CN101035892B

CN101035892B - 具有肌醇六磷酸酶活性的多肽及编码其的多核苷酸

Info

Publication number: CN101035892B
Application number: CN2005800338360A
Authority: CN
Inventors: 莫尼卡·塔卡米娅; 卡斯滕·肖霍尔姆; 亨里克·弗里斯纳; 阿伦·诺加德; 米凯尔·B·索伦森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2025-10-04
Also published as: JP2012205593A; CA2610106C; AU2005291728B2; WO2006037328A1; BRPI0517540B1; CN101035892A; BRPI0517540A; DK1799818T3; ES2400828T3; MX2007003564A; AU2005291728A1; US7867743B2; JP5096152B2; MX288775B; JP2008515397A; US20080292753A1; CA2610106A1; EP1799818A1; PL1799818T3; AR050895A1

Abstract

本发明涉及来源于布氏柠檬酸杆菌的肌醇六磷酸酶以及有关的肌醇六磷酸酶。此肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，是酸稳定的，在动物饲料中优秀的性能，对底物肌醇六磷酸高特异性，以及预期的高比活。本发明还涉及相应的DNA，肌醇六磷酸酶的重组和野生型生产，以及其应用。

Description

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽及编码其的多核苷酸

发明背景

发明领域

本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽以及编码所述多肽的分离的多核苷酸。所述多肽与来源于布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)的肌醇六磷酸酶有关，其氨基酸序列如附加的序列表SEQ ID NO：4所示。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及生产和使用所述多肽的方法，特别是在动物饲料中。

相关技术描述

肌醇六磷酸酶是众所周知的酶，优点在于能添加到包括人在内的动物的食品中。已从多种来源分离得到肌醇六磷酸酶，包括许多真菌和细菌菌株。

已知大肠杆菌(Escherichia coli)的酸性组氨酸磷酸酶appA和其他革兰氏阴性细菌的肌醇六磷酸酶具有高比活。

Kim等在Biotechnology Letters 25：1231-1234，2003中报道了利用布氏柠檬酸杆菌YH-15生产细胞内肌醇六磷酸酶。KR-2004-A-045267和WO-2004/085638公开了来自保藏为KCCM 10427的布氏柠檬酸杆菌YH-15的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列，为SEQ ID NO：7。本文包括了该氨基酸序列，为SEQ ID NO：5。WO-2004/085638在2004年10月7日公布，即在本申请最早的优先权日之后。

本发明的一个目的是提供具有肌醇六磷酸酶活性的可选择的多肽以及编码所述多肽的多核苷酸。本发明的多肽优选具有改进的，更优选具有改善的特性，例如不同的底物特异性、更高的比活、增加的稳定性(例如酸稳定性、热稳定性和/或蛋白酶稳定性，特别是胃蛋白酶稳定性)、改进的最适pH(例如更低的、或更高的最适pH)和/或在动物饲料中改善的性能(例如改善的肌醇六磷酸释放和/或降解)。

发明概述

本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自：(a)具有与(i)SEQ IDNO：2的氨基酸1-411和/或(ii)SEQ ID NO：2的成熟多肽部分具有至少98.6％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)包含(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-411，和/或(ii)SEQ ID NO：2的成熟多肽部分的一个或多个氨基酸缺失、插入和/或保守取代的变体；和/或(c)(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-411，和/或(ii) SEQ ID NO：2的成熟多肽部分的片段。

本发明还涉及编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸，选自：(a)编码具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411具有至少98.6％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299具有至少98.3％同一性的多核苷酸。

本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体以及重组宿主细胞。

本发明还涉及用于生产具有肌醇六磷酸酶活性的所述多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下，培养包含含有编码所述多肽的多核苷酸的核苷酸构建体的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及在动物饲料中使用本发明的多肽的方法，以及含有所述多肽的动物饲料和动物饲料添加剂。

本发明进一步涉及包含编码可操作地连接编码信号肽的核苷酸序列的蛋白的基因的核酸构建体，所述核苷酸序列由(i)SEQ ID NO：1的核苷酸1-66或(ii)SEQ ID NO：3的核苷酸1-66组成；其中对于核苷酸序列所述基因是外源的。

定义

肌醇六磷酸酶活性：在上下文中，具有肌醇六磷酸酶活性的多肽(肌醇六磷酸酶)是一种催化肌醇六磷酸(肌醇六磷酸盐)水解为(1)肌醇和/或(2)其单、二、三、四和/或五磷酸盐(phosphates)和(3)无机磷酸盐的酶。

因特网上ENZYME站点(http://www.expasy.ch/enzyme/)是与酶命名有关的信息储存库。其主要是以国际生物化学和分子生物学联合会(IUB-MB)命名委员会的建议为基础，描述了其EC(酶学委员会)号已提供的每种已鉴定的酶(Bairoch A.The ENZYME database，2000，Nucleic Acids Res28：304-305)。也参见NC-IUBMB的酶命名手册，1992。

根据ENZYME站点，已知三种不同类型的肌醇六磷酸酶：3-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸3-磷酸水解酶，EC 3.1.3.8)、6-肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸6-磷酸水解酶，EC 3.1.3.26)和5-肌醇六磷酸酶(EC 3.1.3.72)。对本发明来说，全部类型都包括在肌醇六磷酸酶的定义内。

在一个特定的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶属于酸性组氨酸磷酸酶家族，其包括大肠杆菌pH 2.5酸性磷酸酶(基因appA)以及诸如泡盛曲霉(Aspergillus awamorii)肌醇六磷酸酶A和B(EC：3.1.3.8)(基因phyA和phyB)的真菌肌醇六磷酸酶。组氨酸酸性磷酸酶共有两个区域的序列相似性，每个区域都以保守的组氨酸残基为中心。这两个区域的组氨酸似乎与酶催化机制有关。第一个区域的组氨酸位于N-末端区中，并形成磷-组氨酸中间体，而第二个区域的组氨酸则位于C-末端区中，有可能作为质子供体。

在另一个特定的实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶具有保守的活性位点基序，即R-H-G-X-R-X-P，其中X表示任意氨基酸(参见SEQ ID NOs：2和4的氨基酸16-22)。

就本发明来说，肌醇六磷酸酶活性以FYT单位来测定，一FYT是在下列条件下：pH 5.5；温度37℃；底物：0.0050mol/l浓度的肌醇六磷酸钠(C₆H₆O₂₄P₆Na₁₂)，每分钟释出1微摩尔无机正磷酸的酶的量。适合的肌醇六磷酸酶测定法是在WO 00/20569的实施例1中所描述的FYT和FTU测定法。FTU用于测定饲料和预混合料(premix)中的肌醇六磷酸酶活性。还可使用本文实施例4、7和8的肌醇六磷酸酶测定法测定肌醇六磷酸酶活性。

通过在不同的pH值下温育肌醇六磷酸酶，使用预先测定浓度的底物以及固定的温育温度测定本发明多肽的最适pH。然后，由肌醇六磷酸酶活性对pH的图示确定最适pH。在一个特定的实施方案中，使用FYT测定法，即底物是5mM肌醇六磷酸钠，反应温度37℃，并在不同的pH值下以FYT单位测定活性，例如pH 2-12，使用适合的缓冲液，例如：用HCl或NaOH调节pH值至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CABS、1mMCaCl₂、150mM KCl、0.01％Triton X-100。在另一个特定的实施方案中，使用实施例4、7和8任一的肌醇六磷酸酶测定法，即底物是0.5mM，优选5mM肌醇六磷酸钠，其溶解在具期望pH(例如上述那些的)的缓冲液中，通过与钼酸盐/铁络合并在750nm处测量光密度以测定溶解的磷酸，或者，使用实施例7和8的测定法，与钼酸盐/钒酸盐络合并在405nm处测量吸光率。封闭(Blind)(实施例4测试)：混合20ul样品、100ul底物和120ul显色试剂，在37℃温育5分钟并在750nm处测量OD_封闭。样品：混合20ul样品、100ul底物，在37℃温育30分钟，添加120ul显色试剂，在37℃温育5分钟，并在750nm处测量OD_样品。肌醇六磷酸酶活性测量为OD＝OD_样品-OD_封闭。相对低的最适pH指低于pH 5.0的最适pH，例如低于pH 4.5、4.0、3.5、3.0、2.5或甚至低于2.0。相对高的最适pH指高于pH 5.0的最适pH，例如高于pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5或甚至高于9.0。

分离的多肽：本文中使用的术语“分离的多肽”指通过SDS-PAGE测定的，至少20％纯的、优选至少40％纯的、更优选至少60％纯的、还优选至少80％纯的、最优选至少90％纯的和还最优选至少95％纯的多肽。

基本上纯的多肽：本文中术语“基本上纯的多肽”指按重量计算含有至多10％、优选至多8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、至多3％、还优选至多2％、最优选至多1％、以及还最优选至多0.5％的与其天然伴随的其他多肽物质的多肽制品。因此，优选基本上纯的多肽是存在于制品中按重量计算至少92％纯的、优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、更优选至少98％纯的、还优选至少99％、最优选至少99.5％纯的、以及还最优选100％纯的总的多肽物质。

本发明的多肽优选是基本上纯的形式。特别是，优选多肽是“实质上(essentially)纯的形式”，即所述多肽制品实质上不含有与其天然伴随的其他多肽物质。可通过例如使用众所周知的重组方法或经典的提纯方法制备多肽而得以实现。

在此，术语“基本上纯的多肽”和术语“分离的多肽”以及“分离形式的多肽”是同义。

同一性：通过参数“同一性”描述两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的相关性。

就本发明来说，使用程序“align”测定两条氨基酸序列和两条核苷酸序列之间的同一性水平，该程序是一种Needleman-Wunsch比对(即全局比对)，可用于蛋白质和DNA比对。默认得分矩阵(default scoring matrix)BLOSUM50和默认同一性矩阵分别用于蛋白质和DNA比对。对于蛋白质缺口(gap)中第一个残基的罚分(penalty)是-12，对于DNA是-16。同时，对于蛋白质缺口中额外残基的罚分是-2，对于DNA是-4。

“Align”是FASTA软件包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448，和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质比对使用了不限制缺口大小的Smith-Waterman算法(参见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。

Needleman-Wunsch算法描述于Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal ofMolecular Biology，48：443-453，比对程序描述于Myers和W.Miller″Optimal Alignments in Linear Space″CABIOS(computer applications in thebiosciences)(1988)4：11-17。

靶(或样本或测试)序列和指定序列(如SEQ ID NO：2的氨基酸1-411)之间的同一性水平还可测定如下：使用程序“align”比对序列。测定比对中完全匹配的数目(“N-完全匹配”)(完全匹配指在相同位置的比对中相同的氨基酸残基，在比对中通常标为“|”)。测定指定序列的长度(氨基酸残基的数目)(“N-指定的”，在上述的例子中＝411)。同一性水平以“N-完全匹配”和“N-指定的”之间的比值计算(为转换为同一性百分数，乘以100)。

在一个可选的实施方案中，靶(或样本或测试)序列和指定序列(如SEQID NO：2的氨基酸1-411)之间的同一性水平测定如下：使用程序“align”比对两条序列。测定比对中完全匹配的数目(“N-完全匹配”)(完全匹配指在相同位置的比对中相同的氨基酸残基，在比对中通常标为“|”)。还测定两条比对序列的共有长度，即比对重叠部分中氨基酸的总数目(“N-重叠”)。同一性水平以“N-完全匹配”和“N-重叠”之间的比值计算(为转换为同一性百分数，乘以100)。在一个实施方案中，若有的话，N-重叠包括比对产生的拖尾(trailing)和前伸(leading)缺口。在另一个实施方案中，若有的话，N-重叠排除比对产生的拖尾(trailing)和前伸(leading)缺口。

在另一个可选的实施方案中，靶(或样本或测试)序列和指定序列(如SEQ ID NO：2的氨基酸1-411)之间的同一性水平测定如下：使用程序“align”比对序列。测定比对中完全匹配的数目(“N-完全匹配”)(完全匹配指在相同位置的比对中相同的氨基酸残基，在比对中通常标为“|”)。测定靶序列的长度(氨基酸残基的数目)(“N-靶”)。同一性水平以“N-完全匹配”和“N-靶”之间的比值计算(为转换为同一性百分数，乘以100)。

