JP2007525467A - 疼痛を処置するための方法 - Google Patents

疼痛を処置するための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2007525467A
JP2007525467A JP2006517161A JP2006517161A JP2007525467A JP 2007525467 A JP2007525467 A JP 2007525467A JP 2006517161 A JP2006517161 A JP 2006517161A JP 2006517161 A JP2006517161 A JP 2006517161A JP 2007525467 A JP2007525467 A JP 2007525467A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
pain
use according
composition
aav
days
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006517161A
Other languages
English (en)
Inventor
リンダ メイ ロスブルーム ワトキンズ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Colorado
Original Assignee
University of Colorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Colorado filed Critical University of Colorado
Publication of JP2007525467A publication Critical patent/JP2007525467A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1793—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2026—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2086—IL-13 to IL-16
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • A61K38/34—Melanocyte stimulating hormone [MSH], e.g. alpha- or beta-melanotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症誘発性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子の神経系に対する送達によって疼痛を処置する方法が記載される。これらの因子は遺伝子治療技術を用いて送達され得る。あるいは、この因子は、タンパク質組成物中で送達され得る。詳細には、本発明は、抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１ｒａの遺伝子送達が、温熱性痛覚過敏および機械誘発性異痛症を含む疼痛、例えば、病理的な疼痛および神経障害性疼痛を、熱刺激または機械的刺激に対する基礎的な疼痛応答性に影響することなく、防止および逆転するという受容可能な疼痛モデルにおいて示されている。

