CN108289930A - 用于治疗神经退行性和神经炎性病症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于诊断或治疗神经退行性或神经炎性病症的方法、组合物和试剂盒。本发明还提供用于鉴定神经退行性或神经炎性病症的调节剂的方法。

Description

用于治疗神经退行性和神经炎性病症的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月10日提交的美国临时申请62/191,173的权益，该申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明技术通常涉及用于诊断和治疗神经退行性和神经炎性病症的方法和组合物，以及用于鉴定用于治疗和预防的方法的神经退行性或神经炎性病症的调节剂的方法。
背景技术
诸如神经退行性疾病和神经炎性病症的脑部疾病是影响一大部分人群的破坏性病症。许多目前无法治愈，极度衰弱，并且随着时间推移经常导致脑结构和功能累进性恶化。由于全球老龄化人口日益增多，疾病发病率也在快速增加，因为老年人处于发展这些病症的高风险之中。目前，由于对这些疾病的病理生理学的理解有限，许多神经退行性疾病和神经炎性病症难以诊断。同时，目前的治疗无效，并且不能满足市场需求；由于人口老龄化，每年的需求量显著增加。例如：阿尔茨海默氏病(AD)的显著特点是学习和记忆逐渐但累进性下降，并且是老年人死亡的主要原因。目前全世界估计有3500万人患有这种疾病，但是因为预期寿命变长，预计到2050年这一数字将显著上升至1亿人。没有疗法；并且该疾病的病理生理机制还比较陌生。只有四种FDA批准可用于AD患者的药物，但这些药物只能缓解症状，而不改变疾病病理(不能逆转病症或防止进一步恶化)，并且在严重病症下无效。因此，早期治疗干预在AD的管理中至关重要。研究已经证实，早在记忆丧失或认知下降的实际症状实际出现之前很久AD就影响了大脑。然而，还没有用于早期检测的诊断工具，且当患者使用目前的方法诊断出患有AD时，其涉及主观临床评估，病理症状已经处于晚期状态。轻度认知损伤(MCI)被认为是AD的前驱阶段。因此，鉴定个体患有MCI的诊断工具对于AD管理至关重要。
帕金森氏病(PD)是AD后世界上第二大流行的神经退行性疾病。PD是一种主要影响运动系统的神经退行性病症。这种疾病的运动症状是由于黑质(中脑的一个区域)中的多巴胺产生细胞死亡所致。最明显的疾病症状是运动相关的，包括颤抖、僵硬、运动缓慢及步行和步态困难。随着疾病的发展，思维和行为受到影响，痴呆症通常发生在疾病的晚期阶段。抑郁症是与该疾病相关的最常见的精神症状。该疾病的主要病理学标志是α-突触核蛋白积聚到神经元中称为路易体(Lewy body)的内含物中，以及黑质中的多巴胺产生细胞死亡。目前，PD是通过包括震颤、运动迟缓、僵硬和姿势失衡的临床症状来诊断的，因为还没有可靠的诊断试验或PD的标志物。据估计，全世界约有700万人患有PD。另外，由于人口老龄化，预计病例数量会显著增长。在美国，预测PD患者的数量会增加近一倍；但诸如中国的亚洲发展中国家将出现最快的增长率，预测到2030年估计将达到500万例。然而，PD的实际发病率难以评估，因为由于诊断方法的局限性，通常直到疾病发展到晚期状态才诊断出该疾病。
多发性硬化症(MS)是一种炎性退行性疾病，其中保护中枢神经系统(CNS)的脑和脊髓中的神经细胞的髓鞘受到免疫系统攻击并受损，从而阻止CNS内的神经细胞通信。这种疾病通过各种症状表征，这些症状包括视力模糊、失去平衡、不协调、言语不清、震颤、麻木、极度疲劳、记忆和注意力的问题、麻痹和失明。目前还不知道MS的疗法，而临床干预旨在改善发作后的功能并且防止新的发作。然而，目前的药物是中等有效的并且具有不利的副作用。据估计，全世界约有230万人受到MS的影响。然而，MS通常基于体征和症状进行诊断，并且即使与支持医学成像和实验室试验相组合，诊断也是困难的。在症状不可见或与其他医学病症类似的早期阶段尤其如此。
其他神经退行性和神经炎性病症包括抑郁症、中风、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s disease)、视网膜退行性疾病如青光眼年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病、由于神经退化引起的听力损失、创伤性脑损伤、和脊髓损伤、以及其他神经炎性病症，诸如急性播散性脑脊髓炎、视神经炎横断性脊髓炎灰质炎后遗症、多灶性运动神经病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。随着神经退行性和神经炎性疾病和病症的发病率升高以及其对特别是老年人的人类健康的重大影响，迫切需要为脑病的诊断、管理和治疗开发出新的且有效的策略。
本发明技术通过利用细胞因子白细胞介素-33(IL-33)及其负调控剂可溶性ST2(sST2)来满足这种需要。IL-33是IL-1家族的成员，其包括IL-1α、IL-1β和IL-18。白细胞介素是免疫系统的重要组分，并且在免疫反应中起关键作用。IL-33mRNA在人类和小鼠的各种器官(例如，中枢神经系统、肺和皮肤)和细胞类型(例如，成纤维细胞、巨噬细胞和神经胶质细胞)中表达(Liew,F.Y.,Pitman,N.I.和McInnes,I.B.Nature Reviews Immunology 10,103-110(2010))。全长IL-33具有生物学活性，但定位在其发挥转录调控的细胞核中(Moussion,C.,Ortega,N.和Girard,J.P.PLoS One 3,e3331(2008))，同时其可以通过在接受损伤刺激后释放到细胞外空间中而充当传统的细胞因子(Cayrol,C.和Girard,J.P.ProcNatl Acad Sci U S A 106,9021-9026(2009))。在细胞核中，IL-33通过结合核小体的组蛋白H2A-H2B复合物来调节染色质构造(Roussel,L.,Erard,M.,Cayrol,C.和Girard,J.P.EMBO Rep 9,1006-1012(2008))，或与转录因子NF-κB相关以压制其转录活性。IL-33在其他蛋白酶的存在下被半胱天冬酶-1裂解。除了半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-7和半胱天冬酶-3以外，钙蛋白酶也介导IL-33裂解。然而，IL-33的裂解产物是没有生物学活性的(LüthiAU,Cullen SP,McNeela EA,Duriez PJ,Afonina IS,Sheridan C,Brumatti G,Taylor RC,Kersse K,Vandenabeele P,Lavelle EC,Martin SJ.Immunity3,84-98(2009))。在组织损伤或坏死时，IL-33从细胞核中释放以触发其他细胞中的炎性反应(Liew,F.Y.,Pitman,N.I.和McInnes,I.B.Nature Reviews Immunology 10,103-110(2010))。
释放的IL-33的特异性受体是ST2(也称为IL-1RL1)。在与ST2受体结合后，IL-33诱导白细胞介素-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)(Chackerian,A.A.等，J Immunol 179,2551-2555(2007))募集到ST2受体并形成异二聚体，以引发下游信号传导级联。鉴定出了若干下游信号传导途径，例如MyD88/IRAK/TRAF6、PI3K/Akt/mTOR、Syk/PLCγ或JAK/STAT途径。一种或多种信号传导途径的激活取决于细胞类型和炎性病症(Martin,M.U.Semin Immunol25,449-457(2013))。ST2决定着IL-33信号传导的特异性。ST2基因通过另选的剪接编码不同的同种型：全长形式(ST2L)、分泌的可溶形式(sST2)和变体形式(ST2V)(Miller,A.M.,JInflamm(Lond)8,22(2011))。sST2充当IL-33的诱饵受体以抑制IL-33/ST2信号传导的激活(Hayakawa,H.,Hayakawa,M.,Kume,A.和Tominaga,S.J Biol Chem 282,26369-26380(2007))。在与受体复合物结合后，IL-33募集髓样分化原代反应蛋白88、IL-1受体相关激酶1(IRAK1)和IRAK4复合物以刺激促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)激酶和转录因子核因子-κB(NF-κB)的信号传导。这两种途径介导相应细胞类型的不同细胞因子和趋化因子的生成(Liew,F.Y.,Pitman,N.I.和McInnes,I.B,Nature Reviews Immunology10,103-110(2010))。
