CN108690858B - 利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法 - Google Patents

利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法：①将淀粉与水调成淀粉浆，加入耐高温α‑淀粉酶，90℃保温3min，灭酶；②灭酶后的淀粉液中加入mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶，酶解结束，煮沸离心即得高麦芽糖浆。与未修饰β‑淀粉酶相比，应用mPEG‑Mal5000‑β‑淀粉酶生产高麦芽糖浆，加酶量由200 U/g降低至120 U/g，使用量减少了40%；糖化时间由28h减少到16h；产率由73.29%提高至85.67%。酶解玉米淀粉，加酶量由200 U/g降低至100 U/g，使用量减少了50%；糖化时间由27h减少到14h；产率由76.53%提高至86.34%。

Description

利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法
技术领域
本发明属于植物淀粉利用领域，具体涉及一种利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法。
背景技术
β-淀粉酶是淀粉酶类中的一种，广泛存在于大麦、小麦、甘薯、大豆等高等植物以及芽孢杆菌属等微生物中。据报道，近年来中国甘薯产后淀粉加工比例达到70％-80％。中国每年因生产薯类淀粉而排放的废液约1650万t，如果得不到及时处理会对环境造成污染，甘薯中β-淀粉酶是块根中仅次于甘薯贮藏蛋白的一种蛋白质成分，甘薯中提取的β-淀粉酶是植物β-淀粉酶最佳来源。但在实际生产应用中发现甘薯中β-淀粉酶容易受到环境条件(如pH、压力、温度和离子强度等)的影响，其酶学活性表现得不稳定，这些特性极大制约了甘薯β-淀粉酶在食品及啤酒工业中的应用。酶的化学修饰除了可以改善该酶的热稳定性外还可以增强其pH稳定性和酶的活性。聚乙二醇类是一种良好的化学修饰剂，其在磷脂酶、蛋白酶、精氨酸激酶、草酸脱羧酶等各种酶中有所应用，但其β-淀粉酶的应用中鲜有报道。
本发明中制备的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的稳定性显著于未修饰β-淀粉酶。修饰后的β-淀粉酶在酶解淀粉时，缩短酶解时间，降低酶解温度，提升了耐热性和耐碱性。将mPEG-Mal5000-β-淀粉酶应用到麦芽糖浆生产时酶用量减少，酶解时间缩短，降低了麦芽糖浆生产成本，提高了生产效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产成本低、生产效率高的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，包括以下步骤：①将淀粉与水调成淀粉浆，加入耐高温α-淀粉酶，90℃保温3min，再于121℃高压灭酶15min；②灭酶后的淀粉液中加入mPEG-Mal5000-β-淀粉酶，于自动糖化仪中酶解16h，酶解结束，煮沸10min，离心，即得高麦芽糖浆；所述mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的制备方法如下：向试管中加入8.0mLpH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/Lβ-淀粉酶酶液1.0mL和500μmol/LmPEG-Mal5000溶液1.0mL，置于58℃恒温金属浴中震荡10min，取反应液进行透析24h，透析完毕，将透析液在20℃下真空浓缩后进行真空冷冻干燥。
优选的，所述步骤①中淀粉与水的重量为1:3.5-4.0。
优选的，所述步骤①中耐高温α-淀粉酶的添加量为5U/g干淀粉。
优选的，所述步骤②中mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的添加量为100～120U/g干淀粉。
优选的，所述步骤②中的酶解温度为60℃。
优选的，所述淀粉为玉米淀粉或甘薯淀粉。
本发明产生的有益效果是：将β-淀粉酶采用mPEG-Mal5000修饰后制备的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的稳定性显著于未修饰β-淀粉酶。应用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解甘薯淀粉，加酶量由200U/g降低至120U/g，使用量减少了40％；糖化时间由28h减少到16h，节省12h；产率由73.29％提高至85.67％，提高了16.89％。应用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解玉米淀粉，加酶量由200U/g降低至100U/g，使用量减少了50％；糖化时间由27h减少到14h，节省13h；产率由76.53％提高至86.34％，提高了12.82％。修饰后的β-淀粉酶在酶解淀粉时，缩短酶解时间，降低酶解温度，提升了耐热性和耐碱性，这大大降低了生产成本。
附图说明
图1为6种修饰剂在不同比例下对β-淀粉酶活力的影响；
图2为不同温度对修饰反应的影响；
图3为不同pH缓冲液对修饰反应的影响；
图4为不同时间对修饰反应的影响；
图5a为修饰比例与修饰pH的交互作用；
图5b为修饰温度与修饰pH交互作用；
图5c为修饰pH与修饰比例交互作用；
图6为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性，其中a为温度对比酶活力的影响，b为温度对相对酶活的影响；
图7为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适酶解pH(a)和pH稳定性(b)，其中a为pH对比酶活力的影响，b为pH对相对酶活的影响；
图8为β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶Lineweaver-Burk曲线；
