CN108690841B - 一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种mPEG‑Mal5000修饰β‑淀粉酶的方法，mPEG‑Mal5000作为修饰剂，最佳修饰工艺参数为mPEG‑Mal5000添加比例为1:4、修饰反应温度为58℃、修饰反应pH为6.0，反应时间为10min。mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶的比酶活力为（2.08±0.055）万U/mg，酶活比未修饰β‑淀粉酶提高了20.10%；修饰后酶动力学参数Km降低了12.95%，Vmax提升了26.87%，在温度为30℃‑70℃时，mPEG‑β‑淀粉酶耐热性明显高于β‑淀粉酶耐热性。在pH6.5‑7.5时，mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶pH稳定性明显高于β‑淀粉酶pH稳定性。

Description

一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法
技术领域
本发明属于甘薯生物活性物质提取技术领域，具体涉及一种响应面法优化mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法。
背景技术
β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)是外切型糖化酶，它从淀粉分子的非还原性末端，按α-1,4糖苷键顺次切下麦芽糖单位，并在切断麦芽糖的同时发生瓦尔登转化，使产物由α型变为β型麦芽糖。β-淀粉酶主要应用于食品、发酵、纺织、制药等工业过程中。β-淀粉酶广泛存在于高等植物中，如甘薯、大麦、小麦、大豆等。甘薯中β-淀粉酶是块根中仅次于甘薯贮藏蛋白的一种蛋白质成分，而其他高等植物中仅含有痕量酶。甘薯β-淀粉酶是从新鲜甘薯制备淀粉的废液中提取分离，具有生物活性的蛋白质大分子，其热稳定性是制约甘薯β-淀粉酶在食品工业中应用的关键因素。
随着淀粉糖行业的迅猛发展，高麦芽糖浆和超高麦芽糖浆的产量迅速扩大，β-淀粉酶的应用范围越来越广，而β-淀粉酶的研究尚未取得较大突破，目前甘薯β-淀粉酶在高温下性质不稳定，环境条件如pH、压力、温度和离子强度等稍微变化，酶就会失去活性，因此，提高甘薯β-淀粉酶热稳定性和酶活极其重要。
酶分子化学修饰是指通过化学手段剪接切割酶的主链或者修饰侧链，从而提高酶的稳定性、生物活性或者延长酶的半衰期，创造出天然酶不具备的某些优良性状，修饰酶得到越来越广泛的应用。蛋白质的化学修饰可应用于医药领域及生物催化剂领域。在医药领域，不同种类的蛋白药物，包括酶、细胞因子、抗体等经过聚乙二醇修饰后其理化性质显著改良。
酶修饰技术在β-淀粉酶研究上也有进一步的发展。在蛋白质的化学修饰中，修饰剂的选择极为重要，它不但关系到修饰反应能否顺利进行，而且对修饰的效果有着重要的影响。当前用来对蛋白质进行化学修饰的修饰剂很多，其中应用最广泛的是聚乙二醇，聚乙二醇是一种可溶性惰性聚合物，既溶于水，也溶于有机溶剂，它没有免疫原性和毒性，不会破坏生物分子的活性，其次是多糖类，如右旋糖苷、聚蔗糖、淀粉、壳聚糖、β-环糊精，琼脂糖等；另外，长链脂肪酸类以及聚烯属烃基氧化物等，如硬脂酸、月桂酸、棕搁酸等。
目前，用于食品中酶分子修饰的修饰剂有壳聚糖、聚乙二醇、和戊二醛等。如前所述，以壳聚糖和戊二醛作为修饰剂时，仅能提高酶的稳定性，酶活力均有损失。
随着工业的发展，对酶量的需求会越来越大，对酶的种类要求也会越来越多，对酶的稳定性要求会越来越高。为满足工业上越来越多的要求，酶修饰技术应用会越来越广泛为了提高酶的活力稳定性等性质，酶修饰技术的研究还要更加深入。
酶分子化学修饰目前是提高酶的稳定性、生物活性或者延长酶的半衰期的非常有效的手段。β-淀粉酶作为一种具有生物催化效应的蛋白质，在如稳定性、活性等方面还有望继续挖掘，以便降低生产成本，更好的应用于工业生产。因此，对β-淀粉酶的修饰和改造具有潜在应用价值，也一直是研究的热点。采用mPEG-NHS5000、mPEG-NHS20000、mPEG-Ts5000、mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-Mal5000对β-淀粉酶进行化学修饰，以提高酶的催化性能。修饰反应工艺参数对酶的修饰影响较大，如酶蛋白分子中反应基团的解离状态是由pH决定的；温度过高造成酶蛋白空间结构被破坏，降低酶活力；修饰剂与酶的比例应严格控制，防止酶的过度修饰而导致活性的丧失。应用响应面法优化mPEG与酶的添加比例、修饰温度、修饰pH及修饰时间，研究工艺参数对酶热稳定性的影响规律，并研究最佳参数下mPEG-β-淀粉酶的酶学性质。研究对改善酶制剂酶学性质理论具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是构建mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶模型，并提供一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法，为提高甘薯加工副产物附加值及甘薯生物活性物质工业化生产提供参考和依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种响应面法优化mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法，该方法包括以下步骤：
(1)mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶
向试管中加入8.0mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/Lβ-淀粉酶酶液1.0mL和1.0mL mPEG-Mal5000溶液，置于恒温金属浴中震荡10min～30min，取反应液进行透析24h，待透析完毕，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力；
(2)实验设计与统计分析