IL-33在疾病中起双重作用。首先，它具有重要的抗感染的保护功能。感染流感病毒的小鼠在IL-33治疗后表现出肺部炎症和病理学减少(Liew,F.Y.,Pitman,N.I.和McInnes.I.B.Nature Reviews Immunology 10,103-110(2010))。IL-33mRNA水平在抗鼠鞭虫小鼠的结肠中升高(Humphreys等，Journal of immunology 180,2443-2449(2008))。相比之下，IL-33通过诱导在Th2细胞和其他先天性免疫细胞中的细胞因子生成来促进包括哮喘、特应性皮炎和过敏反应的T辅助细胞2(Th2)细胞相关疾病的发病机理(Kakkar,R.和Lee,R.T.Nature reviews Drug discovery 7,827-840(2008))。例如，哮喘患者具有较高的IL-33表达水平；一致地，IL-33施用加剧哮喘小鼠模型中的哮喘病理学。有趣地，IL-33的三种单核苷酸多态性(SNP)与高加索人群中的AD相关(Chapuis等，Mol Psychiatry 14,1004-1016(2009))。一种SNP(rs1179633)与中国人群中的迟发型阿尔茨海默氏病密切相关(Yu等，Neurobiology of aging 33,1014e1011-1014(2012))。IL-33参与AD中的另外证据来自人AD脑中IL-33mRNA表达减少的发现(Chapuis等，Mol Psychiatry 14,1004-1016(2009))。还有证据表明IL-33和ST2-阳性细胞在AD患者的内嗅皮质中显著增加，尽管这仍然是有争议的。另外，IL-33和ST2与淀粉样斑块和神经原纤维缠结在AD患者的脑中共定位。在聚集体中，尽管在AD脑中mRNA和蛋白质表达之间存在差异，但这些发现提出IL-33/ST2信号传导的调控在AD病理学中是重要的。
发明内容
在一些方面，本公开内容提供了一种用于治疗或降低在有需要的受试者中的神经退化的风险的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含IL-33的组合物。
在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症或者处于患阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症的风险之中。在一些实施方案中，组合物经皮下、腹膜内、静脉内、皮内、脑室内、鞘内、口服、吸入、透皮或透粘膜施用。
在一些实施方案中，组合物与一种或多种另外的治疗活性剂共同施用。在一些实施方案中，这一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐(donepezil)、利斯的明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine)、美金刚(memantine)、阿杜单抗(aducanumab)、罗格列酮(rosiglitazone)、贝沙罗汀(bexarotene)、氯沙坦(losartan)和钩藤碱(rhynchophylline)。
在一些实施方案中，IL-33是重组IL-33蛋白。在一些实施方案中，IL-33重组蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的多肽和与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的多肽。
在一些方面，本公开提供一种用于确定受试者中神经退化的风险的方法，其包括：(a)确定取自受试者的生物学样品中分泌的可溶性ST2(sST2)水平；(b)对sST2水平与标准对照进行比较；以及(c)当在步骤(a)中获得的sST2水平大于标准对照时，确定受试者具有增加的神经退化的风险。在一些实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆或脑脊髓液(CSF)样品。在一些实施方案中，步骤(a)包括使用抗sST2的抗体的免疫学测定。
在一些方面，本公开提供一种用于鉴定神经退化的调节剂的方法，其包括：(a)在容许IL-33/ST2L结合或IL-33/sST2结合的条件下，使候选试剂与IL-33和全长ST2(ST2L)或sST2接触；(b)检测IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平；以及(c)当步骤(b)中获得的IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平大于或小于在相同条件下但在缺乏候选试剂的情况下的IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平时鉴定该候选试剂为神经退化的调节剂。在一些实施方案中，步骤(a)包括体外蛋白质结合测定。在一些实施方案中，步骤(a)包括在表达ST2L的细胞的表面上的蛋白质结合测定。
在一些方面，本公开提供一种用于治疗或抑制受试者中的神经退化的药物，其包含：有效量的IL-33和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，该药物还包含一种或多种另外的治疗活性剂。在一些实施方案中，这一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱。
在一些实施方案中，将药物配制成用于皮下、透皮、皮内、透粘膜、肌内、静脉内、腹膜内、颅内、脑室内、鞘内、局部或口服施用。在一些实施方案中，将药物配制成用于皮下施用。
在一些方面，本公开提供一种用于确定受试者中的神经退化的风险的试剂盒，其包含(1)用于确定取自受试者的生物学样品中的sST2水平的试剂；和(2)标准对照，其指示取自未患神经退化并且并未处于患神经退化的风险中的受试者的相同类型的生物学样品中的sST2水平。在一些实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆或CSF样品。在一些实施方案中，试剂是对sST2具有特异性的抗体。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于确定神经退化的风险的说明手册。
在一些方面，本公开提供一种用于检测受试者中分泌的可溶性ST2(sST2)的方法，其包括：(a)通过使取自受试者的生物学样品与抗-ST2抗体接触并检测在sST2与抗体之间的结合来检测样品中的sST2水平；和(b)对sST2水平与标准对照进行比较。在一些实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆或脑脊髓液(CSF)样品。在一些实施方案中，步骤(a)包括使用抗sST2的抗体的免疫学测定。
在一些方面，本公开提供一种用于增加有需要的受试者中Aβ受体的转录的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含IL-33的组合物。在一些实施方案中，Aβ受体包括选自Toll样受体2(TLR2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)的受体。在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症或者处于患阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症的风险之中。在一些实施方案中，组合物经皮下、腹膜内、静脉内、皮内、脑室内、鞘内、口服、吸入、透皮或透粘膜施用。
在一些实施方案中，组合物与一种或多种另外的治疗活性剂共同施用。在一些实施方案中，这一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱。
在一些实施方案中，IL-33是重组IL-33蛋白。在一些实施方案中，IL-33重组蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的多肽和与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的多肽。
在一些方面，本公开提供一种用于确定受试者中神经退化的风险的方法，其包括：(a)确定取自受试者的生物学样品中分泌的可溶性ST2(sST2)水平；(b)对sST2水平与标准对照进行比较；(c)当在步骤(a)中获得的sST2水平大于标准对照时，确定受试者具有增加的神经退化的风险；(d)确定ST2的遗传变体，并将数据与取自受试者的生物学样品中的sST2水平组合；(e)对sST2水平与同生群内的标准对照进行比较；和(f)当步骤(d)中获得的sST2水平大于标准对照时，确定受试者具有增加的神经退化的风险。
