CN101068574B

CN101068574B - 与自身抗原有关的自身免疫和疾病的特异性抑制

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Publication number: CN101068574B
Application number: CN2005800317082A
Authority: CN
Inventors: 齐岩; 尤维·D·斯泰尔兹
Original assignee: Isogenis Inc
Current assignee: Isogenis Inc
Priority date: 2004-07-20
Filing date: 2005-07-20
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2025-07-20
Also published as: EP1778296A2; EP1778296B1; CN101068574A; CA2574802A1; EP1778296A4; WO2006012416A3; WO2006012416A2; IL180817A0; US20090053249A1; JP2008507282A

Abstract

本发明提供了特异性抑制针对自身抗原的宿主免疫应答的组合物和方法。具体地，描述了联合CD8多肽的表达与自身抗原的表达或呈递的组合物和方法，以特异性抑制针对自身抗原的宿主免疫应答的体液成分和细胞成分。

Description

与自身抗原有关的自身免疫和疾病的特异性抑制

相关文献概述

已知当已经通过其T细胞受体复合物接受信号的CTL也通过其MHC I类分子的α3结构域接受信号时，MHC I类限制性T细胞(例如CD8⁺CTL)的活性可以被抑制。这种所谓的反抑(veto)信号可以被刺激物或“反抑”细胞表达的CD8分子传递。Sambhara and Miller，Science 252：1424-1427(1991)。引起的免疫抑制既是抗原特异的也是MHC限制的，并且是由于反应性CTL单向识别反抑细胞，而不是由于反抑细胞识别反应性CTL。Rammensee et al.，Eur.J.Immunol.12：930-934(1982)；Fink etal.，J.Exp.Med.157：141-154(1983)；Rammenseeet al.，J.Immunol.132：668-672(1984)。由于反抑活性与CD8α-链的存在相联系，因此如果CD8的表达缺失则反抑功能丧失，当CD8α-链表达时则反抑功能建立。Hambor et al.，J.Immunol.145：1646-1652(1990)；Hambor etal.，Intem.Immunol.2：8856-8879(1990)；Kaplan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8512-8515(1989)。

已经提出了多种策略来开发这种抗原特异的抑制途径以除去不希望的细胞毒性T细胞应答。一种这样的策略包括使用多肽偶联物将CD8或其功能结构域共价连接于指导CD8对特异靶细胞的反抑活性的第二配体。参见例如美国专利5,242,687，5,601,828和5,623,056。或者，已经研究了杂合抗体分子，其具有对连接于CD8α链细胞外结构域的MHC I类分子特异的单克隆抗体结合位点。Qi et al.，J.Exp.Med.183：1973-1980(1996)。但是这种分子有几个缺陷，而且还没有发现真正的临床效用。明显地，为了治疗自身免疫病，由于确信需要CD4杂合体来影响反应性CD4⁺辅助性T细胞群，提出了使用CD4和CD8杂合抗体的杂合抗体方法。Staerz et al.，ImmunolToday 21(4)：172-6(2000)。

最近，国际公开的PCT申请WO 02/102852描述了使用可溶性CD8α-链变体来抑制CTL，其中所述变体具有设计来提高对MHC I类分子亲和性的氨基酸修饰。明显地，与前述的现有技术一致，该申请指出所建议的CD8α组合物是对MHC I类分子特异的，并且有望仅抑制CD8⁺CTL的应答。见第27页。该申请还提出，在包括细胞和体液免疫应答的其他因素例如，MHCII类限制性T细胞如CD4⁺T细胞的情况下，与其他免疫抑制剂的联合是需要的。见第28页。

发明概述

本发明是基于如下惊人发现：CD8α的靶向表达协同诱导的自身抗原的表达或呈递可有效地并特异性地抑制针对自身抗原的自身免疫应答。因此，使用本文所述的组合物和方法，可以选择性抑制针对自身抗原的全面的宿主免疫应答，而不需要长期施用普通的免疫抑制剂，来有效导致对自身抗原的特定免疫耐受。可使用本文所述的组合物和方法来抑制特定的自体反应的T细胞群，作为预防措施或用于正在进行的自身免疫应答的治疗。

根据本发明，提供了预防自身免疫病的发病或治疗自身免疫病的方法和组合物，其包括使靶细胞先体外后体内(ex vivo)或体内接触自身抗原和编码CD8多肽的表达载体，所述CD8多肽优选人的CD8多肽，更优选CD8α-链，其中表达CD8多肽和由所接触的靶细胞呈递自身抗原的联合会特异性抑制针对自身抗原的自体反应性免疫应答。所述靶细胞可以是，例如肌细胞，造血细胞，干细胞或经受自身免疫应答或处于自身免疫应答风险(subjected to or at risk of)的细胞。在优选的实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，如树突细胞，并且接触是先体外后体内的。当施用于或存在于宿主中的时候，所接触的靶细胞和其他表达相同自身抗原的宿主细胞都受到保护，并且它们的存活因为对自身抗原有反应性的CD4+和CD8+T细胞都被除去而延长。优选地，受试的组合物和方法能够抑制对这些自身抗原的体液和细胞免疫应答。

一方面，提供了特异性抑制针对自身抗原的免疫应答的方法，其包括使靶细胞先体外后体内或体内接触编码CD8多肽的表达载体和自身抗原，所述CD8多肽优选人的CD8多肽，更优选人的CD8α-链，其中所述CD8多肽和自身抗原由靶细胞表达，并且其中针对自身抗原的自身免疫应答受到特异性抑制。在一个实施方案中，CD8多肽和自身抗原由相同的表达载体编码。在可供选择的实施方案中，CD8多肽和自身抗原由分开的表达载体编码。自身抗原可以是全长序列的蛋白质或其片段，或可包含一或多个功能相关的表位。在另一个实施方案中，自身免疫应答包括体液成分和细胞成分。在优选的实施方案中，自身免疫应答可被有效抑制而不需要普通的免疫抑制剂。

在另一方面，提供了特异性抑制针对自身抗原的免疫应答的方法，其包括使靶细胞先体外后体内或体内接触自身抗原蛋白质或肽和编码CD8多肽的表达载体，所述CD8多肽优选人的CD8多肽，更优选人的CD8α-链，其中所述CD8多肽由靶细胞联合自身抗原的呈递来表达，并且其中针对自身抗原的自身免疫应答被特异性抑制。自身抗原可以是全长序列的蛋白质或其片段，或可包含一或多个功能相关的表位。在优选的实施方案中，靶细胞是造血细胞，具体为淋巴细胞或抗原呈递细胞。在特别优选的实施方案中，接触先体外后体内进行。

在另一方面，提供了抑制针对靶细胞的自身免疫应答的组合物，其包含编码CD8多肽的表达载体和与靶细胞相关的自身抗原，所述CD8多肽优选人的CD8多肽，更优选人的CD8α-链。在一个实施方案中，CD8多肽和自身抗原由相同的表达载体编码。在另一个实施方案中，CD8多肽和自身抗原由分开的表达载体编码。在可供选择的实施方案中，所述组合物包含与编码CD8多肽的表达载体联合的自身抗原蛋白质或多肽。

也提供了延长表达自身抗原的细胞的存活的方法，其包括使所述细胞接触编码CD8多肽的表达载体和自身抗原，其中所述CD8多肽和自身抗原由细胞表达，并且所述细胞的存活时间延长。

用于受试方法和组合物的优选CD8多肽通常包含CD8α-链，更优选CD8α-链的细胞外结构域，更优选CD8α-链的Ig-样结构域。在可供选择的优选实施方案中，CD8多肽可包含或基本上由CD8α-链的细胞外结构域和跨膜结构域组成，或更优选CD8α-链的Ig-样结构域和跨膜结构域。在特别优选的实施方案中，跨膜结构域是CD8α-链的跨膜结构域。鉴于受试的表达方法的性质，以及上述CD8α-链的现有可溶形式的明显不适宜，CD8α-链的跨膜结构域或适当可供选择的跨膜结构域的存在被认为是必需的。

在一个优选的实施方案中，CD8α-链与自身抗原共表达。在另一个优选的实施方案中，包含CD8多肽的表达载体与自身抗原蛋白质或肽被共同施用。优选的自身抗原是与自身免疫病有关的抗原，如I型糖尿病中的胰岛素原(β-链)和谷氨酸脱羧酶(GAD)，多发性硬化中的髓鞘碱性蛋白，类风湿性关节炎中的MMP-1，重症肌无力中的胆碱能受体α-链，自身免疫性甲状腺炎中的甲状腺球蛋白等。

本文所述组合物和方法的优选的靶细胞包括，如肌细胞，造血来源的细胞，如抗原呈递细胞(如树突细胞)，巨噬细胞，粒细胞，红细胞，白细胞，B淋巴细胞，T淋巴细胞等，和皮肤的朗格汉斯细胞(Langerhans cell)，干细胞如造血干细胞和组织特异性干细胞，即针对神经元，肝等的定向(dedicated)干细胞；和处于自身免疫攻击风险或经受自身免疫攻击的细胞，如胰岛细胞，脑的神经胶质细胞，及其他本文所述的细胞和组织。

考虑用于受试方法和组合物的合适表达载体包括重组和非重组的载体，和病毒载体(例如腺病毒载体，逆转录病毒载体，腺伴随病毒载体等等)以及非病毒载体(例如细菌质粒，噬菌体，脂质体等等)。在优选的实施方案中，可用脂质体介导的核酸转移载体，或病毒介导的核酸转移载体，或裸DNA实现对靶细胞的修饰。

在另一个实施方案中，先体外后体内诱导靶细胞来表达本发明免疫调控分子的功能部分和自身抗原或其生物活性片段，并使所诱导的细胞输入患者。所述自身抗原可以表达载体的形式传递到靶细胞或可选择地作为蛋白质或多肽来经I类或II类MHC途径加工呈递到靶细胞的表面。

虽然公开了多个实施方案，但是从下面的详细描述中(其显示和描述发明例证性的实施方案)，本发明的其他实施方案对本领域的技术人员是明显的。如所认识到的，发明能在各种明显的方面修改，均不背离本发明精神和范围。因此，附图和详述被视为用于举例而不是限制。

附图简述

图1A-B描述了野生型CD8α-链的氨基酸和核酸序列，包括人和小鼠各自的蛋白质的不同结构域的划分。

图2A-B描述了用C57BL/6脾细胞刺激的Balb/c脾细胞。给培养物补充正常成纤维细胞、培养基或带有小鼠(A)或人(B)来源的CD8的成纤维细胞。收获培养物并检验它们对C57BL/6-衍生的靶细胞的裂解能力。

图3描述了Balb/c(H-2d)小鼠，该小鼠注射了对照成纤维细胞(■和▲)或mCD8-转染的C57BL/6-(H-2^b)衍生的(○和●)成纤维细胞。2周后处死动物，收获脾细胞，用C57BL/6-(H-2^b)(■和○)或CBA/J(H-2^k)(●和▲)脾细胞刺激，并检验它们对EL4(H-2^b)(■和○)或S.AKR(H-2^k)(●和▲)靶细胞的裂解能力。

图4A-B描述了靶细胞(▲)或表达CD8的靶(■)，所述细胞通过同种异体反应的T细胞(A)或通过抗原特异性的CTL(B)来检验它们对裂解的易感性。

图5A-B描述了在正常的成纤维细胞(●)和转导了mAdCD8(A，▲)或HAdCD8(B，▲)的成纤维细胞存在的情况下建立的MLC(Balb/c抗-C57BL/6)。对照培养物(■)中没有加入成纤维细胞。这些培养物对C57BL/6-衍生的靶的裂解活性在培养结束时被测定。

图6描述了用腺病毒反抑转移载体mAdCD8免疫。用上面指示的载体感染C57BL/6小鼠。10天后，收集脾细胞并在Adbgal病毒存在时培养。给出了胚细胞(blast cell)的数量。

图7A-B描述了用mAdCD8的负免疫(A)用Adβgal或mAdCD8静脉内(i.v.)免疫C57BL/6小鼠一次。(B)5天后用Adβgal再次免疫像(A)那样处理的动物。在最后一次注射7天后处死动物，在Adβgal存在下培养它们的脾细胞。培养5天后，检验Adβgal-感染的同系(syngeneic)靶细胞的裂解能力。

图8描述了与1×10⁶刺激细胞(stimulator cell)温育的、或无刺激细胞的3×10⁶C57B1/6脾细胞，按所示转导。4天后，通过免疫荧光分析培养物中CD4⁺T淋巴母细胞的存在。

图9A-D描述了用不同病毒构建体感染后，小鼠和人CD 8α-链的表面表达。A.感染的细胞：MC57T成纤维细胞；第1栏：模拟感染(mock-infection)；第2栏：用hAdCD8感染；B.感染的细胞：MC57T成纤维细胞；第1栏：模拟感染；第2栏：用mAdCD8感染。C.感染的细胞：Balbc未经选择的骨髓细胞；第1栏：用lacZ腺病毒载体(AdlacZ)感染；第2栏：用mAdCD8感染。D.感染的细胞：MC57T成纤维细胞；第1栏：模拟感染；第2栏：用pAAV-mCD8感染；第3栏：用pAAV-hCD8感染。

图10A-E描述了在这些成纤维细胞存在下建立MLC(Balb/c抗-C57BL/6)，这些成纤维细胞加入到MLC之前已于转导后培养了0或5小时。培养结束时，在荧光活化的细胞分析仪上测定淋巴母细胞的数量。

图11描述了用反抑转移载体体外抑制。在未感染或感染了mAdCD8的MC57成纤维细胞(H-2^b)存在或不存在的情况下建立了BALB/c抗-C57BL/6混合淋巴细胞培养物(MLC)(X)。在EL4(H-2^b)靶细胞中测量CTL应答。

图12描述了用AdLacZ(▲)或mAdCD8(■)免疫的Balb/c小鼠。在AdLacZ存在时培养它们的脾细胞，并检验对感染了AdLacZ的同系P815靶细胞的特定裂解活性。

图13A-B描述了(A)用AdLacZ(■)或mAdCD8(▲)免疫的C57BL/6动物。检验它们的脾细胞对同系的AdLacZ EL4靶细胞的裂解活性。(B)在检验它们对感染了AdLacZ的EL4靶的裂解活性之前，用AdLacZ再次免疫这些动物。

图14描述了糖尿病小鼠在注射了pBudCE4.1/CD8α-链/胰岛素2反抑载体(■)的小鼠中的百分比，相对未被处理的对照组(◆)下降。

发明详述

有效并持续地治疗自身免疫病一直是困难的(elusive)。本发明的成功是基于如下的惊人发现：免疫调节分子与自身抗原的共表达会有效并特异性地抑制自身抗原反应性T细胞，所述免疫调节分子如CD8，具体为CD8α-链，因此也可抑制自体反应性免疫应答。

与此一致，本发明提供组合物和方法来抑制针对表达自身抗原的宿主细胞的免疫应答，包括在靶宿主细胞中联合自身抗原的至少一个表位共表达免疫调节分子的全部或其功能部分，所述免疫调节分子优选CD8多肽，更优选CD8α-链。在优选的实施方案中，调节(conditioning)步骤包括使宿主细胞接触如上所述的编码CD8多肽的表达载体和自身抗原的至少一个表位。本发明还涉及可选择的调节方法，用于调控靶细胞中CD8的表达水平来有效地并特异性地抑制针对靶细胞的免疫应答，如提供使CD8表达增加的转录激活物。见例如Mortlock et al.，Nuc.Acids.Res.31：152(2003)；Mizuguchi et al.，Hum.Gene Ther.14：1265-77(2003)。受试方法和组合物达到的免疫抑制的特异性和选择性相对传统免疫抑制策略具有明显改善，传统免疫抑制一般产生全面的和非特异的免疫系统抑制，因此使宿主对偶然感染和一些情况下对诱变和癌症高度易感。

可以将这里描述的方法单独或联合其他方法使用，例如施用本领域已知的其他活性试剂，例如治疗性的或预防性的试剂和/或普通免疫抑制剂(例如环孢霉素，FK506)，T细胞缺失型(depletion)抗体(例如OKT3，多克隆抗-胸腺细胞制备物)等。优选地，鉴于使用受试组合物和方法获得的对自身抗原特异的免疫抑制，这些试剂的使用不是必需的。

“抑制”指针对自身抗原的细胞(例如白细胞募集)或体液的、先天性或获得性的免疫应答的直接或间接、部分或全部的抑制和/或减弱。抑制可包括通过将变化发信号给免疫细胞使该细胞不再靶向自身抗原，从而预防免疫应答。可选择地，抑制可包括提供使免疫细胞无反应性(anergy)和/或死亡如凋亡的信号。

“免疫应答”优选指获得性免疫应答，例如细胞或体液免疫应答。

“特异性免疫抑制”或“抗原特异的免疫抑制”指与非抗原特异的全面免疫抑制相对的，针对抗原例如自身抗原的免疫应答的抑制。因此，例如，针对之前为患者识别的自身抗原的细胞和/或体液自身免疫应答的缺乏，联合对其他抗原的体内免疫能力的证据，可表明对自身抗原的特异性免疫抑制。

“表达载体”指用于向靶细胞传送核酸的任何载体。一般可以将表达载体分成病毒载体和非病毒载体。病毒载体指但不限于腺病毒载体，腺伴随病毒载体，逆转录病毒载体，慢载体等等。非病毒载体指质粒载体，裸DNA，偶联于不同载体的裸DNA，或与脂质体或其他脂类制备物相关的DNA。一般地，表达载体是重组的，但在某些实施方案中，例如当使用脂质体或细胞消融例如基因枪(biolostic)技术时表达载体不是重组的。本文所用的优选重组载体是质粒载体和病毒载体，其选自下组载体：腺病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。在使用重组病毒载体，具体为腺病毒载体的一些实施方案中，衣壳例如腺病毒衣壳的六邻体(hexon)蛋白的免疫原性可以按照本领域已知的方法来减弱，尽管鉴于这里详细描述的改进这种修饰不再是必需的。

“接触”指以实现载体和细胞间的物理接触的方式和量将表达载体施用于细胞。如果载体是重组的病毒颗粒，它会有利地通过这种物理接触实现病毒载体对细胞的附着并感染。如果病毒载体是重组病毒颗粒以外的载体，例如无衣壳的病毒核酸或其他核酸，希望使所述核酸进入细胞。

这种“接触”可以通过本领域技术人员已知的和本文描述的任何方式进行，通过这些方法可以产生载体与靶细胞的明显接触或相互接触。可选地，可以将载体，例如腺病毒载体，与双特异的或多特异的分子(例如抗体或其片段)形成复合物，此时“接触”包括载体和双特异或多特异分子的复合物与靶细胞的明显的接触或相互接触。例如，可以将载体和双特异(多特异的)分子共价连接，例如通过本领域技术人员已知的化学方法，或其他方法。优选地，可以将载体和双特异的(多特异的)分子通过非共价作用(例如离子键，氢键，范德华力，和/或非极性作用)的方式连接。尽管可以将载体和双特异的(多特异的)分子通过在小体积的同种溶液中混合而接触，但是靶细胞和复合物不需要在小体积中进行接触，例如，在向宿主(例如人类)施用复合物的情况下，复合物通过血流达到靶细胞，所述靶细胞是其选择性结合并进入的。优选地在将靶细胞与载体和双特异的(多特异的)分子复合物接触之前将载体与双特异的(多特异的)分子进行接触。

自身抗原

“自身抗原”指作为自身免疫系统的靶的“自身的”抗原。自身抗原包括由宿主或患者免疫系统作为异体识别并反应的任何自身的抗原，例如，与自身免疫病相关的自身的抗原，例如，髓鞘碱性蛋白(MBP)，蛋白脂质蛋白PLP-1，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，胰岛素原/胰岛素，谷氨酸脱羧酶(GAD)，基质金属蛋白酶(MMP-1)，II型胶原蛋白，甲状腺球蛋白等。另外，自身抗原可存在于宿主中，其水平不同于在健康良好的或不患病的患者中存在的水平(如上升或下降)。这些包括阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和朊病毒病(Priondisease)。多种其他疾病与自身抗原有关，所述自身抗原存在于宿主中的水平不同于在健康良好的或不患病的患者中存在的水平，所述疾病包括肥胖症、骨关节炎、脊髓损伤、高血压、消化性溃疡病、老龄化抑郁(agingdepression)、痛风、偏头痛、高脂血症和冠状动脉病。

