KR102266308B1

KR102266308B1 - 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델

Info

Publication number: KR102266308B1
Application number: KR1020200118051A
Authority: KR
Inventors: 하인혁; 김현성; 홍진영; 전완진; 이준선
Original assignee: 재단법인 자생의료재단
Priority date: 2020-09-15
Filing date: 2020-09-15
Publication date: 2021-06-16

Abstract

본 발명은 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 추간판 탈출증 동물모델 등에 관한 것으로서, 본 발명은 요추 추간판 천공과 IL-1β 주사를 통해 일관된 디스크의 형태변화와 분자생물학적 변화를 유도하여 추간판 동물모델의 표준으로 제공될 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 실제 임상적 상황에 접근한 모델로서 제조된 동물모델은 IL-1β의 농도에 따라 디스크 손상의 중증도를 조절할 수 있고 그 증상이 장기간 지속되어 추간판 탈출증 치료제 연구를 위한 적절한 모델로 제공될 수 있다.

Description

추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델{Method of manufacturing an animal model of disc herniation and an animal model manufactured therefrom}

본 발명은 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 추간판 탈출증 동물모델 등에 관한 것이다.

척수 신경근 주위의 요추부 추간판 탈출은 대표적인 척추 질환중의 하나로, 이로 인한 신경근병증의 증상으로 운동과 감각신경의 증상이 있으며, 이 중 감각신경 증상으로 이상감각, 감각의 소실 및 방사통이 나타날 수 있다. 그리고 방사통은 신경병증성 통증의 여러 유형 중 가장 흔한 유형으로 알려져 있다. 척수 신경근 주위의 요추부 추간판 탈출로 인한 신경병증성 방사통의 실험을 위한 동물 모델로서 이전 연구에서는 추간판 수핵 자가 이식 모델이 사용되고 있다. 실험동물의 추간판 수핵을 신경근에 이식하면 신경병증성 통증이 발생하며, 그 외 신경근의 기능적, 구조적인 변이를 일으킨다. 이 모델의 신경 병증성 통증에 대한 연구에서 기계적 자극에 대한 이질통 및 통각과민이 이식 후 1일부터 시작되어 수 주 이내 감소하여 짧은 기간 유지되는 것으로 보고되고 있다. 또한 종래의 기술은 미추에서 추출한 수핵을 이용하여 신경병증성 방사통을 유도하는 것으로 이는 임상의 환자에서 생기는 방사통의 모델로 볼 수 없는 상황이다. 또한 탈출증 증상의 유발 정도도 미약하고 그 방법이 명확히 표준화 되어있지 않다. 외상의 경우를 제외하고는 수핵이 탈출되기 전에 퇴행성 변화가 반드시 선행되고, 퇴행성 변화가 진행되면서 수핵에서는 대체로 전염증성 사이토카인과 케모카인의 활성도가 증가된다. 염증성 활성도가 증가된 수핵이 경막외 공간으로 탈출되면 탐식세포등의 면역세포들을 동원하여 급격히 염증반응이 증가되면서 신경독성과 통증이 발생한다. 따라서 향후 염증성 활성도가 높아진 상태의 수핵이식모델로 종래의 동물모델은 적합하지 않고 수핵 이식 후 짧은 기간 신경병증이 유지되므로 장기간의 추적을 통한 시간에 따른 통증양상의 변화를 관찰하기 위한 연구모델로 활용되기에는 한계점을 가지고 있다.

KR 10-2015-0145303

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 IL-1β를 요추 디스크에 주사하여 중증 추간판 동물모델을 제조하는 방법과 이로 제조된 중증 추간판 동물모델을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (1) 인간이 아닌 척추동물의 편측-척추후궁적제술(hemi-laminectomy)을 수행하는 단계; (2) 상기 척추동물의 요추 추간판을 천공하는 단계; 및 (3) 상기 천공에 인터루킨(interleukin 1β: IL-1β)를 주사하는 단계;를 포함하는 추간판 탈출증 동물모델 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 제조방법은 신경압박과 통증이 나타나는 2단계 이상의 중증 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (1) 단계의 편측-척추후궁적제술은 우측-척추후궁적제술일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 추간판은 요추 L4-5 또는 L5-6추간판일 수 있으며, 바람직하게는 L5-6 추간판일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 천공은 25 내지 35 게이지 주사 바늘을 이용하여 요추 추간판 표면으로부터 3~5 mm, 바람직하게는 4mm 깊이로 천공하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (2) 단계의 천공은 30 게이지 주사 바늘을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (3) 단계는 상기 천공에 IL-1β를 1~100ng/100ul 농도로 주사하는 것일 수 있으며, 주사되는 IL-1β 농도는 제조되는 동물모델의 중증도와 비례한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 추간판 탈출증 동물모델을 제공하며, 상기 동물모델은 2단계 이상의 중증 추간판 탈출증 동물모델일 수 있고, 신경압박과 통증을 증상으로 나타날 수 있고, 염증을 동반할 수 있으며, 운동능력이 감소된 것일 수 있다.