附图说明
图1A-1B显示IL-33挽救APP/PS1突变小鼠中的LTP损伤。约7.5月龄的WT和APP/PS1小鼠通过腹膜内注射(i.p.)施用小鼠IL-33(IL-33；200ng)或对照媒介物(Con)2天。图1A显示基线归一化场兴奋性突触后电位(fEPSP；平均值±SEM)的平均斜率。显示在(1)LTP诱导(箭头)之前5分钟和在(2)LTP诱导(箭头)之后55分钟的迹线记录。插入迹线是在(灰色)高频刺激(HFS)之前和(黑色)高频刺激(HFS)之后记录的fEPSP的实例。图1B显示在LTP诱导后记录的最后10分钟期间的平均fEPSP斜率的量化。WT，对照(Con)＝8个脑，16个切片；WT，IL-33＝8个脑，17个切片；APP/PS1，Con＝8个脑，18个切片；APP/PS1，IL-33＝8个脑，18个切片。***p<0.001，双因素ANOVA，随后是邦弗朗尼(Bonferroni)事后检验。
图2A-2C显示IL-33减轻APP/PS1小鼠的行为缺陷。图2A是显示IL-33施用(腹膜内)的时间线和包括开场(OF)和筑巢(NB)试验的行为实验的示意图。图2B显示IL-33治疗的APP/PS1小鼠(约14月龄)在OF试验中显示改善的习惯化。允许对小鼠施用IL-33或对照媒介物(Con)以探究如图2A中安排的新舞台；每次训练项目持续15分钟。图2B显示在每次训练项目内行进的总距离。每个实验组n＝7只小鼠，不同的是对于APP/PS1中的Con，n＝6只小鼠。在第3天，*p<0.05，双因素重复测量ANOVA，随后是邦弗朗尼事后。图2C显示IL-33治疗的APP/PS1小鼠表现出比Con APP/PS1小鼠好的筑巢性能。对筑巢活性进行评估并评分。n＝4。
图3A-3B显示sST2衰减由IL-33引起的淀粉样斑块沉积的减少。图3A是在输注sST2的APP/PS1小鼠(10月龄)中施用IL-33(腹膜内)2天后淀粉样斑块沉积的DAB染色的代表性图像。在IL-33或DPBS(Con)注射后在APP/PS1小鼠的皮质中的Aβ沉积使用DAB试剂盒通过抗-Aβ抗体(4G8)免疫染色。比例尺＝250μm。图3B显示皮质中斑块数量的量化。数据以平均值±SEM提供(n＝6只小鼠/条件；*p<0.05，学生t检验)。
图4A-4B显示IL-33降低APP/PS1小鼠中的可溶性Aβ含量。对约10月龄的APP/PS1小鼠施用(腹膜内)IL-33两天。通过ELISA定量分析皮质匀浆中可溶性部分(图4A，DEA提取)和不溶性部分(图4B，甲酸提取)中的Aβx–40和Aβx–42水平[与Con比较的倍数变化；n＝4只小鼠，**p<0.01，学生t检验]。
图5A-5C显示IL-33增强小胶质细胞和Aβ共定位。通过腹膜内注射用IL-33治疗APP/PS1小鼠2天。图5A展示显示在对照媒介物(Con)或IL-33治疗的APP/PS1小鼠的皮质中的Aβ、Iba1和Hoechst标记的代表性投影共焦图像。图5B展示显示在Aβ斑块和小胶质细胞之间的详细相互作用的使用Imaris图像分析软件进行的三维重建。构建共定位通道(以白色显示)，由此Aβ斑块和小胶质细胞(Iba1)体积共定位在每个共焦堆栈中。图5C显示与小胶质细胞共定位的Aβ斑块体积的估计百分比的量化。共定位通道的总体积除以每个共焦堆栈中的Aβ斑块的总体积。在每种条件下，在4只个体小鼠的皮质中拍摄n＝16个图像；p<0.001，学生t检验。比例尺＝10μm。
图6A-6F显示IL-33增强常驻小胶质细胞的Aβ摄取。代表性散点图显示在用IL-33治疗的APP/PS1小鼠中的单核细胞(图6A)、CD11b+CD45lo细胞(图6C)和CD11b+CD45hi细胞(图6E)的群体。通过腹膜内注射用IL-33治疗APP/PS1小鼠2天。图6A中的顶部象限(红色和蓝色)被鉴定为骨髓细胞群，而图6A中的顶部右象限以及图6C和图6E中的门代表吞噬Aβ(MeX04+)的细胞群。比较在对照组和IL-33治疗组之间在CD11b+(图6B)、CD11b+CD45lo(图6D)和CD11b+CD45hi(图6F)群体中MeX04+细胞的平均比例。Con：n＝5只小鼠，IL-33-治疗组：n＝6只小鼠，来自三个独立实验，*p<0.05，**p<0.01，学生t检验。
图7显示IL-33/ST2信号传导介导小胶质细胞吞噬活性。ST2-缺陷型小胶质细胞废除了IL-33刺激的Aβ摄取。比较对照(Con)和IL-33治疗的ST2+/+和ST2-/-培养物之间FAM-Aβ1–42摄取量的差异。在每种条件下，在3个独立实验中，n＝6只小鼠，*p<0.05，双向ANOVA，随后是邦弗朗尼事后。
图8A-8C显示IL-33施用恢复APP/PS1小鼠中降低的脑啡肽酶(NEP)表达。对WT或APP/PS1小鼠(约12月龄)施用(腹膜内)IL-33或对照媒介物(Con)2天。分离皮质用于西方印迹分析。图8A展示显示NEP和胰岛素降解酶(IDE)表达的代表性印迹。APP和肌动蛋白分别指示小鼠基因分型和等量负载。图8B显示NEP表达的定量分析，且图8C显示IDE表达的定量分析(相对于WT,Con的倍数变化)。n＝4个脑，**p<0.01，单因素ANOVA，随后是邦弗朗尼事后。
图9显示IL-33和美金刚的组合治疗挽救由Aβ诱导的LTP损伤。C57小鼠通过口服施用1mg/kg/天美金刚和通过腹膜内施用50ng/天IL-33(一种不能挽救APP/PS1小鼠中的LTP损伤的剂量)共同施用。然后对具有不同施用范例的小鼠的海马切片进行Aβ治疗并测量由HFS诱导的LTP(Con：3个脑，4个切片；Con+Aβ：3个脑，6个切片；IL-33+Aβ：1个脑，2个切片；美金刚+Aβ：3个脑，6个切片；IL-33+美金刚+Aβ：4个脑，8个切片)。
图10A-10R显示IL-33改变APP/PS1小鼠中的小胶质细胞基因表达。对APP/PS1小鼠腹膜内注射IL-33两天。图10A-10C显示IL-33改变APP/PS1小鼠中的小胶质细胞转录组标签。显示2007种基因的热图的图10A(显示p<0.05，单因素ANOVA)通过K-平均值聚类法对于归一化FPKM值进行分亚组。将不同样品中个体基因的表达水平在[-2,+2]的范围内根据平均值0和标准差1归一化；平均值以上的水平和平均值以下的水平分别以黄色和蓝色显示。不同聚类的基因由K-平均值聚类法对于归一化表达水平获得，并且由标记C1-C6或具有不同颜色的侧边栏指示。列出了每个簇中由DAVID数据库所建议的丰富基因本体术语(Benjamini-Hochberg调整的p<0.05)。图10B展示代表由相应颜色指示的不同簇中归一化基因表达水平的模式的转录组标签，其中标记在每个簇中的基因编号。图10C提供在施用了对照媒介物(Con)或具有上调的基因簇C4、C5和C6的IL-33的APP/PS1小鼠中的代表性基因的列表。在每个基因集中的上调基因的相应网络根据STRING数据库进行分类(图10D-10O)。显示在APP/PS1小鼠的小胶质细胞中响应于IL-33的顶部六种网络：胆固醇平衡(图10D、图10G)；IL-6/JAK/STAT3信号传导(图10E、图10H)、IFN-α反应(图10F、图10I)；IFN-γ反应(图10J、图10M)；细胞周期的G2M期(图10K、图10N)；和TNF-α反应(图10L、图10O)。上图(图10D、10E、10F、10J、10K、10L)显示由GSEA建议的由IL-33调控的APP/PS1小鼠的基因集。下图(图10G、10H、10I、10M、10N、10O)显示STRING网络，其中节点代表基因，且边缘提示基因之间的连接。较大的节点指示更多的连接边缘，而颜色较深的边缘指示节点之间的更强关联。在IL-33治疗后基因的倍数变化在[-1.5至+1.5]的log2范围内计算；每个节点上的相应颜色指示以蓝色和红色展示的值。图10P-10R显示，IL-33增加Aβ受体、Toll样受体2(图10P，TLR2)、低密度脂蛋白受体(图10Q，LDLR)和巨噬细胞清道夫受体1(图10R，MSR1)在APP/PS1小鼠的小胶质细胞中的转录。n＝2。
图11是显示在正常、MCI和AD患者中可溶性ST2(sST2)水平的箱线图。通过ELISA检查人血清的可溶性ST2浓度。Con：n＝137；MCI：n＝24；AD：n＝30；得自两样本t检验的***p-值<0.005。
图12显示APP/PS1小鼠中sST2和ST2L mRNA表达增加。通过定量实时PCR检查野生型(WT)和APP/PS1小鼠(12月龄)的皮质中可溶形式(sST2)和膜锚定形式(ST2L)的转录物表达。使用WT将mRNA表达归一化。数据以平均值±SEM提供(n＝3只小鼠/条件；**p<0.01，学生t检验)。