与本发明优选的方面一致，表达载体可选地包含一或多个编码自身抗原的至少一个表位的转基因及至少一个编码本文所述的免疫调节分子的转基因。可选择地，在某些实施方案中，自身抗原蛋白质或肽可联合基于DNA的CD8多肽的表达使用。所述自身抗原可以是全长蛋白质或其片段，或可包含一或多个功能相关的表位。可由本发明治疗的疾病包括，但不限于多发性硬化，I型糖尿病，重症肌无力，自身免疫甲状腺炎和类风湿性关节炎等。其它的自身抗原描述见Nature Medicine 7：8(Aug.2001)899-905，其全文引入本文作为参考。与这些疾病有关的自身抗原见下表1。

表1

与自身抗原和值得注意的靶组织有关的自身免疫病的几个例子见下表2。

表2

自身免疫病	靶向组织
		多发性硬化	中枢神经系统
吉-巴综合征	外周神经系统
		胰岛素依赖型糖尿病	胰岛β细胞
类风湿性关节炎	滑膜关节
		自身免疫性眼色素层炎	眼，色素层
原发性胆汁性肝硬化	肝的胆道
		自身免疫性肝炎	肝的胆道
寻常性天疱疮	皮肤神经-肌肉连接(junc.)
		自身免疫性胃炎	胃/壁细胞
恶性贫血多发性肌炎	胃肌肉
		自身免疫甲状腺炎	甲状腺
格雷夫斯病	甲状腺
		牛皮癣	皮肤
白癜风	皮肤
		全身性红斑狼疮
乳糜泻	小肠

多发性硬化

多发性硬化(MS)是最常见的中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘性疾病，有350,000美国人及全球一百万人发病。症状出现通常出现于20到40岁之间，并表现为单侧视力缺损(visual impairment)，肌无力，感觉异常，共济失调，眩晕，尿失禁，构音困难，或精神障碍(mental disturbance)的急性或亚急性发作(以下降的频率)。这些症状是由于脱髓鞘的局灶性损害，其造成由于轴突传导变慢导致的负(negative)传导异常，和由于异位性冲动产生(如Lhermitte′s综合征)导致的正(positive)传导异常。MS的诊断是基于包括至少两次分别的神经功能障碍(neurologic dysfunction)发作的病史，这两次发作在时间上分隔，产生神经功能障碍的客观临床证据，并涉及CNS白质不同区域。提供了其他的客观证据来支持MS诊断的实验室研究，包括CNS白质损害的核磁共振成像(MRI)，IgG的脑脊液(CSF)寡克隆显带(oligoclonalbanding)，及所引起的异常应答。尽管大多数患者经历了渐进的复发缓解病程，MS的临床病程在个体间明显不同，在从仅限于一生中的几次轻度(mild)发作到暴发性的慢性进行性疾病的范围内变动。具有分泌IFN-γ能力的髓鞘自体反应的T细胞的数量增加与MS和EAE的发病机理有关。

与自身免疫性脱髓鞘疾病如多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)(EAE)中的自身免疫应答有关的自身抗原，可包含蛋白脂质蛋白(PLP)；髓鞘碱性蛋白(MBP)；髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)；环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)；髓鞘相关性糖蛋白(MAG)，和髓鞘相关性少突胶质碱性蛋白(MBOP)的表位；α-B-晶体蛋白(热休克蛋白)；病毒和细菌的模拟肽如流感病毒，疱疹病毒，乙型肝炎病毒等；OSP(少突胶质细胞特异性蛋白质)；瓜氨酸修饰的MBP(其中6个精氨酸加水脱氨(de-imminated)成为瓜氨酸的MBP的C8同种型)等。完整的膜蛋白PLP是髓鞘的显性自身抗原。PLP抗原性的决定簇已经在多个小鼠品系中鉴定，其包括残基139-151，103-116，215-232，43-64和178-191。已经报道了至少26个MBP表位(Meinl et al.，J Clin Invest 92，2633-43，1993)。值得注意的是残基1-11，59-76和87-99。已在多个小鼠品系中鉴定的免疫显性MOG表位包括残基1-22，35-55，64-96。根据理解，本文所用术语“表位”指具有能被动物免疫系统的B细胞或T细胞识别的特定形状或结构的自身抗原的一部分。

在人类MS病人中，如下髓鞘蛋白和表位被鉴定为自身免疫性T和B细胞应答的靶。从MS脑斑块(plaques)流出的抗体识别髓鞘碱性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfennig et al.，J Clin Invest 100：1114-1122，1997)。另一项研究发现，MS病人中的大约50％对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)有外周血淋巴细胞(PBL)T细胞反应性(6-10％对照)，20％对MBP有反应性(8-12％对照)，8％对PLP有反应性(0％对照)，0％对MAG有反应性(0％对照)。此研究中，10名MOG反应性病人中的7名产生集中针对3个肽表位之一的T细胞增殖性应答，所述表位包括MOG 1-22，MOG 34-56，MOG 64-96(Kerlero deRosbo et al。Eur J Immunol 27，3059-69，1997)。T和B细胞(脑损伤-流出的Ab)应答集中针对MBP 87-99(Oksenberg et al.，Nature 362，68-70，1993)。MBP87-99中，氨基酸基序HFFK是T和B细胞应答的显性靶(Wucherpfennig et al.，J Clin Invest 100，1114-22，1997)。另一项研究观察了针对髓鞘相关性少突胶质碱性蛋白(MOBP)的淋巴细胞反应性，所述MOBP包括残基MOBP 21-39和MOBP 37-60(HoIz et al.，J Immunol 164，1103-9，2000)。用MOG和MBP肽的免疫金偶联物来染色MS和对照的脑，MBP和MOG肽被MS斑块-结合的Ab识别(Genain and Hauser，Methods 10，420-34，1996)。

类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(RA)是影响0.8％全球人口的慢性的自身免疫炎性滑膜炎。其特征为导致侵蚀性关节破坏(erosive joint destruction)的慢性炎性滑膜炎。RA由T细胞，B细胞和巨噬细胞来介导。

T细胞在RA中起关键作用，其证据包括(1)浸润滑膜的CD4⁺T细胞占优势，(2)与用药物如环孢菌素使T细胞功能下降有关的临床改善，和(3)RA与某些HLA-DR等位基因的相关。与RA有关的HLA-DR等位基因包含α-链第三高变区的67-74位氨基酸的类似序列，所述高变区参与肽结合和向T细胞呈递。RA是由识别在滑膜关节存在的自身抗原的自体反应T细胞介导的。与RA有关的自身抗原包括II型胶原蛋白的表位；hnRNP；A2/RA33；Sa；聚丝蛋白；角蛋白；瓜氨酸；软骨蛋白包括gp39；I、III、IV、V、IX、XI型胶原蛋白；HSP-65/60；IgM(类风湿因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛缩酶A；瓜氨酸-修饰的聚丝蛋白和血纤蛋白。包含修饰过的精氨酸残基(加水脱氨形成瓜氨酸)的识别聚丝蛋白肽的自身抗体在高比例的RA病人的血清中鉴定。自体反应性T和B细胞应答在一些病人中都针对相同的免疫显性II型胶原蛋白(CII)肽257-270。

胰岛素依赖型糖尿病

人的I型胰岛素依赖型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的特征为朗格汉斯胰岛中β细胞的自身免疫破坏。β细胞的缺失导致不能调节血液中的葡萄糖水平。当血液中的葡萄糖水平上升超过特定水平，通常约250mg/dl时，出现明显的糖尿病。在发作糖尿病前，在人中有一个长期的症状前(presymptomatic)阶段。在此阶段中胰腺β细胞的功能会渐进地丧失。抗胰岛素、谷氨酸脱羧酶、和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)的自身抗体的存在可提示该疾病的发生，每种都是与IDDM有关并可用于本发明的自身抗原的例子。

可在症状前阶段评价的标记物是胰腺的胰岛炎、胰岛细胞抗体、胰岛细胞表面抗体的水平和频度、MHC II类分子在胰腺β细胞中的异常表达、血液中的葡萄糖浓度、和胰岛素的血浆浓度。胰腺中的T淋巴细胞数、胰岛细胞抗体、和血糖的增加，如同胰岛素浓度的下降一样，是所述疾病的指标。

非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠是具有很多与人IDDM一致的临床、免疫、和组织病理特征的动物模型。NOD小鼠自发地发生胰岛炎症和β细胞的破坏；这导致高血糖症和明显的糖尿病。CD4⁺和CD8⁺T细胞是发生糖尿病必需的，但各自的作用仍是不清楚的。如上所述，已经显示以蛋白质或DNA疫苗的形式向NOD小鼠施用胰岛素或GAD，在耐受的情况下可预防疾病并能下调对其它自身抗原的应答。

具有多种特异性的自身抗体组合在血清中的存在对人的I型糖尿病是高度灵敏的和特异的。例如，抗GAD和/或IA-2的自身抗体的存在对于将I型糖尿病与对照血清区分几乎是98％灵敏的、99％特异的。在I型糖尿病病人的非糖尿病型一级相对参数(first degree relatives)中，对GAD、胰岛素和IA-2三种自身抗原中的两种具有特异性的自身抗体的存在对于在5年内发病I型DM的阳性预测值为＞90％。

与人的胰岛素依赖型糖尿病有关的自身抗原可包括酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2.β.；谷氨酸脱羧酶(GAD)(包括65kDa和67kDa型)；羧肽酶H；胰岛素；胰岛素原；热休克蛋白(HSP)；glima 38；胰岛细胞抗原69KDa(ICA69)；p52；两种神经节苷脂抗原(GT3和GM2-1)；和胰岛细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT 2)。

对人IDDM的治疗现在通过监测血糖水平来指导注射或泵传递重组胰岛素。饮食和锻炼方案有助于实现足够的血糖控制。

自身免疫性眼色素层炎

自身免疫性眼色素层炎是眼的自身免疫病，估计影响400,000人，美国一年就有43,000例新病例的发病率。自身免疫性眼色素层炎现在用类固醇、免疫抑制剂如甲氨喋呤和环孢菌素、静脉内免疫球蛋白和TNF-α拮抗剂来治疗。

实验性自身免疫性眼色素层炎(EAU)是一种T细胞介导的靶向神经视网膜、色素层和眼内相关组织的自身免疫病。EAU有很多与人的自身免疫性眼色素层炎相同的临床和免疫学特征，并且由外周施用乳化于完全福氏佐剂(CFA)中的眼球血管膜源性(uveitogenic)肽来诱导。

在人的自身免疫性眼色素层炎中与自身免疫应答有关的自身抗原可包括S-抗原、光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)、视紫红质和恢复蛋白。

原发性胆汁性肝硬化

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是器官特异性的自身免疫病，主要在40-60岁的女性发病。这一群体的流行性报道接近1∶1,000。PBC的特征为被覆(lining)在小肝内胆管上的肝内胆管上皮细胞(IBEC)的进行性破坏。这导致阻塞并干扰了胆汁的分泌，造成最终的肝硬化。已经报道该病与特征在于上皮细胞被覆/分泌系统破坏的其它自身免疫病有关联，所述其它自身免疫病包括舍格伦氏(Sjogren′s)综合征、CREST综合征、自身免疫性甲状腺病和类风湿性关节炎。对于驱动(driving)抗原的关注已经集中于线粒体50多年，从而发现了抗线粒体抗体(AMA)(Gershwin et al.，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackay et al.，Immunol Rev 174：226-237，2000)。AMA不久成为实验室诊断PBC的基石，它在临床症状出现前很早就在90-95％的患者血清中存在。线粒体中的自身抗原反应性被命名为M1和M2。M2反应性针对一族48-74kDa的成分。M2代表了2-酮酸脱氢酶复合物(2-OADC)的酶的多个自身抗原亚基，并且是本发明另一个举例的自身抗原。鉴定丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)抗原在PBC发病机理中的作用的研究支持PDC在诱导疾病中起主要作用的观点(Gershwin et al.，Immunol Rev 174：210-225，2000)；(Mackayet al.，Immunol Rev 174：226-237，2000)。在95％PBC病例中频度最高的反应性是E274kDa亚基，属于PDC-E2。存在有关但有区别的复合体，包括：2-酮戊二酸脱氢酶复合物(OGDC)和支链(BC)2-OADC。三种组成酶(constituent enzymes)(E1，2，3)对将2-酮酸底物转变乙酰基辅酶A CoA)并将NAD⁺还原为NADH的催化功能起作用。哺乳动物的PDC包含另外的成分，称为X蛋白或E-3结合蛋白(E3BP)。在PBC患者中，主要的抗原反应针对PDC-E2和E3BP。E2多肽包含两段串联重复的硫辛酰结构域，而E3BP有一个硫辛酰结构域。硫辛酰结构域发现于PBC的多个自身抗原靶中，这里称为“PBC硫辛酰结构域”。PBC现在用糖皮质激素和免疫抑制剂包括甲氨喋呤和环孢菌素A来治疗。

如下产生实验性自身免疫性胆管炎(EAC)的鼠模型：用哺乳动物PDC以腹膜内方式(i.p.)使雌性SJL/J小鼠致敏，诱导非-化脓性破坏性胆管炎(NSDC)，并产生AMA(Jones，J Clin Pathol 53：813-21，2000)。

其它自身免疫病及有关的自身抗原

与重症肌无力有关的自身抗原可包括在乙酰胆碱受体内的表位。与寻常性天疱疮有关的自身抗原可包括桥粒芯糖蛋白-3。舍格伦氏综合征抗原可包括SSA(Ro)；SSB(La)；和胞衬蛋白(fodrin)。寻常性天疱疮的显性自身抗原可包括桥粒芯糖蛋白-3。与肌炎有关的自身抗原可包括tRNA合成酶(如苏氨酰基，组氨酰基，丙氨酰基，异亮氨酰基，和甘氨酰基)；Ku；ScI；SSA；U1 Sn核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku；和SRP。与硬皮病有关的自身抗原可包括Scl-70；着丝粒；U1核糖核蛋白；和核仁纤维蛋白。与恶性贫血有关的自身抗原可包括内因子；和胃H/K ATPase的糖蛋白β亚单位。与全身性红斑狼疮(SLE)有关的自身抗原可包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；钙网蛋白；Grp78；Scl-70；组蛋白；Sm蛋白质；和染色质等。对于格雷夫斯病，自身抗原可包括Na+/I-共运输体(symporter)；促甲状腺激素受体；Tg；和TPO。

神经变性疾病

另外，几种神经变性疾病是与自身抗原有关的，所述自身抗原在宿主中存在的水平不同于在健康良好的或不患病的患者中存在的水平。这些的例子如表3所述。

表3

神经变性疾病	病理畸形	非生理性存在的自身抗原
			阿尔茨海默病	老年斑(senile plaque)	淀粉状β蛋白
帕金森氏病	Lewy小体	α-突触核蛋白(α-synuclein)
			亨廷顿氏病	核内包涵体	亨廷顿蛋白
朊病毒病	朊病毒蛋白包涵体	朊病毒蛋白

阿尔茨海默病

阿尔茨海默病(AD)是人群中最常见的神经变性疾病(Cummings et al.，Neurology 51，S2-17；discussion S65-7，1998)。AD影响约10％的65岁以上的人和差不多50％的85岁以上的人。估计到2025年，约2200万人会患上AD。AD的特征为缓慢进行的痴呆。如果死后发现痴呆、神经纤维缠结、和老年斑的三联征，可确诊AD。在阿尔茨海默病患者的脑中无一例外地发现老年斑。老年斑的主要组成是淀粉状β蛋白(Aβ)(Iwatsubo et al.，Neuron13：45-53，1994)(Lippa et al.，Lancet 352：1117-1118，1998)，这是本发明自身抗原的另一个例子。Aβ是源自淀粉状前体蛋白(APP)的42个氨基酸的肽，它是具有多种生理作用的跨膜糖蛋白，所述作用包括细胞增殖、粘附、细胞信号传导、和轴突增生(outgrowth)(Sinha et al.，Ann N Y Acad Sci 920：206-8，2000)。APP通常在Aβ结构域内被切割以产生被分泌的片段。然而，可选择的加工也可切割APP以产生在老年斑内累积的可溶性Aβ。

AD的现有疗法的有效性有限，并且不是靶向Aβ累积。现有药物是目的在于提高脑中突触后乙酰胆碱浓度的中枢胆碱酯酶抑制剂(Farlow andEvans，Neurology 51，S36-44；discussion S65-7，1998)；(Hake，Cleve Clin J Med68，608-9：613-4，616，2001)，这些药物仅在几项认知(cognitive)参数上提供了最少的临床益处。人Aβ的转基因小鼠已经显示出具有很多与人AD共同的特征(Games et al.，Nature 373：523-527，1995)；(Hsiao et al.，Science 274：99-102，1996)。在这些转基因小鼠中，用Aβ肽免疫在认知提高和组织病理减少方面显示了有效性(Morgan et al.，Nature 408：982-985，2000)；(Schenk et al.，Nature 400：173-177，1999)。研究还显示用肽疫苗在阿尔茨海默病动物模型产生抗Aβ的抗体应答，可逆转在这些模型观察到的异常的组织病理及行为改变(Bard et al.，Nat Med 6：916-19，2000)；(DeMattos et al.，Proc Natl Acad Sci US A 98：8850-8855，2001)。

帕金森氏病

帕金森氏病是锥体外运动系统的神经变性疾病，它具有很高的128-168比100,000的流行性(Schrag et al.，Bmj 321：21-22，2000)。其主要临床特征在于静止性震颤、运动徐缓、强直、和直立不稳定性(postural instability)。在大多数病例后期阶段也出现痴呆。病理生理标志是在脑内的锥体外系统内，尤其是在黑质内的神经元丧失。在帕金森氏病患者脑内的很多神经元有已知为Lewy小体的胞内包涵体(Forno and Norville，Acta Neuropathol(Berl)34：183-197，1976)。已经发现Lewy小体的主要成分是已知为α-突触核蛋白的蛋白质，这是本发明自身抗原的另一个例子(Dickson，Curr Opin Neurol14：423-432，2001)。含α-突触核蛋白的Lewy小体的累积与疾病表型相关。

帕金森氏病的现有疗法针对控制(managing)该疾病所导致的症状而不是潜在原因(Jankovic，Neurology 55：S2-6，2000)。帕金森氏病的可用药物被分为多巴胺能药剂(例如卡比多巴(carbidopa)/左旋多巴和司来吉兰(selegiline))，多巴胺激动剂(例如培高利特(pergolide)和罗匹尼罗(ropinirole))，和儿茶酚-o-甲基-转移酶或COMT抑制剂(例如恩他卡朋(entacapone)和托卡朋(tolcapone))。这些疗法都针对提高病变神经元中的存在的多巴胺的量。总而言之，这些药物在大多数患者最初可有效降低一些运动症状，如震颤和强直，但在减弱神经变性过程的进展上不太有效，神经变性过程的进展会导致黑质神经元的破坏。

亨廷顿氏病

亨廷顿氏病是以常染色体显性方式遗传的遗传病，它与称为亨廷顿蛋白的基因内所包含的CAG三核苷酸重复长度的异常延长(expansion)连锁(Cell 72，971-9831993)。其主要的临床特征包括称为舞蹈病的异常的不受控制运动和进行性的痴呆。从病理生理上讲，在纹状体和大脑皮层内存在选择性的神经元死亡和变性。这些区域内的神经元已显示出累积了突变的亨廷顿蛋白蛋白质的胞内团聚体，这是本发明的另一种自身抗原并且其累积与疾病表型有关(DiFiglia et al.，Science 277：1990-1993，1997)；(Scherzinger etal.，Cell 90：549-558，1997)；(Davies et al.，Cell 90：537-548，1997)。

