別の基部(N−末端局在)グリコシル化部位の導入によるグリコシル化部位有用 性の改良 野生型ヒトFVIIaグリコシル化部位の自己溶解を防ぐために、置換:上記
R315NとV317Tを行い位置315にグリコシル化部位を導入してPF#
249を得た。 リポフェクタミン(Lipofactamine)2000を用いたCHO
K1細胞のトランスフェクションにより、一過性の低発現レベルを得た。アミド
溶解アッセイ、COASETRFVIIにより24時間の一過性上清をアッセイ
したところ、変異体が活性であることを示した。400μg/mlのヒグロマイ
シン(Hygromycin)Bを用い選別して安定型クローンのプールを得た
。このプールはR315N+V317T変異体を約0.2μg/mlで発現し、
ウエスタンブロット分析により導入されたグリコシル化部位の有用性を決定する
ことができた。安定型プールより得た24時間上清をウエスタンブロットでアッ
セイしたところ、位置315に導入されたグリコシル化部位が部分的に有用であ
り、完全に加工された分泌蛋白質の約半数がグリコシル化されていることが示さ
れた。しかし、位置145の本来のグリコシル化部位が、置換K143N+N1
45Tにより位置143に移された場合、位置315に導入されたグリコシル化
部位は完全にグリコシル化されるとウエスタンブロットにより判定された。
【0136】
【実施例5】HEK293細胞でのFVIIの発現 細胞株HEK293(ATCC#CRL−1573)は、EMEM、高グルコ
ース10%熱不活性化FCS(ギブコ(Gibco)/BRLカタログ#100
91)、5μg/mlフィロキノンを含むT−25フラスコ中に20%集密度で
接種し、融合するまで増殖させた。この融合単細胞層に1、2、5、10および
20μgの上記プラスミドp226を、リポフェクタミン2000トランスフェ
クション試薬(ライフテクノロジーズ(Life technologies)
をメーカー指示書通りに用いてトランスフェクションした。トランスフェクショ
ン24時間後にサンプルを採取した。24時間の一過性発現実験に於けるFVI
I濃度は平均して0.15μg/mlであった。 続いて、100μg/mlのヒグロマイシンBを含む選択培地を細胞に投与し
た。3日または4日毎に培地を新しくしながら3週間選別した後に、ヒグロマイ
シン耐性細胞を1μgのプラスミドDNAと2μgのプラスミドDNAをトラン
スフェクションしたフラスコ中に融合融合させた。5個のフラスコそれぞれから
得た細胞を集め、プールした。得られた未変性ヒト血液凝固VII因子を発現す
るトランスフェクタントの安定型プールを液体窒素中に標準的方法に従い凍結し
た。
【0137】
【実施例6】安定してFVIIを発現するHEK293細胞の作成 HEK293PF#226トランスフェクタントプールのバイアルを融解し、
細胞を15mlのDMEM高グルコース、10%のFCS、フィロキノン(5μ
g/ml)、100U/lペニシリン、100μg/mlストレプトマイシンを
含む75cm2組織フラスコに接種し、24時間増殖させ、そして以後の実験は
これを用いて行った。細胞を集め、希釈し、96ウエルマイクロタイタープレー
トに1/2細胞/ウエルの密度で接種した。12日後、約20−100細胞のコ
ロニーがウエル内に存在し、1コロニーのみ含むウエルを標識した。さらに2日
間増殖させた後、100μlの培地をウエルに追加し加えた。2日後、1コロニ
ーのみを含む全てのウエルの培地を交換した。最初のコロニーは25cm2組織
フラスコに移され、3日間培養された後集密度に応じてコロニーは25cm2
織フラスコに移され、さらに11日間培養された。T−25組織フラスコで融合
した場合には、培地が交換され、コロニーに24時間増殖培地中にFVIIを分
泌させ、その後上清を集めてCOASET FVIIアミド溶解アッセイを用い
てVII因子の存在についてアッセイされた。1クローン、C18が29μg/
mlのFVIIを発現することが見いだされた。
【0138】
【実施例7】FVIIaの機能を阻害するアミド溶解能を持たないFVIIグリコシル化変異 体の発現 活性部位リッジ突然変異体R290N+A292TおよびG291の発現に適
した発現プラスミドを、実質的に実施例3記載通りに構築した。 アミド溶解アッセイCOASETRFVII(上記参照)を用い、2種類のグ
リコシル化変異体、R290N+A292TおよびG291NのrFVIIa活
性阻害能力を評価した。R290N+A292TをコードしているプラスミドP
F#250とG291NをコードしているプラスミドPF#294を、リポフェ
クタミン2000を用いて、ほぼ集密的まで血清培養されたHEK293細胞内
にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞は、トランスフ
ェクション後、培地を無血清培地(DMEM、ITS−A、ExCyte、フィ
ロキノン、P/S)に交換するまえに、5%CO2下、37℃で3時間インキュ
ベーションされた。トランスフェクション4時間後に、コンディショニング培地
を集め、分析にかけるために遠心分離し清浄化した。 標準曲線はrFVIIa:0.0125ng、0.025ng、0.05ng