Description

（連邦政府の支援による研究開発に関する声明）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ ＳｔｒｏｋｅのＮＩＨ Ｇｒａｎｔｓ ＮＳ３８０２０およびＮＳ４０６９６、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｄｒｕｇ ＡｂｕｓｅのＤＡ１５６４２ ＤＡ１５６５６による支援で行なった。従って、米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
（技術分野）
本発明は概して、遺伝子送達方法に関する。詳細には、本発明は、炎症誘発性サイトカインに作用する抗炎症性分子、またはこれをコードする核酸の神経組織への送達によって疼痛を処置または予防する方法に関与する。
（背景）
遺伝子操作された細胞およびウイルスを用いる遺伝子治療は、過去４０年間にわたって目立った発達を遂げてきている。遺伝子治療技術は、多様な医学的問題に適用されており、３５０を超える臨床試験で用いられている（Ｗｕら、Ｍｅｔｈ．Ｓｔｒａｔ．Ａｎｅｓｔｈｅｓ．（２００１）９４：１１１９−１１３２）。しかし、遺伝子治療は最近では、病的な疼痛を管理する意図で用いられているだけである。いくつかのアプローチが開発されている。例えば、遺伝子操作された細胞の脊髄移植が、ＧＡＢＡ（Ｅａｔｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（２０００）５：５９−７４）、ガラニン（Ｅａｔｏｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（１９９９）４：２４５−２５７）およびβエンドルフィン（Ｉｓｈｉｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００）１６６：９０−９８）を含む抑制性伝達物質を増大するために用いられている。ヘルペスウイルスは、それらが末梢神経末端から後根神経節細胞体に後ろ向きに輸送される能力を利用されている。この方法では、プレプロエンケファリンの上昇（Ａｎｔｕｎｅｓ Ｂｒａｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９８）７０：１２９９−１３０３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：３２１１−３２１６）およびＣＧＲＰアンチセンスの誘導性産生を介したＣＧＲＰの減少（Ｌｕら、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ａｂｓ．（１９９８）２４：１６２５）が感覚神経で生じている。最後に、アデノウイルスがＣＳＦに注射されて、髄膜細胞からウイルスによって誘導されるβエンドルフィン放出が得られている（Ｆｉｎｅｇｏｌｄら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０：１２５１−１２５７．これらの遺伝子治療アプローチは、入ってくる疼痛シグナルに対して脊髄疼痛伝達ニューロンの興奮を抑えることに集中している。
活性化された脊髄のミクログリア（小膠細胞）および星状細胞が、病的な疼痛の発生および維持に寄与していると考えられる。詳細には、活性化されたグリア（膠細胞）は、少なくとも一部は、炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１（ＩＬ１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびＩＬ６（概説については、Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２４：４５０−４５５を参照のこと）の放出を介して、そのようにすると考えられる。これらの炎症誘発性サイトカインは、「疼痛（ｐａｉｎ）」神経伝達物質の放出を感覚神経末端に入るものから増強することによって、および脊髄後角疼痛伝達ニューロンの興奮を増強することによって疼痛を増幅する（Ｒｅｅｖｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐａｉｎ（２０００）４：２４７〜２５７；Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（２００１）２４：４５０−４５５）。
星状細胞およびミクログリアは、ＩＬ−１０のレセプターを発現する（Ｍｉｚｕｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９４）２０５：１９０７−１９１５）が、脊髄ニューロンは、発現しない（Ｌｅｄｅｂｏｅｒら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１３６：９４〜１０３）。ＩＬ−１０はこれらのグリア細胞において炎症誘発性サイトカイン産生およびシグナル伝達を選択的に抑制し得ることがインビトロ研究で示されている（Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：６８３−７６５）。実際、ＩＬ−１０は、病的な疼痛に関与する全ての炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ１、ＴＮＦおよびＩＬ６）を抑制できるという点で、抗炎症性サイトカインファミリーの特に強力なメンバーである。ＩＬ−１０は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害すること（Ｓｔｒｉｅら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２１：４２７−４４９）；ＮＦκＢ活性化、転位およびＤＮＡ結合を阻害すること（Ｓｔｉｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２１：４２７−４４９）；炎症誘発性サイトカイン転写を阻害すること（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．（１９９９）１９：５６３−５７３）；炎症誘発性サイトカインｍＲＮＡの安定性および翻訳を阻害すること（Ｈａｍｉｌｔｏｎら、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６７：２４１−２４４；Ｋｏｎｔｏｙｉａｎｎｉｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．（２００１）２０：３７６０−３７７０）；ならびに炎症誘発性サイトカイン放出を阻害すること（Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：６８３−７６５）によってこの効果を発揮する。さらに、ＩＬ−１０は、サイトカインシグナル伝達の抑制因子のｍＲＮＡを安定化して、これによって炎症誘発性サイトカイン産生をさらに阻害するタンパク質のファミリーの産生を増大する（Ｓｔｉｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）２１：４２７−４４９）。ＩＬ−１０はまた、炎症誘発性サイトカインレセプター発現を下方制御することによって炎症誘発性サイトカインシグナル伝達を妨害する（Ｓａｗａｄａら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．（１９９９）７２：１４６６−１４７１。最後に、ＩＬ−１０は、ＩＬ１レセプターアンタゴニストおよびＴＮＦデコイレセプターを含む、炎症誘発性サイトカインの内因性アンタゴニストを上方制御する（Ｆｏｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：９２０−９２８；Ｈｕｂｅｒら、Ｓｈｏｃｋ（２０００）１３：４２５−４３４）。
ＩＬ−１０の公知の効果は、活性化された免疫細胞およびグリア細胞の炎症誘発性機能の抑制に限定され、影響されない細胞機能の非炎症性の状況は残される（Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１９：６８３−７６５）。いくつかのニューロンがＩＬ−１０レセプターを発現するが、ニューロンに対するＩＬ−１０の唯一の公知の作用は、細胞死（アポトーシス）の阻害である（Ｂａｃｈｉｓら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：３１０４−３１１２）。Ｌａｕｇｈｌｉｎら（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｐａｉｎ（２０００）８４：１５９−１６７）は、クモ膜下ＩＬ−１０によって、クモ膜下のジノルフィン誘発性、ＩＬ１媒介性機械誘発性異痛症の発現がブロックされることを報告した。次いで、これらの研究者らは、損傷部位で星状細胞およびミクログリアを活性化する操作である興奮毒性の脊髄損傷によって誘発される病的疼痛に対するＩＬ−１０の効果を試験した（Ｂｒｅｗｅｒら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９９）１５９：４８４−４９３）。ＩＬ−１０は、損傷後３０分で与えた場合、病的な疼痛の行動を軽減した（Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００１）１６８：１４４−１５４；Ｙｕら、Ｊ．Ｐａｉｎ（２００３）４：１２９−１４０）。これは、血液脳関門の破壊に起因して損傷した脊髄に全身性ＩＬ−１０が達することを可能にする操作である、興奮毒性傷害に応答して、全身のＩＬ−１０が脊髄炎症誘発性サイトカイン産生を軽減し得るという事実と一致している（Ｃｒｉｓｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）２：３０３３−３０４０；Ｂｅｔｈｅａら、Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ（１９９９）１６：８５１−８６３）。
しかし、ＣＮＳ傷害を処置するための全身的なＩＬ−１０の送達は問題がある。ＩＬ−１０は、インタクトな血液脳関門を検知できるほどの量が横切ることはなく、（Ｂａｎｋｓ，Ｗ．Ａ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｖｉｒｏｌ．（１９９９）５：５３８−５５５）、長期の持続可能な送達が困難であるような短い半減期を有し（Ｒａｄｗａｎｓｋｉら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９８）：１５：１８９５−１９０１）、経口的に首尾よく送達されることはなく、そのために全身投与には問題があり、身体の免疫系の正常な機能を破壊して、患者の健康に対して有害であると思われる（Ｘｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９７）４：１４０−１４９；Ｆｅｄｏｒａｋら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．（２０００）１１９：１４７３−１４８２；Ｔｉｌｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）１６９：２２０４−２２０９）。さらに、ジノルフィン誘発性異痛症（アロジニア）の２４時間後のＩＬ−１０の送達は、異痛症を軽減しなかったことが以前の実験者らによって見出された（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｐａｉｎ（２０００）８４：１５９−１６７）。
ＩＬ−１０遺伝子治療は肺炎誘発性の肺障害を軽減し（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（２０００）６８：４７５２−４７５８）、関節リウマチの重篤度を下げ（Ｇｈｉｖｉｚｚａｎｉら、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．（２０００）３７９、補遺：Ｓ２８８−２９９）、炎症性肺線維症を軽減し（Ｂｏｅｈｌｅｒら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９８）９：５４１−５５１）、心臓の同種移植片拒絶を阻害し（Ｂｒａｕｎｅｒら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．（１９９７）１１４：９２３−９３３）、内毒素血症を抑制し（Ｘｉｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９７）４：１４０−１４９）、大腸炎を防止および処置し（Ｌｉｎｄｓａｙら、Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）１６６：７６２５−７６３３）、そして接触過敏症を軽減する（Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）１０１：１４６２−１４６７）ことが以前の報告によって実証されている。
しかし、ＩＬ−１０遺伝子治療が、継続している疼痛を逆転させる能力は、本発明の前に実証されている。
（発明の要旨）
本発明は、疼痛が抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１ｒａを送達すること、脊髄グリアを含む神経系の細胞および組織を標的するような遺伝子治療技術を用いることによって、首尾よく処置され得るという驚くべき発見に基づく。詳細には、本発明は、抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１ｒａの遺伝子送達が、温熱性痛覚過敏および機械誘発性異痛症を含む疼痛、例えば、病理的な疼痛および神経障害性疼痛を、熱刺激または機械的刺激に対する基礎的な疼痛応答性に影響することなく、防止および逆転するという受容可能な疼痛モデルにおいて示されている。これらの因子は、病状につながるグリア活性化の生成物を選択的に阻害するが、基底グリアおよびニューロンの機能を未改変のままに残すと思われるので、疼痛の管理のためのこの新規な遺伝子治療アプローチによって、神経的に集中している遺伝子治療に対して極めて望ましい代替法が得られる。さらに、炎症誘発性サイトカインに作用するＩＬ−１０および他の因子は、既存の疼痛を処置するために単独で、または遺伝子治療と組み合わされて送達され得る。
従って、１実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体において、神経障害性疼痛のような疼痛を処置する方法に関し、この方法は、この被験体の神経系に対して、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症誘発性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを、このポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で投与して疼痛を軽減する工程を包含する。
特定の実施形態では、この因子は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＬＩ−１３）、腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）、α−ＭＳＨおよびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）からなる群より選択される、１つ以上の因子である。
なおさらなる実施形態では、脊椎動物被験体はヒトであり、かつ前記抗炎症性サイトカインはヒトＩＬ−１０である。
任意の上記の実施形態では、前記組み換えベクターは、組み換えウイルス、例えば、組み換えアデノウイルスもしくは組み換えアデノ随伴ビリオン、またはプラスミドＤＮＡであってもよい。さらに、ＩＬ−１０が用いられる場合、ＩＬ−１０は、以下にさらに詳細に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ部分との融合物として分子を提供することによって安定化され得る。
さらなる実施形態では、投与は、実質内送達、クモ膜下送達、または硬膜外送達による。
さらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを、インビボでこのポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含む組成物の治療上有効な量を、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらに別の実施形態では、本発明は、哺乳動物被験体における疼痛を処置する方法に関しており、この方法は、この被験体の中枢神経系に対して、ＩＬ−１０をコードするポリヌクレオチドを発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えウイルスまたはプラスミドを、インビボにおいてこのポリヌクレオチドの発現を生じる条件下でクモ膜下投与して疼痛を軽減する工程を包含する。
特定の実施形態では、脊椎動物被験体は、ヒトであり、ＩＬ−１０はヒトＩＬ−１０である。ＩＬ−１０は、以下にさらに詳細に記載されるとおり、ＩｇＧのＦｃ部分との融合物として分子を提供することによって安定化され得る。
さらなる実施形態では、この被験体は、組み換えアデノウイルスまたは組み換えアデノ随伴ビリオンのような組み換えウイルスを投与される。他の実施形態では、この被験体はプラスミドＤＮＡを投与される。
さらなる実施形態では、この方法はさらに、発現制御レメントに作動可能に連結された、ＩＬ−１０をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを、このポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらなる実施形態では、ＩＬ−１０を含む組成物の治療上有効な量が、初回投与後５日以内に、例えば３日以内に引き続いて投与されて疼痛の軽減が維持される。
なおさらなる実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体における既存の疼痛を処置する方法に関しており、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよびサイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子の治療上有効な量をこの被験体にクモ膜下腔内に投与する工程を包含する。
特定の実施形態では、この因子は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＬＩ−１３）、腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）、α−ＭＳＨおよびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）からなる群より選択される１つ以上の因子である。
さらなる実施形態では、脊椎動物被験体は、ヒトであり、かつ抗炎症性サイトカインはヒトＩＬ−１０である。ＩＬ−１０は、以下にさらに詳細に記載されるように、ＩｇＧのＦｃ部分との融合物として分子を提供することによって安定化され得る。
なおさらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御レメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを、インビボにおいてこのポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含む組成物の治療上有効な量を、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらなる実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体において既存の疼痛を処置する方法に関しており、この方法は：
（ａ）治療上有効な量のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を含む第一の組成物をこの被験体の神経系に投与する工程と、
（ｂ）治療上有効な量のＩＬ−１０を含む第二の組成物をこの被験体の神経系に対して初回投与後５日以内に、例えば３日以内に投与する工程と、
を包含する。
特定の実施形態では、この第一の成分および第二の成分は同じである。他の実施形態では、この第一の成分および第二の成分は異なる。この第一の成分における、および／または第二の成分におけるＩＬ−１０はＩｇＧのＦｃ部分に融合され得る。さらに、特定の実施形態では、この脊椎動物被験体はヒトであり、かつこの第一の成分における、および／または第二の成分におけるＩＬ−１０はヒトＩＬ−１０である。
なおさらなる実施形態では、本発明は、脊椎動物被験体における既存の疼痛を処置する方法に関しており、この方法は：
（ａ）治療上有効な量のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を含む第一の組成物をこの被験体の神経系に投与する工程と、
（ｂ）ＩＬ−１０をコードするポリヌクレオチドを発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを、含む第二の組成物を、インビボにおいてこのポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、この被験体の神経系に投与する工程であって、この第二の組成物は第一の成分が投与された後５日以内に、例えば３日以内に投与される工程と、を包含する。
本発明の特定の実施形態では、第一の成分における、および／または第二の成分におけるＩＬ−１０はＩｇＧのＦｃ部分に融合される。さらなる実施形態では、この脊椎動物被験体はヒトであり、かつ第一の成分における、および／または前記第二の成分におけるＩＬ−１０はヒトＩＬ−１０である。
さらなる実施形態では、本発明は、神経障害性疼痛のような被験体における既存の疼痛を処置する方法に関しており、この方法は、ＩＬ−１０ポリペプチドを含む組成物の治療上有効な量をこの被験体に投与する工程を包含する。特定の実施形態では、ＩＬ−１０ポリペプチドは、ＩｇＧのＦｃ部分に融合される。さらなる実施形態では、脊椎動物被験体はヒトであり、かつ抗炎症性サイトカインはヒトＩＬ−１０である。
なおさらなる実施形態では、投与は、実質内送達、クモ膜下腔内送達または硬膜外送達による。
さらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを発現制御レメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを、インビボにおいてこのポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
さらなる実施形態では、この方法は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含む組成物の治療上有効な量を、初回投与後５日以内、例えば３日以内に引き続いて投与して、疼痛の軽減を維持する工程をさらに包含する。
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示の観点から当業者に容易に明らかである。
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、当該分野の技術の範囲内の化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献中に詳細に例示される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第二版、第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，現在追加）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
（１．定義）
本発明の記載では、以下の用語を使用して、以下に示されるように規定するものとする。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（「ａ」、「ａｎ」）」および「この、その（「ｔｈｅ」）」は、この文脈が明確に他を示すのでない限り複数の言及を包含する。従って、例えば、「抗炎症性サイトカイン（ａｎ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」という言及は、２つ以上のこのようなサイトカインの混合物などを包含する。
「病理学的疼痛、病的な疼痛（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｉｎ）」とは、機能的障害および／または病的な変化、傷害、損傷、火傷などに由来する病理から生じる任意の疼痛を意味する。病的な疼痛の１形態は、「神経障害性疼痛（ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ）」である。「神経障害性疼痛」という用語は本明細書において用いる場合、限定はしないが、神経障害、脳症および／または脊髄症（すなわち、それぞれ末梢神経系、脳および脊髄の機能的障害または病的状態）によって生じる疼痛をいう。神経障害性疼痛は、神経の障害、損傷、例えば、脊髄損傷、神経炎、炎症、非炎症病変、電気的傷害、頭痛などによって生じ得る。神経障害性疼痛はまた、限定はしないが脱髄疾患、糖尿病、アミロイド病、ポルフィリン病、ライム病、ハンセン病、末端肥大症、関節リウマチ、自己免疫疾患、代謝性疾患、ガン、およびウイルス感染を含む種々の疾患の合併によって生じ得る。このような疼痛はまた、限定はしないがヒ素、イソニアジド、鉛およびニトロフラントインによって生じる毒性状態のような毒性状態によって生じ得る。神経障害性疼痛の例としては、限定はしないが、温熱性または機械誘発性の痛覚過敏、温熱性または機械誘発性の異痛症、糖尿病性疼痛、過敏性腸症状または他の内臓障害から生じる疼痛、子宮内膜症疼痛、幻肢痛、複合性局所疼痛性症候群、線維筋痛、腰痛、癌性疼痛、末梢神経または中枢神経系に対する感染、炎症または外傷から生じる疼痛、多発性硬化症の疼痛、絞扼性（エントラップメント）疼痛、ＨＩＶ感染、ヘルペスウイルス感染由来の疼痛などが挙げられる。
「痛覚過敏（ｈｙｐｅｒａｌｇｅｓｉａ）」とは、異常に増大した疼痛感、例えば、過剰な過敏性または感度から生じる疼痛を意味する。
「痛覚鈍麻（ｈｙｐａｌｇｅｓｉａ）」（または「痛覚鈍麻（ｈｙｐｏａｌｇｅｓｉａ）」）とは、疼痛感の低下を意味する。
「異痛症（ａｌｌｏｄｙｎｉａ）」とは、皮膚に対する非毒性の刺激から生じる疼痛を意味する。異痛症の例としては、限定はしないが、冷感異痛症、触知性異痛症などが挙げられる。
「痛覚（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）」とは、本明細書においては疼痛感として規定される。「侵害受容器（ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒ）」とは、本明細書においては、痛覚を媒介する構造をいう。痛覚は、機械的刺激、電気的刺激、熱的刺激または化学的刺激のような物理的な刺激の結果であり得る。侵害受容器は、身体の実質的に全ての組織に存在する。
「鎮痛（ａｎａｌｇｅｓｉａ）」とは、本明細書においては、意識喪失のない疼痛の緩和として規定される。「鎮痛薬（ａｎａｌｇｅｓｉｃ）」は、やはり意識喪失のない疼痛の救済のために有用な因子または薬物である。
「神経系（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、中枢神経系および末梢神経系の両方を包含する。「中枢神経系（ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）」または「ＣＮＳ」という用語は、脊椎動物の脳および脊髄の全ての細胞および組織を包含する。「末梢神経系（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、脳および脊髄の外側の神経系の一部の全ての細胞および組織をいう。従って、「神経系（ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）」という用語は、限定はしないが、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、脳脊髄益（ＣＳＦ）中の細胞、間質腔の細胞、脊髄の防御被覆の細胞、硬膜外細胞（すなわち、硬膜の外側の細胞）、神経組織に隣接するか、またはそれに接触するか、または神経支配される非神経組織中の細胞、神経上膜、神経周膜、神経内膜、索、束の細胞などを包含する。
「抗炎症性サイトカイン（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）」という用語は本明細書において用いる場合、神経、ニューロン、グリア細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉、免疫細胞または他の細胞タイプによって生じる１つ以上の炎症誘発性サイトカンまたはタンパク質の作用または産生を抑制するタンパク質をいう。このような炎症性サイトカインおよびタンパク質としては、限定はしないが、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、誘導性一酸化窒素シンセターゼ（ｉＮＯＳ）などが挙げられる。抗炎症性サイトカインの非限定的な例としては、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）が挙げられ、これには、ウイルスＩＬ−１０、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、α−ＭＳＨ、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β１）などが挙げられる。これらの抗炎症性サイトカインの全て、ならびにその活性フラグメントおよび活性アナログであって、本明細書にさらに記載されるモデルを含む任意の公知の疼痛モデルにおいて測定した場合、疼痛を軽減する能力を保持しているものは、本発明で利用されるものとする。
従って、全長タンパク質およびそのフラグメント、ならびに天然の配列に対して欠失、付加および置換（現実には保存的または非保存的置換のいずれか）のような改変を有するタンパク質は、このタンパク質がその所望の活性を維持する限り、本明細書において利用されるものとする。これらの修飾は、部位指向性変異誘発による場合のように意図的であってもよく、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによって偶発性であってもよい。従って、親の配列に対して実質的に相同な活性タンパク質、例えば、疼痛を軽減する能力を保持する、７０．．．８０．．．８５．．．９０．．．９５．．．９８．．．９９％などの同一性を有するタンパク質は、本明細書で利用されるものとする。
「炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」とは、炎症誘発性サイトカインの生物学的作用を、例えば、炎症誘発性サイトカインレセプターと結合または相互作用して、これによってこの炎症誘発性サイトカインの産生を軽減または阻害することによって、ブロックまたはアンタゴナイズする任意の分子を意味する。「アンタゴニスト（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」、「インヒビター（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」および「ブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）」という用語は、本明細書において互換可能に用いられる。このようなアンタゴニストの非限定的な例としては、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）；ＫＩＮＥＲＥＴ（組み換えＩＬ−１ｒａ、Ａｍｇｅｎ）；腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）；可溶性ＴＮＦレセプターＩ型（Ａｍｇｅｎ）；ペグ化された可溶性ＴＮＦレセプターＩ型（ＰＥＧｓ ＴＮＦ−Ｒ１）（Ａｍｇｅｎ）；ＴＮＦデコイレセプター；ＥＴＡＮＥＲＣＥＰＴ（ＥＮＢＲＥＬ、Ａｍｇｅｎ）；ＩＮＦＬＩＸＩＭＡＢ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）；Ｄ２Ｅ７、ヒト抗ＴＮＦモノクローナル抗体（Ｋｎｏｌｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＣＤＰ ５７１（ヒト化抗ＴＮＦ ＩｇＧ４抗体）；ＣＤＰ８７０（抗ＴＮＦαヒト化モノクローナル抗体フラグメント）、両方ともＣｅｌｌｔｅｃｈ；ＯＮＥＲＣＥＰＴ、組み換えＴＮＦ結合タンパク質（ｒ−ＴＢＰ−１）（Ｓｅｒｏｎｏ）；ＩＬ１−レセプター２型（Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７１９（Ａｍｇｅｎ）およびＩＬ−１ Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）が挙げられる。
これらの炎症誘発性サイトカインアンタゴニストの全て、ならびにそれらの活性フラグメントおよび活性アナログであって、本明細書にさらに記載されるモデルを含む任意の公知の疼痛モデルにおいて測定した場合、疼痛を軽減する能力を保持しているものは、本発明において利用されるものとする。
従って、全長分子およびそのフラグメント、ならびに天然の配列に対して欠失、付加および置換（現実には保存的または非保存的置換のいずれか）のような改変を有するタンパク質は、このタンパク質がその所望の活性を維持する限り、本明細書において利用されるものとする。これらの修飾は、部位指向性変異誘発による場合のように意図的であってもよく、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによって偶発性であってもよい。従って、親の配列に対して実質的に相同な活性タンパク質、例えば、疼痛を軽減する能力を保持する、７０．．．８０．．．８５．．．９０．．．９５．．．９８．．．９９％などの同一性を有するタンパク質は、本明細書で利用されるものとする。
「炎症性サイトカインの作用を軽減するように機能する因子（ａｎ ａｇｅｎｔ ｔｈａｔ ａｃｔｓ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｃｔｉｏｎｓ）」とは、抗炎症誘発性サイトカイン産生を誘導する因子を意味する。このような因子としては、限定はしないが、ＩＬ−９、Ｈｓｐ２７が挙げられる（米国特許公開番号２００１／００４９３５７を参照のこと）。
これらの因子の全て、ならびにそれらの活性フラグメントおよび活性アナログであって、本明細書にさらに記載されるモデルを含む任意の公知の疼痛モデルにおいて測定した場合、疼痛を軽減する能力を保持しているものは、本発明において利用されるものとする。
従って、全長分子およびそのフラグメント、ならびに天然の配列に対して欠失、付加および置換（現実には保存的または非保存的置換のいずれか）のような改変を有するタンパク質は、このタンパク質がその所望の活性を維持する限り、本明細書において利用されるものとする。これらの修飾は、部位指向性変異誘発による場合のように意図的であってもよく、またはタンパク質を生成する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによって偶発性であってもよい。従って、親の配列に対して実質的に相同な活性タンパク質、例えば、疼痛を軽減する能力を保持する、７０．．．８０．．．８５．．．９０．．．９５．．．９８．．．９９％などの同一性を有するタンパク質は、本明細書で利用されるものとする。
「アナログ（ａｎａｌｏｇ）」という用語は、疼痛を軽減する能力を維持する、基準分子の生物学的に活性な誘導体、またはこのような誘導体のフラグメントをいう。詳細には、「アナログ」という用語は、ネイティブなポリペプチド配列、ならびに天然の分子に対して１つ以上のアミノ酸の付加、置換および／または欠失を有する構造を有する化合物をいう。特に好ましいアナログとしては、実質的に保存的である置換、すなわち、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で生じる置換が挙げられる。詳細には、アミノ酸は一般に、４つのファミリーに分割される：（１）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）無電荷極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは時に、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、イソロイシンまたはバリンでのロイシン、グルタミン酸でのアスパラギン酸、セリンでのトレオニンという孤立性の置換、または構造的に関連するアミノ酸でのアミノ酸の同様の保存的置換は、生物学的活性に対して大きな影響はないということが合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、最大約５〜１０個の保存的アミノ酸置換、もしくは非保存的アミノ酸置換、または最大では約１５〜２５もしくは５０もの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または５〜５０の間の任意の数の置換を含んでもよい。
「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」とは、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントをいう。２つのＤＮＡ配列、または２つのポリペプチド配列は、この配列がこの分子の規定される長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、お互いに対して「実質的に相同（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」である。本明細書において用いる場合、実質的にホモログとはまた、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
概して、「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチドの対応、またはアミノ酸対アミノ酸の対応をいう。同一性パーセントは、配列を整列すること、２つの整列された配列の間の適合（マッチング）の正確な数をカウントすること、短い配列の長さで割ること、およびこの結果に１００を掛けることにより、２つの分子の間の配列情報の直接比較によって決定され得る。ペプチド解析についての、Ｓｍｉｔｈ、およびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムに適合するＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣのような、容易に利用可能なコンピュータープログラムを用いて、解析を補助することができる。ヌクレオチド配列の同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）例えば、これらもＳｍｉｔｈ、およびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依るＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＡＰプログラムにおいて利用可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、かつ上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォールトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の類似性パーセントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて、６つのヌクレオチド位置のデフォールトスコアリングテーブル、およびギャップペナルティーによって決定され得る。
本発明の文脈においてパーセント類似性を確立する別の方法は、エジンバラ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）が著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ、およびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって流通されたＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを用いることである。この一組のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムは使用され得、ここでデフォールトパラメーターがスコアリングテーブルのために用いられる（例えば、ギャップオープンペナルティーが１２、ギャップ伸長ペナルティーが１、そしてギャップが６）。作成されたデータから、「マッチング（Ｍａｔｃｈ）」値は、「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を反映する。配列の間の同一性パーセントまたは類似性パーセントを算出するための他の適切なプログラムは一般に、当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォールトパラメーターとともに用いられるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ、およびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォールトパラメーターを用いて用いることができる：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド（鎖）＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ 翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ）＋Ｓｗｉｓｓタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、当該分野で周知である。
あるいは、相同性は、相同性領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼによる消化、および消化したフラグメントのサイズ決定によって決定されてもよい。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系について規定されるような、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において決定されてもよい。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。
「縮重改変体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、その核酸配列に変化を含むポリヌクレオチドであって、この縮重改変体が由来するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意図する。
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または選択されたポリヌクレオチドを「コードする（ｅｎｃｏｄｅ）」配列とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボで転写されて（ＤＮＡの場合）ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終止配列は、このコード配列に対して３’側に配置されてもよい。
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどのような任意の遺伝因子であって、適切な制御エレメントと会合された場合、複製され得、そして遺伝子配列を細胞に移動させることができる遺伝因子を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。
「組み換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、インビボで発現し得る異種の核酸配列を含むベクターを意味する。
「組み換えウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒｕｓ）」とは、例えば、異種核酸構築物の粒子中への付加または挿入によって、遺伝子的に変化されているウイルスを意味する。
「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうために用いられ、そしてこの細胞は、外因性ＤＮＡが、細胞膜の内側へ導入された場合、「トランスフェクト」されたことになる。多数のトランスフェクション技術が一般に当該分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら、（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｄａｖｉｓら、（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ａｎｄ Ｃｈｕら、（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞中に導入するために用いられ得る。
「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、コード配列および制御配列のような核酸配列に関する場合、正常には一緒に連結されない配列、および／または正常には特定の細胞と関連しない配列を意味する。従って、核酸構築物、またはベクターの「異種」領域とは、天然には他の分子との関連が見出されない別の核酸分子内の核酸のセグメント、またはそのような核酸分子に結合された、核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、コード配列であって、このコード配列との関連が天然には見出されない配列に隣接されるコード配列を含んでもよい。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物（例えば、ネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。同様に、正常には細胞に存在しない構築物を用いて形質転換された細胞は、本発明の目的について異種であるとみなされる。対立遺伝子の改変、または天然に存在する変異性の事象は、本明細書において用いられるように、異種ＤＮＡを生じない。
「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」配列とは、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、限定はしないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、および２、６−ジアミノプリンのような、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含む配列を包含する。
ＤＮＡ「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、総称的に、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）エンハンサー、などをいい、これらは集団として、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、および翻訳を提供するものである。選択されたコード配列が、適切な宿主細胞において複製、転写、および翻訳できるのでさえあれば、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、本明細書において、その通常の意味で用いられ、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域であって、この調節配列が、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、かつ下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができる遺伝子から誘導される、ヌクレオチド領域をいう。転写プロモーターとしては、「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」（ここでは、このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質、などによって誘導される）、「抑制性プロモーター（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」（ここでは、このプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質、などによって誘導される）、および「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」を挙げることができる。
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、エレメントの配置であって、ここで、そのように記載された成分が、その通常の機能を発揮するように構成されている配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の発現を発揮し得る。この制御配列は、それらがその発現を指向するように機能しさえすれば、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、介在する、未翻訳だが、転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列は、コード配列に対して「作動可能に連結される」と依然として見なすことができる。
「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、ヌクレオチド配列をいう場合、示された分子が、同じタイプの他の生物学的高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。従って、「特定のポリペプチドをコードする単離された核酸分子（ｉｓｏｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、核酸分子であって、対象のポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に含まない核酸分子、をいう；しかし、この分子は、この組成物の基本的特徴に有害に影響しない、いくつかのさらなる塩基または部分を含んでもよい。
本出願を通じて、特定の核酸分子におけるヌクレオチド配列の相対的位置を記載する目的のために、例えば、特定のヌクレオチド配列が、別の配列に対して、「上流（ｕｐｓｔｒｅａｍ）」、「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」、「最も３側（３’）」、または「最も５側（５’）」であると記載される場合、それは、当該分野で従来いわれているとおり、ＤＮＡ分子の「センス」鎖、または「コード」鎖における配列の位置であることが理解されるべきである。
「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」、または「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」という用語は、本明細書において互換可能に用いられて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物をいう。哺乳動物としては、マウス、げっ歯類、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットが挙げられるがこれらに限定されない。
組成物または因子の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ」という用語は、本明細書において用いる場合、所望の応答、例えば、疼痛の軽減または逆転を得るのに十分であるが毒性ではない組成物または因子の量をいう。必要な正確な量は、被験体間で異なり、その被験体の種、年齢および一般的状態、処置されている状態の重篤度、および目的の特定の高分子、投与の方式などに依存する。任意の個体の場合の適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて当業者によって決定され得る。
疼痛の「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」としては、（１）疼痛の緩和、すなわち、疼痛に曝され得るかまたは疼痛に対する素因があるが疼痛の経験もなく疼痛を示してもいない被験体において、疼痛を発症させないか、強度を小さくすること、（２）疼痛を阻害すること、すなわち、疼痛の発症を阻止するかまたは疼痛を逆転すること、あるいは（３）疼痛を救済すること、すなわち、被験体が経験する疼痛の量を低下させることを包含する。
「既存の疼痛を処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ ｅｘｉｓｔｉｎｇ ｐａｉｎ）」とは、少なくとも２４時間、例えば２４〜９６時間以上、例えば、２５．．．３０．．．３５．．．４０．．．４５．．．４８．．．５０．．．５５．．．６５．．．７２．．．８０．．．９０．．．９６．．．１００などの時間、疼痛を経験している被験体において疼痛を救済または逆転することを意味する。この用語はまた、数週間、数ヶ月または数年間もの長期間にわたって存在している疼痛を処置することも意図する。
（２．本発明を実行する方式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物またはプロセスパラメーター自体には限定されず、当然ながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的でしかなく、限定を意図するものではないということも理解されるべきである。
本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な多数の方法および材料が本発明の実施に用いられ得るが、好ましい材料および方法は本明細書に記載される。
本発明の中心は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症誘発性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する他の因子をコードする遺伝子を用いる遺伝子治療が、脊椎動物被験体において疼痛を軽減するように働くという発見である。疼痛管理に対するこのアプローチの利点は多数である。第一に、少なくとも温熱および機械的な刺激に対する基本的な疼痛応答性は変化されない。従って、正常な疼痛処置は、ＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインの有効用量の存在によって著しく影響されることはないようである。第二に、ＩＬ−１０のような抗炎症性サイトカインは、グリア活性化の病理的局面を標的して、活性化されたグリアが疼痛調節系に作用する侵害誘発性（ｐｒｏｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ）の影響を抑制すると考えられる。第三に、この因子は病的な疼痛が発症するのを防ぐだけでなく、既に樹立された病理的な疼痛状態を軽減および／または逆転もし得る。
遺伝子治療技術はまた、単独で、または伝統的な薬物およびタンパク質送達技術と組み合わせて用いられ得る。あるいは、炎症誘発性サイトカインに作用する因子、例えば、本明細書に記載される任意の抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインアンタゴニストは、既存の疼痛を有する被験体を処置するために、遺伝子治療なしで、単独で投与されてもよい。
本発明をさらに理解するために、抗炎症性サイトカインおよび本発明とともに用いるための種々の遺伝子送達方法に関して、以下にさらに詳細な考察が提供される。
（抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子）
上記で例示されるように、本発明は、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子を利用して、病的な疼痛および神経障害性の疼痛のような疼痛を処置する。本発明とともに用いるための特に好ましい抗炎症性サイトカインおよびアンタゴニストとしては、限定はしないが、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＬＩ−１３）、腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）、α−ＭＳＨおよびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）が挙げられる。本明細書でさらに記載される疼痛モデルを含む、任意の公知の疼痛モデルで測定した場合、疼痛を軽減する能力を保持しているこの天然の分子、ならびにそのフラグメントおよびアナログは、本発明で使用されるものとする。本明細書における使用のための１つの特に好ましいＩＬ−１０としては、以下にさらに詳細に記載される、ＩｇＧのＦｃ部分に対するＩＬ−１０の融合物が挙げられる。さらに、任意の多数の種由来の配列が、処置される動物に依存して、本発明とともに用いられ得る。