본 발명의 추간판 탈출증 동물모델은 요추 추간판 천공과 IL-1β 주사를 통해 일관된 디스크의 형태변화와 분자생물학적 변화를 유도하여 추간판 동물모델의 표준으로 제공될 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 실제 임상적 상황에 접근한 모델로서 제조된 동물모델은 IL-1β의 농도에 따라 디스크 손상의 중증도를 조절할 수 있고 그 증상이 장기간 지속되어 추간판 탈출증 치료제 연구를 위한 적절한 모델로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명은 향후 디스크 탈출증 및 신경병증성 통증의 목표 치료 물질의 약물 개발 및 약효 연구 등의 목적을 위한 동물 모델로서 활용될 수 있을 것이며, 추간판 탈출증의 발생기전과 병태생리 연구를 위한 새로운 발판으로 이용될 것으로 기대된다.

도 1에 A는 추간판 탈출증 모델 제작의 실험 모식도 이고, B 내지 D는 추간판 탈출증 모델 제조 이미지이다. B는 편측-척추후궁적제술 이전에 중앙에 위치한 제 5 요추부 사진이고, C는 척추후궁적제술 이후의 사진이고, D는 디스크 천공 이후의 사진이다.
도 2는 추간판 천공 이후에 디스크의 형태학적 변화를 MRI(A)와 safranin-O / Fast green 염색(B)를 이용하여 확인한 도면이다.
도 3은 IL-1β 주입에 따른 LDH 모델의 추간판 천공 주변부 디스크, DRG, 및 신경뿌리 내의 CD68의 발현 정도를 확인한 면역형광염색 사진(A)과 CD68 양성 세포의 상대적인 수와 강도를 정량화하여 비교한 그래프이다(B 및 C)
도 4는 IL-1β 주입에 따른 LDH 모델의 아그레칸 및 MMP3 발현 수준의 변화를 면역형광염색을 통해 확인한 도면이다.
도 5는 IL-1β 주입에 따른 LDH 모델의 DRG 뉴런에서 TRPV1 발현 수준의 변화를 면역형광염색을 통해 확인한 도면이다.
도 6은 IL-1β 주입에 따른 LDH 모델의 디스크 및 DRG 뉴런에서 염증관련 인자와 디스크 퇴행과 관련된 유전자(MMP3 및 Aggrecan)의 발현 수준의 변화를 비교한 그래프이다.
도 7은 5개 추간판 탈출증 동물모델 그룹의 시간 경과에 따른 운동기능 평가 결과를 비교한 그래프이다.

전임상 연구를 위한 동물 모델은 인간 질병의 발생 기전을 이해하고, 질병의 예방, 진단 및 치료방법을 모색하는 수단으로 반드시 필요하다. 따라서 동물 모델은 인간의 질병과 임상적으로 유사한 병리 소견과 병태생리학적 유사성을 지녀야 한다. 종래 추간판 탈출증 동물모델의 제작방법은 미추간판에서 수핵을 채취한 후 자가 수핵을 후근신경절과 척수사이에 이식하는 것으로, 자가 수핵의 정확한 양을 신경근 위에 이식하는 방법이 표준화되어 있지 않아 수핵의 일부가 이식하는 과정 중 다른 위치로 손실되는 등 고정에 어려움이 있고, 이식 후 유도되는 행동학적 변화가 Sham 그룹과 비교하여 차이가 미미하고, 회복이 매우 빨라 증상의 유지기간이 짧은 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 임상적으로 발생하는 추간판 탈출증과 병태생리학적 변화가 유사한 동물모델의 제작방법에 대해 예의연구하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 섬유륜(annulus fibrosus)으로부터 수핵이 빠져나올 수 있도록 인위적으로 구멍을 내어 수핵의 탈출을 유도하고, 빠져나온 수핵이 요추 통증을 유발하고 퇴행화가 일어나는지 확인하여 추간판 탈출증 동물모델을 제작하였다.