改变mPEG-Mal5000溶液浓度使β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比为1:1～1:6、恒温金属浴的温度为25℃～75℃、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH为3.0～8.0，进行单因素实验，测定比酶活力；根据单因素试验结果，选取比酶活力影响较显著的β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH这三个因素，并对其进行实验因素与水平的设定，然后进行实验；
(3)模型的建立和统计分析
根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比B、恒温金属浴的温度C、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值A与响应值比酶活力Y的二次多项回归方程：
Y＝2.15+0.025*A+0.00528*B+0.016*C-0.033*A*B+0.027*A*C+0.0011*B*C-0.17*A2-0.13*B2-0.13*C2；
(4)试验结果分析与优化
根据回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面三维图，响应值由此得到优化，根据模型分析可得到β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH的最优化工艺参数。
本发明还提供了一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法，包括以下步骤：向试管中加入8.0mLpH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/Lβ-淀粉酶酶液1.0mL和500μmol/L mPEG-Mal5000溶液1.0mL，置于58℃恒温金属浴中震荡10min，取反应液进行透析24h，透析完毕，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL后进行真空冷冻干燥。
本发明产生的有益效果是，采用mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶，将mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的比酶活力作为响应值，建立该工艺的二次多项数学模型，该模型极显著，拟合良好，各反应条件参数对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶活性的影响的次序由大到小为修饰pH>修饰温度>修饰比例，对mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶活性影响极为显著，修饰pH与修饰温度交互作用显著，结合回归模型分析和验证试验，可得mPGE-Mal5000修饰β-淀粉酶的最佳工艺参数：修饰比例为1:4，修饰温度为58℃，修饰pH为6.0，在此条件下mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的酶活为(2.082±0.148)万U/mg，相比β-淀粉酶的酶活性提高20.1％。修饰后的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在酶学性质方面有很大改善，修饰后酶动力学参数Km降低了12.95％，Vmax提升了26.87％，在温度为30℃-70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶耐热性明显高于β-淀粉酶耐热性。在pH6.5-7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶pH稳定性明显高于β-淀粉酶pH稳定性。修饰后的β-淀粉酶在酶解淀粉时，缩短酶解时间，提高酶解效率，提升了耐热性和耐碱性，降低了生产成本，这在啤酒加工与饴糖生产等工业中具有一定的实际意义。
附图说明
图1为6种修饰剂在不同比例下对β-淀粉酶活力的影响；
图2为不同温度对修饰反应的影响；
图3为不同pH缓冲液对修饰反应的影响；
图4为不同时间对修饰反应的影响；
图5a为修饰比例与修饰pH的交互作用；
图5b为修饰温度与修饰pH交互作用；
图5c为修饰pH与修饰比例交互作用；
图6为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性，其中a为温度对比酶活力的影响，b为温度对相对酶活的影响；
图7为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适酶解pH(a)和pH稳定性(b)，其中a为pH对比酶活力的影响，b为pH对相对酶活的影响；
图8为β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶Lineweaver-Burk曲线。
具体实施方式
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试剂
β-淀粉酶：美国Sigma-Aldrich公司，分子量55.7kDa，比酶活力1.70万U/mg；mPEG-NHS5000、mPEG-NHS20000、mPEG-Ts5000、mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-Mal5000，美国Nanocs公司，纯度≥95％。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2仪器与设备
紫外可见分光光度计：WFJ7200(优尼柯上海仪器有限公司)；
恒温水浴锅：DZKW-4(北京中兴伟业仪器有限公司)；
振荡型恒温金属浴：TUS-200P(上海一恒科技有限公司)。
1.2.2mPEG修饰β-淀粉酶的反应
向试管中加入8.0mL一定pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/Lβ-淀粉酶酶液1.0mL和一定浓度的mPEG溶液1.0mL，总体积为10.0mL。在一定温度下置于恒温金属浴中震荡一定时间，取反应液进行透析24h，待透析完毕，获得mPEG-β-淀粉酶复合物透析液，4℃储藏备用。
1.2.3单因素设计