图13显示IL-33治疗的APP/PS1小鼠(14月龄；腹膜内注射)在探索性开场(OF)试验中表现出改善的习惯化。上图显示IL-33施用和OF试验的时间线。下图显示相对于训练第一天行进的距离而言的行进距离的百分比变化(n＝11-13只小鼠/组。数据是平均值±SEM。*p<0.05；***p<0.001，双因素重复测量ANOVA)。
图14A-14D显示IL-33治疗逆转了APP-PS1小鼠中的情境性记忆缺陷。图14A显示IL-33施用(腹膜内)和情境性恐惧条件反射(FC)试验的时间线。S，电击；T，冻结试验。图14B显示紧接FC试验的电击的冻结时间的百分比。图14C显示在施用电击之后1天的冻结时间的百分比。图14D显示在施用电击之后7天的冻结的百分比。数据是平均值±SEM。n＝11-13只小鼠/组。*p<0.05；**p<0.01，双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验。
图15A-15B显示，在IL-33治疗后两天，在12月龄的APP/PS1小鼠的皮质中，4G8-标记的淀粉样斑块显著减少。图15A显示代表性图像，且图15B显示在输注或不输注sST2的情况下在施用IL-33施用(腹膜内)之后在APP/PS1小鼠(12月龄)的皮质中4G8-染色的淀粉样斑块的量化。n＝7只小鼠/组。*p<0.05，单因素ANOVA和邦弗朗尼事后检验。所有数据都是平均值±SEM。(比例尺顶部，500μm；底部，100μm)。
图16A-16B显示IL-33增加在Aβ斑块中的CD68表达。通过腹膜内注射用IL-33治疗APP/PS1小鼠2天。代表性投影共焦图像显示在媒介物治疗的APP/PS1小鼠(Con；图16A)或IL-33治疗的APP/PS1小鼠(图16B)的皮质中Aβ斑块周围的CD68+Iba1+细胞的分布。
图17A-17B显示在APP/PS1小鼠中，IL-33驱使小胶质细胞进入另选的激活状态。对APP/PS1小鼠腹膜内注射IL-33两天。显示在从施用IL-33的APP/PS1小鼠脑分离的小胶质细胞中Fizz1(图17A)和精氨酸酶1(Arg1，图17B)mRNA水平的定量ddPCR分析。WT/Con，n＝5只小鼠；WT/IL-33，n＝4只小鼠；APP/PS1/Con，n＝7只小鼠；APP/PS1/IL-33，n＝6只小鼠。*p<0.05；**p<0.01，双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验。
图18A-18C显示IL-33压制APP/PS1小鼠中的促炎基因。对APP/PS1小鼠腹膜内注射IL-33两天。显示在12月龄APP/PS1小鼠的皮质中NLRP3(图18A)、IL-1β(图18B)和IL-6(图18C)的定量ddPCR分析。WT/Con，n＝5只小鼠；WT/IL-33，n＝3只小鼠；APP/PS1/Con，n＝5只小鼠；APP/PS1/IL-33，n＝4只小鼠。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验。所有数据都是平均值±SEM。
图19A-19B显示在腹膜内施用IL-33之后在APP/PS1小鼠的皮质中IL-33水平增加。对APP/PS1小鼠(11月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)30分钟。通过ELISA测量皮质(图19A)和血浆(图19B)中的IL-33水平。数据是平均值±SEM，n＝4-5只小鼠/组。**p<0.01；学生t检验。
图20显示IL-33不影响野生型或APP/PS1小鼠中的血浆组胺水平。对野生型(WT)和APP/PS1小鼠(8月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)或媒介物对照(Con，DPBS)2天。通过ELISA确定血浆组胺水平。n＝4只小鼠/组。数据是平均值±SEM。对于WT BALB/c小鼠获得了类似的结果(数据未显示)。
图21显示IL-33降低APP/PS1小鼠中的可溶性Aβ含量。对APP/PS1小鼠(25月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)三次，历时7天。图21是在APP/PS1小鼠的皮质匀浆中可溶性Aβ和不溶性Aβ的代表性西方印迹。每条泳道代表个体APP/PS1小鼠。Con，n＝2只小鼠；IL-33，n＝3只小鼠。
图22A-22B显示IL-33减少5XFAD小鼠的皮质中的4G8-染色的Aβ斑块。连续两天对5XFAD小鼠(10月龄)施用(腹膜内)IL-33(200ng)或DPBS对照(Con)。在皮质中4G8抗体染色的Aβ斑块的代表性图像(图22A)和量化(图22B)。数据是平均值±SEM。Con，n＝6；IL-33，n＝5。(**p<0.01；学生t检验)。比例尺＝500μm。
图23A-23C显示野生型小鼠的脑中CD11b+骨髓细胞群的分布。对成年C57BL/6小鼠腹膜内注射甲氧基-X04并在3小时后处死。将来自脑皮质的单核细胞悬浮液纯化并通过流式细胞术分析。代表性散点图显示具有由甲氧基-X04标记的Aβ的CD11b+细胞(图23A)、CD11b+CD45lo细胞(图23B)和CD11b+CD45hi细胞(图23C)的群体。图23A中的顶部左象限(以蓝色显示)被鉴定为没有Aβ摄取的骨髓细胞群，而图23A中的顶部右象限以及图23B和图23C中的门代表吞噬Aβ(MeX04+)的细胞群。数据代表了两个实验。
图24A-24D显示IL-33不增加APP/PS1小鼠的脑中外周单核细胞的浸润。对WT和APP/PS1小鼠(17月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)或DPBS(Con)两天。将脑皮质中的单核细胞分离并通过流式细胞术分析。图24A-24D显示CD11b+CD45lo和CD11b+CD45hi细胞群的分布。代表性等高线图显示WT小鼠(图24A)、施用了DPBS的APP/PS1小鼠(图24B)或注射了IL-33的APP/PS1小鼠(图24C)中CD11b+CD45lo和CD11b+CD45hi细胞群的分布。图24D显示在施用了IL-33或Con的APP/PS1小鼠的CD11b+细胞群中CD45hi细胞的量化。APP/PS1/Con，n＝5只小鼠；APP/PS1/IL-33，n＝6只小鼠。所有数据都是平均值±SEM。(ns＝统计意义上不显著；学生t检验)。
图25A-25C显示IL-33刺激原代小鼠CD11b+骨髓细胞中的Aβ摄取。将原代CD11b+骨髓细胞从WT C57BL/6小鼠脑中分离，并在体外培养6-7天。然后用分级浓度的IL-33刺激细胞20小时，然后用荧光素-Aβ1–42刺激细胞1小时。然后将细胞固定并通过宽视场荧光显微镜分析。图25A展示显示CD11b+骨髓细胞的吞噬活性的荧光图像。比例尺＝50μm。CD11b+骨髓细胞的边界通过Iba1标记强度和对于每个Iba1+细胞估计的吞噬荧光素-Aβ的量来确定(图25B)。图25C显示吞噬作用的量化。结果是吞噬到细胞中的荧光素-Aβ的面积相对于总细胞面积的倍数变化，并将数据归一化到对照。n＝来自3个独立实验的75-490个细胞。**p<0.01；***p<0.001；单因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验。
图26A-26D显示小胶质细胞中的IL-33/ST2信号传导。在WT和APP/PS1小鼠中在衰老期间，脑骨髓细胞中的ST2水平保持相对不变(图26A)。CD11b+骨髓细胞从WT和APP/PS1小鼠脑中分离。对ST2执行定量实时RT-PCR分析并归一化到CD11b转录物。5月龄：WT，n＝4只小鼠；APP/PS1，n＝4只小鼠；9月龄：WT，n＝3只小鼠；APP/PS1，n＝3只小鼠。图26B-26D显示IL-33刺激原代CD11b+骨髓细胞中p38和ERK1/2的激活。将来自成年C57BL/6小鼠的CD11b+骨髓细胞在体外培养7天，且然后用IL-33(100ng/mL)治疗指定的时间。代表性西方印迹(图26B)和磷酸化p38的倍数变化(图26C)以及磷酸化ERK1/2的倍数改变(图26D)归一化到其总蛋白质。n＝3-4个实验。与0分钟比较，*p<0.05；**p<0.01；单因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验。
图27A显示健康受试者(NC，n＝17)和具有轻度认知损伤的患者(MCI，n＝18)的血清中可溶性ST2(sST2)水平的箱线图。(*p<0.05；两样品t检验)。图27B是显示人受试者对于血清sST2测定的人口统计表征的表。汇总统计数据以平均值[最小值-最大值]或计数(％)提供。NC＝健康对照；MCI＝轻度认知损伤。