、0.075ngおよび0.1ngを用い作成した。2種類のグリコシル化変異
体R290N+A292TおよびG291Nについて得た未希釈、2倍希釈、5
倍希釈、10倍希釈、そして50倍希釈のコンディショニング培地、またはモッ
クトランスフェクション由来のコンディショニング培地の一部を0.025ng
のrFVIIaでスパイクした。COASET FVIIアッセイでアッセイし
た場合、0.025ngのFVIIaはOD405=0.35(初回測定)とOD4 05 =0.26(第2回測定)のシグナルに相当した。 得られた結果を下表にまとめる:
【0139】
【表5】
【0140】 上記データから明らかな様に、グリコシル化コンジュゲートG291Nおよび
R290N+A292Tは機能的fFVIIaを阻害する。
【実施例8】FVIIの精製およびその後の活性化 野生型FVIIおよびそのコンジュゲートの精製は4℃で行われた。コンジュ
ゲート(または野生型FVII)を発現している細胞より得た上清を無菌濾過し
(0.22μm)、冷ミリQ水で2倍に希釈した。サンプルを4℃にて10mM
のTris pH8.6に平衡化されたO−セファロースファーストフロー樹脂
(ファルマシア(Pharmacia)にかけた。サンプルを加えた後、カラム
を10mMのTris(pH8.6)、150mM NaClで280nmの吸
光度がベースラインになるまで洗浄した。次にカラムを10mMのTris(p
H8.6)、100mMのNaClで平衡化した。結合したコンジュゲート(ま
たは野生型FVII)は10mMのTris(pH8.6)、100mMのNa
Cl、5mMのCaCl2で溶出された。コンジュゲート(または野生型FVI
I)を多く含む分画をプールし、透析により、またはVivaspin濃縮装置
(Vivascience)を用い濃縮した。
【0141】 コンジュゲート(または野生型FVII)の自己活性化は、濃縮し、10mM
のTris(pH7.8−8.6)、100mM NaCl、5mM CaCl 2 中に溶出蛋白質をインキュベーションすることで得た。 あるいはコンジュゲート(または野生型FVII)はCNBr活性化セファロ
ースに結合された第Xa因子により、10mM Tris(pH7.4−8.0
)、100mM NaCl、5mM CaCl2中で活性化された。 コンジュゲート(または野生型FVII)は10mMのCaCl2、50mMの
NaCl、3%マンニトール、0.05%Tween80を含みpH5.6に緩
衝化された溶液中に緩衝液交換され、無菌濾過後に−80℃で保管された。
【0142】
【実施例9】FVIIのN−末端グリコシル化 第VII因子は、10mMクエン酸ナトリウム、20mMCaCl2、100m
M NaCl、pH5.5を含む緩衝液中にM−PEG−CHO(M−ALD−
5000,シェアウォーター(Shearwater)より得た)を用い、約5
kDaの分子量を持つメトキシポリエチレングリコール(mPEG)でコンジュ
ゲートされた。M−PEG−CHOは50−100倍モル過剰に存在し、そして
その蛋白質濃度は0.2−0.5mg/mlであった。反応は室温で1時間、攪
拌しながら300−1500μlのバッチで行われ、それからNaBH3CNが
500−1000倍過剰量加えられ、一晩、攪拌しながら室温にて連続インキュ
ベーションされた。 PEG化FVIIは緩衝液A(10mM Tris pH7.6)に緩衝液交
換され、緩衝液Aで平衡化されたモノQカラム(ファルマシア(Pharmac
ia))に4℃にてかけられた。結合蛋白質は40倍量の0−100%B(10
mM Trsi(pH7.6)、500mM NaCl)の勾配で溶出された。
【0143】
【実施例10】ラットでの薬物動態研究 野生型FVIIと本発明のコンジュゲートを、1.5mg/mlCaCl2
30mg/mlマンニトール、0.1mg/mlポリソルバット80および3m
g/mlNaClを含むpH5.5のグリシル−グリシン緩衝液中に1.3mg
/mlで調合した。各調剤のインビボ半減期を測定するために、Sprague
−Dawleyラットに静脈内への1回大量注射により投与した。高濃度のCa 2+ を原因として起こり得る心不全のリスクを減らす為に、注射は約10秒以上か
けてゆっくりと行った。それぞれについて、9匹の麻酔をかけたラットから好適
間隔、例えば注射後1分、15分、30分、45分および1時間目に採血を行っ
た。血液サンプルは凝固を防ぐために、50μlのアデニン添加クエン酸−リン
酸−デキストロース液(シグマ(Sigma)#C4431)を含む1mlのチ
ューブに集められた。採血後すぐに、サンプルはアッセイのために遠心分離して
クエン酸血漿上清が集められるまで約0℃に保管された。サンプルは凝固活性測
定法の節に記載の1段階凝固アッセイでアッセイされ、続いて半減期が計算され