1.2.3.1β-淀粉酶与修饰剂比例对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，使β-淀粉酶与mPEG-NHS5000、mPEG-NHS20000、mPEG-Ts5000、mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-Mal5000的摩尔比分别为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，溶液pH 6.0，放置在55℃振荡恒温金属浴内10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.3.2温度对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000混溶到pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，两者摩尔比为1:4，分别放置在25℃，35℃，45℃，55℃，65℃，75℃振荡恒温金属浴中10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.3.3pH对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000按1:4摩尔比混溶到pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，放置在55℃的恒温金属浴中10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配方如下：
Figure BDA0001573790580000051
Figure BDA0001573790580000061
1.2.3.4时间对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000混溶到pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，两者摩尔比为1:4，放置在55℃的恒温金属浴中，分别保温5min、10min、15min、20min、25min、30min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.4响应面设计
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken中心组合进行三因素三水平的试验设计。以修饰反应pH(A)、β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的比例(B)、反应温度(C)为自变量，以比酶活(Y)为响应值，设计了三因素三水平响应面分析试验，试验方案见表1。
表1响应面试验因素及水平
Figure BDA0001573790580000062
1.2.5酶学性质
1.2.5.1最适温度及热稳定性
最适温度：酶液pH 6.0，在不同温度(20-75℃)下，测定酶的比酶活力，获得最适温度。
热稳定性：将酶液分别置于不同温度(20-75℃)恒温水浴中，保温1h后测其酶活。以未保温酶酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活，获得酶热稳定性。
1.2.5.2最适pH及pH稳定性
最适pH：酶液置于50℃水浴，在不同pH(3.0-8.5)下，测定比酶活，获得最适pH。
pH稳定性：将酶液分别置于不同pH(3.0-8.5)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，保温4h后测其酶活。以未保温酶酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活，获得酶pH稳定性。
1.2.5.3米氏常数和酶促反应速率的测定
利用米氏公式求出米氏常数(Km),和最大反应速率(Vmax)。米氏公式表示为：
Figure BDA0001573790580000071
式中：ν——反应速率mol/(L·min)，Vmax——最大反应速率mol/(L·min)，Km——米氏常数mmol/L，S——底物浓度mmol/L。
分别测定β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在55℃，pH6.0条件下不同淀粉底物浓度[S]的反应速率V，用纵坐标表示酶促反应速率的倒数(1/V)，用横坐标表示底物浓度的倒数(1/[S])，绘制Lineweaver-Burk曲线，求出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。
1.3测定方法
1.3.1蛋白含量测定
考马斯亮蓝G250法。取1mL待测样品，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂并摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色记录A595nm。根据所测A595nm从标准曲线上计算蛋白质含量。每隔样品重复三次，取平均值。
绘制标准曲线：以A595nm值为纵坐标，以牛血清蛋白微克数为纵坐标，绘制标准曲线。
Figure BDA0001573790580000072
式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。
1.3.2酶活力测定
采用DNS法测定酶活。测定步骤：取9mL1.1％的淀粉溶液含0.2mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸(pH 6.0)于试管中，55℃预热5min后加入1.0mL酶液准确反应10min，立即移取2mL反应液至装有2mLDNS溶液的具塞比色管中，沸水浴10min，取出，冷却至室温，加入10mL蒸馏水摇匀并于520nm波长处进行比色，空白管以失活的酶液代替原液。
绘制标准曲线：以OD520nm值为纵坐标，以葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
测的OD520nm值后，由标准曲线计算出相应的葡萄糖毫克数，得常数K，再乘以1.9倍，即为麦芽糖毫克数。