优选地，重叠是指定序列的至少20％(如上定义的“N-重叠”，除以指定序列(“N-指定的”)中氨基酸的数目，并乘以100)，更优选至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％。这意味着当样本序列与指定序列比对时，至少20％(优选25-95％)的指定序列的氨基酸最终包括在重叠中。

或者，重叠是靶(或样本或测试)序列的至少20％(如上定义的“N-重叠”，除以如上定义的“N-靶”，并乘以100)，更优选至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少95％。这意味着当与指定序列比对时，至少20％(优选25-95％)的靶序列的氨基酸最终包括在重叠中。

多肽片段：本文中术语“多肽片段”定义为具有从指定序列如SEQ ID NO：2或4或其同源序列的成熟肽部分的氨基和/或羧基末端上缺失一个或多个氨基酸的多肽，其中所述片段具有肌醇六磷酸酶活性。在特定的实施方案中，所述片段含有至少350、360、370、380、390、400、405或至少410个氨基酸残基。

子序列：本文中术语“子序列”定义为具有从指定序列如SEQ ID NO：1或3或其同源序列的成熟肽编码部分的5′和/或3′末端上缺失一个或多个核苷酸的核苷酸序列，其中所述子序列编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽片段。在特定的实施方案中，所述子序列含有至少1050、1080、1110、1140、1170、1200、1215或至少1230个核苷酸。

等位变体：本文中术语“等位变体”表示占有相同的染色体基因座的基因的两个或更多个可选形式中的任一个。通过自然突变出现等位变异，并可在种群中产生多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是一种基因的等位变体编码的多肽。

基本上纯的多核苷酸：本文中使用的术语“基本上纯的多核苷酸”指不含有其他外来的或不需要的核苷酸并以适合于在基因工程蛋白质生产系统中使用的形式存在的多核苷酸制品。因此，基本上纯的多核苷酸按重量计算含有至多10％、优选至多8％、更优选至多6％、更优选至多5％、更优选至多4％、更优选至多3％、还优选至多2％、最优选至多1％和还最优选至多0.5％的与其天然伴随的其他多核苷酸。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计算至少90％纯的、优选至少92％纯的、更优选至少94％纯的、更优选至少95％纯的、更优选至少96％纯的、更优选至少97％纯的、还优选至少98％纯的、最优选至少99％和还最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选是基本上纯的形式。特别是，优选本文公开的多核苷酸是“实质上纯的形式”，即所述多核苷酸制品实质上不含有与其天然伴随的其他多核苷酸物质。在此，术语“基本上纯的多核苷酸”和术语“分离的多核苷酸”以及“分离形式的多核苷酸”是同义的。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任意组合。

核酸构建体：本文中使用的术语“核酸构建体”指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或经修饰以天然不存在的方式包含核酸的区段。当核酸构建体包含本发明的编码序列表达所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

控制序列：本文中术语“控制序列”定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达所必需或有利的全部组分。对于编码多肽的核苷酸序列，每种控制序列可以是固有的或外源的。这样的控制序列包括，但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。在最低限度上，控制序列包括启动子和转录和翻译终止信号。为了导入有利于控制序列与编码多肽的核苷酸序列的编码区连接的特定的限制酶切位点，所述控制序列可具有接头。

可操作地连接的：本文中术语“可操作地连接的”定义为这样一种构型，其中相对于多核苷酸序列的编码序列，将控制序列置于适当位置使得控制序列指导多肽编码序列表达。

编码序列：当在本文中使用时，术语“编码序列”指直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，其通常以ATG起始密码子或诸如GTG和TTG的备选起始密码子开始。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苷酸序列。

成熟多肽部分：当在本文中使用时，术语“成熟多肽部分”或“成熟肽部分”指细胞分泌的多肽的一部分，所述细胞含有作为其遗传设备(equipment)一部分的编码所述多肽的多核苷酸。换言之，所述成熟多肽部分指当信号肽部分实施指导编码多肽进入细胞分泌途径的功能时，在其切除后所留下的多肽的一部分。SEQ ID NOs：2和4预计的信号肽部分是其氨基酸-22至-1，这意味着SEQ ID NOs：2和4预计的成熟多肽部分相应于其氨基酸1-411。然而，不同宿主细胞之间可能出现轻微的变异，因此优选表达成熟多肽部分的。

成熟多肽编码部分：当在本文中使用时，术语“成熟多肽编码部分”或“成熟多肽编码序列”指编码所述多肽的多核苷酸的一部分，其编码成熟多肽部分。例如，对于SEQ ID NO：1，预计的成熟多肽编码部分相应于核苷酸67-1299(编码SEQ ID NO：2的氨基酸1-411)。

表达：术语“表达”包括涉及多肽生产的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：在本文中，术语“表达载体”定义为线性或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且可操作地连接到供其表达的额外的核苷酸上。

宿主细胞：本文中使用的术语“宿主细胞”包括可被包含本发明多核苷酸的核酸构建体转化、转染、转导等的任何细胞类型。

修饰：本文中，术语“修饰”指指定多肽如由SEQ ID NO：2或4的氨基酸1-411组成的多肽的任何化学修饰，以及编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及氨基酸侧链的置换。

人工变体：当在本文中使用时，术语“人工变体”指具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，所述多肽产生自表达SEQ ID NO：1或3修饰的核苷酸序列的生物体。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预修饰SEQ ID NO：1或3所公开的核苷酸序列而获得。

发明详述

具有肌醇六磷酸酶活性的多肽

在第一方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411(即成熟多肽)至少98.6％同一性水平的氨基酸序列的分离的多肽。

在特定的实施方案中，同一性水平是至少98.7％、98.8％、98.9％、99％、99.0％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或至少99.9％，其具有肌醇六磷酸酶活性(在下文中的“同源多肽”)。

在其他特定的实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411相差20、18、16、14、12、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411(即成熟多肽)的同一性水平是至少70、80、85、90、95、97、98％、98.2％、98.3％、98.4％或98.5％。

在特定的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或是其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在更进一步的特定实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸1-411，或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。

在第二方面，本发明涉及具有与SEQ ID NO：4的氨基酸1-411(即成熟多肽)至少99.1％同一性水平的氨基酸序列的分离的多肽。

在特定的实施方案中，同一性水平是至少99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、或至少99.9％，其具有肌醇六磷酸酶活性(在下文中的“同源多肽”)。

在其他的特定实施方案中，同源多肽具有与SEQ ID NO：4的氨基酸1-411相差20、18、16、14、12、10、8、6、5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸序列。

在可选的实施方案中，与SEQ ID NO：4的氨基酸1-411(即成熟多肽)的同一性水平是至少70、80、85、90、95、97、98％、98.2％、98.3％、98.4％、98.5％、98.6％、98.7％、98.8％、98.9％、或至少99.0％。

在特定的实施方案中，本发明的多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或是其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。在更进一步的特定实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸1-411，或其等位变体；或其具有肌醇六磷酸酶活性的片段。

在第三方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其为在至少中等、优选中等的严格条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和(ii)任一的互补链，和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的子序列杂交的多核苷酸所编码(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。SEQ ID NO：1的子序列含有至少100个连续的多核苷酸，或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述子序列可编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽片段。

在特定的实施方案中，所述杂交在至少中高、至少高、或至少极高的严格条件下；优选在中高、高、或极高的严格条件下进行。

在可选的实施方案中，所述杂交在极低、或低的严格条件下进行。

根据本领域众所周知的方法，SEQ ID NO：1的核苷酸序列、或其子序列，以及SEQ ID NO：2的氨基酸序列、或其片段，可用于设计核酸探针以从不同属或种的菌株中鉴定并克隆编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。特别是，为了鉴定并分离其中相应的基因，在标准的Southern印迹操作后，这样的探针可用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交。与完整的序列相比，这样的探针可以是相当短的，但长度应当是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、和最优选至少70个核苷酸。然而，优选核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、或最优选至少500个核苷酸。甚至更长的探针也可使用，如长度是至少600个核苷酸、优选至少700个核苷酸、更优选至少800个核苷酸、或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针皆可使用。所述探针通常被标记用于检测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白标记)。这样的探针也包含在本发明中。

因此，可在制备自其他生物体的基因组DNA文库中筛选与上述探针杂交并编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术从所述其他生物体中分离基因组或其他DNA。来自文库的DNA或分离的DNA可转移并固定到硝酸纤维素或其他合适的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO：1或其子序列同源的克隆或DNA，在Southern印迹中使用所述载体材料。

对本发明来说，杂交指核苷酸序列在极低至极高的严格条件下，与相应于SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列、其互补链、或其子序列的标记的核酸探针杂交。可使用X-射线胶片检测在这些条件下与所述核酸探针杂交的分子。

在一个特定的实施方案中，所述核酸探针是SEQ ID NOs：1和3-8的任一。在另一个特定的实施方案中，所述核酸探针是的SEQ ID NO：1的核苷酸67-450、核苷酸450-900或核苷酸900-1299的互补链。在另一个特定的实施方案中，所述核酸探针是编码SEQ ID NO：2的多肽或其子序列的多核苷酸序列。在一个更进一步的特定实施方案中，所述核酸探针是SEQ ID NO：1，特别是任何一个的其成熟多肽编码区。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，极低至极高的严格条件定义为，按照标准的Southern印迹操作，最佳进行12-24小时，在42℃于5XSSPE、0.3％SDS、200μg/ml剪切和变性的鲑鱼精子DNA，和对于极低和低的严格性在25％甲酰胺中，对于中等和中高的严格性在35％甲酰胺中，或对于高和极高的严格性在50％甲酰胺中，预杂交或杂交。

对于长度为至少100个核苷酸的长探针，最后用2X SSC、0.2％SDS，优选至少在45℃(极低严格性)、更优选至少在50℃(低严格性)、更优选至少在55℃(中等严格性)、更优选至少在60℃(中高严格性)、还优选至少在65℃(高严格性)、和最优选至少在70℃(极高严格性)洗涤所述载体材料三次，每次15分钟。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，严格条件定义为，按照标准的Southern印迹操作，在比使用Bolton和McCarthy(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48：1390)的计算法计算的Tm低约5℃-约10℃下，于0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH 7.6、6mMEDTA、0.5％NP-40、1X Denhardt′s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP和0.2mg/ml酵母RNA中预杂交、杂交和杂交后洗涤。

对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针，所述载体材料在6X SCC+0.1％SDS中洗涤一次，持续15分钟，并使用6X SSC在比计算的T_m低5℃-10℃下洗涤两次，每次15分钟。

在含盐的杂交条件下，有效T_m决定了探针和滤纸结合的DNA之间成功杂交所需的同一性水平。可使用如下公式确定所述有效T_m，以决定在不同的严格条件下两条DNAs杂交所需的同一性水平。

有效T_m＝81.5+16.6(log M[Na⁺])+0.41(％G+C)-0.72(％甲酰胺)

(参见www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm)

“G+C”指探针中核苷酸G和T的含量。对于中等严格性，例如，甲酰胺是35％且5X SSPE的Na⁺浓度是0.75M。

在第四方面，本发明涉及具有肌醇六磷酸酶活性以及下列物理化学性质(如对基本上纯的多肽所分析的)的分离的多肽：

(i)高比活，例如对肌醇六磷酸的比活是至少50％的大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)比活，所述比活优选按FYT单位/毫克肌醇六磷酸酶蛋白质计量；

(ii)酸稳定性；例如

(a)相对于在37℃于HEPES缓冲液pH 7.0中温育过夜后的残余活性，在37℃于甘氨酸/盐酸缓冲液pH 2.2中温育过夜后，至少60％、优选至少65％、至少70％、或至少75％的残余活性；

(b)相对于在37℃于HEPES缓冲液pH 7.0中温育过夜后的残余活性，在37℃于甘氨酸/盐酸缓冲液pH 3.0中温育过夜后，至少80％、优选至少85％、至少90％、或至少95％的残余活性；和/或

(c)与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，在25、30、35或37℃，优选37℃温度条件下，和pH 2.2、2.4、2.5、2.6，、2.8、3.0、3.2、3.4或3.5，优选pH 2.2或3.0的甘氨酸/盐酸缓冲液中温育2小时后，残余的肌醇六磷酸酶活性；