た。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成14年8月21日(2002.8.21)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 7/02 A61P 9/10 4H045 7/04 101 9/10 11/00 101 31/04 11/00 35/00 31/04 C07K 14/745 35/00 C12P 21/02 C C07K 14/745 C12N 15/00 ZNAA C12N 5/10 5/00 B C12P 21/02 A61K 37/465 (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF ,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW, ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ, MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM, AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B Z,CA,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK ,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE, GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,J P,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR ,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK, MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,R O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,UZ,VN, YU,ZA,ZW (72)発明者 ペダーセン,アンデルス・ヒェルホルト デンマーク国デーコー−2970 フルスホル ム,アガーン・アレー 1,マキシゲン・ エイピーエス (72)発明者 ボルネス,クラウス デンマーク国デーコー−2970 フルスホル ム,アガーン・アレー 1,マキシゲン・ エイピーエス Fターム(参考) 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA93X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C076 CC11 CC15 CC27 DD66A EE06A EE23A FF02 FF04 4C084 AA02 AA07 DC14 NA05 ZA361 ZA451 ZA531 ZA541 ZA591 ZB261 ZB351 4H045 AA10 AA30 BA10 CA42 DA65 EA22 EA28 FA74

Claims (73)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ポリペプチドに共有結合した少なくとも1つの非ポリペプチド部
    分を含んでなるコンジュゲートであって、該ポリペプチドのアミノ酸配列が、前
    記非ポリペプチド部分のための結合基を含む少なくとも1つのアミノ酸残基を導
    入または除去されている点で、配列番号1中に示される野生型FVIIまたはF
    VIIaのアミノ酸配列と異なるコンジュゲート。
  2. 【請求項2】 該結合基が、リジン、システイン、アスパラギン酸およびグルタ
    ミン酸より成るグループから選択される、請求項1記載のコンジュゲート。
  3. 【請求項3】 該結合基がリジンである、請求項2記載のコンジュゲート。
  4. 【請求項4】 該ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つのリジン残基
    を除去されている点で配列番号1の配列と異なる、請求項3記載のコンジュゲー
    ト。
  5. 【請求項5】 リジン残基が置換により除去されている、請求項4記載のコンジ
    ュゲート。
  6. 【請求項6】 除去されたリジン残基が、K18、K32、K38、K62、K
    85、K109、K137、K143、K148、K157、K161、K19
    7、K199、K316、K337、K341、K389およびそれらの組み合
    わせより成るグループから選択される、請求項4または5記載のコンジュゲート
  7. 【請求項7】 リジン残基が、K18、K62、K85、K197、K341お
    よびそれらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項6記載のコン
    ジュゲート。
  8. 【請求項8】 リジン残基がR、Q、NおよびHより成るグループから選択され
    るアミノ酸残基で置換されている、請求項5−7の何れかに記載のコンジュゲー
    ト。
  9. 【請求項9】 リジン残基がRで置換されている、請求項8記載のコンジュゲー
    ト。