酶活力/(U/mL)＝K×n×6×5×1.9
式中：K为根据标准曲线和OD520nm值计算得出的葡萄糖毫克数；n为稀释倍数；6为反应10min换算成1h；5为将吸取2mL反应液换成10mL；1.9为葡萄糖换算成麦芽糖系数。
β-淀粉酶酶活力单位定义为：在55℃，pH6.0条件下，每小时从1.1％的可溶淀粉中释放出1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。
比酶活力为每毫克蛋白所具有的β-淀粉酶的活力单位数，单位为U/mg。
1.4统计分析方法
采用SPSS 17.0数据处理软件对实验数据的方差显著性进行分析。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1修饰剂不同添加比例对修饰的影响
6种修饰剂在不同比例下对β-淀粉酶活力的影响如图1所示，由图1可知，β-淀粉酶与6种修饰剂按不同不同摩尔比混合，随着修饰剂摩尔浓度的增加，mPEG-Mal5000、mPEG-NHS5000、mPEG-Ts5000三种修饰剂可增强β-淀粉酶酶活，在摩尔比为1:4时，酶活力分别达到最大值(2.081±0.050)万U/mg、(1.96±0.055)万U/mg、(2.01±0.053)万U/mg，与β-淀粉酶相比，酶活分别提高了20.08％、13.16％、15.75％。mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-NHS-20000对β-淀粉酶酶活没有明显提高。另外，随着β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比由1:1增加到1:4，酶活力逐渐提高。酶活力由(1.79±0.051)万U/mg提高到(2.08±0.050)万U/mg，当摩尔比继续增加到1:6时，酶活力降为(2.01±0.051)万U/mg，经方差显著性分析，摩尔比为1:4与1:6时酶活力有显著性差异(P<0.05)。因此β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应摩尔比为1:4。
2.1.2温度对β-淀粉酶修饰的影响
不同温度对修饰反应的影响如图2所示，由图2可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应温度由25℃增加到55℃时，酶活力逐渐提高，当反应温度为55℃时，酶活力达到最大为(2.081±0.059)万U/mg。当温度继续升高，酶活力迅速下降，当温度为65℃时，酶活力降为(1.794±0.055)U/mg，降低了13.79％。所以β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应温度为55℃。
2.1.3pH对酶修饰的影响
不同pH缓冲液对修饰反应的影响如图3所示，由图3可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应，pH由3.0增加到6.0时，酶活力逐渐增加。当反应pH为6.0时，酶活力达到最高(2.186±0.046)万U/mg。当pH继续升高，酶活逐渐下降，当pH为7.0时，酶活力为(1.955±0.045)万U/mg，比pH 6.0时酶活降低了10.57％。所以β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应pH为6.0。
2.1.4时间对酶修饰的影响
不同时间对修饰反应的影响如图4所示，由图4可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应时间由5min提升至10min时，酶活力提高。当反应时间为10min时，酶活力达到最大值(2.101±0.059)万U/mg。继续延长反应时间，酶活力没有明显增加，经方差显著性分析，随着时间的继续延长，反应时间为15-30min时与10min时的酶活力没有明显差异(P<0.05)。因此，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应时间为10min。
2.2修饰条件的响应面优化试验
2.2.1响应面试验设计及结果
以上述单因素试验为基础，依据方法1.2.4，把修饰pH(A)，修饰比例(B)，修饰温度(C)作为三个因素，以mPEG-Mal5000-β-淀粉酶活力(Y)为响应值，遵循Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面进行试验。试验结果见表2。
表2试验设计方案及结果
Figure BDA0001573790580000091
Figure BDA0001573790580000101
利用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合，以mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的活性为响应值，得到模拟方程如下:
Y＝2.15+0.025*A+0.00528*B+0.016*C-0.033*A*B+0.027*A*C+0.0011*B*C-0.17*A2-0.13*B2-0.13*C2。
对上述模型有效性进行方差分析，结果见表3。
表3回归模型方差分析
Figure BDA0001573790580000102
注:**为极显著，P＜0.01；*为显著，P＜0.05。
由表3可知，模型回归方程的P<0.001，模型方程回归性极显著；因为回归系数R2＝0.995，失拟项0.317>0.05，失拟性检验结果不显著，故回归方程拟合程度较好。综合上述数据可得出该回归模型有高度相关性，可以用于mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶提升酶活的理论预测。从回归模型显著性分析可以看出，影响酶活力各因素按影响大小排序依次为修饰pH>修饰温度>修饰比例。
2.2.2两因素交互作用分析
响应面两因素交互作用分析如图5(a)-(c)所示，可以直观的看到各因素之间的交互作用情况。
如图5(a)所示，随着修饰pH和修饰比例的增加，酶活先升高后降低，相应曲面陡峭，等高线为椭圆形，表明修饰pH与修饰比例交互作用显著；如图5(b)所示，随着修饰pH和修饰温度的提高，酶活先升高后降低，等高线为椭圆形，表明修饰pH与修饰温度交互作用显著；如图5(c)所示，随着修饰比例和修饰温度的增加，酶活先升高后降低，等高线接近圆形，表明修饰比例与修饰温度交互作用不显著。