(iii)热稳定性，例如在pH 5.5和温度55、60、65、70、75，80、85或95℃，优选70℃条件下，温育0.5、1、1.5或2小时，优选0.5小时后，与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，至少50％的残余的肌醇六磷酸酶活性；

(iv)蛋白酶稳定性，例如在温度20、25、30、35或37℃，优选37℃，和pH 5.5下，在0.1mg/ml胃蛋白酶存在下，温育0.5、1、1.5或2小时，优选1小时后，与大肠杆菌appA(SPTREMBL：Q8GN88)的残余活性相比，至少50％的残余的肌醇六磷酸酶活性；和/或

(v)如上文所述，使用FYT测定法和/或实施例4的测定法测定的低于pH 5.0的最适pH，例如低于pH 4.5、4.0、3.5、3.0，、2.5，或甚至低于2.0。

在上述方面(i)的特定的实施方案中，所述比活是大肠杆菌appA比活的至少60、70、80、90、100、110、120、130、140、或至少150％。在上述(ii)-(iv)每一方面的特定的实施方案中，所述残余活性是大肠杆菌appA的残余活性的至少60、70、80、90、100、110、120、130、140或至少150％。

在第五方面，如本文中实施例7所提及，在pH 5.0和37℃下，测量的对底物pNP-磷酸的本发明的酶活性小于测量的对底物肌醇六磷酸的酶活性的11％。优选地，所述比值小于10％、9％、8％、7％、6％，或小于5％。PNP水解对肌醇六磷酸水解的比值表示所述酶真实的肌醇六磷酸酶特性。pNP活性对肌醇六磷酸活性的高比值可表示所述的酶是一种具有相对低的底物特异性的磷酸酶，而低比值，如实施例7中所测试的肌醇六磷酸酶，则表示其是一种特异性更强地接受肌醇六磷酸作为底物的酶。

在第六方面，在本文实施例6的体外模型中，与来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶相比，本发明的肌醇六磷酸酶具有更高的磷(P)释放，优选是其的至少110％，更优选是其的至少120％、130％、或至少140％。在一个实施方案中，在本文实施例6的体外模型中，相对于也配制为0.25 FYT/g饲料的来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶释放的磷，配制为0.25 FYT/g饲料的本发明的肌醇六磷酸酶释放至少150％的磷(P)。优选地，所述释放是至少155％、160％、165％、170％、175％、或至少180％。在另一个实施方案中，在本文实施例6的体外模型中中，相对于也配制为0.75 FYT/g饲料的来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶释放的磷，配制为0.75 FYT/g饲料的本发明的肌醇六磷酸酶释放至少150％的磷(P)。优选地，所述释放是至少155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、或至少190％(参见实施例6中的表2：367/190得到193％)。

在第七方面，在37℃和0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.0温育4小时后，与在时间t＝0处的活性相比，本发明的肌醇六磷酸酶具有至少20％的残余活性，使用0.25 M醋酸钠缓冲液pH 5.5，减去缓冲液封闭的，测定在37℃和pH 5.5下对1％(w/v)肌醇六磷酸钠的活性(以及残余活性)。在优选的实施方案中，所述残余活性是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或至少80％。在另一个实施方案中，在37℃和0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.5温育1天(24小时)后，与在时间t＝0处的活性相比，本发明的肌醇六磷酸酶具有至少20％的残余活性，使用0.25M醋酸钠缓冲液pH 5.5，减去缓冲液封闭的，测定在37℃和pH 5.5下对1％(w/v)肌醇六磷酸钠的活性(以及残余活性)。在优选的实施方案中，所述残余活性是至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或至少80％。

在第八方面，本发明涉及包含SEQ ID NO：2或其成熟多肽的一个或多个氨基酸保守取代、缺失和/或插入的人工变体。插入可在分子内部，和/或在也特指延伸的情况下，在所述分子的N-和/或C-末端。优选地，轻微特性的氨基酸改变是保守的氨基酸取代；小的缺失，通常是1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端的延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；至多约20-25个残基的小的连接肽；或通过改变净电荷或其他功能而有利于纯化的小的延伸，例如多组氨酸区(tract)，抗原表位或结合域——换言之：不明显影响所述蛋白质折叠和/或活性的改变。

保守取代的例子是在碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳香族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的范围内。

其他保守取代的例子是20种标准氨基酸和非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)的取代。保守取代还可包括不为遗传密码所编码的氨基酸和非天然氨基酸的取代。在蛋白合成后“非天然氨基酸”已被修饰，和/或在其侧链中具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以化学合成，优选是市售的，包括六氢吡啶羧酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸和3，3-二甲基脯氨酸。

在一个特定的实施方案中，变体不包含所有下列四种取代的组合：N31D、Q139K、L197F、N316K。在另一个特定的实施方案中，变体不包含所有下列四种取代的组合：N31D、N121T、K132T、Q139K。

或者，所述氨基酸改变是这样一种情况，即所述多肽的物理化学特性被改变。例如，氨基酸改变可改善所述多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等等。

根据本领域公知的方法可以鉴定亲本多肽中的必需氨基酸，例如定向诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一种技术中，单个丙氨酸诱变被导入分子中的每个残基处，并测试所得到的突变分子的生物活性(即肌醇六磷酸酶活性)以鉴定对所述分子活性起关键作用的氨基酸残基。也参见Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271：4699-4708。还可通过结构的物理分析，如诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术，并结合推定的接触位点氨基酸的突变，来确定酶或其他生物学相互作用的活性位点。参见，例如，de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol.224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Lett.309：59-64。还可通过分析与根据本发明的多肽相关的多肽所具有的特性推定必需氨基酸的身份(identities)。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，并继之以相应的筛选方法，例如描述于Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science 241：53-57；Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625中的那些，可制备并测试单个或多个氨基酸取代。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(如Lowman等，1991，Biochem.30：10832-10837；U.S.专利号5,223,409；WO 92/06204)、和区域-定向诱变(Derbyshire等，1986，Gene 46：145；Ner等，1988，DNA 7：127)。

诱变/改组方法可与高通量、自动化的筛选方法组合以检测宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可从宿主细胞中回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法进行快速测序。这些方法使目的多肽中单个氨基酸残基重要性的快速确定成为可能，并可应用于未知结构的多肽。

在SEQ ID NO：2的氨基酸1-411序列中，氨基酸取代(优选保守取代)、缺失和/或插入的总数是至多10、优选至多9、更优选至多8、更优选至多7、更优选至多6、更优选至多5、更优选至多4、还优选至多3、最优选至多2、和还最优选1。

SEQ ID NO：2的氨基酸1-411的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10、优选9、更优选8、更优选7、更优选至多6、更优选至多5、更优选4、还优选3、最优选2、和还最优选1。或者，在SEQ ID NO：2的氨基酸1-411序列中，氨基酸取代(优选保守取代)、缺失和/或插入的总数是至多50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、或至多11。

在一个具体的实施方案中，本发明的多肽一种低变应原性(low-allergenic)变体，目的在于当暴露于包括人的动物时，产生减少的免疫应答。术语免疫应答应理解为暴露于所述多肽的动物的免疫系统的任何反应。一种类型的免疫应答是在暴露的动物中导致增加的IgE水平的变态反应。可使用本领域公知技术制备低变应原性变体。例如，所述多肽可缀合屏蔽与免疫应答相关的多肽部分或表位的聚合物部分。与聚合物的缀合可包括体外化学偶联聚合物至所述多肽上，如WO96/17929、WO98/30682、WO98/35026和/或WO99/00489中所描述的。缀合可额外或可选地包括体内偶联聚合物到所述多肽上。这样的缀合可通过遗传改造编码所述多肽的核苷酸序列，在所述多肽中插入编码额外的糖基化位点的共有序列，并在能糖基化所述多肽的宿主中表达所述多肽而得以实现，参见如WO00/26354。另一种提供低变应原性变体的方法是遗传改造编码所述多肽的核苷酸序列，使得所述多肽自寡聚体化，招致多肽单体能屏蔽其他多肽单体的表位，并因此降低所述寡聚体的抗原性。这样的产物及其制备描述于如WO96/16177。可通过多种方法鉴定与免疫应答相关的表位，例如WO00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体展示法，或EP 561907中描述的随机法。一旦鉴定了表位，通过已知的基因操作技术，例如定向诱变(参见如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO00/22103)和/或缀合足够邻近所述表位的聚合物以屏蔽所述表位，可改变其氨基酸序列以产生具有改变的免疫学特性的多肽。

具有肌醇六磷酸酶活性多肽的来源

本发明的多肽可获得自任何属的微生物。对本发明来说，本文使用的术语“获得自”与给定的来源相结合应意指核苷酸序列所编码的多肽产生自所述来源或已插入来自所述来源的核苷酸序列的菌株。在一个优选的方面，所述获得自给定的来源的多肽是胞外分泌的。

本发明的多肽可以是细菌多肽。例如，多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，例如芽孢杆菌属多肽、或链霉菌属(Streptomyces)多肽，或是革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌、耶尔森氏菌属(Yersinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、或假单胞菌属(Pseudomonas)多肽。在一个特定的实施方案中，所述多肽来源于蛋白菌(Proteobacteria)，例如γ-蛋白菌(Gammaproteobacteria)，如肠细菌，如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。

在一个特定的方面，来源于肠杆菌科的多肽是柠檬酸杆菌属多肽，例如无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、布氏柠檬酸杆菌、法氏柠檬酸杆菌(Citrobacter farmeri)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、Citrobacter gillenii、中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、差异柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、Citrobacter murliniae、Citrobacter rodentium、塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)、或柠檬酸杆菌(Citrobacter species)多肽。

在一个更优选的方面，多肽是布氏柠檬酸杆菌多肽，最优选布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113多肽，如SEQ ID NO：4多肽。对于特定菌株公众可获得自美国典型培养物保藏中心，ATCC。

本发明的多肽还可以是真菌多肽，例如酵母多肽或丝状真菌多肽。

公众很容易从许多菌种保藏单位，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)，德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)，真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Regional Research Center)(NRRL)获得上述微生物菌株。

此外，上述多肽可被鉴定或获得自其他来源，包括使用上述探针从自然界(如土壤、堆肥、水等)分离的微生物。用于从天然环境分离微生物的技术是本领域众所周知的。然后，可通过类似方法筛选其他微生物的基因组或cDNA文库获得多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就可使用本领域技术人员众所周知的技术(参见如Sambrook等，1989，同上)分离或克隆所述多核苷酸。

本发明的多肽还包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽融合到所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。通过将编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合到本发明的核苷酸序列(或其部分)产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域公知的，包括连接编码所述多肽的编码序列使得它们符合读框，并在相同的启动子和终止子控制下表达所述融合多肽。

多核苷酸

本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸。在一个优选的方面，所述核苷酸序列如SEQ ID NOs：1或3任一所示。在另一个优选的方面，所述核苷酸序列是SEQ ID NOs：1或3任一的成熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQ ID NOs：2或4的氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的核苷酸序列，由于遗传密码简并性，所述核苷酸序列分别与SEQID NOs：1或3不同。本发明还涉及SEQ ID NOs：1或3的子序列，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的SEQ ID NOs：2或4的片段。

本发明还涉及在SEQ ID NOs：1或3任一的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变的突变的多核苷酸，其中所述突变的核苷酸序列编码由SEQ IDNOs：2或4的氨基酸1-411组成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域公知的，包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或它们的组合。如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或用抗体筛选表达文库以检测具有共同结构特性的克隆的DNA片段，可实现从上述基因组DNA克隆本发明的多核苷酸。参见如Innis等，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可使用其他的核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和核苷酸序列依赖的扩增(NASBA)。所述多核苷酸可克隆自柠檬酸杆菌属菌株、或不同的或相关的生物体，并因此例如，可以是所述核苷酸序列多肽编码区的等位或物种变体。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列(即核苷酸67-1299)至少98.3％同一性水平，并编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在特定的实施方案中，所述同一性水平是至少98.4、98.5、98.6、98.7、98.9、99、99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、或至少99.9％。在可选的实施方案中，所述同一性水平是至少61％、或至少70％、75％、80％、85％、90％、94、97、98、98.0、98.1、98.2、或至少98.3％。