现在对于亨廷顿氏病的症状或病因没有可行的治疗方法。所以，在首次症状发作后平均17年，这些患者会缓慢发展至必然死亡。

朊病毒病

朊病毒病，也称为可传播性海绵状脑病，是在动物和人发病的潜在传染病，该病的特征为脑的海绵样变性(Prusiner，Proc Natl Acad Sci U S A 95，13363-83，1998)。此疾病最常见的形式也称作克-雅(Creutzfeldt-Jakob)病。此病的另一种称作新-变型的克-雅病的形式具有重要的公共健康意义，因为该病似乎通过物种交叉性传播而出现，例如从牲畜到人。此种疾病的临床特征包括迅速发展的痴呆、肌阵挛、虚弱、和共济失调。从病理生理上讲，已有文献报道在正常的朊病毒蛋白中有构象改变会使朊病毒蛋白质累积成为β片层样结构，导致在中枢神经系统内可见的变性，所述正常的朊病毒蛋白是本发明的另一种自身抗原。对于朊病毒病现在没有可行的治疗方法。该病的临床病程快，通常在诊断2年内必然死亡，并且介入不能改变此病程。

另外，几种其他的疾病与自身抗原有关，所述自身抗原在宿主中存在的水平不同于在健康良好的或不患病的患者中存在的水平。这些病的例子见表4。

表4

疾病	异常	与疾病有关的且非生理性存在的自身抗原
			肥胖症	由于摄入能量摄入超过消耗而增重	粘结蛋白聚糖-3，围脂滴蛋白，食欲肽，甘丙肽，胰高血糖素-样肽受体
骨关节炎	软骨变性	组织蛋白酶，纤维蛋白溶酶，胶原酶，金属蛋白酶
			脊髓损伤	再生抑制	Nogo-1
高血压	持续性高血压	血管紧张素转换酶
			消化性溃疡病	胃酸过量	H⁺/K⁺ATPase，促胃液素
老龄化		超氧化物歧化酶

抑郁	5-羟色胺过量	5-羟色胺5HT2受体，α₁-肾上腺素能受体
			痛风	尿酸过量	黄嘌呤氧化酶
偏头痛	血管痉挛	5-羟色胺5HT_1B和5HT_1D受体
			高脂血症	脂质升高	HMG CoA还原酶，载脂蛋白A，B-100
冠状动脉病	冠状动脉限制性血流梗阻	血管紧张素转换酶，载脂蛋白A，B-100

骨关节炎和退化性关节病

骨关节炎(OA)影响30％的60岁以上的人，该病是人的最常见的关节病。骨关节炎表现为滑膜关节的退化和衰退(failure)，并涉及关节软骨的分解。

软骨主要由蛋白聚糖和胶原蛋白组成，蛋白聚糖提供了硬度(stiffness)和承受负荷的能力，而胶原蛋白提供拉伸和抗剪切强度(sheer strength)。软骨细胞通过产生并分泌潜在的胶原酶、潜在的溶基质蛋白酶、潜在的明胶酶、组织纤维蛋白溶酶原激活物及其它有关的酶，来破坏(turnover)并重塑正常软骨，每一种所述酶都是本发明所用的自身抗原。软骨细胞还产生包括金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)和纤维蛋白溶酶激活物抑制剂(PAI-1)在内的几种抑制剂，所述抑制剂限制了中性金属蛋白酶、组织纤维蛋白溶酶激活物、及其它酶的降解能力。这些降解酶和抑制剂，也是本发明所用的自身抗原。这些降解酶和抑制剂协助正常软骨的重塑和维持。在OA中，这些过程调节异常会使软骨退化并降解。

在早期OA时胶原纤维排列和大小上有异常改变。金属蛋白酶、组织蛋白酶、和纤维蛋白溶酶单独或联合成为本发明的一或多种自身抗原，它们会造成明显的软骨基质丧失。最初软骨细胞的蛋白聚糖和软骨产生增加使关节软骨比正常的厚。然后关节软骨由于降解酶作用而变薄变软，所述酶包括胶原酶、溶基质蛋白酶、明胶酶、组织纤维蛋白溶酶原激活物及其它有关的酶，它们单独或联合成为本发明的一或多种自身抗原。IL-1、组织蛋白酶、及纤维蛋白溶酶可单独或联合促进软骨的退化和分解，它们也是本发明的一或多种自身抗原。较薄较软的软骨更易被机械应力损伤。这些因素导致软骨表面分解并形成垂直裂口(原纤维形成)。在疾病末期软骨表面形成侵蚀，并延伸到骨。软骨细胞最初增殖并形成簇(clusters)，在末期软骨细胞减少(hypocelluar)。骨的重塑和肥大是OA的明显特征。

对OA的现有疗法包括休息、物理疗法来加强支持关节的肌肉、支架及其他支持型设备来稳定关节，非类固醇的抗炎药剂及其他镇痛药。对每日生活活动关键的关节如膝或髋，在末期骨叠骨(bone-on-bone)OA时，常进行手术关节置换。

肥胖症

肥胖症是美国及其他工业化国家面对的主要健康问题。估计肥胖症发病占美国人口的20％。肥胖症是脂肪组织过量。当过度的(prolonged)能量摄入超过消耗过长时间(prolonged period)，过量的卡路里储存为脂肪组织导致肥胖症。因此，肥胖症可源于摄入增加和/或消耗下降。摄入依赖于进食行为，这是由大脑皮层控制的复杂过程。下丘脑的独立区域，包括摄食中枢和饱中枢，向大脑皮层发出信号来促进对进食的调节。血糖、胰岛素、甘油及其它水平可以被下丘脑中的摄食中枢和饱中枢察觉来辅助调节进食行为。

人可通过若干项机制部分地适应过量卡路里的摄入。通过提高三碘甲腺原氨酸(T3)血浆水平和降低反T3(reverse T3，rT3)水平的机制来提高静息代谢率，可部分地代偿碳水化合物和蛋白质的过量摄入。中枢或外周的交感输出增加也增加儿茶酚胺诱导的卡路里(caloric)利用和产热。饮食性产热或身体对食物的热反应包括，在进餐后数小时产热(heat)和代谢消耗增加超过静息代谢率，并且基于蛋白质的进餐比基于碳水化合物或脂肪的进餐作用更强。

进食行为和脂肪产生受复杂机制控制。分子包括粘结蛋白聚糖-3调节进食并促进下丘脑中的进食行为(Reizes et al，Cell 106：105-116，2001)。影响食物摄入和代谢的其他分子和受体包括食欲肽(Orexin)、甘丙肽(Galanin)、促肾上腺皮质激素-释放因素、黑色素浓缩激素、瘦蛋白(leptin)、胆囊收缩素、促生长素抑制素、肠抑肽(enterostating)、胰高血糖素-样肽1和2、和铃蟾肽，它们单独或联合成为本发明的一或多种自身抗原。(Chiesi et al，Trends Pharmacological Sciences，22：247-54，2001)。肥胖症的动物模型中，一些这些分子的拮抗剂或激动剂已经显示了减轻体重的有效性(Chiesi et al，Trends Pharmacological Sciences，22：247-54，2001)。围脂滴蛋白(perilipin)包被脂肪细胞的脂小滴并调节三酰甘油酯的水解，干扰围脂滴蛋白会使小鼠抵抗饮食诱导的肥胖症但葡萄糖耐量正常(but with normal glucosetolerance)(Tansey et al，Proc.Natl.Acad.ScL USA，98：6494-99)。

当肥胖症继发于继发性代谢或其他疾病状态，治疗该继发性病因。对原发性肥胖症的治疗是通过饮食方案和进食行为调控(modification)以减少卡路里摄入，和锻炼方案来增加消耗。厌食药物(Anorexiant)(安非它明(amphetimine)样药物)，甲状腺激素药物，和人的绒毛膜促性腺激素都已经用于治疗肥胖症。通过手术使小肠改道(Surgical small bowel bypass)(空肠回肠改道(jujunoileal shunts))也用于治疗病态肥胖症的严重病例。

脊髓损伤

估计美国一年有约11,000例脊髓损伤的新病例，总流行性是美国现存在总计183,000到230,000例病例(Stover et al.，Arch Phys Med Rehabil 80，1365-71，1999)。脊髓损伤恢复很差，并且导致破坏性的不可逆状的神经系统失能(disability)。对于急性脊髓损伤的现有治疗方法包含损伤位置的机械稳定化，例如通过手术介入，和施用肠胃外类固醇。这些介入对于降低脊髓损伤后永久性瘫痪的发病率作用不大。慢性脊髓损伤的治疗集中在维持生活质量，如控制疼痛、痉挛状态和膀胱功能。现在没有可用的注重于神经功能恢复的治疗方法。

造成脊髓损伤后恢复差的因素之一是在髓鞘中存在轴突再生抑制剂。这些因素在损伤后立即释放，预防轴突穿过损害(lesion)生长来重建功能性连接。这些轴突再生抑制剂之一是称作Nogo-A的蛋白质，这是本发明的自身抗原(Huber and Schwab，Biol Chem 381，407-19.，2000；Reilly，J Neurol 247，239-40，2000；Chen et al.，Nature 403，434-9，2000)。Nogo-A已经显示在体外抑制轴突增生，而且抗Nogo-A的中和抗体已经显示逆转了这种生长抑制性质。进一步，抗Nogo-A的单克隆抗体已经显示在脊髓损伤的动物模型体内促进了轴突再生(Raineteau et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 98，6929-34.，2001；Merkler et al.，J Neurosci 21，3665-73，2001；Blochlinger et al.，J CompNeurol 433，426-36，2001；Brosamle et al.，J Neurosci 20，8061-8，2000)。Nogo-A是主要在大脑皮层和脊髓内的少突胶质细胞中表达的跨膜蛋白。已经鉴定出Nogo-A分子的两个区域潜在负责此分子的抑制能力，这两个区域是胞外66氨基酸环(loop)和称为AS472的胞浆内C-末端区。

分子拟态(Molecular mimicry)

由于分子拟态，已知传染性物质(agent)也影响T细胞检测自身抗原的能力。不受理论所限，认为与自身抗原紧密相关的来自传染性病原体的抗原会诱导抗所述自身抗原的免疫应答，导致明显的自身免疫。因此，在提供如本文所述的CD-8时，也发现了来自传染性物质的这些抗原的用途。由于分子拟态而导致自身免疫病的传染性物质的例子见Nature Medicine，7：8(Aug，2001)，pp：899-905所述，在此将其引入以作参考。

在一些实施方案中，不必将全长的自身抗原与本发明的免疫调节分子共表达。在此实施方案中，自身抗原的至少一个表位与本发明的免疫调节分子共表达。在优选实施方案中，表位长度至少为约3个，优选至少约5个并最优选至少约8个氨基酸。另外，全长自身抗原的其他截短物可与免疫调节分子共表达。在表达自身抗原的部分或片段时，取决于所需靶细胞，理想的是将所述片段表达为融合蛋白，来确保自身抗原表位的恰当靶向和/或加工。在一些实施方案中，可能必需表达包括与例如本文所述信号或前导肽融合的片段的融合蛋白，以确保包括至少一个表位的多肽到达靶细胞的质膜。信号序列通常编码信号肽，所述肽包含指导所述细胞分泌所述蛋白质的疏水氨基酸，这是本领域公知的。另外，还是取决于所需靶细胞，在融合蛋白中包括跨膜结构域或其他膜锚定区是理想的，以确保所述融合蛋白仍与表达它的靶细胞相连。在一个实施方案中，跨膜结构域(transmembrane)不需要与自身抗原起源相同(native to)。在此实施方案中，“合成的跨膜结构域”含有约20到25个疏水氨基酸，之后是至少一个、优选两个带电氨基酸。

如果免疫调节分子由载体内包含的基因来编码，而该载体与包含并表达治疗性转基因例如自身抗原的载体是分开的，那么在细胞接触包含并表达所述基因的载体之前、同时、或之后，包含所述免疫调节分子的载体都可以与该细胞接触，只要使用了相似的或相同种的载体并且接触作用的时间足以抑制对接触了所述细胞的载体的免疫应答。然而，优选所述载体编码免疫调节分子以及编码自身抗原或表位或其它片段的序列。当免疫调节分子和治疗性转基因在相同的载体中表达，优选各自的插入子受分开的控制元件的控制。在此实施方案中，表达系统包含两个或单个表达盒，以使两个核酸同时表达(双顺反子单元)。当所述系统包含两个表达盒，这可以使用相同的或不同的启动子。

当表达系统在载体内包括免疫调节分子和治疗性转基因，可以使用强度相同或类似的启动子，和拷贝数相同或类似的核酸。通常，体内产生的两种转基因各自的量十分接近。然而，可以优选在某些条件下使每种转基因产生的量不同。此时，可使用不同强度的启动子，或存在多种拷贝数的不同基因的系统，或改变施用的剂量。

在一个实施方案中，治疗分子，例如自身抗原，以蛋白质或多肽的形式递送到靶细胞，来经MHC I类或II类途径加工呈递到靶细胞的表面。全长蛋白质或其免疫原性片段被递送到靶细胞。在此实施方案中，免疫调节分子优选在本文所述的表达系统中递送到靶细胞。

在一个实施方案中，治疗性自身抗原以与MHC I类和/或II类分子的融合蛋白来提供，或是编码此融合蛋白的核酸。在此实施方案中，自身抗原和MHC I类和II类分子被改造，从而自身抗原与MHC分子连接，优选通过共价来连接。在一些实施方案中，所述自身抗原直接连接(例如接近)一或多个MHC分子，这是本领域公知的。见例如Mottez et al.，J.Exp.Med.181：493-502(1995)。在另一个实施方案中，在自身抗原和MHC分子之间包括接头，包括但不限于肽接头，此技术也是本领域已知的。见例如Kozonoet al.，nature 369：151-154(1994)；White et al.，J.Immunol.162：2671-76(1999)。这些融合蛋白更详细地描述在美国专利6,211,342中，在此将其引入以作参考。

“靶细胞”可以以单一实体存在，或可以是更大的细胞群体的一部分。这种“更大的细胞群体”可以包括，例如，细胞培养物(或者混合的或者纯的)，组织(例如上皮或其他组织)，器官(例如心脏，肺脏，肝脏，胆囊，膀胱，眼或其他器官)，器官系统(例如循环系统，呼吸系统，胃肠系统，泌尿系统，神经系统，皮肤系统或其他器官系统)，或生物体(例如鸟类，哺乳类，具体是人类，等等)。优选地，靶向的器官/组织/细胞是造血来源(例如包括但不限于树突细胞，巨噬细胞，红细胞，白细胞，T和B淋巴细胞等等)的和/或可以是造血的或其他组织特异性的干细胞。培养和使用干细胞的方法在美国专利5,672,346，6,143,292和6,534,052中有详细描述，在此将其引入以作参考。

具体地，与表达载体例如病毒载体或质粒接触的靶细胞与其他细胞不同，因为接触的靶细胞包含可被表达载体靶向的具体的细胞表面结合位点。“具体的细胞表面结合位点”指存在于细胞表面的任何位点(即分子或分子的联合)，其中载体例如腺病毒载体可以与之相互作用，以附着于细胞，并因此进入细胞。因此，具体的细胞表面结合位点包括细胞表面受体，并优选地是蛋白质(包括修饰的蛋白质)，碳水化合物，糖蛋白，蛋白聚糖，脂质，粘液素(mucin)分子或粘蛋白等等。可能的细胞表面结合位点的例子包括但不局限于：发现于葡萄糖胺聚糖上的肝素和硫酸软骨素部分；发现于粘液素，糖蛋白和神经节苷脂上的唾液酸部分；主要组织相容性复合物I(MHC I)糖蛋白；发现于膜糖蛋白上的普通碳水化合物分子，包括甘露糖，N-乙酰-半乳糖胺，N-乙酰-葡糖胺，岩藻糖，和半乳糖；糖蛋白例如ICAM-1，VCAM，E选择素，P选择素，L选择素，和整合素分子；和癌细胞上存在的肿瘤特异抗原，例如MUC-1肿瘤特异性表位。但是，将表达载体例如腺病毒靶向细胞不限于细胞相互作用的任何特定机制(即与已知的细胞表面结合位点相互作用)。

在一个实施方案中，表达载体的靶细胞特异性通过假型包装的(pseudotyping)载体而相对野生型载体改变。通过假型包装指，其它靶细胞特异的结合部分被包括在表达载体中，所述表达载体赋予载体靶细胞特异性。这些靶细胞特异的结合部分包括但不局限于，编码相对于野生型载体靶向不同细胞的蛋白质的基因，抗体片段或其他结合分子，如亮氨酸拉链或生物素-抗生物素结合位点。在一些实施方案中，靶细胞特异的结合部分整合到病毒壳体中，从而可容易地连接其它靶向分子，例如用抗壳体的抗体来连接细胞表面分子或细胞表面结合抗体。假型包装载体的其它例子见美国专利6,734,014，6,783,981和6,762,031所述，在此将其引入以作参考。本发明的表达载体和方法可有利地包括这些假型包装的修饰以及其它本领域技术人员公知的靶向修饰和技术。一般参见Curiel and Douglas，Eds.，Vector Targeting for Therapeutic Gene Delivery(Wiley-Liss，Inc.2002)。

在优选的实施方案中，全身施用载体，并且免疫调节分子和自身抗原表位的表达可出现在任何细胞中。在此实施方案中，治疗自身免疫病时，不必使载体接触自身免疫应答所作用的一或多个细胞。但是，载体可施用到或表达在任何细胞中。

在一个实施方案中，树突细胞用于呈递抗原到患者的免疫系统。树突细胞表达MHC I和II类、B7共刺激物、和IL-12，因此是高度特异化的抗原呈递细胞。树突细胞可用于在MHC I和II类分子的范围内(in the context of)呈递肽到T细胞。在一个实施方案中，自体的树突细胞用能结合MHC分子的肽进行脉冲作用(pulsed)。在另一个实施方案中，树突细胞用完整的蛋白质进行脉冲作用。但另一个实施方案涉及改造编码树突细胞中抗原的基因的过表达，用多种本领域已知和本文所述的实施(implementing)载体，如腺病毒(Arthur et al.，1997，Cancer Gene Ther.4：17-25)，逆转录病毒(Hendersonet al.，1996，Cancer Res.56：3763-3770)，慢病毒，腺伴随病毒，DNA转染(Ribas et al.，1997，Cancer Res.57：2865-2869)，和源于肿瘤的RNA的转染(Ashley et al.，1997，J.Exp.Med.186：1177-1182)，在此将这些都引入以作参考。这些树突细胞疫苗的其它例子见于美国专利6,440,735中，在此将其引入以作参考。

如这里使用的和下面进一步详细说明的，“多核苷酸”或“核酸”可以指或者DNA或者RNA，或者既含有脱氧核糖核苷酸也含有核糖核苷酸的分子。核酸包括基因组DNA，cDNA和包括有义和反义核酸的寡核苷酸。这种核酸也可以含有核糖-磷酸骨架中的修饰，其增加稳定性和这些分子在生理环境中的半寿期。

核酸可以是双链的，单链的，或含有双链两条序列的部分或单链序列的部分。可以被本领域技术人员理解的，单链(“Watson”)的描述也定义了另一条链(“Crick”)的序列；因此图中描述的序列也包括序列的互补链。术语“重组的核酸”在这里指一般通过核酸内切酶操作核酸，最初在体外形成的核酸，该核酸呈通常在天然未发现的形式。因此，分离的线性形式核酸，或通过连接非正常连接的DNA分子在体外形成的表达载体，都被认为是符合本发明目的的重组体。应理解一旦制备重组核酸并将其再次引入宿主细胞或生物体，其会以非重组方式复制，即利用宿主细胞体内细胞机制而不是体外或染色体外操作；但是，所述核酸一旦被重组制备，尽管随后的复制是非重组的方式，仍然被认为是符合本发明目的的重组体。