추간판 탈출증 치료제 개발을 위해서는 후보인자를 적용하는 모델의 변화가 분명한 것이 유리하며, 변화를 유도하는 인자가 후보인자가 유일해야 하기에 탈출증 증상이 장기간 유지되어야 한다. 한편, 디스크에 구멍을 내는 것만으로는 유도되는 디스크의 변화가 미미하고, 회복속도가 빨라서 추간판 탈출증 치료 후보인자들의 장기간 추적 및 정확한 효과 평가에 어려움이 있었다.

이에, 본 발명자들은 디스크 천공과 함께 IL-1β를 주입하여 추간판 탈출증의 특징인 섬유륜과 수핵의 형태 변화와 기질의 파괴(아그레칸과 MMP3의 발현 수준 확인) 및 염증 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

한편, 임상적으로 추간판 탈출증 환자를 중증도에 따라 구분하고 대응과 치료전략을 달리한다. 이와 같이 중증도에 따라 달리하는 치료전략의 정확한 효과를 평가하기 위하여 모델의 차별화된 제작방법을 통한 임상 증상 재현 정도, 손상의 중증도, 그리고 치료 성적 평가에 체계적인 비교가 이루어져야 하며 앞으로 이를 보완하기 위한 체계적인 연구가 더욱 필요한 실정이다.

본 발명자들은 IL-1β의 주입 농도를 달리하여 조직학적, 분자생물학적 변화를 확인한 결과 IL-1β의 주입 농도를 조절하여 중증도가 다른 추간판 탈출증 동물모델의 제작이 가능함을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 동물모델은 추간판 디스크의 다양한 증상들 및 회복 과정에서의 이상 소견들을 재현할 수 있는 실험동물로서 이용될 수 있고, 추간판 탈출증의 발생기전과 병태생리 연구에 제공될 수 있다.

추간판 탈출증은 진행단계에 따라 신경압박과 통증이 없는 단계 추간판 팽윤 단계(1단계), 섬유륜이 완전히 파괴되어 수핵이 신경을 눌러 통증이 발생하고 근력약화와 감각저하 증상이 나타나는 추간판 돌출 단계(2단계), 신경압박이 심한 추간판 탈출 단계(3단계), 및 심한 다리 통증과 하지 마비를 유발할 수 있는 추간판 박리 단계(4단계)로 구분된다. 1단계는 경증으로 구분한다.

본 발명자들은 IL-1β 주입 여부와 주입 농도에 따라 5개 그룹의 추간판 탈출증 동물모델을 제작하고 조직학적, 분자생물학적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 요추간 추간판을 천공만으로도 수핵과 섬유륜의 형태 변화를 유도할 수 있으나 IL-1β 주입은 그 형태 변화를 보다 증가시킬 수 있고, IL-1β 주입의 농도가 높을수록 수핵과 섬유륜의 경계를 확인하기 어려울 만큼 형태 변화를 극적으로 유도할 수 있었다(실시예 2 참조). 또한, 요추 추간판 천공만으로는 염증을 유도하지 못하지만 IL-1β 주입으로 염증을 유도할 수 있고, 주입하는 IL-1β의 농도가 높을수록 염증 정도가 높음을 알 수 있었다(실시예 3 참조). 또한, IL-1β의 주입은 아그레칸(Aggrecan)의 발현을 감소시키고 MMP3의 발현을 증가시켜 디스크의 퇴행을 가속화함을 확인하였다(실시예 4 참조). 주입된 IL-1β가 디스크 퇴행을 가속화시킴은 운동능력 평가에서도 확인할 수 있다. 디스크 천공만 유도한 Control 그룹은 수술 이후 시간의 경과에 다라 운동능력이 개선되었으나 IL-1β을 주입한 그룹에서는 상대적으로 운동능력이 감소됨을 확인할 수 있었다(실시예 5 참조). 상기 결과로부터, 요추 추간판 천공과 함께 IL-1β의 주입시 2단계 이상의 중증 추간판 탈출증 동물모델을 제조할 수 있음을 알 수 있다.

추간판 탈출증 동물모델의 제조방법은 아래와 같다.