本发明还涉及具有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列具有与SEQ ID NO：3的成熟多肽编码序列(即核苷酸67-1299)至少98.9％同一性水平，并编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽。在特定的实施方案中，所述同一性水平是至少99.0、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、或至少99.9％。在可选的实施方案中，所述同一性水平似乎至少61％、或至少70％、75％、80％、85％、90％、94、97、98、98.0、98.1、98.2、98.3、98.4、98.5、98.6、98.7、或至少98.8％。

对于合成基本上类似于本发明多肽的多肽，修饰编码本发明多肽的核苷酸序列是必需的。对于所述多肽，术语“基本上类似”指所述多肽非天然存在的形式。这些多肽可通过某些改造方式而不同于分离自其天然来源的多肽，如在比活、热稳定性、最适pH等上不同的人工变体。所述变体序列可在作为SEQ ID NO：1的多肽编码区存在的核苷酸序列如其子序列的基础上，和/或通过导入不产生所述核苷酸序列编码的多肽的不同的氨基酸序列，但相应于预期用于产生所述多肽的宿主生物体的密码子选择的核苷酸取代，或通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代而得到构建。对于核苷酸取代的概述，参见如Ford等，1991，Protein Expression and Purification2：95-107。

对于本领域技术人员，显而易见的是这样的取代能在对分子功能起关键作用的区域外进行，且还产生活性多肽。对于本发明分离的多核苷酸编码的多肽的活性所必需的并因此优选不被取代的氨基酸残基，可根据本领域公知的方法进行鉴定，例如定向诱变或丙氨酸扫描诱变(参见如Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后一种技术中，突变被导入分子中每个带正电荷的残基处，并测试所得到的突变分子的肌醇六磷酸酶活性以鉴定对所述分子活性起关键作用的氨基酸残基。还可通过分析诸如核磁共振分析、结晶学或光亲和标记的技术(参见如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，Journal of Molecular Biology 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)所测定的三维结构，确定底物-多肽相互作用的位点。

本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，其在如本文所定义的中等严格条件、更优选中高严格条件、还优选高严格条件、和最优选极高严格条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和/或(ii)任一的互补链；或其等位变体和子序列杂交(Sambrook等，1989，同上)。在可选的实施方案中，所述杂交在极低、或低严格条件下进行。

本发明还涉及通过(a)在极低、低、中等、中高、高或极高严格条件下将一群DNA与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)和/或(ii)任一的互补链杂交；和(b)分离编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的杂交的多核苷酸，获得的或可获得的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明分离的多核苷酸的核酸构建体，所述控制序列在与其相容的条件下，在合适的宿主细胞中指导编码序列表达。

可以多种方式处理编码本发明多肽的分离的多核苷酸，以供所述多肽表达之用。取决于表达载体，在多核苷酸序列插入载体前对其的处理可能是期望的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。

所述控制序列可以是适合的启动子序列，一种为宿主细胞所识别用于编码本发明多肽的多核苷酸表达的核苷酸序列。所述启动子序列含有调节多肽表达的转录控制序列。所述启动子可以是任何在所选择的宿主细胞中显示转录活性的核苷酸序列，包括突变、截短和杂合的启动子，并且可获得自编码与所述宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

适合指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获得自大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)，地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核生物β内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等，1978，Proceedings ofthe National Academyof Sciences USA 75：3727-3731)的启动子，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 80：21-25)。更多的启动子描述于″Useful proteins from recombinant bacteria″in Scientific American，1980，242：74-94；和Sambrook等，1989，同上。

适合指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的启动子的例子是获得自编码米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡萄糖苷酶(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(WO 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO00/56900)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶的基因的启动子，以及NA2-tpi启动子(一种来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的杂合启动子)；及其突变、截短和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子是获得自编码酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)，酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)，酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)，酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)，酿酒酵母金属硫蛋白(metallothionine)(CUP1)，酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)醇氧化酶(AOX1)的基因。其他用于酵母宿主细胞的启动子描述于Romanos等，1992，Yeast 8：423-488。

所述控制序列还可以使适合的转录终止子序列，一种为宿主细胞所识别以终止转录的序列。所述终止子序列可操作地连接到编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端。任何在所选择的宿主细胞中起作用的终止子都可用于本发明。

优选用于丝状真菌宿主细胞的终止子获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因。

优选用于酵母宿主细胞的终止子获得自编码酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。其他用于酵母宿主细胞的终止子描述于Romanos等，1992，同上。

所述控制序列还可以是适合的前导序列，一种对于宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。所述前导序列可操作地连接到编码所述多肽的核苷酸序列的5’末端。任何在所选择的宿主细胞中起作用的前导序列都可用于本发明。

优选用于丝状真菌宿主细胞的前导序列获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。

适合于酵母宿主细胞的前导序列是获得自编码酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。

所述控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接到所述核苷酸序列的3’末端，并且当转录时为宿主细胞所识别作为信号以添加多腺苷残基到转录的mRNA上的序列。任何在所选择的宿主细胞中起作用的多腺苷酸化序列都可用于本发明。

优选用于丝状真菌宿主细胞的多腺苷酸化序列是获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列描述于Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990。

所述控制序列还可以是编码连接多肽氨基末端并指导所编码多肽进入细胞分泌途径的氨基酸序列的信号肽编码区。所述核苷酸序列的编码序列的5’末端可固有地包含在翻译读框中与编码所述分泌多肽的编码区区段天然连接信号肽编码区。或者，所述编码序列的5’末端可含有对于编码序列是外源的信号肽编码区。当天然不含有信号肽编码区的编码序列时，所述外源信号肽编码区可能是必需的。或者，所述外源信号肽编码区可简单地取代天然的信号肽编码区，以便增强所述多肽的分泌。然而，任何指导所述表达的多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码区是获得自编码芽孢杆菌NCIB11837产麦芽糖淀粉酶，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因的信号肽编码区。更多的信号肽描述于Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137。

用于丝状真菌宿主细胞的信号肽编码区是获得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂酶的基因的信号肽编码区。

用于酵母宿主细胞的信号肽是获得自编码酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他有用的信号肽编码区描述于Romanos等，1992，同上，和Xiong等，Journal of Applied Microbiology 2005，98，418-428。

在一个优选的方面，所述信号肽编码区是SEQ ID NO：1的核苷酸1-66，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸1-22。在另一个优选的方面，所述信号肽编码区是SEQ ID NO：3的核苷酸1-66，其编码SEQ ID NO：4的氨基酸1-22。

所述控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得到的多肽称为前多肽或多肽原(或有时称为酶原)。前多肽通常是失活的，并且可通过来自前多肽的前肽催化或自催化裂解，而转变为成熟的活性多肽。所述前肽编码区可获得自编码枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(WO95/33836)的基因。

当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，所述前肽区紧靠近在多肽的氨基末端，而信号肽区则紧紧靠近在前肽区的氨基末端。

还期望的是添加提供调节与宿主细胞生长相关的多肽的表达的调节序列。调节系统的例子是响应化学或物理刺激，包括存在调节化合物情况下，引起基因表达启动或关闭的那些。原核生物系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可用作为调节序列。其他调节序列的例子是供基因扩增用的那些。

表达载体

本发明还涉及包含本发明多核苷酸、启动子、以及转录和翻译停止信号的重组表达载体。上述不同的核酸和控制序列可连接以产生重组表达载体，其可包括一个或多个合适的限制酶切位点以供编码多肽的核苷酸序列在该位点的插入或取代之用。或者，本发明的核苷酸序列可通过将所述核苷酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当的表达载体中而得以表达。在创建表达载体中，所述编码序列位于载体中以便其可操作地连接适当的控制序列用于表达。

所述重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作且可使所述核苷酸序列发生表达的载体(如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与其所要导入的宿主细胞的相容性。所述载体可以是线性或闭合环状质粒。

所述载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。所述载体可含有任何用于确保自复制的结构。或者，所述载体可以是这样一种载体，即当其导入宿主细胞中时，被整合到基因组中并与其所整合入的染色体一起复制。此外，可以使用单个载体或质粒，或共同含有要被导入宿主细胞基因组的总DNA或转座子的两个或更多个载体或质粒。

本发明的载体优选含有一个或多个选择标记，其使转化细胞易于选择。选择标记是一种其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型原营养(prototrophy to auxotrophs)等的基因。

条件必需基因可起非抗生素选择标记的作用。细菌条件必需非抗生素选择标记的非限制的例子是来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或其他芽孢杆菌的dal基因，仅当所述细菌在不存在D-丙氨酸情况下培养时是必需的。当细胞在半乳糖存在下生长或在导致半乳糖出现的培养基中生长时，编码与UDP-半乳糖循环相关的酶的基因在所述细胞中也可起条件必需标记的作用。这样的基因的非限制性例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌编码UTP-依赖型磷酸化酶(EC 2.7.7.10)、UDP-葡萄糖-依赖型尿苷酰转移酶(uridylyltransferase)(EC 2.7.7.12)或UDP-半乳糖差向异构酶(EC 5.1.3.2)的那些。在木糖作为唯一碳源的基本培养基中生长的细胞中，诸如芽孢杆菌的xylA的木糖异构酶基因亦可作为选择标记。在葡糖酸/盐作为唯一碳源的基本培养基中生长的细胞中，对于利用葡糖酸/盐、gntK和gntP必需的基因也可用作为选择标记。其他条件必需基因的例子是本领域公知的。抗生素选择标记赋予了对诸如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、红霉素、四环素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤的抗生素的抗生素抗性。

对于酵母宿主细胞，适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。供丝状真菌宿主细胞使用的选择标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，及其等价物。优选供曲霉菌细胞使用的标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因，以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有容许所述载体整合入宿主细胞基因组或在细胞中不依赖于基因组载体自主复制的元件。

为了整合入宿主细胞基因组，所述载体可依赖于编码所述多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组得到所述载体的任何其他元件。或者，所述载体可含有额外的用于指导通过同源重组在染色体中准确位置整合入宿主细胞基因组的核苷酸序列。为增加在准确位置整合的可能性，所述整合元件应优选含有足够数量的核酸，例如100--10,000个碱基对、优选400-10,000个碱基对、以及最优选800-10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高水平的同一性以增加同源重组的可能性。所述整合元件可以是任何与宿主细胞基因组中靶序列同源的序列。此外，所述整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组整合入宿主细胞基因组。

为了自主复制，所述载体可进一步包含能使其在所述的宿主细胞中自主复制的复制起点。所述复制起点可以是任何在细胞中起介导自主复制作用的质粒复制区。在本文中，术语“复制起点”或“质粒复制区”定义为能使质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。

细菌复制起点的例子是容许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC 19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和容许在芽孢杆菌中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞的复制起点的例子是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。

用于丝状真菌细胞的复制起点的例子是AMA1和ANS1(Gems等，1991，Gene 98：61-67；Cullen等，1987，Nucleic Acids Research 15：9163-9175；WO00/24883)。可根据WO 00/24883中所公开的方法实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

多于一个拷贝的本发明的多核苷酸可插入宿主细胞中以增加基因产物的产量。可通过将至少一个额外的序列拷贝整合入宿主细胞基因组或通过在所述多核苷酸中包含可扩增的选择标记基因，在此细胞含有扩增的选择标记基因拷贝，并因此可通过在适当的选择试剂存在下培养所述细胞以选择额外的多核苷酸拷贝，从而获得所述多核苷酸拷贝数的增加。

用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员众所周知的(参见如Sambrook等，1989，同上)。

宿主细胞

本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组宿主细胞，其便于所述多肽的重组生产。将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细胞，使得所述载体保持为染色体整合体或如上所述的自主复制的染色体外载体。由于在复制过程中发生突变，术语“宿主细胞”包含任何与亲本细胞不相同的亲本细胞后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码所述多肽的基因及其来源。

所述宿主细胞可以是单细胞微生物如原核生物，或非单细胞微生物如真核生物。

有用的单细胞微生物是诸如革兰氏阳性细菌的细菌细胞，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、Bacillus clausii、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌、和苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)；或链霉菌属细胞，如浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)和鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)，或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌和假单胞菌(Pseudomonas sp)。在一个优选的方面，所述细菌宿主细胞是迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在另一个优选的方面，所述芽孢杆菌属细胞是嗜碱芽孢杆菌。

将载体导入细菌宿主细胞中可例如通过原生质体转化(参见如Chang和Cohen，1979，Molecular General Genetics 168：111-115)、使用感受态细胞(参见如Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology 56：209-221)、电穿孔(参见如Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)、或接合(参见如Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)来实施。

宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。本文中使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等，在Ainsworth和Bisby’sDictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定义的)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，文献同上，第171页中所提及的)以及所有有丝分裂孢子(mitosporic)真菌(Hawksworth等，1995，文献同上)。

在更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子孢子囊酵母(basidiosporogenous)和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类将来可能会有所变化，对本发明而言，应按照Biology and Activities ofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.，和Davenport，R.R.，编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所述的定义酵母。

在更加优选方案中，酵母宿主细胞可以是念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia细胞。

在最优选的的方案中，酵母宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、Pichia methanolica、卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化糖酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis或卵形糖酵母(Saccharomyces oviformis)细胞。在另一个最优选的方案中，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方案中，酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，文献同上所定义的)所有丝状形式的亚类。丝状真菌特征在于通常由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖、以及其它复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长依靠菌丝延长，且碳分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母的酵母的营养生长通过单细胞原植体的芽殖进行，且碳分解代谢可以是发酵的。

在一个还优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是一种(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、Ceriporiopsis、鬼伞属(Coprinus)、采绒革盖菌(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filobasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Phanerochaete、Phlebia、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、耐热子囊菌(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium、Trametes或木霉属(Trichoderma)细胞。

在一个最优选的方面，所述丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选的方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense，大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum细胞。在另一个最优选的方面中，丝状真菌宿主细胞为黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis aneirina、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、Ceriporiopsis subvermispora、Coprinus cinereus、Coriolushirsutus、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米赫毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Phanerochaete chrysosporium、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、Pleurotus eryngii、Thielavia terrestris、Trametes villosa、Trametes versicolor、Trichoderma harzianum、康氏木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichodermaviride)菌株细胞。

真菌细胞可通过在某种意义上就其本身而论是已知的涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的过程得到转化。适合曲霉属和木霉属宿主细胞转化的方法描述于EP 238 023和Yelton等，1984，Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 81：1470-1474。适合镰孢属(Fusarium)菌种转化的方法描述于Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO96/00787。使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编，Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York中；Ito等，1983，Journal ofBacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920描述的方法可转化酵母。

生产方法

本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养其野生型能生产所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。优选地，所述细胞是柠檬酸杆菌属的，以及更优选是布氏柠檬酸杆菌的。

本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含在SEQ ID NOs：1和3任一的成熟多肽编码区中具有一个突变的突变的核苷酸序列，其中所述突变的核苷酸序列编码由SEQ ID NOs：2和4任一的氨基酸1-411组成的多肽，和(b)回收所述多肽。

在本发明的生产方法中，使用本领域众所周知的方法，在适合于所述多肽生产的营养培养基中培养所述细胞。例如，可在实验室或工业发酵罐中，在适合的培养基中和在容许所述多肽表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、和小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料、或固态发酵)培养所述细胞。使用本领域公知的方法，在包含碳源和氮源及无机盐的适合的营养培养基中进行所述培养。适合的培养基可从供应商处获得或可根据公布的成分进行制备(如在美国典型培养物保藏中心目录中)。如果所述多肽分泌到营养培养基中，则其可直接从该培养基中回收。如果所述多肽不分泌，则其可从细胞裂解液中回收。

可使用本领域公知的特异于所述多肽的方法检测多肽。这些检测方法可包括使用特异性抗体、形成多肽产物、或多肽底物的消失。例如，本文所述的多肽测定法可用于测定所述多肽的活性。

可使用本领域公知的方法回收所得到的多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基中回收所述多肽。

本发明的多肽可过多种本领域公知的方法进行纯化，包括但不限于，层析法(如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和大小排阻)、电泳操作(如制备型等电聚焦)、差异的溶解度(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见如Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，NewYork，1989)。

转基因植物

本发明还涉及已用编码具有肌醇六磷酸酶活性的本发明多肽的核苷酸序列转化的转基因植物、植物部分或植物细胞，使得以可回收的量表达并产生所述多肽。所述多肽可以回收自植物或植物部分。或者，含有重组多肽的植物或植物部分可同样地用于改善食物或饲料的质量，如改善营养价值、适口性和流变特性，或用于破坏抗营养因子。

在一个特定的实施方案中，所述多肽靶向于种子中的胚乳贮藏液泡。可通过将其作为带有适合的信号肽的前体合成而获得，参见Horvath等，PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。

所述转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或其工程变体。单子叶植物的实例是草类/禾本科(grasses)，例如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))，饲用牧草(forage grass)，例如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)、寒地型牧草(temperate grass)，例如Agrostis，和谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、triticale(小麦(triticum))和黑麦(Secale)的稳定杂种和玉蜀黍(玉米)。双子叶植物植物的实例有烟草、豆类(legumes)，例如向日葵(Helianthus)、棉花(Gossypium)、羽扇豆(lupin)、马铃薯、甜菜(sugar beet)、豌豆、菜豆和大豆，和十字花科植物(十字花科(Brassicaceae)科)，例如花椰菜、油菜籽(rape seed)、和紧密相关的模型生物拟南芥(Arabidopsis thaliana)以及十字花科植物(Brassicaceae家族)，例如菜花、菜籽(rape seed)和密切相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。美国专利no.5,689,054和美国专利no.6,111,168中描述的低肌醇六磷酸植物是工程化植物实例。

植物部分的例子是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎，以及包含这些部分的单个组织，如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特定的植物细胞区室，例如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也被视为植物部分。此外，所有的植物细胞，无论其组织来源，都被视为植物部分。同样地，被分离以利于本发明应用的诸如特定组织和细胞的植物部分也被视为植物部分，如胚、胚乳、糊粉和种皮。

也包括在本发明范围中的是上述植物、植物部分和植物细胞的后代。

可根据本领域公知方法构建所述表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简言之，通过将一个或多个编码本发明多肽的表达构建体掺入植物宿主基因组并将所得到的修饰的植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞，构建所述植物或植物细胞。

方便地，所述表达构建体是包含编码本发明多肽的核酸序列的核酸构建体，所述核酸序列可操作地连接有在所选择的植物或植物部分中表达核酸序列所必需的适当的调节序列。此外，所述表达构建体可包含用于鉴定其中所述表达构建体已整合入的宿主细胞的选择标记，和将所述构建体导入所述的植物中所必需的DNA序列(后者取决于要使用的DNA导入方法)。

例如，基于期望所述多肽何时、何地及以何方式表达，决定诸如启动子和终止子序列的调节序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，所述编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的细胞区室、组织或植物部分。例如种子或叶。调节序列是例如描述于Tague等，1988，PlantPhysiology 86：506的。

对于组成型表达，可使用下列启动子：35S-CaMV启动子(Franck等，1980，Cell 21：285-294)、玉米泛蛋白1(Christensen AH，Sharrock RA和Quail1992.Maize polyubiquitin genes：structure，thermal perturbation of expressionand transcript splicing，and promoter activity following transfer to protoplasts byelectroporation)、或稻肌动蛋白1启动子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；ZhangW，McElroy D.和Wu R 1991，Analysis of rice Act1 5’region activity intransgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特异性启动子可以是，例如，来自诸如种子、马铃薯块茎和果实的贮藏库(sink)组织的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自诸如分裂组织的代谢库(sink)组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，诸如来自稻的谷蛋白、醇溶谷蛋白、球蛋白或白蛋白启动子的种子特异性启动子(Wu等，1998，Plant and Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白B4的蚕豆(Vicia faba)启动子和来自蚕豆的未知种子蛋白基因(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)，来自种子油体蛋白的启动子(Chen等，1998，Plant and Cell Physiology 39：935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的储存蛋白napA启动子或任意其它本领域中公知的，例如如WO 91/14772中所述的种子特异性启动子。此外，启动子可以为叶特异性启动子，诸如来自稻米或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等，1993，PlantPhysiology 102：991-1000；小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant Molecular Biology 26：85-93)或来自水稻的aldP基因启动子(Kagaya等，1995，Molecular和General Genetics 248：668-674)；或伤口诱导型启动子，诸如马铃薯pin2启动子(Xu等，1993，Plant MolecularBiology 22：573-588)。同样，启动子可以通过非生物性处理，诸如温度、干旱或盐浓度改变而成为诱导型的或通过活化启动子的外部施用的物质诱导，所述的外部施用的物质例如为乙醇、雌激素、植物激素，诸如乙烯、脱落酸和赤霉酸和/或重金属。

启动子增强子元件还可以用于在所述植物中实现多肽的更高表达。例如，所述启动子增强子元件可以是一种置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如，Xu等，1993，同上公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增加表达。

更进一步，对于所述的植物物种，可以优化密码子选择以提高表达(参见Horvath等上述所提及的)。

选择标记基因和任何其他表达构建体的部分可选自在本领域中可得到的那些。

根据本领域公知技术，将核酸构建体掺入植物基因组中，包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹轰击和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto等，1989，Nature 338：274).

目前，根癌农杆菌介导的基因转移是选择用于产生转基因双子叶植物的方法(对于评述，参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant MolecularBiology 19：15-38)，并且其还可用于转化单子叶植物，尽管其他的转化方法更常用于这些植物。目前，用于补充农杆菌方法的产生转基因单子叶植物的方法的选择是胚愈伤组织或发育的胚的粒子轰击(用转化的DNA包被的极微小的金或钨颗粒)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil等，1992，Bio/Technology 10：667-674)。一种可选的用于单子叶植物转化的方法是基于如Omirulleh等，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428所描述的原生质体转化。

转化后，根据本领域众所周知的方法，选择其中已插入表达构建体的转化体并再生为全株。通常，所述转化方法被设计用于在再生过程中、或在通过使用如用两种单独的T-DNA构建体共转化增殖后选择性淘汰所选择的基因，或通过特异性重组酶位点特异性切除所选择的基因。

本发明还涉及用于生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含编码具有肌醇六磷酸活性的本发明多肽的核酸序列的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

转基因动物

本发明还涉及转基因的、非人动物及其产物或组成部分，其例子是诸如乳和血液的体液、器官、肉以及动物细胞。用于在例如哺乳动物细胞中表达蛋白质的技术是本领域公知的，参见如手册Protein Expression：APractical Approach，Higgins和Hames(编)，Oxford University Press(1999)，以及该系列中三本涉及基因转录(Gene Transcription)、RNA加工(RNAprocessing)和翻译后加工(Post-translational Processing)的其他手册。一般来说，为制备转基因动物，用编码具有肌醇六磷酸活性的本发明多肽的核酸序列转化所选择动物的所选择细胞，使之表达并产生所述多肽。可从所述动物如从雌性动物的奶回收多肽，或为了动物自身的利益，可表达所述多肽，如帮助动物消化。动物的例子将在下述标题为动物饲料的节中提及。

为产生以从所述动物的奶中回收多肽为目的的转基因动物，可将编码所述多肽的基因插入所述动物的受精卵中，如通过使用包含适合的奶蛋白质启动子以及编码所述多肽的基因的转基因表达载体。将所述转基因表达载体显微注射到受精卵中，并优选永久整合到染色体中。一旦所述卵开始生长并分裂，就将有能力的胚植入代孕母体中，并鉴定携带所述转基因的动物。然后，可通过常规的饲养方法繁殖所得到的动物。可从所述动物的奶中纯化多肽，参见如Meade，H.M.等(1999)：Expression of recombinantproteins in the milk of transgenic animals，Gene expression systems：Usingnature for the art of expression.J.M.Fernandez and J.P.Hoeffler(编)，Academic Press。

或者，为产生在其体细胞和/或生殖细胞基因组中携带核酸序列的转基因非人动物，所述核酸序列包括包含编码所述多肽的转基因的异源转基因构建体，可将转基因可操作地连接到用于唾液腺特异性表达所述多肽的第一个调节序列，如WO 00/064247所公开的。

组合物和用途

在更进一步的方面，本发明涉及包含本发明多肽的组合物以及使用这些组合物的方法。

所述多肽组合物可根据本领域公知方法制备，并且可以液体或干燥组合物的形式存在，例如，所述多肽组合物可以颗粒状或微颗粒状形式存在。可以根据本领域公知方法稳定所述包含在组合物中的多肽。

