KR101528429B1 - 농도구배 미세유체칩장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치는 수핵이 배양되는 수핵챔버, 섬유륜이 배양되는 섬유륜챔버와 신경세포가 배양되는 신경세포챔버가 동일평면 상에서 일측에서 타측방향으로 순차적으로 배치된 배양플레이트; 염증전구물질이 투입되는 제 1 투입구와 완충용액이 투입되는 제 2 투입구가 배양플레이트의 일측에서 상호 간에 이격되어, 수핵챔버에 각각 연결된 투입부; 수핵챔버와 섬유륜챔버를 각각 연결하고, 수핵과 섬유륜이 물리적으로 접촉되는 제 1 채널부; 및 섬유륜챔버와 신경세포챔버를 연결하는 제 2 채널부를 포함하는 것이 바람직하다.

Description

농도구배 미세유체칩장치{gradient microfluidic chip device}
본 발명은 농도구배 미세유체칩장치에 관한 것이며, 상세하게는 인체의 추간판과 유사한 추간판 구조를 한 개의 배양플레이트에 복수 개로 구현하고, 복수의 추간판 구조를 동일한 평면 상에 구현하여, 염증전구물질의 농도변화에 따른 수핵과 섬유륜의 염증변화, 신경세포의 자극시 섬유륜의 변화 등을 동시에 실시간으로 파악할 수 있는 농도구배 미세유체칩장치에 관한 것이다.
일반적으로 요통은 전체 인구의 대략 80%에서 한번은 겪게 되는 흔한 질환이다. 요통의 원인은 나이에 따라 조금씩 다르게 나타난다. 예를 들어, 20대 내지 30대의 요통 원인은 허리 근육의 이상으로 인한 요추 염좌나 디스크 질환이 나타나고, 60대 이후에는 골다공증과 관절염이 오면서 디스크 질환등으로 나타난다. 여기서, 디스크는 추간판이라고도 한다. 추간판은 등꼴뼈 사이에서 충격을 흡수하는 탄력적인 구조를 가진다.
도 1에는 정상추간판의 해부학적 개략도가 개시되어 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 정상 추간판(Intervertebral disc ; IVD)은 디스크 안쪽에 존재하는 수핵(Nucleus pulposus ; NP)과, 수핵 바깥쪽으로 존재하는 섬유륜(Annulus fibrosus ; AF)으로 나누어진다. 또한 섬유륜 조직 바깥쪽 3분의 1지점까지 유리 신경 말단(free nerve ending)이 존재한다.
추간판은 연령이 증가함에 따라 탄력성을 잃고 섬유륜이 균열을 일으키는 등의 퇴행성 변화에 외력이 가해지면 추간판 섬유륜의 약해진 부분이나 찢어진 부분으로 수핵이 후방으로 밀려 나오면서 증상을 일으키게 된다.
밀려나오는 형태에 따라 섬유륜이 골고루 팽윤된 추간판 팽윤(bulging), 국소적으로 돌출된 추간판 탈출(protrusion), 섬유륜이 파열되어 경막외 공간으로 수핵이 밀려나왔으나 내부와 연결된 형태인 추간판 추출(extrusion), 파열되어 수핵편이 경막외 공간으로 이동하여 내부와 연결이 끊어진 추간판 수핵 부골화(sequestration) 등으로 구분할 수 있다.
상기에 예시된 바와 같이, 섬유륜 조직에 손상이 일어나면, 해당 손상 부위를 회복하는 과정에서 염증이 생기면서 발생하게 된다. 이러한 염증 반응에 관여하는 대식세포는 섬유륜 세포와의 상호작용을 통해 다양한 염증전 매개인자(pro-inflammatory mediator)를 발현하게 되고, 이를 통해 섬유륜 세포 역시 다양한 염증 매개물이 분비된다.
염증과정에서 나타나는 염증매개물에 의해 섬유륜 바깥쪽에 존재하는 유리 신경말단이 자극을 받게 되면, 신경세포가 섬유륜과 수핵의 안쪽으로 내성장(ingrowth)되면서 통증이 발생되는데, 이러한 요통의 발병기전은 정확히 밝혀져 있지 않다.
또한, 현재 요통 발병기전 연구의 경우 해당 염증 매개물 등의 분자적 발현정도의 측정과 같은 마이크로 플레이트 리더(micro plate reader)등의 실험에 의존적이며, 실시간으로 세포들의 상호작용과 움직임을 정확히 관찰하기 어렵다.
또한, 해당 실험들이 개별적으로 이루어지면서 각 세포를 동시에 배양해야 하는 복잡성으로 인한 다양한 조건(예를 들어, 미세환경의 조성, 각 세포간의 동시 배양 및 실험분석)의 실험이 어려운 단점이 있다. 한국공개특허 제10-2013-0105179호에는 직선형 농도구배 미세유체칩을 이용한 폐상피세포의 배양방법이 개시되어 있다.