  10. 【請求項10】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つのリジン残基
    が導入されている点で配列番号1と異なる、請求項3−9の何れかに記載のコン
    ジュゲート。
  11. 【請求項11】 リジン残基が置換により導入されている、請求項10記載のコ
    ンジュゲート。
  12. 【請求項12】 置換がI42K、Y44K、L288K、D289K、R29
    0K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S314K、R31
    5K、V317K、L390K、M391K、R392K、S393K、E39
    4K、P395K、R396K、P397K、G398K、V399K、L40
    0K、L401K、R402K、A403K、P404K、F405Kおよびそ
    の組み合わせより成るグループから選択される、請求項11記載のコンジュゲー
    ト。
  13. 【請求項13】 置換がR290K、R315K、R392K、R396K、R
    402Kおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項12記
    載のコンジュゲート。
  14. 【請求項14】 少なくとも1つのリジン残基が除去され、そして少なくとも1
    つのリジン残基が導入されている、請求項3−13のいずれかに記載のコンジュ
    ゲート。
  15. 【請求項15】 結合基がシステインである、請求項2記載のコンジュゲート。
  16. 【請求項16】 システイン残基が置換により導入された、請求項15記載のコ
    ンジュゲート。
  17. 【請求項17】 置換がI30C、K32C、D33C、A34C、T37C、
    K38C、W41C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C
    、K143C、R144C、L288C、D289C、R290C、G291C
    、A292C、S314C、R315C、K316C、V317C、L390C
    、M391C、R392C、S393C、E394C、P395C、R396C
    、P397C、G398C、V399C、L401C、R402C、A403C
    、P404Cおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求項1
    6記載のコンジュゲート。
  18. 【請求項18】 置換がK32C、Y44C、K143C、R290C、R31
    5C、K341C、R392C、R396C、R402Cおよびその組み合わせ
    より選択される、請求項17記載のコンジュゲート。
  19. 【請求項19】 結合基がアスパラギン酸および/またはグルタミン酸である、
    請求項2記載のコンジュゲート。
  20. 【請求項20】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つのアスパラギ
    ン酸残基および/またはグルタミン酸残基が導入されている点で配列番号1と異
    なっている、請求項19記載のコンジュゲート。
  21. 【請求項21】 アスパラギン酸残基および/またはグルタミン酸残基が置換に
    より導入された、請求項20記載のコンジュゲート。
  22. 【請求項22】 置換がI30D/E、K32D/E、A34D/E、T37D
    /E、K38D/E、W41D/E、Y44D/E、S45D/E、D46C、
    L141D/E、E142D/E、K143D/E、R144D/E、L288
    D/E、R290D/E、G291D/E、A292D/E、Q313D/E、
    S314D/E、R315D/E、K316D/EV317D/E、L390D
    /E、M391D/E、R392D/E、S393D/E、P395D/E、R
    396D/E、E397D/E、G398D/E、V399D/E、L401D
    /E、R402D/E、A402D/E、A403D/E、P404D/Eおよ
    びその組み合わせより成るグループから選択される、請求項21記載のコンジュ
    ゲート。
  23. 【請求項23】 置換がK32D/E、Y44D/E、K143D/E、R29
    0D/E、R315D/E、K341D/E、R392D/E、R396D/E
    、R402D/Eおよびその組み合わせより成るグループから選択される、請求
    項22記載のコンジュゲート。
  24. 【請求項24】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つのアスパラギ
    ン酸残基および/またはグルタミン酸残基が除去されている点で配列番号1と異
    なっている、請求項19記載のコンジュゲート。
  25. 【請求項25】 アスパラギン酸残基および/またはグルタミン酸残基が置換に
    より除去された、請求項24記載のコンジュゲート。