图9为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加酶量对甘薯淀粉酶解产物中麦芽糖含量的影响；
图10为mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解时间对麦芽糖含量的影响。
具体实施方式
一、mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的制备
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1试剂
β-淀粉酶：美国Sigma-Aldrich公司，分子量55.7kDa，比酶活力1.70万U/mg；mPEG-NHS5000、mPEG-NHS20000、mPEG-Ts5000、mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-Mal5000，美国Nanocs公司，纯度≥95％。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2仪器与设备
紫外可见分光光度计：WFJ7200(优尼柯上海仪器有限公司)；
恒温水浴锅：DZKW-4(北京中兴伟业仪器有限公司)；
振荡型恒温金属浴：TUS-200P(上海一恒科技有限公司)。
1.2.2mPEG修饰β-淀粉酶的反应
向试管中加入8.0mL一定pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/Lβ-淀粉酶酶液1.0mL和一定浓度的mPEG溶液1.0mL，总体积为10.0mL。在一定温度下置于恒温金属浴中震荡一定时间，取反应液进行透析24h，待透析完毕，获得mPEG-β-淀粉酶复合物透析液，4℃储藏备用。
1.2.3单因素设计
1.2.3.1β-淀粉酶与修饰剂比例对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，使β-淀粉酶与mPEG-NHS5000、mPEG-NHS20000、mPEG-Ts5000、mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-Mal5000的摩尔比分别为1:1，1:2，1:3，1:4，1:5，1:6，溶液pH 6.0，放置在55℃振荡恒温金属浴内10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.3.2温度对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000混溶到pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，两者摩尔比为1:4，分别放置在25℃，35℃，45℃，55℃，65℃，75℃振荡恒温金属浴中10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.3.3pH对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000按1:4摩尔比混溶到pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，放置在55℃的恒温金属浴中10min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
表1不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的配方如下：
Figure BDA0001573873500000041
1.2.3.4时间对修饰反应的影响
按照方法1.2.2，将β-淀粉酶与mPEG-Mal5000混溶到pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，两者摩尔比为1:4，放置在55℃的恒温金属浴中，分别保温5min、10min、15min、20min、25min、30min，取出反应液透析，待透析结束后，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，测定比酶活力。
1.2.4响应面设计
在单因素试验基础上，采用Box-Behnken中心组合进行三因素三水平的试验设计。以修饰反应pH(A)、β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的比例(B)、反应温度(C)为自变量，以比酶活(Y)为响应值，设计了三因素三水平响应面分析试验，试验方案见表2。
表2响应面试验因素及水平
Figure BDA0001573873500000051
1.2.5酶学性质
1.2.5.1最适温度及热稳定性
最适温度：酶液pH 6.0，在不同温度(20-75℃)下，测定酶的比酶活力，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，获得最适温度。
热稳定性：将酶液分别置于不同温度(20-75℃)恒温水浴中，保温1h后测其酶活。以未保温酶酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活，获得酶热稳定性。
1.2.5.2最适pH及pH稳定性
最适pH：酶液置于50℃水浴，在不同pH(3.0-8.5)下，测定比酶活，将透析液在20℃下真空浓缩至2.0mL，获得最适pH。
pH稳定性：将酶液分别置于不同pH(3.0-8.5)的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中，保温4h后测其酶活。以未保温酶酶活为100％，计算其它温度下的相对酶活，获得酶pH稳定性。
1.2.5.3米氏常数和酶促反应速率的测定
利用米氏公式求出米氏常数(Km),和最大反应速率(Vmax)。米氏公式表示为：
Figure BDA0001573873500000052
式中：ν——反应速率mol/(L·min)，Vmax——最大反应速率mol/(L·min)，Km——米氏常数mmol/L，S——底物浓度mmol/L。