2.2.4最佳条件下的验证试验
通过Design-Expert软件分析，模拟预测得出酶活最高的优化组合为A＝6.08、B＝4.04、C＝58.85℃，即修饰pH为6.08、修饰比例为1:4.04、修饰温度为58.85℃时，酶活为2.147万U/mg。考虑验证试验的可操作性，将最佳工艺参数修正为修饰pH6.0、修饰比例1:4、修饰温度58℃。按照修正后的条件对修饰后的β-淀粉酶进行酶活测定，进行三次重复性试验，将三次测定的酶活取平均值为(2.082±0.148)万U/mg，修饰后酶活提高20.10％，与预测值标准偏差为3.56％。验证试验表明，响应面优化结果可靠，利用响应面优化mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的工艺是可行的。
2.3mPEG-Mal5000-β-淀粉酶与未修饰β-淀粉酶酶学性质比较
2.3.1mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和未修饰β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性进行研究，结果如图6(a)-(b)。
由图6(a)可知，β-淀粉酶在55℃时酶活最高，其值为(1.750±0.542)万U/mg，而mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在45℃-60℃均具有较高的酶活，其值分别为(2.081±0.058)万U/mg，(2.054±0.060)万U/mg，(2.017±0.062)万U/mg，(2.001±0.064)万U/mg。经mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶在温度为55℃时比β-淀粉酶酶活提高了15.27％。由图6(b)可知，当温度为30℃-70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶耐热性明显高于β-淀粉酶耐热性。当温度为30℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.80％和97.01％，耐热性提高了2.87％；当温度为35℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.62％和94.87％，耐热性提高了5.01％；当温度为40℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.50％和92.01％，耐热性提高了8.14％；当温度为45℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.01％和90.03％，耐热性提高了9.97％；当温度为50℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为98.50％和87.14％，耐热性提高了13.03％；当温度为55℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为95.22％和80.95％，耐热性提高了17.62％；当温度为60℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为88.05％和70.46％，耐热性提高了24.96％；当温度为65℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为76.41％和45.62％，耐热性提高了67.49％；当温度为70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为30.15％和18.96％，耐热性提高了59.02％；因此，在30℃-70℃mPEG-Mal5000-β-淀粉酶比β-淀粉酶热稳定性均有提高，在65℃下提高最多，这表明mPEG-Mal5000可以增强β-淀粉酶热稳定性，进而提高酶解效率，降低生产成本。
2.3.2mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适pH和pH稳定性对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适酶解pH和pH稳定性进行研究，结果如图7(a)-(b)所示。
由图7(a)可知，在pH5.0-7.0，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶均具有较高酶活，最佳酶解pH均为6.0。在pH6.0时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶酶活分别为(2.081±0.051)万U/mg，(1.709±0.053)万U/mg，经mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶在pH为6.0时比β-淀粉酶酶活提高了21.78％。由图7(b)可知，当pH为6.5-7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶pH稳定性明显高于β-淀粉酶pH稳定性。当pH为6.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为98.20％和89.25％，pH稳定性提高了10.03％；当pH为7.0时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为75.36％和53.95％，pH稳定性提高了39.68％；当pH为7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为55.22％和45.68％，pH稳定性提高了20.88％。因此，在pH6.5-7.5，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶比β-淀粉酶的pH稳定性均有提高，在pH7.0时提高最多。这表明mPEG-Mal5000可以增强β-淀粉酶的pH稳定性，提高了β-淀粉酶应用的pH范围。