(1) 인간이 아닌 척추동물의 편측-척추후궁적제술(hemi-laminectomy)을 수행하는 단계;

(2) 상기 척추동물의 요추 추간판을 천공하는 단계; 및

(3) 상기 천공에 인터루킨(interleukin 1β)를 주사하는 단계.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

[실험 방법 및 재료]

1. 추간판 탈출증 동물모델 제작

실험에 사용할 랫트는 230~250g의 7주령 수컷 SD 랫트이고 대한바이오링크(청주, 한국)에서 구입하였다. 모든 절차는 자생 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 각 랫트는 별도의 케이지에서 사육하였으며, 사육장은 23~25℃ 온도, 45~50% 습도, 12시간 암주기/명주기 조건으로 통제하였으며, 물과 음식은 자율급식할 수 있도록 하였다.

랫트는 2~3% 이소플루란 가스(isoflurane gas)(Forane; BK Pham, 고양, 한국)로 마취시킨 후 미세한 론저(rongeur)를 이용하여 요추 L5에 우측-후궁적제술(hemi-laminectomy)을 수행하고 우측 L5-6 요추간 추간판을 노출시켜 그 표면에 30-게이지 바늘(㈜성심메디칼, 한국)을 4mm 깊이로 삽입하여 천공하였다. sham 그룹은 요추 L5 우측-후궁적제술만을 수행하였다. 척수는 흡수성 지혈제(Surgicel^®fabric, Johnson and Johnson, Arlington, TX)로 덮고, 봉합 후 모든 랫트에 40 mg/kg cefotiam hydrochloride(Fontiam™, Hanmi Pharma, Seoul, Korea)을 주사하였다. 또한, 마취가 풀리고 10 mg/kg 아세트아미노펜(acetaminophen) 시럽 (Tylenol™, Janssen Pharmaceutica, Titusville, NJ)를 각 랫트에 경구투여하였다.

실험 동물은 하기의 5개 그룹(n=18/그룹)으로 구분하였고, 각 그룹의 랫트는 수술 후 1주 또는 4주 후에 희생하였다.

- Sham ; 요추 제5 추간판 편측-척추후궁적제술(hemi-laminectomy) 수행

- Control ; 편측-척추후궁적제술 + 요추 L5-6 추간판 천공

- IL-1β_1ng ; 편측-척추후궁적제술 + 요추 L5-6 추간판 천공 + IL-1β (1ng/100μl) 주사

- IL-1β_10ng ; 편측-척추후궁적제술 + 요추 L5-6 추간판 천공 + IL-1β (10 ng/100μl) 주사

- IL-1β_100ng ; 편측-척추후궁적제술 + 요추 L5-6 추간판 천공 + IL-1β (100ng/100μl) 주사

2. 조직학적 분석

추간판 내부와 외부의 형태적 변화와 병리 상태를 확인하기 위하여 safranin-o 염색 (Sciencell, Carlsbad, CA)과 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하였다. 랫트의 심장에 0.9 % 생리 식염수 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 4 % 파라포름알데히드 (Biosesang, Seongnam, Korea)를 주사한 후, 요추 L5-6 추간판과 DRG 뉴런이 포함된 요추를 추출하고 4 ℃에서 파라포름알데히드로 밤새 고정하였다. 척추 샘플이 무른 상태가 될 때까지 칼슘을 제거하고, 완전히 칼슘이 제거된 샘플은 PBS로 3회 세척하고 30% sucrose로 3일 동안 동결보존하였다. 샘플은 20 μm 두께로 횡절단 하였고, 요추 L5-6 추간판 영역은 Safranin O 염색 및 Fast Green 염색 (Sciencell의 지침에 따름)을 수행하여 1주일 동안 각 그룹의 천공 추간판 손상을 확인하였다. 염색된 부분은 Nikon inverted microscope (Eclipse C2 Plus, Nikon, Japan)을 이용하여 촬영하였고, 추간판 손상은 4 점의 정상 디스크부터(각 범주에서 1 점) 12 점의 심하게 퇴화된 디스크까지(각 범주에서 3 점) 4 점의 퇴행성 변화 범주를 기반으로 하는 조직학적 등급 척도를 사용하여 평가하였다(Eur Spine J. 2008 Dec; 17(12): 1705-1713).