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 인체의 추간판과 유사한 추간판 구조를 한 개의 배양플레이트에 복수 개로 구현하고, 복수의 추간판 구조를 동일한 평면 상에 구현하여, 염증전구물질의 농도변화에 따른 수핵과 섬유륜의 염증변화, 신경세포의 자극시 섬유륜의 변화 등을 동시에 실시간으로 파악할 수 있는 농도구배 미세유체칩장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 염증전구물질의 농도변화에 따른 염증매개물의 분비량에 따른 신경세포의 자극정도, 자극정도에 따른 신경세포의 섬유륜과 수핵방향으로의 내성장정도에 따른 수핵, 섬유륜과 신경세포의 상호작용과 움직임을 실시간으로 동시에 관찰하게 할 수 있는 농도구배 미세유체칩장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치는 수핵이 배양되는 수핵챔버, 섬유륜이 배양되는 섬유륜챔버와 신경세포가 배양되는 신경세포챔버가 동일평면 상에서 일측에서 타측방향으로 순차적으로 배치된 배양플레이트; 염증전구물질이 투입되는 제 1 투입구와 완충용액이 투입되는 제 2 투입구가 배양플레이트의 일측에서 상호 간에 이격되어, 수핵챔버에 각각 연결된 투입부; 수핵챔버와 섬유륜챔버를 각각 연결하고, 수핵과 섬유륜이 물리적으로 접촉되는 제 1 채널부; 및 섬유륜챔버와 신경세포챔버를 연결하는 제 2 채널부를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 2 채널부에는 제 3 채널부가 연결되고, 제 3 채널부는 콜라겐챔버와 제 2 채널부 사이에 연결되어, 제 2 채널부로 콜라겐겔을 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 제 2 채널부는 콜라겐겔이 콜라겐층을 형성할 수 있는 마이크로 채널이고, 콜라겐층은 제 2 채널부에서 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 환경을 조성하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 배양플레이트에는 복수의 수핵챔버와 복수의 섬유륜챔버가 복수의 제 1 채널부에 의해 각각 연결되고, 복수의 섬유륜챔버는 복수의 제 2 채널부에 의해 신경세포챔버에 연결되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 투입부와 복수의 수핵챔버 사이에는 농도구배부가 배치되고, 농도구배부는 투입부에서 제공된 염증전구물질과 완충용액의 혼합에 의해 염증전구물질의 농도를 구배하고, 복수의 농도구배채널에 의해 농도구배된 염증전구물질을 복수의 수핵챔버로 제공하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 복수의 수핵챔버, 복수의 섬유륜챔버와 신경세포챔버는 농도구배부를 중심으로 상호 간에 소정의 간격으로 순차적으로 이격되고 방사형으로 배치된 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 농도구배채널은 농도구배부와 복수의 수핵챔버 사이에서, 방사형으로 패턴화된 마이크로 채널인 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 신경세포챔버에는 신경세포배양물질이 투입되는 배양물질투입챔버가 제 4 채널부에 의해 연결되고, 제 4 채널부는 마이크로채널 구조를 가진 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 배양플레이트는 PDMS(polydimethylsiloxane stamp) 재질인 것이 바람직하다.
한편, 염증전구물질은 인터류킨-1베타(Interleukin-1beta, IL-1b) 또는 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)인 것이 바람직하다.
본 발명은 한 개의 배양플레이트에 복수의 추간판 구조를 구현하여, 동일한 환경에서 복수의 수핵과 복수의 섬유륜을 동시에 세포배양한 후, 수핵으로 제공된 염증전구물질의 농도에 따라 수핵과 섬유륜의 염증반응에서 분비된 염증매개물이 신경세포에 어떠한 영향을 미치는지 여부를 분석하여, 요통의 발병기전을 연구할 수 있다.
또한, 본 발명은 염증전구물질의 농도변화에 따른 염증매개물의 분비량에 따른 신경세포의 자극정도, 자극정도에 따른 신경세포의 섬유륜과 수핵방향으로의 내성장정도에 따른 수핵, 섬유륜과 신경세포아의 상호작용과 움직임을 실시간으로 동시에 관찰하게 할 수 있고, 이에 따라, 추간판의 손상시 염증매개물의 농도별에 따른 수핵과 섬유륜의 반응관계에 대한 여러 개의 실험데이터를 동시에 확보할 수 있어, 요통 기전 연구를 보다 용이하게 할 수 있다.
아울러, 본 발명은 배양플레이트의 크기를 기존의 배양칩과 달리 대형화하여, 세포의 변화를 시각적으로 관찰가능하고, 정량적이 수치산출을 보다 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치는 인체의 추간판과 유사한 추간판 구조를 배양플레이트에 복수 개로 구현하고, 복수의 추간판 구조를 동일한 평면 상에 구현하여, 염증전구물질의 농도변화에 따른 수핵과 섬유륜의 염증변화, 신경세포의 자극시 섬유륜의 변화 등을 동시에 실시간으로 실험할 수 있어, 요통이 발병기전 연구를 보다 효율적으로 할 수 있도록 도움을 줄 수 있다.
아울러, 본 발명은 배양플레이트에 대식세포, 신경세포, 섬유륜세포와 신경세포를 배양하여, 복수의 수핵챔버, 복수의 섬유륜챔버와 신경세포챔버를 통해 인체의 추간판과 유사하게 추간판 구조를 모사(micromimic)함으로써, 단지 염증전구물질과 수핵, 섬유륜과의 반응시 발생되는 염증매개물 외에, 대식세포가 염증전구물질과의 반응시 발생되는 다양한 염증매개물이 염증전구물질과 더불어 수핵, 섬유륜과의 염증반응을 유도할 수 있고, 농도구배 미세유체칩장치를 이용한 실험데이터의 신뢰성을 증대시킬 수 있다.