例えば、ＩＬ−１０に関連する多数の配列、ならびに疼痛を軽減するように機能するＩＬ−１０のフラグメント、改変体およびアゴニストも本明細書において用途を見出す。例えば、ＩＬ−１０に関連する配列は、例えば、国際公開番号ＷＯ００／６５０２７；ＷＯ ９８／２８４２５；ＷＯ ９５／２４４２５（免疫調節物質の旋毛虫物質）に記載される。国際公開番号ＷＯ ９５／０３４１１は、短縮されたＩＬ−１０配列、成熟ヒト配列のカルボキシル末端および／またはアミノ末端でアミノ酸置換または欠失を有するＩＬ−１０の改変体およびアゴニストを記載している；米国特許第６，４２８，９８５号は、成熟ヒトＩＬ−１０配列の８７位のＩｌｅのＡｌａまたはＧｌｙによる置換を有するＩＬ−１０改変体を記載している；米国特許第６，１５９，９３７号は、配列Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）（配列番号４）を有するＩＬ−１０フラグメントを記載している；国際公開番号ＷＯ ９７／２６７７８は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｔｈｒ−Ｘ４−Ｌｙｓ−Ｘ５−Ａｒｇ−Ｘ６（配列番号５）を有するＩＬ−１０改変体を記載しており、ここでＸ１＝ＡｌａまたはＧｌｙであり；Ｘ２＝ＴｙｒまたはＰｈｅであり；Ｘ３、Ｘ４およびＸ５は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌから独立して選択され；そしてＸ６＝Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＧｌｙである。
数種の動物種に由来する、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子、ならびにその改変体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、周知である。例えば、ＩＬ−１０は、多数の動物およびウイルス種から単離されている。本明細書における使用のためのＩＬ−１０としては、任意のこれらの種々の種由来のＩＬ−１０が挙げられる。ウイルスＩＬ−１０の非限定的な例としては、ヘルペスウイルスから、例えば、エプスタインバーウイルス（例えば、Ｍｏｏｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４８：１２３０−１２３４；Ｈｓｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：８３０−８３２；Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１８２：４７７−４８６を参照のこと）、サイトメガロウイルス（例えば、Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅら、Ｖｉｒｏｌ．（２０００）２６８：２７２−２８０；Ｋｏｔｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：１６９５−１７００；国際公開番号ＷＯ ０１／１６１５３を参照のこと）、およびウマヘルペスウイルス（例えば、Ｒｏｄｅら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ（１９９３）７：１１１−１１６を参照のこと）から単離されたＩＬ−１０ホモログ、ならびにＯｒＦウイルス由来のＩＬ−１０ホモログ（例えば、Ｉｍｌａｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）８３：１０４９−１０５８およびＦｌｅｍｉｎｇら、Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ（２０００）２１：８５−９５を参照のこと）が挙げられる。また、本明細書の図３１も参照のこと、この図では、ウイルスのＩＬ−１０の成熟の分泌型のアミノ酸配列が示されている。本発明で用いられるための他のＩＬ−１０配列の代表的な非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００５７２、Ｕ６３０１５、ＡＦ４１８２７１、ＡＦ２４７６０３、ＡＦ２４７６０４、ＡＦ２４７６０６、ＡＦ２４７６０５、ＡＹ０２９１７１、ＵＬ１６７２０（全てヒト配列）、ならびにヒトＩＬ−１０の成熟の分泌型のアミノ酸配列が示されている本明細書の図３１；ＮＭ０１２８５４、Ｌ０２９２６、Ｘ６０６７５（ラット）；ＮＭ０１０５４８、ＡＦ３０７０１２、Ｍ３７８９７、Ｍ８４３４０（全てマウスの配列）、ならびにマウスＩＬ−１０の成熟の分泌型のアミノ酸配列が示されている本明細書の図３１；Ｕ３８２００（ウマ）；Ｕ３９５６９、ＡＦ０６０５２０（ネコの配列）；Ｕ００７９９（ウシ）；Ｕ１１４２１、Ｚ２９３６２（ヒツジの配列）；Ｌ２６０３１、Ｌ２６０２９（マカクの配列）；ＡＦ２９４７５８（サル）；Ｕ３３８４３（イヌ）；ＡＦ０８８８８７、ＡＦ０６８０５８（ウサギの配列）；ＡＦ０１２９０９、ＡＦ１２００３０（マーモットの配列）；ＡＦ０２６２７７（フクロネズミ）；ＡＦ０９７５１０（モルモット）；Ｕ１１７６７（シカ）；Ｌ３７７８１（アレチネズミ）；ＡＢ１０７６４９（ラマおよびラクダ）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＩＬ−１ｒａ配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ１７３８４３、ＮＭ１７３８４２、ＮＭ１７３８４１、ＮＭ０００５７７、ＡＹ１９６９０３、ＢＣ００９７４５、ＡＪ００５８３５、Ｘ６４５３２、Ｍ６３０９９、Ｘ７７０９０、Ｘ５２０１５、Ｍ５５６４６（全てヒトの配列）；ＮＭ１７４３５７、ＡＢ００５１４８（ウシの配列）；ＮＭ０３１１６７、Ｓ６４０８２、Ｍ５７５２５、Ｍ６４４０４４（マウスの配列）；Ｄ２１８３２、５６８９７７、Ｍ５７５２６（ウサギの配列）；ＳＥＧ ＡＢ０４５６２５Ｓ、Ｍ６３１０１（ラットの配列）；ＡＦ２１６５２６、ＡＹ０２６４６２（イヌの配列）；Ｕ９２４８２、Ｄ８３７１４（ウマの配列）；ＡＢ０３８２６８（イルカ）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＩＬ−４配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ１７２３４８、ＡＦ３９５００８、ＡＢ０１５０２１、Ｘ１６７１０、Ａ０００７６、Ｍ１３９８２、ＮＭ０００５８９（全てヒトの配列）；ＢＣ０２７５１４、ＮＭ０２１２８３、ＡＦ３５２７８３、Ｍ２５８９２（マウスの配列）；ＮＭ１７３９２１、ＡＨ００３２４１、Ｍ８４７４５、Ｍ７７１２０（ウシの配列）；ＡＹ１３０２６０（チンパンジー）；ＡＦ０９７３２１、Ｌ２６０２７（サル）；ＡＹ０９６８００、ＡＦ１７２１６８、Ｚ１１８９７、Ｍ９６８４５（ヒツジの配列）；ＡＦ０３５４０４、ＡＦ３０５６１７（ウマの配列）；ＡＦ２３９９１７、ＡＦ１８７３２２、ＡＦ０５４８３３、ＡＦ１０４２４５（イヌの配列）；Ｘ１６０５８（ラット）；ＡＦ０４６２１３（ハムスター）；Ｌ０７０８１（シカ）；Ｕ３９６３４、Ｘ８７４０８（ネコ）；Ｘ６８３３０、Ｌ１２９９１（ブタの配列）；Ｕ３４２７３（ヤギ）；ＡＢ０２０７３２（ドルフィン）；Ｌ３７７７９（アレチネズミ）；ＡＦ０６８０５８、ＡＦ１６９１６９（ウサギの配列）；ＡＢ１０７６４８（ラマおよびラクダ）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＩＬ−１３配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ００２１８８、Ｕ１０３０７、ＡＦ３７７３３１、Ｘ６９０７９（全てヒトの配列）；ＮＭ０５３８２８、Ｌ２６９１３（ラットの配列）；ＡＦ３８５６２６、ＡＦ３８５６２５（ブタの配列）；ＡＦ２４４９１５（イヌ）；ＮＭ１７４０８９（ウシ）；ＡＹ２４４７９０（サル）；ＮＭ００８３５５（マウス）；ＡＢ１０７６５８（ラクダ）；ＡＢ３１０７６５０（ラマ）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＴＧＦ−β１配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００６６０、ＢＤ００９７５０５、ＢＤ００９７５０４、ＢＤ００９７５０３、ＢＤ００９７５０２（全てヒトの配列）；ＮＭ０２１５７８、Ｘ５２４９８（ラットの配列）；ＡＪ００９８６２、ＮＭ０１１５７７、ＢＣ０１３７３８、Ｍ５７９０２（マウスの配列）；ＡＦ４６１８０８、Ｘ１２３７３、Ｍ２３７０３（ブタの配列）；ＡＦ１７５７０９、Ｘ９９４３８（ウマの配列）；Ｘ７６９１６（ヒツジ）；Ｘ６０２９６（ハムスター）；Ｌ３４９５６（イヌ）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのα−ＭＳＨ配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ ０００９３９（ヒト）；ＮＭ１７４５１（ウシ）；ＮＭ ００８８９５（マウス）；およびＭ １１３４６（アフリカツメガエル）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＴＮＦレセプター配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｘ５５３１３、Ｍ６０２７５、Ｍ６３１２１、ＮＭ１５２９４２、ＮＭ００１２４２、ＮＭ１５２８７７、ＮＭ１５２８７６、ＮＭ１５２８７５、ＮＭ１５２８７４、ＮＭ１５２８７３、ＮＭ１５２８７２、ＮＭ１５２８７１、ＮＭ００００４３、ＮＭ００１０６５、ＮＭ００１０６６、ＮＭ１４８９７４、ＮＭ１４８９７３、ＮＭ１４８９７２、ＮＭ１４８９７１、ＮＭ１４８９７０、ＮＭ１４８９６９、ＮＭ１４８９６８、ＮＭ１４８９６７、ＮＭ１４８９６６、ＮＭ１４８９６５、ＮＭ００３７９０、ＮＭ０３２９４５、ＮＭ００３８２３、ＮＭ００１２４３、ＮＭ１５２８５４、ＮＭ００１２５０（全てヒトの配列）；ＮＭ０１３０９１、Ｍ６５１１２２（ラットの配列）に記載される配列が挙げられる。
本発明での使用のためのＩＬ−９配列の非限定的な例としては、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００５９０（ヒト）およびＮＭ００８３７３（マウス）に記載される配列が挙げられる。
本発明で用いるための所望の抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインを軽減または防止するように作用する因子をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術を用いて作製され得る。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、遺伝子を発現する細胞からｃＤＮＡおよびゲノムのライブラリーをスクリーニングすること、またはこれらを含むことが公知のベクターから遺伝子を誘導することなどによる、組み換え方法を用いて得ることができる。目的の遺伝子はまた、公知の配列に基づいて、クローニングではなく合成的に産生されてもよい。この分子は、特定の配列のための適切なコドンで設計されてもよい。次いで完全な配列が標準的な方法で調製された重複するオリゴヌクレオチドからアセンブリされて、完全なコード配列にアセンブルされる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２３：１２９９；およびＪａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８４）２５９：６３１１を参照のこと。
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を有するベクターから得ることができるし、または必要に応じて、部位指向性変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術のような当該分野で公知の種々のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて、完全にもしくは部分的に合成されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照のこと。所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１方法は、従来の自動化されたポリヌクレオチドシンセサイザーで生成された重複する合成オリゴヌクレオチドの相補的セットをアニーリングすること、続いて、適切なＤＮＡリガーゼを用いるライゲーションおよび連結されたヌクレオチド配列のＰＣＲによる増幅による。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４０８４−４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向性の合成（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）５４：７５−８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向性変異誘発（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６）、ならびにＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップのオリゴヌクレオチドの酵素的な充填（Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１００２９−１００３３）が本発明の方法における使用のための分子を提供するために用いられ得る。
（遺伝子送達技術）
上記のような抗炎症性遺伝子は、任意のいくつかの遺伝子送達技術を用いて該当の被験体に送達される。遺伝子送達のためのいくつかの方法が当該分野で公知である。以下にさらに記載されるとおり、遺伝子は、哺乳動物被験体に直接送達されてもよいし、または被験体に由来する細胞にエキソビボで送達されてこの細胞がこの被験体に再移植されてもよい。
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために多数のウイルスに基づく系が開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のために簡便な基盤を提供する。選択された遺伝子は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、この組換えウイルスが、単離され、そしてインビボまたはエキソビボで被験体の細胞に送達され得る。多数のレトロウイルス系が記載されている。例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；ＢｕｒｎｓらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ（１９９３）３：１０２−１０９を参照のこと。複製欠損のマウスレトロウイルスベクターは広範に利用される遺伝子導入ベクターである。マウス白血病レトロウイルスは、核コアタンパク質およびタンパク質コア（ｇａｇ）に入れられたポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合されて、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）によって囲まれた一本鎖ＲＮＡを含む。レトロウイルスのゲノム構造は、５’および３’の末端反復配列（ＬＴＲｓ）で囲まれるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。５’および３’ＬＴＲならびにパッケージングシグナルを含む最小ベクターは、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株中でトランスで提供される条件では、ベクターのパッケージングならびに標的細胞への感染および取り込みを可能にするのに十分であるという事実を、レトロウイルスベクター系は活用する。遺伝子移入のためのレトロウイルスベクターの基本的な利点としては、ほとんどの細胞タイプでの効率的な感染および遺伝子発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの正確な一回コピーのベクター取り込み、およびレトロウイルスゲノムの操作の容易さが挙げられる。
多数のアデノウイルスベクターもまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、これによって、挿入変異誘発に関連する危険性を最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。本発明の方法における使用のためのアデノウイルスベクターは以下にさらに詳細に記載される。
さらに、種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、遺伝子送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９８８）８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（１９９０）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。ＡＡＶベクター系はまた以下にさらに詳細に記載される。
目的の核酸分子を送達するための用途を見出すさらなるウイルスベクターとしては、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含むポックスウイルスのファミリーから誘導されるウイルスベクターが挙げられる。１例として、遺伝子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。特定のポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列、例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを用いて、ワクシニアで同時に感染される細胞をトランスフェクトする。相同組換えは、ワクシニアプロモーターに加えてこのタンパク質をコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入するように機能する。得られたＴＫ−組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって選択することができる。
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）、例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスを用いても、目的のコード配列を送達することができる。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を付与することが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、従って哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ ９１／１２８８２；ＷＯ ８９／０３４２９；およびＷＯ ９２／０３５４５を参照のこと。
分子結合体化ベクター、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクターも、遺伝子送達に用いられ得る。
限定はしないが、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルス由来のベクターのようなアルファウイルス属のメンバーも抗炎症性サイトカイン遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての用途を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンバスウイルス（Ｓｉｎｂｕｓ−ｖｉｒｕｓ）由来のベクターの説明については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；ならびに国際公開番号ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。
あるいは、抗炎症性サイトカインは、ウイルスベクターの使用なしに、例えば、米国特許第６，４１３，９４２号；同第６，２１４，８０４号；同第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，７６３，２７０号および同第５，６９３，６２２号に記載されるようなプラスミドに基づく核酸送達系を用いることによって、送達され得る。プラスミドは、インビボにおいてタンパク質産物の発現を指向する制御エレメントに作動可能に連結された目的の遺伝子を包含する。このような制御エレメントは当該分野で周知である。
（プラスミド遺伝子送達系）
上記で例示されるように、目的の遺伝子は、プラスミドのような非ウイルスベクター、および当該分野で周知の任意のいくつかのプラスミド送達技術を用いて、被験体に、または被験体の細胞に導入され得る。例えば、ベクターは、例えば、米国特許第６，４１３，９４２、同第６，２１４，８０４号および同第５，５８０，８５９号に記載されるように送達因子なしで導入されてもよい。
あるいは、目的の遺伝子をコードするベクターは、米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５４９，１２７号；同第５，２６４，６１８号；同第５，７０３，０５５号に記載されるように、被験体に、またはそれに由来する細胞に送達される前に、リポソーム中にパッケージングされ得る。脂質のカプセル化は一般に、核酸を安定に結合するかまたは包含して保持し得るリポソームを用いて達成され得る。脂質調製物に対する凝縮ＤＮＡの比は変化し得るが、一般には、１：１（ＤＮＡのｍｇ：脂質のマイクロモル）であるか脂質がさらに多い。核酸の送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用の概説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）、第１０１巻、ｐｐ５１２−５２７を参照のこと。ＤＮＡはまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１によって記載されるのと同様の蝸牛状脂質組成物中で送達されてもよい。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号も参照のこと。
ベクターはまた、当該分野で周知の粒子状のキャリアでカプセル化されても、それに吸着されても、またはそれに会合されてもよい。このようなキャリアは、免疫系に対して多数のコピーの選択された分子であり、そして局所のリンパ節における分子の捕獲および保持を容易にする。この粒子は、マクロファージによって食作用を受けることが可能であり、そしてサイトカイン放出を通じて抗原提示を増強し得る。粒子状のキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される微小粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
さらに、プラスミドＤＮＡは、核局在シグナルまたは同様の修飾によってガイドされ得る。
さらに、金およびタングステンのような粒子性キャリアを使用する微粒子銃送達システム（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ）は、目的の遺伝子を送達するために有用である。この粒子は、送達されるべき遺伝子でコーティングされて、一般に減圧下で、「遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」から火薬充填を用いて、高速まで加速される。このような技術およびその技術に有用な装置については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第５，１７９，０２２号；同第５，３７１，０１５号および同第５，４７８，７４４号を参照のこと。
ベクターを送達するためには、広範な種々の他の方法が用いられ得る。このような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジンまたはポリオルニチン媒介性トランスフェクション、または他の不溶性の無機塩、例えば、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、滑石などを用いる沈殿が挙げられる。トランスフェクションの他の有用な方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合、ペプチド送達またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞を形質転換するための技術の考察については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；そして遺伝子移入のために有用な送達系の概説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポレーションを用いてＤＮＡを送達するための方法は、例えば、米国特許第６，１３２，４１９号；同第６，４５１，００２号、同第６，４１８，３４１号、同第６２３３，４８３号、米国特許公開番号２００２／０１４６８３１；および国際公開番号ＷＯ／００４５８２３に記載される。
持続的な発現を得るために、免疫グロブリン分子に対して目的の遺伝子をコードするプラスミドを融合することも所望され得る。従来の技術の１つは、非細胞溶解性変異を有するマウスＩｇＧ２ａのＦｃ部分に対して目的の因子をコードするプラスミドを融合することである。さらに、ＩＬ−１０遺伝子は、ＩｇＧのＦｃ部分に融合された融合タンパク質の形態で存在し得る。このような技術は、特にエレクトロポレーションと組み合わされた場合、ＩＬ−１０のようなサイトカインの持続的な発現を提供することが示されている。例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）１３３：４２３−４２７；およびＡｄａｃｈｃｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００２）９：５７７−５８３を参照のこと。
（アデノウイルス遺伝子送達系）
本発明の好ましい実施形態では、抗炎症性サイトカインをコードするヌクレオチド配列が、アデノウイルスベースの発現ベクターに挿入される。アデノウイルスゲノムは、各々の鎖の５’末端に共有結合された５５−ｋＤａの末端タンパク質を有する約３６，０００塩基対の直線の二本鎖ＤＮＡ分子である。アデノウイルス（「Ａｄ」）ＤＮＡは、血清型に依存して正確な長さで約１００塩基対の同一の逆方向末端反復（「ＩＴＲ」）を含む。複製のウイルス起点は、ＩＴＲ内で正確にゲノム末端に位置する。ＤＮＡ合成は２つの段階で生じる。第一に、複製は、娘二重分子および平行な置換鎖を生成する鎖の置き換えによって進行する。この置換鎖は、一本鎖であって、「パンハンドル（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）」中間体を形成し得、これによって、娘二重分子の複製開始および生成を可能にする。あるいは、複製はゲノムの両端から同時に進行し得、これによってパンハンドル構造を形成する要件が除かれる。
生産的な感染周期の間、ウイルス遺伝子は、２つの相で発現される：ウイルスＤＮＡ複製にまでいたる期間である初期段階、およびウイルスＤＮＡ複製の開始と一致する後期段階。初期段階の間、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４の領域によってコードされる初期遺伝子産物のみが発現され、これがウイルスの構造的タンパク質の合成のために細胞を調製する多数の機能を実行する。後期段階の間、後期ウイルス遺伝子産物が初期遺伝子産物に加えて発現されて、宿主細胞ＤＮＡおよびタンパク質合成が停止される。結果として、細胞は、ウイルスＤＮＡおよびウイルスの構造的タンパク質の産生に供される。
アデノウイルスのＥ１領域は、標的細胞の感染後に発現される第一領域である。この領域は、２つの転写単位であるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子からなる。Ｅ１Ａ遺伝子産物の主な機能は、静止期の細胞が細胞周期に入り細胞ＤＮＡ合成を再開するように誘導すること、ならびにＥ１Ｂ遺伝子および他の初期領域（Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４）を転写的に活性化することである。Ｅ１Ａ遺伝子のみを用いる一次細胞のトランスフェクションは、制限のない増殖を誘導し得る（不死化）が、完全なトランスフェクションは生じない。しかし、Ｅ１Ａの発現はほとんどの場合、プログラムされた細胞死（アポトーシス）の誘導、およびごくたまには不死化を生じる。Ｅ１Ｂ遺伝子の同時発現には、アポトーシスの誘導を妨げること、および完全な形態学的形質転換が生じることが必要とされる。樹立された不死化細胞株では、Ｅ１Ａの高レベル発現は、Ｅ１Ｂの非存在下で完全な形質転換を生じ得る。
Ｅ１Ｂコードタンパク質は、細胞機能にウイルス複製をさせるように指示することにおいてＥ１Ａを補助する。本質的に核に局在する複合体を形成する、Ｅ１Ｂ ５５ｋＤおよびＥ４ ３３ｋＤタンパク質は、宿主タンパク質の合成を阻害するのに、そしてウイルス遺伝子の発現を促進するのに機能する。それらの主な影響は、感染の後期段階の開始と同時に、核から細胞質へのウイルスｍＲＮＡの選択的輸送を確立することである。Ｅ１Ｂ ２１ｋＤタンパク質は、生産的な感染周期の正確な一時的制御に重要であり、これによってウイルスのライフサイクルが終了される前に宿主細胞が早死にすることを妨げるものである。
アデノウイルスベースのベクターは、遺伝子産物ペプチドを高レベルで発現する。アデノウイルスベクターは、低力価のウイルスでさえ高い有効性の感染度を有する。さらに、このウイルスは、無細胞ビリオンとして完全に感染性であり、そのためプロデューサー細胞株の注射は不必要である。アデノウイルスベクターは、インビボで異種遺伝子の長期発現を達成する。アデノウイルスは、重篤なヒト病状には関連しないので、このウイルスは広範な種々の細胞に感染し得、そして広範な宿主範囲を有し、このウイルスは、比較的簡単に大量で産生され得、そしてこのウイルスは、ウイルスゲノムの初期領域１（「Ｅ１」）における欠失によって複製欠損にされ得る。従って、少なくともＥ１領域が欠失されており目的の遺伝子で置換されているヒトアデノウイルス由来のベクターは、前臨床段階および臨床段階で遺伝子治療実験に大規模に用いられている。
本発明での使用のためのアデノウイルスベクターは、限定はしないが任意の４０を越える血清型株のアデノウイルスを含む任意の種々のアデノウイルス血清型、例えば、血清型２、５、１２、４０および４１に由来する。本明細書で用いられるアデノウイルスベクターは、複製欠損であり、安定なプロモーター、例えば、アデノ随伴ウイルスに関して以下に考察される任意のプロモーターの制御下で目的の遺伝子を含む。例えば、米国特許第６，０４８，５５１号は、それぞれ、ＡｄＲＳＶＩＬ−１０およびＡｄ．ＲＳＶＩＬ−１ｒａと命名される、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０のヒト遺伝子を含む複製欠損アデノウイルスベクター、ならびに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの制御下で、抗炎症性サイトカインＩＬ−１ｒａの遺伝子を含むベクター、を記載している。
任意のアデノウイルス血清型由来であって、異なるプロモーター系を有する他の組み換えアデノウイルスは当業者によって用いることができる。例えば、米国特許第６，３０６，６５２号は、Ｅ２Ａ過剰発現による細胞死を妨げるための、ｔｓ４００と命名される、ｈｒ変異およびｔｓ１２５変異を含む、Ｅ２Ａ配列を有するアデノウイルスベクター、ならびにｈｒ変異のみを誘導性プロモーターの制御下で含む、２Ａ配列を有するベクター、ならびにｈｒ変異およびｔｓ１２５変異（ｔｓ４００）を、誘導性プロモーターの制御下で含む、Ｅ２Ａ配列を有するベクターを記載する。
さらに、米国特許第６，３０６，６５２号に記載されるような「最小（ｍｉｎｉｍａｌ）」アデノウイルスベクターは、本発明での用途を見出す。このようなベクターは、ウイルス粒子へのゲノムのキャプシド形成に必要であるウイルスゲノム（キャプシド形成シグナル）の少なくとも一部、ならびにＩＴＲの少なくとも機能的部分または誘導体の少なくとも１コピーを保持する。最小アデノウイルスベクターのパッケージングは、米国特許第６，３０６，６５２号に記載されるように、ヘルペスウイルスとの、またはパッケージング欠損複製ヘルパー系との同時感染によって達成され得る。
抗炎症性サイトカインの送達のための他の有用なアデノウイルスベースのベクターとしては、ウイルスゲノムのかなりの部分が除去されている「無力な（ｇｕｔｌｅｓｓ）」（ヘルパー依存性）アデノウイルスが挙げられる（Ｗｕら、Ａｎｅｓｔｈｅｓ．（２００１）９４：１１１９−１１３２）。このような「無力な」アデノウイルスベクターは本質的に、ウイルスタンパク質を作製せず、そのために、ウイルス駆動による遺伝子治療が単回投与後１年間にわたって首尾よく続くことが可能になり（Ｐａｒｋｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．（２０００）５８：１−１１；Ｔｓａｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２：５１５−５２３）、免疫系による妨害を排除する。さらに、ウイルスゲノムの除去によって、全身投与された薬物による発現調節を提供する制御配列の挿入のための空間が作製され（Ｂｕｒｃｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９）９６：３５５−３６０）、ウイルスが駆動するタンパク質発現の安全性および制御の両方が加えられる。これらおよび他の組み換えアデノウイルスは、本発明での用途を見出す。
（アデノ随伴ウイルス遺伝子送達系）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、遺伝子治療のための遺伝子を送達することは成功している。ＡＡＶゲノムは直線で、約４６８１ヌクレオチドを含む一本鎖ＤＮＡ分子である。ＡＡＶゲノムは一般に、各々の末端に逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接している内部の非反復ゲノムを含む。このＩＴＲは、約１４５塩基対（ｂｐ）の長さである。ＩＴＲは、多様な機能を有し、この機能としては、ＤＮＡの複製起点、およびウイルスゲノムのパッケージングシグナルを提供することが挙げられる。このゲノムの内部非反復部分としては、ＡＡＶ複製（ｒｅｐ）遺伝子、およびキャプシド（ｃａｐ）遺伝子として公知の、２つの大きいオープンリーディングフレームが挙げられる。このｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子は、ウイルスの複製、およびビリオンへのパッケージングを可能にするウイルスタンパク質をコードする。詳細には、少なくとも４つのウイルスタンパク質のファミリーが、その見かけの分子量によって、Ｒｅｐ ７８、Ｒｅｐ ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０と命名されたＡＡＶ ｒｅｐ領域から発現される。このＡＡＶ ｃａｐ領域は、少なくとも３つのタンパク質であるＶＰＩ、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。
ＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの内部非反復部分（すなわち、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子）を欠失すること、およびＩＴＲの間に異種遺伝子（この場合には、この抗炎症性サイトカインをコードする遺伝子）を挿入することによって、目的の遺伝子を送達するように操作されている。この異種遺伝子は代表的に、適切な条件下で、患者の標的細胞における遺伝子発現を駆動し得る異種プロモーター（構成的プロモーター、細胞特異的プロモーター、または誘導性プロモーター）に機能的に連結される。終止シグナル（例えば、ポリアデニル化部位）がまた含まれてもよい。
ＡＡＶは、ヘルパー依存性ウイルスである；すなわち、ＡＡＶビリオンを形成するためには、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニア）との同時感染が必要である。ヘルパーウイルスとの同時感染がなければ、ＡＡＶは、ウイルスゲノムが宿主細胞染色体へ入るが、感染ビリオンは生成されない潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによる引き続く感染は、組み込まれたゲノムを「レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）」して、これによって、そのゲノムを複製して感染性ＡＡＶビリオンへパッケージングすることを可能にする。ＡＡＶは、異なる種由来の細胞に感染し得るが、ヘルパーウイルスは、宿主細胞と同じ種のものでなければならない。従って、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌのアデノウイルスに同時感染されたイヌの細胞において複製する。
抗炎症性サイトカインコード配列を含む組み換えＡＡＶビリオンは、以下にさらに詳細に記載される種々の当該分野で認識される技術を用いて産生され得る。野生型ＡＡＶおよびヘルパーウイルスを用いて、ｒＡＡＶビリオンを産生するために必要な複製機能を提供することができる（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと）。あるいは、ヘルパー機能遺伝子を含むプラスミドは、周知のヘルパーウイルスの１つによる感染と組み合わされて、複製機能の供給源として用いられ得る（例えば、米国特許第５，６２２，８５６号、および米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと）。同様に、アクセサリ機能遺伝子を含むプラスミドを、野生型ＡＡＶによる感染と組み合わせて用いて、必要な複製機能を提供することができる。これらの３つのアプローチは、ｒＡＡＶベクターと組み合わせて用いられる場合、ｒＡＡＶビリオンを生成するのに各々が十分である。当該分野で周知の他のアプローチをまた当業者によって使用して、ｒＡＡＶビリオンを生成することができる。
本発明の好ましい実施形態では、三重トランスフェクション法（ｔｒｉｐｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載される）を用いて、ｒＡＡＶビリオンを生成する。なぜなら、この方法は、感染性ヘルパーウイルスの使用が必要ではなく、いずれの検出可能なヘルパーウイルスも存在することなしに、ｒＡＡＶビリオンが生成されることを可能にするからである。これは、ｒＡＡＶビリオン生成のための以下の３つのベクターの使用によって達成される：ＡＡＶヘルパー機能ベクター、アクセサリ機能ベクター、およびｒＡＡＶ発現ベクター。しかし、これらのベクターによってコードされた核酸配列は、種々の組み合わせで２つ以上のベクターに提供され得ることを、当業者は、理解する。
本明細書において説明されるとおり、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、「ＡＡＶヘルパー機能（ＡＡＶ ｈｅｌｐｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」配列（すなわち、ｒｅｐ、およびｃａｐ）をコードし、この配列が、生産的なＡＡＶ複製およびキャプシド形成のためにトランスで機能する。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能なｗｔ ＡＡＶビリオン（すなわち、機能的なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶビリオン）を生成することなく、効率的なＡＡＶベクター産生を支持する。このようなベクターの例であるｐＨＬＰ１９は、米国特許第６，００１，６５０号に記載される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターのｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子は、上記で説明されたように、任意の公知のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、ＡＡＶ−２由来のｒｅｐ遺伝子、およびＡＡＶ−６由来のｃａｐ遺伝子を有してもよい；当業者は、決定的な特徴がｒＡＡＶビリオン産生を支持する能力である、他のｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の組み合わせが可能であることを認識する。
アクセサリ機能ベクターは、非ＡＡＶ由来ウイルス、および／または複製のためにＡＡＶが依存する細胞性機能（すなわち、「アクセサリ機能（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）」）のヌクレオチド配列をコードする。このアクセサリ機能としては、限定はしないが、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドのアセンブリに関与する部分を含む、ＡＡＶ複製のために必要なアクセサリ機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスのような任意の周知のヘルパーウイルスに由来し得る。好ましい実施形態において、アクセサリ機能プラスミドｐＬａｄｅｎｏ５（ｐＬａｄｅｎｏ５に関する詳細は、米国特許第６，００４，７９７号に記載される）が用いられる。このプラスミドは、ＡＡＶベクターの生成のためのアデノウイルスアクセサリ機能の完全なセットを提供するが、複製コンピテントなアデノウイルスを形成するのに必要な成分は欠く。
ＡＡＶのさらなる理解のために、組み換えＡＡＶ発現ベクター、およびＡＡＶヘルパー、およびアクセサリ機能に関して、より詳細な考察を以下に提供する。
（組み換えＡＡＶ発現ベクター）
公知の技術を用いて、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）発現ベクターを構築して、転写物の方向に作動可能に連結された成分として、転写開始領域を含む制御因子、目的の抗炎症性ポリヌクレオチド、および転写終止領域を少なくとも提供する。この制御因子は、哺乳動物の筋細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含む、得られた構築物を、機能的なＡＡＶ ＩＴＲ配列と結合させる（５’、および３’）。
ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、ＡＡＶ−２配列に関しては、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、およびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）を参照のこと。本発明のベクターにおいて用いられるＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、そして例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって変更されてもよい。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定はしないがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、およびＡＡＶ−８などを含む、任意のいくつかのＡＡＶ血清型に由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクターにおける選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’、および３’ＩＴＲは、それらが意図されるように機能して、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切除およびレスキューを可能にし、そしてＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物がこの細胞に存在するときはレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にする限り、同じＡＡＶ血清型または単離物と同一である必要もないし、同じＡＡＶ血清型または単離物由来である必要もない。
ＡＡＶベクターにおける使用のための適切なポリヌクレオチド分子は、約５キロベース（ｋｂ）のサイズより小さい。選択されたポリヌクレオチド配列は、インビボにおいて被験体中でそれらの転写または発現を指向する制御因子に作動可能に連結される。このような制御因子は、選択された遺伝子と正常に会合する制御配列を含み得る。あるいは、異種制御配列が使用され得る。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来する配列を含む。例としては、限定はしないが、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ中初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。さらに、非ウイルス遺伝子、例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子由来の配列がまた、本明細書において用途を見出す。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。
ＡＡＶ ＩＴＲに結合された目的のポリヌクレオチド分子を保有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列（単数または複数）を、それから主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）が切り出されたＡＡＶゲノムに直接挿入することによって構築され得る。複製およびパッケージング機能を可能にするのに十分なＩＴＲの部分が残っている限り、ＡＡＶゲノムの他の部分はまた、欠失されてもよい。このような構築物は当該分野で周知の技術を用いて設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）、およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８〜３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら、（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７〜１２９；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１；Ｓｈｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１６５〜１６９；およびＺｈｏｕら、（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７〜１８７５、を参照のこと。
あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムから切り出されても、または同じものを含むＡＡＶベクターから切り出されてもよく、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるのと同じような標準的な連結技術を用いて、別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’および３’に融合されてもよい。例えば、ライゲーション（連結）は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ ｍＭ ＭｇＣ１２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ ｍＭ ＮａＣｌ、および以下のいずれか４０μＭ ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（０℃）（「付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）」ライゲーションについて）、または１ｍＭ ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１４℃）（「平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）」ライゲーションについて）の中で達成され得る。分子内の「付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）」ライゲーションは、総ＤＮＡ濃度３０〜１００μｇ／ｍｌ（５〜１００ｎＭの総末端濃度）で通常実施される。ＩＴＲを含むＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。詳細には、いくつかのＡＡＶベクターが、ここに記載されており、これらは、アクセッション番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、および５３２２６としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。
本発明の目的のために、ＡＡＶ発現ベクターからｒＡＡＶビリオンを生成するための適切な宿主細胞としては、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられ、これらの宿主細胞は、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして用いられてもよいし、または用いられており、そして例えば、懸濁培養物、バイオリアクターなどにおいて増殖できる。この用語は、トランスフェクトされたもとの細胞の子孫を包含する。従って、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」とは、本明細書において用いる場合、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞をいう。適切なヒト細胞株である２９３（例えば、アクセッション番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３としてアメリカンタイプカルチャーコレクションを通じて、容易に入手可能）由来の細胞が、本発明の実施において好ましい。詳細には、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡフラグメントで形質転換されたヒト胚性腎臓細胞株であり（Ｇｒａｈａｍら、（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）、そしてアデノウイルスのＥ１ａ遺伝子、およびＥ１ｂ遺伝子を発現する（Ａｉｅｌｌｏら、（１９７９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９４：４６０）。２９３細胞株は、容易にトランスフェクトされて、ｒＡＡＶビリオンを生成するのに特に都合のよいプラットフォームを提供する。
（ＡＡＶヘルパー機能）
上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接したヌクレオチド配列を複製してキャプシド化し、ｒＡＡＶビリオンを生成するために、ＡＡＶヘルパー機能を提供することができるようにされなければならない。ＡＡＮヘルパー機能は一般に、ＡＡＶ遺伝子産物を提供するように発現され得るＡＡＶ由来コード配列であり、この産物が次に、生産的なＡＡＶ複製のためにトランスで機能する。ＡＡＶヘルパー機能はここで、ＡＡＶ発現ベクターから欠失している必須のＡＡＶ機能を補完するために用いられる。従って、ＡＡＶヘルパー機能としては、主なＡＡＶ ＯＲＦ、すなわち、ｒｅｐ、およびｃａｐコード領域の１つもしくは両方、またはそれらの機能的ホモログが挙げられる。
「ＡＡＶ ｒｅｐコード領域（ＡＡＶ ｒｅｐ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、複製タンパク質であるＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの、当該分野で認識される領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、多くの機能を有することが示されている。この機能としては、ＡＡＶのＤＮＡ複製起点の認識、結合、およびニック作製、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種の）プロモーターからの転写の調節が挙げられる。Ｒｅｐ発現産物は全体として、ＡＡＶゲノムを複製するために必要である。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：９７〜１２９；およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３〜８０１を参照のこと。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切なホモログとしては、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子が挙げられるが、これはまたＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介することが公知である（Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０４：３０４〜３１１）。
「ＡＡＶ ｃａｐコード領域（ＡＡＶ ｃａｐ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、キャプシドタンパク質であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはその機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識される領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために全体として必要である、パッケージング機能を供給する。ＡＡＶ ｃａｐコーディング領域の説明については、例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．およびＫｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（前出）を参照のこと。
ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前か、またはトランスフェクションと同時に、ＡＡＶヘルパー構築物を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることによって宿主細胞中に導入される。従って、ＡＡＶヘルパー構築物を用いて、ＡＡＶ ｒｅｐ、および／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供して、生産的ＡＡＶ感染のために必要である、失われているＡＡＶ機能を補完する。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲを欠き、そしてそれ自体では複製することもパッケージングすることもできない。
これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンの形態であってもよい。通常用いられるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ、およびＲｅｐおよびＣａｐ発現産物の両方をコードするｐＩＭ２９＋４５のような多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；およびＭｃＣａｒｔｙら、（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照のこと。Ｒｅｐ、および／またはＣａｐ発現産物をコードする、多数の他のベクターが記載されている。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号を参照のこと。
（ＡＡＶアクセサリ機能）
宿主細胞（またはパッケージング細胞）はまた、ｒＡＡＶビリオンを生成するために、非ＡＡＶ由来機能、すなわち「アクセサリ機能」を提供することができるようにされなければならない。アクセサリ機能とは、非ＡＡＶ由来のウイルス、および／または細胞の機能であって、ＡＡＡがその複製のために依存する機能である。従って、アクセサリ機能としては、少なくともそれらの非ＡＡＶタンパク質、およびＡＡＶ複製に必要であるＲＮＡが挙げられ、これには、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶキャプシドのアセンブリに関与する機能が挙げられる。ウイルスに基づくアクセサリ機能は、任意の公知のヘルパーウイルスに由来し得る。
詳細には、アクセサリ機能は、当業者に公知の方法を用いて、宿主細胞に導入され、次いで宿主細胞中で発現され得る。代表的には、アクセサリ機能は、関連のないヘルパーウイルスを用いた宿主細胞の感染によって提供される。多数の適切なヘルパーウイルスが公知であり、これには、アデノウイルス；ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス１型、および２型；ならびにワクシニアウイルスが挙げられる。非ウイルスアクセサリ機能はまた、任意の種々の公知の因子を用いる細胞同期化によって提供されるような用途を本明細書において見出す。例えば、Ｂｕｌｌｅｒら、（１９８１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：２４１〜２４７；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、（１９８５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４７：２１７〜２２２；Ｓｃｈｌｅｈｏｆｅｒら（１９８６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５２：１１０〜１１７を参照のこと。