면역조직화학(Immunohistochemistry: IHC)을 이용하여 요추 L5-6 추간판 천공 내부와 주변부의 염증 및 통증과 관련된 발현을 분석하였다. 1차 항체, 토끼 항-단핵구/대식세포 ED1(1:500, Abcam), Aggrecan, MMP3, TRPV1을 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 이후 3차례 세척하고 2차 항체로 rhodamine goat anti-guinea pig, FITC-goat anti-mouse (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA)을 2% NGS(in PBS)에서 1: 300으로 희석하였다. 2시간 동안 인큐베이션하고 각 섹션을 PBS로 2회 헹구었다. 각 염색된 조직은 공초점 현미경(Eclipse C2 Plus, Nikon)으로 촬영하였고, 면역 반응은 각 그룹의 ED1⁺ 세포 수를 수동으로 계산하고 image J software를 이용하여 ED1⁺ 강도를 측정하여 정량화하였다. aggrecan 및 MMP3의 상대적 형광 광도도 마찬가지로 측정하였고, TRPV1을 발현하는 DRG 감각 뉴런을 정량화하여 그 비율을 통해 각 그룹의 통정 정도를 비교하였다.

3. Real-time polymerase chain reaction (RT-PCR)

각 그룹의 요추 L5-6 추간판의 천공부위와 인접한 DRG 뉴런이 포함된 샘플에서 Allprep DNA/RNA/protein kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 RNA를 분리하고 random hexamer primers 및 Accupower RT premix (Bioneer, Daejeon, Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하고 RT-PCR을 수행하여 염증과 통증에 관련된 mRNA 발현 수준의 변화를 측정하였다. 모든 프라이머 쌍은 UCSC Genome Bioinformatics 및 NCBI 데이터베이스를 사용하여 설계되었으며(표 1), CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템에서 SYBR green supermix (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 Real-time PCR을 3회 이상 수행하였다. (Bio-Rad). 각 표적 유전자의 발현은 GAPDH로 정규화되었고 대조군에 대한 배수 변화로 나타내었다.

Gene	5′-3′	Primer Sequence
IL-1β	Forward	TTGCTTCCAAGCCCTTGACT
	Reverse	GGTCGTCATCATCCCACGAG
IL-10	Forward	TAACTGCACCCACTTCCCAG
	Reverse	AGGCTTGGCAACCCAAGTAA
Aggrecan	Forward	GCCTCTCAAGCCCTTGTCTG
	Reverse	GATCTCACACAGGTCCCCTC
MMP-3	Forward	ATGATGAACGATGGACAGATGA
	Reverse	CATTGGCTGAGTGAAAGAGACC
GAPDH	Forward	CCCCCAATGTATCCGTTGTG
	Reverse	TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT

4. 운동기능 평가(Locomotor function assays)

척추관 탈출증 유도 후 Von Frey test, the Basso, Beattie, 및 Bresnahan (BBB)와 함께 수평 사다리 검사를 통해 운동기능 평가를 수행하였다. Von Frey test는 고통에 대한 반응을 측정하는 것으로, 측정 전 15분 동안 기계적 환경에서 랫트를 적응시켰다. 기계적 자극에 의해 회피반응이 관찰되는데 걸리는 시간과 역치는 발 중앙에 부착된 Von Frey filament (Ugo Basile, Varese, Italy)를 이용하여 측정하였다. 회피반응은 자극을 가하는 동안 발을 들어올리거나, 휘젓거나, ?q거나, 발을 빼어내는 행동으로 정의하고 3번 이상의 반복 결과의 평균값으로 나타내었다.

BBB 측정은 개방공간(원통형 아크릴 박스; 직경 90cm, 높이 15cm) 에서 2명의 관찰자가 4분 동안 뒷다리의 움직임을 분석하여 0~21 점으로 구분하고 평균값으로 표시하였다(뒷다리 움직임이 관찰되지 않는 경우 0, 정상적인 뒷다리 움직임이 있는 경우 21).

수평 사다리 실험은 랫트의 균형 감각을 측정하기 위하여 수행하였다. 모든 랫트는 금속 격자판 (격자간격 2.5cm)의 왼쪽에서 오른쪽으로 3회 이동하였으며, 그 움직임은 디지털 캠코더로 영상화하여 그 점수(ladder score)를 하기 수학식 1로 계산하였다.

[수학식 1]

ladder score (%) = erroneous steps of hind limb/total steps of hind limb Х 100

각 그룹의 랫트는 희생되기 전 7일동안 매일 운동기능을 평가하였고, 모든 운동시험은 디지털 카메라를 사용하여 210초 이상 영상으로 기록하였다. 운동기능의 평가는 랫트의 수술내용을 알지 못하는 2명의 관찰자에 의해 수행되었다.