在整个申请中可以将术语“多肽”和“蛋白质”互换使用，它们指至少二个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。蛋白质可以由天然存在的氨基酸和肽键、或合成的肽类似物结构构成。因此这里使用的“氨基酸”或“肽残基”既指天然存在的也指合成的氨基酸。例如，高苯丙氨酸，瓜氨酸和正亮氨酸被认为是符合本发明目的的氨基酸。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基例如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是或者(R)或者(S)构型。在优选的实施方案中，氨基酸为(S)或L-构型。如果使用非天然存在的侧链，可使用非氨基酸的取代物，例如为防止或延迟体内的降解。改变天然氨基酸序列以产生用于靶向或者作为转基因表达的变体蛋白和肽，例如可以通过本领域技术人员已知的多种方式进行。变体肽是基本上与已知肽同源的、但是具有不同于该肽氨基酸序列的肽。同源性的程度(即相同百分比)可以例如通过使用针对这种比较加以优化的的计算机程序比较序列信息来确定，例如使用6.0版本或更高版本的GAP计算机程序，如Devereux等所述(NucleicAcids Res.，12，387(1984)，并可免费从Wisconsin大学遗传计算机组(UWGCG)获得)。可以使用本领域技术人员已知的其他方法评价变体蛋白和/或肽的活性。

就变体蛋白(肽)和参考蛋白(肽)之间不同的氨基酸残基而言，变体蛋白(肽)优选包括保守的氨基酸取代，即已知的氨基酸被另一大小、电荷密度、疏水性/亲水性、和/或构型相似的氨基酸取代(例如用缬氨酸取代苯丙氨酸)。可以通过将包括修饰位点的合成寡核苷酸连接入表达载体来引入变体位点特异的突变。或者，可以使用针对寡核苷酸的定点诱变方法，例如Walder et al.，Gene，42：133(1986)；Bauer et al.，Gene，37：73(1985)；Craik，Biotechniques，January 1995，pp.12-19；和美国专利申请4,518,584和4,737,462中公开的那些方法。

免疫调节分子

在本说明书的上下文中，“免疫调节分子”是多肽分子，其以抗原特异方式调节，即增强或减弱针对靶细胞的细胞和/或体液的宿主免疫应答，并且优选地可减轻宿主免疫应答。一般地，依据本发明所述，在从本文描述的载体表达后，免疫调节分子可以与靶细胞表面膜结合，例如，插入到细胞表面膜中或共价或非共价地结合于其上。

在优选实施方案中，免疫调节分子包括CD8蛋白的全部或功能部分，并且甚至更优选CD8α链的全部或功能部分。对于人CD8编码序列，参见Leahy，Faseb J.9：17-25(1995)；Leahy et al.，Cell 68：1145-62(1992)；Nakayamaet al.，Immunogenetics 30：393-7(1989)。对于CD8蛋白和多肽，“功能部分”指保留本文所述的反抑活性的CD8α-链的一部分，更具体为保留CD8α-链的HLA结合活性的部分，且具体为CD8α-链的细胞外结构域的Ig样结构域。实例的变体CD8多肽描述于Gao and Jakobsen，Innunology Today21：630-636(2000)，在此将其引入以作参考。在一些实施方案中，使用全长CD8α-链。但是，在一些实施方案中，缺失了胞质结构域。优选保留跨膜结构域和细胞外结构域。

本领域技术人员可以理解，如果需要，CD8α链的跨膜结构域可以与其它分子的跨膜结构域交换，以修饰细胞外结构域与靶细胞表面的缔合。在此实施方案中，将编码CD8α链细胞外结构域的核酸可操作性地连接于编码跨膜结构域的核酸。本发明中可以使用任何跨膜蛋白的跨膜结构域。或者可以使用不知道会在跨膜蛋白中发现的跨膜结构域。在此实施方案中，“合成的跨膜结构域”含有大约20-25个疏水氨基酸，其后是至少一个且优选两个带电氨基酸。在一些实施方案中，通过本领域常用技术将CD8细胞外结构域连接于靶细胞膜。优选的CD8α-链序列见下表所示，并且包括氨基酸序列或编码全长CD8α-链的核酸序列的全长序列的登录号，所述全长CD8

α-链来自以下物种：人、小鼠、大鼠、猩猩(Orangutan)、蜘蛛猿(spider monkey)、豚鼠、牛、刚毛棉鼠(Hispid cotton rat)、家猪和猫。在登录号内包括的序列在此引入以作参考。

CD8α-链序列

物种	登录号
		人(Homo sapiens)	NM_001768，M27161，和NM_171827
猩猩(Pongo pygmaeus)	X60223
		小鼠(Mus musculus)	XM_132621，BC030679和U34881
大鼠(Rattus norveticus)	NM_031538
		豚鼠(Cavia porcellus)	AY303773
牛(Bos Taurus)	NM_174015
		家猪(Sus scrofa)	AY517855
猫(Felis catus)	D16536

刚毛棉鼠(Sigmodon hispidus)	AY065643
		常见的松鼠猴(Saimiri sciureus)	AJ130818

在优选的实施方案中，CD8α-链不是融合蛋白，而是其中缺失了胞内结构域的截短蛋白。如图1A-B描述的，人CD8α-链基因表达235个氨基酸的蛋白。可以考虑将蛋白分成下列结构域(在多肽的氨基端开始并在羧基端结束)：信号肽(氨基酸1-21)；免疫球蛋白(Ig)样结构域(大约氨基酸22-136)；膜近侧茎区(stalk region)(氨基酸137-181)；跨膜结构域(氨基酸183-210)和胞质结构域(氨基酸211-235)。编码这些不同结构域的编码序列的核苷酸包括：编码信号肽的1-63，编码细胞外结构域的64-546，编码胞内结构域的大约547-621和编码胞内结构域的大约622-708。同样地，也可将小鼠序列分成如下结构域。可将多肽分成包括氨基酸1-27的信号肽序列，包括大约氨基酸28-194的细胞外结构域，包括大约氨基酸195-222的跨膜结构域和包括大约氨基酸223-310的胞内结构域。相似地，编码这些结构域的编码序列的核苷酸包括编码信号肽的核酸1-81，编码细胞外结构域的大约82-582，编码跨膜结构域的大约583-666和编码胞内结构域的大约667-923。

在一些实施方案中，基因转移载体中包括编码全长蛋白质的核酸。在其它实施方案中，在基因递送载体的多核苷酸中不包括编码胞内结构域的核酸，导致膜锚定蛋白缺少胞内结构域。在其他物种包括优选实施方案的小鼠中，也可以鉴定出对应的结构域。

本领域的技术人员也会理解，与上述多肽基本同源的免疫调节分子可有利地用于本发明。因此，例如，“CD8多肽”也包含与图1A所示核苷酸编码的多肽具有至少大约80％序列同一性、通常至少大约85％序列同一性、优选至少大约90％序列同一性、更优选至少大约95％序列同一性且最优选大约98％序列同一性的同源多肽。

“编码CD8的核酸分子”和其同义词指图1A所示的人CD8的核苷酸序列，以及与图1A所示核苷酸有至少80％序列同一性、通常至少大约85％序列同一性、优选至少大约90％序列同一性、更优选至少大约95％序列同一性且最优选大约98％序列同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有图1A所示序列的多肽。

如前所述，可以使用许多不同程序鉴定是否蛋白质或核酸与已知序列具有序列同一性或相似性。序列同一性和/或相似性用本领域已知的标准技术确定，所述技术包括但不限于：Smith&Waterman的局部序列同一性算法，Adv.Appl.Math.2：482(1981)，Needleman&Wunsch的序列同一性比对算法，J.Mol.Biol.48：443(1970)，Pearson&Lipman的搜索相似性的方法，PNAS USA85：2444(1988)，这些算法的计算机工具(implementation)(在Wisconsin遗传软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，W1)，Devereux等描述的Best Fit序列程序，Nucl.Acid Res.12：387-395(1984)，优选地使用缺省设置或通过检查。优选地，用以下列参数为基础的FastDB计算同一性百分比：错配罚分为1；缺口罚分为1，缺口大小罚分为0.33；和连接罚分为30，″CurrentMethods in Sequence Comparison and Analysis，″Macromolecule Sequencingand Synthesis，Selected Methods and Applications，pp127-149(1988)，Alan R.Liss，Inc。

有用的算法的一个例子是PILEUP。使用累加的(progressive)成对比对，PILEUP创造了一组相关序列的多序列比对。它也可以绘制表示聚类关系的树图用于创建比对。PILEUP使用Feng&Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)的累加对比方法的简化方式；该方法与Higgins&Sharp CABIOS 5：151-153(1989)描述的方法相似。有用的PILEUP参数包括缺省的缺口权重(weight)为3.00，缺省的缺口长度权重为0.10，和加权的(weighted)末端缺口。

有用的算法的另一个例子是BLAST算法，见Altschul et al.，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)和Karlin et al.，PNAS USA 90：5873-5787(1993)所述。特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其来自Altschul et al.，Methodsin Enzymology，266：460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html]。WU-BLAST-2使用几个搜索参数，其大多数设置成缺省值。可调节的参数用如下值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字符阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，它们是程序本身根据具体序列的组成和进行目的序列搜索的具体数据库的组成而建立的，但是，可以调节所述值以增加灵敏度。

另一个有用的算法是Altschul et al.Nucleic Acids Res.25：3389-3402报道的缺口BLAST。缺口BLAST使用BLOSUM-62取代得分(substitutionscore)；阈值T参数设为9；双击方法以触发非缺口延伸；缺口长度为k扣(charge a cost)10+k分；Xu设为16，且Xg在数据库搜索阶段设为40而在算法输出阶段设为67。由对应于～22位(bit)的得分来触发缺口比对。

氨基酸或核酸序列同一性％值通过匹配的相同残基数除以比对区中“较长”序列的残基总数来确定。“较长”的序列是在比对区中具有最多实际残基的序列(为最大化比对得分而由WU-BLAST-2引入的缺口被忽略)。

比对可以包括在被对比的序列中引入缺口。此外，对于比图1A所示核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列含有更多或者更少氨基酸的序列，在一个实施方案中理解，序列同一性的百分比根据将相同的氨基酸数与氨基酸总数相比来确定。因此，在一个实施方案中，例如对于比图1A的核苷酸所编码的多肽的序列短的序列，如下面讨论的，其序列同一性使用较短序列的氨基酸数来确定。在同一性百分比计算中，对于序列变异的各种表现如插入、删除、取代等不指定(assign)相对权重。

在一个实施方案中，只有同一性得正分(+1)，包括缺口在内的所有形式的序列变异得分为“0”，其避免了在序列相似性计算中对下述加权的尺度(scale)或参数的需要。计算序列同一性百分比，可以例如，用匹配的相同的残基数除以比对区中“较短”序列的残基总数，再乘以100。“较长”的序列是在比对区中具有最多实际残基的序列。

与图1A的核苷酸所编码的多肽具有低于100％的序列同一性的CD8，通常用除人类以外的其他物种的天然CD8核苷酸序列，以及人或非人来源的天然CD8核苷酸序列的变体来制备。在这点上，可以注意到许多技术是本领域公知的，可以按常规使用这些技术来制备天然CD8序列的核苷酸序列变体，并测定那些变体的多肽产物中通常与天然CD8多肽相关的至少一种活性的存在。在优选的实施方案中，CD8α-链来自人类，但是如表2所示，来自大鼠、小鼠、和灵长类的CD8α-链是已知的并且也用于本发明中。

具有CD8活性的多肽可以比图1A的核苷酸所编码的多肽短或长。因此，在优选实施方案中，CD8多肽的定义包括图1A的核苷酸所编码的多肽的部分或片段。在这里的一个实施方案中，如上所述，如果图1A的核苷酸所编码的多肽的片段a)具有至少所示的序列同一性；和b)优选具有天然存在的CD8的生物活性，则认为它们是CD8多肽。

此外，如下面更详细描述的，可以制备比图1A的核苷酸所编码的多肽长的CD8α-链；例如，通过添加其他融合序列，或通过对附加的编码和非编码序列的说明。

优选CD8多肽是重组的。“重组的多肽”是用重组技术，即如下所述通过表达重组核酸来制备的多肽。在优选的实施方案中，本发明的CD8通过表达图1A所示的核酸序列或其片段来制备。重组多肽与天然存在的蛋白质有至少一个或多个特性不同。例如，可以将多肽与在野生型宿主中通常与其缔合的一些或全部蛋白质和化合物分离或纯化，因此所述多肽基本上是纯的。例如，分离的多肽不掺杂(unaccompany)至少某些在天然状态通常与其缔合的物质，优选组成在已知样品中占总蛋白质重量至少大约0.5％，更优选至少大约5％。基本纯的多肽占总多肽重量的包括至少大约75％，优选至少大约80％，且具体优选至少大约90％。所述定义包括在不同的生物或宿主细胞中制备来自一种生物体的CD8多肽。

或者，可以制备明显高于常见浓度的多肽，通过使用可诱导的启动子或高表达启动子，可以使多肽以升高的浓度水平制备。或者，多肽可以不是通常天然发现的形式，因为如下面讨论引入了氨基酸取代、插入和缺失。

在一个实施方案中，本发明提供核酸CD8变体。这些变体属于三类中的一种或多种：取代的，插入的或缺失的变体。这些变体的制备一般通过在图1A的核苷酸中作核苷酸定点诱变，使用盒式诱变或PCR诱变或本领域公知的其他技术，来制备编码变体的DNA，所述变体包括在基因治疗载体中和此后表达DNA的变体。氨基酸序列变体的特征为变异的预先决定性，使它们与CD8氨基酸序列的天然存在的等位基因变异或种间变异分开。所述变体一般表现出与天然存在的类似物相同性质的生物学活性，但也可以选择如下面更详细描述的具有改变特性的变体。

虽然预先确定了引入序列变异的位点或区域，但突变本身不需预先确定。例如，为了在已知位点使突变的效果最优化，可以在靶密码子或区域进行随机突变，并筛选具有最优化的所需活性的表达变体。在具有已知序列的DNA的预先确定位点进行取代突变的技术是公知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。制备变体技术的另一个例子是基因改组方法，因此使核苷酸序列的相似变体的片段重组以产生新的变体组合。这种技术的例子见美国专利5,605,703；5,811,238；5,873,458；5,830,696；5,939,250；5,763,239；5,965,408；和5,945,325，在此将其每一个全部引入以作参考。

氨基酸取代通常是单个残基的；插入通常约为大约1-20个氨基酸的级别，但可以允许相当大的插入。缺失在大约1至大约20个残基的范围，但在某些情况下缺失可以更大，且可以包括胞质结构域或其片段。

可以使用取代、缺失、插入或它们的任何组合以获得最终的衍生物。一般地，在几个氨基酸上进行这些改变以使分子的改变降到最低。但是，在某些情况下可以允许更大的改变。当希望CD8的特性发生小改变时，一般按照下表进行取代：

图表1

原始残基	取代举例
		Ala	Ser
Arg	Lys
		Asn	Gln，His
Asp	Glu
		Cys	Ser
Gln	Asn
		Glu	Asp
Gly	Pro
		His	Asn，Gln
Ile	Leu，Val
		Leu	Ile，Val
Lys	Arg，Gln，Glu
		Met	Leu，Ile
Phe	Met，Leu，Tyr
		Ser	Thr
Thr	Ser
		Trp	Tyr
Tyr	Trp，Phe
		Val	Ile，Leu

通过选择比图表1所示的取代保守性低的取代进行功能或免疫学特性的实质改变。例如，可以进行有更明显影响的取代：在改变区内多肽骨架的结构，例如α螺旋或β片层结构；在靶位点的分子的电荷或疏水性；或者侧链的大小。一般希望产生多肽特性上最大改变的取代是那些其中(a)亲水性残基，例如丝氨酰或苏氨酰取代(或被取代为)疏水性残基，例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代(或被取代为)任何其他残基；(c)具有带正电侧链的残基，例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰取代(或被取代为)带负电的残基，例如谷氨酰或天门冬氨酰；或者(d)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸，取代(或被取代为)没有侧链的残基例如甘氨酸。

尽管按照需要也选择变体以改变CD8特性，但是变体一般与天然存在的类似物一样表现出同样性质的生物学活性并引起同样的免疫应答。或者，可以设计变体以改变蛋白质的生物学活性。

在本发明范围里包括的多肽的一种共价修饰类型包括改变多肽的天然糖基化模式。“改变天然的糖基化模式”在这里目的是指缺失一个或多个发现于天然CD8多肽序列中的糖部分，和/或添加一个或多个天然序列多肽中不存在的糖基化位点。

向多肽添加糖基化位点可以通过改变其氨基酸序列实现。例如，所述改变的进行可以通过向天然多肽序列添加、或取代成一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)来实现。所述氨基酸序列可选通过在DNA水平的变化来改变，具体是通过在预先选好的碱基处突变编码多肽的DNA，以致产生翻译成所需氨基酸的密码。

去除多肽上存在的碳水化合物部分可以通过对编码作为糖基化靶点的氨基酸残基的密码子作突变取代来实现。

一旦重组核酸从其天然来源中分离，例如包含在质粒或其他载体或从中切成线性核酸片段，重组核酸可以进一步用作探针以鉴定和分离其他核酸。重组核酸也可以被用作“前体”核酸以制备经修饰的或变体核酸和蛋白质。也可以按照这里描述的将其掺入载体或其他递送载体以治疗靶细胞。

表达载体

在本发明的上下文中，可以使用任何合适的表达载体。如本领域的技术人员所理解的，“载体”是基因转移的工具。本发明的表达载体包括但不局限于质粒，噬菌体，病毒，脂质体，等等。本发明的表达载体优选包含附加的序列和突变。具体地，如本文所限定的，本发明的表达载体包含核酸，其包含编码免疫调节分子的转基因，具体是CD8α-链。另外，核酸可以包括全部或部分合成制备的编码序列或其它遗传序列或者基因组的或互补DNA(cDNA)的序列，并可以DNA或者RNA的形式提供。

可以将编码自身抗原的基因移入或移出病毒载体或杆状病毒或合适的原核或真核表达载体，以表达mRNA并制备蛋白质，并评价其他生化特性。

对于制备本发明的载体(包括重组腺病毒载体和转移载体)，可以用标准的分子和遗传技术，例如本领域技术人员已知的那些技术，来构建这种载体。可以用适当的细胞系中的病毒载体制备包含病毒体或病毒颗粒的载体(例如重组腺病毒载体)。类似地，包含一个或多个嵌合外壳蛋白的颗粒可以在标准细胞系中制备，例如腺病毒载体常用的那些细胞系。如果需要，那么这些得到的颗粒可以靶向特异的细胞。

可以使用任何合适的表达载体(例如Pouwels et al.，Cloning Vectors：ALaboratory Manual(Elsevior，N.Y.：1985)所描述的)和相应的合适的宿主细胞来在宿主细胞中制备重组的肽或蛋白。表达宿主包括但不局限于细菌，所述细菌属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属，哺乳动物或昆虫的宿主细胞系统，包括杆状病毒系统(例如，如Luckow et al.，Bio/Technology，6，47(1988)所描述的)，和建立的细胞系，例如COS-7，C127，3T3，CHO，HeLa，BHK，等等。按照本发明制备嵌合蛋白(肽)的具体优选的表达系统是杆状病毒表达系统，其中Trichoplusia ni，Tn 5B1-4昆虫细胞，或其他合适的昆虫细胞可用于制备高水平的重组蛋白。当然，普通技术人员知道根据所产生肽的类型对表达宿主的选择是不同的。例如，在酵母或哺乳动物细胞(例如COS-7细胞)中产生的肽的糖基化与在细菌细胞诸如埃希氏大肠杆菌中产生的肽是不同的。

在一个优选实施方案中，所述蛋白在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达系统也是本领域已知的，并包括逆转录病毒的和慢病毒的系统。哺乳动物启动子是任何能结合哺乳动物RNA聚合酶并起动蛋白质编码序列向下游(3’)转录成mRNA的DNA序列。启动子可以有通常位于靠近编码序列5’端的转录起始区，和TATA盒，其利用定位在转录起始位点上游的25-30个碱基对。认为TATA盒指导RNA聚合酶II在正确位点开始RNA合成。哺乳动物启动子也含有上游启动子元件(增强子元件)，通常位于TATA盒上游100-200个碱基对以内的地方。上游启动子元件决定转录起动速率并可以在任何方向起作用。具体用作哺乳动物启动子的是来自哺乳动物病毒基因的启动子，因为病毒基因经常高表达并具有广泛的宿主范围。例子包括SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子，腺病毒主要晚期启动子，单纯疱疹病毒启动子，和CMV启动子。