あるいは、アクセサリ機能は、上記のようなアクセサリ機能ベクターを用いて提供され得る。例えば、米国特許第６，００４，７９７号、および国際公開番号ＷＯ０１／８３７９７を参照のこと。アクセサリ機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムなどの天然の供給源から獲得されてもよいし、または当該分野で公知の組み換え法もしくは合成法を用いて構築されてもよい。上記で説明したように、完全に相補的なアデノウイルス遺伝子はアクセサリヘルパー機能には必要ないことが実証されている。詳細には、ＤＮＡ複製および後期遺伝子合成をできないアデノウイルス変異体は、ＡＡＶ複製を許容する状態であることが示されている。Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：３１７。同様に、Ｅ２Ｂ、およびＥ３領域内の変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、このことは、Ｅ２ＢおよびＥ３領域が、アクセサリ機能を提供することにおそらく関与していないということを示す。Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。しかし、Ｅ１領域を欠損しているか、またはＥ４領域を欠いているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持できない。従って、Ｅ１Ａ、およびＥ４領域は、直接、または間接的にＡＡＶ複製に必要であると考えられる。Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２６：５０５。他の特徴付けられたＡｄ変異体としては、以下が挙げられる：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）（前出）；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）（前出）；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｃａｒｔｅｒ，Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｌｐｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，Ｉ ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ ｅｄ．，１９９０））；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）（前出））；ならびにＥ４（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）（前出）；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））。Ｅ１Ｂコード領域に変異を有するアデノウイルスによって提供されたアクセサリ機能の研究は、矛盾する結果を生じたが、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６−２１０は、近年、ＡＡＶビリオン生成にＥ１Ｂ５５ｋは、必要であるが、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要でないことを報告した。さらに、国際公開番号ＷＯ ９７／１７４５８、およびＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：９３８〜９４５は、種々のＡｄ遺伝子をコードするアクセサリ機能を記載している。特に好ましいアクセサリ機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡコード領域、アデノウイルスＥ４ ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、およびインタクトなＥ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。このようなベクターは、国際公開番号ＷＯ０１／８３７９７に記載されている。
ヘルパーウイルスを用いた宿主細胞の感染、またはアクセサリ機能ベクターを用いた宿主細胞のトランスフェクションの結果として、アクセサリ機能は、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化して、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、および／またはＣａｐタンパク質を生成することが示される。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶ発現ベクターから組み換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）を切り出す。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを二倍にするように働く。発現されたＣａｐタンパク質は、キャプシドへと会合（アセンブル）して、組み換えＡＡＶゲノムは、キャプシドにパッケージングされる。従って、生産的ＡＡＶ複製が結果として生じ、そしてＤＮＡは、ｒＡＡＶビリオン中にパッケージングされる。「組み換えＡＡＶビリオン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎ）」または「ｒＡＡＶビリオン（ｒＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎ）」とは、ＡＡＶ ＩＴＲが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化するＡＡＶタンパク質シェルを含む、感染性の複製欠損ウイルスとして本明細書に規定される。
組み換えＡＡＶ複製後、ｒＡＡＶビリオンは、カラムクロマトグラフィー、ＣｓＣｌ勾配などのような、種々の従来の精製方法を用いて宿主細胞から精製され得る。例えば、陰イオン交換カラム、アフィニティーカラム、および／または陽イオン交換カラムによる精製のような、複数のカラム精製工程が用いられ得る。例えば、国際公開番号ＷＯ ０２／１２４５５を参照のこと。さらに、アクセサリ機能を発現するために感染を用いる場合、残りのヘルパーウイルスは公知の方法を用いて不活化され得る。例えば、アデノウイルスは、例えば２０分以上の約６０℃の温度への加熱によって不活化され得る。この処置は、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活化する。なぜなら、ＡＡＶは、極度に熱安定性であるが、ヘルパーアデノウイルスは熱不安定性であるからである。
次いで、目的のヌクレオチド配列を含む、得られたｒＡＡＶビリオンを、以下に記載の技術を用いて遺伝子送達のために用いることができる。
（組成物および送達）
（Ａ．組成物）
一旦生成されれば、抗炎症性サイトカインをコードするベクター（またはビリオン）を、送達に適切な組成物中に処方する。組成物は、目的の抗炎症性サイトカインの治療上有効な量、すなわち、疼痛を軽減もしくは改善するのに十分な量生成するのに十分な遺伝物質を含む。この組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤としては、この組成物を投与された個体に有害な抗体の生成をそれ自体が誘発せず、そして過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬剤が挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤としては限定はしないが、ソルビトール、任意の種々のＴＷＥＥＮ化合物、ならびに水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体が挙げられる。薬学的に受容可能な塩が、そこに含まれてもよい、例えば、鉱物の酸性塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤、または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、などが、このようなビヒクルに存在してもよい。薬学的に受容可能な賦形剤の詳しい考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）から入手可能である。
特に有用な処方物の１つは、１つ以上の二価アルコール、または多価アルコール、および必要に応じて界面活性剤、例えば、ソルビタンエステルと組み合わせて、目的のベクターまたはビリオンを含む。例えば、国際公開番号ＷＯ ００／３２２３３を参照のこと。
本明細書の教示の観点から当業者に明白であるように、有効量は、経験的に決定され得る。代表的な用量は以下に詳細である。投与は、処置の経過全体を通じて、１用量でも、連続してでも、または間欠的に達成されてもよい。投与の最も有効な手段および投薬量を決定するための方法は、当業者に周知であり、そしてベクター、治療の組成物、標的細胞、および処置される被験体によって変化する。単一、および複数の投与は、処置する医師によって選択される用量レベル、およびパターンを用いて実行され得る。
以下の実施例に示されるとおり、疼痛の長期緩和を生じるのに特に有用な１方法は、ＩＬ−１０の２つ以上の用量を近い間隔で、例えば、少なくとも１０日未満空けて、好ましくは５日未満空けて、より好ましくは４日未満、例えば３日．．．２日．．．１日．．．など空けて、そして述べた範囲内の任意の時間空けて投与する工程を包含する。
複数の用量が投与される場合、投与される第一の処方物は、その後の処方物と同じであっても異なってもよい。従って、例えば、第一の投与は、アデノウイルスベクターの形態であってもよく、そして第二の投与は、アデノウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、ＡＡＶビリオン、サブユニットワクチン組成物などの形態であってもよい。さらに、その後の送達はまた、第二の形態の送達と同じであっても異なってもよい。
２つ以上の導入遺伝子が送達された組み換えベクターによって発現され得ることが理解されるべきである。例えば、組み換えベクターは、２つ以上の抗炎症性サイトカインをコードし得る。あるいは、別々のベクターであって、各々が１つ以上の異なる導入遺伝子を発現するベクターがまた、本明細書に記載のように神経系に送達され得る。従って、多数の抗炎症性サイトカインが、同時にまたは連続して送達されてもよい。さらに、本発明の方法によって送達されるベクターは、他の適切な組成物および治療と組み合わされることがまた意図される。例えば、他の疼痛緩和剤および鎮痛薬、例えば、限定はしないがシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）インヒビター、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）インヒビターなどを含む抗プロスタグランジンが、本発明の組成物とともに同時投与されてもよい。送達のための他の組成物としては、神経障害性疼痛の処置に用いられる因子、例えば、限定はしないが、三環系抗うつ薬（例えば、アミノトリプチリン、イミプラミン、デシプラミン）、抗痙攣薬（例えば、ガバペンチン、カルバマゼピン、フェニトイン）および局所麻酔薬（例えば、メキシレチン、リドカイン）；ならびに限定はしないが、ＮＳＡＩＤ類（例えば、イブプロフェン、ナプロシンナトリウム、アスピリン、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、トレチン）、ステロイド（例えば、メチルプレドニゾン、プレドニゾン）、鎮痛薬（例えば、アセトアミノフェン）およびオピエート（例えば、トラモドール、デメロール、ダルボン、バイコディン、フェンタニル）を含む炎症性疼痛の処置に用いられる因子が挙げられる。
（Ｂ．送達）
組み換えベクターは、ＣＮＳもしくは末梢神経系の任意の細胞もしくは組織中に、またはそれに近位の細胞もしくは組織を包含する、神経系に導入され得る。従って、送達は、例えば、脊髄グリア細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の細胞、間質腔の細胞、脊髄の防御被覆中の細胞、硬膜外細胞（すなわち、硬膜の外側の細胞）、神経組織に隣接するかもしくは接触するかまたは神経支配される非神経組織中の細胞を標的するために、例えば、限定はしないが、末梢神経、網膜、後根神経節、神経筋接合部、ならびにＣＮＳを含む任意の神経系に対してであってもよい。組み換えベクターは、既存の神経損傷、神経障害および他の原因の上記で規定される神経障害疼痛を処置するために、インビボまたはインビトロ（エキソビボともいわれる）のいずれかで導入され得る。インビトロで形質導入された場合、所望のレシピエント細胞がこの被験体から取り出され、ｒＡＡＶビリオンを用いて形質導入され、そしてこの被験体に再導入される。あるいは、同種遺伝子的または異種遺伝子的な細胞は、これらの細胞が被験体中において不適切な免疫応答を生じない場合、用いられてもよい。さらに、神経前駆細胞がインビトロで導入され、次いでＣＮＳに送達され得る。
形質導入された細胞の被験体への送達および導入のための適切な方法が記載されている。例えば、適切な培地中で、組み換えベクターを、形質導入される細胞と組み合わせることによって、細胞はインビトロで形質導入され得る。そして目的のＤＮＡを保有するそれらの細胞は、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲのような従来の技術を用いて、または選択マーカーを用いることによってスクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、上記のような、薬学的組成物中に処方され、そしてこの組成物は下記のような種々の技術によって、１つ以上の用量で、被験体に導入され得る。
インビボ送達のために、組み換えベクターは、薬学的組成物中に処方され、そして１つ以上の用量が、示された様式で直接投与され得る。治療上有効な用量は、当業者によって容易に決定され得、そして用いられる特定の送達系に依存する。ＡＡＶに由来する抗炎症性サイトカインについては、治療上有効な用量とは、約１０６〜１０１５個程度のｒＡＡＶビリオン、より好ましくは１０７〜１０１２個、そしてなおより好ましくは約１０８〜１０１０個のｒＡＡＶビリオン（またはウイルスゲノム、「Ｖｇ」とも呼ばれる）、またはこれらの範囲内の任意の値を包含する。アデノウイルス由来抗炎症性サイトカインについては、治療上有効な用量は、約１×１０６プラーク形成単位（ＰＦＵ）〜１×１０１２ＰＦＵ、好ましくは約１×１０７ＰＦＵ〜約１×１０１０ＰＦＵ、または疼痛を緩和するのに十分であるこれらの範囲内の任意の用量を包含する。
一般に、１μｌ〜１ｍｌの組成物が送達され、例えば、０．０１〜約０．５ｍｌ、例えば、約０．０５〜約０．３ｍｌ、例えば、０．０８、０．０９、０．１、０．２など、およびこれらの範囲内の任意の値の組成物が送達される。
組み換えベクター、またはインビトロで導入される細胞は、例えば、脊髄グリア細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の細胞、間質腔の細胞、脊髄の防御被覆中の細胞、硬膜外細胞（すなわち、硬膜の外側の細胞）、神経組織に隣接するかもしくは接触するかまたは神経支配される非神経組織中の細胞などを標的するために、神経組織、例えば、末梢神経、網膜、後根神経節、神経筋接合部、ならびにＣＮＳに、定位固定注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（例えば、Ｓｔｅｉｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４〜３４２９，１９９９；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ ９７：３４２８〜３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９〜２２３，１９９３；ならびにＡｌｉｓｋｙ、およびＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１１：２３１５〜２３２９，２０００を参照のこと）、硬膜外送達などによる、当該分野で公知の神経外科技術を用いて、針（ニードル）、カテーテル、または関連のデバイスによって、例えば、脳室領域へ、ならびに線条体へ（例えば、尾状核、または線条体の被殻）、脊髄、および神経筋接合部へ、または小脳小葉への注射によって、直接送達されてもよい。
脊髄グリアのような神経系を標的するための特に好ましい方法は、脊髄組織自体にではなくクモ膜下腔送達によるものである。このような送達は、多くの利点を示す。標的されたタンパク質は、周囲のＣＳＦおよび／または組織に放出され、そしてウイルスとは異なり、放出されたタンパク質はクモ膜下腔内注射の直後に脊髄の実質に浸透し得る。実際、ウイルスベクターのクモ膜下腔内送達は、発現を局所に維持し得る。さらに、ＩＬ−１０の場合は、その短い半減期がまた、クモ膜下腔内遺伝子治療の後に局所中でＩＬ−１０を保つように機能する；すなわち、活性タンパク質はその急速な分解によって、その放出部位の近位で濃いままに維持される。クモ膜下腔内遺伝子治療のさらなる利点は、このクモ膜下腔経路が、ヒトにおいて既に慣用的な使用である腰椎穿刺投与（すなわち、脊椎穿刺）を模倣するということである。
送達の別の方法は、硬膜外腔への投与による。硬膜外腔は、脊柱管を被覆する骨膜と硬膜との間の脊柱管を占める。硬膜外腔は腰部領域を通って容易にアプローチできる。一般には、ニードル、カテーテルなどが正中線に挿入されて、硬膜外腔に達する前に皮膚、筋膜、棘上靱帯および棘間靱帯、ならびに黄色靭帯を通過する。しかし、投与はまた、胸部と通じてであってもよい。硬膜外に因子を送達するための方法は当該分野で周知である。例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ（Ｄ．Ｃ．Ｓａｂｉｓｔｏｎ編）Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
組み換えベクターまたは形質導入細胞を投与するために好ましい別の方法は、後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンに対して投与することであり、これは、例えば、ＤＲＧへの引き続く拡散をともなう硬膜外腔への注射による。例えば、組み換えベクターまたは形質導入細胞は、タンパク質がＤＲＧに拡散される条件下でクモ膜下腔内カニューレ挿入を介して送達され得る。例えば、Ｃｈｉａｎｇら、Ａｃｔａ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．Ｓｉｎ．（２０００）３８：３１−３６；Ｊａｉｎ，Ｋ．Ｋ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ（２０００）９：２４０３−２４１０を参照のこと。
ＣＮＳに対する投与の別の形態は、コンベクションエンハンスドデリバリー（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（ＣＥＤ）システムを用いる。この方法では、組み換えベクターは、ＣＮＳの大きい領域にまたがって多くの細胞に送達され得る。さらに、送達されたベクターは、ＣＮＳ細胞（例えば、グリア細胞）において、導入遺伝子を効率的に発現する。任意のコンベクションエンハンスドデリバリーデバイスが、組み換えベクターの送達に適切であり得る。好ましい実施形態では、このデバイスは、浸透圧ポンプ、またはインフュージョンポンプである。浸透圧ポンプ、およびインフュージョンポンプは両方とも様々な供給業者、例えば、Ａｌｚｅｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌｚａ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から商業的に入手可能である。代表的には、組み換えベクターは、以下のように、ＣＥＤデバイスを介して送達される。カテーテル、カニューレ、または他の注射デバイスを、選択された被験体のＣＮＳ組織に挿入する。定位マッピング、および位置決めデバイスは、例えば、ＡＳＩ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗａｒｒｅｎ，ＭＩ．から入手可能である。ＣＴおよび／またはＭＲＩ画像によって得られた解剖学的なマップを用いることによって、また位置決めを実行して、選択された標的に対して注射デバイスをガイドすることを補助してもよい。さらに、本明細書において記載された方法を実施すれば、被験体の比較的大きい領域が、組み換えウイルスベクターを拾い上げるので、インフュージョン（注入）カニューレは少なくてもかまわない。外科的な合併症は、穿通の回数に関連するので、この様式の送達は、従来の送達技術でみられる副作用を減らすように働く。ＣＥＤデリバリーに関する詳細な説明については、米国特許第６，３０９，６３４号を参照のこと。
（タンパク質送達技術）
上記で例示されるように、炎症誘発性サイトカインに作用する因子、例えば、本明細書に記載される任意の抗炎症性サイトカインおよび炎症誘発性サイトカインアンタゴニストは、疼痛を処置または緩和するために、単独で遺伝子送達なしに投与されても、または遺伝子治療と組み合わせて投与されてもよい。従って、例えば、１つ以上のＩＬ−１０（ウイルスＩＬ−１０を含む）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＴＮＦｓｒ、α−ＭＳＨ、ＴＧＦ−β１、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび／または炎症誘発性サイトカインに作用する他の因子は、組成物に処方されて、これらの因子の１つ以上の遺伝子送達の前、それと同時または引き続いて被験体に送達され得る。あるいは、これらの因子は、既存の疼痛を有する被験体に対して、遺伝子なしに単独で送達されてもよい。
組成物は、疼痛が軽減または逆転されるような治療上有効な量の因子を含む。この組成物はまた、薬学的に受容可能な賦形剤を含む。このような賦形剤としては、この組成物を投与された個体に有害な抗体の生成をそれ自体が誘発せず、そして過度の毒性なしに投与され得る、任意の薬剤が挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤としては、限定はしないが、ソルビトール、任意の種々のＴＷＥＥＮ化合物、ならびに水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような液体が挙げられる。薬学的に受容可能な塩が、そこに含まれてもよい、例えば、鉱物の酸性塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；ならびに有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、などが、このようなビヒクルに存在してもよい。薬学的に受容可能な賦形剤の詳しい考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）から入手可能である。薬学的組成物は、この化合物またはその薬学的に受容可能な塩もしくは水和物を活性成分として含んでもよい。
一般に、この因子は、経口（口腔内および舌下を含む）、直腸、経鼻、局所、肺、膣もしくは非経口（筋肉内、動脈内、クモ膜下腔内、硬膜外、皮下および静脈内を含む）投与のための組成物中に、または吸入もしくはガス注入による投与に適切な形態に処方される。投与の好ましい方式は、組み換えベクターに関して上記で記載された任意の技術を用いて、例えば、脊髄グリア細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）中の細胞、間質腔の細胞、脊髄の防御被覆中の細胞、硬膜外細胞（すなわち、硬膜の外側の細胞）、神経組織に隣接するかもしくは接触するかまたは神経支配される非神経組織中の細胞を標的するために、神経系に、例えば、限定はしないが、末梢神経、網膜、後根神経節、神経筋接合部、ならびにＣＮＳを含む任意の神経領域に対してである。
好ましくは、この組成物は、活性因子の安定性を向上して、半減期を延長するために処方される。例えば、活性因子、例えば、ＩＬ−１０は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で誘導体化されてもよい。ペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）技術は、当該分野で周知であり、これには例えば、部位指向性のペグ化（例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００３）２１：５４６−５５２；Ｍａｎｊｕｌａら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（２００３）１４：４６４−４７２；ＧｏｏｄｓｏｎおよびＫａｔｒｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：３４３−３４６；米国特許第６，３１０，１８０号を参照のこと）、サイズ排除反応クロマトグラフィーを用いるペグ化（例えば、Ｆｅｅ，Ｃ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００３）８２：２−２０６を参照のこと）、および固相を用いるペグ化（例えば、ＬｕおよびＦｅｌｉｘ，Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．（１９９３）６：１４０−１４６を参照のこと）が挙げられる。ペグ化の他の方法については、例えば、国際公開番号ＷＯ０２／２６２６５、米国特許第５，２０６，３４４号および同第６，４２３，６８５号、ならびにＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３）２：２１４−２２１；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．（２００３）５５：２１７−２５６；ならびにＤｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１９９２９：２４９−３０４による概説を参照のこと。
さらに、この活性因子は、当該分野で周知の技術を用いて、安定性を改善して、半減期を延長するために抗体またはペプチドに融合され得る。例えば、この活性因子は、徐放性を得るために免疫グロブリン分子に融合されてもよい。従来の技術の１つは、非細胞溶解性変異体を有するヒトまたはマウスＩｇＧ２ａのようなＩｇＧのＦｃ部分に対して目的の因子を融合することである。例えば、Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００３）１３３：４２３−４２７；Ａｄａｃｈｃｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（２００２）９：５７７−５８３；ならびに米国特許第６，４１０，００８号を参照のこと。非溶解性組み換えヒトＩＬ−１０／ＦｃキメラはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されている。
さらに、活性因子は、酵素的に不活性なポリペプチド、例えば、アルブミン、ならびにこの因子が送達される生物体以外の生物体で酵素活性を有する酵素に融合され得る。例えば、有用なポリペプチドとしては、植物酵素、ブタまたはげっ歯類のグリコシルトランスフェラーゼ、およびα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼが挙げられる。例えば、Ｓａｎｄｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：１１３９１および米国特許第６，４０３，０７７号を参照のこと。目的の因子を安定化させるための他の方法は、グリコシル化部位を導入することおよび／または活性に関与する部位（例えば、分解のためにタンパク質を標的化する）を除去することなどによって、プロテアーゼに対するタンパク質の接近性を大きくするかまたは小さくすることである。
さらに、活性因子は徐放性の処方物中で送達されてもよい。徐放性処方物または持続放出性処方物は、タンパク質を、キャリアまたはビヒクル、例えば、リポソーム、非再吸収性不浸透性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニルコポリマーおよびＨｙｔｒｅｌ（登録商標）コポリマー、膨潤性ポリマー、例えば、ヒドロゲル、または再吸収性ポリマー、例えば、コラーゲンおよび特定のポリ酸またはポリエステル、例えば、再吸収縫合糸を作製するために用いられるものに組み込むことによって作製される。さらに、この活性因子は、粒子状のキャリアでカプセル化されても、それに吸着されても、またはそれと結合体化されてもよい。粒子状のキャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびＰＬＧとして公知のポリ（ラクチド−コ−グリコリド）由来の微小粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
上記で例証されるように、処置の経過にわたって、投与は１用量で、連続してまたは間欠的に行なわれてもよい。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、処方物、治療の組成物、標的細胞および処置されている被験体によって変化する。単独および多数の投与は、処置する医師によって選択される用量のレベルおよびパターンを用いて行なわれ得る。
疼痛の長期の軽減を得るための１つの特に有効な方法は、２回以上の用量のＩＬ−１０を近い間隔で、例えば、少なくとも１０日未満空けて、好ましくは５日未満空けて、より好ましくは４日未満空けて、例えば３日．．．２日．．．１日．．．など空けて、そして述べた範囲内の任意の時間空けて投与する工程を包含する。
複数の用量が投与される場合、投与される第一の処方物は、その後の処方物と同じであっても異なってもよい。従って、例えば、第一の投与は、サブユニットワクチン組成物の形態であってもよく、そして第二の投与は、サブユニットワクチン組成物、アデノウイルスベクター、ＡＡＶビリオン、ＤＮＡプラスミドなどの形態であってもよい。さらに、その後の送達はまた、第二の形態の送達と同じであっても異なってもよい。
（疼痛モデル）
抗炎症性サイトカインが疼痛を処置する能力は、当該分野で公知の任意の受容される疼痛モデルによって評価され得る。このようなモデルの例は以下のとおりである。
（テールフリックモデル（Ｔａｉｌ Ｆｌｉｃｋ Ｍｏｄｅｌ））：テールフリック試験（ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ ｔｅｓｔ）（Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．ａｎｄ Ｔｈｅｒ．（１９４１）７２：７４−７９）は、急性疼痛のモデルである。軽く拘束したラットを試験台の上に置いて、そのラットの尾の背側または腹側の表面に集束光源を照らさせた。光センサーは、試験ステージ上で光源の反対に置く。試験を開始するために、ラットの尾は光をブロックし、これによって光センサーに光が達することを妨げる。潜伏測定は光源の活性化で開始する。ラットが動くかその尾をピシッと振る（フリック）とき、光センサーが光源を検出して、測定を停止させる。この試験によってラットの尾が不動である時間の長さ（期間）（潜時）が測定される。ラットは目的の化合物をそれに投与する前に、次いでこのような投与後種々の時点で測定される。
（ラットテール浸漬モデル）：このラットテール浸漬アッセイも、急性疼痛のモデルである。ラットを、尾は露出させて、小さく畳んだ薄い綿のタオルで覆ったまま、手で緩く保持する。尾の先端を、例えば５２℃の水浴中に２インチの深さまで浸す。ラットは、尾をくねらせるか、または水から尾を引き揚げることによって応答した；いずれの応答も行動の終点としてスコア付けする。ラットは、目的の化合物をラットに投与する前にテール応答潜時（ＴＲＬ）スコアについて試験し、次いでこのような投与後種々の時点でＴＲＬについて再試験する。
（カラギナン誘発性の足の痛覚過敏モデル）：カラギナン足痛覚過敏試験は、炎症性疼痛のモデルである。ラットの左の後足にカラギナンの皮下注射を行なう。ラットを、カラギナン注射の例えば３０分前に、またはカラギナン注射の例えば２時間後に選択された因子で処置する。各々の動物の足の圧力感度は、カラギナン注射３時間後に無痛覚計で試験する。Ｒａｎｄａｌｌら、Ａｒｃｈ．Ｉｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎ．（１９５７）１１１：４０９−４１９を参照のこと。
カラギナン誘発性の足の浮腫に対する選択された因子の効果も試験され得る。この試験（Ｖｉｎｅｇａｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（１９６９）１６６：９６−１０３を参照のこと）によって、足のカラギナン注射によって誘発される浮腫の形成を化合物が逆転または防止する能力の評価が可能になる。足の浮腫試験は、足の測定のためのプレチスモメーター（体積測定器）を用いて行なった。選択された因子の投与後、左後足の足底面の側方の肢パッド中にカラギナン溶液を皮下注射する。カラギナン処理後３時間で、処置した足（左）および処置していない足（右）の容積を、プレチスモメーターを用いて測定する。
（ホルマリン行動応答モデル）：ホルマリン試験は急性の持続する疼痛のモデルである。ホルマリン処置に対する応答は二相性である（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎら、Ｐａｉｎ（１９７７）４：１６１−１７４）。第Ｉ相の応答は、刺激に対する純粋な非侵害性の応答の指標である。第２相は代表的にはホルマリン注射後２０〜６０分で開始して、脊髄の感作の増大を反映すると考えられる。
（ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験）機械誘発性異痛症の化合物の効果は、疼痛性の末梢神経障害のモデルである。Ｌ−５脊髄神経を固く縛ったラットにおけるｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメント試験（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔ ｔｅｓｔ）によって決定され得る。外科的手順は、Ｋｉｍら．，Ｐａｉｎ（１９９２）５０：３５５−３６３によって記載されるように行なう。一連の較正されたｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いて機械誘発性異痛症を評価する（Ｃｈａｐｌａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）５３：５５−６３）。フィラメントの堅さの増大は、左の後足の坐骨神経分布において足底面に垂直に適用される。このフィラメントは屈曲が始まるまでゆっくりと抑えられ、次いで４〜６秒間保持される。フィラメント適用順序およびトライアルの数は、Ｄｉｘｏｎのアップダウン法（ｕｐ−ｄｏｗｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって決定された（Ｃｈａｐｌａｎら、前出）。縛った側での足のたじろぎ（ｆｌｉｎｃｈｉｎｇ）およびバタツキ（ｌｉｃｋｉｎｇ）および足の引っ込め（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）は、陽性の応答とみなされる。
（絞扼性神経損傷）：温熱および冷感の異痛症応答は、絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）を有するラットにおいて下記のように評価され得る。片側の単神経障害を、Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｐａｉｎ（１９８８）３３：８７−１０７に記載される絞扼性神経損傷モデルを用いてラットで生じさせる。ＣＣＩは、以下のように、麻酔したラットで生じさせる。各々のラットの後肢の側面を剃毛してＮｏｌｖａｓａｎで洗い上げる。無菌技術を用いて、大腿中央レベルで後肢の側面に切開を行う。大腿二頭筋をすっぱり切りとって、坐骨神経を露出させる。各々のラットの右の後肢に、坐骨神経の周囲に約１〜２ｍｍ離れて４つの結紮糸（例えば、Ｃｈｒｏｍｉｃ ｇｕｔ ４．０；Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を緩く縛る。坐骨神経を縛らないこと（ニセ）以外は、各々のラットの左側に同一の切開を行う。例えば、４−０ Ｖｉｃｒｙｌ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を用いて筋肉を連続的な縫合パターンで閉鎖して、重なる皮膚は、創傷クリップで閉鎖する。識別の目的でラットの耳にタグを付けて、飼育箱に戻す。
（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ（ハーグリーブス）試験）：Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｐａｉｎ（１９９８）３２：７７−８８）はまた、疼痛の放射熱（ｒａｄｉａｎｔ ｈｅａｔ）モデルである。ＣＣＩラットは、手術後少なくとも１０日で温熱性痛覚過敏について試験する。この試験装置は、温度上昇（８０〜８２°Ｆ）ガラスプラットフォームから構成される。全ての試験群に相当する、ある時点で８匹のラットを、試験の少なくとも１５分前にこのプラットフォームのガラスの床の上のうつ伏せにしたプラスチックケージ中に個々に閉じ込める。ガラスの下に置いた放射熱源は、各々のラットの後足の足底を狙っている。熱を加えることは、後足が引っ込められる（引っ込め潜時（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ ｌａｔｅｎｃｙ））かまたは経過時間が２０秒になるまで継続する。このトライアルはまた、ニセの操作を行なった足にも行なう。トライアルの間に少なくとも５分の間隔をおいて、２〜４回のトライアルを各々の足で交互に行なう。これらの値の平均が引っ込め潜時に相当する。
（冷感異痛症モデル）：行動試験の試験装置および方法は、Ｇｏｇａｓら、Ａｎａｌｇｅｓｉａ（１９９７）３：１１１−１１８に記載される。神経障害（ＣＣＩ）ラットにおける冷感異痛症の試験のための装置は、チャンバの底から６ｃｍに金属プレートを備えるＰｌｅｘｉｇｌａｓｓチャンバからなる。このチャンバは、試験を通じて０〜４℃で維持する浴の温度を用いて、この金属プレート上の２．５ｃｍの深さまで氷および水で充填される。各々のラットを個々にチャンバ中に入れて、冷却を開始して、動物の応答潜時をほぼ１０分の１秒まで測定した。「応答（ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」は、動物が静止しており旋回しない場合、水の完全に外側の右の縛った後足の急速な引っ込めとして規定した。動物が歩いて、ターンするとき過度にのろければ、応答としてスコア付けされない。水からの縛った肢の引っ込めについての動物のベースラインスコアは代表的に、７〜１３秒に及んだ。最大浸漬時間は２０秒としてトライアル間で２０分の間隔を用いた。
（２／実験）
以下は、本発明の実行のための特定の実施形態の例である。本実施例は、例示の目的でのみ提供されるのであって、いかなる方法でも本発明の範囲を限定することは意図しない。
用いた数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を保障するための労力を払っているが、当然ながらある程度の実験誤差および偏差が、認められるべきである。
（材料、および方法）
（被験体）
無菌の成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（３００〜４５０ｇ；Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、全ての実験で用いた。ラットは、温度および光を管理した室内で飼育して、標準的なげっ歯類の食餌および水を自由に利用可能にさせた。行動試験は明サイクルの間に行なった。
（薬物）
組み換えｇｐ１２０の滅菌アリコート（１μｇ／ｍｌ；生成物＃１０２１；ロット番号８Ｄ１５９Ｍ２；ＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）は−７５で保管した。試験の時点で、ｇｐ１２０を緩徐に解凍して、砕いた氷上で維持した。ｇｐ１２０の各々のアリコートは解凍の３０分内に用いた。ｇｐ１２０を、以前に記載されたように（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８−２８１９）、０．１％ラット血清アルブミンビヒクル中で０．５μｇ／ｍｌの濃度まで希釈した（ＲＳＡ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ，１ｘ）、０．１０ｍ細孔濾過、ｐＨ７．２、カタログ番号１４１９０−１４４；Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｏｒｐ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。
ザイモサン（酵母細胞壁；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のビヒクル中での懸濁によって毎日新鮮に作製した。最終濃度は、以前に記載されたように（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６−１０４０）、０、０．０８または３．２μｇ／μｌであった。
アデノウイルスを用いる実験については、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーターから駆動されるヒトＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡを含む複製欠損アデノウイルス発現ベクター（ＡＤ−ＩＬ１０）が用いられており、米国特許第６，０４８，５５１号に記載される。コントロールのアデノウイルス（ＡＤ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＲＳＶプロモーターがＥ．ｃｏｌｉのβガラクトシダーゼ遺伝子の発現を指向する、同種のアデノウイルス発現ベクターであった。組み換えアデノウイルスは、２５プラーク形成単位／細胞という多重度で３６個の１００ｍｍプレートのヒト胚性腎（Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３（ＨＥＫ２９３）細胞（５×１０６細胞／プレート）を感染させることによって増殖させた。感染した細胞を４８時間後に収集して、低速の遠心分離で濃縮して、２０ｍｌの増殖培地（ＤＭＥＭ、１０％ウシ精子）中に再懸濁した。４回の凍結解凍サイクル後、細胞溶解物を塩化セシウム段階勾配（１ｍｌの１．４ｇ／ｍｌ塩化セシウム／ＰＢＳクッション、１．５ｍｌ １．２５ｇ／ｍｌ塩化セシウム／ＰＢＳ段階）上に重層して、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ ４０ローター中で３６Ｋ ｒｐｍで１時間遠心分離した。ウイルスのバンドを回収して、さらにＢｅｃｋｍａｎ ＶＴｉ６５ローター中において、１．３５ｇ／ｍｌの塩化セシウム／ＰＢＳからなる等密度勾配中で６５Ｋ ｒｐｍで２時間遠心分離して精製した。成熟ウイルス粒子を単離して、ＤＰＢＳ（１×）に対して１時間、そしてＤＰＢＳ−３％スクロースに対して２回、各２時間透析した。透析されたウイルス調製物を−８０℃で１０μｌのアリコートとして保管した。ウイルス力価は、以前に記載されたとおりウイルスプラークアッセイによって決定した（Ｓｃｈａａｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：３９２０−３９２３）。
ＡＡＶを用いる実験については、ＡＡＶ発現ベクターを、以前に記載されたように（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９７３−９８５）生成した（パッケージングおよび精製した）。要するに、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をトランスで、ならびにアデノウイルス遺伝子Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡを提供するプラスミド（ｐＤＧ）を有するプロウイルスカセットの同時感染を行なった。Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子は、相補的な細胞株ＨＥＫ２９３中であった。ラットＩＬ−１０をコードするｃＤＮＡを含むベクターカセット（ＡＡＶ−ＩＬ１０）は、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーター／ハイブリッドイントロンによって駆動された（ｐＴＲ２−ＣＢ−ｒＩＬ−１０）。コントロールのＡＡＶ（ＡＡＶ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβアクチンプロモーターがクラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレポーター遺伝子ＵＦ１１の発現を指向する、同種のＡＡＶ発現ベクターであった。ウイルスの力価は、以前に記載されたとおり（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）６：９７３−９８５）、感染性中央アッセイ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｅｎｔｅｒ ａｓｓａｙ）によって決定した。ここで、それぞれ、２．６×１０１３個の物理的粒子（Ｄｏｔ ｂｌｏｔ）／ｍｌおよび１．３２×１０１３個の物理的粒子／ｍｌというＩＬ−１０およびＵＦ１１についてのウイルス力価が達成された。これらの力価は、それぞれ、ラットＩＬ−１０およびＵＦ１１（ＧＦＰ）について、１．７×１０１１個の感染性粒子／ｍｌおよび１．６９×１０１１個の感染性粒子／ｍｌに相当する。
プラスミドまたは「裸の（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡを用いる実験については、遊離のプラスミドＤＮＡは、上記のＡＡＶのトランスフェクションのために操作した同一のプラスミドであった。これらの研究では、ＩＬ−１０（ｐＴＲ２−ＣＢ−ｒＩＬ−１０）またはＧＦＰ（ｐＴＲ２−ＣＢ−ＧＦＰ−ＴＫ−ＮＥＯ（ＵＦ１１））をコードするプラスミドＤＮＡを、前に記載された手順と同様にサブクローニングして、精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｒ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ１．３８−１．３９，１９８９）。単離手順後、プラスミド（ｐＤＮＡ）をＤＰＢＳ（１×）に対して１時間、そしてＤＰＢＳ−３％スクロースに対して２回、各２時間透析した。透析されたｐＤＮＡ調製物を−８０℃で３００μｌのアリコートとして保管した。ｐＤＮＡ−ＩＬ１０およびｐＤＮＡ−ＵＦ１１調製物の濃度は、２６０ｎｍの吸収で決定したところ、それぞれ４．２μｇ／μｌおよび５．６μｇ／μｌであった。各注射日に１００μｇのｐＤＮＡを動物に与えた。７７日の実験の間に４回の注射の全部を行なった。
（行動の測定）
ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験（Ｃｈａｐｌａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ．（１９９４）５３：５５−６３）を、以前に記載されたとおり坐骨神経および後足の伏在静脈神経支配領域内で行なった（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１−２４４；Ｇａｚｄａら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（２００１）６：１１１−１２９；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８−２８１９。要するに、一連の対数の１０個の較正したＳｅｍｍｅｓ−Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｈａｉｒｓ；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ，Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ，ＩＬ）を左右の後足に無作為に加えて、後足引っ込め応答を誘発するのに必要な刺激強度の閾値堅さを決定した。毛の対数堅さをｌｏｇ１０によって決定する（ミリグラム×１０）。対数堅さ値に従って１０の刺激を与えた（ミリグラム数をカッコ内に示す）：３．６１（４０７ｍｇ）、３．８４（６９２ｍｇ）、４．０８（１２０２ｍｇ）、４．１７（１４７９ｍｇ）、４．３１（２０４１ｍｇ）、４．５６（３６３０ｍｇ）、４．７４（５４９５ｍｇ）、４．９３（８５１１ｍｇ）、５．０７（１１，７４９ｍｇ）および５．１８（１５，１３６ｍｇ）。これらの実験で用いられるモノフィラメントの範囲（０．４０７〜１５．１３６ｇｍ）で、刺激強度の５０％応答閾値を推定する場合、対数的に傾斜した勾配が得られる［ｌｏｇ１０（ミリグラム×１０）として表される］（Ｃｈａｐｌａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈ．（１９９４）５３：５５〜６３）。各々の実験について下記に詳細であるとおり、坐骨神経周囲およびクモ膜下腔内薬物投与の前に（ベースライン）およびその後に特定の時点で評価を行なった。行動試験は、薬物投与に関して盲検的に行なった。以前に詳細に記載されたように（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６）、最大確率あてはめ方法（ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｈａｒｖｅｙ，Ｂｅｈａｖ．Ｒｅｓ．Ｍｅｔｈ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．Ｃｏｍｐｕｔ．（１９８６）１８：６２３−６３２；ＴｒｅｕｔｗｅｉｎおよびＳｔｒａｓｂｕｒｇｅｒ，Ｐｅｒｃｅｐｔ．Ｐｓｙｃｈｏｌｐｈｙｓ．（１９９９）６１：８７−１０６）を用いて、ガウス積分精神測定関数（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）にあてはめることによって、５０％足引っ込め閾値（絶対閾値）を算出するために行動応答を用いた。このあてはめ方法によって、パラメトリックな統計学的分析が可能になる（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６）。
Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ（ハーグリーブス）試験。各々の後足に与えた温熱刺激に対する行動応答の閾値を、以前に記載されたように（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６）、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験：（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓら、Ｐａｉｎ（１９９８）３２：７７−８８）を用いて評価した。要するに、１時間の間に測定した左右の両方の後足の３〜６回連続する引っ込め潜時の平均から、ベースライン（ＢＬ）の足引っ込め値を算出した。熱源に対する電圧を、８〜１２秒におよぶＢＬ潜時を得るように調節して、２０秒というカットオフ時間を課して組織損傷を回避した。この手順の後に、下記のようにクモ膜下腔内注射および経時的な薬物後行動評価を続けた。行動試験は、薬物投与に関して盲検的に行なった。足の試験の順序は無作為に変えた。
（外科手術および微量注射）
留置式クモ膜下腔内カテーテル。腰仙部クモ膜下腔内（クモ膜下腔内）カテーテルを作製して、以前に詳細に記載されるような腰部アプローチによって埋め込んだ（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）９０：８１〜８６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら（２００３）Ｐａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｕｏ Ｄ編）印刷中．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ）。留置カテーテルを用いて、組み換えアデノウイルス、組み換えＡＡＶ、ｇｐ１２０またはビヒクルを腰仙部脊髄の周囲のＣＳＦ腔中に微量注入した。全てのクモ膜下腔内微量注入は、完全な薬物送達を確実にするために８μｌの空隙容量を用いて、以前に詳細に説明したように行なった（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）９０：８１〜８６）。全てのカテーテル位置は、行動試験の完了の際に視覚検査によって確認した。データは、腰仙部の脊髄レベルでＣＳＦ腔内にカテーテルの先端部を有することが確認されたカテーテルを有する動物だけから分析した。
留置式坐骨神経周囲カテーテル。坐骨神経周囲カテーテルを作製して、以前に詳細に記載されるように、左後肢の大腿中央レベルに埋め込んだ（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１〜２４４；Ｇａｚｄａら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（２００１）６：１１１〜１２９；Ｍｉｌｌｉｇａｎら（２００３）Ｐａｉｎ Ｒｅｓｅｒａｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｕｏ Ｄ．，編）印刷中、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａ Ｐｒｅｓｓ）。この方法は、イソフルラン麻酔から動物を複数日回復させた後、坐骨神経の周囲の免疫アクチベータの片側の微量注射をした。これによって、両方の免疫の機能に対する麻酔の有害な効果が回避される（Ｌｏｃｋｗｏｏｄら、Ａｎｅｓｔｈｓ．Ａｎａｌｇ．（１９９３）７７：７６９〜７７４；Ｓａｔｏら．，麻酔（１９９５）４４：９７１〜９７５；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．（１９９６）１６：１４７〜１５４）およびグリア細胞（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌ．１３：９９〜１０５；Ｔａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：５９７２〜５９７５；Ｍａｎｔｚら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ（１９９３）７８：８９２〜９０１；Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ（１９９７）８６：１３５９〜１３６６）。さらに、この留置カテーテル法によって、坐骨神経周囲の免疫活性化を、急性（免疫アクチベータの単回注射）または慢性（週にまたがる反復注射）のいずれかでさせることが可能になった（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２５〜１０４０）。本実験では、覚醒状態の拘束していないラットにおいて、両方の方法を用いた。左の坐骨神経におよぶこれらの急性および慢性の坐骨神経周囲の微量注射を以前に記載のとおり行なった（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１〜２４４；Ｍｉｌｌｉｇａｎら（２００３）Ｐａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｕｏ Ｄ編）印刷中．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ）。カテーテルは、屠殺の際に視覚検査によって確認した。データは、確認された部位だけから分析した。
絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）。ＣＣＩは、前に記載したとおり、左の後足の大腿中央レベルで作製した（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ、Ｐａｉｎ（１９８８）３３：８７〜１０７）。イソフルラン（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍ．，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，ＭＯ）麻酔下で穏やかに単離した坐骨神経の周囲で４つの滅菌の吸収性の外科用クロム腸結紮糸（クチクラ４−０、ｃｈｒｏｍｉｃ ｇｕｔ，２７インチ切断ＦＳ−２；Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を緩く縛る。ニセの操作をしたラットの坐骨神経は、識別用に露出したが、結紮しなかった。結紮糸の位置は、屠殺の時点で視覚的に確認した。データは、確認された部位だけから分析した。