5. 통계

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 분석은 IBM SPSS Statistics 24 (International Business Machines Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하였다. Mann-Whitney U test는 각 그룹 간의 조직학적, 면역조직화학적, 및 유전자 발현 수준 차이를 정량화하기 위하여 이용되었다(p<0.05). 일원배치 분산분석을 이용하여 BBB 및 수평 사다리 평가에서 각 그룹을 비교하고 Mann-Whitney U 테스트를 이용하여 각 집단의 차이를 분석하였다. 각 그룹간의 유의한 차이는 p<0.05로 결정하였다.

[실험 결과]

실시예 1. 추간판 탈출증 동물모델 제작 및 실험의 설계

실험의 설계는 추간판 탈출증 모델 제작 실험의 계획의 과정이다(도 1에 A). 랫트의 우측 L5-6 요추간 추간판을 천공하고 동시에 IL-1β를 주사하여 인간의 추간판 탈충증과 보다 일치하는 동물모델을 제작하였다. 추간판 탈출증의 신경학적 증상은 IL-1β 주사 농도에 의해 조절하였다. Sham 그룹은 신경 압박 및 추간판 손상 없이 우측-척추후궁적제술만을 수행하였다. 도 1에 B는 추간판 탈출증 모델 제조 이미지이다. 가장 우측 이미지는 제거 이전에 제5 요추부가 중앙에 위치한 모습이다. 그리고, 신경 압박 없이 요추 L5-6 추간판이 노출되도록 편측-척추후궁적제술을 시행하였다. L5-6 추간판을 노출시킨 이후에 척수와 DRG 사이의 공간을 통해 바늘을 척수의 측면과 추간판 내부에 비스듬히 삽입하였다.

실시예 2. IL-1β 주입 농도에 따른 LDH 모델의 조직학적 차이 분석

추간판 천공 이후에 수핵의 탈출 시점과 조직학적 변화를 확인하기 위하여 각 랫트를 수술 후 2주 동안 매주 MRI를 수행하였다. T2-weighted axial plane MRI 이미지는 디스크 내 수핵의 양이 수술 후 1주일 동안 급격히 감소하였으며, 2주 후에는 정상 디스크와 비교하여 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 2에 A). 상기 결과로부터 수핵이 디스크의 구멍을 통해 흘러나감을 알 수 있다. 이어서, safranin-O / Fast green 염색을 수행하여 IL-1β 주입 후 디스크의 형태학적 변화를 확인하였다(도 2에 B). Sham 그룹에서 디스크의 모양은 섬유연골 박편의 정상적인 섬유륜(annulus fibrosus) 패턴을 유지하였다. 반면에 LDH 모델 랫트(Control)는 디스크가 파열되어 섬유륜과 수핵 사이의 경계가 분명하지 아니하였다. 특히 IL-1β를 주입한 그룹은 Control 그룹보다 그 경계를 구분하기 어려웠다. 섬유륜과 수핵의 형태 변화 특성은 4~12 점의 조직학적 등급으로 정량하였다(도 2에 C). 4점의 정상 디스크는 섬유연골 박편의 정상 패턴과 섬유륜 및 수핵 사이의 경계가 분명한 것으로 정의하였다. Sham 그룹은 평균 4 점이고, IL-1β 주입 그룹의 점수는 Control 그룹과 비교하여 높으며 주입된 IL-1β의 용량 의존적으로 높은 점수로 구분되었다. 상기 결과로부터 디스크 천공에 주입하는 IL-1β의 농도 조절을 통해 LDH 동물모델의 중증도를 통제할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3. IL-1β 주입 농도에 따른 LDH 모델의 염증 반응 분석

이어서, 대식세포 및 단핵구의 CD68를 마커로 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하여 수술 이후 각 랫트의 염증 정도를 정량적으로 평가하였다. 각 그룹에서 병변 부위의 디스크, DRG, 및 신경뿌리(nerve root) 내에서 CD68의 발현 강도와 수를 정량하였다. Sham 그룹은 모든 영역에서 염증 반응을 확인할 수 없었다(도 3에 A). Control 그룹은 디스크 가장자리에서 염증 세포의 침윤이 확인되었으나, 천공 주변의 DRG 뉴런 및 기타 말초 신경에서는 염증 세포가 확인되지 않았다. IL-1β 주사 그룹은 디스크, DRG 뉴런, 신경근에 국한되어 염증세포를 확인할 수 있었다. 그리고, CD68 양성 세포의 상대적인 수와 강도는 IL-1β 주사 그룹에서 그 용량 의존적으로 상승되었다(도 3에 B 및 C). 특히, 평균 CD68의 수 및 강도는 100ng를 주입한 IL-1β 군에서 가장 큰 증가를 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 IL-1β가 염증의 증가를 유도하고 염증의 정도가 IL-1β 주입 농도와 양의 상관관계가 있음을 알 수 있다.