本发明的肌醇六磷酸酶在任何工业环境中可用于降解，例如肌醇六磷酸、植酸(phytic acid)和/或肌醇的单、二、三、四和/或五磷酸盐。众所周知这些化合物的磷酸盐部分与诸如金属离子的二价和三价阳离子螯合，即营养必需离子钙、铁、锌和镁以及微量元素锰、铜和钼。此外，所述植酸在某种程度上还通过静电相互作用与蛋白质结合。

因此，本发明多肽优选用于动物饲料制备物(包括人类食物)或该制备物的添加剂中。

在一个特定的实施方案中，本发明多肽可用于改善动物饲料的营养价值。改善动物饲料(包括人类食物)营养价值的非限制性例子是：改善饲料消化率；促进动物生长；改善饲料利用性；改善蛋白的生物利用率；增加可消化的磷酸盐的水平；改善肌醇六磷酸的释放和/或降解；改善痕量矿物的生物利用率；改善大分子矿物质的生物利用度；消除添加补充的磷酸盐、微量矿物质和/或大分子矿物质的需要；和/或改善蛋壳质量。因此提高了饲料的营养价值，而且也可以改善动物的增长率和/或体重增加和/或饲料转化率(即摄取的饲料重量/增加的体重)。

而且，本发明的多肽可用于降低粪(manure)中的肌醇六磷酸水平。

动物、动物饲料和动物饲料添加剂

术语动物包括所有的动物，包括人类。动物的例子是非反刍类和反刍类。反刍类动物包括诸如绵羊、山羊、马和牛的动物，如肉牛、母牛和小牛犊。在一个特定的实施方案中，所述动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，如猪(pigs)或猪(swines)(包括但不限于小猪、育成猪和母猪)；家禽例如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉用仔鸡、蛋鸡)；兽仔，和鱼类(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼；以及甲壳类(包括但不限于包括但不是限于虾和对虾)。

术语饲料或饲料成分(composition)指适合被动物摄取或为被动物摄取而设计的任何化合物、制品、混合物或组合物。

依照本发明的用途，可以在饮食之前、之后或同时给动物饲喂本发明的多肽。优选后者。

在特定实施方案中，添加到饲料中的多肽或包含在饲料添加剂中的多肽是基本上纯的多肽形式。在特定实施方案中，已经明确限定这一点。术语″明确限定″(well-defined)指用分子排阻色谱确定时，肌醇六磷酸酶制品的纯度为至少50％(参见WO 01/58275的实施例12)。在其他特定实施方案，用这种方法确定的肌醇六磷酸酶制品的纯度为至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％。

一种基本上纯和/或明确限定的多肽制备物是有利的。例如，其更易于将基本上不含干扰或污染的其他多肽的多肽精确配制到饲料中。术语精确配制特别指获得一致且不变结果的客观事实，以及基于所期望效果获得最佳剂量的能力。

然而，对于在动物饲料中使用，本发明的肌醇六磷酸酶多肽无需这样的纯度；其可以例如包括其他多肽，在这样情况下其可命名为肌醇六磷酸酶制备物。

所述肌醇六磷酸酶制备物可以(a)直接添加到饲料中(或在蛋白质的处理过程中直接使用)，或(b)可在生产一种或多种中间组合物中使用，例如随后添加到饲料中的饲料添加剂或预混合料(或用于处理过程)。无论根据上述(a)或(b)来使用，上述纯度指原始多肽制备物的纯度。

具体来说，使用重组生产方法可获得具有这样数量级纯度的多肽制备物，然而，当所述多肽通过传统的发酵方法生产时，这样数量级的纯度不易获得，并且还存在非常高的批间偏差。

这样的多肽制备物当然可以与其他多肽混合。

所述多肽可以任何形式添加到饲料中，只要其是相对纯的多肽，或与其他预期添加入动物饲料中的组分以掺和物的形式存在，即以动物饲料添加剂的形式存在，例如所谓的用于动物饲料的预混合料。

在另一方面，本发明涉及供动物饲料使用的组合物，例如动物饲料和动物饲料添加剂，如预混合料。

除本发明多肽之外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素，和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物。所述饲料添加剂还可含有至少一种大分子矿物质。

此外，饲料添加剂组分可以随意地是着色剂，例如类胡萝卜素，比如β-胡萝卜素、虾青素和叶黄素(lutein)；芳香族化合物；稳定剂；抗菌肽；多不饱和脂肪酸；活性氧产生物质；和/或至少一种从肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC 3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC3.1.4.4)；淀粉酶，例如，α淀粉酶(EC 3.2.1.1)；和/或β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或者EC 3.2.1.6)中选择出来的其他多肽。

在特定实施方案中，明确限定了这些其他多肽(就象上文限定肌醇六磷酸酶制品一样)。

在特别优选的实施方案中，本发明的具有相对低的pH最适条件的肌醇六磷酸酶可以与至少一种具有更高pH最适条件的肌醇六磷酸酶组合。具有更高pH最适条件的肌醇六磷酸酶的优选实例有芽孢杆菌属肌醇六磷酸酶，例如来自地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的肌醇六磷酸酶，以及其具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、变体或片段。

本发明的肌醇六磷酸酶也可以与其他的肌醇六磷酸酶，例如子囊菌(ascomycete)肌醇六磷酸酶，例如曲霉肌醇六磷酸酶，例如来源于无花果曲霉(Aspergillus ficuum)、黑曲霉或泡盛曲霉的肌醇六磷酸酶；或担子菌(basidiomycete)肌醇六磷酸酶，例如来源于Peniophora lycii、Agrocybepediades、Trametes pubescens或Paxillus involutus的肌醇六磷酸酶；或其具有肌醇六磷酸酶活性的衍生物、片段或变体组合。

因此，在用于本发明的动物饲料的优选实施方案和用于本发明的动物饲料添加剂和动物饲料的优选实施方案中，本发明的肌醇六磷酸酶可以与这些肌醇六磷酸酶组合。

上述子囊菌和担子菌肌醇六磷酸酶，特别是来源于Peniophora lycii的RONOZYME P肌醇六磷酸酶，以及其衍生物、变体和片段也可以与芽孢杆菌属肌醇六磷酸酶，特别是地衣芽孢杆菌肌醇六磷酸酶，以及其衍生物、片段和变体组合以特别用于动物饲料中。

抗微生物肽(AMP′s)的实例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、protegrin-1、Thanatin、防卫素(Defensin)、Lactoferrin、Lactoferricin和Ovispirin，例如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins、和抑制素(Statins)，包括在WO 03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及上述保持抗微生物活性的肽的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP′s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)，和黑曲霉(Aspergillus niger)肽，以及保持抗真菌活性的其变体和片段，如在WO94/01459和WO 02/090384中所公开的。

多聚不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22多聚不饱和脂肪酸，例如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid)和γ-亚油酸。

产生活性氧物质类的实例是例如过硼酸盐、过硫酸盐、或过碳酸盐的化学试剂；和例如氧化酶、加氧酶或合成酶的多肽。

通常脂溶或水溶性的维生素，以及微量矿物质形成将加入饲料的所谓预混合料的部分，而通常将大量矿物质单独加入饲料。任何这些组合物的类型，在富集本发明蛋白酶时，是本发明的动物饲料添加剂。

在特定的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂预期包括(或如必须包括时规定)在动物的日常饮食中，或以0.01至10.0％；更具体为0.05至5.0％；或0.2至1.0％的水平喂饲(％是指每100g饲料的g添加剂)。这特别地用于预混合料。

以下是这些成分实例的非排它列表：

脂溶性维生素的实例有维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例有维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸(panthothenate)，例如D-泛酸钙(Ca-D-panthothenate)。

微量无机物的实例有锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

大分子矿物质的实例有钙、磷和钠。

这些成分的营养需要量(以家禽和仔猪/猪例证)如WO 01/58275的表A所列。营养需要量是指在日常饮食中应以指明的浓度提供这些成分。

可选的，本发明的动物饲料添加剂包括WO01/58275的表A中列举的至少一种单独成分。在本文中，至少一种意味着任何一种、一种或多种、一种或2、或3、或4种等直到所有的13种、或直到所有的15种单独成分。更具体地说，这个至少一种单一成分包括在本发明的添加剂中，其在饲料浓度中呈现的数量是在表A的第4栏、第5栏、或第6栏指明的范围内。

本发明也涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或日常饮食具有相对高含量的蛋白质。可如WO 01/58275的表B中第2-3栏所指明的表征家禽和猪的调养饲料。可如该表B的第4栏中所指明的表征鱼饮食饲料。此外这种鱼饮食饲料通常具有200-310g/kg含量的粗脂肪。

WO 01/58275对应US 09/779334，其包含在本文作为参考。

本发明所述的动物饲料组合物具有50-800g/kg含量的粗蛋白，而且包括至少一种在此所要求保护的蛋白酶变体。

此外，或可选的(关于如上所述的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。

在特定的实施方案中，代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量是在WO 01/58275表B中第2、3、4或5中任何一项的范围内(R.2-5)。

通过将氮(N)乘以因子6.25来计算粗蛋白，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通过Kjeldahl定氮法(A.O.A.C.，1984，Official Methods ofAnalysis第14版，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)确定含氮量。

可基于NRC出版物Nutrient requirements in swine，第九修订版，1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animal nutrition，board ofagriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6，和European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DA Beekbergen，TheNetherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5计算可代谢能量。

基于诸如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7的饲料表格计算完全动物食物中钙、有效磷和氨基酸的食物含量。

具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物含有至少一种蛋白。所述蛋白可以是动物蛋白，诸如肉和骨类粉，和/或鱼粉(fish meal)；或在具体实施方案中，其可以是植物蛋白质。术语植物蛋白是指包括至少一种衍生自或起源于植物的蛋白质，包括修饰的蛋白质和蛋白质-衍生物的任何化合物、组合物、制剂或混合物。在特定的实施方案中，植物蛋白的蛋白质含量是至少10、20、30、40、50、或60％(w/w)。

植物蛋白可衍生自植物蛋白来源，例如豆类和谷类，例如来自豆科(Fabaceae)(Leguminosae)、十字花科、藜科(Chenopodiaceae)、和禾本科(Poaceae)植物的材料，例如大豆粗粉、羽扇豆粗粉和油菜籽粉。

在特定的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种豆科植物，例如大豆、羽扇豆、豌豆或菜豆的材料。

在另一个特定的实施方案中，植物蛋白来源是来自一种或多种藜科植物，例如甜菜、制糖甜菜(sugar beet)、菠菜或奎藜籽(quinoa)的材料。

植物蛋白来源的其它实例是油菜籽，葵花籽，棉花籽和卷心菜。

大豆是优选的植物蛋白来源。

植物蛋白来源的其它实例是谷类，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、王蜀黍(玉米)、稻(rice)，triticale，和高粱。

在更进一步的特定实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％的玉米；和/或0-80％的高粱；和/或0-70％的小麦；和/或0-70％的大麦；和/或0-30％的燕麦；和/或0-40％的大豆粉；和/或0-25％的鱼粉；0-25％肉和骨粉；和/或0-20％的乳清。

动物食物可例如制备为糊状饲料(非颗粒状的)或颗粒状饲料。典型地，混合磨成粉的饲料原料并根据所述物种的规格标准添加足够量的必需维生素和矿物质。多肽可以固体或液体多肽配方(formulation)添加。例如，固体多肽配方通常在混合步骤之前或混合过程中添加；而液体多肽制备物则通常在造粒步骤后添加。所述多肽还可掺入饲料添加剂或预混合料中。

最终食物中多肽浓度在0.01-200毫克多肽蛋白质/公斤食物范围内，例如在5-30毫克多肽蛋白质/公斤动物食物范围内。

本发明的肌醇六磷酸酶应当然以有效量施用，即以足以改善饲料增溶化和/或营养价值的量施用。目前，预计所述多肽以一种或多种下列量(剂量范围)施用：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；10-100；0.05-50；或0.10-10——所有这些范围以毫克肌醇六磷酸酶多肽蛋白质/公斤饲料(ppm)计。

为了测定毫克肌醇六磷酸酶多肽蛋白质/公斤饲料，从饲料组合物中纯化肌醇六磷酸酶，使用相关测定法测定所纯化的肌醇六磷酸酶的比活。同样地，也使用相同的测定法测定饲料组合物的肌醇六磷酸酶活性，并在这两个测定的基础上，计算以毫克肌醇六磷酸酶蛋白质/公斤饲料计的剂量。