腰仙部脊髄へのＡＡＶのクモ膜下腔内微量注射。ＡＡＶまたはｐＤＮＡのいずれかを注射する実験のためには、持続性の留置式カテーテルは用いなかった。代わりに、短時間のイソフルラン麻酔（酸素中に２容積％）のもとでの急性のカテーテル適用法を使用した。ここでは、滅菌の５０μｌガラスＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに対して３０ゲージの０．５インチの滅菌ニードルを装着された２５ｃｍのＰＥ−１０カテーテルを、開口末端から７．７〜７．８ｃｍで黒色のパーマネントインクで印を付けて、注射時まで滅菌の乾燥容器中に置いた。ラットを浅く麻酔して、腰部背側の骨盤領域を剃毛し７０％のアルコールで軽く洗い上げた。プラスチックハブを除いた１８ゲージの滅菌ニードルをＬ５とＬ６の腰椎の間に挿入した。ＰＥ−１０カテーテルの開口末端を１８ゲージのニードルに挿入して、７．７ｃｍのマークを通して、脊髄腰仙骨膨大部のレベルにクモ膜下腔内ＰＥ−１０カテーテル先端部を配置した。薬物は、１分間の間に１μｌの前後の０．９％滅菌等張性生理食塩水溶液フラッシュを用いて薬物を注射した。ＰＥ−１０カテーテルを直ちに抜き取って、１８ゲージのニードルをＬ５−Ｌ６の脊椎の間の空隙から取り出した。この急性の注射方法は完了に２〜３分を要して、ラットは１０分以内に麻酔からの完全な回復を示した。異常な運動行動は注射の１００％で観察されなかった。
（脳脊髄液（ＣＳＦ）の収集および分析）
実施例２および３における行動試験の終了直後に、ペントバルビタールナトリウム（Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）をラットに過量投与した。頚部および腰仙部のＣＳＦは以前に記載されたとおり収集した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。これらのサンプルを液体窒素中で急速凍結して、ＩＬ−１０を検出するための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による分析まで−８０℃で保管した。上記で注記されるとおり、用いたＩＬ−１０はヒトタンパク質であった。これによって、ヒトＩＬ−１０は検出するが、ラットＩＬ−１０は検出しない（製造業者の情報）Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ヒトＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号Ｄ１０００）の使用によって、ウイルス誘導性ＩＬ−１０生成を、ラットＩＬ−１０により混同されることなく評価することができた。ＣＳＦサンプル調製は、以前に記載されたとおりであった（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８−２８１９）。製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡを行なった。
同様に、ＡＡＶおよびｐＤＮＡ実験については、ラットは上記のようにペントバルビタールナトリウムで処理して、上記のように頚部および腰仙部のＣＳＦを収集し、サンプルは、ラットＩＬ−１０を検出するためにＥＬＩＳＡを用いる分析まで急速凍結させた。ラットＩＬ−１０は、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）ラットＩＬ−１０ ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＣＳＦサンプル調製物は以前に記載したとおりであった（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。ＥＬＩＳＡは、製造業者の指示に従って行なった。
（後根神経節および脊髄組織の収集および分析）
ＡＡＶおよびｐＤＮＡ実験におけるＣＳＦの収集の直後に、以前に記載された方法に従って（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）、Ｌ４〜Ｌ６後根神経節および腰仙脊髄を、ＣＣＩの同側でおよび反対側で、そして両側の頚髄で収集した。これらのサンプルをドライアイス上で急速に凍結して、予め冷却した標識チューブに移し、当該分野で周知の技術を用いて、ラットＩＬ−１０ ｍＲＮＡを検出するためのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応による分析まで−８０℃で保管した。例えば、Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）２５：３８６〜４０１を参照のこと。
（データ分析）
全ての統計学的比較は、ＭａｃｉｎｔｏｓｈのＳｔａｔｖｉｅｗ ５．０．１を用いて算出した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験からのデータは、刺激強度（モノフィラメント堅さのミリグラム×１０）の底１０の対数値の補間された５０％閾値（絶対閾値）として分析した。ｖｏｎ ＦｒｅｙおよびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験の両方についてのベースライン測定、ならびに容量応答効果は、１元ＡＮＯＶＡによって分析した。各々の行動試験についての経時的な測定は、反復測定ＡＮＯＶＡと、その後、必要に応じてＦｉｓｈｅｒの保護最小有意差ｐｏｓｔｈｏｃ比較（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｌｅａｓｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｓｔｈｏｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）によって分析した。頚部および腰仙部のＣＳＦ ＩＬ−１０含量は、２×２ ＡＮＯＶＡ、その後、必要に応じてＦｉｓｈｅｒの保護最小有意差ｐｏｓｔｈｏｃ比較によって分析した。
（実施例１ 較正された接触／圧力刺激に対する行動感度に対するクモ膜下腔内アデノウイルス投与の用量応答特徴づけ）
以下の実験を行なって、較正された接触／圧力刺激に対する応答閾値の明確な変化を生じないアデノウイルス用量の範囲を規定した。ベースラインのｖｏｎ Ｆｒｅｙ応答の評価後、０（ｎ＝７）、５（ｎ＝５）、１０（ｎ＝５）、６０（ｎ＝２）、８０（ｎ＝７）、１６０（ｎ＝４）、３００（ｎ＝２）または６００（ｎ＝２）×１０７のいずれかのプラーク形成単位（ＰＦＵ）のアデノウイルスを用いてラットをクモ膜下腔内に注射した。１２００×１０７個のＰＦＵの試験を企図したが、この用量の前庭運動（ｖｅｓｔｉｂｕｌｏｍｏｔｏｒ）効果が観察された際に終了した。アデノウイルスをクモ膜下腔内に注射されたラットは、２４時間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験で評価した。
３００×１０７ＰＦＵまでのアデノウイルスの用量では、ビヒクルコントロールに比較して、較正された接触／圧力刺激に対する応答に信頼性のある効果を有さなかったが、最高の用量（６００×１０７ＰＦＵ）では、応答閾値は低くなった（図１）。ウイルス前に注射した（ｐｒｅ−ｖｉｒａｌ−ｉｎｊｅｃｔｅｄ）ＢＬ値は、群間で信頼性のある相違を示さなかった（Ｆ７，２６＝１．１７１５，ｐ＞０．１４）。一元ＡＮＯＶＡによってウイルス用量の信頼性のある効果が明らかになった（Ｆ７，２６＝５．６９４，ｐ＞０．００５）。ｐｏｓｔｈｏｃ分析によって、わずか６００×１０７ＰＦＵのアデノウイルス用量がコントロールに比較して応答閾値を低下させたことが明らかになった（ｐ＜０．００２）。その後の実験で使用したアデノウイルス用量は、疼痛感度におけるウイルス誘導性の変更の機会を最小にするように、用量範囲の下限に制限した（図１の星印を参照のこと）。
（実施例２ クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０によるクモ膜下腔内ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０誘発性機械誘発性異痛症の予防）
ヒト免疫不全ウイルスＩのエンベロープの糖タンパク質であるｇｐ１２０のクモ膜下腔内送達によって誘発された脊髄免疫活性化は、接触／圧力刺激に対する応答閾値を下げることが以前に示されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。この疼痛応答は、脊髄グリア活性化、ならびにグリアの炎症誘発性サイトカインＩＬ１およびＴＮＡの放出の結果である（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。従って、ＡＤ−ＩＬが１０このグリア駆動性機械誘発性異痛症を予防する能力を試験した。
実施例１に規定された範囲内のアデノウイルス用量のパイロット研究に基づいて、１０×１０７ＰＦＵのＡＤ−ＩＬ１０を含む１０μｌを研究のために選択した。等容積のＡＤコントロール（１６×１０７ＰＦＵ含有１０μｌ）をコントロール群に投与した。ラットを最初に、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬまたはＡＤコントロール注射の前（ベースライン；ＢＬ）そして４日および５日後に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対するそのラットの応答について評価した（ｎ＝８匹／群）。このＡＤ−ＩＬ１０ベクターの先行の研究に基づいて、ウイルス指向性のＩＬ−１０のほぼ最大のレベルがこの時までに誘導されるはずである（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１９：８１２〜８１８）。４日および５日で行動試験を行なって、このクモ膜下腔内アデノウイルス用量もウイルス指向性ＩＬ１０放出もこの測定に対してなんら観察可能な混同される効果は有さなかったことを確認した。５日の試験の完了の際、全てのラットに３μｇのｇｐ１２０を注射した。このｇｐ１２０用量は、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験によって測定した場合、機械誘発性異痛症を生じることが以前に示されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｐａｉｎ（２００１）６：３２６〜３３３）。ビヒクル注射コントロールは、含まなかった。なぜなら、この手順は行動測定には影響がないことが繰り返し実証されているからである（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｐａｉｎ（２００１）６：３２６〜３３３；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。ｇｐ１２０注射後、接触／圧力刺激に対する応答は、以前の刊行物に従って、１２０分間にわたって２０分ごとに再評価した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｐａｉｎ（２００１）６：３２６〜３３３；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）。試験の終了時、頚部および腰仙部のＣＳＦサンプルをＩＬ−１０分析のために収集した。
１０×１０７ＡＤ−ＩＬ１０およびＡＤコントロールのクモ膜下腔内投与は、ＢＬに比較してｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対する行動応答に信頼性のある影響は無かった（Ｆ１，２１＝１．３８５，ｐ＞０．２５）（図２）。従って、アデノウイルスによって放出されたＩＬ−１０も、この用量のアデノウイルス自体の存在も、基礎的な疼痛の応答性を変化しなかった。以前の研究と同様に（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５〜１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８〜２８１９）、クモ膜下腔内ｇｐ１２０は、ＡＤコントロールでは頑固な機械誘発性異痛症を生じた。対照的に、ＡＤ−ＩＬ１０処理した動物では機械誘発性の異痛症は生じなかった。反復測定したＡＮＯＶＡによって、ＩＬ−１０の信頼性のある主効果が明らかになった（Ｆ１，２１＝２３５．６９４、ｐ＜０．０００１）。
行動試験の終了の際に収集したＣＳＦによって、ＡＤ−ＩＬ１０が、腰仙のレベルで濃縮された、ヒトＩＬ−１０の放出を誘導したことが支持された（図３）。ＡＮＯＶＡによって、ＩＬ−１０（Ｆ１，２１＝３７．４３０、ｐ＜０．０００１）およびＣＳＦ収集の部位（腰仙対頚部；Ｆ１，２１＝４６．２４０、ｐ＞０．０００１）およびＩＬ１０とＣＳＦ収集部位との間の相互作用（Ｆ１，２１＝３６．５７７、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになり、これによってＡＤ−ＩＬＩＯが頚部レベルよりも腰仙レベルで大きいＩＬ−１０濃度の部位特異的効果を生じたことが支持される。
（実施例３ クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０による坐骨神経刺激神経障害（ＳＩＮ）誘発性の機械誘発性異痛症の予防）
神経障害性疼痛に対するＡＤ−ＩＬ１０の効果を試験することによって、実施例３〜５の目的を実施例２の結果に拡大した。神経障害性の疼痛は、末梢神経の炎症および／または外傷の結果として生じる。神経障害性の疼痛は、標的ニューロンに対して開発された現在利用可能な薬物によって管理することは困難である（概説については、ＷａｔｋｉｎｓおよびＭａｉｅｒ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．（２００２）８２：９８１〜１０１１を参照のこと）。
以下のように、ＡＤ−ＩＬ１０が坐骨神経炎症性神経障害（ＳＩＮ）によって誘発される機械誘発性の異痛症を予防する能力について試験した。実施例１に規定された範囲内のアデノウイルス用量のパイロット研究に基づいて、１，５×１０７ＰＦＵのＡＤ−ＩＬ１０を含む５μｌを研究のために選択した。等容積のＡＤコントロール（８×１０７ＰＦＵ含有５μｌ）をコントロール群に投与した。ラットを最初に、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロール注射の前（ＢＬ）そして後に再度４日目に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対するそのラットの応答について評価した。上で注記したとおり、ウイルス指向性のＩＬ−１０のほぼ最大のレベルがこの時までに予想される（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１９：８１２〜８１８）。４日目に行動試験を行なって、このクモ膜下腔内アデノウイルス用量もウイルス指向性ＩＬ１０放出もこの測定に対して観察可能な混同される効果は有さなかったことを確認した。４日の試験のちょうど完了の際、全てのラットに４または１６０μｇのいずれかのザイモサンを坐骨神経周囲に注射した（ｎ＝５〜６匹／群）。坐骨神経周囲のビヒクル注射したコントロールは、含まなかった。なぜなら、この手順は行動測定には影響がないことが繰り返し実証されているからである（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１〜２４４；Ｇａｚｄａら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（２００１）６：１１１〜１２９；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）。４μｇおよび１６０μｇのザイモサン用量は、クモ膜下腔内にカテーテル留置されたラットにおいて、それぞれ片側および両側の機械誘発性異痛症を誘発することが以前に繰り返し示されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対する行動応答は、以前の研究に従って、３時間および２４時間後に再評価した（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１〜２４４；Ｇａｚｄａら、Ｊ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓ．（２００１）６：１１１〜１２９；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）。試験の終了時、頚部および腰仙部のＣＳＦサンプルをＩＬ−１０分析のために収集した。
クモ膜下腔内に投与されたＡＤ−ＩＬ１０は、（ａ）ヒトＩＬ−１０のＣＳＦ中への部位指向性放出を首尾よく誘導し、そして（ｂ）脊髄免疫活性化に応答して生じる機械誘発性異痛症を防止した、ことが見出された。ＡＮＯＶＡによって、ＡＤ−ＩＬ１０およびＡＤ−コントロールが、ＢＬに比較して、ウイルス送達の５日後に測定した機械誘発性の応答閾値に効果を有さなかったことが明らかになった（Ｆ７，８８＝０．６８６、ｐ＞０．６８）（図４）。このように、ＩＬ１０の存在もアデノウイルスの存在も基礎の疼痛応答には測定可能な影響を有さなかった。本発明者らの以前の研究と同様に（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）、低用量のザイモサンは、片側の異痛症を誘発した（図４Ａ）が、より高用量のザイモサンは、ＢＬ測定値に比較して、両側性の異痛症（図４Ｃ）を誘発した。反復測定ＡＮＯＶＡによって、坐骨神経周囲のザイモサン用量（Ｆ１，４０＝１２．０９３、ｐ＜０．００２）、クモ膜下腔内ＩＬ−１０（Ｆ１，４０＝６９．８２９、ｐ＜０．０００１）、側性（Ｆ１，４０＝２２．３１５、ｐ＜０．０００１）および坐骨神経周囲ザイモサン適用後の時間（Ｆ１，４０＝１３．０２９、ｐ＜０．０００１）そしてザイモサン用量とクモ膜下腔内ＩＬ−１０との間（Ｆ１，４０＝６．１６１、ｐ＜０．０２）ならびにクモ膜下腔内ＩＬ−１０と側性との間（Ｆ１，４０＝１５．４１２、ｐ＜０．００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ ｈｏｃ平均比較によって、４μｇのザイモサンがＡＤコントロール処理した動物において、右側（反対側）の後足に比べて、左側（同じ側）の後足で機械誘発性異痛症を誘発した（ｐ＜０．０００１）ことが明らかになった。４μｇの坐骨神経周囲ザイモサンの後の右後足の機械誘発性応答は、ＢＬと異なることはなく、これによって４μｇのザイモンサンが注射の部位と同じ側で片側の異痛症しか誘発しなかった（ｐ＞０．４５）ことが示される。さらに、ｐｏｓｔｈｏｃ分析によって、両側性の機械誘発性異痛症が、ＡＤコントロール処置した動物では１６０μｇの坐骨神経周囲のザイモサンに応答して生じたことが明らかになった。すなわち、左右の両方の足の閾値がＢＬ測定とは確実に異なった（ｐ＜０．０００１）。坐骨神経周囲のザイモサンの後のｖｏｎ Ｆｒｅｙ応答はＢＬと異なることはなかったので、同側性（ｐ＞０．０５）｛図４Ｂ）および両側性（ｐ＞０．１５）（図４Ｄ）の両方の異痛症がＡＤ−ＩＬ１０によってブロックされた。
行動試験の終了時に収集した腰仙部ＣＳＦによって、ＡＤ−ＩＬ１０がヒトＩＬ−１０の放出を誘発したことが示された（図３）。１元ＡＮＯＶＡによって、ＡＤ−ＩＬ１０の信頼性のある主効果が明らかになった（Ｆ１，１０＝８．３６２，ｐ＜０．０２）。図３は、１０×１０７ＰＦＵ ＩＬ１０（実施例２）に比較した、５×１０７ＰＦＵ ＡＤ−ＩＬ１０（本実施例）の用量依存性の効果を示唆する。これらのアッセイは種々のキットを用いて別々の時間で行なったので、これらの値は、統計学的には比較していない。
（実施例４ クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０による、坐骨神経炎症性神経障害（ＳＩＮ）誘発性の機械誘発性異痛症の逆転）
実施例３によって、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０がＳＩＮ誘発性の機械誘発性異痛症を防止したことが明らかになった。本実施例では、慢性的ＳＩＮ法（ｃｈｒｏｎｉｃ ＳＩＮ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）を用いて、ＡＤ−ＩＬ１０が樹立されたＳＩＮ誘発性の機械誘発性の異痛症を逆転し得るか否かを試験した。研究のために選択したＡＤ−ＩＬ１０の用量は、実施例３の用量と同じであった（５×１０７ＰＦＵのアデノウイルスを５ｍｌに含有）。等容積のＡＤコントロール（８×１０７ＰＦＵ含有５μｌ）をコントロール群に投与した。ラットを、慢性的なＳＩＮの開始の前（ＢＬ）にｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対するそのラットの応答について評価した。片側および両側の慢性的ＳＩＮを前に記載したとおり作製した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）。ザイモサンの坐骨神経周囲の微量注射（４μｇまたは１６０μｇのいずれか）をＢＬ（０日目）の直後、そして２、４、６、８、１０および１２日後に送達した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を再度、１日、４日、８日、９日、１０日、１２日および１４日目に行なった。行動試験および坐骨神経周囲注射を同じ日に行なった場合、行動試験は坐骨神経周囲注射に先行した。８日目の行動評価によって、４μｇおよび１６０μｇの慢性的なザイモサンレジメンが、それぞれ片側および両側の異痛症を生じたという確認が得られた。クモ膜下腔内アデノウイルス（ＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロールのいずれか）を８日目の試験の直後に送達した（ｎ＝５〜６匹／群）。９〜１４日の行動評価によって、ＡＤ−ＩＬ１０が完全に確立された炎症性神経障害疼痛を逆転する能力の評価が可能になった。
同側性の領域（坐骨神経によって神経支配される皮膚）、同側性の領域外（伏在神経によって神経支配される皮膚）、鏡像領域および鏡像領域外の異痛症が、クモ膜下腔内ＩＬ１０遺伝子治療によって同等に影響されるか否かを試験するため、１６０μｇの坐骨神経周囲ザイモサンを慢性的に投与したラットにおいて、坐骨神経および伏在神経の神経支配ゾーンを、ＢＬ、８日目（ＡＤ投与前）、そして１２日目および１４日目に（ＡＤ投与後４日および６日）別々に試験した。
以前に報告されたように（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）、繰り返しの低用量（４μｇ）および高用量（１６０μｇ）のザイモサンプロトコールによって、それぞれ持続的な片側のおよび両側の異痛症が生じた（図５）。ザイモサン投与の開始後８日で、アデノウイルス投与の前、ＡＮＯＶＡによって、ザイモサン用量（Ｆ１，３６＝３５．０４９、ｐ＜０．０００１）、および側性（Ｆ１，３６＝４１．６３４、ｐ＜０．０００１）、および坐骨神経周囲ザイモサン適用後の時間（Ｆ２，７２＝７．５３７、ｐ＜０．００１）そしてザイモサン用量と側性との間の相互作用（Ｆ１，３６＝３５．９１９、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ ｈｏｃ平均比較によって、４μｇのザイモサンがＩＬ−１０処理群およびコントロールウイルス処理群において、右側（反対側）の後足に比べて、左側（同じ側）の後足で機械誘発性異痛症を誘発した（ｐ＜０．０００１）ことが明らかになった。４μｇの坐骨神経周囲ザイモサンの後の右後足の機械誘発性応答は、ＢＬと異なることはなく（ｐ＞０．６６）、これによって４μｇのザイモンサンが注射の部位と同じ側で片側の異痛症しか誘発しなかったことが支持される。さらに、ｐｏｓｔｈｏｃ分析によって、両側性の機械誘発性異痛症が、１６０μｇの坐骨神経周囲のザイモサンに応答して生じたことが支持された。すなわち、左右の両方の後足の閾値は異なることはなかった（ｐ＞０．２９）が、左右の両方の足についての閾値はＢＬとは確実に異なった（ｐ＜０．０００１）。
クモ膜下腔内のアデノウイルス投与後、ＡＤ−ＩＬ１０はこれらの継続している病理的疼痛状態を逆転した。すなわち、ＡＤ−ＩＬ１０は、坐骨神経周囲のザイモサンによって誘発された片側および両側の両方の異痛症を逆転した。ＡＮＯＶＡによって、ザイモサン用量（Ｆ１，３６＝２２．７２４、ｐ＜０．０００１）、ＩＬ１０（Ｆ１，３６＝５０．０４４、ｐ＜０．０００１）、側性（Ｆ１，３６＝３５．５３２、ｐ＜０．０００１）およびクモ膜下腔内アデノウイルス投与後の時間（Ｆ３，１０８＝６．３０１、ｐ＜０．００１）およびＩＬ−１０と側性との間の相互作用（Ｆ１，３６＝３５．９１９、ｐ＜０．０５）の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ平均比較によって、ＩＬ−１０が同側の後足において４μｇのザイモサンの異痛症効果を減弱した（ｐ＜０．０００１、ＡＤ−ＩＬ１０群における１４日目の同側の後足応答に対して８日目の同側の後足応答を比較する）が、ＡＤコントロール群の後足応答は、１４日にわたって異痛症のままであった（ｐ＞０．８、ＡＤコントロール群における１４日目の同側の後足応答に対して８日目の同側の後足応答を比較する）ことが支持された。
ＩＬ−１０はまた、反対側の後足において１６０μｇのザイモサンの異痛症効果を減弱した（ｐ＜０．０００１、ＡＤ−ＩＬ１０群における１４日目の反対側の後足応答に対して８日目の反対側の後足応答を比較する）が、ウイルス単独では、継続している鏡像異痛症を変更しなかった（ｐ＞０．２、ＡＤコントロール群における１４日目の反対側の後足応答に対して８日目の反対側の後足応答を比較する）。
慢性的な坐骨神経周囲１６０μｇのザイモサンの後（ＡＤ投与の前）に、ＢＬ（Ｆ１，５０＝１．３５２、ｐ＜０．９０）および８日目（Ｆ１，５０＝０．１７０、ｐ＞０．８９）での同側および反対側の後足の坐骨神経（領域）および伏在神経（領域外）神経支配領域の種々の試験によって、群の間に相違がないことが明らかになった（図６）。８日目（ＢＬに比較した）、領域および領域外機械誘発性異痛症は、同側および鏡像の後足の両方で観察された。ＡＮＯＶＡによって、坐骨神経周囲ザイモサン後の時間（ＢＬ対８日目）の主効果が明らかになった（Ｆ１，３８＝２２．３９８、ｐ＜０．０００１）。慢性的な坐骨神経周囲の１６０μｇのザイモサンによって、両方の後足の領域および領域外の両方の神経支配領域において確実な両側性の異痛症が生じた。ＡＮＯＶＡによって、坐骨神経領域に対して伏在神経領域の間に相違がないことが明らかになった（Ｆ１，３６＝０．００８、ｐ＞０．９２）。さらに、同側性対反対側の後足応答の間では相違は見出されなかった（Ｆ１，３６＝０．７１６、ｐ＞０．４０）。ＡＤ−ＩＬ１０は、両側の後足の神経支配領域の領域および領域外の両方で坐骨神経ザイモサンによって生じた両側性の機械誘発性異痛症を確実に逆転した。反復測定ＡＮＯＶＡによって、ＩＬ−１０（Ｆ１，３２＝４５．１７４、ｐ＜０．０００１）、およびウイルス処置後の時間（Ｆ２，６４＝３７．３５４、ｐ＜０．０００１）、ならびにウイルス処置後の時間とＩＬ−１０との間の相互作用（Ｆ２，６４＝１５．２６５、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔｈｏｃ分析によって、ＡＤ−ＩＬ１０が、ＡＤコントロール処置動物に比較して、同側性の領域（ｐ＜０．０５）、同側性の領域外（ｐ＜０．００１）、鏡像領域（ｐ＜０．０１）、および鏡像領域外（ｐ＜０．０１）の異痛症を確実に逆転したことが明らかになった。これらの異痛症の各々の逆転の程度は、１２日目（ＡＤ−ＩＬ１０後４日；ｐ＜０．０２、それぞれのＡＤコントロールに対して、ＡＤ−ＩＬ１０の同側性および反対側の伏在および坐骨神経の領域を比較する）および１４日目（ＡＤ−ＩＬ１０後６日；ｐ＜０．００５、それぞれのＡＤコントロールに対して、ＡＤ−ＩＬ１０の同側性および反対側の伏在および坐骨神経の領域を比較する）の両方で匹敵するものであった。
（実施例５ クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０による、絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）誘発性の機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の逆転）
実施例４によって、アデノウイルスＩＬ−１０がｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験によって測定した場合、ＳＩＮ誘発性の病理的疼痛を完全に逆転し得ることが明らかになった。臨床的な神経障害の約５０％が事実上、感染性／炎症性であるが、残りは、末梢神経の外傷に関与している（ＳａｉｄおよびＨｏｎｔｅｂｅｙｒｉｅ−Ｊｏｓｋｏｗｉｃｋ，Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４３：５８９〜５９９）。従って、アデノウイルスＩＬ−１０が、炎症性神経障害に対するその有効性に加えて、外傷性神経障害誘発性の疼痛傷害を逆転し得るか否かを決定することが重要であった。古典的な部分的な神経損傷モデルを研究に用いた；すなわち、絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）（ＢｅｎｎｅｔｔおよびＸｉｅ、Ｐａｉｎ（１９８８）３３：８７〜１０７）。研究のために選択したＡＤ−ＩＬ−１０の用量は、実施例３および４における用量と同一であった（５×１０７ＰＦＵのアデノウイルスを５μｌに含有）。等容積のＡＤコントロール（８×１０７ＰＦＵ含有５μｌ）をコントロール群に投与した。ラットを、ＣＣＩまたはニセの外科手術の前（ＢＬ）およびその後１０日目に再度、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験に対するそのラットの応答について評価した。この後者の試験によって、コントロールに比較して、ＣＣＩラットにおける機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の発症の確認が可能になった。１０日目の試験の直後に、全てのラットにクモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロールを与えた（ｎ＝６匹／群）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を、ウイルス投与後、３、５、７、１４、１８および２１日後に再度行なった。これは、ＣＣＩまたはニセの外科手術の後、１３、１５、１７、２４、２８および３１日に相当する。これらの試験によって、（ａ）ＡＤＩＬ−１０が完全に確立された外傷性神経障害性疼痛を逆転する能力、および（ｂ）ＡＤ−ＩＬ１０有効性の持続期間の評価が可能になった。
ＣＣＩは持続性の両側の機械誘発性の異痛症（図７）および持続性の同側性の温熱性痛覚過敏（図８）を生じた。疼痛変化のこのようなパターンは、以前の刊行物と一致する（Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｐａｉｎ（２０００）８４：２３３〜２４５）。アデノウイルス投与の前の、３〜１０日の間の行動評価について、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，３８＝１４３．２３５、ｐ＜０．０００１）、および側性（Ｆ１，３８＝１６．７９７、ｐ＜０．００１）、およびＣＣＩ外科手術後の時間（Ｆ３，１１４＝１５．６９９、ｐ＜０．０００１）そしてＣＣＩ外科手術と側性との間（Ｆ１，３８＝１３．８２４、ｐ＜０．００１）ならびにＣＣＩ外科手術後の時間とＣＣＩとの間（Ｆ３，１１４＝７．０５４、ｐ＜０．００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ ｈｏｃ平均比較によって、ニセの操作をしたコントロールに比較して、ＣＣＩが両側性の機械誘発性異痛症を誘発した（同側性：ｐ＜０．０００１；反対側：ｐ＜０．０００１）ことが明らかになった。さらに、アデノウイルス投与の前、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，３８＝２３９．１３５、ｐ＜０．０００１）、および側性（Ｆ１，３６＝１５０．９０２、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，３８＝１０３．２２８、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ平均比較によって、ＣＣＩが、ニセの操作をしたコントロールに比較して、片側の温熱性痛覚過敏を誘発した（同側性：ｐ＜０．０００１；反対側：ｐ＞０．４９）ことが明らかになった。
クモ膜下腔内アデノウイルス投与後、ＡＤ−ＩＬ１０は、継続している病理的疼痛状態を逆転した。すなわち、１３〜２４日の間のデータを分析すれば、ＡＤ−ＩＬは、ＣＣＩによって誘発された両側性の異痛症および同側性の温熱性痛覚過敏の両方を逆転した。ＡＮＯＶＡによって、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，３８＝１０５．８３２、ｐ＜０．０００１）、ＩＬ−１０（Ｆ１，３８＝８．９９８、ｐ＜０．００５）および時間（Ｆ３，１１４＝５．６５１、ｐ＜０．０１）、そしてＣＣＩとＩＬ１０との間（Ｆ１，３８＝１４．３０１、ｐ＜０．００１）、クモ膜下腔内アデノウイルスとＩＬ−１０の後の時間（Ｆ３，１１４＝７．２９、ｐ＜０．００１）、およびクモ膜下腔内アデノウイルスとＣＣＩとＩＬ−１０の後の時間（Ｆ３，１１４＝２．６０４、ｐ＜０．０５）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔｈｏｃ平均比較によって、ＩＬ−１０は、１５日目まで（それぞれ、ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０２、１５日目のＡＤ−ＩＬ１０群対ＡＤコントロールの同側性および反対側の足を比較する）および１７日目まで（それぞれ、ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０１、１７日目のＡＤ−ＩＬ１０群対ＡＤコントロールの同側性および反対側の足を比較する）ＣＣＩの両側性の機械誘発性異痛症効果を逆転したことが支持された。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，３８＝４８．０６９、ｐ＜０．０００１）、ＩＬ１０（Ｆ１，３８＝４．７２７、ｐ＜０．０５）、および側性（Ｆ１，３８＝４８．４６６、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，３８＝３０．９５５、ｐ＜０．０００１）ＩＬ１０と側性との間の相互作用（Ｆ１，３８＝６．４９４、ｐ＜０．０１）、ならびにクモ膜下腔内アデノウイルスとＣＣＩとＩＬ１０の後の時間の相互作用（Ｆ３，１１４＝３．１１６、ｐ＜０．０５）の信頼性のある主効果が明らかになった。ｐｏｓｔ平均比較によって、ＩＬ１０は、１５日目まで（ｐ＜０．００２、１５日目のＡＤコントロールに対するＡＤ−ＩＬ１０群の同側性の足を比較する）および１７日目まで（ｐ＜０．０１、１７日目のＡＤコントロールに対してＡＤ−ＩＬ１０群の同側性の足を比較する）ＣＣＩの同側性の温熱性痛覚過敏効果を逆転したことが支持された。
クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０は、継続している病理的疼痛状態を永続的に逆転することはなかった。これは、もしアデノウイルスによって感染された細胞が容易に検出され免疫系によって消去されるので場合は、予想された。実際、本研究によって用いられたアデノウイルスに対する文献では、炎症誘発性のチャレンジの結果が一時的にしか逆転されないことが支持された（Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ＆ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）１９：８１２〜８１８）。この支持においては、ＡＤ−ＩＬ１０は、２４日目までに消失を開始する、ＣＣＩ誘発性病理的疼痛状態を逆転する。２４〜３１日目から、機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の両方が徐々に戻った。２８日目までに、機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏は、１０日目に観察されたアデノウイルスの前のレベルまで戻った。機械誘発性異痛症（Ｆ１，３８＝０．４５０，ｐ＞０．５０）および温熱性痛覚過敏（Ｆ１，３８＝０．６１２、ｐ＞０．４３）は、アデノウイルス前のレベルのものと異なることはなかったということがＡＮＯＶＡによって支持された。
上記の実施例によって、ヒトＩＬ−１０のｃＤＮＡを含む複製欠損アデノウイルスの腰仙部クモ膜下腔内送達が、ＣＳＦへのＩＬ−１０の部位特異的放出を生じることが実証される。５〜１０×１０７のＰＦＵのアデノウイルスの存在もウイルス由来のＩＬ−１０も、較正された接触／圧力（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験）または温熱（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験）刺激に対する基準応答閾値に対して観察可能な効果を生じなかった。しかし、アデノウイルスＩＬ１０は、病的な疼痛状態を防止および逆転した。アデノウイルスＩＬ−１０は、クモ膜下腔内ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０での脊髄の免疫活性化によって、および坐骨神経炎症性神経障害（ＳＩＮ）によって誘発される機械誘発性異痛症を防止した。アデノウイルスＩＬ−１０は、ＳＩＮおよび坐骨神経外傷性神経障害（ＣＣＩ）によって誘発された機械誘発性異痛症を逆転した。最後に、アデノウイルスＩＬ−１０は、ＣＣＩによって誘発される温熱性痛覚過敏を逆転した。神経障害性疼痛が市販の薬物で処置することが特に困難であるならば｛ＭｃＱｕａｙら、Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．（１９９５）３１１：１０４７〜１０５２；ＭｃＱｕａｙら、Ｐａｉｎ（１９９６）６８：２１７〜２２７；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ．Ｐａｉｎ Ｓｙｍｐｔｏｍ．Ｍｏｎａｇｅ．（２０００）２０：３３９〜４５７、この遺伝子治療の成功は劇的である。
（実施例６ クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０による、坐骨神経炎症性神経障害（ＳＩＮ）誘発性の機械誘発性異痛症の予防）
アデノウイルスＩＬ−１０で得られた顕著な結果を考慮して、異なるベクターおよび分子でこの結果が達成可能であるか否かを試験するために、ヒトＩＬ−１０の代わりに、（ａ）異なるウイルスベクター（ＡＡＶ）および（ｂ）ラットＩＬ−１０を用いて、以下の実験を行なった。ラットＩＬ−１０の使用によって、ラットに送達された場合、外来のヒトＩＬ−１０タンパク質への免疫系からの潜在的な妨害が排除される。
研究のために選択したＡＡＶ−ＩＬ１０の用量は、実施例３からの観察に基づいた（５×１０７ＰＦＵのアデノウイルスを５μｌに含有）。ここで、８．５×１０８個の感染性粒子含有の５μｌが有効であると見積もられる。等容積のＡＡＶコントロール（８．５×１０８ＰＦＵを５μｌに含有）をコントロール群に投与した。ラットを、クモ膜下腔内ＡＡＶ（ＡＡＶ−１０またはＡＡＶコントロールのいずれか）を送達する前（ＢＬ）にｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対するそのラットの応答について評価した（ｎ＝５〜６匹／群）。この第二のＢＬ評価（ＢＬ−２）は、ＡＡＶ注射の３日後に行なって、ＡＡＶのこの用量が正常な閾値応答を変更しないことを確実にした。片側および両側の慢性的ＳＩＮは、以前に記載されたとおり作製した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６〜１０４０）。ザイモサンの坐骨神経周囲微量注射（４μｇまたは１６０μｇのいずれか）をＢＬ−２（０日目）の直後そして２、４、６および８日後に送達した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験を再度、８日目および１０日目まで毎日行なった。行動試験および坐骨神経周囲の注射を同じ日に行なった場合、行動試験は坐骨神経周囲の注射より先行させた。
図９に示されるように、ＡＡＶ由来ＩＬ−１０は、正常な（右側）の肢の疼痛応答には影響を有さなかったが、神経障害性の肢（左）は正常なレベルの疼痛感度まで戻った。ＡＮＯＶＡによって、ＡＡＶ−ＩＬ１０およびＡＡＶコントロールは、ＢＬに比較して、ウイルス送達の３日後に測定した機械誘発性応答に影響しなかったことが明らかになった（Ｆ１，４８＝１．０６９、ｐ＜０．３０）。このように、ＩＬ−１０およびＡＡＶの存在は、基礎の疼痛応答に測定可能な影響を有さなかった。低用量のザイモサンは、片側の異痛症を誘発したが、高用量のザイモサンは、ＢＬ測定に比較して、両側性の異痛症を誘発した。反復測定ＡＮＯＶＡによって、坐骨神経周囲ザイモサン用量（Ｆ２，４４＝２３７．７９５、ｐ＜０．０００１）、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０（Ｆ１，４４＝３９９．９１２、ｐ＜０．０００１）、側性（Ｆ１，４４＝１２５．１２２、ｐ＜０．０００１）、および坐骨神経周囲ザイモサン適用後の時間（Ｆ８，３５２＝１４．８６５、ｐ＜０．０００１）、そしてクモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０とザイモサン用量との間（Ｆ２，４４＝１２５．９７５、ｐ＜０．０００１）、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０と側性との間（Ｆ１，１４＝２４．９０６、ｐ＜０．０００１）、ザイモサン用量と側性との間（Ｆ２，４４＝６９．６５１、ｐ＜０．０００１）、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０とザイモサン用量と側性との間（Ｆ２，１４＝２４．３２３、ｐ＜０．０００１）、ならびに坐骨神経周囲ザイモサン適用後の時間と、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０と、ザイモサン用量と側性との間（Ｆ１６，３５２＝１．７０６、ｐ＜０．０５）の信頼性のある主効果が明らかになった。
（実施例７ クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０による、絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）誘発性の機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の逆転の全時間経過）
ＡＡＶ媒介性ＩＬ−１０遺伝子送達が、ＣＣＩ誘発性機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏を逆転するのに有効であるか否かを決定するために、以下の実験を行なった。研究のために選択されたＡＡＶ−ＩＬ１０の用量は、ＡＡＶの感染性粒子を５μｌ中に８．５×１０８個含有した。等容積のＡＡＶコントロール（８．５×１０８ＰＦＵを５μｌに含有）をコントロール群に投与した。ＣＣＩまたはニセの外科手術の前（ＢＬ）そしてその後３日目および１０日目に再度、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験に対するそのラットの応答についてラットを評価した。この後者の試験によって、コントロールに比較して、ＣＣＩラットにおける持続性の機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の発症の確認が可能になった。１０日目の試験の直後に、全てのラットにクモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロールを与えた（ｎ＝６匹／群）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を、ウイルス投与後、３、５、７、９、１１、１４、１６および２０日後に再度行なった。これは、ＣＣＩまたはニセの外科手術の後、１３、１５、１７、１９、２１、２４、２６および３０日に相当する。これらの試験によって、（ａ）ＡＡＶＩＬ−１０が完全に確立された外傷性の神経障害性疼痛を逆転する能力、および（ｂ）ＡＡＶ−ＩＬ１０有効性の持続期間の評価が可能になった。
図１０および１１に示されるように、ＡＡＶ−ＩＬ１０は、ニセの操作をしたラットには影響を有さなかったが、神経障害性の疼痛は正常なレベルの疼痛感度まで戻した。ＣＣＩ手術の前に、全ての群が同様のＢＬ値を示した（Ｆ７，４０＝０．３４５、ｐ＞０．９）。上記の実験で観察されたとおり、ＣＣＩは、慢性的な両側性の機械誘発性異痛症および慢性的な同側性の温熱性痛覚過敏を生じた。ＡＡＶクモ膜下腔内投与の前、３日目および１０日目の行動評価のために、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，４０＝１９７．４４６、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，４０＝６．３５６、ｐ＜０．０５）の信頼性のある主効果が明らかになった。
さらに、ＣＣＩ手術の前に、全ての群がＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験については行動上ＢＬの相違を示さなかった（Ｆ７，４０＝２．１０２、ｐ＞０．０５）。ＡＡＶクモ膜下腔内投与の前、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，４０＝１４０．７４０、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，３８＝４８．９０１、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，４０＝１０４．２９５、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
クモ膜下腔内ＡＡＶ投与後、ＡＡＶ−ＩＬ１０は、これらの継続している病的な疼痛状態を逆転した。すなわち、１３〜３０日（３〜２０日に相当する）の間のデータを分析したところ、ＡＡＶ−ＩＬ１０は、ＣＣＩによって誘発される両側性の異痛症および同側性の温熱性痛覚過敏の両方を逆転した。ＡＮＯＶＡによって、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，４０＝４９６．３３６、ｐ＜０．０００１）およびＡＡＶ−ＩＬ１０（Ｆ１，４０＝５９．６３６、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，４０＝２８．５６５、ｐ＜０．０００１）、ならびにＡＡＶ後の時間（Ｆ７，２８０＝１０．４６２、ｐ＜０．０００１）、そしてＣＣＩとＡＡＶ−ＩＬ１０との間（Ｆ１，４０＝７２．９８８、ｐ＜０．０００１）、ＣＣＩと側性との間（Ｆ１，４０＝９．３２５、ｐ＜０．０１）、ＡＡＶとＣＣＩの後の時間（Ｆ７，２８０＝５．８２３、ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶとＡＡＶ−ＩＬ１０の後の時間（Ｆ７，２８０＝５．９９３、ｐ＜０．０００１）、ならびにＡＡＶとＣＣＩとＡＡＶ−ＩＬ１０との後の時間（Ｆ７，２８０＝４．８４０、ｐ＝０．０００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，３９＝１３４．０３６、ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ−ＩＬ１０（Ｆ１，３９＝１２．０４７、ｐ＜０．０１）および側性（Ｆ１，３９＝６６．２８４、ｐ＜０．０００１）、ならびにクモ膜下腔内ＡＡＶ投与後の時間（Ｆ７，２７３＝１２．２３７、ｐ＜０．００５）、そしてＣＣＩとＡＡＶ−ＩＬ１０との間（Ｆ１，３９＝２４．４８６、ｐ＜０．０００１）、ＣＣＩと側性との間（Ｆ１，３９＝９１．９５６、ｐ＜０．０００１）、ＩＬ−１０と側性と間（Ｆ１，３９＝１７．３９２、ｐ＜０．０００１）、ＣＣＩとＡＡＶ−ＩＬ１０と側性との間（Ｆ１，３９＝３５．７２１、ｐ＜０．０００１）、ならびにクモ膜下腔内ＡＡＶ投与とＩＬ１０との後の時間（Ｆ７，２７３＝３．７８３、ｐ＝０．００５）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
（実施例８ 全逆転の時点でＣＳＦおよび組織サンプルを収集するための、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０による、絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）誘発性の機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏の逆転の部分的時間経過）
実施例７を、１つを除いて反復した。すなわち、クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０の時間経過を、脊髄ＡＡＶ−ＩＬ１０の作用機序を試験するために、温熱性痛覚過敏および低閾値の異痛症の両方の完全な行動逆転の時点で短縮した。ＡＡＶ−ＩＬ１０の用量は、ＡＡＶの感染性粒子を５μｌ中に８．５×１０８個含有した。等容積のＡＡＶコントロール（８．５×１０８個の感染性粒子を５μｌに含有）をコントロール群に投与した。ラットを、ＣＣＩまたはニセの外科手術の前（ＢＬ）そしてその後３、５、７および１０日目に再度、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験に対するそのラットの応答について評価した。１０日目の試験の直後に、全てのラットにクモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロールを与えた（ｎ＝６匹／群）。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験を、ウイルス投与後、３、５、および７日後に再度行なった。これは、ＣＣＩまたはニセの外科手術の後、１３、１５および１７日に相当する。これらの試験によって、（ａ）コントロールのＡＡＶに比較したＡＡＶ−ＩＬ１０の産生および放出、（ｂ）炎症誘発性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ−ｂおよびＩＬ−６）およびそれらの反応性レセプターならびにＩＬ１０レセプターに対するＡＡＶ−ＩＬ１０の作用の評価が可能になった。
図１２Ａおよび１２Ｂに示されるように、ＡＡＶ由来ＩＬ−１０はやはり、ＣＣＩによって誘発された慢性的な温熱性痛覚過敏を逆転した。これは部分的な時間経過である。なぜなら、この実験は組織を分析用に収集するように、完全な疼痛逆転の時点で停止されるからである。ベースライン（ＢＬ）の評価後、ラットに左の坐骨神経のニセの手術またはＣＣＩのいずれかを与えて、外傷性の神経障害を誘発させた。１０日目の行動評価後、ラットにＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをクモ膜下腔内に注射した。行動を、３、５、および７日後（ＣＣＩまたはニセの外科手術の後、１３、１５および１７日に相当する）に再度評価した。１７日目の試験後、動物を屠殺して組織を分析用に収集した。クモ膜下腔内コントロールウイルスを与えられたＣＣＩラットにおいて、顕著な神経障害性疼痛が実証された。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０は、この神経障害性疼痛を鈍らせた。ＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかを投与されたニセの操作をされたラットについて正常な疼痛応答が観察された。
詳細には、ＣＣＩの誘発の前、全ての群が同様のＢＬ値を示した（Ｆ７，４２＝０．４９７、ｐ＞０．８０）。ＣＣＩの誘発後およびＡＡＶ投与の前、３日目〜１０日目の間の行動評価のために、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，４２＝２８２．３６９、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，４２＝１３．１１９、ｐ＜０．００１）およびＣＣＩ手術と側性との間の相互作用（Ｆ１，４２＝８．０７６、ｐ＜０．０１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
ＣＣＩの導入の前に、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験から評価したＢＬ値によって、相違がないことが明らかになった（Ｆ７，４２＝０．９５７、ｐ＞０．４７）。しかしＣＣＩの誘発後およびＡＡＶ投与の前、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，４２＝１３７．３１２、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，４２＝４０．４８０、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，４２＝１５６．５６２、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
クモ膜下腔内ＡＡＶ投与後、ＡＡＶ−ＩＬ１０は、継続している病的な疼痛状態を逆転した。すなわち、１３〜１７日の間のデータを分析したところ、ＡＡＶ−ＩＬ１０は、ＣＣＩによって誘発される両側性の異痛症および同側性の温熱性痛覚過敏の両方を逆転した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，４２＝２２０．４８９、ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ−ＩＬ１０（Ｆ１，４２＝３８．９３１、ｐ＜０．０００１）、側性（Ｆ１，４２＝８６．８１２、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，４２＝４３．１６９、ｐ＜０．０００１）、ＡＡＶ−ＩＬ１０（Ｆ１，４２＝１４．７４０、ｐ＜０．０１）および側性（Ｆ１，４２＝３１．６０９、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間（Ｆ１，４２＝１８．４０２、ｐ＜０．０００１）、およびＡＡＶ−ＩＬ１０と側性と間（Ｆ１，４２＝６．４９４、ｐ＜０．０１）、ならびにクモ膜下腔内アデノ随伴ウイルスとＣＣＩとＩＬ１０の後の時間（Ｆ３，１１４＝５．５３４、ｐ＜０．０５）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
（実施例９ ＩＬ−１０をコードするプラスミドＤＮＡをクモ膜下腔内に注射することによる、絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）神経障害性疼痛の逆転）
ＩＬ−１０の効果が、非ウイルスベクター（ＮＶＶ）を用いる送達によって誘発され得るか否かを決定するために、以下の実験を行なった。ラットＩＬ−１０またはＧＦＰ（コントロールとして）のいずれかをコードする１００μｇのプラスミド（「ｎａｋｅｄ（裸の）」）ＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を１０日後、１５日後（初回注射の５日後）、２４日後（２回目の注射の９日後）および６７日後（３回目の注射の４３日後）にクモ膜下腔内に注射した。図１３に示されるとおり、初回注射は、ラットにおける病的な疼痛を完全に、ただし短時間だけ逆転した。第二の注射は、ベースラインへの回復後に与えられて、やはり疼痛を完全に、ただし長時間逆転した。第三の注射は、ベースラインへの回復後に与えられて、やはり疼痛を完全に、ただしさらに長時間逆転した。著しいことに、第四の注射は、異痛症の後に与えられて、６日間完全に再確立され（図１３では３８〜４３日）、再度完全に疼痛を逆転した。コントロールのプラスミドは、ＣＣＩにもニセの操作をしたラットにも影響を有さなかった。これらの結果は顕著である。本発明者らの知識の及ぶ限りでは、このような短時間の間隔で、プラスミド注射を反復した公開された試験された報告はない。さらに、等量のコントロールＧＦＰプラスミドがＣＣＩに対して影響を有さないのであれば、この結果はＩＬ−１０に特異的であると思われる。
これらのデータによって、首尾よいプラスミド投与のための注射の間の間隔がさらに短くなった場合、何が発生し得るかという問題が生じた。従って、ラットＩＬ−１０をコードする１００μｇのｐＤＮＡをＣＣＩ誘発性の機械誘発性異痛症の１０日後（１０日目）にクモ膜下腔内注射した。これによって、１２日目までに異痛症の完全な逆転が誘導された（図２４）。１００μｇのプラスミドの２回目のクモ膜下腔内注射を１３日目に与え、一方、ＣＣＩ疼痛増強は、図１３に示される実験と対照的に、完全に逆転されたまま残り、そして上記の第二のプラスミド注射が異痛症の後に与えられた場合、再発されることになった。図２４に示されるように、第二のプラスミド注射が送達されたが、ＣＣＩ疼痛増強が完全に逆転されたまま残った場合、この第二の注射の有効性は著しく強調された。
さらなるコントロールとして、ＩＬ−１０およびＧＦＰコントロールプラスミドは、それらを直線化するために酵素的に切断された。直線化されたプラスミドは、酵素分解に対してさらにずっと過敏であり、そして活性をほとんどまたは全く示さないということが公知である。予想どおり、等用量の直線化されたプラスミドはＣＣＩに効果を有さなかった（図２５）。
（実施例１０ モルフィン鎮痛、モルフィン耐性および慢性のオピエートの休止にともなう疼痛の増強に対するＡｄ−ＩＬ１０の効果）
モルフィン耐性および病的疼痛は、共通の多くの特徴を有し、これによって両方とも共通の生物学的基盤を有するという概念がもたらされる。従って、遺伝子治療が抗炎症性サイトカインを誘導する能力は、同様にこの現象に影響し得る。ラットに、モルフィンチャレンジの開始の５日前にＡＤ−ＩＬ１０またはＡＤコントロールのいずれかをクモ膜下腔内注射した。それらを、数日間にまたがるクモ膜下腔のモルフィン（１０μｇ）対生理食塩水の前後に行動的に試験した。１日目、３日目および５日目に、ラットを触覚感度（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験）および温熱性疼痛感度（テールフリック試験）について試験した。モルフィンの後、試験は６時間の時間経過を続けた。