도 1는 정상추간판의 해부학적 개략도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치의 전체 평면도를 개략적으로 도시한 것이고,
도 3은 도 2의 일부를 확대한 확대도를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치의 염증전구물질과 완충용액의 투입시 상태를 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 도 4의 일부를 확대한 확대도로서, 수핵, 섬유륜과 신경세포에 대한 염증전구물질의 유동경로를 개략적으로 도시한 것이다.
도 6은 염증전구물질의 농도-섬유륜의 움직이는 속도에 관한 실험그래프이고,
도 7은 염증전구물질의 농도-섬유륜의 세포면적변화 그래프이고,
도 8은 염증전구물질의 농도-섬유륜세포의 다리길이(Dendritic length)에 대한 변화그래프이고,
도 9은 염증전구물질의 농도-세포성장비율 그래프이다.
이하에서는 첨부도면을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치에 대해 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치(100)는 배양플레이트(110), 투입부(120), 농도구배부(130), 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e), 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 제 1 채널부(160a, 160b, 160c, 160d, 160e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e), 복수의 제 2 채널부(171a, 171b, 171c, 171d, 171e), 제 3 채널부(172a), 신경세포챔버(180), 배양물질투입챔버(181a)와 제 4 채널부(182a)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치(100)는 한 개의 배양플레이트(110)에 복수의 추간판 구조를 동시에 구현하여, 추간판을 이루는 수핵, 섬유륜과 신경세포를 배양한 후, 염증전구물질(A)을 통해 이들에 염증을 유발시킨 후, 염증유발시 염증매개물이 신경세포를 자극함에 따라 신경세포의 내성장되면서 신경세포가 섬유륜세포에 미치는 영향과 염증유발시 수핵과 섬유륜 사이의 관계를 동시에 관찰할 수 있어, 요통의 발병기전 연구를 위한 장치이다.
본 실시예에서, 배양플레이트(110)는 추간판 구조가 복수 개로 구현되어, 신체조직인 추간판이 모사되는 부재이다. 배양플레이트(110)에는 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 신경세포챔버(180)로 이루어진 5개의 추간판 구조가 예시적으로 구현되어 있다.
추간판 구조는 각각 하나의 수핵챔버, 하나의 섬유륜챔버와 신경세포챔버(180)로 이루어진다. 여기서, 하나의 수핵챔버, 하나의 섬유륜챔버와 신경세포챔버(180)는 배양플레이트(110)의 일측에서 타측방향으로 동일한 평면 상에서 순차적으로 배치된 구조를 가진다. 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 신경세포챔에 대해서는 후술하기로 한다.
배양플레이트(110)에 마련된 추간판 구조의 개수는 배양플레이트(110)의 크기에 따라 당업자의 입장에서 자명한 범위 내에서 다양하게 가변될 수 있다. 여기서, 배양플레이트(110)는 70mm×50mm의 크기를 가진다.
배양플레이트(110)는 PDMS(polydimethylsiloxane stamp) 재질인 것이 바람직하다. 배양플레이트(110)에는 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 신경세포챔버(180) 외에, 투입부(120), 농도구배부(130), 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e), 제 1 채널부(160a, 160b, 160c, 160d, 160e), 제 2 채널부(171a, 171b, 171c, 171d, 171e), 제 3 채널부(172a), 배양물질투입챔버(181a)와 제 4 채널부(182a)가 마련된다.
투입부(120)는 염증전구물질(A)과 완충용액(B)이 투입되어, 이를 농도구배부(130)로 제공하는 부재이다. 투입부(120)는 제 1 투입구(121), 제 2 투입구(122), 제 1 투입채널(123)과 제 2 투입채널(124)로 이루어진다.
제 1 투입구(121)는 염증전구물질(A)이 투입되는 부분이다. 여기서, 염증전구물질(A)은 수핵과의 반응시 염증반응하여 염증매개물을 분비하는 물질이다. 염증전구물질(A)로는 인터류킨-1베타(Interleukin-1beta, IL-1b) 또는 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)이 사용될 수 있다. 다만, 이는 예시적인 물질이며, 당업자의 입장에서 자명한 범위 내에서 다양한 염증전구물질(A)이 사용될 수 있다.
제 1 투입구(121)는 배양플레이트(110)의 일측에서 홈구조로 마련된다. 제 1 투입구(121)는 농도구배부(130)와 인접하게 위치된다. 제 1 투입구(121)는 제 1 투입채널(123)에 의해 농도구배부(130)와 연결된다. 여기서, 제 1 투입채널(123)은 마이크로 채널이다. 마이크로채널이란 마이크로미터(㎛)의 통로간격을 가진 채널을 말한다.
제 2 투입구(122)는 제 1 투입구(121)와 이격되어 배양플레이트(110)의 일측에 마련된다. 제 2 투입구(122)는 제 1 투입구(121)와 마찬가지로 홈구조를 가진다. 제 2 투입구(122)에는 완충용액(B)이 투입된다. 여기서, 완충용액(B)은 염증전구물질(A)과 혼합하여, 염증전구물질(A)의 농도를 낮추는 물질이다. 완충용액(B)으로는 증류수가 사용될 수 있다.
제 2 투입구(122)는 제 2 투입채널(124)에 의해 농도구배부(130)에 연결된다. 제 2 투입채널(124)은 제 1 투입채널(123)과 개별적으로 농도구배부(130)에 연결된다. 제 2 투입채널(124)에는 완충용액(B)이 유동한다. 제 2 투입채널(124)은 제 1 투입채널(123)과 마찬가지로 마이크로채널구조를 가진다.