실시예 4. IL-1β 주입 농도에 따른 LDH 모델의 디스크 변화 확인

추간판 기질에서 단백질의 파괴는 추간판 탈출증의 특징이다. 아그레칸(Aggrecan)은 디스크의 주요 프로테오글리칸이며 디스크 내부의 수분 함량을 유지하는 데 핵심적인 역할을 수행하는데, 이어서, 면역염색을 통해 각 그룹의 수핵(nucleus pulposus)에서 아그레칸의 발현 수준을 확인하였다(도 4에 A). Sham 그룹은 아그레칸의 발현 수준이 높았으나, IL-1β 주입 그룹에서는 주입 용량 의존적으로 그 발현 수준이 감소함을 확인할 수 있었다. 또한, Control 그룹과 IL-1β 1ng 주입군은 Sham 그룹과 비교하여 아그레칸의 발현 수준이 증가하지 않았다. 아그래칸의 발현 수준을 형광 강도를 통해 정량하였고(도 4에 C), 그 결과 IL-1β 주입 그룹은 용량에 따라 디스크에서 기질의 손상의 증가를 확인할 수 있었다.

디스크의 주 성분은 물, 콜라겐, 및 프로테오글리칸이며, MMP3은 추간판의 기질(프로테오글리칸, 콜라겐, 젤라틴, 라미닌 등)의 파괴와 퇴행성 변화에 관여하는 효소이다. 탈출 디스크에서 matrix metalloproteinase 3 (MMP3)의 발현을 확인한 결과, IL-1β 주입 그룹에서 디스크의 섬유륜과 수핵 모두에서 MMP3의 발현이 크게 증가함을 확인하였다(도 4에 D). 상기 결과로부터, IL-1β의 주입이 디스크의 퇴행을 가속화하고 인간 추간판 탈출증과 보다 유사한 동물모델 제작의 핵심요소임을 확인할 수 있었다.

실시예 5. LDH 모델에서 통증 관련 TRPV1 단백질 발현 수준 확인

수술 후 각 그룹의 랫드에서 통증 관련 인자인 TRPV1의 면역화학염색법을 이용하여서 단백질 수준에서 발현을 확인하였다. 일시적인 수용체 전위 바닐 로이드 아형 1 (TRPV1)의 활성은 신경 병성 통증에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. TRPV1 발현은 감각 뉴런에서 통증 경로의 조절에 관여한다. 우리는 면역 조직 화학 염색에 의해 DRG 감각 뉴런에서 TRPV1 발현을 분석했다 (그림 5에 A). IL-1β는 DRG 뉴런에서 TRPV1 발현을 크게 유도함을 확인했다. 정량적으로 DRG 뉴런에서 TRPV1 양성 뉴런의 비율은 Control 그룹에서 16.7 ± 4.0 %, 1ng 주사 쥐에서 16.9 ± 2.3 %, 10ng 주사 쥐에서 22.1 ± 1.8 %, 100 마리에서 26.1 ± 4.8 % 이다. 통계적으로 TRPV1 양성 뉴런 비율은 Control 그룹과 비교하여 100 ng 주입된 그룹에서 유의적으로 증가했다. (그림 5에 B). 각 그룹에서 TRPV1의 정량화 된 강도는 Control 그룹과 비교하여 10ng 및 100ng가 주입된 IL-1β 그룹에서 유의적으로 증가했다. (그림 5에 C). 상기 결과로부터, IL-1β에 의해 *?*유도된 TRPV1의 향상된 발현이 신경 병성 통증의 악화에 관여할 수 있음을 시사한다.