図１４に示されるとおり、脊髄でのＩＬ−１０の発現によって、初回用量のモルフィンでさえさらに長時間の鎮痛（すなわち、疼痛抑制的な）効果を生じた。なぜなら、ＩＬ−１０発現ラットは、コントロールでの１００〜２４０分後よりも長いテールフリック潜時を有したからである。
図１５および図１６からわかるように、脊髄でのＩＬ−１０の発現によって、モルフィン耐性の発生の遅延が生じた。なぜなら、ＩＬ−１０発現ラットは、コントロールラットよりも大きいモルフィン鎮痛を示したからである。
図１７に示されるように、反復モルフィン投与によって、ＡＤコントロール（図ではビヒクルと表示した）を投与された動物では、疼痛閾値の低下（疼痛応答性の増大）が生じた。これは、慢性的モルフィンの古典的な効果であり、オピエートからの離脱は、疼痛応答の増強を生じる。ここで、これは、モルフィンの毎日の投与の直前に、従ってモルフィンの最後の投与後２４時間で記録した。ＡＤ−ＩＬ１０は、疼痛感度におけるこの増大を防止した。
（実施例１１ モルフィン鎮痛、モルフィン耐性および慢性のオピエートの休止にともなう疼痛の増強に対するＩＬ−１ｒａの効果）
Ａ．普遍性について試験するために、炎症誘発性サイトカインのアンタゴニストがＩＬ−１０と同等な効果を発揮する能力を試験した。炎症誘発性サイトカインのアンタゴニストは、種々の病的疼痛状態をブロックおよび逆転することが公知である。ここで、ラットに、毎日ＩＬ−ｒａ（インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト）またはビヒクルのいずれかを、毎日のモルフィンまたはビヒクルとともに、クモ膜下腔内注射した。それらのラットを、これらの毎日のクモ膜下腔内注射の前後に行動的に試験した。１日目、３日目および５日目に、ラットを触覚感度（ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験）および温熱性疼痛感度（テールフリック試験）について試験した。モルフィンの後、試験は６時間の時間経過を続けた。
図１８に示されるとおり、脊髄周囲の脳脊髄液へのＩＬ−１ｒａ注射によって、初回用量のモルフィンでさえ、さらに長時間の鎮痛（すなわち、疼痛抑制的な）効果を生じた。なぜなら、ＩＬ−１ｒａ注射ラットは、コントロールでの１００〜２４０分後よりも長いテールフリック潜時を有したからである。従って、モルフィンの効果および疼痛はここでも平行であった。
図１９および図２０からわかるように、脊髄脳脊髄液へのＩＬ−１ｒａ注射によって、モルフィン耐性の発生の遅延が生じた。なぜなら、ＩＬ−１ｒａ注射ラットは、コントロールもラットよりも大きいモルフィン鎮痛を示したからである。
図２１Ａに示されるように、反復モルフィン投与によって、クモ膜下腔内モルフィン＋ビヒクルを投与された動物（左の黒いバー）では、疼痛閾値の低下（疼痛応答性の増大）が生じた。これは、慢性的モルフィンの古典的な効果であり、オピエートからの離脱は、疼痛応答の増強を生じる。ここでは、モルフィンの毎日の投与の直前に、従ってモルフィンの最後の投与後２４時間で記録した。毎日のクモ膜下腔内ＩＬ−１ｒａは、疼痛感度におけるこの増大を防止した（右の黒いバー）。
Ｂ．実施例１０および１１Ａで観察された効果は、慢性のモルフィンが炎症誘発性サイトカインの産生および放出を増大することを意味するか否かを試験するために、ＩＬ−１タンパク質のレベルを、慢性のクモ膜下腔内モルフィン対ビヒクル投与後に収集した組織からＥＬＩＳによってアッセイした。そこで、ラットには５日の１０μｇモルフィンまたは等量のビヒクルのいずれかを与えた。最後のクモ膜下腔内注射の２時間後（慢性のモルフィン誘発性の機械誘発性異痛症および温熱性痛覚過敏が生じた時点で）、ラットにペントバルビタールナトリウムを過量投与して、腰仙ＣＳＦおよび背側の脊髄を収集した。サンプルを液体窒素中で直ちに急速凍結して、ＥＬＩＳＡによってアッセイするまで−８０℃で保管した。
図２１Ｂおよび２１Ｃに示されるように、慢性のモルフィン処置は、両方の脊髄ＣＳＦにおいて（図２１Ｂ）、そして背側の脊髄組織において（図２１Ｃ）、ＩＬ−１タンパク質の発現を増大した。ＣＳＦレベルの増大は重要である。なぜなら、これによってＩＬ−１が単に生成されたのではなく、むしろ放出されたものでもあり、これはニューロンおよび他のグリアに対する効果を発揮することが可能になることを示すからである。
（実施例１２ ＣＣＩ誘発性の機械誘発性異痛症に対するＩＬ−１ｒａの効果）
このポイントに対して提示されたデータによって、ＩＬ−１０が、病的な疼痛状態をブロック／逆転し得るということが示唆された。なぜならこれは、炎症誘発性サイトカインを抑制していたからである。ＣＣＩが実際に炎症誘発性サイトカインによって媒介されたか否かを試験するために、以下の実験を行なった。ラットを最初に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験においてベースライン（ＢＬ）応答性について評価し、次いで、ＣＣＩまたはニセの手術に供した。外科手術の効果を確認するために３日および１０日後に行動を再評価した。次いで、１群のラットには、１００μｇ ＩＬ−１ｒａまたは等量（１μｌ）のビヒクルのいずれかをクモ膜下腔内に直ちに投与して、次いで、数時間の間、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験で行動についてモニターした（図３０Ａ）。第二群のラットは、同一で処置して、これらのクモ膜下腔内注射を外科手術後２ヶ月で行なうようにした（図３０Ｂ）。図３０Ａおよび図３０Ｂで示されるとおり、両方の場合とも、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストは、ＣＣＩ処置した動物では機械誘発性異痛症を一時的に逆転したが、ニセの操作をしたコントロールに対しては影響を有さなかった。これらのデータによって、炎症誘発性サイトカインは、長時間にわたって、病的な疼痛状態を作製かつ維持する両方に重要な因子であることが支持される。
（実施例１３ 絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）誘発性の機械誘発性異痛症に対するＩＬ−１０注射の効果）
前の実施例は、疼痛を処置するためのＩＬ−１０をコードするウイルスおよび非ウイルスベクターを送達することの治療有効性を例証する。ＩＬ−１０タンパク質注射対ＩＬ−１０をコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療の効果を比較するために、以下の実験を行なった。組み換えラットＩＬ−１０タンパク質（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ロット番号１０１Ｋ０２９０）を、０．１ｍｇ／ｍＬのストック濃度で０．１％のラット血清アルブミンを含む無菌のダルベッコＰＢＳ中で再構成して、無菌のエッペンドルフチューブにアリコートして、注射の時点まで−８０℃で保管した。動物にはラットＩＬ−１０タンパク質の３回の注射を与えた。初回の注射の時点で、ストックのＩＬ−１０タンパク質を氷上で溶かして、０．１％ラット血清アルブミンを含有するダルベッコのＰＢＳを用いて０．０１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。初回の注射の用量は５０μｌに５０ｎｇであった。ラットのＩＬ−１０タンパク質の２回目および３回目の注射は高く（５μｌに５００ｎｇ）、従って、ＩＬ−１０タンパク質のストック溶液は、氷上で溶かして、直ちにｉ．ｔ．注射を続けた。コントロールの動物は、等容積のビヒクル（５％のウシ血清アルブミンおよび０．１％のラット血清アルブミンを含む滅菌ダルベッコＰＢＳ）注射を与えた。
ラットは、ＣＣＩまたはニセの手術の前に、そして３日後および１０日後に再度、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験に対する、それらのラットのＢＬ応答について評価した。この実験では、３回の別個の時間的に空けたｉ．ｔ．注射を、ＣＣＩの誘発後１０日目に開始して投与した。各々の注射後１時間および／または２時間ならびに２４時間で、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験およびＨａｒｇｒｅａｖｅｓ試験において行動を評価した。ラット組み換えＩＬ−１０タンパク質の用量は、初回のｉ．ｔ．注射について５μｌに５０ｎｇ、そして２回目および３回目の注射については５μｌに５００ｎｇであった。第二および第三の注射についてのさらに高用量では、両方の行動試験でＩＬ−１０タンパク質の最大効果が観察され得ることが確実になった。
全ての群が、ＣＣＩ手術の前のｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験において同様のＢＬ値を示した（Ｆ７，２６＝０．５１０、ｐ＞０．８）。前の実験において観察され、そして図２２および２３に示されるように、ＣＣＩはやはり、慢性の両側性の機械誘発性異痛症および慢性の同側性温熱性痛覚過敏を生じた。ラット組み換えＩＬ−１０クモ膜下腔内投与の前、３日目および１０日目の行動評価のために、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝１１０２．３９０、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
さらに、ＣＣＩ手術の前に、全ての群は、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験の行動的なＢＬの相違を示さなかった（Ｆ７，２６＝０．３２４、ｐ＞０．９）。ラット組み換えＩＬ−１０クモ膜下腔内投与の前に、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験のＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝９４．２２８、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，２６＝３７．７８４、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，２６＝４２．１２８、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。
クモ膜下腔内ラット組み換えＩＬ−１０投与後、ラット組み換えＩＬ−１０は、継続しているこれらの病的な疼痛状態を逆転した。さらに低用量のラット組み換えＩＬ−１０（初回注射についてのみ；５０ｎｇ）は、両側性の異痛症のみを逆転したが、ＣＣＩによって誘発された同側性の温熱性痛覚過敏は逆転しなかった。ＡＮＯＶＡによって、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝９１３．４１１、ｐ＜０．０００１）、ラット組み換えＩＬ−１０（Ｆ１，２６＝２６．７４４、ｐ＜０．０００１）、およびラット組み換えＩＬ−１０後の時間（Ｆ１，２６＝１１．５３８、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ１，２６＝１７．７５５、ｐ＜０．０００１）、時間とＣＣＩとの間（Ｆ１，２６＝４８．９１５、ｐ＜０．０００１）、時間と組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ１，２６＝１７．３４４、ｐ＜０．００１）、時間とＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ１，２６＝２６．５６３、ｐ＜０．０００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝２８．４９２、ｐ＜０．０００１）および側性（Ｆ１，２６＝２５．６０３、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間の相互作用（Ｆ１，２６＝３４．８５７、ｐ＜０．０００１）の信頼性のある主効果が明らかになった。Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験でのこの低用量ではラット組み換えＩＬ−１０の信頼性のある主効果はなかった。
５００ｎｇという高用量で与えられた、第二のクモ膜下腔内ラット組み換えＩＬ−１０投与後、ラット組み換えＩＬ−１０は、ＣＣＩによって誘発される、両側性の異痛症および同側性の温熱性痛覚過敏の両方を逆転した。ＡＮＯＶＡによって、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝４５０．１７５、ｐ＜０．０００１）、ラット組み換えＩＬ−１０（Ｆ１，２６＝５１．８１５、ｐ＜０．０００１）、およびラット組み換えＩＬ−１０後の時間（Ｆ２，５２＝３１．９８３、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ１，２６＝６０．７５８、ｐ＜０．０００１）、時間とＣＣＩとの間（Ｆ２，２６＝３８．２０２、ｐ＜０．０００１）、時間とラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ２，２６＝３９．０３０、ｐ＜０．００１）、時間とＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ２，２６＝４４．３００、ｐ＜０．０００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝１５．９５７、ｐ＜０．０００１）、ラット組み換えＩＬ−１０（Ｆ１，２６＝１１．３３７、ｐ＜０．００５）、および側性（Ｆ１，２６＝２５．２７８、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間（Ｆ１，２６＝２７．１３３、ｐ＜０．０００１）および時間とラット組み換えＩＬ−１０と側性との間（Ｆ２，５２＝２．２３９、ｐ＜０．０５）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。
これも５００ｎｇという高用量で与えられた、第三のクモ膜下腔内ラット組み換えＩＬ−１０注射後、ＩＬ−１０はここでも、ＣＣＩによって誘発される、両側性の異痛症および同側性の温熱性痛覚過敏の両方を逆転した。ＡＮＯＶＡによって、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝１１３０．６４９、ｐ＜０．０００１）、ラット組み換えＩＬ−１０（Ｆ１，２６＝３８．１９０、ｐ＜０．０００１）、およびラット組み換えＩＬ−１０後の時間（Ｆ４，１０４＝３２．７０９、ｐ＜０．０００１）ならびにＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ１，２６＝４５．９５１、ｐ＜０．０００１）、時間とＣＣＩとの間（Ｆ４，１０４＝８１．８６０、ｐ＜０．０００１）、時間とラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ４，１０４＝３７．０４４、ｐ＜０．００１）、時間とＣＣＩとラット組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ４，１０４＝３４．９６９、ｐ＜０．０００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。ラットは三回目の注射後２４〜７２時間に完全に異痛症が残った。ＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩのみの信頼性のある主効果が明らかになった（Ｆ１，２６＝１５０６．０２８、ｐ＜０．０００１）。全ての他の比較は確実ではなかった（ｐ＞０．１０）。
ＡＮＯＶＡによって、Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験について、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝２９３．０３６、ｐ＜０．０００１）、および側性（Ｆ１，２６＝４７．１２６、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間（Ｆ１，２６＝５６．１３４、ｐ＜０．０００１）および時間と組み換えＩＬ−１０との間（Ｆ４，１０４＝３．３９６、ｐ＜０．０５）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。ラットは三番目の注射後２４〜７２時間、完全に異痛症が残った。ＡＮＯＶＡによって、ＣＣＩ（Ｆ１，２６＝３７．７０６、ｐ＜０．０００１）、側性（Ｆ１，２６＝４４．１１８、ｐ＜０．０００１）、ならびにＣＣＩと側性との間（Ｆ１，２６＝７２．０３４、ｐ＜０．０００１）の相互作用の信頼性のある主効果が明らかになった。全ての他の比較は信頼性がなかった（Ｐ＞０．１５）。
（実施例１４ ＰＬＡ２誘発性の機械誘発性異痛症に対するＩＬ−１０注射の影響）
機械誘発性異痛症は、活性化された免疫細胞によって放出された炎症性メディエータであるホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の坐骨神経周囲注射によって、ラットにおいて誘発させた。ＰＬＡ２の坐骨神経周囲注射によって誘発された異痛症は、脊髄の抗炎症誘発性サイトカインによって媒介される（Ｃｈａｃｕｒら、Ｐａｉｎ（２００１）９４：２３１〜２４４）。１０ｎｇのＩＬ−１０をラットのクモ膜下腔内に投与して、続いてＰＬＡ２によって異痛症を誘発した。図２６に示されるとおり、１０ｎｇのＩＬ−１０のクモ膜下腔内投与は、異痛症の発生を少なくとも５分間ブロックした。
（実施例１５ 絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）誘発性の機械誘発性異痛症に対するＦｃ−ＩＬ１０の効果）
実施例１３および１４は、ＩＬ−１０タンパク質が増強された疼痛状態を逆転する能力を示した。ここでは、ＩＬ−１０の安定化された改変体（ＦｃＩＬ−１０）の有効性を試験して、この改変体が、このような効果を発揮し過ぎたか否かを試験した。ラットは最初に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対するベースライン（ＢＬ）応答について試験した。次いで全てのラットにＣＣＩ手術を受けさせた。行動を３日目および１０日目に再評価して、ＣＣＩ手術が機械誘発性異痛症を生じることを確認した（図２７）。２５０ｎｇ ＦｃＩＬ−１０（非溶解性組み換えヒトＩＬ−１０／Ｆｃキメラ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、製品番号Ｉ９４０４）に加えてＩＬ−１０をコードするプラスミドを用いてラットをｉ．ｔ．注射した。プラスミドは１日後まで行動に影響を有さないので、この注射手順の直後に観察される効果は、ＦｃＩＬ−１０自体による作用を反映する。図２７からわかるように、機械誘発性異痛症はＦｃＩＬ−１０処置によって一時的に逆転された。
（実施例１６ ＦｃＩＬ−１０は遺伝子治療の有効性を増強する）
本実験は、遺伝子治療ベクターと近い時間で送達されたＩＬ−１０の治療上の有効性を例示する。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを３日後および１０日後に再試験して、ＣＣＩが顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確認した（図２８）。１０日目の試験後、ＩＬ−１０をコードせず；そうではなく不活性な細胞内タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているコントロールプラスミドをラットにｉ．ｔ．注射した。不活性なプラスミドＤＮＡの存在は、その後の日に試験された行動に影響しなかったことが理解され得る。１３日目の試験後、ラットに（ａ）ＩＬ−１０をコードするプラスミドのみ、または（ｂ）ＩＬ−１０をコードする等量のプラスミドに加えてＩＬ−１０の安定化改変体（ＦｃＩＬ−１０）のいずれかを注射して、ＦｃＩＬ−１０の存在がベクターの有効性を増強するか否かを試験した。実際にこれを行なった。機械誘発性異痛症は、プラスミドＩＬ−１０単独によって約４日間逆転された（図１３に示されるプラスミドＩＬ１０の第一の注射の効果を参照のこと）。対照的に、ＦｃＩＬ−１０との同時投与によって、機械誘発性異痛症に対するプラスミド−ＩＬ１０有効性の発現および期間の両方が顕著に増強された。
（実施例１７ プラスミドＩＬ１０遺伝子治療の低用量および用量の組み合わせの有効性）
ベースライン（ＢＬ）試験後に、ラットはＣＣＩ手術を受けた。それらを３日後および１０日後に再試験して、ＣＣＩがｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験において顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確認した（機械誘発性異痛症）。次いで、（ａ）ＩＬ−１０をコードする１００μｇのプラスミド（１０日目）その後ＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ａ）；（ｂ）ＩＬ−１０をコードする１００μｇのプラスミド（１０日目）その後ＩＬ−１０をコードする２５μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｂ）；または（ｃ）ＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１０日目）その後ＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｃ）のいずれかをラットに注射した。図に示されるとおり、各々が、経時的に機械誘発性異痛症の逆転をもたらした。
従って、病的な疼痛の処置のためにＣＮＳに対して抗炎症性サイトカインを送達するための方法が記載される。本発明の好ましい実施形態は、ある程度詳細に記載されているが、本明細書に記載されるような本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、明白なバリエーションがなされ得ることが理解される。
図１は、較正された接触／圧力刺激に対する応答閾値に対する、漸増量のクモ膜下腔内アデノウイルスの効果を示す。アデノウイルスの用量が低ければ、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ（フォンフレイ）試験によって評価した場合、較正した接触／圧力刺激に対する応答閾値に対して検出可能な効果はなかった。最高の用量では、応答閾値は低くなった。星印は、残りの実験で用いた用量を示す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験で得られたこの図および引き続く全ての図では、ｙ軸はデータ分析のために用いた対数変換である。この試験で用いた刺激の対数変換（カッコ内にそのｍｇ数を続ける）は以下のとおりであった：３．６１（４０７ｍｇ）、３．８４（６９２ｍｇ）、４．０８（１，２０２ｍｇ）、４．１７（１，４７９ｍｇ）、４．３１（２，０４１ｍｇ）、４．５６（３，６３０ｍｇ）、４．７４（５，４９５ｍｇ）、４．９３（８，５１１ｍｇ）、５．０７（１１，７４９ｍｇ）および５．１８（１５，１３６ｍｇ）。 図２は、アデノウイルスから誘導されたＩＬ−１０がクモ膜下腔内ＨＩＶ−Ｉ ｇｐ１２０−誘発性機械誘発性異痛症を防止することを示す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験での前薬物（ベースライン；ＢＬ）評価後、ＩＬ−１０をコードするアデノウイルス（ＡＤ−ＩＬ１０）、またはβガラクトシダーゼをコードするコントロールアデノウイルス（ＡＤ−コントロール）のいずれかを用いて動物をクモ膜下腔内に注射した。応答閾値は、４日および５日後に再評価して、ウイルスの存在および／またはウイルスで生じたヒトＩＬ−１０の存在のいずれが基礎応答閾値に影響したかを試験した。理解されるとおり、４日および５日の閾値は、前薬物ＢＬに比較して影響されなかった。この時点で、機械誘発性異痛症を生じることが以前に示されている用量（３μｇ）でＨＩＶ−１ ｇｐ１２０を用いて動物をクモ膜下腔内注射した（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．（２０００）８６１：１０５−１１６；Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００１）２１：２８０８−２８１９）。ＡＤコントロールをクモ膜下腔内に、続いてｇｐ１２０をクモ膜下腔内に投与された動物は、以前の実験と同様に機械誘発性異痛症を発症した。対照的に、機械誘発性異痛症は、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０を投与された動物では防がれた。 図３は、腰仙部アデノウイルス投与後の腰仙および頚部の脊髄液におけるヒトＩＬ−１０レベルを示す。行動試験の完了の際（ＡＤ投与５日後）、腰仙および頚部のＣＳＦを、実施例２および３の動物から収集した。これらのサンプルをヒトＩＬ−１０についてのＥＬＩＳＡによって評価した、ＥＬＩＳＡは、ラットＩＬ−１０を検出しないので、これによって、ウイルス誘導性のＩＬ−１０がラットＩＬ−１０とは独立して検出されることが可能になる。ｇｐ−１２０誘導性異痛症の防止のために実験２で注射した１０×１０７個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）（図２を参照のこと）によって、頚部ＣＳＦよりも腰仙部ＣＳＦにおいてかなりさらに大きいレベルのヒトＩＬ−１０が生じ、これによってウイルスの部位特異的効果が示される。匹敵する用量のＡＤコントロールでは、この市販のＥＬＩＳＡ試験で生じる値は低かった。坐骨神経の炎症性神経障害の防止のために実施例３で注射した５×１０７ＰＦＵ（図４を参照のこと）によって生じるヒトＩＬ−１０のレベルはより低かったようである。 図４Ａ〜図４Ｄは、アデノウイルスに由来するＩＬ−１０が坐骨神経の炎症性神経障害（ＳＩＮ）誘導性の機械誘発性異痛症を防止することを示す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験での前薬物（ベースライン；ＢＬ）評価後、ＩＬ−１０をコードするアデノウイルス（ＡＤ−ＩＬ１０）（図４Ｂおよび４Ｄ）、またはβガラクトシダーゼをコードするコントロールアデノウイルス（ＡＤ−コントロール）（図４Ａおよび４Ｃ）のいずれかを用いて動物をクモ膜下腔内に注射した。応答閾値は、４日後に再評価して、ウイルスの存在および／またはウイルスで生じたヒトＩＬ−１０の存在のいずれが基礎応答閾値に影響したかを試験した。理解されるとおり、５日の閾値は、前薬物ＢＬに比較して影響されなかった。この時点で、４μｇ（図４および図４Ｂ）または１６０μｇ（図４Ｃおよび図４Ｄ）のザイモサン（酵母細胞壁）のいずれかを用いて、動物を坐骨神経周囲に片側に注射した。これらの用量は、それぞれ、片側（ザイモサン注射に対して同じ側）および両側の機械誘発性異痛症を生じることが以前に示されている（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（２００３）２３：１０２６−１０４０）。ＡＤコントロールをクモ膜下腔内に、続いてザイモサンを坐骨神経周囲に投与された動物は、以前の研究と同様に機械誘発性異痛症を片側（図４Ａ）および両側（図４Ｃ）で発症した。対照的に、片側および両側の機械誘発性異痛症の両方とも、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０を投与された動物では防がれた（図４Ｂおよび図４Ｄ）。 図５は、アデノウイルスＩＬ−１０が慢性の坐骨神経炎症性神経障害（ＳＩＮ）誘発性の機械誘発性異痛症を逆転することを示す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験での前薬物（ベースライン；ＢＬ）評価後、それぞれ、片側（パネルＡ＆Ｂ）または両側（パネルＣおよびＤ）の異痛症を慢性的に誘発するために、４または１６０μｇのいずれかのザイモサンを動物に繰り返し注射した。これらの坐骨神経周囲ザイモサン注射は、行動試験の経過中にわたって継続した。８日目の異痛症の行動の検証後、ＡＤコントロール（パネルＡおよびＣ）またはＡＤ−ＩＬ１０（パネルＢおよびＤ）のいずれかを全ラットにクモ膜下腔内注射した。ＡＤコントロールを投与されているラットは、評価の時間経過にわたって、片側に（パネルＡ）または両側に（パネルＣ）異痛症が残った。対照的に、片側（パネルＢ）および両側（パネルＤ）の異痛症の両方とも、クモ膜下腔内ＡＤ−ＩＬ１０によって逆転された。 図６は、アデノウイルスＩＬ−１０が同側性および鏡像領域および領域外の異痛症の両方を逆転することを示す。坐骨神経（領域的；パネルＡおよびＢ）および伏在静脈（領域外；パネルＣおよびＤ）神経支配領域は、両側性の機械誘発性異痛症を誘発するための慢性的な坐骨神経周囲の１６０μｇのザイモサンの前（ベースライン；ＢＬ）および後（８日、１２日および１４日）に別々に試験した。８日の評価後、ＡＤコントロール（パネルＡおよびＣ）またはＡＤ−ＩＬ１０（パネルＢおよびＤ）を投与した。ＡＤ−コントロールに比較して坐骨神経（パネルＢ）および伏在静脈（パネルＤ）の両方の神経支配領域において、同側性および鏡像の異痛症について、１２日目および１４日目（それぞれ、ＡＤ後４日および６日目）に、ＡＤ−ＩＬ１０による匹敵する逆転が観察された。 図７は、アデノウイルスＩＬ−１０が、絞扼性坐骨神経損傷（ＣＣＩ）誘導性機械誘発性異痛症を減弱することを示す。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験での前薬物（ベースライン；ＢＬ）評価後、ニセ手術（パネルＡおよびＢ）またはＣＣＩ手術（パネルＣおよびＤ）を行なった。行動評価は、３、５、７および１０日目に記録して、ニセの操作をされたラットにおいて異痛症がないこと、およびＣＣＩ群においては両側性の異痛症の進行性の発達を実証した。１０日目の評価後、ラットには、ＡＤコントロール（パネルＡおよびＣ）またはＡＤ−ＩＬ１０（パネルＢおよびＤ）のいずれかのクモ膜下腔内注射を与えた。行動評価を１３、１５、１７、２４、２８および３１日目に；すなわち、ＡＤの後３、５、７、１４、１８および２１日目に再度記録した。ＡＤコントロールもＡＤ−ＩＬ１０も、ニセの操作をした動物では顕著な効果を発揮しなかったが、ＡＤ−ＩＬ１０はＣＣＩの操作をしたＡＤコントロール処理動物（パネルＣ）に比べて両側性のＣＣＩ異痛症を一時的に減弱した（パネルＤ）。 図８は、アデノウイルスＩＬ−１０が絞扼性神経損傷（ＣＣＩ）誘発性温熱性痛覚過敏を減弱することを示す。Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ試験での前薬物（ベースライン；ＢＬ）評価後、ニセ手術（パネルＡおよびＢ）またはＣＣＩ手術（パネルＣおよびＤ）を行なった。行動評価は、３、５、７および１０日目に記録して、ニセの操作をされたラットにおいて温熱性痛覚過敏がないこと、およびＣＣＩ群においては同所性（両側性）の温熱性痛覚過敏症の進行性の発達を実証した。１０日目の評価後、ラットには、ＡＤコントロール（パネルＡおよびＣ）またはＡＤ−ＩＬ１０（パネルＢおよびＤ）のいずれかのクモ膜下腔内注射を与えた。行動評価を１３、１５、１７、２４、２８および３１日目に再度記録した；すなわち、ＡＤの後３、５、７、１４、１８および２１日目に。ＡＤコントロールもＡＤ−ＩＬ１０も、ニセの操作をした動物では顕著な効果を発揮しなかったが、ＡＤ−ＩＬ１０はＣＣＩの操作をしたＡＤコントロール処理動物（パネルＣ）に比べて同側性のＣＣＩ温熱性痛覚過敏を一時的に減弱した（パネルＤ）。 図９は、慢性のＳＩＮ誘発性異痛症に対するＡＡＶ誘導性ＩＬ−１０の効果を示す。ベースライン（ＢＬ）評価後、ラットにＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをクモ膜下腔内注射した。ＡＡＶ感染させた後、次にザイモサン（酵母細胞壁）を用いてラットの左の坐骨神経上に慢性的に注射して、炎症性神経障害を生じさせた。クモ膜下腔内コントロールウイルスを投与されたラットにおいてＳＩＮによって顕著な神経障害性の疼痛が実証された（白抜き四角）。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０はこの神経障害性疼痛を鈍らせた（白抜き丸）。黒塗り四角および黒塗り丸は、無関係の後肢（右）の正常な疼痛応答を示す。 図１０は、ＣＣＩによって誘発された機械誘発性異痛症に対するＡＡＶ誘導性ＩＬ−１０の効果を示す。ベースライン（ＢＬ）評価後、ラットにニセの手術または左の坐骨神経のＣＣＩのいずれかを行なって外傷性神経障害を誘発させた。１０日目の行動評価後、ＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをラットにクモ膜下腔内注射した。クモ膜下腔内のコントロールウイルスを投与されたラットではＣＣＩによって顕著な神経障害性疼痛が実証された（黒塗り四角）。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０は、この神経障害性疼痛を鈍らせた（白抜き四角）。黒塗り丸および白抜き丸は、ＡＡＣコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかを投与されたニセ操作されたラットの正常な疼痛応答を示す。 図１１は、ＣＣＩによって誘発される慢性温熱性痛覚過敏に対するＡＡＶ誘導性ＩＬ−１０の効果を示す。ベースライン（ＢＬ）評価後、ラットにニセの手術または左の坐骨神経のＣＣＩを行なって外傷性神経障害を誘発させた。１０日目の行動評価後、ラットにＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをクモ膜下腔内に注射した。クモ膜下腔内のコントロールウイルスを投与されたラットではＣＣＩによって顕著な神経障害性疼痛が実証された（白抜き丸）。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０は、この神経障害性疼痛を鈍らせた（黒塗り丸）。黒塗り四角および白抜き四角は、ＡＡＣコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかを投与されたニセ操作されたラットの正常な疼痛応答を示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＣＩによって誘発された慢性の温熱性痛覚過敏（図１２Ａ）およびＣＣＩによって誘発された慢性の機械誘発性異痛症（図１２Ｂ）に対するＡＡＶ−ＩＬ１０の効果を示す。これらは、部分的な時間経過である。なぜならこの実験は、分析用に組織が収集できるように、完全な疼痛逆転の時点で終わらされたからである。ベースライン（ＢＬ）評価後、ラットにニセの手術または左の坐骨神経のＣＣＩのいずれかを行なって外傷性神経障害を誘発させた。１０日目の行動評価後、ラットにＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをクモ膜下腔内に注射した。行動を３、５、および７日後に再評価した（ＣＣＩまたはニセの手術後、１３日、１５日および１７日後に相当する）。クモ膜下腔内のコントロールウイルスを投与されたＣＣＩラットでは顕著な神経障害性疼痛が実証された。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０は、この神経障害性疼痛を鈍らせた。ＡＡＶ−コントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかを投与されたニセ操作されたラットでは、正常な疼痛応答が観察された。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ＣＣＩによって誘発された慢性の温熱性痛覚過敏（図１２Ａ）およびＣＣＩによって誘発された慢性の機械誘発性異痛症（図１２Ｂ）に対するＡＡＶ−ＩＬ１０の効果を示す。これらは、部分的な時間経過である。なぜならこの実験は、分析用に組織が収集できるように、完全な疼痛逆転の時点で終わらされたからである。ベースライン（ＢＬ）評価後、ラットにニセの手術または左の坐骨神経のＣＣＩのいずれかを行なって外傷性神経障害を誘発させた。１０日目の行動評価後、ラットにＡＡＶコントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかをクモ膜下腔内に注射した。行動を３、５、および７日後に再評価した（ＣＣＩまたはニセの手術後、１３日、１５日および１７日後に相当する）。クモ膜下腔内のコントロールウイルスを投与されたＣＣＩラットでは顕著な神経障害性疼痛が実証された。クモ膜下腔内ＡＡＶ−ＩＬ１０は、この神経障害性疼痛を鈍らせた。ＡＡＶ−コントロールまたはＡＡＶ−ＩＬ１０のいずれかを投与されたニセ操作されたラットでは、正常な疼痛応答が観察された。 図１３は、非ウイルス性ベクター（ＮＶＶ）プラスミドＤＮＡ誘導性ＩＬ−１０がＣＣＩ誘発性の機械誘発性異痛症を完全に逆転すること、およびプラスミドＩＬ−１０の反復されるクモ膜下腔内投与が漸進的に長くなる疼痛緩和効果を誘発することを示す。ベースライン（ＢＬ）後、ＣＣＩを誘発して、ラットにプラスミドＩＬ−１０またはコントロールとしてプラスミドＧＦＰのいずれかのクモ膜下腔内注射を、矢印で図に示される時点で与えた。黒塗り四角は、プラスミドＩＬ−１０を投与されたＣＣＩラットを示し；白抜き四角は、ＧＦＰコントロールプラスミドを投与されたＣＣＩラットを示し；黒塗り丸は、プラスミドＩＬ−１０を投与されたニセの操作されたラットを示し；白抜き丸は、ＧＦＰコントロールプラスミドを投与されたニセ操作されたラットを示す。 図１４は、ＡＤ−ＩＬ１０が、急性のモルフィンの鎮痛効果を強化することを示す。ＩＬ−１０がモルフィンのようなオピエートの疼痛緩和効果に影響するいか否かを試験するため、ラットをＡＤ−コントロール（白抜きひし形）またはＡＤ−ＩＬ１０（黒塗り四角）のいずれかを用いてモルフィンの５日前に前処置した。１匹の動物にはウイルスを与えなかった。理解されるように、ＡＤ−ＩＬ１０を発現するラット（黒塗り四角）は、ＡＤコントロールを発現するラット（ひし形）よりも長い鎮痛効果を示した。 図１５によって、ＡＤ−ＩＬ１０がモルフィン耐性の発達を示すことが示される。ラットには毎日１０μｇのクモ膜下腔内モルフィンを与えた。モルフィン投与の３日目まででさえ、ＡＤ−ＩＬ１０はモルフィン耐性の発達を提示していたことが観察された。 図１６によって、ＡＤ−ＩＬ１０がモルフィン耐性の発達を示すことが示される。ラットには毎日１０μｇのクモ膜下腔内モルフィンを与えた。ここでも、モルフィン投与の５日目に、ＡＤ−ＩＬ１０はモルフィン耐性の発達を提示していたことが観察された。 図１７によって、反復されるオピエート投与の結果として発達する疼痛の強調をＡＤ−ＩＬ１０が防止することが示される。モルフィンの前に（１日目）、全てのラットは、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験に対して機械誘発性の疼痛の重篤度について正常に応答した。その後、ラットに毎日１０μｇのクモ膜下腔内モルフィンを与えた。モルフィンの最終用量の２４時間後、重篤度の増大（すなわち、疼痛促進）がＡＤコントロール（白抜きひし形）を投与されているラットで見られた。ＡＤ−ＩＬ１０（黒塗り四角）は、慢性のモルフィンによって生じる強調された疼痛応答を完全に防止した。 図１８は、ラットにおけるモルフィン鎮痛に対するインターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）の結果を示す。この概念の普遍性について試験するために、内因性の炎症誘発性サイトカインアンタゴニストであるＩＬ−１ｒａの反復注射をＩＬ−１０の遺伝子送達の代わりに用いた。炎症誘発性サイトカイン機能をブロックするＩＬ １ｒａの単回注射は、ビヒクル＋モルフィン（白抜き四角）に比べてモルフィン（黒塗り四角）の鎮痛効果を増強した。 図１９は、モルフィン耐性の発達に対するＩｌ−１ｒａの結果を示す。毎日のモルフィン注射とともに毎日ＩＬ−１ｒａを注射したところ（黒塗り四角）、毎日ビヒクル＋モルフィンを投与されたラット（白抜き四角）に比較してモルフィン耐性の発達が遅れた。 図２０は、モルフィン耐性に対するＩＬ−１ｒａの持続的な効果を示す。持続的な効果は、試験の最終日、すなわちモルフィンの５日後にも観察された。 図２１Ａ〜図２１Ｃは、疼痛のモルフィン投与の効果およびＩＬ−１産生を示す。図２１Ａは、モルフィンの反復注射後、強調された疼痛がオピエートの消失の際に生じることを示す。モルフィンを反復して与えられた動物は、モルフィンの代わりにクモ膜下腔内に生理食塩水を投与されたラット（白のバー、左）に比較して、クモ膜下腔内モルフィン（黒いバー、左）の５日毎日の投与の最後の２４時間後に接触／圧力刺激に対して強調された応答感度を示した。対照的に、ラットが毎日ＩＬ−１ｒａを投与された場合、疼痛感度におけるこの増大は軽減された（黒いバー、右）。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、慢性のクモ膜下腔内ビヒクルと等量ではないが、慢性のクモ膜下腔内モルフィンが、脊髄における炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−１の産生および放出を増大したことを示す。ラットは１０μｇのモルフィンまたは等量のビヒクルのいずれかの１日１回の５日のクモ膜下腔内注射を与えられた。最終注射の２時間後、ＣＳＦおよび脊髄を回収して、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１タンパク質含量の分析をした。脊髄ＣＳＦ（図２１Ｂ）および組織（図２１Ｃ）の両方で理解されるとおり、炎症誘発性サイトカイン含量は、慢性モルフィンによって増大された。 図２１Ａ〜図２１Ｃは、疼痛のモルフィン投与の効果およびＩＬ−１産生を示す。図２１Ａは、モルフィンの反復注射後、強調された疼痛がオピエートの消失の際に生じることを示す。モルフィンを反復して与えられた動物は、モルフィンの代わりにクモ膜下腔内に生理食塩水を投与されたラット（白のバー、左）に比較して、クモ膜下腔内モルフィン（黒いバー、左）の５日毎日の投与の最後の２４時間後に接触／圧力刺激に対して強調された応答感度を示した。対照的に、ラットが毎日ＩＬ−１ｒａを投与された場合、疼痛感度におけるこの増大は軽減された（黒いバー、右）。図２１Ｂおよび図２１Ｃは、慢性のクモ膜下腔内ビヒクルと等量ではないが、慢性のクモ膜下腔内モルフィンが、脊髄における炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−１の産生および放出を増大したことを示す。ラットは１０μｇのモルフィンまたは等量のビヒクルのいずれかの１日１回の５日のクモ膜下腔内注射を与えられた。最終注射の２時間後、ＣＳＦおよび脊髄を回収して、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１タンパク質含量の分析をした。脊髄ＣＳＦ（図２１Ｂ）および組織（図２１Ｃ）の両方で理解されるとおり、炎症誘発性サイトカイン含量は、慢性モルフィンによって増大された。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ラット組み換えＩＬ−１０（プラスミドなし；単なるＩＬ１０タンパク質の注射）のクモ膜下腔内注射が、極めて高用量でさえ機械誘発性異痛症を極短時間しか逆転しないことを示す。図２２Ａは、ＣＣＩの同じ側の後足（左側）を示し、図２２Ｂは、健常な後肢の後足（右側）を示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術またはニセの手術のいずれかを受けた。それらは、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩ（ただしニセ手術ではない）が、機械誘発性異痛症によって測定された場合、顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日、１１日および１２日目（ＣＣＩ手術に対して）に、ラットにＩＬ−１０タンパク質またはビヒクルのいずれかのｉ．ｔ．注射を与えた。最初の注射（１０日目）は、５０ｎｇ ＩＬ−１０であった；第二の注射（１１日目）および第三の注射（１２日目）は５００ｎｇのＩＬ−１０であった。図２２Ａおよび２２Ｂにみられるとおり、５０ｎｇは異痛症を部分的にのみ逆転し、その量の１０倍でわずかに大きい逆転がみられた。著しいことに、この逆転は、極めて短期間（２４時間未満）であって、反復投与で有効性の増大は観察されなかった。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ラット組み換えＩＬ−１０（プラスミドなし；単なるＩＬ１０タンパク質の注射）のクモ膜下腔内注射が、極めて高用量でさえ機械誘発性異痛症を極短時間しか逆転しないことを示す。図２２Ａは、ＣＣＩの同じ側の後足（左側）を示し、図２２Ｂは、健常な後肢の後足（右側）を示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術またはニセの手術のいずれかを受けた。それらは、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩ（ただしニセ手術ではない）が、機械誘発性異痛症によって測定された場合、顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日、１１日および１２日目（ＣＣＩ手術に対して）に、ラットにＩＬ−１０タンパク質またはビヒクルのいずれかのｉ．ｔ．注射を与えた。最初の注射（１０日目）は、５０ｎｇ ＩＬ−１０であった；第二の注射（１１日目）および第三の注射（１２日目）は５００ｎｇのＩＬ−１０であった。図２２Ａおよび２２Ｂにみられるとおり、５０ｎｇは異痛症を部分的にのみ逆転し、その量の１０倍でわずかに大きい逆転がみられた。著しいことに、この逆転は、極めて短期間（２４時間未満）であって、反復投与で有効性の増大は観察されなかった。 図２３Ａおよび２３Ｂは、ラット組み換えＩＬ−１０（プラスミドなし；単なるＩＬ１０タンパク質の注射）のクモ膜下腔内注射が、極めて高用量でさえ温熱性痛覚過敏をごく短時間しか逆転しないことを示す。図２３Ａは、ＣＣＩの同じ側の後足（左側）を示し、図２３Ｂは、健常な後肢の後足（右側）を示す。神経障害の側の脚（すなわち、左足）でＣＣＩは病理学的な疼痛変化を生じるだけであることが注目されるべきである。右足からのデータが完全性のために含まれ、これによって、ＩＬ−１０およびビヒクル注射はこのコントロールの足から誘発される行動に対して影響を有さないことが示される。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術またはニセの手術のいずれかを受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩ（ただしニセ手術ではない）が機械誘発性異痛症によって測定された場合、顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日、１１日および１２日目（ＣＣＩ手術に対して）に、ラットにＩＬ−１０タンパク質またはビヒクルのいずれかのｉ．ｔ．注射を与えた。最初の注射（１０日目）は、５０ｎｇ ＩＬ−１０であった；第二の注射（１１日目）および第三の注射（１２日目）は５００ｎｇのＩＬ−１０であった。図２３Ａにみられるとおり、５０ｎｇは効果を有さなかった。その量の１０倍で一過性の逆転がみられた。この逆転は、極めて短期間（２４時間未満）であって、反復投与で有効性の増大は観察されなかった。 図２３Ａおよび２３Ｂは、ラット組み換えＩＬ−１０（プラスミドなし；単なるＩＬ１０タンパク質の注射）のクモ膜下腔内注射が、極めて高用量でさえ温熱性痛覚過敏をごく短時間しか逆転しないことを示す。図２３Ａは、ＣＣＩの同じ側の後足（左側）を示し、図２３Ｂは、健常な後肢の後足（右側）を示す。神経障害の側の脚（すなわち、左足）でＣＣＩは病理学的な疼痛変化を生じるだけであることが注目されるべきである。右足からのデータが完全性のために含まれ、これによって、ＩＬ−１０およびビヒクル注射はこのコントロールの足から誘発される行動に対して影響を有さないことが示される。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術またはニセの手術のいずれかを受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩ（ただしニセ手術ではない）が機械誘発性異痛症によって測定された場合、顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日、１１日および１２日目（ＣＣＩ手術に対して）に、ラットにＩＬ−１０タンパク質またはビヒクルのいずれかのｉ．ｔ．注射を与えた。最初の注射（１０日目）は、５０ｎｇ ＩＬ−１０であった；第二の注射（１１日目）および第三の注射（１２日目）は５００ｎｇのＩＬ−１０であった。図２３Ａにみられるとおり、５０ｎｇは効果を有さなかった。その量の１０倍で一過性の逆転がみられた。この逆転は、極めて短期間（２４時間未満）であって、反復投与で有効性の増大は観察されなかった。 図２４は、３日離れた、２用量の非ウイルスベクター（ＮＶＶ）プラスミドＤＮＡ由来のＩＬ−１０送達が、ＣＣＩ誘発性機械誘発性異痛症の長期の減弱を誘発することを示す。プラスミドＩＬ−１０をＣＣＩ後１０日目および３日後にクモ膜下腔内に注射した。黒塗り四角は、プラスミドＩＬ−１０を用いた結果を示すが、白塗り四角は、コントロールプラスミドの結果を示す。 図２５は、図２５に記載される実験由来のＩＬ−１０プラスミドが直線化された場合、ＣＣＩ誘発性の機械誘発性異痛症を減弱するにはもはや有効ではないということを示す。 図２６は、組み換えＩＬ−１０タンパク質のクモ膜下腔内投与が、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）の坐骨神経周囲注射によって誘発される機械誘発性異痛症をブロックしたことを示す。白抜きの楕円は、ＩＬ−１０のクモ膜下腔内投与およびビヒクルのみの坐骨神経周囲送達からの結果を示す。白抜きの長方形は、ビヒクルのみのクモ膜下腔内投与およびビヒクルのみの坐骨神経周囲送達からの結果を示す。黒塗りの楕円は、ＩＬ−１０のクモ膜下腔内投与およびＰＬＡ２の坐骨神経周囲送達からの結果を示す。黒塗りの長方形は、ビヒクルのみのクモ膜下腔内投与およびビヒクルのみの坐骨神経周囲送達からの結果を示す。 図２７は、クモ膜下腔内に送達されたＦｃＩＬ−１０が、ＣＣＩによって誘発される機械誘発性異痛症を逆転するのに有効であることを示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩが両方の指標で顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日の試験後、ラットにＩＬ−１０の安定化改変体（ＦｃＩＬ−１０）に加えてＩＬ−１０をコードするプラスミドを用いてｉ．ｔ．注射を与えた。１日後までプラスミドは行動に影響を有さなかったので、この注射手順の直後に観察された効果は、ＦｃＩＬ−１０自体による作用を反映する。図２７でわかるように、機械誘発性異痛症はＦｃＩＬ１０処置によって一時的に逆転された。 図２８は、ＦｃＩＬ−１０が、ここではＩＬ−１０をコードするプラスミドで示される、遺伝子治療ベクターと同時投与された場合、機械誘発性異痛症の逆転を増強するのに有効であることを示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩが両方の指標で顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。１０日の試験後、ラットにＩＬ−１０をコードしておらず；代わりに、不活性な細胞内タンパク質（ＧＦＰ）をコードしているコントロールプラスミドを用いてｉ．ｔ．注射を与えた。不活性なプラスミドＤＮＡの存在は、後日試験された行動に影響しなかった。１３日目の試験後、ラットに（ａ）ＩＬ−１０をコードするプラスミドのみ、または（ｂ）ＩＬ−１０をコードする等量のプラスミドに加えてＩＬ−１０の安定化改変体（ＦｃＩＬ−１０）のいずれかを注射して、ＦｃＩＬ−１０の存在がベクターの有効性を増強するか否かを試験した。実際にこれを行なう。機械誘発性異痛症は、約４日間の間にプラスミドＩＬ−１０単独で逆転された。対照的に、ＦｃＩＬ−１０での同時の処置は、機械誘発性異痛症に対するプラスミド−ＩＬ−１０の有効性の発現および期間の両方を顕著に増強した。 図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃは、プラスミドＩＬ−１０遺伝子治療の低用量および用量の組み合わせが、ＣＣＩ誘発性機械誘発性異痛症を効率的に逆転することを示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩが顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。次いでラットに（ａ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ａ）；（ｂ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする２５μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｂ）または（ｃ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド５０μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｃ）のいずれかを注射した。各々が経時的に機械誘発性異痛症の逆転をもたらした。 図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃは、プラスミドＩＬ−１０遺伝子治療の低用量および用量の組み合わせが、ＣＣＩ誘発性機械誘発性異痛症を効率的に逆転することを示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩが顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。次いでラットに（ａ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ａ）；（ｂ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする２５μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｂ）または（ｃ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド５０μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｃ）のいずれかを注射した。各々が経時的に機械誘発性異痛症の逆転をもたらした。 図２９Ａ、図２９Ｂおよび図２９Ｃは、プラスミドＩＬ−１０遺伝子治療の低用量および用量の組み合わせが、ＣＣＩ誘発性機械誘発性異痛症を効率的に逆転することを示す。ベースライン（ＢＬ）試験後、ラットは、ＣＣＩ手術を受けた。それらを、３日および１０日後に試験して、ＣＣＩが顕著な神経障害性疼痛を誘発したことを確証した。次いでラットに（ａ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ａ）；（ｂ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド１００μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする２５μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｂ）または（ｃ）ＩＬ−１０をコードするプラスミド５０μｇ（１０日目）、続いてＩＬ−１０をコードする５０μｇのプラスミド（１３日目）（図２９Ｃ）のいずれかを注射した。各々が経時的に機械誘発性異痛症の逆転をもたらした。 図３０Ａおよび３０Ｂは、ＩＬ−１０を用いる遺伝子治療が、ＣＣＩを逆転している可能性が高いことを示す。なぜならＣＣＩは、炎症誘発性サイトカインによって媒介されるからである。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験でのベースライン評価（ＢＬ）後、ＣＣＩまたはニセの手術を行なって、行動を３日後および１０日後に再評価して、手術有効性を確証した。図３０Ａでは、次いで、ラットにクモ膜下腔内インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたは等量のビヒクルのいずれかを与えて、経時的に試験した。図３０Ｂでは、薬物注射を手術の２ヵ月後に投与した以外は同一の手順を行なった。理解されるとおり、ＩＬ−１ｒａは、試験した両方の時点でＣＣＩ誘発性の疼痛増強を一時的に逆転し、このことは炎症誘発性サイトカインが、特に神経障害性疼痛、そして病理学的疼痛の持続的な媒介因子、より一般的には特に神経障害性疼痛、そしてより一般的には病理学的疼痛の持続的な媒介因子であることを支持する。 図３０Ａおよび３０Ｂは、ＩＬ−１０を用いる遺伝子治療が、ＣＣＩを逆転している可能性が高いことを示す。なぜならＣＣＩは、炎症誘発性サイトカインによって媒介されるからである。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験でのベースライン評価（ＢＬ）後、ＣＣＩまたはニセの手術を行なって、行動を３日後および１０日後に再評価して、手術有効性を確証した。図３０Ａでは、次いで、ラットにクモ膜下腔内インターロイキン−１レセプターアンタゴニストまたは等量のビヒクルのいずれかを与えて、経時的に試験した。図３０Ｂでは、薬物注射を手術の２ヵ月後に投与した以外は同一の手順を行なった。理解されるとおり、ＩＬ−１ｒａは、試験した両方の時点でＣＣＩ誘発性の疼痛増強を一時的に逆転し、このことは炎症誘発性サイトカインが、特に神経障害性疼痛、そして病理学的疼痛の持続的な媒介因子、より一般的には特に神経障害性疼痛、そしてより一般的には病理学的疼痛の持続的な媒介因子であることを支持する。 図３１は、ヒトＩＬ−１０（ｈＩＬ−１０）（配列番号１）、マウスＩＬ−１０（ｍＩＬ−１０）（配列番号２）およびＩＬ−１０のウイルス型（ｖＩＬ−１０）（配列番号３）の成熟分泌型のアミノ酸配列の比較を示す。ヒト配列とは異なるアミノ酸残基を枠で囲んでいる。