一般地，由哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于翻译终止密码子3’端的调节区，因此，所述调节区与启动子元件一起，位于免疫调节分子和自身抗原表位的插入子的编码序列旁侧。成熟mRNA的3’末端通过位点特异的翻译后裂解和聚腺苷酸化来形成。转录终止子和聚腺苷酸化信号的例子包括源自SV40的那些。

向哺乳动物宿主以及其他宿主中导入外源核酸的方法是本领域公知的，并可以依使用的宿主细胞而变化。所述技术包括葡聚糖介导的转染，磷酸钙沉淀法，1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染，原生质体融合，电穿孔，病毒感染，将多核苷酸包裹在脂质体中，和直接向细胞核中显微注射DNA。

也可以使用本领域公知的技术将蛋白质制成融合蛋白。因此，例如，可以将蛋白质制成融合蛋白以增加表达，或因为其他原因。例如，当蛋白质是肽时，为了表达目的，可以如本文所述将编码肽的核酸与其他核酸连接。在优选的实施方案中，表达自身抗原的表位时，蛋白质被表达为融合蛋白以确保适当的靶向和加工。也就是说，含表位的多肽被表达为包含加工序列的融合蛋白，所述加工序列如使多肽靶向分泌途径的信号序列。融合蛋白也可包括跨膜结构域来将含自身抗原表位的多肽固定在细胞膜上，从而免疫调节分子和自身抗原的表位在细胞表面共表达。

为测试CD8或自身抗原，在表达后纯化或分离蛋白质。依据样品中存在的其它成分，可用本领域技术人员已知的许多方法将蛋白质分离或纯化。标准的纯化方法包括电泳技术，分子技术，免疫学技术和层析技术，其中层析包括离子交换层析，疏水层析，亲和层析，和反相HPLC层析，和层析聚焦。例如，可以使用标准的抗CD8抗体柱将CD8蛋白纯化。也使用与蛋白质浓缩结合的超滤和渗滤技术。对于合适的纯化技术中一般的指导说明参见Scopes，R.，Protein Purification，Springer-Verlag，NY(1982)。必需的纯化程度会依据CD8蛋白的使用而改变。在某些情况下纯化不是必需的。在某些情况下在细胞表面检测CD8和/或自身抗原的表达，例如通过抗体结合并经荧光或通过荧光活化的细胞分选(FACS)来检测。

可以将编码CD8的核酸分子和自身抗原以及来源于CD8核酸的编码链或者非编码链的任何核酸分子以本领域已知和常用的各种方式与靶细胞接触，其中所述接触可以先体外后体内或在体内进行。

对病毒粘附、进入和基因表达的评价最初可以通过利用含有目的插入子的腺病毒载体以产生表达所需蛋白质或RNA和标记基因例如β-半乳糖苷酶的重组病毒。在用含β-半乳糖苷酶基因(Ad-LacZ)的腺病毒感染的细胞中，β-半乳糖苷酶的表达可以早在向细胞加入Ad-Gluc后两小时检测到。此方法提供对重组病毒进入细胞和基因表达的快速有效分析，并是使用传统技术的普通技术人员容易使用的。

使用本发明编码蛋白质的核酸，可以制备各种表达载体。表达载体可以是自我复制的染色体外载体，或是整合到宿主基因组中的载体。一般地，这些表达载体包括转录和翻译的调节核酸，其可操作地连接于编码蛋白质的核酸。术语“控制序列”指在具体宿主生物内表达可操作连接的编码序列所必需的转录和翻译的调节核酸序列。适合原核细胞的控制序列，例如，包括启动子，任选操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞会利用启动子、聚腺苷酸化信号、和增强子。

当核酸与另一核酸序列产生功能上的关联时，该核酸与所述另一核酸序列是“可操作连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA在表达为参与多肽分泌的前蛋白时，编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码该多肽的DNA是可操作连接的；在启动子或增强子影响编码序列的转录时，所述启动子或增强子与该编码序列是可操作连接的；或在核糖体结合位点处在促进翻译的位置时，它与编码序列是可操作连接的。另一个例子是，可操作连接指相连从而邻接的DNA序列，而且，在分泌性前导序列的情况下，是邻接并处在同一个阅读框中的。但是，增强子不必是邻接的。连接可通过在便利的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这类位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。转录和翻译的调节核酸一般适合于用来表达CD8和自身抗原的宿主细胞；例如，优选使用人的转录和翻译的调节核酸序列来在人类细胞中表达CD8和自身抗原。对各种宿主细胞，本领域已知多种合适的表达载体和适合的调节序列。

通常，转录和翻译的调节序列可以包括但不局限于：启动子序列，核糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，和增强子或激活子序列。在优选的实施方案中，所述调节序列包括启动子和转录的起始和终止序列。

启动子序列编码组成性或者可诱导性的启动子。所述启动子可以是天然存在的启动子或者杂合启动子。结合一个以上启动子元件的杂合启动子，也是本领域已知的，并且在本发明中是有用的。

此外，表达载体可以包括额外的元件。例如，所述表达载体可以具有两套复制系统，因此允许其保留在两种生物中，例如在哺乳动物的或昆虫的细胞中表达和在原核宿主中克隆和扩增。而且，对于整合型表达载体，表达载体含有至少一个与宿主细胞基因组同源的序列，并优选在表达构建体旁侧的两个同源序列。通过选择载体中包含的合适的同源序列，可以将整合载体定向到宿主细胞内的特定位点。整合载体的构建体是本领域公知的。

在进一步的实施方案中，所述表达载体可以含有可选择的标记基因以允许选择经转化的宿主细胞。选择性基因是本领域公知的，并且根据使用的宿主细胞而不同。

优选地，载体是病毒载体，例如腺病毒载体，腺伴随病毒载体，疱疹病毒载体或逆转录病毒载体等。最优选地，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可以源于任何腺病毒。“腺病毒”是腺病毒科(the family Adenoviridae)的、理想的是哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属(例如哺乳动物腺病毒)或者禽腺病毒(Aviadenovirus)属(例如禽类的腺病毒)的任何病毒。腺病毒是任何血清型的。可以用作腺病毒来源的腺病毒原种(stock)可以从目前可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，Md.)获得的腺病血清型1到47扩增，或者可从任何其他来源的任何其他腺病毒血清型扩增得到。例如，腺病毒可以是A亚型(例如血清型12，18，和31)，B亚型(例如血清型3，7，11，14，16，21，34，和35)，C亚型(例如血清型1，2，5，和6)，D亚型(例如血清型8，9，10，13，15，17，19，20，22-30，32，33，36-39，和42-47)，E亚型(例如血清型4)，F亚型(例如血清型40和41)，或任何其他腺病毒血清型。但是优选地，腺病毒是血清型2、5、或9。有利地，腺病毒包括同种血清型的外壳蛋白(例如五邻体基质(penton base)，六邻体，和/或尾丝)。然而，也优选地，一个或多个外壳蛋白可以是嵌合的，在此意义上，例如，全部或部分已知的外壳蛋白可以来自另一种血清型。

尽管优选是腺病毒载体的病毒载体可以有复制能力，但是优选地，病毒载体是复制缺陷的或条件性复制缺陷的。例如，优选是腺病毒的病毒载体包含具有使病毒复制缺陷的至少一个修饰的基因组。对病毒基因组的修饰包括但不局限于：DNA片段的缺失，DNA片段的添加，DNA片段的重排，DNA片段的取代，或DNA损伤的引入。DNA片段可以是小至一个核苷酸或大至36千碱基对，即接近腺病毒基因组的大小，或38千碱基对，这是能被包装腺病毒体(adenoviral virion)中的最大量。

对病毒基因组具体是腺病毒基因组的优选修饰包括，除了使病毒复制缺陷的修饰外，插入编码本文定义的免疫调节分子的转基因，另外并优选至少一种编码目的治疗分子的转基因。病毒，例如腺病毒，也优选可以是共整合体(cointegrate)，即病毒的例如腺病毒的基因组序列与其它序列的连接，所述其它序列例如质粒、噬菌体或其他病毒的序列。

对于腺病毒载体(具体是复制缺陷的腺病毒载体)而言，这种载体可以包含完整的衣壳(即包含病毒基因组例如腺病毒基因组)或者空衣壳(即其中病毒基因组例如通过物理的或化学的方法而缺失或降解)。优选地，病毒载体包含完整的衣壳，即作为携带编码免疫调节分子的转基因的工具，并且选择地和优选地包含至少一种编码抑制手段的转基因。或者，优选地，所述转基因可以在腺病毒衣壳的外面携带入细胞。

鉴于将病毒例如腺病毒靶向具体细胞是优选的或理想的，可以基本上将所述病毒用作将质粒DNA转移入细胞中的内体裂解剂(endosomolyticagent)，其中质粒DNA包含标记基因并与共价结合于细胞结合配体如转铁蛋白的聚赖氨酸复合并浓集(Cotten et al.，PNAS(USA)，89，6094-6098(1992)；和Curiel et al.，PNAS(USA)，88，8850-8854(1991))。已经证实转铁蛋白-聚赖氨酸/DNA复合物与腺病毒的偶联(例如，通过针对腺病毒的抗体，利用转谷氨酰胺酶，或经生物素/链霉抗生物桥)基本促进了基因转移(Wagner et al.，PNAS(USA)，89，6099-6103(1992))。

或者，对一种或多种病毒外壳蛋白(例如腺病毒尾丝)的修饰，例如可以通过掺入细胞表面受体的配体的序列或者允许结合双特异性抗体的序列(即一端对尾丝有特异性而另一端对细胞表面受体有特异性的分子)(PCT国际专利申请WO 95/26412(第412申请)和Watkins et al.，″TargetingAdenovirus-Mediated Gene Delivery with Recombinant Antibodies，″Abst.No.336)。在两种情况下，通常的尾丝/细胞表面受体相互作用被取消，而病毒例如腺病毒通过其尾丝重新指向新的细胞表面受体。

或者，可以将能特异性结合于所选细胞类型的靶向元件偶联于高亲和力结合对的第一个分子，并施用给宿主细胞(PCT国际专利申请WO95/31566)。然后，可以向宿主细胞施用偶联于高亲和力结合对的第二个分子的基因递送载体，其中第二个分子能特异性结合第一个分子，使得基因递送载体靶向所选择的细胞类型。

同样，因为例如电穿孔、转化、三亲杂交的接合(conjugation of triparentalmating)、(共)转染、(共)感染、膜融合、微粒轰击的使用、与磷酸钙-DNA沉淀一同保温、直接显微注射等方法对于以核酸序列(即RNA或DNA)形式转移病毒、质粒和噬菌体是可用的，所以在缺乏任何缔合蛋白例如衣壳蛋白和缺乏任何被膜脂质情况下，载体同样可以包含RNA或DNA。

相似地，由于脂质体通过与细胞膜融合实现进入细胞，所以载体可以包含带有编码外壳蛋白的组成性核酸的脂质体。这种脂质体是可商业得到的，例如，从Life Technologies，Bethesda，Md.得到，并且可以按照生产商的建议使用。而且，可以将脂质体用于实现基因递送，并且可以使用具有增强的转移能力和/或降低的体内毒性的脂质体。在按照生产商说明制备脂质体后或者在脂质体制备过程中，可以将可溶的嵌合外壳蛋白(按照这里描述的方法制备的)加入脂质体。

按照发明的载体不仅限于那些能用于发明方法的载体，而且包括中间型载体(例如“转移载体”)，所述载体可用于基因转移载体的构建。

体内递送一种或多种核酸序列的优选方法之一包括腺病毒表达载体的使用。“腺病毒表达载体”指包含腺病毒序列的那些构建体，所述序列足以(a)支持构建体的包装和(b)以有义或反义方向表达已克隆到其中的多核苷酸。当然，在反义构建体情况下，表达不需要合成基因产物。

表达载体包含腺病毒的遗传改造的形式。对36kb、线性、双链的DNA病毒-腺病毒的遗传构造的认识，允许用最大7kb的外源序列来取代腺病毒DNA的大片段(Grunhaus and Horwitz，1992)。与逆转录病毒相反，腺病毒感染宿主细胞不导致染色体整合，因为腺病毒DNA能以无潜在遗传毒性的附加体方式复制。而且，腺病毒结构稳定，大量扩增后未检测到基因组重排。实际上腺病毒可以感染所有上皮细胞，无论它们处于何细胞周期阶段。迄今为止，在人类腺病毒感染似乎只与轻微的疾病例如急性呼吸道疾病有关。

由于腺病毒的基因组大小中等、易于操作、滴度高、靶细胞范围广泛并且感染性高，它特别适合于用作基因转移载体。病毒基因组的两端都含有100-200个碱基对的反向重复(ITRs)，该反向重复是病毒DNA复制和包装必需的顺式元件。基因组的早期(E)区和晚期(L)区含有由病毒DNA复制的出现所分开的不同转录单位。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组和一些细胞基因的转录的蛋白质。E2区(E2A和E2B)的表达可合成用于病毒DNA复制的蛋白质。这些蛋白质参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(shut-off)(Renan，1990)。包括大部分病毒衣壳蛋白的晚期基因的产物，只在主要晚期启动子(MLP)启动(issued)的单个初始转录物的明显加工后表达。MLP(位于16.8m.u.)在感染的晚期是特别有效的，并且所有由该启动子启动的mRNA具有5’-三联前导序列(TPL)，该序列使它们成为翻译优选的mRNA。

在目前的系统中，重组腺病毒由穿梭载体和原病毒载体的同源重组产生。由于两种原病毒载体间可能重组，此方法可产生野生型腺病毒。因此，从各个噬菌斑分离病毒的单个克隆并检测其基因组结构是关键的。

复制缺陷的腺病毒载体的产生和增殖依靠特定的辅助细胞系。天然地，腺病毒可以包装野生型基因组的大约105％(Ghosh-Choudhury et al.，1987)，提供额外的大约2kBDNA的容量。加上在E1和E3区中可置换的大约5.5kBDNA，目前腺病毒载体的最大容量低于7.5kB，或者是载体总长度的大约15％。80％以上的腺病毒基因组仍存在于载体骨架中，并且是载体携带的细胞毒性的来源。而且，E1-缺失的病毒的复制缺陷是不完全的。例如，用目前可得到的载体以高感染复数(MOI)使用时，已经观察到病毒基因表达的渗漏(leakage)(Mulligan，1993)。

辅助细胞系可以源自人类细胞例如人类胚胎肾细胞，肌肉细胞，造血细胞或其他人类胚胎的间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可以源自容许人类腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。这种细胞包括例如，Vero细胞或其他猴胚胎的间充质细胞或上皮细胞。如上所述，目前优选的辅助细胞系是293。

最近，Racher等(1995)公开了培养293细胞和繁殖腺病毒的改良方法。在一种形式中，通过将单个细胞接种于含有100-200毫升培养基的1升硅化处理的旋动培养瓶(spiner flask)(Techne，Cambridge，UK)中使天然细胞聚集物生长。在40rpm搅拌后，用台盼兰估计细胞生存力。在另一种形式中，如下使用Fibra-Cel微载体(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。将重悬于5毫升培养基的细胞接种物加入在250毫升Erlenmeyer培养瓶中的载体(50毫升)中并静置1-4小时，时而摇动。然后将培养基换成50毫升新鲜培养基并开始摇动。对于病毒产生，允许细胞生长至大约80％汇合的，此后更换培养基(至终体积的25％)并将腺病毒以0.05MOI加入。将培养物静置过夜，随后将体积增加至100％并开始摇动72小时。

在优选实施方案中，腺病毒是本领域已知的“无内容(gutless)”腺病毒。“无内容”腺病毒载体是最近开发的用于腺病毒基因递送的系统。腺病毒的复制需要辅助病毒和特别的表达Ela和Cre的人类293细胞系，这种情况在天然环境中是不存在的。在目前最有效的系统中，使用带有包装信号的E1-缺失的辅助病毒，所述包装信号两侧加上了噬菌体P1 loxP位点(“在序列两侧加上loxP位点(floxed)”)。由于辅助病毒DNA中缺失了包装信号，所以用无内容病毒和带有在序列两侧加上loxP位点的包装信号的辅助病毒来感染表达Cre重组酶的辅助细胞，应该只产生无内容的rAV。但是，如果使用以293为基础的辅助细胞，那么辅助病毒DNA可以与整合到辅助细胞DNA中的Ad5DNA重组。结果，重新获得野生型包装信号以及E1区。因此，如果使用E1-缺失的辅助病毒，在基于293(或911)的辅助细胞中无内容的rAV的产生也能导致RCA的产生。

所有病毒基因都从载体中除去。因此该载体是非免疫原性的，并且如果需要可以重复使用。“无内容”腺病毒载体还含有36kb的空间以接纳转基因，因此允许向细胞共同递送大量基因。可以将具体的序列基序例如RGD基序插入腺病毒载体的H-I环以增强它的感染性。腺病毒重组体通过将具体的转基因或转基因片段克隆到任何腺病毒载体中来构建，所述腺病毒载体例如这里描述的和本领域已知的那些。可以将腺病毒重组体以非侵入方式转导脊椎动物的表皮细胞以用作免疫药剂。

对于异源DNA的大插入子的插入，“无内容”腺病毒的使用特别有优势(综述参见Yeh.and Perricaudet，FASEB J.11：615(1997))，在此将其引入以作参考。此外，无内容腺病毒载体及其制备和使用方法见美国专利6,156,497和6,228,646更详细的描述，在此将其都引入以作参考。

除了需要腺病毒载体是复制缺陷的或是至少条件性缺陷的以外，据认为腺病毒载体的性质对发明成功实施并不重要。腺病毒可以是42种不同的已知血清型或A-F亚群中的任一种。为了获得用于本发明的条件性复制缺陷的腺病毒载体，C亚群的5型腺病毒是优选的起始物质，因为5型腺病毒是人类腺病毒，它的大量生物化学的和遗传的信息是已知的，并且它过去曾用于使用腺病毒作为载体的大多数构建方法中。

如上所述，本发明的常用载体是复制缺陷的并且没有腺病毒E1区。因此，在缺失E1编码序列的位置引入编码免疫调节分子和/或额外的目的治疗蛋白的转基因很方便。然而，表达构建体在腺病毒序列中插入的位置对发明不重要。目的转基因也可以插入E3置换载体中以取代缺失的E3区，如Darlsson等(1986)描述，或者在辅助细胞系或辅助病毒补充E4缺陷的情况下插入E4区中。

腺病毒在体外和体内易于生长和操作并表现出广范的宿主范围。这组病毒可以高滴度例如每毫升10⁹-10¹¹个空斑形成单位来获得，而且它们是高度感染性的。腺病毒的生活周期不需要整合到宿主细胞基因组中。由腺病毒载体递送的外源基因是附加型的，因此对宿主细胞具有低遗传毒性。在用野生型腺病毒疫苗接种的研究中没有对于副作用的报道(Couch et al.，1963；Top et al.，1971)，这证明它们作为体内基因转移载体的安全性和治疗潜力。

腺病毒载体已经用于真核基因表达(Levrero et al.，1991；Gomez-Foix etal.，1992)和疫苗开发(Grunhaus and Horwitz，1992；Graham and Prevec，1992)。最近，动物研究提示重组腺病毒可用于基因治疗(Stratford-Perricaudet andPerricaudet，1991；Stratford-Perricaudet et al.，1990；Rich et al.，1993)。向不同组织施用重组腺病毒的研究包括气管滴注(Rosenfeld et al.，1991；Rosenfeldet al.，1992)，肌肉注射(Ragot et al.，1993)，外周静脉内注射(Herz and Gerard，1993)和向脑内的立体定向(stereotactic)接种(Le Gal La Salle et al.，1993)。