分别测定β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在55℃，pH6.0条件下不同淀粉底物浓度[S]的反应速率V，用纵坐标表示酶促反应速率的倒数(1/V)，用横坐标表示底物浓度的倒数(1/[S])，绘制Lineweaver-Burk曲线，求出米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。
1.3测定方法
1.3.1蛋白含量测定
考马斯亮蓝G250法。取1mL待测样品，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂并摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色记录A595nm。根据所测A595nm从标准曲线上计算蛋白质含量。每隔样品重复三次，取平均值。
绘制标准曲线：以A595nm值为纵坐标，以牛血清蛋白微克数为纵坐标，绘制标准曲线。
Figure BDA0001573873500000061
式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。
1.3.2酶活力测定
采用DNS法测定酶活。测定步骤：取9mL1.1％的淀粉溶液含0.2mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸(pH 6.0)于试管中，55℃预热5min后加入1.0mL酶液准确反应10min，立即移取2mL反应液至装有2mLDNS溶液的具塞比色管中，沸水浴10min，取出，冷却至室温，加入10mL蒸馏水摇匀并于520nm波长处进行比色，空白管以失活的酶液代替原液。
绘制标准曲线：以OD520nm值为纵坐标，以葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
测的OD520nm值后，由标准曲线计算出相应的葡萄糖毫克数，得常数K，再乘以1.9倍，即为麦芽糖毫克数。
酶活力/(U/mL)＝K×n×6×5×1.9
式中：K为根据标准曲线和OD520nm值计算得出的葡萄糖毫克数；n为稀释倍数；6为反应10min换算成1h；5为将吸取2mL反应液换成10mL；1.9为葡萄糖换算成麦芽糖系数。
β-淀粉酶酶活力单位定义为：在55℃，pH6.0条件下，每小时从1.1％的可溶淀粉中释放出1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活单位，用U表示。
比酶活力为每毫克蛋白所具有的β-淀粉酶的活力单位数，单位为U/mg。
1.4统计分析方法
采用SPSS 17.0数据处理软件对实验数据的方差显著性进行分析。
2结果与分析
2.1单因素试验
2.1.1修饰剂不同添加比例对修饰的影响
6种修饰剂在不同比例下对β-淀粉酶活力的影响如图1所示，由图1可知，β-淀粉酶与6种修饰剂按不同不同摩尔比混合，随着修饰剂摩尔浓度的增加，mPEG-Mal5000、mPEG-NHS5000、mPEG-Ts5000三种修饰剂可增强β-淀粉酶酶活，在摩尔比为1:4时，酶活力分别达到最大值(2.081±0.050)万U/mg、(1.96±0.055)万U/mg、(2.01±0.053)万U/mg，与β-淀粉酶相比，酶活分别提高了20.08％、13.16％、15.75％。mPEG-Ts10000、mPEG-Ts20000和mPEG-NHS-20000对β-淀粉酶酶活没有明显提高。另外，随着β-淀粉酶与mPEG-Mal5000的摩尔比由1:1增加到1:4，酶活力逐渐提高。酶活力由(1.79±0.051)万U/mg提高到(2.08±0.050)万U/mg，当摩尔比继续增加到1:6时，酶活力降为(2.01±0.051)万U/mg，经方差显著性分析，摩尔比为1:4与1:6时酶活力有显著性差异(P<0.05)。因此β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应摩尔比为1:4。
2.1.2温度对β-淀粉酶修饰的影响
不同温度对修饰反应的影响如图2所示，由图2可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应温度由25℃增加到55℃时，酶活力逐渐提高，当反应温度为55℃时，酶活力达到最大为(2.081±0.059)万U/mg。当温度继续升高，酶活力迅速下降，当温度为65℃时，酶活力降为(1.794±0.055)U/mg，降低了13.79％。所以β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应温度为55℃。
2.1.3pH对酶修饰的影响
不同pH缓冲液对修饰反应的影响如图3所示，由图3可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应，pH由3.0增加到6.0时，酶活力逐渐增加。当反应pH为6.0时，酶活力达到最高(2.186±0.046)万U/mg。当pH继续升高，酶活逐渐下降，当pH为7.0时，酶活力为(1.955±0.045)万U/mg，比pH 6.0时酶活降低了10.57％。所以β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应pH为6.0。
2.1.4时间对酶修饰的影响
不同时间对修饰反应的影响如图4所示，由图4可知，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000反应时间由5min提升至10min时，酶活力提高。当反应时间为10min时，酶活力达到最大值(2.101±0.059)万U/mg。继续延长反应时间，酶活力没有明显增加，经方差显著性分析，随着时间的继续延长，反应时间为15-30min时与10min时的酶活力没有明显差异(P<0.05)。因此，β-淀粉酶与mPEG-Mal5000最佳反应时间为10min。
2.2修饰条件的响应面优化试验
2.2.1响应面试验设计及结果