2.4.5β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉动力学参数
由图8和米氏方程根据双倒数作图法计算得β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶米氏常数Km分别为64.54±0.97mmol/L和56.18±0.70mmol/L，最大酶促反应速率Vmax分别为5.21±0.05mol/(L·min)和6.61±0.06mol/(L·min)。结果表明，经mPEG-Mal5000修饰后β-淀粉酶的米氏常数Km降低了12.95％，其最大酶解速率提升了26.87％
3结论
采用mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶，将mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的比酶活力作为响应值，建立该工艺的二次多项数学模型，该模型极显著，拟合良好，各反应条件参数对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶活性的影响的次序由大到小为修饰pH>修饰温度>修饰比例，对mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶活性影响极为显著，修饰pH与修饰温度交互作用显著，结合回归模型分析和验证试验，可得mPGE-Mal5000修饰β-淀粉酶的最佳工艺参数：修饰比例为1:4，修饰温度为58℃，修饰pH为6.0，在此条件下mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的酶活为(2.082±0.148)万U/mg，相比β-淀粉酶的酶活性提高20.1％。修饰后的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在酶学性质方面有很大改善，修饰后酶动力学参数Km降低了12.95％，Vmax提升了26.87％，在温度为30℃-70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶耐热性明显高于β-淀粉酶耐热性。在pH6.5-7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶pH稳定性明显高于β-淀粉酶pH稳定性。修饰后的β-淀粉酶在酶解淀粉时，缩短酶解时间，提高酶解效率，提升了耐热性和耐碱性，降低了生产成本，这在啤酒加工与饴糖生产等工业中具有一定的实际意义。

Claims (2)

1.一种mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法，其特征在于包括以下步骤：向试管中加入8.0 mL pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/L β-淀粉酶酶液1.0 mL和500μmol/L mPEG-Mal5000溶液1.0 mL，置于58℃恒温金属浴中震荡10min，取反应液进行透析24h，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL后进行真空冷冻干燥；其中，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH由以下步骤得到：
（1）mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶向试管中加入8.0 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/L β-淀粉酶酶液1.0 mL和1.0 mL mPEG-Mal5000溶液，置于恒温金属浴中震荡10min~30min，取反应液进行透析24h，待透析完毕，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力；
（2）实验设计与统计分析
改变mPEG-Mal5000溶液浓度使β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比为1:1~1:6、恒温金属浴的温度为25℃~75℃、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH为3.0~8.0，进行单因素实验，测定比酶活力；根据单因素试验结果，选取比酶活力影响较显著的β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH这三个因素，并对其进行实验因素与水平的设定，然后进行实验；
（3）模型的建立和统计分析根据所得数据进行多元回归分析，得到响应变量β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比B、恒温金属浴的温度C、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH值A与响应值比酶活力Y的二次多项回归方程：Y=2.15+0.025*A+0.00528*B+0.016*C-0.033*A*B+0.027*A*C+0.0011*B*C-0.17*A2-0.13*B2-0.13*C2；
（4）试验结果分析与优化
根据回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应面三维图，响应值由此得到优化，根据模型分析可得到β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比、恒温金属浴的温度和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的pH的最优化工艺参数。
2.如权利要求1所述mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的方法，其特征在于：所述步骤（1）中恒温金属浴中震荡反应时间为10min。
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