相应地，在优选实施方案中，这里使用的表达载体是腺病毒载体。合适的腺病毒载体包括人类腺病毒例如Ad2或Ad5的修饰物，其中已经除去了病毒在体内复制所必需的遗传元件例如E1区，并且将编码目的外源基因的表达盒插入腺病毒基因组中。

此外，如上所述，优选的表达载体系统是逆转录病毒载体系统，例如PCT/US97/01019和PCT/US97/01048中一般描述的，在此将其都引入以作参考。

逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征为通过逆转录过程在感染的细胞中将它们的RNA转变成双链DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得的DNA作为前病毒稳定整合到细胞染色体中，并指导病毒蛋白质的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其子代中。逆转录病毒基因组含有三个基因gag、pol、和env，其分别编码衣壳蛋白、聚合酶、和包膜成分。在gag基因上游发现的序列含有将基因组包装成病毒体的信号。两个长末端重复序列(LTR)存在于病毒基因组的5’和3’末端。它们含有强的启动子和增强子序列，并且也是整合入宿主细胞基因组所需要的(Coffin，1990)。

为了构建逆转录病毒载体，将编码一个或多个目的寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸被插入病毒基因组，取代某些病毒序列以产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，构建含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装成分的包装细胞系(Mann et al.，1983)。当将重组质粒(其含有cDNA)连同逆转录病毒LTR和包装序列引入该细胞系时(例如通过磷酸钙沉淀)，包装序列允许将重组质粒的RNA转录物包装入病毒颗粒，然后将所述病毒颗粒分泌到培养基中(Nicolas and Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann et al.，1983)。然后收集、可选浓缩含有重组逆转录病毒的培养基，并用于基因转移。逆转录病毒载体能感染广泛的细胞类型。但是整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.，1975)。

最近开发了设计使逆转录病毒载体具有特异靶向性的新方法，该方法以通过化学方法向病毒被膜添加乳糖残基的对逆转录病毒的化学修饰为基础。这种修饰可以允许经唾液酸糖蛋白受体来特异性感染肝细胞。

设计靶向重组逆转录病毒的不同方法，其中使用了抗逆转录病毒外壳蛋白和抗具体细胞受体的生物素化的抗体。使用链霉抗生物素经由生物素成分偶联所述抗体(Roux et al.，1989)。使用抗主要组织相容性复合物I类和II类抗原的抗体，证明了嗜亲性(ecotropic)病毒体外感染了对各种带有那些表面抗原的人类细胞(Roux et al.，1989)。合适的逆转录病毒载体包括LNL6，LXSN，和LNCX(见Byun et al.，Gene Ther.3(9)：780-8(1996)的综述)。

AAV(Ridgeway，1988；Hermonat and Muzycska，1984)是细小病毒，作为腺病毒原种的污染物而被发现。它是一种普遍的病毒(抗体存在于85％的美国人群中)，其不与任何疾病有关系。它也被分类为依赖病毒属，因为它的复制依赖于辅助病毒例如腺病毒的存在。已经分离了5种血清型，其中AAV-2是最具特征的。AAV有单链线性DNA，其被包裹在衣壳蛋白VP1，VP2和VP3内以形成直径20到24nm的二十面体病毒粒(Muzyczka andMcLaughlin，1988)。

AAV DNA大约是4.7千碱基长。它含有两个开放可读框并侧接两个ITR。在AAV基因组中有两个主要的基因：rep和cap。rep基因编码负责病毒复制的蛋白质，而cap编码衣壳蛋白VP 1-3。每个ITR形成T-形发夹结构。这些末端重复是AAV染色体整合的唯一必需的顺式元件。因此，可以将AAV用作除去了所有病毒编码序列并由基因盒取代以便进行递送的载体。已经鉴定了三种病毒启动子，并按照它们的图谱位置命名为p5，p19，和p40。从p5和p19转录会导致rep蛋白的产生，从p40转录产生衣壳蛋白(Hermonat and Muzyczka，1984)。

AAV由于其安全性也是递送载体的良好选择。拯救(rescue)机制是相对复杂的：转移(mobilize)rAAV不仅需要野生型腺病毒而且需要AAV基因。同样地，AAV是非致病的并且不与任何疾病相关。除去了病毒编码序列使对病毒基因表达的免疫反应降至最低，因此rAAV不引发炎症反应。其他涉及AAV的公开在美国专利申请6,531,456中提及，在此将其引入以作参考。

在本发明中可以使用其它病毒载体作为表达载体用于将免疫调节分子递送到宿主细胞。可以使用源于病毒例如痘苗病毒(Ridgeway，1988；Couparet al.，1988)、慢病毒、脊髓灰质炎病毒和疱疹病毒的载体。它们提供了对多种哺乳动物细胞有吸引力的多种特点(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar et al.，1988；Horwich et al.，1990)。

表达载体的递送

为了实现免疫调节分子(例如CD8α-链)和/或额外的治疗蛋白(如包含自身抗原的至少一个表位的多肽)的表达，必须将表达载体递送入细胞。这种递送可以用如转化细胞系的实验方法那样在体外完成，或如对某些疾病状态的治疗那样在体内或先体外后体内完成。如上所述，递送的一种优选机制是经由感染，其中核酸被包裹在重组病毒颗粒中。在优选的实施方案中，通过向患者全身施用载体，如通过注射或静脉内施用来完成递送。全身施用可导致免疫调节分子与包含表位的多肽在任何细胞内的共表达。也就是说表达不靶向具体的细胞种类。

一旦表达载体已递送入宿主细胞，可以将编码所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸定位在不同位点并表达。在某些实施方案中，编码构建体的核酸可以稳定整合到细胞基因组中。这种整合可以经同源重组(基因置换)在具体位置和方向进行，或者可以在随机的、非特异性位点整合(基因增加)。在进一步和优选的实施方案中，核酸可以作为分别的DNA附加型片段在细胞中稳定维持。这种核酸片段或“附加体”编码序列，所述序列足以允许独立于或同步于宿主细胞循环而进行维持和复制。表达载体递送入细胞的方式和在核酸在细胞中保留的位置取决于使用的表达载体的类型。

在发明的某些实施方案中，表达载体可以简单地由裸重组DNA或质粒组成。载体的转移可以通过上面提到的通过物理或化学方法使细胞膜通透的任何方法进行。这特别适用于体外转移，但也可用于体内使用。Dubenskyet al.(1984)向成年的和新生的小鼠肝脏和脾脏成功注射了磷酸钙沉淀形式的多瘤病毒DNA，证明活跃的病毒复制和急性感染。Benvenisty和Reshef(1986)也证明直接腹膜内注射磷酸钙沉淀的质粒会表达转染的基因。设想编码目的基因的DNA在体内也可以相似的方式转移并表达基因产物。

本发明向细胞转移裸DNA表达构建体的另一个实施方案可以包括粒子轰击。该方法依靠将DNA包被的微粒加速至高速的能力，使微粒穿过细胞膜并进入细胞而不杀伤细胞(Klein et al.，1987)。已经开发了加速小颗粒的几种装置。一种这样的装置依靠高电压发射来产生电流，电流接着提供动力(Yang et al.，1990)。使用的微粒一般含有生物学上的惰性物质例如钨或金珠。

在体内已经轰击了选定的器官，其包括大鼠和小鼠的肝，皮肤，和肌肉组织(Yang et al.，1990；Zelenin et al.，1991)。这可能需要组织或细胞的手术暴露，以减少在枪和靶器官之间的任何干扰组织，即，离体处理。此外，编码具体基因的DNA可以经此方法转移，并且仍包含在本发明中。

在本发明的一个优选实施方案中，通过脂质体介导的核酸转移将核酸分子导入靶细胞。关于这一点，许多以脂质体为基础的试剂是本领域熟知的，是可商业得到的，并且可以常规用于向靶细胞导入核酸分子。本发明的某些实施方案会使用阳离子脂质转移载体例如Lipofectamine或Lipofectin(Life Technologies)，二油酰磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)(DOPE)连同阳离子胆固醇衍生物(DC胆固醇)，N[1-(2，3-二油氧(dioleyloxy)丙基]-N，N，N-三甲铵氯化物(trimethylammonium chloride)(DOTMA)(Sioud etal.，J.Mol.Biol.242：831-835(1991))，DOSPA:DOPE，DOTAP，DMRIE:胆固醇，DDAB:DOPE等等。脂质体包裹的核酸的制备是本领域熟知的，并一般联用大约1∶1的脂类和核酸。

本发明的用途

如上面详细描述的，这里描述的和使用的方法和组合物可普遍应用于抑制对自身抗原的细胞和/或体液的自身免疫应答。按照本发明，通过调节(conditioning)宿主来表达CD8多肽，更优选CD8α-链和包含自身抗原的至少一个表位的多肽，可以延长表达自身抗原的细胞的存活而不需要长期的普通免疫抑制剂。CD8多肽和上述自身抗原表位的表达会导致有效和特异地抑制针对自身抗原的自身免疫应答。

不受理论所限，认为CD8在靶细胞上的表达赋予靶细胞诱导对宿主免疫系统“反抑效应”的能力。即，如上所述，当将表达CD8的细胞与宿主T细胞接触时，T细胞被下调或杀伤。相应地，通过“反抑”或“反抑效应”指靶细胞下调针对靶细胞或在靶细胞上表达的抗原的免疫应答的能力。认为反抑效应的诱导或转移必需CD8，具体是CD8α-链。“反抑效应的转移”指将反抑效应转移至正常情况不诱导反抑效应的细胞上。即，将减弱或下调对靶细胞的免疫应答的能力通过诱导或增加的CD8表达而赋予靶细胞。如这里第一次报道的，现在已经惊奇地发现靶细胞上CD8α-链的存在连同诱导的自身抗原表达或呈递，可以“反抑”自体反应的CD4⁺T细胞以及CD8⁺T细胞的活性，并因此可以抑制免疫应答的细胞和体液成分。

相应地，本发明可用于通过诱导反抑效应减弱对靶细胞的免疫应答。这导致可识别靶细胞的T细胞的下调和缺失。当靶细胞是表达自身抗原的细胞时，诱导反抑效应可防止宿主有自身免疫应答。

通常，当将CD8的表达用于自身免疫方案时，表达自身抗原的细胞的寿命可被显著延长，超过缺乏受试核酸时正常预期的时间更通常至少5天、更优选至少大约30天、甚至更优选大约3个月、最优选大约6个月到1年。表达自身免疫抗原的细胞的寿命延长的实际时间可以随方法的各种情况变化，具体取决于表达自身抗原的细胞。而且，如果CD8表达下降从而靶细胞被免疫应答识别，可以重复用含有CD8核酸的递送载体来处理。

体内递送包括但不局限于直接注入肌肉、器官，经导管，或通过输注的其他方式。可以血管内或全身施用核酸。本领域的技术人员会知道每种递送方式的优点和缺点。例如，直接注射可以在患者中产生核酸的最高滴度，但是核酸的分布可能在整个机体中不平均。全身施用如同肌肉内注射一样是优选的方法。可以通过单次施用或数次施用来引入核酸。不需过多实验，技术人员能判断令人满意的递送手段和递送方案。

可以将受试核酸用于广泛的宿主，具体是灵长类，更具体是人类，或家养动物。

本发明的方法和组合物的其他应用对本领域的技术人员是明显的。

表达载体的制剂和剂量

本领域的技术人员会理解有许多向动物施用表达载体(具体是腺病毒载体)的合适方法(见，例如，Rosenfeld et al.，Science，252，431-434(1991)；Jaffeet al.，Clin.Res.，39(2)，302A(1991)；Rosenfeld et al.，Clin.Res.，39(2)，311A(1991)；Berkner，BioTechniques，6，616-629(1988))，并且尽管施用可以使用不止一种途径，但是具体的途径比另一种途径能提供更及时更有效的反应。用在表达载体施用的可药用赋形剂和/或抑制免疫应答的方法对本领域的技术人员也是公知的，并是易于得到的。赋形剂的选择部分由用于施用表达载体的具体方法和抑制免疫应答的方法决定。相应地，本发明提供在适宜载体中的组合物，其包括单独或进一步与转基因组合的编码免疫调节分子(例如CD8α-链)的表达载体，并且有在本发明中使用的大量合适的配制剂。具体地，本发明提供组合物，其包括含有编码CD8α-链和至少一个自身抗原或其功能片段的基因的表达载体，和其载体。在可选择的实施方案中，所述表达载体还编码其它的目的治疗分子或蛋白例如抗炎分子。这种组合物还可包括其他活性物质，例如本领域已知的治疗性或预防性物质和/或免疫抑制剂。下面的方法和赋形剂仅作为例子，绝不是限制。

适合口服施用的制剂包括(a)液体溶液，例如有效量的溶解于稀释剂，例如水、盐水、或橙汁的化合物；(b)胶囊、囊剂(sachet)或片剂，各含有预定量的作为固体或颗粒的活性成分；(c)在合适液体中的悬液；和(d)合适的乳剂。片剂形式可包括一种或多种乳糖，甘露醇，玉米淀粉，马铃薯淀粉，微晶纤维素，阿拉伯胶，明胶，二氧化硅胶，交联甲羧纤维素钠(croscarmellosesodium)，滑石粉，硬脂酸镁，硬脂酸，和其他赋形剂，色素，稀释剂，缓冲剂，湿润剂，防腐剂，调味剂，和药理学相容的赋形剂。糖锭(lozenge)形式可包括调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶)中的活性成分，以及在惰性基质例如明胶和甘油中包含活性成分的锭剂(pastille)，除含有活性成分外，还含有例如本领域已知的赋形剂的乳剂、凝胶剂等。

可制备气雾配制剂来通过吸入施用。可将这些气雾配制剂放入可加压的可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮等等。也可将它们配制成例如在喷雾器或雾化器中用于非加压制备物的药物。

适用于肠胃外施用的配制剂包括水性的和非水性的，等渗的无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、和溶质(其使配制剂与所欲的受体的血液等渗)，和水性和非水性无菌悬液(其可包括悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定剂、和防腐剂)。配制剂可以在单位剂量或多剂量密封的容器中存在，例如安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥的(冻干的)条件贮存，在临用前，仅需要加入无菌的液体赋形剂例如水用于注射。也可以从前面描述的无菌粉末、颗粒、和片剂制备现配现用的注射液和悬液。此外，可以用各种基质制备栓剂，例如乳化的基质或水溶的基质。适合阴道施用的配制剂可以阴道栓剂、塞子(tampon)、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、或喷雾剂剂型提供，其中除含有活性成分外，还含有例如本领域已知的合适的载体。

施用给动物(具体是人类)的剂量，在本发明的上下文中会根据以下因素变化：目的治疗转基因、载体的来源和/或免疫调节分子的性质、使用的组合物、施用方法、和治疗的具体位点以及生物体。但是，优选地，使用相当于载体(例如本发明的腺病毒载体)的有效量的剂量。“有效量”是足以在宿主中产生所需效应的量，其可用本领域技术人员已知的几种终点监测。例如，一种所需效应是核酸转移入宿主细胞。这种转移可通过多种方式监测，包括但不局限于治疗效果(例如某些与所治疗的疾病、状态、紊乱或综合征相关的症状的减轻)，或通过宿主中转移的基因或编码序列或其表达的证据(例如使用聚合酶链式反应、Northern或Southern杂交、或用来检测宿主细胞中的核酸的转录实验，或使用免疫印迹分析、抗体介导的检测、或具体化的测定以检测由转移的核酸编码的蛋白质或多肽、或由于此转移而水平或功能受影响的蛋白质或多肽)进行监测。这些所述的方法并没有包括全部，并且适合具体应用的其它方法对普通技术人员是明显的。就此而言，应当指出宿主对引入载体(例如病毒载体，具体是腺病毒载体，以及编码抑制免疫应答的手段的载体)的应答可以依下列情况而变化：施用的病毒剂量、递送位置、和载体以及转基因的遗传组成和抑制免疫应答的手段。

通常，为确保本发明的载体有效转移，优选以要通过给定的施用途径接触的大约细胞数为基础，对每个被接触的细胞使用大约1-5000个拷贝的本发明载体，并且甚至更优选大约3-300pfu的载体进入每个细胞。但是，这只是一般原则，其不排除在体外或体内的具体应用中可能是正当的更高或更低的量。相似地，如果以含有蛋白质的组合物的形式，抑制免疫应答的手段的量应当足以抑制对包含转基因的重组载体的免疫应答。例如，实际的剂量和方案可以根据组合物是否与其他药物组合物联用，或根据药代动力学、药物性质(disposition)和代谢的个体间差异而变动。相似地，根据靶向的具体细胞类型或载体转移的方式，在体外应用中所述量可以改变。考虑具体情况的需要，本领域的技术人员可以容易地进行任何必需的调整。

尽管已经参考优选实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员知道在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行形式和细节的改变。这里提到的每个专利、出版物和其他参考文献在此特别以其全部引入以作参考。

实施例1：用反抑载体的研究

a.用质粒表达载体将成纤维细胞改造为反抑细胞

改造成纤维细胞以在其表面表达人类或小鼠的CD8α-链。将成纤维细胞用pCMVhCD8α质粒或pCMVmCD8α质粒转染，在这些质粒中CD8α-链的表达由CMV立即早期启动子/增强子(Invitrogen)驱动。当将CD8α-链转染的成纤维细胞(H-2^b)加入混合的淋巴细胞物(Balb/c；H-2^d抗-C57BL/6；H-2^b)时，只有表达CD8α-链的细胞系抑制CTL应答。如图2A和B所示，添加表达小鼠或者人类的CD8α-链的MC57T成纤维细胞完全抑制了对CTL的诱导。相反，添加未转染的成纤维细胞不影响T淋巴细胞激活。除了建立CD8α-链的抑制功能，这些实验也证明小鼠T淋巴细胞可以被人CD8α-链反抑。因此，所述小鼠模型对于检测设计用于临床使用的反抑是有用的。

经改造的反抑细胞的体内功能

确定经改造的反抑是否在动物体内起作用。将经转染来表达CD8α-链的C57BL/6(H-2^b)来源的成纤维细胞注射到Balb/c(H-2^d)小鼠内。向对照动物注射未转染的成纤维细胞。8到40天后收获脾细胞，并将其引入MLC培养物，以C57BL/6(H-2^b)脾细胞作为刺激细胞。5天后，收获培养物并测试它们裂解EL4(C57BL/6，H-2^b)靶细胞的能力。在已经注射了表达CD8α-链的成纤维细胞的动物中，对于抗H-2^bCTL应答的诱导被完全抑制(图3)。对于抗H-2^b T细胞的抑制是高度特异的。来自这些小鼠的T细胞对第三方的H-2^k同种异型(allo)-MHC分子仍旧产生应答。这些实验确认，经改造的反抑细胞与传统的反抑细胞相似，可在体内特异地抑制免疫应答，并且非经典的反抑细胞可以被改造为反抑细胞。换言之，经改造的细胞使动物对这些细胞上携带的抗原负免疫(negatively immunized)。

检测CD8α-链的表达是否干扰完全激活的T细胞的功能。为此目的，检测表达CD8α-链的靶细胞对被完全活化的CTL裂解的易感性。在这些研究中选择了两种不同的T细胞群，在MLC中刺激的同种异体-反应性CTL和活化的肽-特异性CTL，来用于这些研究。如图4A-B所示，表达CD8α-链的靶被同种异体反应性T细胞群高效裂解，但不被抗原特异性T细胞裂解。这些结果显示经改造的反抑能干扰甚至正在进行的抗原特异性免疫应答，例如那些自身免疫应答中发现的免疫应答。

b.将成纤维细胞改造为反抑细胞的病毒转移载体

腺病毒转移载体m-CD8的反抑功能：开发携带小鼠CD8α-链的复制-缺陷载体：腺病毒转移载体(mAdCD8α)。已经用mAdCD8反抑转移载体感染的小鼠成纤维细胞(MC57)在第2天表达高水平的小鼠CD8α-链。在这些快速增殖的细胞中，小鼠CD8α-链的表达到第5天明显减弱。虽然效率较低(结果未显示)，mAdCD8也感染其他小鼠细胞系，例如EL4。