  26. 【請求項26】 置換がD33、D46、D48、E77、E82、D86、D
    87、E94、E99、D104、E116、D123、E132、E142、
    E163、D196、E210、D212、E215、D217、D219、E
    220、D256、E265、E270、D289、E296、D309、D3
    19、E325、D334、D338、D343、E385、E394およびそ
    の組み合わせより成るグループから選択される、請求項25記載のコンジュゲー
    ト。
  27. 【請求項27】 少なくとも1つのアスパラギン酸および/またはグルタミン酸
    残基が導入され、そして少なくとも1つのアスパラギン酸および/またはグルタ
    ミン酸残基が除去された、請求項19−26の何れかに記載のコンジュゲート。
  28. 【請求項28】 非ポリペプチド部分がポリマー分子である、前記請求項の何れ
    かに記載のコンジュゲート。
  29. 【請求項29】 ポリマー分子が天然型または合成ホモポリマーおよびヘテロポ
    リマーから成るグループより選択される、請求項28記載のコンジュゲート。
  30. 【請求項30】 ポリマー分子が、直鎖型または分岐型ポリエチレングリコール
    、ポリビニールアルコール(PVA)、ポリカルボン酸およびポリ(ビニルピロ
    リドン)から成るグループより選択されるホモポリマーまたはヘテロポリマーで
    ある、請求項29記載のコンジュゲート。
  31. 【請求項31】 ポリマーが直鎖型または分岐型ポリエチレングリコールである
    、請求項30記載のコンジュゲート。
  32. 【請求項32】 ポリエチレングリコールが分子量約300ないし100,00
    0Daである、請求項31記載のコンジュゲート。
  33. 【請求項33】 ポリペプチドが、配列番号1に示すアミノ酸配列と1−15ア
    ミノ残基異なっている、前記請求項何れかに記載のコンジュゲート。
  34. 【請求項34】 前記非ポリペプチド部分が糖成分であり、そして前記結合基が
    糖成分に関する結合基である、 請求項1記載のコンジュゲート。
  35. 【請求項35】 前記結合基がグルコシル化部位である、請求項34記載のコン
    ジュゲート。
  36. 【請求項36】 少なくとも1つの非天然に生ずるグリコシル化部位が導入され
    た、請求項35記載のコンジュゲート。
  37. 【請求項37】 少なくとも1つの天然に生ずるグリコシル化部位が除去された
    、請求項35記載のコンジュゲート。
  38. 【請求項38】 少なくとも1つの非天然に生ずるグリコシル化部位が導入され
    、そして少なくとも1つの天然に生ずるグリコシル化部位が除去された、請求項
    36−37の何れかに記載のコンジュゲート。
  39. 【請求項39】 導入されたグリコシル化部位がインビボグリコシル化部位であ
    る、請求項36記載のコンジュゲート。
  40. 【請求項40】 グリコシル化部位がインビボO−グリコシル化部位である、請
    求項39記載のコンジュゲート。
  41. 【請求項41】 グリコシル化部位がインビボN−グリコシル化部位である、請
    求項39記載のコンジュゲート。
  42. 【請求項42】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つの天然に生ず
    るN−X‘−X配列がN−X’−SまたはN−X‘−T配列である点で配列番号
    1と異なっており、前記X’がP以外のいずれかのアミノ酸であり、そしてXが
    SおよびT以外のいずれかのアミノ酸である、請求項41記載のコンジュゲート
  43. 【請求項43】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つの天然に生ず
    るX−X‘−Sまたは配列番号1に天然に存在するX−X’−T配列配列がN−
    X’−SまたはN−X‘−T配列で弛緩されており、前記X’がP以外のいずれ
    かのアミノ酸であり、そしてXがN以外のいずれかのアミノ酸である、請求項4
    1記載のコンジュゲート。
  44. 【請求項44】 該置換が、F4S/T、P10N、Q21N、W41N、S4
    3N、A51N、G58N、L65N、G59S/T、E82S/T、N95S
    /T、G97S/T、Y101N、D104N、T106N、K109N、G1
    17N、G124N、S126N、T128N、A175S/T、G179N、
    I186S/T、V188N、R202S/T、I205S/T、D212N、
    E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、V253N、
    E265N、T267N、E270N、R277N、L280N、G291N、
    P303S/T、L305N、Q312N、G318N、G331N、D334
    N、K337N、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361