在饲料添加剂中使用相同的原理测定毫克肌醇六磷酸酶多肽蛋白质。当然，如果用于制备饲料添加剂或饲料的肌醇六磷酸酶样品可得到，则测定该样品的比活(无须从饲料组合物或添加剂中纯化所述的肌醇六磷酸酶)。

信号肽

本发明还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，所述基因可操作地连接到由SEQ ID NOs：1或3任一的核苷酸1-66组成的第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码由SEQ ID NOs：2或4任一的氨基酸1-22组成的信号肽，其中所述基因对于第一核苷酸序列是外源的。

本发明还涉及包含上述核酸构建体的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及用于生产蛋白质的方法，包括(a)在适合于生产所述蛋白质的条件下培养上述重组宿主细胞；和(b)回收所述蛋白质。

所述第一核苷酸序列可与其他控制序列可操作地单独连接到外源基因，或与其他控制序列结合可操作地连接到外源基因。上述其他控制序列如上所述。

对于宿主细胞，所述蛋白质可以是原生的或异源的。本文中，术语“蛋白质”并不意指特定长度的编码产物，因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包含两个或多个多肽结合形成的编码产物。所述蛋白质还包括杂合多肽，其包含获得自至少两个不同的蛋白质的部分或完整的多肽序列的组合，其中对于宿主细胞，一种或多种蛋白质可以是异源或原生的。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质天然存在的等位和工程化变体。

优选地，所述蛋白质是一种激素或其变体、多肽、受体或其部分、抗体或其部分、或报道子。在一个更优选的方面，所述蛋白质是一种氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在一个还优选的方面，所述蛋白质是一种氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶溶解多肽(pectinolytic polypeptide)、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解多肽、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

所述基因可获得自任何原核生物、真核生物或其他来源。

各种实施方案

以下是本发明的额外的实施方案。还包括在本文中的是如权利要求所述的涉及核酸序列、核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞、用于生产所述多肽的方法、转基因植物和动物以及不同的应用、使用方法和饲料组合物/添加剂的所有相应方面。

一种分离的多肽，具有肌醇六磷酸酶活性和在37℃和0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.0中温育4小时后，与在时间t＝0处的活性相比，至少20％的残余活性，所述对1％(w/v)肌醇六磷酸钠的活性在37℃和pH 5.5下，使用0.25M醋酸钠缓冲液pH 5.5，减去封闭的(blind)缓冲液测定的；

优选与i)SEQ ID NO：4的氨基酸1-411，或ii)SEQ ID NO：2的氨基酸1-411具有至少50％，优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少98％的同一性。

一种分离的多肽，具有肌醇六磷酸酶活性和在37℃和0.1M甘氨酸/HCl缓冲液pH 2.5中温育24小时后，与在时间t＝0处的活性相比，至少20％的残余活性，所述对1％(w/v)肌醇六磷酸钠的活性在37℃和pH 5.5下，使用0.25 M醋酸钠缓冲液pH 5.5，减去封闭的缓冲液测定的；

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中在pH 5.0和37℃下，测量的对底物pNP-磷酸的所述多肽的活性小于测量的对底物肌醇六磷酸的所述多肽的活性的11％；

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中与来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶相比，所述多肽具有更高的磷(P)释放；

优选在本文实施例6的体外模型中测定；

和/或，其中所述多肽优选与i)SEQ ID NO：4的氨基酸1-411，或ii)SEQID NO：2的氨基酸1-411具有至少50％，优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少98％的同一性。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中相对于也配制为0.25FYT/g饲料的来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶释放的磷，配制为0.25FYT/g饲料的所述多肽释放至少150％的磷(P)；

优选在本文实施例6的体外模型中测定；

一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，其中相对于也配制为0.75FYT/g饲料的来自Peniophora lycii的肌醇六磷酸酶释放的磷，配制为0.75FYT/g饲料的所述多肽释放至少150％的磷(P)；

优选在本文实施例6的体外模型中测定；

I.一种具有肌醇六磷酸酶活性的分离的多肽，选自：(a)与(i)SEQ IDNO：2的氨基酸1-411，和/或(ii)SEQ ID NO：2的成熟多肽部分具有至少98.2％同一性的氨基酸序列的多肽，(b)在至少中等严格条件下与(i)SEQ IDNO：1的核苷酸67-1299，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码部分，和/或(iii)(i)或(ii)任一的互补链杂交的多核苷酸编码的多肽；(c)包含一个或多个氨基酸保守取代、缺失和/或插入的(a)(i)-(a)(ii)多肽任一的变体；和(d)(a)(i)-(a)(ii)多肽任一的片段。

II.一种分离的多核苷酸，包含编码项I多肽的核苷酸序列。

III.一种编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的分离的多核苷酸，选自：(a)编码与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411具有至少98.2％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299具有至少95％同一性的多核苷酸；和(c)在至少中等严格条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸67-1299，(ii)SEQ ID NO：1的成熟多肽编码部分，(iii)(i)或(ii)任一的互补链杂交的多核苷酸。

IV.项II和III任一的分离的多核苷酸，在SEQ ID NO：1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变的核苷酸序列编码包含SEQ IDNO：2的氨基酸1-411的多肽。

V.一种核酸构建体，包含可操作地连接到一个或多个控制序列的项II-IV任一的多核苷酸，所述控制序列指导在表达宿主中生产所述多肽。

VI.一种包含项V核酸构建体的重组表达载体。

VII.一种包含项V核酸构建体的重组宿主细胞。

VIII.一种用于生产项1的多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养其野生型能生产所述多肽的细胞；和(b)回收所述多肽。

IX.一种用于生产项1的多肽的方法，包括(a)在有助于生产所述多肽的条件下培养包含含有编码所述多肽的核苷酸序列的核酸构建体的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

X.一种已用编码项1的多肽的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。

XI.一种能表达项1的多肽的转基因、非人动物或其产物或元件。

XII.至少一种项1的多肽在动物饲料中的应用。

XIII.至少一种项1的多肽在制备供动物饲料之用的组合物中的应用。

XIV.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，其中至少一种项1的多肽被添加到饲料中。

XV.一种动物饲料添加剂，包含(a)至少一种项1的多肽；和(b)至少一种脂溶性维生素，(c)至少一种水溶性维生素，和/或(d)至少一种微量元素。

XVI.项XV的动物饲料添加剂，还包含至少一种淀粉酶、至少一种额外的肌醇六磷酸酶、至少一种木聚糖酶、至少一种半乳聚糖酶、至少一种α-半乳糖苷酶、至少一种蛋白酶、至少一种磷脂酶，和/或至少一种β-葡聚糖酶。

XVII.项XVI的动物饲料添加剂，其中与具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-411的氨基酸序列的多肽的最适pH相比，所述额外的肌醇六磷酸酶具有更高的最适pH。

IIXX.一种具有50-800g/kg粗蛋白含量并包含至少一种项I的多肽的动物饲料组合物。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，选自：

(a)包含与

(i)SEQ ID NO：4的氨基酸1-411，和/或

(ii)SEQ ID NO：4的成熟多肽部分；

具有至少99.1％同一性的氨基酸序列的多肽

(b)包含一个或多个氨基酸缺失、插入和/或保守取代的(a)(i)-(a)(ii)多肽任一的变体；和

(c)(a)(i)-(a)(ii)多肽任一的片段。

一种编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的多核苷酸，选自：

(a)编码与SEQ ID NO：4的氨基酸1-411具有至少99.1％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和

(b)与SEQ ID NO：3的核苷酸67-1299具有至少98.9％同一性的多核苷酸。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1-411至少98.6％同一性的氨基酸序列。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有与SEQ ID NO：4的氨基酸1-411至少99.1％同一性的氨基酸序列。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有序列

(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-411，和/或

(ii)SEQ ID NO：2的成熟多肽部分；或该多肽

(a)是一种包含一个或多个氨基酸缺失、插入和/或保守取代的(i)-(ii)多肽任一的变体；或

(c)是一种(i)-(ii)多肽任一的片段。

一种具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，其包含，优选具有序列

(i)SEQ ID NO：4的氨基酸1-411，和/或

(ii)SEQ ID NO：4的成熟多肽部分；或该多肽

(c)是一种(i)-(ii)多肽任一的片段。

通过以下实施例更进一步地描述本发明，但不应视为对本发明范围的限制。

实施例

实施例1：克隆布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶

进行下列酸性组氨酸磷酸酶的多重比对：appA大肠杆菌(SPTREMBL：Q8GN88)、phyk Klebsiella terrigena(SPTREMBL：Q7WSY1)和ypo1648鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)CO92(SPTREMBL：Q8ZFP6)。基于共有序列设计两种简并寡核苷酸引物：

5′-TGG TGA TTG TGT CCC GTC AYG GNG TNM G-3′(SEQ ID NO：6，正向引物)

5′-GCC CGG CGG GGT RTT RTC NGG-3′(SEQ ID NO：7，反向引物)。

所述引物用于多种细菌菌种在45、48和50℃的退火温度下的PCR筛选。

在布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113中鉴定以900 bp DNA片段形式存在的部分肌醇六磷酸酶基因。

将PCR片段克隆入pEZSeq平端(blunt)克隆试剂盒中(商品目录号40501-1，来自Lucigen Corporation，2120 West Greenview Dr.，Ste 9，Middleton，WI 53562，US)。首先，用PCR终止子末端修复试剂盒(pEZSeq平端克隆试剂盒的一部分)处理PCR片段，该试剂盒含有已优化用于在任一类型的PCR产物上产生平头的、5′-磷酸化末端的酶活性混合物。在克隆入pEZSeq载体后，使用两种特异性载体引物对克隆测序。通过翻译核苷酸序列，证实了所克隆的DNA片段是肌醇六磷酸酶基因的一部分。

为了获得所述基因的全长核苷酸序列，使用DNA步行(Walking)加速试剂盒(DWSK-V102，来自Seegene，Inc.，2nd Fl.，Myungji Bldg.，142-21，Samsung-dong，Kangnam-gu，Seoul，135-090，Korea)，其用于捕捉未知的靶位点。为了该目的，设计并以试剂盒的方式使用4种特异性寡核苷酸。

TSP1N：5′-ACATTTTGGTGCTAACCCAGCC-3′(SEQ ID NO：8)

TSP1C：5′-AGAAGTTGCCCGTAGTAGGGCC-3′(SEQ ID NO：9)

TSP2N：5′-ATTCAGAAACAAGTTCTCCCCCACG-3′(SEQ ID NO：10)

TSP2C：5′-ACCAATCTTGCAAATTTAAGCGGGG-3′(SEQ ID NO：11)

正确的编码来自布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113的肌醇六磷酸酶的全长核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示，相应的编码的氨基酸序列为SEQ IDNO：4。SEQ ID NO：4的头22个氨基酸预计是信号肽(通过Signal P V3.0预测)。

将布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113肌醇六磷酸酶基因克隆入不带有融合标记的pET-30a(+)大肠杆菌表达载体中(商品目录号69909，来自Novagen，购自Bie & Berntsen A/S，7 Sandbaekvej，DK-2610 Roedovre，Denmark)。在该系统中，通过在大肠杆菌BL21star(DE)pLysS宿主菌株(商品目录号69388，来自Novagen，购自Bie & Berntsen)中提供T7 RNA聚合酶源诱导基因表达，该宿主菌株含有受lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因的染色体拷贝。通过添加乳糖到培养基中进行靶基因的诱导。乳糖应与阻遏物结合并诱导其从操纵子上解离，使得启动子能启动转录。

为了表达肌醇六磷酸酶基因，将转化的大肠杆菌菌株的单个菌落转移到不容许T7 RNA聚合酶表达的非诱导培养基(含有葡萄糖作为唯一碳源)种子培养物中。作为阴性对照，使用含有空的pET-30(+)载体的大肠杆菌(BL21star(DE)pLysS)。将小等分试样(大约150微升)的种子培养物转移到含有乳糖作为唯一碳源的烧瓶中。诱导的培养物在37℃以300rpm摇瓶生长过夜。