在随后的实验中，将mAdCD8α-感染的MC57成纤维细胞(H-2^b)加入Balb/C(H-2^d)抗-C57B1/6(H-2^b)MLC中。5天后，收获培养物并测试抗H-2^bCTL的存在。已经加入感染的成纤维细胞的MLC不再含有抗H-2^bCTL(图11)。这些实验确定了反抑转移载体介导免疫抑制的能力。

此外，已经制备了人类CD8-版的腺病毒载体。而且，已经制备了表达小鼠CD8α-链的腺伴随病毒。已经证明这些病毒诱导各自的CD8链表达。表达小鼠或者人类的CD8α-链的腺病毒反抑载体介导了对于诱导杀伤T细胞的完全抑制(见图6)。

用mAdCD8反抑转移载体进行的负免疫：设计两个不同的实验来确定mAdCD8是否在体内抑制免疫应答。第一个实验中，用等剂量的mAdCD8反抑载体或者编码β-半乳糖苷酶而不是小鼠CD8α-链(Adβgal)的相似腺病毒对照载体感染C57B1/6小鼠。在免疫后7天，将这些动物处死。将它们脾细胞的单细胞悬液在存在Adβgal病毒情况下培养5天。然后收获培养物并评价它们的增殖能力。如图6所示，从Adβgal免疫的小鼠收获的T细胞对Adβgal增殖活跃，表明存在高增殖活性的CD4⁺T细胞。相反，从注射了mAdCD8的动物收获的T细胞不能扩增。

在第二步，我们测定这些培养物是否含有功能性的CD8⁺CTL，测定它们裂解Adβgal-感染的靶细胞(EL4，H-2^b)的能力。仅在从注射了Adβgal的小鼠建立的培养物中发现了CTL(图8)。这第一个实验表明AdCD8α可能由于表达CD8α-链而不诱导对腺病毒抗原的应答。但是，可能AdCD8诱导免疫应答失败有不同原因。AdCD8以某些未确定的方式是无功能的，或者小鼠仅与mAdCD8中没发现的β-半乳糖苷酶蛋白起反应。

为测试不同结论的正确性，将C57B1/6小鼠用mAdCD8或者Adβgal注射一次，随后在7天后第二次输注Adβgal。7天后，处死小鼠，在Adβgal存在情况下建立5天的脾细胞培养物。测定应答性T细胞对Adβgal-感染的靶细胞的裂解能力(图7A-B)。实际上，两次暴露于Adβgal导致更好的免疫。这些研究也显示AdCD8注射后，小鼠不再对Adβgal应答，并且Adβgal主要(如果不是唯一地)诱导对两种载体中共同的腺病毒蛋白的CTL应答。这一系列实验有力地提示制备基因治疗性病毒载体是可能的，所述载体能够对免疫应答产生负免疫，所述免疫应答是针对这些载体上所携带的基因的。

通过反抑对CD4⁺T淋巴细胞的抑制：为检验是否能将反抑转移载体用于抑制对CD4⁺T淋巴细胞的诱导，建立下面的实验系统。转化C57B1/6来源的成纤维细胞刺激物以表达同种异型的MHC II类分子(H-2E^k)和免疫刺激性CD80。将这些未经照射以保留其全部刺激能力的、缓慢增殖的成纤维细胞用mAdCD8或者Adβgal转移载体转导，并加入到未经选择的C57B1/6脾细胞中。4天后，收获这些培养物并用表面免疫荧光分析活化的、即分裂型(blasting)CD4⁺T淋巴细胞的存在(图8)。发现与正常或Adβgal-转导的刺激细胞一起培养的未经选择的C57B1/6脾细胞具有高数目的CD4⁺T淋巴母细胞。相反，加入mAdCD8-感染的刺激物的培养物中仅检测到少量CD4⁺T淋巴母细胞。这些研究确认反抑抑制CD4⁺T淋巴细胞，并且此外可将病毒的反抑转移载体用于此目的。

用不同病毒构建体感染后小鼠和人的CD8α-链的表面表达

染色方法：

mAdCD8：

将MC57T在改良的IMDM中用mAdCD8以大约10⁴的感染复数模拟感染或感染3天。收获感染的细胞并用直接标记了FITC的抗小鼠CD8α-链抗体(Pharmingen)对CD8α-链的表面表达作染色。在荧光活化的细胞分析仪(FACScan，Beckton-Dickinson)上测定表面荧光强度(图9B)。

从Balb/c小鼠股骨腔中收获骨髓细胞。将细胞在改良的IMDM中用表达β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(AdLacZ)或mAdCD8以10⁴的感染复数感染3天。收获感染的细胞，并用直接标记了FITC的抗小鼠CD8α-链抗体对CD8α链的表面表达作染色。测定表面荧光的强度(图9C)。此外包括CD34⁺骨髓细胞在内的几种细胞类型，即干细胞库中的细胞，也确定被有效转导(表5)。

表5

标志	细胞类型	阳性染色
			CD11aCD34CD19CD3	白细胞造血系B淋巴细胞T淋巴细胞	29.3％31.5％13.8％10.5％0.6％7.7％0.6％未检测到

hAdCD8：

模拟感染MC57T。hAdCD8的病毒滴度未知。将100μl的其原种溶液用于感染3×10⁵个细胞3天。收获感染的细胞并用直接标记了FITC的抗人CD8α-链抗体(Pharmingen)对CD8α-链的表面表达作染色。在荧光活化的细胞分析仪上测定表面荧光强度(图9A)。

AAV-为基础的载体：使用Strategene/Avigen系统平行生产AAV-为基础的载体。在这些构建体中，人类和小鼠的CD8α-链由同一CMV立即早期启动子/增强子驱动。将两种病毒mAAVCD8和hAAVCD8包装在HEK 293包装细胞系中。使用的系统不需辅助病毒。mAAVCD8和hAAVCD8高效感染小鼠的成纤维细胞(MC57T)，并且各自驱动小鼠或人类CD8α-链的高水平表达。在荧光活化的细胞分析仪上测定荧光强度(图9D)。值得注意的是，在转导后36小时内观察到CD8α-链表达的高水平。这一发现与其他人的观察形成对比。他们发现AAV-驱动的基因表达需要几天以达到显著水平(PHSchmelck，PrimeBiotech)。用AAV载体进行的另外研究重复了我们前面的发现，即可以将它们用于抑制免疫应答。这里，使用标准的MLC方法(图5A-B)。

实施例2：体外抑制研究-混合的淋巴细胞培养物

从Balb/c(H-2^d)和C57BL/6(H-2^b)小鼠收获脾细胞。制备单细胞悬液。将C57BL/6脾细胞用3,000拉德(rad)射线照射(Mark 1 Cesium Irradiator)。在24孔板(TPP，Midwest Scientific，Inc.)的每个孔中将4×10⁶Balb/c脾细胞(应答/效应细胞)与4×10⁶照射过的C57BL/6脾细胞(刺激细胞)一起在IMDM(Sigma)中培养，IMDM含有10％胎牛血清(FCS)(Sigma)，HEPES，青霉素G，硫酸链霉素，硫酸庆大霉素，L-谷氨酰胺，2-巯基乙醇，非必需氨基酸(Sigma)，丙酮酸钠和碳酸氢钠(改良的IMDM)。在CO₂孵箱(Forma Scientific)中培养5天后，收获全部培养物，并测定其裂解C57BL/6来源的靶细胞(H-2^b)的能力。向一些这样的培养物中加入已经用12,000拉德射线照射的4×10⁵MC57T成纤维细胞(H-2^d)。抑制培养物中包括4×10⁵MC57T细胞，所述细胞已经用mAdCD8以大约10⁴比1的感染复数感染2天。

细胞毒T淋巴细胞杀伤实验：计数从混合的淋巴细胞培养物收获的细胞中的母细胞的数目，作为活化的T淋巴细胞的指标。将这些效应细胞加入U-形底96孔板的单个孔中。以3倍滴定步骤从每孔3×10⁶或1×10⁵效应细胞开始滴定每孔的效应细胞数。在每孔中向这些效应细胞加入1×10⁴靶细胞EL4(H-2^b)，MC57T(H-2^b)或P815(H-2^d)。所述靶细胞之前已经用⁵¹Cr(Na-Chromate，Perkin-Elmer)标记。将1×10⁶靶细胞与100μCi一起在大约500μl体积的改良的IMDM中保温90分钟。此后，用改良的IMDM多次洗涤去除未掺入的⁵¹C。

将效应细胞和靶细胞以200μl的总体积在CO₂孵箱中保温4小时。此后，将所述板在离心机(Centra CJ35R，International Equipment Company)上1500转/分旋转3分钟。从每孔中去除100μl培养基，在4000型γ计数仪(BeckmanInstruments)上计数从靶细胞释放的⁵¹Cr的量。设立对照培养物，其中效应细胞被忽略以确定本底释放。确定孔中掺入靶细胞中的⁵¹Cr总量，其中用1％(w/v)Triton X 100溶液(Sigma)取代效应细胞。

特异性裂解的量如下测定：

％＝(特异性释放-本底释放)/(总释放-本底释放)×100

体外mAdCD8的活性：建立混合的淋巴细胞培养物(Balb/c抗-C57BL/6)。向这些培养物中加入MC57T成纤维细胞(如所示)，其已经用12,000拉德射线照射并已经用mAdCD8感染。培养5天后，收获培养物并测定它们在不同效应物对靶(E/T)比例时裂解EL4(H-2^b)靶细胞的能力。如可观察到的，甚至在混合的淋巴细胞培养物中，表达CD8的细胞都会抑制对裂解型T淋巴细胞的诱导。

mAdCD8和hAdCD8的制备：借助于Biogene的AdEasy^TM系统制备两种腺病毒载体。这里将小鼠和人的CD8α-链cDNA掺入转移载体中(步骤1)。在BJ5183EC细菌中进行与Ad5ΔE1/ΔE3载体的重组(步骤2)。然后将重组载体转移入QBI-HEK 293A细胞中，该细胞中含有E1A和E1B腺病毒5病毒基因，其补充了重组腺病毒中此必需区的缺失。因此，这些细胞产生的hAdCD8和mAdCD8是复制缺陷的。

作为表达细菌LacZ基因(β-半乳糖苷酶)的对照载体，Qbiogene提供QBI-Infect+Viral Particle(Ad5.CMVLacZΔE1/ΔE3)。使用小鼠的CD8α链序列。该序列与公开的小鼠序列相似：

实际序列：MASPLTRFLS LNLLLMGESI ILGSGEAKPQAPELRIFPKKMDAELGQKVD LVCEVLGSVS QGCSWLFQNS SSKLPQPTFV VYMASSHNKITWDEKLNSSK LFSAVRDTNN KYVLTLNKFS KENEGYYFCS VISNSVMYFSSVVPVLQKVN STTTKPVLRT PSPVHPTGTS QPQRPEDCRP RGSVKGTGLDFACDIYIWAP LAGICVAPLL SLIITLICYH RSRKRVCKCP RPLVRQEGKP RPSEKIV

使用人CD8α-链序列。此序列与所示公开的人序列相比有沉默突变。

实际序列：MALPVTALLL PLALLLHAAR PSQFRVSPLD RTWNLGWTVELKCQVLLSNP TSGCSWLFQP RGAAASPTFL LYLSQNKPKA AEGLDTQRFSGKRLGDTFVL TLSDFRRENE GYYFCSALSN SIMYFSHFVP VFLPAKPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLR PEACRPAAGG AGNRRRVCKC PRPVVKSGDKPSLARYV

pAAV-mCD8和pAAV-hCD8的制备：借助于Stratagene的AAV无辅助物系统(Helper-Free System)制备这些载体。通过在pAAV-MCS克隆载体中插入小鼠和人的序列使系统运行。然后将此质粒与辅助质粒(含有必需的腺病毒蛋白)和pAAV-RC载体(含有衣壳基因)一起共转染到HEK293细胞中来制备重组AAV颗粒。

实施例3：在动物模型上经改造的反抑

我们研究了动物对注射大剂量mAdCD8如何应答。在第一组实验中，给Balb/c小鼠(每组两只)静脉内注射等剂量的mAdCD8或编码β-半乳糖苷酶的腺病毒对照载体(AdLacZ)。7天后将动物处死。将它们的脾细胞在AdLacZ存在时培养5天。然后测定它们裂解AdLacZ-感染的靶细胞(P815，Balb/c来源的)的能力。如图13A所示，可以将具有特异的裂解活性的CTL从已经用AdLacZ免疫的Balb/c小鼠扩增，但是不能从已经接受mAdCD8的小鼠扩增。结果显示由于CD8α-链的表达，AdCD8不诱导针对腺病毒抗原的免疫应答。

在第二组(set-up)实验中，将C57B1/6小鼠用等剂量的mAdCD8(2只小鼠)或AdLacZ(2只小鼠)免疫。免疫7天后，处死每组的一只动物。将它们的脾细胞在AdLacZ存在时于细胞悬液中培养5天。然后测定它们特异性裂解AdLacZ-感染的靶细胞(EL-4，C57B1/6来源的)的能力。此外，注射AdLacZ诱导了特异性杀伤细胞的产生但频度较低，而mAdCD8无此效果(图13A)。

在该实验的第二阶段，已经接受了mAdCD8或者AdLacZ的其余C57BL/6小鼠，在它们接受第一次病毒注射后7天接受了第二个剂量的AdLacZ。7天后，处死小鼠，并在AdLacZ存在时建立5天的脾细胞培养物。再次测定应答性T细胞对AdLacZ-感染的EL4-靶细胞的裂解能力(图13B)。实际上，两次暴露于AdLacZ使免疫在某种程度得以改善。但是以前已经接受mAdCD8的动物仍不能产生应答。这些实验表明AdCD8不仅不能诱导免疫应答，而且防止对针对其自身的免疫应答的诱导。因此，mAdCD8逃避免疫系统。

实施例4：载体的制备

腺病毒载体的制备：全长小鼠CD8α-链cDNA与卵清蛋白cDNA通过从丙型肝炎病毒取得的短IRES来连接。将此通过PCR制备的双顺反子构建体移入腺病毒转移质粒中，其中该构建体位于非特异性CMV立即早期启动子/增强子之后。此载体也提供聚腺苷酸化。此质粒将与含DE1-DE2腺病毒5基因组的质粒(pAdEasy-1)一起进行同源细菌重组，产生新的质粒，其中表达盒被插入腺病毒基因组原来的E1区中。然后将此所得的载体质粒转染到QBI-293A细胞中，产生重组腺病毒载体Ad/CMV/CD8/Ova，受CMV启动子控制来表达CD8α-链和卵清蛋白。用相同系统产生仅表达卵清蛋白的对照载体。制备第二组腺病毒载体，其中CMV启动子区被置换为小鼠MHC II类启动子，已发现后者指导所有天然表达MHC II类分子的细胞的基因表达(Ceman，J Immunol.1992 Aug 1；149(3)：754-61；Martin，JImmunogenet.1990 Feb-Apr；17(1-2)：151-9)。在QBI-293A细胞中用标准方法制备腺病毒载体颗粒，并用梯度纯化法来纯化。每份制备物中的感染性颗粒数用标准的噬菌斑测定来确定。

AAV-为基础的载体的制备：用无辅助病毒的Strategene AAV-载体系统将上述的双顺反子表达盒包装到2型AAV衣壳中。在此载体系统中，将目的基因(在本实施例中为双顺反子构建体)通过多克隆位点移入pCMV-MCS克隆载体中。在克隆后，将表达盒移入pAAV-LacZ复制缺陷的AAV载体中。结果是去除了LacZ基因。用重组载体与携带cap和rep基因的pAAV-RC载体和携带诱导AAV裂解期所需的腺病毒基因(E2A、E4和VA的RNA)的pHelper载体一起，共转染到病毒包装细胞系293中，来制备重组的复制缺陷的AAV病毒体。再次用标准的纯化方案纯化病毒体。另外，制备了仅携带卵清蛋白(ovalbumin only)的载体。

无内容腺病毒以无辅助病毒方式的制备：为了包装无内容腺病毒，必须以反式(trans)提供必需的腺病毒基因。大多数公开的方案使用必须从最终的治疗制品中去除的辅助腺病毒。Cre-Lox重组系统已经用于限制另外的辅助病毒的包装(Hardy，1996；Sakhuja，2003)。作为感染型腺病毒的辅助病毒的替代物，已经描述了一个系统，其中通过腺病毒/杆状病毒杂合(hybrid)基因组构建体递送了辅助基因组(Cheshenko，2001)。此杂合基因组构建体避免了使用腺病毒辅助病毒。然而，它允许通过杂合基因组中ΔE1片段和293A包装细胞中E1之间的同源重组，来进行有复制能力的腺病毒的重组。所用的辅助基因组在E1基因内有相对短的缺失。

预防重组体的策略是去除在包装细胞基因组中和辅助基因组中存在的E1序列之间重叠的序列(Nichols，2002)。实现此目的的潜在障碍是调节E1B和plX基因的方式。它们使用相同的聚腺苷酸化位点。而且，plX基因必须携带于辅助基因组中来使其表达。因此，可构建新的腺病毒/杆状病毒杂合基因组，其中缺失了E1A和E1B而不是plX表达盒。此包装细胞会表达E1A和E1B，但会缺无plX。E1区会从位置460-3509去除。这会使E1b截短，但plX仍会完整。否则腺病毒/杆状病毒杂合基因组就会如以前所述(Cheshenko，2001)来构建。它被设计成携带缺无了包装信号和E1和E3的5型腺病毒的功能基因组。它也会包含融合的ITR作为腺病毒复制起点。腺病毒基因组可与loxP位点侧接，使其借助于Cre重组酶来被切割。显示用VSV糖蛋白假型包装杆状病毒可以更高效转导哺乳动物细胞(Cheshenko，2001)。水泡性口炎病毒(VSV)糖蛋白被膜蛋白将被置入此构建体的杆状病毒基因组。由杆状病毒多角体蛋白启动子驱动，它会在昆虫细胞中提供选择性表达。腺病毒/杆状病毒杂合基因组会在昆虫细胞中被拯救为重组杆状病毒。通过感染表达Cre的包装细胞(见下)，环状腺病毒基因组会从杂合基因组中切割出来。可创建两个环状分子，一个包含腺病毒基因组(ΔE1，ΔE3)而另一个包含杆状病毒基因组。腺病毒基因组会提供扩增插入子DNA构建体即表达盒(设计见下)所必需的所有辅助功能。因为通过Cre-Lox重组从杂合体释放的腺病毒基因组缺乏腺病毒包装信号，所以只有CD8α-链表达盒被包装以产生无-辅助物的载体制备物。

建立新的包装细胞系：可用人胚成视网膜细胞(HER)。它们可用腺病毒E1基因来永生化(Graham，1977)，并且它们在制备腺病毒上极高效(Gallimore，1986)。为了在无内容腺病毒的制备中使用，HER细胞必须以如下方式来修饰：(i)它们会表达Cre，从而从杂合分子中切割环状腺病毒基因组。因此，可用经SV40 T-抗原核定位信号修饰的Cre-基因来转染它们(Lieber，1996)。Cre可由肌动蛋白启动子驱动。将不使用立即早期CMV启动子，以避免与病毒表达盒发生任何序列重叠，(ii)HER细胞必须提供从腺病毒/杆状病毒杂合基因组中丢失的互补E1基因。E1启动子和E1聚腺苷酸化序列可从非病毒来源获得，如人的管家基因磷酸甘油激酶(PGK)启动子和肝炎病毒聚腺苷酸化位点(Valerio，1985；Simonsen，1983)。(iii)HER细胞可用Cre和E1-表达盒共转染。将HER细胞的永生化作为E1整合的证据。然后可通过PCR进一步分析连续生长的HER(CE-HER)细胞的克隆中全长的Cre-和E1构建体的存在和表达。