실시예 6. LDH 모델에서 염증 및 항염증 인자 관련 유전자 발현 수준 확인

수술 1주 후 각 그룹의 디스크 및 DRG 뉴런에서 염증과 항염증 및 디스크 변성과 관련된 유전자에 대한 mRNA 발현을 확인했다. 염증유발 사이토카인인 IL-1β (표 1)의 발현이 Control 그룹에 비해 IL-1β 그룹에서 유의하게 증가했다(도 6에 A). 항 염증성 사이토카인인 IL-10 유전자는 IL-1β 군에서 발현량이 유의적으로 감소되었고 100ng가 주입된 IL-1β 군에서 현저하게 감소했다 (그림 6에 B). 이어서 추간판 탈출 후 1 주차에 각 그룹에서 디스크 변성 관련 유전자의 발현을 추가로 분석했다. Aggrecan 유전자 발현량은 IL-1β 그룹에서 감소했다. 특히 100ng 농도의 IL-1β가 주입된 그룹은 Control 그룹에 비해 유의적으로 감소했다 (그림 6에 C). 또한 MMP3 유전자는 IL-1β 그룹에서 용량 의존적으로 증가되었다 (그림 6에 D). 상기 결과로부터, 일부 유전자 인자들의 분석을 통해 IL-1β가 LDH 모델을 유도하는 데 더 효과적인지 여부를 명확하게 밝히지 못하지만, 이러한 결과는 IL-1β가 aggrecan 및 MMP3 발현 변화를 유도하고 디스크 변성 및 염증 반응을 유도함을 확인할 수 있다.

실시예 7. LDH 모델의 운동기능 평가

IL-1β 주입이 랫트의 운동 및 행동 기능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 BBB, Von Frey test, 및 수평 사다리 검사를 수행하였다. Sham 그룹에 비하여 Control 그룹은 수술 1주일 후 BBB 점수에서 현저한 감소를 확인하였다. Control 그룹은 평균 점수가 18점이고 잘 조화된 뒷다리와 앞다리의 움직임을 보이고, 발톱을 끌지 않는 움직임은 90% 이상였다. 반면에 IL-1β 주입군의 수술 1주일 후 BBB 점수는 평균 16 점이고 3주까지 Control 그룹과 유의한 차이를 나타내었다. 그러나 IL-1β의 주입 농도에 따른 차이는 확인할 수 없었다(도 7에 A). BBB 결과와 달리 수평 사다리 점수는 각 그룹간에 보다 급격한 차이를 나타내었다. 특히 Control 그룹과 비교하여 IL-1β 주입 그룹은 높은 발빠짐을 나타내었다. Sham 그룹은 수술 1주 후 약 5%의 발빠짐 비율을 나타내었으나, 매주 개선되어 3주차에는 2% 발빠짐 비율을 나타내었다. 그러나, IL-1β 주입 그룹은 수술 후 매주 발빠짐 비율이 증가하였다(도 7에 B). Von Frey test에서 Control 그룹은 1주일 동안 4~5초의 지연시간을 나타내었으며, 1주차에 Sham과 Control 그룹간에 유의한 차이를 확인하였다. 그러나, IL-1β 주입 그룹은 Control 그룹과 비교하여 지연시간이 짧았으며 특히, 100ng의 IL-1β이 주입된 그룹에서 현저한 지연시간의 감축을 확인할 수 있었다(도 7에 C). 비록 Von Frey test 결과에서 Control 그룹과 비교하여 IL-1β 그룹에서 유의적인 차이는 없었지만, 상기 모든 행동학적 평가 결과로부터 IL-1β의 주입은 운동능력이 감소된 추간판 탈출증 동물모델을 제작할 수 있음을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(1) 랫트(rat)의 요추5/6번 디스크 노출 시 까지 편측-척추후궁적제술(hemi-laminectomy)을 수행하는 단계;
(2) 상기 척추동물의 요추 L5-6 추간판을 천공하는 단계; 및
(3) 상기 천공에 인터루킨 1β(interleukin 1β: IL-1β)를 1~100 ng/100 ul 농도로 주사하는 단계;를 포함하는 추간판 탈출증 동물모델 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (1) 단계는 랫트(rat)의 우측-척추후궁적제술을 수행하는 것인, 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계는 25 내지 35 게이지 주사 바늘을 이용하여 수행되는 것인, 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (2) 단계는 요추 L5-6 추간판 표면으로부터 3~5 mm 깊이로 천공하는 것인, 제조방법.
삭제
제1항, 제2항, 제4항, 및 제5항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 추간판 탈출증 랫트모델.
제7항에 있어서,
상기 랫트모델은 2단계 이상의 중증 추간판 탈출증 랫트모델인 것을 특징으로 하는, 랫트모델.