Claims (46)

  1. 抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターの使用であって、インビボにおいて該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、脊椎動物被験体における疼痛を、該被験体の神経系に対して該ベクターを投与する工程によって処置する方法における、使用。
  2. 前記ポリヌクレオチドが抗炎症性サイトカインをコードする、請求項１に記載の使用。
  3. 前記因子がインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）、α−ＭＳＨおよびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
  4. 前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０である、請求項２に記載の使用。
  5. 前記ＩＬ−１０がＩｇＧのＦｃ部分に融合される、請求項４に記載の使用。
  6. 前記脊椎動物被験体がヒトであり、かつ前記抗炎症性サイトカインがヒトＩＬ−１０である、請求項２に記載の使用。
  7. 前記組み換えベクターが組み換えウイルスである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
  8. 前記組み換えウイルスが組み換えアデノウイルスである、請求項７に記載の使用。
  9. 前記組み換えウイルスが組み換えアデノ随伴ビリオンである、請求項７に記載の使用。
  10. 前記組み換えベクターがプラスミドＤＮＡである、請求項１に記載の使用。
  11. 前記投与が実質内送達による、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
  12. 前記投与がクモ膜下送達による、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
  13. 前記投与が硬膜外送達による、請求項１〜１０のいずれかに記載の使用。
  14. 前記疼痛が神経障害性疼痛である、請求項１に記載の使用。
  15. 請求項１〜１０のいずれかに記載の使用であって、組み換えベクターが初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組み換えベクターが、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、および炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む、疼痛の軽減を維持するようにインビボで該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下での、使用。
  16. 請求項１〜１０のいずれかに記載の使用であって、治療上有効な量の組成物が、初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組成物が、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、および炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含む、疼痛の軽減を維持するための、使用。
  17. 請求項１〜１０のいずれかに記載の使用であって、組み換えベクターが、初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組み換えベクターが、ＩＬ−１０をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む使用であって、疼痛の軽減を維持するようにインビボで該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下での、使用。
  18. 請求項１〜１０のいずれかに記載の使用であって、ＩＬ−１０を含む治療上有効な量の組成物が、疼痛の軽減を維持するように、初回投与後５日以内に引き続いて投与される、使用。
  19. 抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、および炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子の使用であって、脊椎動物被験体における既存の疼痛を、該被験体に対して治療上有効な量のベクターをクモ膜下腔内に投与する工程によって処置する方法における、使用。
  20. 前記被験体が抗炎症性サイトカインを投与される、請求項１９に記載の使用。
  21. 請求項１９に記載の使用であって、前記因子がインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、腫瘍壊死因子可溶性レセプター（ＴＮＦｓｒ）、α−ＭＳＨおよびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）からなる群より選択される１つ以上の因子である、使用。
  22. 前記抗炎症性サイトカインがＩＬ−１０である、請求項２０に記載の使用。
  23. 前記ＩＬ−１０が、ＩｇＧのＦｃ部分に融合される、請求項２２に記載の使用。
  24. 前記脊椎動物被験体がヒトであり、かつ前記抗炎症性サイトカインがヒトＩＬ−１０である、請求項２２に記載の使用。
  25. 請求項１９〜２４のいずれかに記載の使用であって、組み換えベクターが初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組み換えベクターが、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む、疼痛の軽減を維持するようにインビボで該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下での、使用。
  26. 請求項１９〜２４のいずれかに記載の使用であって、治療上有効な量の組成物が、初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組成物が、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、および炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含み、疼痛の軽減を維持するための、使用。
  27. 請求項２５または２６のいずれかに記載の使用であって、前記引き続く投与が、初回投与後３日以内に行なわれる、使用。
  28. 脊椎動物被験体において、既存の疼痛を処置する方法でのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の使用であって、該方法は、以下：
    （ａ）治療上有効な量のＩＬ−１０を含有する第一の組成物を、該被験体の神経系に投与する工程、および
    （ｂ）治療上有効な量のＩＬ−１０を含有する第二の組成物を、該被験体の神経系に対して初回投与後５日以内に投与する工程、
    を包含する、使用。
  29. 前記第一の組成物および前記第二の組成物が同じである、請求項２８に記載の使用。
  30. 前記第一の組成物および前記第二の組成物が異なる、請求項２８に記載の使用。
  31. 前記第一の組成物および／または前記第二の成分におけるＩＬ−１０がＩｇＧのＦｃ部分に融合される、請求項２８に記載の使用。
  32. 前記脊椎動物被験体がヒトであり、かつ前記第一の組成物および／または前記第二の組成物におけるＩＬ−１０がヒトＩＬ−１０である、請求項２８に記載の使用。
  33. 前記第二の組成物が前記第一の組成物の後３日以内に投与される、請求項２８〜３２のいずれかに記載の使用。
  34. 脊椎動物被験体における既存の疼痛を処置する方法でのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の使用であって、該方法は、以下：
    （ａ）治療上有効な量のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を含有する第一の組成物を該被験体の神経系に投与する工程、および
    （ｂ）ＩＬ−１０をコードするポリヌクレオチドを発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む組み換えベクターを含有する第二の組成物を、インビボにおいて該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下で、該被験体の神経系に投与する工程であって、該第二の組成物は、第一の組成物が投与された後５日以内に投与される工程、
    を包含する、使用。
  35. 前記第一の組成物および／または前記第二の組成物におけるＩＬ−１０がＩｇＧのＦｃ部分に融合される、請求項３４に記載の使用。
  36. 前記脊椎動物被験体がヒトであり、かつ前記第一の組成物および／または前記第二の組成物におけるＩＬ−１０がヒトＩＬ−１０である、請求項３４に記載の使用。
  37. 前記第二の組成物が前記第一の組成物の後３日以内に投与される、請求項３４〜３６のいずれかに記載の使用。
  38. 脊椎動物被験体において、既存の疼痛を処置する方法でのインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）ポリペプチドを含有する、組成物の使用。
  39. 前記ＩＬ−１０ポリペプチドがＩｇＧのＦｃ部分に融合される、請求項３８に記載の使用。
  40. 前記脊椎動物被験体がヒトであり、かつ前記ＩＬ−１０がヒトＩＬ−１０である、請求項３８に記載の使用。
  41. 前記投与がクモ膜下送達による、請求項３８〜４０のいずれかに記載の使用。
  42. 前記投与が硬膜外送達による、請求項３８〜４０のいずれかに記載の使用。
  43. 前記疼痛が神経障害性疼痛である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の使用。
  44. 請求項３８〜４０のいずれかに記載の使用であって、組み換えベクターが初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組み換えベクターが、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニストおよび炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子をコードするポリヌクレオチドを、発現制御エレメントに作動可能に連結されて含む、疼痛の軽減を維持するようにインビボで該ポリヌクレオチドの発現を生じる条件下での、使用。
  45. 請求項３８〜４０のいずれかに記載の使用であって、治療上有効な量の組成物が、初回投与後５日以内に引き続いて投与され、該組成物が、疼痛の軽減を維持するために、抗炎症性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインアンタゴニスト、および炎症性サイトカインの作用を軽減または防止するように作用する因子からなる群より選択される因子を含有する、使用。
  46. 請求項４４または４５のいずれかに記載の使用であって、前記引き続く投与が、初回投与後３日以内に行なわれる、使用。
JP2006517161A 2003-06-23 2004-05-28 疼痛を処置するための方法 Pending JP2007525467A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US48088603P 2003-06-23 2003-06-23
US50417503P 2003-09-18 2003-09-18
US10/742,641 US7261882B2 (en) 2003-06-23 2003-12-18 Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
PCT/US2004/016894 WO2005000215A2 (en) 2003-06-23 2004-05-28 Methods for treating pain