以上述单因素试验为基础，依据方法1.2.4，把修饰pH(A)，修饰比例(B)，修饰温度(C)作为三个因素，以mPEG-Mal5000-β-淀粉酶活力(Y)为响应值，遵循Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面进行试验。试验结果见表3。
表3试验设计方案及结果
Figure BDA0001573873500000081
利用Design-Expert V8.0.6软件进行多元回归拟合，以mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的活性为响应值，得到模拟方程如下:
Y＝2.15+0.025*A+0.00528*B+0.016*C-0.033*A*B+0.027*A*C+0.0011*B*C-0.17*A2-0.13*B2-0.13*C2。
对上述模型有效性进行方差分析，结果见表3。
表4回归模型方差分析
Figure BDA0001573873500000091
注:**为极显著，P＜0.01；*为显著，P＜0.05。
由表4可知，模型回归方程的P<0.001，模型方程回归性极显著；因为回归系数R2＝0.995，失拟项0.317>0.05，失拟性检验结果不显著，故回归方程拟合程度较好。综合上述数据可得出该回归模型有高度相关性，可以用于mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶提升酶活的理论预测。从回归模型显著性分析可以看出，影响酶活力各因素按影响大小排序依次为修饰pH>修饰温度>修饰比例。
2.2.2两因素交互作用分析
响应面两因素交互作用分析如图5(a)-(c)所示，可以直观的看到各因素之间的交互作用情况。
如图5(a)所示，随着修饰pH和修饰比例的增加，酶活先升高后降低，相应曲面陡峭，等高线为椭圆形，表明修饰pH与修饰比例交互作用显著；如图5(b)所示，随着修饰pH和修饰温度的提高，酶活先升高后降低，等高线为椭圆形，表明修饰pH与修饰温度交互作用显著；如图5(c)所示，随着修饰比例和修饰温度的增加，酶活先升高后降低，等高线接近圆形，表明修饰比例与修饰温度交互作用不显著。
2.2.4最佳条件下的验证试验
通过Design-Expert软件分析，模拟预测得出酶活最高的优化组合为A＝6.08、B＝4.04、C＝58.85℃，即修饰pH为6.08、修饰比例为1:4.04、修饰温度为58.85℃时，酶活为2.147万U/mg。考虑验证试验的可操作性，将最佳工艺参数修正为修饰pH6.0、修饰比例1:4、修饰温度58℃。按照修正后的条件对修饰后的β-淀粉酶进行酶活测定，进行三次重复性试验，将三次测定的酶活取平均值为(2.082±0.148)万U/mg，修饰后酶活提高20.10％，与预测值标准偏差为3.56％。验证试验表明，响应面优化结果可靠，利用响应面优化mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶的工艺是可行的。
2.3mPEG-Mal5000-β-淀粉酶与未修饰β-淀粉酶酶学性质比较
2.3.1mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和未修饰β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适温度和温度稳定性进行研究，结果如图6(a)-(b)。
由图6(a)可知，β-淀粉酶在55℃时酶活最高，其值为(1.750±0.542)万U/mg，而mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在45℃-60℃均具有较高的酶活，其值分别为(2.081±0.058)万U/mg，(2.054±0.060)万U/mg，(2.017±0.062)万U/mg，(2.001±0.064)万U/mg。经mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶在温度为55℃时比β-淀粉酶酶活提高了15.27％。由图6(b)可知，当温度为30℃-70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶耐热性明显高于β-淀粉酶耐热性。当温度为30℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.80％和97.01％，耐热性提高了2.87％；当温度为35℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.62％和94.87％，耐热性提高了5.01％；当温度为40℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.50％和92.01％，耐热性提高了8.14％；当温度为45℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为99.01％和90.03％，耐热性提高了9.97％；当温度为50℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为98.50％和87.14％，耐热性提高了13.03％；当温度为55℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为95.22％和80.95％，耐热性提高了17.62％；当温度为60℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为88.05％和70.46％，耐热性提高了24.96％；当温度为65℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为76.41％和45.62％，耐热性提高了67.49％；当温度为70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为30.15％和18.96％，耐热性提高了59.02％；因此，在30℃-70℃mPEG-Mal5000-β-淀粉酶比β-淀粉酶热稳定性均有提高，在65℃下提高最多，这表明mPEG-Mal5000可以增强β-淀粉酶热稳定性，进而提高酶解效率，降低生产成本。