通过离心收获细胞，并通过SDS-PAGE对15微升的上清液等分试样进行分析。作为分子量(MW)标记物，使用10微升的Precision Plus蛋白质标准(商品目录号161-0363，购自Bio-Rad Laboratories Headquarters，1000 AlfredNobel Drive，Hercules，CA 94547，US)。在来自重组大肠杆菌菌株的上清液中鉴定了清楚的MW约为50kDa的条带，但在阴性对照中没有该条带。

溶解所收获的细胞沉淀，并也通过前述SDS-PAGE分析可溶的细胞内级分。在此也出现了MW 50kDa的条带。

这证明重组肌醇六磷酸酶蛋白质部分分泌到培养基中。然而，大多数的酶仍然留在细胞内级分中。

通过使用实施例4的测定法证实上清液和细胞内级分的肌醇六磷酸酶活性。

实施例2：制备布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶制备物

布氏柠檬酸杆菌ATCC51113在添加有0.1％(w/w)肌醇六磷酸钠的LB培养基(25g的LB肉汤(Bouillon)，Merck 0285，离子交换水加到1000ml)中，于30℃摇瓶(225rpm)生长过夜。通过离心(4000rpm，60min)收获细胞，并弃去上清液。在具有100mg/ml溶菌酶的两倍体积的蒸馏水中重悬浮细胞沉淀，并在37℃下裂解过夜。离心(4000rpm，2h)所裂解的细胞，并保留上清液用于酸稳定性分析。

实施例3：布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的酸稳定性

将50微升获得自实施例2的裂解液与50微升分别具有pH值2.2、3.0(甘氨酸/盐酸)和7.0(HEPES)的100mM缓冲液混合。将样品在37℃温育过夜，并使用实施例4中所描述的分析方法分析残余的肌醇六磷酸酶活性。表示为光密度的残余肌醇六磷酸酶活性如下表1所示。此外，活性以相对于在pH7的残余活性的百分数计算。

表1

实施例4：肌醇六磷酸酶测定

该测定法是基于通过与钼酸盐/铁的络合作用测定可溶性磷酸盐，以及通过光度计测量微量滴定板中的蓝色。

底物是溶解于0.1M醋酸盐缓冲液pH＝5.5中的0.5mM肌醇六磷酸钠(Sigma，P-8810)。在一个特定的实施方案中，底物浓度是5mM。

显色试剂制备如下：将1％钼酸铵(Merck 1181，(NH₄)₆Mo₇O₂₄，4H₂O)溶解于3.2％硫酸(Merck 731)中。将1.1g硫酸亚铁(Merck 3965)溶解于15ml上述钼酸盐试剂中，并添加10ml 0.5M的硫酸。每天新鲜配制，并贮藏在暗处。

封闭：混合20ul样品、100ul底物和120ul显色试剂，在37℃温育5分钟并在750nm处测量OD_封闭。

样品：混合20ul样品、100ul底物，在37℃温育30分钟，添加120ul显色试剂，在37℃温育5分钟，并在750nm处测量OD_样品。

OD＝OD_样品-OD_封闭。

实施例5：制备重组肌醇六磷酸酶

在枯草芽孢杆菌中表达SEQ ID NO：4的肌醇六磷酸酶并使用常规方法纯化：离心、微生物过滤、硫酸铵沉淀(80％硫酸铵饱和)、离心、在缓冲液A(50mM醋酸钠，1.5M硫酸铵pH 4.5)中重悬沉淀、过滤、疏水相互作用层析(Phenyl Toyopearl，加载缓冲液A，用缓冲液B(50mM醋酸钠pH 4.5)洗脱)，以及阳离子交换层析(SP-sepharose，加载10mM柠檬酸钠pH 4.0，用线性盐梯度(10mM柠檬酸钠pH 4.0+1M NaCl)洗脱。

考马斯染色的SDS-PAGE凝胶显示，基于蛋白质纯化的成熟肌醇六磷酸酶应大于50％纯度。然而，发现大多数的非肌醇六磷酸酶条带是布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的降解产物或截短形式。因此，当相对于总的蛋白量作为肌醇六磷酸酶和肌醇六磷酸酶降解产物量表达时，纯度远高于80％。

实施例6：在动物饲料中的性能

在体外模型中，与WO 98/28408中描述的来自Peniophora lycii的、可以RONOZYME P肌醇六磷酸酶购自DSM Nutritional Products的商用肌醇六磷酸酶，比较了实施例5的纯化的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶在动物饲料中的性能。该体外模型模拟在单胃动物中的消化并与体内动物试验所获得的结果充分相关。

制备具有添加CaCl₂到5克钙/公斤饲料浓度的、由30％大豆粉和70％玉米粉组成的饲料样品，并在40℃和pH 3.0下预温育30分钟，随后添加胃蛋白酶(3000 U/g饲料)和两种不同剂量的两种肌醇六磷酸酶，即0.25或0.75肌醇六磷酸酶单位(FYT)/g饲料。也包括没有肌醇六磷酸酶活性的空白。将样品先在40℃和pH 3.0下温育60分钟，再在pH 4.0下温育30分钟。

停止反应并通过添加HCl至0.5M的终浓度并在40℃下温育2小时，以抽提植酸和肌醇磷酸，然后进行一次冻融循环并在40℃下温育1小时。

如“Chen，Q.C.和Li，B.W.(2003).Separation of phytic acid and other relatedinositol phosphates by high-performance ion chromatography and itsapplications.Journal of Chromatography A 1018，41-52”所述，通过高效离子层析分离植酸和肌醇磷酸，并根据“Skoglund，E.，Carlsson，N.G.，和Sandberg，A.S.(1997).Determination of isomers of inositol mono-to hexaphosphates inselected foods and intestinal contents using high-performance ion chromato-graphy.J.Agric.Food Chem.45，431-436”所述进行定量。

释放的磷以用肌醇六磷酸酶处理和不用其处理的样品之间肌醇磷酸结合的磷(IP-P)的差值来计算。

根据下表2所示的结果，很清楚与商用肌醇六磷酸酶相比，在从饲料中释放磷酸上，本发明的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶更有效。

表2

处理	剂量(FYT/g)	相对的P释放(％)
			Peniophora lycii肌醇六磷酸酶	0.25	100
Peniophora lycii肌醇六磷酸酶	0.75	190
			布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶	0.25	184
布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶	0.75	367

实施例7：底物特异性

在pH 5.0和37℃下，测试实施例5的纯化的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶对两种底物，即肌醇六磷酸和对硝基苯磷酸(pNP-磷酸)的活性。更特别的是，通过来自每种底物对磷酸标准曲线(减去缓冲液封闭的)的比较测定读数，测定相对于对肌醇六磷酸的活性的对pNP-磷酸的活性。

原料

酶稀释缓冲液：0.25M肌醇六磷酸钠缓冲液pH 5.0，含0.005％Tween-20

肌醇六磷酸酶底物：在0.25M醋酸钠缓冲液pH 5.0中，10mg/ml的来自稻的肌醇六磷酸钠(Aldrich 274321)

pNP-磷酸酯(phosphate)底物：将两片5mg对硝基苯磷酸(Sigma N9389)溶解于10ml 0.1M醋酸钠缓冲液pH5中

钼酸盐溶液(溶于氨溶液的10％七钼酸铵)：

将10g七钼酸铵(Merck 1.001182)溶解于90ml去离子H₂O中

1ml 25％氨溶液(Merck 1.05432)

用去离子H₂O将体积调节到100ml

单钒酸铵试剂(0.24％(w/v)溶于3.25％HNO₃的NH₄VO₃溶液，Bie &Berntsen，Denmark，LAB17650)。

停止试剂(溶于HNO₃的钼酸盐/钒酸盐试剂)：10ml钼酸盐溶液+10ml单钒酸铵试剂+20ml 21.7％硝酸

方法

在微量滴定板(Nunc 269620)上分配75μl/孔的酶溶液(或封闭的缓冲液)。添加75μl底物(肌醇六磷酸钠或pNP-磷酸)并用一张带粘性的密封片密封该滴定板。迅速地将该滴定板置于装备有微量滴定板固定器Eppendorff热混合器中T，并在37℃下以750rpm摇动15分。添加75μl停止试剂。在微量滴定板分光光度计(Molecular Devices Spectramax 384 Plus)中测量在405nm处的吸光率。如本领域技术人员众所周知的，为了在405nm处获得适合的吸光率读数，测试不同稀释的酶。

结果

发现pNP-磷酸的磷酸水解是肌醇六磷酸的4％。KR-2004-A-045267(WO-2004/085638)的表6报道了相对于肌醇六磷酸(phytate)的活性，YH-15肌醇六磷酸酶对pNP-磷酸的活性为11.27％，这表明本发明的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶在该方面是不同的。

实施例8：酸稳定性

在37℃和pH 2.0、2.5或3.0(0.1M甘氨酸/HCl缓冲液)温育后，实施例5的纯化的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶的酸稳定性以残余的磷酸水解活性来测定。在pH 5.5，37℃下测定对肌醇六磷酸钠的残余活性，减去缓冲液封闭的，并将结果与在时间t＝0处的活性进行比较。

原料

酶稀释缓冲液：0.25M乙酸钠pH 5.5缓冲液，包含0.005％Tween-20

肌醇六磷酸酶底物：1％(w/v)肌醇六磷酸钠(Aldrich 274321)，溶解于0.25 M乙酸钠pH 5.5中

停止试剂：

10ml 10％(w/v)(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O溶液

10ml 0.24％(w/v)NH₄VO₃溶液

20ml 21.7％HNO₃溶液

10％(w/v)(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O溶液：

10g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O(Merck 1.001182)，溶解于90ml去离子水中

1ml 25％(w/v)NH₃溶液(Merck 1.05432)

使用去离子水调节体积至100ml

溶于3.25％HNO₃中的0.24％(w/v)NH₄VO₃溶液(Bie & Berntsen，Denmark，LAB17650)。

使用0.1M甘氨酸/HCl缓冲液稀释储存于20mM NaAc pH 4.0中的纯化的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶储液(充分的稀释以确保获得预期的pH值)，并在37℃、750rpm下于Eppendorf热混合器上温育(1.5ml EppendorfProtein LoBind管，PCR清洁的，产品目录号2243108-1)。使用下述程序测定残余活性。

每毫升肌醇六磷酸酶储液的肌醇六磷酸酶活性应容许1)使用0.1M甘氨酸/HCl缓冲液溶液稀释，以便获得期望的pH，之后2)使用酶稀释缓冲液(见上)稀释，以便获得测定条件的pH，因此得到在405nm处的适合的吸光度读数。

测定方法

在t＝x小时后，从每种pH温育混合物中取出样品并用酶稀释缓冲液稀释(充分的稀释以确保获得5.5的pH)。并将75μl酶溶液(或缓冲液封闭的，由酶稀释缓冲液组成)添加到微量滴定板(Nunc 269620)的孔中。添加75μl底物溶液，用带粘性的密封片密封滴定板，然后快速转移到装备有微量滴定板固定器的Eppendorf热混合器中。在37℃下温育，摇动(750rpm)滴定板15分钟。添加75μl停止试剂，并在微量滴定板分光光度计(MolecularDevices Spectramax 190)中读出在405nm处的吸光率。

结果

在pH 2.0、37℃温育4小时后，观察到明显的残余活性。同样地，在pH 2.5、37℃温育1天后也观察到明显的残余活性。

KR-2004-A-045267的实施例4-2(参见WO-2004/085638第27页底部)解释了在pH 3.0下温育4小时后，YH-15肌醇六磷酸酶的酶活性几乎都丧失了，该KR申请并没有记载所使用的缓冲液，但根据Kim等相关的出版物(Biotechnology Letters 25：1231-1234，2003)，所使用的甘氨酸/HCl缓冲液出现在图2，因此该缓冲液也用于本实施例中。

总之，与YH-15肌醇六磷酸酶相比，本发明的布氏柠檬酸杆菌肌醇六磷酸酶更具酸稳定性。

本发明在此描述和要求包括的在范围上不会受限于本文所披露的特定方面，因此这些方面意在举例说明本发明的几个方面。任何等同的方面都被规定在本发明的范围内。事实上，对于本领域技术人员，除了本文所示和所述的那些之外，根据前述说明书其他的对本发明的各种修饰都是显而易见的。这样的修饰也被规定落在附加权利要求的范围内。如有冲突，以包括定义在内的本文为准。

在此引用的多篇参考文献，其全文在此并入作为参考。