한편, 농도구배부(130)는 투입부(120)와 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e) 사이에 위치된다. 농도구배부(130)는 투입부(120)로부터 제공받은 염증전구물질(A)과 완충용액(B)을 서로 상이한 농도, 예를 들어, 100%, 50%, 25%, 12.5% 및 0% 비율로 농도구배하는 부재이다.
농도구배부(130)에는 인체의 대식세포(macrophage) 환경을 조성하기 위한 마크로파지조정배지(macrophage conditioned medium, 이하, 'MCM'이라 한다)가 배양된다. 이는, 가능한한 신체조직과 유사한 환경에서 염증전구물질(A)과 수핵 및/또는 섬유륜과의 반응뿐 아니라, 염증전구물질(A)과 마크로파지와의 반응시 분비되는 다양한 종류의 염증매개물까지 실험환경에 고려하여, 인체와 가능한 유사한 환경에서 염증전구물질(A)의 농도변화에 따라 추간판을 이루는 수핵, 섬유륜, 신경세포 사이의 상호관계와 염증반응을 고려하기 위함이다.
농도구배부(130)에는 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)이 연결된다. 여기서, 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)은 농도구배부(130)와 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e)를 연결하는 통로이다. 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)은 농도구배부(130)를 중심으로 방사형으로 패턴화된 마이크로 채널이다. 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)에는 서로 상이한 농도, 예를 들어, 100%, 50%, 25%, 12.5% 및 0% 농도를 가진 염증전구물질(A)이 유동된다.
본 실시예에서는 설명의 편의를 위하여, 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)에 대해, 제 1 농도구배채널(140a) 내지 제 5 농도구배채널(140e)이라 지칭하기로 한다. 여기서, 제 1 농도구배채널(140a)은 농도구배부(130)와 제 1 수핵챔버(150a)를 연결하는 채널이다. 제 1 농도구배채널(140a)은 농도구배부(130)에서 제공된 100%의 염증전구물질(A)을 제 1 수핵챔버(150a)로 제공한다.
제 2 농도구배채널(140b)은 농도구배부(130)와 제 2 수핵챔버(150b)를 연결하는 채널이다. 제 2 농도구배채널(140b)은 농도구배부(130)에서 제공된 50%의 염증전구물질(A)을 제 2 수핵챔버(150b)로 제공한다.
제 3 농도구배채널(140c)은 농도구배부(130)와 제 3 수핵챔버(150c)를 연결하는 채널이다. 제 3 농도구배채널(140c)은 25%의 염증전구물질(A)을 제 3 수핵챔버(150c)로 제공한다. 제 4 농도구배채널(140d)은 농도구배부(130)와 제 5 수핵챔버(150e)를 연결하는 채널이다. 제 4 농도구배채널(140d)은 12.5%의 염증전구물질(A)을 제 4 수핵챔버(150d)로 제공한다. 제 5 농도구배채널(140e)은 농도구배부(130)와 제 3 수핵챔버(150c)를 연결하는 채널이다. 제 5 농도구배채널(140e)은 0%의 농도를 가진 완충용액(B)을 제 5 수핵챔버(150e)로 제공한다.
이하에서는, 추간판 구조를 구현하는 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 신경세포챔버(180)에 대해 설명하기로 한다.
본 실시예에서는 설명의 편의를 위하여, 배양플레이트(110)에 5개의 추간판 구조를 이루는 구성요소 중에 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e)에 대해 각각 '제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)'로 구분하여 지칭하기로 하며, 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)에 대해 각각 '제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)'로 구분하여 지칭하기로 한다.
제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)에는 수핵세포가 배양되는 부분이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)는 농도구배부(130)를 중심으로 상호 간에 소정의 간격만큼 이격되어 방사형으로 배치된다. 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)는 농도구배부(130)와 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e) 사이에 배치된다.
제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)는 복수의 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)에 의해 농도구배부(130)에 연결되고, 복수의 제 1 채널부에 의해 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)에 연결된다.
제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e) 내의 수핵은 농도구배부(130)로부터 제공받은 서로 상이한 농도(예를 들어, 100%, 50%, 25%, 12.5%, 0%)를 가진 염증전구물질(A)과 염증반응하여 염증매개물을 분비한다.
염증매개물로는 인터류킨6(IL-6), 인터류킨8(IL-8) 또는 VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) 등을 예로 들 수 있으나, 이는 현재까지 발견된 염증매개물의 예시에 불과한 바, 본 명세서에 기재된 염증매개물에 반드시 한정되지는 않는다.
제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)에서 분비된 염증매개물은 복수의 제 1 채널부를 통해 각각 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)로 이동된다.
본 실시예에서, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)는 인체의 추간판 구조와 유사하게, 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)와 신경세포챔버(180) 사이에 배치된다. 이때, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)의 내측에는 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)가 배치되고, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)의 외측에는 신경세포챔버(180)가 배치된다. 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)는 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)와 소정의 간격만큼 이격되어, 방사형으로 배치된다.
제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)는 각각 섬유륜세포가 동일한 조건으로 배양된다. 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e) 내의 섬유륜은 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)로부터 분비된 염증매개물과 염증반응을 하여 염증매개물을 분비하고, 이를 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)에 각각 연결된 제 2a 채널부(171a) 내지 제 2e 채널부(171e)를 통해 신경세포챔버(180)로 제공하는 구조를 가진다.