2.3.2mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适pH和pH稳定性对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶的最适酶解pH和pH稳定性进行研究，结果如图7(a)-(b)所示。
由图7(a)可知，在pH5.0-7.0，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶均具有较高酶活，最佳酶解pH均为6.0。在pH6.0时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶酶活分别为(2.081±0.051)万U/mg，(1.709±0.053)万U/mg，经mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶在pH为6.0时比β-淀粉酶酶活提高了21.78％。由图7(b)可知，当pH为6.5-7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶pH稳定性明显高于β-淀粉酶pH稳定性。当pH为6.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为98.20％和89.25％，pH稳定性提高了10.03％；当pH为7.0时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为75.36％和53.95％，pH稳定性提高了39.68％；当pH为7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶和β-淀粉酶相对酶活酶分别为55.22％和45.68％，pH稳定性提高了20.88％。因此，在pH6.5-7.5，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶比β-淀粉酶的pH稳定性均有提高，在pH7.0时提高最多。这表明mPEG-Mal5000可以增强β-淀粉酶的pH稳定性，提高了β-淀粉酶应用的pH范围。
2.4.5β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉动力学参数
由图8和米氏方程根据双倒数作图法计算得β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶米氏常数Km分别为64.54±0.97mmol/L和56.18±0.70mmol/L，最大酶促反应速率Vmax分别为5.21±0.05mol/(L·min)和6.61±0.06mol/(L·min)。结果表明，经mPEG-Mal5000修饰后β-淀粉酶的米氏常数Km降低了12.95％，其最大酶解速率提升了26.87％
3结论
采用mPEG-Mal5000修饰β-淀粉酶，将mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的比酶活力作为响应值，建立该工艺的二次多项数学模型，该模型极显著，拟合良好，各反应条件参数对mPEG-Mal5000-β-淀粉酶活性的影响的次序由大到小为修饰pH>修饰温度>修饰比例，对mPEG-Mal5000修饰后的β-淀粉酶活性影响极为显著，修饰pH与修饰温度交互作用显著，结合回归模型分析和验证试验，可得mPGE-Mal5000修饰β-淀粉酶的最佳工艺参数：修饰比例为1:4，修饰温度为58℃，修饰pH为6.0，在此条件下mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的酶活为(2.082±0.148)万U/mg，相比β-淀粉酶的酶活性提高20.1％。修饰后的mPEG-Mal5000-β-淀粉酶在酶学性质方面有很大改善，修饰后酶动力学参数Km降低了12.95％，Vmax提升了26.87％，在温度为30℃-70℃时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶耐热性明显高于β-淀粉酶耐热性。在pH6.5-7.5时，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶pH稳定性明显高于β-淀粉酶pH稳定性。修饰后的β-淀粉酶在酶解淀粉时，缩短酶解时间，提高酶解效率，提升了耐热性和耐碱性，降低了生产成本，这在啤酒加工与饴糖生产等工业中具有一定的实际意义。
二、利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆
4.应用
4.1酶解甘薯淀粉
4.1.1酶解条件
4.1.1.1mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加酶量对麦芽糖产率的影响
利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，包括以下步骤：①将淀粉与水调成淀粉浆，加入耐高温α-淀粉酶，90℃保温3min，再于121℃高压灭酶15min；②灭酶后的淀粉液中加入mPEG-Mal5000-β-淀粉酶，于自动糖化仪中酶解，酶解结束，煮沸10min，离心，即得高麦芽糖浆。
依据此方法，高温α-淀粉酶加入量5U/g，酶解温度60℃，酶解20h，考察mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加入量为0-210U/g干淀粉时对甘薯淀粉水解的影响，结果如图9。由图9可知，mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加酶量对酶解产物中麦芽糖含量有较大影响。加酶量在0-120U/g时，随着加酶量的增加，麦芽糖含量从11.68±0.57％迅速增加至86.73±2.88％；其中加酶量为90U/g时，麦芽糖含量为75.82±2.35％，高于β-淀粉酶研究结果73.29±5.22％(酶解条件：β-淀粉酶加酶量为200U/g，高温α-淀粉酶加入量5U/g，酶解温度60℃，酶解28h)。随着mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加酶量的继续增加，麦芽糖含量增加不明显，经方差显著性分析，在p＜0.05水平时，加酶量在120U/g至180U/g时酶解产物麦芽糖含量没有显著向差异。因此，在酶解淀粉时mPEG-Mal5000-β-淀粉酶加酶量为120U/g。