图28A-28B显示皮下(s.c.)施用IL-33降低APP/PS1小鼠的脑皮质中的可溶性Aβ水平。显示在皮下注射(图28A)和腹膜内注射(图28B)的APP/PS1小鼠的皮质匀浆中可溶性Aβ和不溶性Aβ的代表性西方印迹。
图29A-29B显示皮下注射IL-33逆转了APP/PS1小鼠中的LTP损伤。连续两天对野生型(WT)和APP/PS1小鼠皮下(图29A-29B)施用IL-33以及媒介物对照(Con)。通过HFS诱导海马CA1区中的LTP。图29A显示基线归一化场兴奋性突触后电位(fEPSP；平均值±SEM)的平均斜率。图29B显示在LTP诱导后记录的最后10分钟期间平均fEPSP斜率的量化；n＝4个切片，来自2只小鼠。(**p<0.01；双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验)。
图30是IL-33施用和行为试验的时间线，其结果示于图31-33中。如所描述的那样施用IL-33注射液(腹膜内)并在第21天停止，并且使小鼠休息10天。然后处死小鼠用于免疫组织化学分析和炎症基因表达分析。
图31A-31B展示IL-33治疗的APP/PS1小鼠(腹膜内)在OF和NB试验中表现出行为性能改善的趋势。IL-33治疗的APP/PS1小鼠在OF试验中表现出习惯化改善的趋势(图31A)。IL-33施用在APP/PS1小鼠中表现出筑巢活性增加的趋势(图31B)。(n＝5-6只小鼠/实验组。)
图32A-32B显示长期IL-33施用(腹膜内)减轻在APP/PS1小鼠中的Aβ斑块。在IL-33施用之后在APP/PS1小鼠的皮质中4G8-染色的淀粉样斑块的代表性图像(图32A)和量化(图32B)。
图33A-33C显示长期IL-33治疗(腹膜内)调节在APP/PS1小鼠中的炎症反应。IL-33压制若干炎性基因在APP/PS1小鼠的皮质中的表达。对SPP1(图33A)、CD11c(图33B)和Lilrb4(图33C)执行定量实时RT-PCR分析并归一化到β-肌动蛋白转录物。(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验)。所有数据都是平均值±SEM。
图34A-34B显示人IL-33(hIL-33)挽救APP/PS1小鼠中的LTP损伤。连续两天对野生型(WT)和APP/PS1小鼠腹膜内注射hIL-33或媒介物对照(Con)。通过HFS诱导海马CA1区中的LTP。图34A显示基线归一化fEPSP的平均斜率(平均值±SEM)。图34B显示在LTP诱导后记录的最后10分钟期间平均fEPSP斜率的量化；n＝3-4个来自2只小鼠的切片。(*p<0.05，双因素ANOVA，邦弗朗尼事后检验)。
图35A-35B显示IL-33和美金刚的组合治疗挽救由Aβ诱导的LTP损伤。C57小鼠通过口服递送1mg/kg/天美金刚(Mem)和通过腹膜内注射50ng/天IL-33(一种不能挽救APP/PS1小鼠中的LTP损伤的剂量)共同施用。然后对具有不同施用范例的小鼠的海马切片进行Aβ治疗并测量由HFS诱导的LTP。图35A显示基线归一化场兴奋性突触后电位(fEPSP；平均值±SEM)的平均斜率。图35B显示在LTP诱导后记录的最后10分钟期间的平均fEPSP斜率的量化。(Con：4个脑，6个切片；Con+Aβ：4个脑，8个切片；IL-33+Aβ：4个脑，8个切片；Mem+Aβ：3个脑，6个切片；IL-33+Mem+Aβ：5个脑，10个切片；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，单因素方差分析，随后是邦弗朗尼事后检验)。
具体实施方式
I.引言
本发明技术涉及如下发现：IL-33是有效治疗神经退行性和神经炎性病症或降低发生此类病症的风险的神经保护剂。在一些实施方案中，本发明技术提供了利用IL-33的这种新揭示的性质可用于治疗或抑制神经退行性和神经炎性病症的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明技术的治疗组合物包含任选地与一种或多种另外的药学活性成分组合的IL-33，其用于有效治疗诸如阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)或轻度认知损伤(MCI)的神经退行性和神经炎性病症。
本发明技术还涉及如下发现：可溶形式的IL-33受体sST2的水平升高与神经退行性和神经炎性病症如MCI或AD的存在相关。因此，在一些实施方案中，本发明技术提供了用于神经退行性和神经炎性病症如MCI或AD的早期检测或风险评估的新颖的先前未公开的诊断方法。
在一些实施方案中，经由调节IL-33和ST2相互作用的神经退行性和神经发炎病症的调节剂可以首先在蛋白质结合测定中鉴定，且然后通过诸如在用于神经退行性和神经炎性病症的动物模型中的另外试验验证。调节剂，尤其是已经鉴定的小分子调控IL-33/ST2结合水平，代表治疗神经退行性和神经炎性病症的新型潜在有效的治疗剂。
因此，在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于治疗或降低受试者的神经退化或神经炎症的风险的方法。该方法包括向受试者施用有效量的IL-33的步骤。在一些实施方案中，本公开包括一种用于相对于对照增加有需要的受试者中的Aβ受体表达的方法，其包括施用有效量的IL-33。在一些实施方案中，本公开提供一种用于增加选自Toll样受体2(TLR2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)的Aβ受体的表达的方法，其包括施用有效量的IL-33。在一些实施方案中，受试者患有阿尔茨海默氏病(AD)、轻度认知损伤(MCI)、帕金森氏病(PD)或多发性硬化症(MS)或者处于患阿尔茨海默氏病(AD)、轻度认知损伤(MCI)、帕金森氏病(PD)或多发性硬化症(MS)的风险之中。在一些实施方案中，该方法中使用的IL-33可以是IL-33蛋白(例如，重组生成的IL-33蛋白)或编码IL-33蛋白的核酸。在一些实施方案中，施用包括腹膜内(i.p.)施用IL-33，例如腹膜内施用1天、2天、3天、4天、5天、1周、10天或至多2周的时间。在一些实施方案中，IL-33施用期是2天。
在一些实施方案中，施用包括共同施用IL-33和第二治疗活性剂。例如，第二治疗活性剂是多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦或钩藤碱。在一些实施方案中，施用的第二活性剂的量可以是0.1-1000毫克/天、1-500毫克/天、1-100毫克/天、2-50毫克/天或5-20毫克/天，例如是10毫克/天、15毫克/天、或20毫克/天。单独或与第二治疗活性剂一起施用的IL-33蛋白的量可以是0.01-3000毫克/天、0.1-500毫克/天、0.1-300毫克/天、0.2-100毫克/天、0.5-100毫克/天、2-100毫克/天、5-50毫克/天，或10毫克/天、15毫克/天、20毫克/天、25毫克/天、30毫克/天和50毫克/天。
在一些实施方案中，在本发明技术的实践中，与IL-33组合使用因具有治疗神经退化或神经炎症的有效性而已知的常规方法或试剂。例如，在一些实施方案中，抗癫痫剂与IL-33组合施用(参见，例如，Sanchez等，Proc Natl Acad Sci U S A.2012年10月16日；109(42):E2895-903.doi:10.1073/pnas.1121081109.Epub 2012年8月6日)。而且，在一些实施方案中，诸如美国临时专利申请62/031,793中描述的那些的抗EphA4抗体与IL-33组合施用。在一些实施方案中，诸如基于计算机的认知训练方法(参见，例如Hofmann等，JPsychiatr Res.1996年11月-12月；30(6):493-501)的已知疗法与IL-33的施用组合使用。
在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于确定受试者的诸如阿尔茨海默氏病或轻度认知损伤的神经退行性或神经炎性病症的风险的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)确定取自受试者的生物学样品中分泌的可溶性ST2(sST2)水平；(b)对sST2水平与标准对照进行比较；以及(c)当在步骤(a)中获得的sST2水平大于标准对照时，确定受试者具有增加的神经退化的风险。在一些实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆或脑脊髓液(CSF)样品。在一些实施方案中，步骤(a)包括使用抗sST2的抗体的免疫学测定。在一些实施方案中，当确定患者具有诸如阿尔茨海默氏病或轻度认知损伤的神经退行性或神经炎性病症或在随后的时间发展该病症的风险增加时，患者可以接受医生认为合适的医学干预。在一些实施方案中，医学干预在性质上是治疗性或预防性的并且涉及任何当前批准用于治疗该病症的可用方法和活性剂。此外，在一些实施方案中，疾病进展的长期患者监测适用于已经接受存在神经退行性或神经炎性病症的阳性诊断或发展该病症的风险增加的患者。