    N、V376N、R379N、M391Nおよびそれらの組み合わせより成るグ
    ループから選択される、請求項42または43記載のコンジュゲート。
  45. 【請求項45】 該置換が、F4S/T、P10N、Q21N、W41N、A5
    1N、G58N、G59S/T、N95S/T、G97S/T、Y101N、D
    104N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126N、T
    128N、A175S/T、I186S/T、V188N、R202S/T、I
    205S/T、D212N、E220N、V253N、E265N、T267N
    、E270N、L280N、G291N、P303S/T、G318N、G33
    1N、D334N、K337N、R353N、Y357N、M391Nおよびそ
    れらの組み合わせより成るグループから選択される、請求項44記載のコンジュ
    ゲート。
  46. 【請求項46】 ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも1つの配列番号1
    に天然に存在するK−X‘−X配列またはR−X‘−X配列がN−X‘−Sまた
    はN−X’−T配列により置換されている点で異なっており、前記X‘がP以外
    のアミノ酸であり、XがSおよびT以外のアミノ酸である、請求項41記載のコ
    ンジュゲート。
  47. 【請求項47】 置換がK32N+A34S/T、K38N+F40S/T、K
    62N+Q64S/T、K85N+D87S/T、K137N+P139S/T
    、K143N+N145S/T、K148N+Q149S/T、K161N+E
    163S/T、K197N+K199S/T、K199N+W201S/T、K
    316N+G318S/T、K338N、K341N+D343S/T、K38
    9N+M391S/Tおよびその組み合わせより成るグループから選択される、
    請求項46記載のコンジュゲート。
  48. 【請求項48】 非天然に生ずるインビボN−グリコシル化部位が、置換により
    28−48、139−147、286−294、311−319、338−34
    5および388−406より成るグループから選択される位置に導入される、請
    求項41記載のコンジュゲート。
  49. 【請求項49】 置換がK32N+A34S/T、F31N+D33S/T、I
    30N+K32S/T、A34N+R36S/T、K38N+F40S/T、T
    37N+L39S/T、R36N+K38S/T、L39N+W41S/T、F
    40N+I42S/T、W41N、I42N+Y44S/T、S43N、Y44
    N+D46S/T、S45N+G47S/T、D46N+D48S/T、G47
    N+Q49S/T、K143N+N145S/T、E142N+R144S/T
    、L141N+K143S/T、I140N+E142S/T、R144N+A
    146S/T、A146N+K148S/T、S147N+P149S/T、R
    290N+A292S/T、D289N+G291S/T、L288N+R29
    0S/T、L287N+D289S/T、G291N、A292N+A294S
    /T、T293N+L295S/T、R315N+V317S/T、S314N
    +K316S/T、Q313N+R315S/T、Q312N、K316N+G
    318S/T、V317N+D319S/T、G318N、K341N+D34
    3S/T、S339N+K341S/T、G342N、D343N+G345S
    /T、R392N+E394S/T、M391N、L390N+R392S/T
    、K389N+M391S/T、S393N+P395S/T、E394N+R
    396S/T、P395N+P397S/T、R396N+G398S/T、P
    397N+V399S/T、G398N+L400S/T、V399N+L40
    1S/T、L400N+R402S/T、L401N+A403S/T、R40
    2N+P404S/T、A403N+F405S/T、P404N+P406S
    /T、K143N+N145S/T+R315N+V317S/Tおよびその組
    み合せより成るグループから選択される、請求項48記載のコンジュゲート。
  50. 【請求項50】 置換がK32N+A34S/T、K38N+F40S/T、Y
    44N+D46S/T、K143N+N145S/T、R290N+A292S
    /T、R315N+V317S/T、K341N+D343S/T、R392N
    +E394S/T、R396N+G398S/T、R402N+P404S/T
    、K143N+N145S/T+R315N+V317S/Tおよびそれらの組
    み合せより成るグループから選択される、請求項49記載のコンジュゲート。
  51. 【請求項51】 置換がK32N+A34T、K38N+F40T、Y44N+