CD8α-链/胰岛素表达盒和非病毒dmVTV的设计：可装配如下表达盒。将全长的小鼠CD8α-链cDNA与(前)胰岛素(原)或胰岛素(原)的cDNA通过从丙型肝炎病毒取得的短IRES来连接。在mAdCD8中所用的立即早期CMV启动子/增强子会用来驱动两种基因的同步表达。此双顺反子构建体可置于在左腺病毒ITR的两个反向拷贝和包装信号之间的填充(stuffer)DNA序列中。可放置限制性位点来从构建质粒中切割表达盒。可制备仅表达两个基因中的一个的对照载体。缺无腺病毒ITR和包装信号的表达盒会形成非病毒dmVTV的基础。可设计非病毒dmVTV，在使用之前可切割出抗生素选择序列和其他的非必需DNA片段。非病毒DNA构建体也可用于检测两种不同基因的表达。为此目的，可用此表达盒转染不同的细胞系。可用PCR测试DNA整合和特定mRNA的水平。CD8α-链表面表达的水平可用表面免疫荧光来测定，释放到上清中的胰岛素水平可借助于之前建立的特异性ELISA来研究。

病毒和非病毒的dmVTV的制备：对于无内容的腺病毒dmVTV，CD-HER细胞可用酶促切割的CD8/胰岛素/ITR构建体来转染，然后用腺病毒/杆状病毒辅助基因组转染。可收获来自经转染的CE-HER细胞的粗制裂解物，并用于转染293细胞或组织培养成纤维细胞。表达CD8的细胞的频度可用于测定dmVTV的“功能性”滴度。测定293噬菌斑的数目会提供给我们针对高效重组复制病毒的实验。腺病毒dmVTV可以通过用腺病毒/杆状病毒辅助基因组在CE-HER细胞中进一步传代来扩增。除了测定dmVTV滴度和重组病毒的存在，可借助于对dmVTV的限制性酶作图、PCR研究和DNA测序来研究dmVTV的完整性。由双顺反子表达盒组成的非病毒dmVTV可用于转染不同的细胞系，如成纤维细胞。选择性标记物可由分开的质粒来提供。可研究CD8α-链和胰岛素的表达。

实施例5：载体的功能性试验

不同载体的转导有效性：建立不同表型的标准组织培养细胞系，如成纤维细胞，淋巴瘤，巨噬细胞等，测试新鲜收获的和分化的细胞，如巨噬细胞和DC。收获来自C57BL/6的BM细胞并在鼠GM-CSF(从经转染的J558L细胞收获，由U.D.Staerz提供)存在时培养。重复洗涤细胞培养物来去除未粘着的(non-adherent)细胞。大约4天后，粘着的DC主要表达不成熟的表型。将DC取出，再次铺板和再培养。对所得细胞进行表型分析(Kamath，2000；Bell，1999；Liu，2002；Mellman，2001；Mellman，1998)。通过加入LPS(10ng/ml，Sigma-Aldrich)来激活它们。从之前腹膜内注射或未注射

蛋白胨(由U.D.Staerz提供的制品)的C57BL/6小鼠的腹膜腔中收获巨噬细胞。它们由于其粘着到塑料的能力而被富集并且被染色(Leenen，1994)。可选择地，巨噬细胞在存在M-CSF时从骨髓(BM)中生长。巨噬细胞在培养物中通过加入IFN-γ和LPS而被活化。

不同的细胞群用不同的载体以增加的感染复数(MOI)来感染，最可能从MOI 10比1开始，并达到MOI 10⁴比1的水平。细胞群接触载体30分钟到24小时。较短的接触时间之后是保温阶段，来使转导基因表达。在这些实验中整体培养阶段可以是24小时。检测被转导细胞的生存力。用碘化丙锭染色作为总体DNA含量的测量指标(measure)，膜联蛋白-5作为膜定位(orientation)的早期测量指标。然后在荧光活化的细胞分析仪(FACSCalibur，Becton-Dickinson)上分析细胞。

在平行实验中，测定CD8α-链和免疫原(卵清蛋白)的表达水平。自这些细胞中纯化RNA，并通过用肌动蛋白RNA的水平标准化的RT-PCR来测定CD8α-链和免疫原(卵清蛋白)的基因表达的水平。在这些研究后是蛋白质水平的测定。对于CD8α-链，对经转导的细胞作小鼠CD8α-链(FITC-连接的抗CD8α-链mAb 53-6-75)的表面表达的染色。由于非特异性抗体结合而对染色的干扰，通过使用抗体的F(ab)′₂制备物来预防。在荧光活化的细胞分析仪上测定mAb结合及CD8α-链表达的程度。

卵清蛋白制备的水平用两种方法测定。由于卵清蛋白通过经转染的细胞来分泌，培养物上清中卵清蛋白的量通过夹心ELISA、借助于U.D Staerz所提供的大鼠的抗卵清蛋白mAb和纯化的兔的抗卵清蛋白抗体来测定。另外，确定卵清蛋白是否能够以免疫相关形式来呈递到在这些细胞表面上的MHC分子上。为此目的，从T细胞受体的转基因小鼠OT-I和DO11.10收获T淋巴细胞，并且在体外将其活化。然后将它们暴露于表达适当MHC分子的不同的转导细胞群。在标准的活化试验中，通过测定确定它们是否能够特异性裂解靶细胞(OTOI)或分泌IL-2(DO11.10)。用已经转导了仅携带CD8α-链的载体的细胞进行对照试验。加入外源的卵清蛋白肽。在这里我们确定反抑是否抑制了效应T细胞。加入抗CD8mAb来抑制靶细胞CD8。另外，使用仅携带卵清蛋白的载体。

载体的体外抑制功能：在已经最优化转导方案后，我们确定不同的载体是否以特异性方式抑制MHC I类和MHC II类限制性的免疫应答。从之前的试验，我们了解到不同载体中哪一种是最有希望的，并且哪种细胞系表达CD8α-链并高效呈递卵清蛋白。第一个研究中，如上述在MLC中测试了CD8α-链的功能。简言之，建立了C57BL/6抗Balb/c MLC。向它们提供通过表达CD8α-链的分级数目(graded number)的不同转导细胞群，并培养5天。在随后的CTL和再刺激测定中，测量同种异体反应性CD8⁺和CD4⁺T细胞的产生(development)。

胰岛素特异性的CD8⁺和CD4⁺T淋巴细胞系可从NOD小鼠建立，可能来自收获的胰岛。这些细胞系可用已制定的再刺激方案来维持。dmVTV转导或转染的同系细胞将被加入杀伤试验(CD8⁺CTL)和细胞因子释放试验(CD4⁺T_H细胞)。检测它们抑制这些应答的能力。不同的细胞群，包括APC，会用这种方式测试。用总DNA含量和膜联蛋白-5定位(见上研究)，可检测被反抑的T细胞是否在这些培养物中被抑制或杀死。

对dmVTV的总体反抑功能的体内功能试验：不同dmVTV的总体反抑功能可借助于同种异体应答、在以前证明了反抑的体内活性的试验方案(set-up)中检测。转导了或稳定转染了各自dmVTV的C57BL/6来源的细胞系将被注射到BALB/c动物中。10天后处死小鼠，收获它们的脾细胞，居留的(resident)T细胞将会被C57BL/6刺激细胞在体外活化。应答性T细胞的存在将在杀伤和细胞因子释放试验中测定。因为没有胰岛素特异性T细胞受体的转基因小鼠，dmVTV抑制胰岛素特异性免疫应答的能力将必须在NOD小鼠的试验(见下)中评估。

确定不同的载体是否能特异性地抑制对卵清蛋白特异性TCR转基因T淋巴细胞的诱导：另外，确定不同的细胞群(见上)是否能借助于不同载体被转化到抑制细胞中。收获OT-I和DO11.10T淋巴细胞，并用经照射的用分别的卵清蛋白肽调理的脾刺激细胞来刺激。向这些培养物中加入用不同载体转导的分级数目的细胞(不同表型)。培养约5天后，收获T淋巴细胞，计数并作功能测试。检测OT-I T淋巴细胞特异性杀死卵清蛋白包被(coated)的靶细胞(OT-1)的能力。在DO11.10的情况下，测量它们在原代培养物中的繁殖应答。在两种情况下，确定应答性T淋巴细胞的命运。我们希望确定它们是否经历过凋亡。所有的研究用仅表达CD8α-链或卵清蛋白自身的不同对照载体作为对照。

测定抗原特异性的反抑抑制：在这些实验中，在存在合适单倍型(haplotype)的载体感染的细胞时，在肽包被的刺激细胞上刺激来自TCR转基因小鼠的T淋巴细胞(C10.4，AttM，MHC Ib类限制性的(由U.D.Staerz提供)和AND，鸽细胞色素C，MHC II类限制性的)。

对载体的体内功能性测试：TCR转基因动物代表了测量T细胞的活性和寿命的最直接途径。因此，我们选择了两只TCR转基因小鼠，其中T细胞与模型抗原卵清蛋白有反应性。一只小鼠OT-I，携带对卵清蛋白257-264特异的CD8⁺H-2K^b限制性的CTL，另一只小鼠DO11.10携带对卵清蛋白329-339特异的CD4⁺H-2A^b限制性的T辅助细胞。在嵌合小鼠中进行体内的反抑试验，其中只有某个百分比的外周T细胞是TCR转基因型的。这些嵌合体是在经过亚致死照射的小鼠中构建的。给小鼠注射混合BM，其中一定数量的前体(5％)来自一只或两只TCR转基因的小鼠。相似百分比的外周T细胞表达转基因的T细胞受体。这个百分比在外周血中测量，并在为此目的手术摘除的淋巴结中确认。活组织检查脾来确定那里转基因T细胞的频度。除了用mAb(见上)或用对TCR转基因特异的MHC四聚体作细胞表面染色之外，借助于mAb如抗CD62L、抗CD44、抗CD25、和抗CD122，来确定这些T细胞的活化状态。这些T细胞的功能性在标准的体外活化测定中检测，其中测定了它们发育为特异性CTL或响应它们的抗原来特异性增殖的能力。

注射不同的载体和对照载体，最可能以静脉内方式以增加的剂量并可能通过多次。在某些时间阶段后(可能在一周后，最多六个月)，给动物放血。确定TCR转基因T细胞的频度和功能表型(静息时比静息时)。另外，用碘化丙锭和膜联蛋白-5染色来测定它们是否经历了凋亡。在不同时间点处死动物。收获它们的脾和淋巴结。测定回收的T淋巴细胞的数目、活化状态和生存力。另外，应调查在特异性的体外刺激后这些T细胞是否能被诱导增殖(DO11.10)或发育成功能性CTL(OT-I)。如果TCR转基因的T细胞不再应答，但仍存在，不同的T细胞群将过继(adoptively)转移入嵌合状态类似的第二宿主中，以确定是否已经诱导了调节性T细胞，如CD4⁺CD25⁺T细胞。

用各自的mAb联合抗CD8α-链mAb将鉴定B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、DC、粒细胞，以确定何种细胞群已接纳了载体并正在表达CD8α-链。除了脾和淋巴结之外，研究了肝和肺。作为将载体直接注射到嵌合小鼠的替代途径，先体外后体内注射了不同细胞如巨噬细胞和DC，并再注射入小鼠。对此治疗的T细胞应答如上述确定。

已经接受了载体的小鼠可同时或以不同的时间延迟注射有效的免疫原如流感病毒PR/8，来确定反抑抑制是否是特异的。免疫后约两周，收获脾细胞和淋巴结，并进行抗病毒的体外再刺激，来检查增殖型CD4⁺流感特异性的T细胞是否已经产生或者是否可以诱导流感特异性的CTL。

实施例6：对NOD小鼠I型糖尿病发生的抑制

CD8α/胰岛素2载体的制备：pBudCE4.1载体(Invitrogen#V532-20)包含两个多克隆位点(MCS)：1)CMV启动子，MCS，SV40PA信号；2)延伸因子1α(EF-1α)，MCS，BGH PA信号。将小鼠CD8α-链基因克隆到带Kpn1(5′)和Xho1(3′)限制性位点的pEF-1αMCS中，所用引物如下：正向：5′-CT TATGGT ACC GCA ATG GCC TCA CCG TTG-3′；反向：5′-CG CTC CTC GAGTTA TTA CAC AAT TTT CTC-3′。在克隆到pBudCE4.1载体中之前，将小鼠CD8α-链基因首先克隆到pCR2.1载体中。当用Kpn1和Xho1酶切出所述基因，事实上是用来自pCR2.1载体的Kpn1位点切割的，从而在小鼠CD8α-链基因的5′末端上添加了大约30个核苷酸。这些多出的核苷酸位于启动子之后，但在基因的ATG起始密码子之前。

小鼠胰岛素的基因被克隆到带Hind III(5′)和Xba1(3′)限制性位点的CMV MCS中，所用引物如下：正向：5′-GC TTG AAG CTT GCA ATG GCCCTG TGG ATG-3′；反向：5′-CG CTC TCT AGA TTA CTA GTT GCA GTAGTTC-3′。

对小鼠CD8α-链基因和小鼠胰岛素2基因测序，并且不包含突变。

多表位胰岛素载体：在可选择的实施方案中，用通过取自丙型肝炎病毒的短IRES与小鼠胰岛素抗原性片段连接的全长小鼠CD8α-链cDNA制备载体，其包含主要的MHC I类(H-2^d-B15-B23，B24-C36)和MHC II类(H-2A^g7-B9-23)-限制性表位，即B9-C36(Martinez，2003；Chen，2001；Wong，1999；Wegmann，1994；Wegmann，1994；Wegmann，1993)。另外，合成各自的肽。

在基线(base-line)试验中，调查从不同的疾病阶段的NOD小鼠收获的T淋巴细胞是否对由他人描述的这些胰岛素表位应答(Wegmann，1993)。另外，试验此胰岛素构建体是否被适当呈递。制备了仅携带此构建体的转移载体。它们用于转导刺激细胞并确定识别的有效性。在通过这些初步试验已确定识别了各自的胰岛素构建体之后，制备了各自的载体。

对于NOD小鼠患糖尿病的预防：在初步研究中，我们已经发现在约4个月内我们的动物群体中约70％的雌性NOD小鼠自发地患糖尿病。从其它人的工作，我们得知在成熟型(full-blown)糖尿病之前在约4周龄时会有胰岛炎。此胰岛炎的特征在于T淋巴细胞在约4周龄侵入胰岛。

本试验中使用了两组NOD小鼠。对于对照组中的十一只15周龄的小鼠未给予治疗。给同龄的四只小鼠(NOD，雌性，Jackson Laboratories)I.M.(肌肉内)注射pBudCE4.1/CD8α-链/胰岛素2反抑载体。在不同的时间点给两侧四头肌(或腓肠肌)注射50μl(1ml/mg)。一周测量两次血糖水平。一周一次收集来自3滴血的血清并离心，来测试自身抗体的产生。

如图14所示，接受pBudCE4.1/CD8α-链/胰岛素2反抑载体的小鼠与未治疗的对照组相比，显示在六周的过程中糖尿病小鼠的百分比持续下降。当将相同的载体提供给已经患有成熟型糖尿病的NOD小鼠，它们的糖尿病状态无改变，这提示通过载体制备治疗有效的胰岛素是不可能的(数据未示)。并且，公开的研究已经显示12周后注射含胰岛素2和GAD的载体不显示任何效果，而在15周立即(instant)施用CD8α-链/胰岛素2载体是有效的。因此，我们得出结论，根据受试者方法最可能在肌肉细胞、也在抗原呈递细胞上共表达CD8和胰岛素，会抑制破坏产生胰岛素的胰岛细胞所需的胰岛素特异性T细胞的活性。

为了证实此结论，用pBudCE4.1/CD8α-链/胰岛素2反抑载体(与上相同)与对照载体pBudCE4.1+仅有小鼠CD8α-链(EF-1α启动子)、PBudCE4.1+仅有小鼠胰岛素2(CMV启动子)、和空的pBudCE4.1载体进行如下实验。

将雌性NOD小鼠分成如下组(表6)。将用各自的载体给它们肌肉内注射50μl(1ml/mg)。与最初的试验不同，它们要接受相隔2周的两次注射。一周测量两次血糖水平。用RIA和ELISA测定抗胰岛素抗体的水平。在某些时间，处死一些小鼠。收获它们的脾和淋巴结，并用标准的T细胞活化试验确定胰岛素和GAD特异性的CD4⁺和CD8⁺T细胞的存在。也进行组织学研究来确定炎性过程是否已经出现在这些小鼠的胰岛中。

表6

组	治疗	治疗的时间/周
			1对照	未注射	-
2CD8对照	pBud/CD8	8和10
			3CD8对照	pBud/CD8	12和14
4胰岛素	pBud/胰岛素	8和10
			5胰岛素	pBud/胰岛素	12和14
6反抑载体	pBud/CD8/胰岛素	8和10
			7反抑载体	pBud/CD8/胰岛素	12和14

约70-80％的未治疗的NOD小鼠在其生命的约26周发病糖尿病，这个比率是在之前的试验中检测的。注射反抑载体自身预计不会显著降低此比率(第2和3组)。在第8和10周给予时，注射胰岛素2可降低糖尿病发病率至约30％(第4组)。在较晚的时间点给予时，预计第5组的糖尿病发病率无显著降低。在早给予反抑载体(第6组)时，与第2组相比预计糖尿病发病率会明显更显著地降低。预计不到20％的动物会患糖尿病。也预计出现糖尿病传递(delivery)的延迟。预计第7组中不超过30％的动物(与第5组的超过70％相比)会患糖尿病。预计在糖尿病发作上有相似的延迟。

在另一个试验中，在疾病发作前给雌性NOD小鼠注射CD8α-链/胰岛素载体，从两周龄开始测定糖尿病的明显发作在这些动物中如果没能预防的话是否会被推迟。测量外周血糖水平。另外，在不同时间段处死小鼠，并且对胰岛作组织学检查寻找胰岛炎证据。将这些结果与注射各自的对照载体(仅有胰岛素，仅有CD8α-链)的研究相比较。

在疾病的较晚阶段给予载体治疗，来确定载体是否能干扰疾病发展的较晚阶段，如胰岛炎。最后，治疗有明显糖尿病证据的动物。

如果预防了糖尿病发病，进行研究来调查是否能观察到T淋巴细胞的伴随(concomitant)抑制。为此目的，从这些小鼠收获T淋巴细胞，并研究它们对胰岛素应答的能力。包括过继转移试验，来寻找任何调节性细胞诱导的证据。

Claims

1.抑制针对靶细胞的自体反应性T细胞应答的治疗组合物，其包含表达载体，所述表达载体编码CD8多肽和自身抗原的至少一个表位，所述CD8多肽包含CD8α-链的全部或功能部分，其中所述CD8α-链包括跨膜结构域，以实现所述CD8α-链在所述靶细胞表面上的缔合，所述自身抗原与所述自体反应性T细胞应答有关，其中所述CD8多肽的表达与所述自身抗原的表达是分开的。

2.根据权利要求1的治疗组合物，其中所述表达载体编码所述自身抗原的多个表位。

3.根据权利要求1的治疗组合物，其中所述CD8多肽和自身抗原的所述至少一个表位的表达受同一启动子的控制。

4.根据权利要求1至3任一项的治疗组合物，其中所述CD8多肽是人CD8多肽。

5.根据权利要求4的治疗组合物，其中所述CD8多肽基本上由人CD8α-链的细胞外结构域和跨膜结构域组成。

6.根据权利要求1至5任一项的治疗组合物，其中所述自身抗原选自下组：胰岛素，蛋白脂质蛋白PLP-1，髓鞘碱性蛋白，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，谷氨酸脱羧酶2，胆碱能受体γ-链，甲状腺球蛋白，II型胶原，α1基质金属蛋白酶和MMP-1。

7.根据权利要求1-6任一项的治疗组合物在制备用于抑制针对靶抗原的自身免疫应答的药物中的用途。

8.根据权利要求7的用途，其中所述靶细胞是肌肉细胞。

9.根据权利要求7的用途，其中所述靶细胞是造血细胞。

10.根据权利要求7的用途，其中所述靶细胞是淋巴细胞或抗原呈递细胞。

11.根据权利要求1至6任一项的治疗组合物在制备用于预防宿主中自身免疫病的发生或治疗宿主中自身免疫病的药物中的用途。