在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于鉴定神经退化或神经炎症的调节剂的方法。该方法包括：(a)在容许IL-33/ST2L结合或IL-33/sST2结合的条件下，使候选试剂与IL-33和全长ST2(ST2L)或sST2接触；(b)检测IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平；以及(c)当步骤(b)中获得的IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平大于或小于在相同条件下但在缺乏候选试剂的情况下的IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平时鉴定该候选试剂为神经退化的调节剂。在一些实施方案中，步骤(a)包括体外蛋白质结合测定。在一些实施方案中，步骤(a)包括在表达ST2L的细胞的表面上的蛋白质结合测定。任选地，在一些实施方案中，采取另外的步骤来进一步验证由该方法如在本文所述的动物实验中鉴定的调节剂的活性。
在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于治疗或抑制受试者的神经退化或神经炎症的药物。在一些实施方案中，该药物包括：(1)有效量的IL-33和(2)药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，IL-33是IL-33蛋白。在一些实施方案中，IL-33是编码IL-33蛋白的核酸，诸如包含IL-33编码序列的表达盒。在一些实施方案中，该药物包括第二治疗活性剂，诸如多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦或钩藤碱。在一些实施方案中，已知可用于治疗神经退化或神经炎症的其他治疗活性剂包括在药物中：例如抗癫痫剂或抗EphA4的抗体。在一些实施方案中，将药物配制成用于肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、颅内、脑室内、鞘内、口服、呼吸(例如，通过吸入)、透皮(局部)和透粘膜施用。在一些实施方案中，将药物配制成用于腹膜内施用。在一些实施方案中，将药物配制成用于皮下施用。在一些实施方案中，将药物配制成用于鞘内施用。在一些实施方案中，本发明技术的药物以水溶液的形式或以冻干形式。
在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于确定受试者的神经退化或神经炎症的试剂盒。该试剂盒包括：(1)用于确定取自受试者的生物学样品中的sST2水平的试剂；和(2)标准对照，其指示取自未患神经退化或神经炎症并且并未处于患神经退化或神经炎症的风险中的受试者的相同类型的生物学样品中的sST2水平。通常，这些组分被保存在试剂盒的单独容器中。在一些实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆或CSF样品。在一些实施方案中，该试剂是对sST2具有特异性的抗体，其在一些实施方案中还特异性识别ST2L，而在其他实施方案中不特异性识别ST2L。在一些实施方案中，试剂盒还包括用于确定神经退化或神经炎症的风险的说明手册。
本发明技术的公开内容涉及用于预防和治疗神经退行性和神经炎性疾病的组合物和方法。组合物包含IL-33，任选地与多种治疗活性化合物(包括其药学上可接受的盐)中的一种或多种组合，并且提供一种或多种赋形剂用于治疗神经退行性和神经炎性病症。还提供了施用组合物的方法。
本公开技术的公开内容还涉及可溶性ST2(sST2)蛋白作为神经退行性疾病如轻度认知损伤(MCI)、早期阿尔茨海默氏病(AD)以及其他神经炎症相关性神经退化的生物标志物的用途，并且公开了诊断人受试者具有这些病症、评估发展这些病症的风险或者评估患者响应于这些病症的治疗的治疗有效性。本发明技术的公开内容还涉及通过操纵/激活ST2途径；通过调控ST2和IL-33的转录和表达；或通过调节IL-33和ST2的相互作用来治疗人受试者的神经退行性或神经炎性病症的方法。
因此，本发明技术代表对各种神经退行性和神经炎性病症的预防性和治疗性干预，这些神经退行性和神经炎性病症包括痴呆、轻度认知损伤(MCI)、阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、多发性硬化症(MS)、抑郁症、中风、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、亨廷顿氏舞蹈病(HD)、视网膜退行性疾病如青光眼年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病、由于神经退化引起的听力损失、创伤性脑损伤、和脊髓损伤、以及其他神经炎性病症，诸如急性播散性脑脊髓炎、视神经炎横断性脊髓炎灰质炎后遗症、多灶性运动神经病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
II.定义
如在本申请中所用的术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”描述了导致预定医学病症的任何症状的消除、减少、缓解、逆转、预防和/或延迟发作或复发的行为。换句话说，“治疗”病症涵盖针对病症恶化的治疗性干预和预防性干预两者。受试者被成功治疗了特定病症，其中在接受有效量的治疗剂之后，受试者显示出该病症的一种或多种体征和症状的可观察和/或可测量的减少或不存在。在一些实施方案中，受试者在根据本文所述的方法接受有效量的IL-33后被成功治疗了神经退行性或神经炎性病症，受试者显示出神经退行性或神经炎性病症的一种或多种体征和症状的可观察和/或可测量的减少或不存在。
如本文所用，术语“有效量”是指对于所施用的物质生成治疗作用的量。这些作用包括预防、校正或抑制疾病/病症和相关并发症的症状进展到任何可检测程度。确切的量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
如本文所用，术语“标准对照”是指包含预定量的分析物的样品，以指示存在于这类样品中的分析物的量或浓度，这类样品取自未患预定疾病或病症(例如，神经退行性或神经炎性病症，例如阿尔茨海默氏病或轻度认知损伤)或未处于发展预定疾病或病症的风险之中的平均健康受试者。
如在描述未患任何神经退行性病症并且未处于发展任何神经退行性病症的风险之中的健康受试者的上下文中使用的术语“平均”是指某些特征，诸如人血液中的sST2水平，它们代表着一组随机选择的未患任何神经退行性或神经炎性病症或未处于发展任何神经退行性或神经炎性病症的风险之中的健康人类。该选择的组应包含足够数量的人类受试者，使得在这些个体之中关注的分析物的平均量或浓度以合理的准确度反映一般健康人群中的相应概况。任选地，选择的受试者组可以被选择为具有与测试神经退行性或神经炎性病症的指征或风险的人类似的背景，例如匹配或可比的年龄、性别、种族和病史等。
如本文所用，术语“抑制(inhibiting)”或“抑制(inhibition)”是指对目标生物学过程的任何可检测的负面作用。通常，当与不存在这样的抑制的对照相比时，抑制反映在指示生物学过程或其下游作用的一个或多个参数中的至少10％、20％、30％、40％或50％的减小。术语“增强(enhancing)”或“增强(enhancement)”以类似的方式定义，不同的是指示积极作用，即，积极变化为与对照相比至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多。术语“抑制剂”和“增强剂”分别用于描述表现出如上所述的抑制或增强作用的试剂。在本公开中也以类似的方式使用术语“增加”、“减少”、“更多”和“更少”，其意图指示一个或多个预定参数至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％或甚至更多的积极变化，或一个或多个预定参数至少10％、20％、30％、40％、50％、80％或甚至更多的负面变化。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合性质，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地讲，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语核酸可以与基因、由基因编码的cDNA和mRNA互换使用。