    D46T、K143N+N145T、R290N+A292T、R315N+V
    317T、K341N+D343T、R392N+E394T、R396N+G
    398T、R402N+P404T、K143N+N145T+R315N+V
    317Tおよびそれらの組み合わせから成るグループより選択される、請求項5
    0記載のコンジュゲート。
  52. 【請求項52】 ポリペプチドが配列番号1に示すアミノ酸配列と1−15アミ
    ノ酸残基異なっている、請求項34−51の何れかに記載のコンジュゲート。
  53. 【請求項53】 1またはそれ以上のインビボグリコシル化部位が導入された、
    請求項39−51のいずれかに記載のコンジュゲート。
  54. 【請求項54】 さらにポリペプチドのアミノ酸残基に共有結合した少なくとも
    1の非ポリペプチド部分を含み、前記非ポリペプチド部分が糖成分とは異なる、
    請求項34−53のいずれかに記載のコンジュゲート。
  55. 【請求項55】 非ポリペプチド部分が請求項29−32の何れかに規定されて
    いるポリマー分子である、請求項54のコンジュゲート。
  56. 【請求項56】 コンジュゲートが少なくとも67kDaの分子量を有する、前
    記請求項の何れかに記載のコンジュゲート。
  57. 【請求項57】 コンジュゲートが不活性化されている、前記請求の何れかに記
    載のコンジュゲート。
  58. 【請求項58】 請求項1−56の何れかに規定されているアミノ酸配列を有す
    るポリペプチド。
  59. 【請求項59】 請求項58の該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
  60. 【請求項60】 請求項59の該ヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクター。
  61. 【請求項61】 請求項59によるヌクレオチド配列または請求項60による発
    現ベクターを含んでなる宿主細胞。
  62. 【請求項62】 宿主細胞がインビボグリコシル化の能力を有するガンマカルボ
    キシル化細胞である、請求項61記載の宿主細胞。
  63. 【請求項63】 ポリペプチドの発現を誘導する条件下に請求項61または62
    に規定される宿主細胞を培養すること、およびポリペプチドを回収することを含
    む請求項1−57の何れかに規定されるコンジュゲートの製造方法にあって、a
    )前記ポリペプチドが少なくとも1つのN−またはO−グリコシル化部位を含み
    、そして前記宿主細胞がインビボグリコシル化することができる真核生物宿主細
    胞であり、および/またはb)ポリペプチドがインビトロで非ポリペプチド部分
    へのコンジュゲートを受ける製造方法。
  64. 【請求項64】 請求項1−57の何れかに規定されるコンジュゲートと、薬学
    的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤とを含んでなる組成物。
  65. 【請求項65】 医薬品として使用されるための、請求項1−57のいずれかに
    規定されるコンジュゲート。
  66. 【請求項66】 哺乳動物におけるFVIIa/TF関連疾患または障害の治療
    を目的とした医薬品の製造のための、請求項1−56の何れかに規定されたコン
    ジュゲートの使用。
  67. 【請求項67】 FVIIa/TF関連疾患または障害が、凝固形成の増加が望
    ましい疾患より成るグループから選択される、請求項66記載の使用。
  68. 【請求項68】 哺乳動物におけるFVIIa/TF関連疾患または障害の治療
    を目的とした、薬剤の製造に関する、請求項57に規定された不活性型コンジュ
    ゲートの使用。
  69. 【請求項69】 FVIIa/TF−関連疾患または障害が、凝固形成の増加が
    望ましい疾患より成るグループから選択される、請求項68記載の使用。
  70. 【請求項70】 FVIIa/TF−関連疾患または障害を有する哺乳動物を治
    療する方法にあって、それを必要とする哺乳動物に請求項1−56のいずれかに
    規定されるコンジュゲートを有効量投与することを含む方法。
  71. 【請求項71】 疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグ
    ループから選択される、請求項70記載の方法。
  72. 【請求項72】 FVIIa/TF−関連疾患または障害を有する哺乳動物を
    治療する方法にあって、それを必要とする哺乳動物に請求項57に規定されるコ
    ンジュゲートを有効量投与することを含む方法。
  73. 【請求項73】 疾患または障害が、凝固形成の増加が望ましい疾患より成るグ
    ループから選択される、請求項72記載の方法。
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