구체적으로, 제 1 섬유륜챔버(170a)는 제 1a 채널부(160a)에 의해 제 1 수핵챔버(150a)에 연결되고, 제 2a 채널부(171a)에 의해 신경세포챔버(180)에 연결된다. 제 1 섬유륜챔버(170a)의 내측에는 제 1 수핵세포가 배치되고, 제 1 섬유륜챔버(170a)의 외측에는 신경세포챔버(180)가 배치된다. 이때, 제 1 섬유륜챔버(170a)의 면적은 제 1 수핵챔버(150a)의 면적보다 큰 면적을 가진다.
이와 동일한 구조로, 제 2 섬유륜챔버(170b)가 제 1b 채널부(160b)에 의해 제 2 수핵챔버(150b)에 연결되고 제 2b 채널부(171b)에 의해 신경세포챔버(180)에 연결되고, 제 3 섬유륜챔버(170c)가 제 1c 채널부(160c)에 의해 제 3 수핵챔버(150c)에 연결되고 제 2c 채널부(171c)에 의해 신경세포챔버(180)에 연결되며, 제 4 섬유륜챔버(170d)가 제 1d 채널부(160d)에 의해 제 4 수핵챔버(150d)에 연결되고, 제 2d 채널부(171d)에 의해 신경세포챔버(180)에 연결되고, 제 5 섬유륜챔버(170e)가 제 1e 채널부(160e)에 의해 제 5 수핵챔버(150e)에 연결되고, 제 2e 채널부(171e)에 의해 신경세포챔버(180)에 연결된다.
본 실시예에서, 제 1a 채널부(160a) 내지 제 1e 채널부(160e)는 연결위치에 따라 제 1 채널부를 구분하여 지칭한 것이다. 제 1a 채널부(160a) 내지 제 1e 채널부(160e)는 그 구조, 기능 및 연결관계가 상호 간에 동일한 패턴을 가지는 바, 이하에서는 설명의 반복을 피하기 위하여 제 1a 채널부(160a)에 대해 설명하기로 한다.
그리고, 제 2a 채널부(171a) 내지 제 2e 채널부(171e)는 연결위치에 따라 제 2 채널부(171a, 171b, 171c, 171d, 171e)를 구분하여 지칭한 것이다. 제 2a 채널부(171a) 내지 제 2e 채널부(171e)는 그 구조, 기능 및 연결관계가 상호 간에 동일한 패턴을 가지는 바, 이하에서는 설명의 반복을 피하기 위하여 제 2a 채널부(171a)에 대해 설명하기로 한다.
도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 제 1a 채널부(160a)는 제 1 수핵챔버(150a)와 제 1 섬유륜챔버(170a)를 연결하는 채널이다. 제 1a 채널부(160a)는 제 1 농도구배채널(140a), 제 2a 채널부(171a), 제 3 채널부(172a)와 제 4 채널부(182a)와 같은 마이크로 채널 구조가 아니라, 제 1 수핵챔버(150a)에서 배양되는 수핵세포의 일부와 제 1 섬유륜챔버(170a)에서 배양되는 섬유륜세포의 일부가 접촉가능한 크기를 가진다. 이때, 제 1a 채널부(160a)의 통로간격은 제 1 수핵챔버(150a)에서 배양된 수핵이 제 1 섬유륜챔버(170a)로 전부 유출되지 않을 정도의 크기를 가진 것이 바람직하다.
제 1a 채널부(160a)는 수핵과 섬유륜이 공존하는 공간이다. 제 1a 채널부(160a)는 농도구배부를 통해 제 1 수핵챔버(150a)로 유입된 염증전구물질(A)이 보다 균일하게 제 1 섬유륜챔버(170a)로 제공될 수 있도록, 제 1a 채널부(160a)에는 복수의 통로격벽(161)이 존재한다. 여기서, 복수의 통로격벽(161)은 제 1a 채널부(160a)의 통로간격을 구획하기 위한 부재이다. 복수의 통로격벽(161)은 제 1a 채널부(160a)의 통로간격이 0.8mm정도의 크기로 구획하기 위함이다.
제 2a 채널부(171a)는 제 1 섬유륜챔버(170a)와 신경세포챔버(180)를 연결한다. 제 2a 채널부(171a)는 제 1 섬유륜챔버(170a)에서 제 1 수핵챔버(150a)로부터 제공된 염증매개물과 섬유륜과의 염증반응시 분비된 염증매개물이 신경세포챔버(180)로 제공되는 통로이다.
제 2a 채널부(171a)에는 제 3 채널부(172a)가 연결된다. 제 3 채널부(172a)는 제 2a 채널부(171a)와 콜라겐챔버(173a)를 연결하는 통로이다. 여기서, 콜라겐챔버(173a, 173b, 173c, 173d, 173e)에는 콜라겐겔이 수용된다.
제 2a 채널부(171a)에는 제 3 채널부(172a)에서 제공된 콜라겐겔이 채워진다. 이러한 콜라겔겔은 제 2a 채널부(171a)의 통로간격 사이에 발생된 표면장력에 의해 제 2a 채널부(171a)의 내부에 콜라겐층을 형성한다. 콜라겐층은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 환경을 조성하기 위한 것이다.
제 2a 채널부(171a)는 제 1a 채널부(160a)와 달리 마이크로 채널구조를 가진다. 제 2a 채널부(171a)의 통로간격은 콜라겐층이 형성될 수 있는 정도의 마이크로 크기면 족하다.