术语“基因”是指涉及生成多肽链的DNA区段。它可以包括编码区(前导序列和尾随序列)之前和之后的区域以及在单个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即α碳与氢、羧基、氨基和例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍的R基团结合。这类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同，但其功能与天然存在的氨基酸类似的结构的化学化合物。
本领域中有各种已知的方法容许以位点特异性方式将非天然氨基酸衍生物或类似物并入多肽链中，参见，例如WO 02/086075。
氨基酸在本文中可以通过公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来表示。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用以指氨基酸残基的聚合物。所有三个术语都适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
“表达盒”是重组或合成产生的核酸构建体，其具有容许特定多核苷酸序列在宿主细胞中转录的一系列特定的核酸元件。表达盒可以是质粒、病毒基因组或核酸片段的一部分。通常，表达盒包括与启动子可操作连接的待转录的多核苷酸(例如，编码IL-33的多核苷酸)。
如本文所用，“IL-33”是指具有如SEQ ID NO:1-4中所示的氨基酸序列的蛋白质或其功能片段或变体，或者编码其的核酸序列。在本发明技术的一些实施方案中，IL-33包含SEQ ID NO:1、2、3或4。在本发明技术的一些实施方案中，IL-33包含对应于SEQ ID NO:1或3中所示的氨基酸序列的全长IL-33。在本发明技术的一些实施方案中，IL-33包含SEQ IDNO:1、2、3或4的功能性片段。在本发明技术的一些实施方案中，IL-33包含对应于SEQ IDNO:2或4中所示的氨基酸序列的功能性C-末端片段。在本发明技术的一些实施方案中，IL-33包含SEQ ID NO:1、2、3或4的变体。在本发明技术的一些实施方案中，重组生成IL-33的全长、功能性片段或变体。
III.本发明技术的一般描述
本发明技术的公开内容涉及用于预防和治疗神经退行性和神经炎性疾病的组合物和方法。组合物中的活性成分是IL-33。本发明技术的组合物除了IL-33之外还可以包含一种或多种治疗活性剂。例如，组合物可以包含以下组合：IL-33和诸如多奈哌齐、利斯的明或加兰他敏的乙酰胆碱酯酶抑制剂的组合；包括IL-33和诸如美金刚的N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂的组合；包括IL-33和阿杜单抗的组合；包括IL-33和不同化学部分的异二聚体的组合，参见例如美国专利7,605,265；包括IL-33和罗格列酮的组合；包括IL-33和贝沙罗汀的组合；包括IL-33和诸如氯沙坦的血管紧张素2受体阻断剂的组合；包括IL-33和DA001或其衍生物的组合，参见例如美国专利8,642,567和美国专利9,029,414；包括IL-33和诸如钩藤碱的天然产物提取物或化合物的组合；包括IL-33和诸如Rhy-37的小分子Rhy衍生物的组合，参见例如PCT/CN2014/082386。可以将有效量的一种或多种活性成分与药学上可接受的盐以及一种或多种赋形剂一起施用到人受试者以治疗或预防神经退行性或神经炎性疾病/病症。在增加Aβ受体表达的方法中，也可以将有效量的一种或多种活性成分与药学上可接受的盐以及一种或多种赋形剂一起施用到人受试者。在一些实施方案中，Aβ受体包括选自Toll样受体2(TLR2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)的受体。适合这种治疗或预防的病症包括MCI和早期AD、AD、PD、MS、抑郁症、中风、路易体痴呆、肌萎缩性侧索硬化、额颞叶痴呆、亨廷顿氏舞蹈病、视网膜退行性疾病如青光眼年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病、由于神经退化引起的听力损失、创伤性脑损伤、和脊髓损伤、以及其他神经炎性病症，诸如急性播散性脑脊髓炎、视神经炎横断性脊髓炎灰质炎后遗症、多灶性运动神经病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病。
IL-33通过经其受体ST2的信号传导促进Th2型免疫反应。可溶性ST2充当诱饵受体。它结合IL-33，并且使其不可用于ST2受体，因此阻碍了该受体/配体相互作用的下游事件。在此，本发明人已经鉴定出在人受试者血浆中的sST2水平与轻度认知损伤(MCI)(AD的前驱阶段)的发生之间的先前未公开的相关性。升高的水平指示人受试者中神经退行性和神经炎性疾病的存在或增加的风险，并且鉴定出sST2是诸如MCI的神经退行性和神经炎性疾病的可靠生物标志物。这是一种突破性方法，因为目前还没有用于检测MCI和早期AD的诊断工具。因此，本发明技术公开了诊断人受试者中的MCI和早期AD(或检测人受试者中发展MCI和早期AD的增加的风险)的新方法，并且提供了能够测量人受试者血浆中的sST2水平的试剂盒。可以将试剂盒配制成用于皮下、肌内、静脉内、腹膜内、局部、鼻内或口服施用。
先前已知ST2在心脏疾病的进展中起作用，并且sST2水平与心血管疾病(CVD)相关。此外，sST2已经被鉴定为用于心力衰竭患者的神经激素激活的CVD的生物标志物，并作为这些患者的死亡率指标。因此，假定sST2在诊断和/或治疗背景下在CVD中起作用。另外，已经描述了IL-33在治疗和诊断诸如心脏肥大、心肌梗塞、中风、动脉硬化和心力衰竭的心脏疾病和病症中的用途。然而，本发明人是如下的第一人：(i)说明在升高的可溶性sST2水平与诸如轻度认知损伤(MCI)和阿尔茨海默氏病(AD)的神经退行性和神经炎性疾病之间的相关性；(ii)公开测量在人受试者中的血浆中的sST2的方法；并且(iii)公开操纵ST2/IL-33信号传导的下游途径作为治疗神经退行性或神经炎性病症的治疗策略的方法。
IV.本发明技术的治疗剂
本发明技术提供了可以用于治疗或降低发展诸如阿尔茨海默氏病(AD)、轻度认知损伤(MCI)和帕金森氏病(PD)的神经退行性或神经炎性病症的风险的多种治疗剂。适用于预防性和治疗性应用的药学或生理学组合物通常包含活性成分加上一种或多种药学或生理学上可接受的赋形剂或载体。
可以将包含IL-33的组合物配制成用于预防性和治疗性目的。IL-33可以是以蛋白质的形式，例如重组生成的蛋白质。任选地，蛋白质可以含有修饰，诸如用一种或多种不同的氨基酸或一种或多种人造氨基酸(包括D-氨基酸)取代一种或多种天然存在的氨基酸残基。
下文提供由UniProt登录号O95760(SEQ ID NO.1)给出的说明性全长人IL-33(hIL-33)蛋白。SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的下划线部分(氨基酸112-270)代表hIL-33的C-末端片段并对应于SEQ ID NO:2。
下文提供由UniProt登录号Q8BVZ5(SEQ ID NO.3)给出的说明性全长小鼠IL-33(mIL-33)蛋白。SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的下划线部分(氨基酸109-266)代表mIL-33的C-末端片段并对应于SEQ ID NO:4。
在人(hIL-33)C-末端片段和小鼠(mIL-33)C-末端片段(分别地，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4)之间的同源性为57％。
本公开的肽可以通过本领域公知的任何方法合成。用于化学合成蛋白质的合适方法包括例如由Stuart和Young在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，PierceChemical Company(1984)中和在Methods Enzymol.289,Academic Press,Inc,New York(1997)中描述的那些。