4.1.1.2mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解时间对麦芽糖产率的影响
mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解时间对麦芽糖含量的影响如图10所示，从图10可以看出，酶解时间从0增加至16h时，麦芽糖含量迅速增加，麦芽糖含量从10.22±0.46％增加至85.67±2.56％。随着酶解时间的继续增加至20h，麦芽糖含量变化不大。根据方差显著性分析，酶解时间在16-24h时麦芽糖含量没有显著性差异(p＜0.05)。因此，酶解时间在16h为佳。
4.1.2甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解甘薯淀粉参数及酶解产物分析
表5甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解甘薯淀粉条件
甘薯β-淀粉酶 mPEG-Mal5000-β-淀粉酶
高温α-淀粉酶加入量 5U/g 5U/g
加β-淀粉酶量 200U/g 120U/g
酶解温度 60℃ 60℃
酶解时间 28h 16h
4.1.3酶解产物分析
表6甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解甘薯淀粉产物分析
(％) 甘薯β-淀粉酶 mPEG-Mal5000-β-淀粉酶
葡萄糖(％) 0.57±0.032 0.57±0.032
麦芽糖(％) 73.29±5.22 85.67±5.38
麦芽三糖(％) 7.62±0.27 5.28±0.21
麦芽四糖(％) 5.21±0.26 3.36±0.12
其它(％) 13.31 5.12
由表5及表6可以看出，应用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解甘薯淀粉，加酶量由200U/g降低至120U/g，使用量减少了40％；糖化时间由28h减少到16h，节省12h；产率由73.29％提高至85.67％，提高了16.89％。
4.2酶解玉米淀粉
4.2.1甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解玉米淀粉参数及酶解产物分析
表7甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解玉米淀粉条件
甘薯β-淀粉酶 mPEG-Mal5000-β-淀粉酶
高温α-淀粉酶加入量 5U/g 5U/g
加β-淀粉酶量 200U/g 100U/g
酶解温度 60℃ 60℃
酶解时间 27h 14h
4.2.2酶解产物分析
表8甘薯β-淀粉酶和mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解玉米淀粉产物分析
(％) 甘薯β-淀粉酶 mPEG-Mal5000-β-淀粉酶
葡萄糖(％) 0.95±0.041 0.95±0.041
麦芽糖(％) 76.53±4.98 86.34±5.11
麦芽三糖(％) 7.88±0.33 5.14±0.23
麦芽四糖(％) 5.45±0.24 3.38±0.17
其它(％) 9.19 4.19
由表7及表8可以看出，应用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶酶解玉米淀粉，加酶量由200U/g降低至100U/g，使用量减少了50％；糖化时间由27h减少到14h，节省13h；产率由76.53％提高至86.34％，提高了12.82％。

Claims (6)

1.利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于包括以下步骤：①将淀粉与水调成淀粉浆，加入耐高温α-淀粉酶，90℃保温3min，再于121℃高压灭酶15min；②灭酶后的淀粉液中加入mPEG-Mal5000-β-淀粉酶，于自动糖化仪中酶解16h，酶解结束，煮沸10min，离心，即得高麦芽糖浆；所述mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的制备方法如下：向试管中加入8.0 mL pH 6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，再分别加入125μmol/L β-淀粉酶酶液1.0mL和500μmol/L mPEG-Mal5000溶液1.0 mL，置于58℃恒温金属浴中震荡10min，取反应液进行透析24h，将透析液在20℃下真空浓缩后进行真空冷冻干燥。
2.如权利要求1所述利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于：所述步骤①中淀粉与水的重量为1:3.5-4.0。
3.如权利要求1所述mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于：所述步骤①中耐高温α-淀粉酶的添加量为5U/g干淀粉。
4.如权利要求1所述利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于：所述步骤②中mPEG-Mal5000-β-淀粉酶的添加量为100~120U/g干淀粉。
5.如权利要求1所述利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于：所述步骤②中的酶解温度为60℃。
6.如权利要求1所述利用mPEG-Mal5000-β-淀粉酶生产高麦芽糖浆的方法，其特征在于：所述淀粉为玉米淀粉或甘薯淀粉。
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