이는, 제 2a 채널부(171a)의 통로간격이 적정 정도(예를 들어, 배양플레이트(110)의 크기가 50mm×70mm일 때, 225㎛)보다 큰 경우에는 제 2a 채널부(171a)에 표면장력이 충분히 생기지 않아 제 3 채널부(172a)에서 유입되는 콜라겐겔이 제 1 섬유륜챔버(170a) 또는 신경세포챔버(180)로 빠져나갈 우려가 있기 때문이다.
이때, 제 2a 채널부(171a)에 연결된 제 3 채널부(172a)의 통로간격은 제 2a 채널부(171a)의 통로간격보다 작은 200㎛ 정도의 간격을 가질 수 있는데, 이는 예시적인 수치이며, 배양플레이트(110)의 크기 증감에 따라 수치가 증감될 수 있다.
한편, 신경세포챔버(180)는 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)의 외측에서, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)를 둘러싸도록 배치된다. 신경세포챔버(180)는 제 2a 채널부(171a)에 의해 제 1 섬유륜챔버(170a)에 연결되고, 제 2b 채널부(171b)에 의해 제 2 섬유륜챔버(170b)에 연결되며, 제 2c 채널부(171c)에 의해 제 3 섬유륜챔버(170c)에 연결되고, 제 2d 채널부(171d)에 의해 제 4 섬유륜챔버(170d)에 연결되며, 제 2e 채널부(171e)에 의해 제 5 섬유륜챔버(170e)에 연결된다.
신경세포챔버(180)는 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e) 및 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)처럼 상호 간에 개별적으로 연결된 구조와 달리, 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)가 한 개의 신경세포챔버(180)에 연결되는 통합형 구조를 가진다.
이는, 신경세포챔버(180)가 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e) 및 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 같은 농도구배지역과 달리 직접적으로 염증 농도에 영향을 받지 않는 구역으로서, 즉, 수핵과 섬유륜의 염증전구물질(A)과의 상호 작용으로 형성된 싸이토카인만 전달되기 때문이다. 신경세포챔버(180)는 통합형 구조를 가짐에 따라, 신경세포의 배양 및 유지를 보다 용이하게 할 수 있다.
신경세포챔버(180)에는 배양물질투입챔버(181a)가 제 4 채널부(182a)에 의해 연결된다. 여기서, 배양물질투입챔버(181a)는 신경세포배양물질이 투입되는 부분이다. 배양물질투입챔버(181a)는 신경세포챔버(180)의 양측에 마련된다. 제 4 채널부(182a)는 마이크로 채널구조를 가진 채널로서, 배양물질투입챔버(181a)로 제공된 신경세포배양물질을 신경세포챔버(180)로 제공하는 통로이다.
본 실시예에서, 배양플레이트(110)는 70mm×50mm의 크기로 제작되고, 이때, 제 1 수핵챔버 내지 제 5 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e)는 각각 7.6mm×5mm의 면적을 가지고, 제 1 섬유륜챔버 내지 제 5 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)는 9.3mm×5mm의 면적을 가진다. 이때, 제 1 채널부의 통로격벽(161)의 통로간격은 0.8mm이고, 제 2 채널부의 통로간격은 225㎛, 제 3 채널부의 통로간격은 200㎛이며, 콜라겐챔버는 직경 2mm를 가진 원형 면적을 가지도록 제작된다.
이하에서는 도 4 내지 도 9을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치(100)를 이용한 추간판의 염증반응에 대한 실험은 다음과 같이 진행될 수 있다.
우선, 제 1 수핵챔버(150a) 내지 제 5 수핵챔버(150e)는 동일한 조건을 가진 수핵세포가 배양되고, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내지 제 5 섬유륜챔버(170e)에는 동일한 조건을 가진 섬유륜세포가 배양된다. 그리고, 신경세포챔버(180)에는 배양물질투입챔버(181a)에서 투입된 신경세포배양물질이 배양된 상태이다.
제 1 투입구(121)를 통해 염증전구물질(A)이 투입되고, 제 2 투입구(122)를 통해 완충용액(B)이 투입된다. 이때, 염증전구물질(A)은 제 1 투입채널(123)을 통해 농도구배부(130)로 유입되고, 완충용액(B)은 제 2 투입채널(124)을 통해 농도구배부(130)로 유입된다. 농도구배부(130)로 유입된 염증전구물질(A)과 완충용액(B)은 농도구배부(130)를 통과하면서, 염증전구물질(A)을 기준으로 100%, 50%, 25%, 12.5% 및 0% 비율로 농도구배된다.
이때, 100%의 염증전구물질(A)은 제 1 농도구배채널(140a)을 통해 제 1 수핵챔버(150a)로 유입되고, 50%의 염증전구물질(A)은 제 2 농도구배채널(140b)을 통해 제 2 수핵챔버(150b)로 유입되며, 25%의 염증전구물질(A)은 제 3 농도구배채널(140c)을 통해 제 3 수핵챔버(150c)로 유입되고, 12.5%의 염증전구물질(A)은 제 4 농도구배채널(140d)을 통해 제 4 수핵챔버(150d)로 유입되며, 0%의 완충용액(B)은 제 5 농도구배채널(140e)을 통해 제 5 수핵챔버(150e)로 유입되어, 각각의 수핵챔버 내의 수핵과 염증반응하면서 염증매개물을 분비한다. 이때, 염증매개물은 염증전구물질(A)의 농도가 증가할수록 분비되는 양이 상대적으로 증가한다.