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007525467A true JP2007525467A (ja) 2007-09-06

Family

ID=33519855

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006517161A Pending JP2007525467A (ja) 2003-06-23 2004-05-28 疼痛を処置するための方法

Country Status (5)

Country Link
US (4) US7261882B2 (ja)
EP (2) EP1636359A4 (ja)
JP (1) JP2007525467A (ja)
CA (1) CA2529103C (ja)
WO (1) WO2005000215A2 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102266308B1 (ko) * 2020-09-15 2021-06-16 재단법인 자생의료재단 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델
KR102293426B1 (ko) * 2020-07-07 2021-08-26 재단법인 자생의료재단 척추관 협착증 동물모델 및 이의 제조방법

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2367891T3 (es) 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
US20040142893A1 (en) * 2002-10-21 2004-07-22 Uichi Ikeda Methods for treating and preventing vascular disease
US20040219150A1 (en) * 2003-02-06 2004-11-04 Cua Daniel J. Uses of mammalian cytokine; related reagents
US7261882B2 (en) * 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
DE602005026269D1 (de) * 2004-04-28 2011-03-24 Univ Pennsylvania Sequenzielle freisetzung immunogener moleküle über adenoviren und adeno-assoziierte viren vermittelte abgaben
WO2006119170A2 (en) * 2005-05-02 2006-11-09 Avigen, Inc. Use of cytokine-derived peptides in treatment of pain and neurodegenerative disease
LT2816118T (lt) 2005-05-31 2018-12-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Genų pristatymo būdai
PL1928438T3 (pl) * 2005-09-26 2013-08-30 Avigen Inc Zastosowanie ibudilastu do leczenia uzależnień od środków odurzających
US20070142477A1 (en) * 2005-12-19 2007-06-21 The University Of Liverpool Analgesia
CA2653345A1 (en) 2006-05-31 2007-12-13 Avigen, Inc. Ibudilast for inhibiting macrophage migration inhibitory factor (mif) activity
BRPI0719446A2 (pt) 2006-09-28 2013-12-10 Schering Corp Uso de il-10 peguilada para tratar câncer
US20080114027A1 (en) * 2006-11-09 2008-05-15 Johnson Kirk W Method for treating delirium
PL2131841T3 (pl) * 2007-01-30 2013-03-29 Avigen Inc Sposoby leczenia bólu ostrego
WO2008137012A1 (en) * 2007-05-03 2008-11-13 Avigen, Inc. Use of a glial attenuator to prevent amplified pain responses caused by glial priming
EP2152308A1 (en) 2007-05-29 2010-02-17 Novartis Ag New indications for anti- il-i-beta therapy
EA201001135A1 (ru) * 2008-01-09 2011-02-28 ПиДжиИксХЭЛС ЭлЭлСи Интратекальное лечение невропатической боли агонистами ar
US8753690B2 (en) 2008-02-27 2014-06-17 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
WO2009108890A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Biomet Biologics, Llc Methods and compositions for delivering interleukin-1 receptor antagonist
US8951979B2 (en) * 2008-06-13 2015-02-10 Cornell University Pain treatment using ERK2 inhibitors
EP3348281B1 (en) 2008-12-17 2023-07-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Mono- and di-peg il-10 production; and uses
EP2385839B1 (en) * 2009-01-09 2014-11-26 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Therapeutic compositions for treatment of corneal disorders
JP5844258B2 (ja) 2009-08-27 2016-01-13 バイオメット、バイオロジクス、リミテッド、ライアビリティー、カンパニーＢｉｏｍｅｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｌｌｃ インターロイキン−１受容体アンタゴニストの生産のための植込み型装置
EP2293072A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-09 Sanofi-Aventis Use of cathepsin H
EP3470421B9 (en) 2010-07-29 2023-10-04 Buzzard Pharmaceuticals AB Chimeric il-1 receptor type i antagonists
WO2012045334A1 (en) * 2010-10-05 2012-04-12 Synthon Bv Biologically active il-10 fusion proteins
EP2701686A4 (en) 2011-04-28 2014-11-05 Stc Unm LIPID BINCHES SUPPORTED ON POROUS NANOPARTICLES (PROTOCELLS) FOR TARGETED ADMINISTRATION, AND METHODS OF USE THEREOF
IL213693B (en) * 2011-06-21 2018-05-31 Dan Pal An assembly for securing two panels adjacent to each other to the structure to allow thermal expansion and contraction
WO2013070076A1 (en) * 2011-11-08 2013-05-16 Umc Utrecht Holding B.V. Fusion protein comprising an interleukin 4 and interleukin
JP2015520754A (ja) * 2012-05-18 2015-07-23 オタゴ イノベーション リミテッド 創傷治癒のための組合せ治療および組成物
RU2015143521A (ru) 2013-03-13 2017-04-19 Илэвэн Байотерапьютикс, Инк. Лекарственные формы химерных цитокинов для глазной доставки
US10208095B2 (en) 2013-03-15 2019-02-19 Biomet Manufacturing, Llc Methods for making cytokine compositions from tissues using non-centrifugal methods
US9895418B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Biomet Biologics, Llc Treatment of peripheral vascular disease using protein solutions
US9758806B2 (en) 2013-03-15 2017-09-12 Biomet Biologics, Llc Acellular compositions for treating inflammatory disorders
US20140271589A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biomet Biologics, Llc Treatment of collagen defects using protein solutions
US9878011B2 (en) 2013-03-15 2018-01-30 Biomet Biologics, Llc Treatment of inflammatory respiratory disease using biological solutions
US9950035B2 (en) 2013-03-15 2018-04-24 Biomet Biologics, Llc Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders
US10143725B2 (en) 2013-03-15 2018-12-04 Biomet Biologics, Llc Treatment of pain using protein solutions
JP2016519108A (ja) 2013-04-18 2016-06-30 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド インターロイキン−１０を疾病及び疾患の治療に用いる方法
WO2014204816A2 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
DK3021873T3 (en) 2013-07-18 2018-12-17 Xalud Therapeutics Inc Composition for the treatment of inflammatory joint disease
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
WO2015060722A1 (en) * 2013-10-24 2015-04-30 Uniqure Ip B.V. Aav-5 pseudotyped vector for gene therapy for neurological diseases
KR20160079114A (ko) 2013-11-11 2016-07-05 아르모 바이오사이언시스 인코포레이티드 질환 및 장애를 치료하기 위한 인터류킨-10을 사용하는 방법
EP3074507B1 (en) 2013-11-26 2022-01-05 Biomet Biologics, LLC Methods of mediating macrophage phenotypes
WO2015187295A2 (en) 2014-06-02 2015-12-10 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
BR112017002980A2 (pt) * 2014-08-15 2017-12-12 Pixarbio Corp composição para inibir a inflamação em um indivíduo com um dano na coluna vertebral, método para tratar inflamação em um indivíduo tendo um dano na coluna vertebral e kit para produzir a composição
JP2017536098A (ja) 2014-10-14 2017-12-07 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド インターロイキン−１５組成物及びその使用
WO2016064817A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
US10441635B2 (en) 2014-11-10 2019-10-15 Biomet Biologics, Llc Methods of treating pain using protein solutions
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
US9763800B2 (en) 2015-03-18 2017-09-19 Biomet C. V. Implant configured for hammertoe and small bone fixation
AU2016268403A1 (en) 2015-05-28 2017-12-07 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
JP7053453B2 (ja) 2015-08-25 2022-04-12 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 疾患及び障害を治療するためのインターロイキン１０の使用方法
US10898590B2 (en) 2015-09-21 2021-01-26 Kolon Life Science, Inc. Method for delivery of biological molecule to nervous tissue
KR20170034701A (ko) * 2015-09-21 2017-03-29 코오롱생명과학 주식회사 통증 치료용 조성물
WO2017120504A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Durfee Paul N Osteotropic nanoparticles for prevention or treatment of bone metastases
CA3019846A1 (en) * 2016-04-22 2017-10-26 Xalud Therapeutics, Inc. Methods and compositions to enhance the anti-inflammatory effects of interleukin 10
BR112019008788A2 (pt) * 2016-10-31 2019-07-16 Kolon Life Science Inc composição para aliviar ou tratar a dor
WO2018160865A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Charles Jeffrey Brinker Active targeting of cells by monosized protocells
WO2020097946A1 (zh) * 2018-11-18 2020-05-22 杭州博虎生物科技有限公司 一种重组人白细胞介素10融合蛋白及其应用
US11084857B2 (en) 2018-12-05 2021-08-10 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Nsp-interleukin-10 proteins and uses thereof
EP3955956A1 (en) 2019-04-19 2022-02-23 Synerkine Pharma B.V. Therapeutic crosslinking of cytokine receptors
US20220281930A1 (en) * 2019-08-23 2022-09-08 Duke University Compositions and methods for the treatment of pathological pain and itch
CA3183151A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il10 agonists and methods of use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003146909A (ja) * 2001-11-07 2003-05-21 Children's Hospital Of Philadelphia 治療用ポリペプチドに対する免疫寛容の誘導

Family Cites Families (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US44384A (en) * 1864-09-27 Improved carpet-fastening
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4663161A (en) 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
US4871488A (en) 1985-04-22 1989-10-03 Albany Medical College Of Union University Reconstituting viral glycoproteins into large phospholipid vesicles
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
DE10399031I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
US5179022A (en) 1988-02-29 1993-01-12 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Biolistic apparatus for delivering substances into cells and tissues in a non-lethal manner
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5231012A (en) 1989-06-28 1993-07-27 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (interleukin-10)
US6217857B1 (en) 1989-06-28 2001-04-17 Schering Corporation Cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) and pharmaceutical compositions thereof
FR2658432B1 (fr) 1990-02-22 1994-07-01 Medgenix Group Sa Microspheres pour la liberation controlee des substances hydrosolubles et procede de preparation.
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US6018036A (en) 1990-06-29 2000-01-25 Schering Corporation Nucleic acids encoding cytokine synthesis inhibitory factor (Interleukin-10)
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
MY109299A (en) 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
CA2115742A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Ronald G. Crystal Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US6132419A (en) 1992-05-22 2000-10-17 Genetronics, Inc. Electroporetic gene and drug therapy
DK0671933T3 (da) * 1992-08-20 1998-09-23 Schering Corp Hidtil ukendte anvendelser af IL-10
US5993434A (en) 1993-04-01 1999-11-30 Genetronics, Inc. Method of treatment using electroporation mediated delivery of drugs and genes
US6310180B1 (en) 1993-06-21 2001-10-30 Vanderbilt University Method for synthesis of proteins
SK150596A3 (en) 1993-07-26 1997-04-09 Schering Corp Agonists and antagonists of human interleukin-10
US5834441A (en) 1993-09-13 1998-11-10 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral (AAV) liposomes and methods related thereto
US6652850B1 (en) 1993-09-13 2003-11-25 Aventis Pharmaceuticals Inc. Adeno-associated viral liposomes and their use in transfecting dendritic cells to stimulate specific immunity
AU1987695A (en) 1994-03-11 1995-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunomodulatory trichinella substances
PT769054E (pt) 1994-07-05 2000-11-30 Steeno Res Group A S Imunoreguladores
WO1996017072A2 (en) 1994-11-30 1996-06-06 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
EP1621206A1 (en) * 1994-12-12 2006-02-01 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Chimeric cytokines and uses thereof
US6410008B1 (en) 1994-12-12 2002-06-25 Beth Israel Hospital Association Chimeric IL-10 proteins and uses thereof
US5549127A (en) 1995-05-03 1996-08-27 Chang; Wen-Hsiung Spring fixing structure for a hairgrip
US5763270A (en) 1995-06-07 1998-06-09 Genemedicine, Inc. Plasmid for delivery of nucleic acids to cells and methods of use
ES2333425T5 (es) 1995-06-15 2012-08-28 Crucell Holland B.V. Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
US6001650A (en) 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6004797A (en) 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US5753895A (en) 1996-01-16 1998-05-19 Golden Valley Microwave Foods, Inc. Microwave popcorn package with adhesive pattern
BR9713632A (pt) 1996-12-23 2000-04-11 Schering Corp Citocina de mamìfero relacionada com a il-10
US6048551A (en) 1997-03-27 2000-04-11 Hilfinger; John M. Microsphere encapsulation of gene transfer vectors
US6233483B1 (en) 1997-05-14 2001-05-15 Pacesetter, Inc. System and method for generating a high efficiency biphasic defibrillation waveform for use in an implantable cardioverter/defibrillator (ICD).
US20030044384A1 (en) * 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
EP1062230B1 (en) 1998-03-05 2004-10-13 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
AU3063899A (en) 1998-03-17 1999-10-11 Schering Corporation Use of il-10 to treat major depressive disorder
WO1999056784A2 (en) 1998-05-06 1999-11-11 Transgene S.A. Inprovements in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor or interleukin-10
PT1080202E (pt) 1998-05-27 2006-05-31 Avigen Inc Distribuicao de vectores aav codificando aadc intensificada por conveccao
US6800484B2 (en) 1998-06-24 2004-10-05 Genetronics, Inc. High efficiency transfection based on low electric field strength, long pulse length
WO2000016799A1 (en) * 1998-09-23 2000-03-30 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of treating chronic pain
US6428985B1 (en) 1998-12-02 2002-08-06 The Regents Of The University Of Michigan Immunosuppressive structural definition of IL-10
DE69903666T2 (de) 1998-12-03 2003-07-03 Avigen Inc Hilfsstoffe zur verwendung in adeno-assoziiertes virus enthaltenden pharmazeutischen zubereitungen und damit hergestellte pharmazeutische zubereitungen
AU2868200A (en) 1999-02-08 2000-08-25 Chiron Corporation Electrically-mediated enhancement of dna vaccine immunity and efficacy in vivo
US6982089B2 (en) 1999-02-24 2006-01-03 Tact Ip, Llc Cytokine antagonists for neurological and neuropsychiatric disorders
EP2357193B1 (en) 1999-04-28 2015-11-04 Genetics Institute, LLC Human GIL-19/AE289 proteins and polynucleotides encoding same
US6165754A (en) 1999-06-08 2000-12-26 Cornell Research Foundation, Inc. Method of expressing an exogenous nucleic acid
WO2001016153A1 (en) 1999-09-02 2001-03-08 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cytomegalovirus-encoded il-10 homolog
AU2575201A (en) 1999-12-03 2001-06-12 University Of Massachusetts Use of hsp27 as an anti-inflammatory agent
US6875748B2 (en) * 2000-04-21 2005-04-05 Vical Incorporated Compositions and methods for in vivo delivery of polynucleotide-based therapeutics
WO2001083797A2 (en) 2000-04-28 2001-11-08 Avigen, Inc. Polynucleotides for use in recombinant adeno-associated virus virion production
US6593123B1 (en) 2000-08-07 2003-07-15 Avigen, Inc. Large-scale recombinant adeno-associated virus (rAAV) production and purification
ES2367891T3 (es) 2000-09-29 2011-11-10 Schering Corporation Interleucina-10 pegilada.
WO2002044376A2 (en) 2000-11-28 2002-06-06 Sangamo Biosciences, Inc. Modulation of gene expression using insulator binding proteins
WO2003022213A2 (en) * 2001-09-06 2003-03-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Therapeutic treatments for spinal cord injury via blockade of interleukin-1 receptor
CA2361462A1 (en) 2001-11-07 2003-05-08 Katherine A. High Induction of tolerance to a therapeutic polypeptide
US20040142893A1 (en) 2002-10-21 2004-07-22 Uichi Ikeda Methods for treating and preventing vascular disease
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
WO2006119170A2 (en) 2005-05-02 2006-11-09 Avigen, Inc. Use of cytokine-derived peptides in treatment of pain and neurodegenerative disease
LT2816118T (lt) 2005-05-31 2018-12-10 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Genų pristatymo būdai
JP4992025B2 (ja) 2005-05-31 2012-08-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト 変異体ｉｌ−１０

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003146909A (ja) * 2001-11-07 2003-05-21 Children's Hospital Of Philadelphia 治療用ポリペプチドに対する免疫寛容の誘導

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102293426B1 (ko) * 2020-07-07 2021-08-26 재단법인 자생의료재단 척추관 협착증 동물모델 및 이의 제조방법
KR102266308B1 (ko) * 2020-09-15 2021-06-16 재단법인 자생의료재단 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델

Also Published As

Publication number Publication date
CA2529103A1 (en) 2005-01-06
CA2529103C (en) 2013-11-05
US7261882B2 (en) 2007-08-28
EP2258841A1 (en) 2010-12-08
US20090136453A1 (en) 2009-05-28
EP2258841B1 (en) 2013-10-30
WO2005000215A2 (en) 2005-01-06
US8598133B2 (en) 2013-12-03
EP1636359A4 (en) 2006-09-13
WO2005000215A3 (en) 2005-03-24
EP1636359A2 (en) 2006-03-22
US20040258671A1 (en) 2004-12-23
US20140093476A1 (en) 2014-04-03
US20060008446A1 (en) 2006-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2007525467A (ja) 疼痛を処置するための方法
JP4992025B2 (ja) 変異体ｉｌ−１０
EP1885863B1 (en) Methods for delivering genes
JP2023106497A (ja) 減少した免疫反応性を有するａａｖビリオン、およびその使用
US20060210541A1 (en) Methods for treating and preventing vascular disease
US20210040484A1 (en) Compositions and methods for treating and preventing macular degeneration
KR20160003792A (ko) 척수성 근위축증을 치료하기 위한 조성물 및 방법
AU5295800A (en) Methods and compositions for lowering the level of tumor necrosis factor (tnf) in the tnf-associated disorders
JP2005516949A (ja) Ｇｄｎｆの骨格筋へのアデノ随伴ウイルス媒介性のデリバリー
US20060073119A1 (en) Methods for treating neurodegenerative disorders
EP2666783B1 (en) Compositions for inhibiting interleukin-23 pathways
US20080312177A1 (en) Serca2 therapeutic compositions and methods of use
WO2022170038A1 (en) Adeno-associated virus delivery of cln3 polynucleotide
EP1939300A1 (en) Methods and compositions for lowering the level of tumor necrosis factor (TNF) in TNF-associated disorders

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100421

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20100928