제 1 수핵챔버(150a)에서 분비된 염증매개물은 제 1a 채널부(160a)를 통해 제 1 섬유륜챔버(170a)로 제공되어, 제 1 섬유륜챔버(170a) 내의 섬유륜과 염증반응을 일으키면서 염증매개물을 분비한다. 상기와 같은 과정에서 발생된 염증매개물은 제 2a 채널부(171a)를 통해 신경세포챔버(180)로 제공되어, 신경세포를 자극하게 된다. 이때, 제 2a 채널부(171a)를 통해 신경세포챔버(180)로 전달되는 물질은 염증전구물질(A)과의 상호 작용에 의해 발생된 싸이토카인에 한정되고, 섬유륜은 제 2a 채널부(171a)에 형성된 콜라겐층에 의해 신경세포챔버(180)로의 이동이 차단된다.
신경세포는 싸이토카인의 자극에 의해 신경세포챔버(180)에서 섬유륜챔버방향으로, 즉, 섬유륜을 지나 수핵으로 내성장하게 되면서, 인체에 통증을 유발시킨다. 신경세포의 내성장은 후두편평세포암종(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 케모카인(chemokine) 인 인터류킨8(IL-8)과 같은 물질에 의할 수 있다.
신경세포는 염증전구물질(A)의 농도변화에 따라 내성장정도가 달라지게 된다. 즉, 신경세포는 염증전구물질(A)의 농도변화에 따라 각각의 섬유륜챔버 내의 섬유륜이 수핵챔버방향으로 움직이는 속도, 섬유륜세포의 수지상세포의 길이 등이 변하게 된다. 이는 도 6 내지 도 9에 개시된 실험그래프를 통해 알 수 있다.
도 6은 염증전구물질(A)의 농도-섬유륜의 움직이는 속도에 관한 실험그래프이고, 도 7은 염증전구물질(A)의 농도-섬유륜의 세포면적변화 그래프이고, 도 8은 염증전구물질(A)의 농도-섬유륜세포의 다리길이(Dendritic length)에 대한 변화그래프이고, 도 9은 염증전구물질(A)의 농도-세포성장비율 그래프이다.
도 6에 도시된 그래프에 따르면, 염증전구물질(A)이 0%이고 완충용액(B)만 제공된 경우와, 12.5%의 농도를 가진 염증전구물질(A)이 제공된 경우에는 섬유륜이 움직이는 속도변화가 거의 미비함을 알 수 있다. 반면, 25%이상의 농도를 가진 염증전구물질(A)이 제공되는 경우에는 염증매개물에 의해 섬유륜세포가 움직이는 속도가 활발히 진행됨을 알 수 있다.
도 7의 그래프에 따르면, 완충용액(B)만 투입된 경우를 기준으로 볼 때, 염증전구물질(A)이 투입된 초기환경에서는 염증전구물질(A)의 농도에 크게 영향을 받지 않고 섬유륜의 세포면적변화가 크지 않으나, 일정시간 경과후에는 섬유륜의 세포면적변화가 가시적으로 나타남을 알 수 있고, 24시간 후에는 완충용액(B)만 투입된 경우와 100%의 염증전구물질(A)이 투입된 경우의 실험데이터에 큰 차이를 보이고 있는 것으로 알 수 있습니다.
도 8에는 섬유륜세포의 염증반응시 섬유륜세포의 몸체에서 나오는 다리길이(dendritic length) 변화가 개시되어 있다. 염증전구물질(A)이 투입되면, 섬유륜세포의 몸체에서 다리가 나오게 되고, 섬유륜세포에서 연장된 다리에 의해 섬유륜세포의 움직임이 빨라지게 된다.
도 8에 도시된 바에 따르면, 염증전구물질(A)의 농도가 25%일 때 섬유륜세포에서 나오는 다리의 길이가, 염증전구물질(A)의 농도가 12.5% 이하일 때 섬유륜세포에서 나오는 다리길이보다 현저히 짧음을 알 수 있고, 이로부터, 25%이상의 염증전구물질(A)의 농도에서 염증반응이 활발하게 나타남을 알 수 있다.
한편, 도 9의 그래프는 염증전구물질(A)의 농도에 따른 세포성장비율을 나타낸 그래프인데, 완충용액(B)만 투입된 경우를 기준으로 볼 때, 염증전구물질(A)의 농도가 12.5%, 25%, 50% 및 100%로 증가할수록 추세선이 변함을 알 수 있다. 도 9의 그래프에서 점선은 각각의 농도에서 측정한 세포의 성장비율을 나타낸 것이고, 실선은 농도변화에 따른 세포의 성장비율에 대한 추세선을 나타낸 것이다.
도 9을 통해 알 수 있듯이, 염증전구물질(A)의 농도가 100%일 때, 세포 생장이 가장 저하가 되어 있기 때문에 염증이 가장 심각한 상태에 있음을 알 수 있고, 도 6에 개시된 섬유륜세포가 움직이는 속도(velocity)와 이하 도 8에 개시된 섬유륜세포의 다리길이(dendritic length) 변화에도 염증전구물질(A)의 농도가 25% 이상의 모든 데이터에서 염증반응이 충분히 일어났다고 가정했을 때, 세포 생장정도를 고려하여 염증 농도 100%일 때가 염증환경에 적합함을 알 수 있습니다.
상기의 그래프를 통해 알 수 있듯이, 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치(100)는 인체의 추간판과 유사한 추간판 구조를 배양플레이트(110)에 복수 개로 구현하고, 복수의 추간판 구조를 동일한 평면 상에 구현하여, 염증전구물질(A)의 농도변화에 따른 수핵과 섬유륜의 염증변화, 신경세포의 자극시 섬유륜의 변화 등을 동시에 실시간으로 파악할 수 있어, 요통이 발병기전 연구를 보다 효율적으로 할 수 있도록 도움을 줄 수 있다.
아울러, 본 발명은 배양플레이트(110)에 대식세포, 신경세포, 섬유륜세포와 신경세포를 배양하여, 복수의 수핵챔버(150a, 150b, 150c, 150d, 150e), 복수의 섬유륜챔버(170a, 170b, 170c, 170d, 170e)와 신경세포챔버(180)를 통해 인체의 추간판과 유사하게 추간판 구조를 모사(micromimic)함으로써, 단지 염증전구물질(A)과 수핵, 섬유륜과의 반응시 발생되는 염증매개물 외에, 대식세포가 염증전구물질(A)과의 반응시 발생되는 다양한 염증매개물이 염증전구물질(A)과 더불어 수핵, 섬유륜과의 염증반응을 유도할 수 있고, 이에 따라 농도구배 미세유체칩장치(100)를 이용한 실험데이터의 신뢰성을 증대시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 일 실시예에 따른 농도구배 미세유체칩장치(110)는 염증전구물질의 농도구배가 필요하지 않은 경우에는, 농도구배부(130) 및 농도구배채널(140a, 140b, 140c, 140d, 140e)이 필요치 않아, 농도구배부(130)가 투입부(120)와 수핵챔버 사이에 반드시 구비될 필요는 없다. 이경우, 상술한 것과 달리, 하나의 수핵챔버, 하나의 섬유륜챔버와 하나의 신경세포챔버가 상호간에 연결되어 추간판 구조를 형성할 수도 있다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.
100: 농도구배 미세유체칩장치 110: 배양플레이트
120: 투입부 121: 제 1 투입구
122: 제 2 투입구 123: 제 1 투입채널
124: 제 2 투입채널 130: 농도구배부
140a, 140b, 140c, 140d, 140e: 농도구배채널
150a, 150b, 150c, 150d, 150e: 수핵챔버
160a, 160b, 160c, 160d, 160e: 제 1 채널부
170a, 170b, 170c, 170d, 170e: 섬유륜챔버
171a, 171b, 171c, 171d, 171e: 제 2 채널부
172a: 제 3 채널부
173a, 173b, 173c, 173d, 173e: 콜라겐챔버
180: 신경세포챔버
181a : 배양물질투입챔버
182a: 제 4 채널부

Claims (10)

  1. 수핵이 배양되는 수핵챔버, 섬유륜이 배양되는 섬유륜챔버와 신경세포가 배양되는 신경세포챔버가 동일평면 상에서 일측에서 타측방향으로 순차적으로 배치된 배양플레이트;
    염증전구물질이 투입되는 제 1 투입구와 완충용액이 투입되는 제 2 투입구가 상기 배양플레이트의 일측에서 상호 간에 이격되어, 상기 수핵챔버에 각각 연결된 투입부;
    상기 수핵챔버와 상기 섬유륜챔버를 각각 연결하고, 상기 수핵과 상기 섬유륜이 물리적으로 접촉되는 제 1 채널부; 및
    상기 섬유륜챔버와 상기 신경세포챔버를 연결하는 제 2 채널부를 포함하는 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 제 2 채널부에는 제 3 채널부가 연결되고,
    상기 제 3 채널부는 콜라겐챔버와 상기 제 2 채널부 사이에 연결되어, 상기 제 2 채널부로 콜라겐겔을 제공하는 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 제 2 채널부는 상기 콜라겐겔이 콜라겐층을 형성할 수 있는 마이크로 채널이고, 상기 콜라겐층은 상기 제 2 채널부에서 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 환경을 조성하는 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양플레이트에는 복수의 수핵챔버와 복수의 섬유륜챔버가 복수의 제 1 채널부에 의해 각각 연결되고,
    상기 복수의 섬유륜챔버는 복수의 제 2 채널부에 의해 상기 신경세포챔버에 연결되는 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 투입부와 복수의 수핵챔버 사이에는 농도구배부가 배치되고,
    상기 농도구배부는 상기 투입부에서 제공된 상기 염증전구물질과 상기 완충용액의 혼합에 의해 상기 염증전구물질의 농도를 구배하고, 복수의 농도구배채널에 의해 농도구배된 상기 염증전구물질을 상기 복수의 수핵챔버로 제공하는 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 복수의 수핵챔버, 상기 복수의 섬유륜챔버와 상기 신경세포챔버는 상기 농도구배부를 중심으로 상호 간에 소정의 간격으로 순차적으로 이격되고 방사형으로 배치된 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 농도구배채널은 상기 농도구배부와 상기 복수의 수핵챔버 사이에서, 방사형으로 패턴화된 마이크로 채널인 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 신경세포챔버에는 신경세포배양물질이 투입되는 배양물질투입챔버가 제 4 채널부에 의해 연결되고,
    상기 제 4 채널부는 마이크로채널 구조를 가진 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 배양플레이트는 PDMS(polydimethylsiloxane stamp) 재질인 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 염증전구물질은 인터류킨-1베타(Interleukin-1beta, IL-1b) 또는 종양괴사인자-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 같은 사이토카인(cytokine)인 것을 특징으로 하는 농도구배 미세유체칩장치.
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