在一些实施方案中，本发明技术的IL-33蛋白是包含SEQ ID NO:1-4中的任一个所示的氨基酸序列的蛋白质或其功能性片段或变体。在一些实施方案中，IL-33包含对应于SEQ ID NO:1或3中所示的氨基酸序列的全长IL-33蛋白。在一些实施方案中，IL-33蛋白包含SEQ ID NO:1、2、3或4的功能性片段。在一些实施方案中，IL-33蛋白包含对应于SEQ IDNO:2或4中所示的氨基酸序列的功能性C-末端片段。在一些实施方案中，IL-33蛋白包含具有一个或多个保守氨基酸取代的在SEQ ID NO:1-4中的任一个中所示的氨基酸序列的变体。在一些实施方案中，该变体与SEQ ID NO:1-4中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少99％、至少95％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％同源性。在本发明技术的一些实施方案中，重组生成IL-33的全长、功能性片段或变体。
诸如糖基化、PEG化等化学修饰也是可能的，只要所得IL-33保留天然IL-33的正常生物学活性即可。IL-33可以以编码IL-33蛋白的核酸的形式，例如以能够指导IL-33编码序列转录以及最终IL-33蛋白的翻译的表达盒的形式。任选地，IL-33可以与第二或更多种活性成分组合使用以增强所需的治疗作用。可能的活性成分包括但不限于多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱，包括在例如美国专利7,605,265中命名的不同化学部分的异二聚体，例如在美国专利8,642,567和9,029,414中命名的DA001或其衍生物，以及在例如PCT/CN2014/082386中命名的Rhy衍生物。
此外，本发明技术提供一种用于鉴定病症的调节剂的方法。在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于鉴定调节剂或神经退行性或神经炎性病症的方法。该方法基于在IL-33与其受体ST2之间的相互作用在IL-33介导的神经保护作用中必不可少的发现。如此，筛选方法包括这些步骤：(a)在容许IL-33/ST2结合的条件下，使候选试剂与IL-33蛋白和ST2蛋白质(其可以是sST2或ST2L)接触；(b)检测IL-33/ST2结合水平；以及(c)当步骤(b)中获得的IL-33/ST2结合水平大于或小于在相同条件下但在缺乏候选试剂的情况下的IL-33/ST2结合水平时，鉴定该候选试剂为神经退化的调节剂。
可以基于候选化合物对IL-33和ST2之间的结合的作用使用体外测定以筛选IL-33信号传导的潜在调节剂。通常，这一测定可以在IL-33和ST2蛋白质或其片段如重组生成的ST2L蛋白或sST2的存在下在容许IL-33与其受体结合的条件下执行。在一些情况下，结合测定可以在无细胞的环境中执行；而在其他情况下，结合测定可以在细胞内或在细胞表面上例如使用重组或内源性表达适当的ST2L多肽的细胞执行。
一旦在结合测定中鉴定化合物为神经退化的潜在调节剂，则可以进行进一步的试验以确认其活性。然后，筛选方法可以进一步包括任何必要的另外试验以使用本领域已知或如本申请中(例如，在实施例中)所述的方法和实验模型确定调节剂是否促进或抑制神经退化。
为了根据本发明技术使用而制造的药物组合物通常包含一种活性剂(任选地具有另外的活性剂)作为治疗有效组分和药学上/生理学上可接受的赋形剂或载体。这样的组合物可以针对施用到患者的预期路径，例如通过腹膜内施用或注射来特别地配制。该技术的治疗剂也可用于制造用于治疗如本申请所述的相关疾病和病症的药物。
V.组合疗法
在一些实施方案中，将本发明技术的IL-33化合物掺入药物组合物中以单独地或与一种或多种另外治疗剂组合施用到受试者以便治疗或预防特定病症。在一些实施方案中，该病症是神经退行性疾病或神经炎性病症。在一些实施方案中，该病症是阿尔茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)或轻度认知损伤(MCI)。
在一个实施方案中，将另外的治疗剂与本发明技术的至少一种IL-33化合物组合施用到受试者，从而生成协同治疗作用。
在一些实施方案中，多种治疗剂(包括IL-33化合物)以任何顺序或甚至同时施用。如果同时施用，则多种治疗剂以单一、统一的形式或以多种形式(仅作为实例，作为单一药丸或作为两个单独的药丸)提供。在一些实施方案中，治疗剂之一以多剂量施用，或者两者可以作为多剂量给药。此外，组合方法、组合物和配制剂不限于仅使用两种试剂。
可能的组合疗法的具体的非限制性实例包括使用与对于特定疾病或病症具有特异性的活性剂组合的一种或多种IL-33化合物。在一些实施方案中，活性剂选自乙酰胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂、阿杜单抗、不同化学部分的异二聚体(参见，例如美国专利7,605,265)、罗格列酮、贝沙罗汀、血管紧张素2受体阻断剂、DA001或其衍生物(参见，例如美国专利8,642,567和美国专利9,029,414)、钩藤碱和Rhy衍生物。在一些实施方案中，乙酰胆碱酯酶抑制剂选自由多奈哌齐、利斯的明和加兰他敏。在一些实施方案中，NMDAR是美金刚。在一些实施方案中，血管紧张素2受体阻断剂是氯沙坦。在一些实施方案中，Rhy衍生物是Rhy-37(参见，例如PCT/CN2014/082386)。
VI.药物组合物和施用模式
本发明技术还提供了包含有效量的一种或多种治疗活性剂(例如，IL-33，任选地与第二活性剂组合)的药物组合物或生理学组合物，因此在预防性和治疗性应用中均提供预期益处。这样的药物或生理学组合物还包含一种或多种药学或生理学上可接受的赋形剂或载体。本发明技术的药学组合物适合在多种药物递送系统中使用。在本发明技术中使用的合适配制剂在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Philadelphia,PA,第17版(1985)中见到。关于药物递送的方法的简要回顾，参见Langer，Science 249:1527-1533(1990)。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括使细胞、器官或组织与本文所述的组合物和/或试剂或其药学上可接受的盐接触。可以采用本领域已知的任何方法，包括体外、体内和离体方法。体外方法通常包括使用培养的样品。例如，可以将细胞放置在储库(例如，组织培养板)中，并在适合获得所需结果的适当条件下与试剂一起温育。可以使用本领域已知的方法容易地确定合适的温育条件。离体方法通常包括从诸如人的哺乳动物移出的细胞、器官或组织。通常使接触的细胞、器官或组织返回到供体中，置于接受者体内或储存以供未来使用。体内方法通常包括向诸如人的受试者施用诸如本文所述的那些试剂的试剂。当在体内用于治疗时，本发明技术的试剂以对于所需结果有效的量且通过适合所需结果的施用路径施用到哺乳动物。
在一些实施方案中，将本发明技术的试剂和组合物配制成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指由可接受施用到诸如哺乳动物的患者的碱或酸制备的盐(例如，对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。
通常将药物组合物配制成与预期的使用路径相容。本发明技术的药物组合物可以通过各种路径施用，这些路径包括例如肠胃外(例如，静脉内、皮内、腹膜内或皮下)、颅内、脑室内、鞘内、口服、呼吸(例如，通过吸入)、透皮(局部)、离子电泳和透粘膜施用。
例如，在一些说明性实施方案中，施用药物组合物的路径是对于70公斤的成人每天以约0.01-2500mg的活性剂的日剂量局部递送到患有由神经细胞的损失或损坏引起或加重的病症的器官或组织。在一些实施方案中，该日剂量对于70kg成人每天为约2.5-500mg的活性剂。适当的剂量可以以单次日剂量或者作为以适当间隔提供的分次剂量施用，例如每天作为两次、三次、四次或更多次亚剂量施用。在一些实施方案中，剂量通过腹膜内注射在2天的时间段内递送。
在一个实施方案中，本发明技术的试剂通过静脉内施用。例如，本发明技术的试剂可以通过快速静脉内大剂量注射来施用。在一些实施方案中，本发明技术的试剂作为恒定速率静脉内输注施用。
在一些实施方案中，全身、脑室内、鞘内、局部、鼻内、皮下或透皮施用的本发明技术的试剂利用常规的药物载体、稀释剂或赋形剂等，诸如本领域已知递送本发明技术的试剂的那些。例如，在一些实施方案中，本发明技术的组合物进一步包含以下一种或多种：稳定剂、诸如非离子表面活性剂的表面活性剂以及任选的盐和/或缓冲剂。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
在一些实施方案中，药物载体以固体或液体的形式。在一些实施方案中，固体形式制剂包括例如粉剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。固体载体可以是一种或多种也可以用作稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘结剂或片剂崩解剂的物质；它也可以是包封材料。
在一些实施方案中，对于粉剂，载体通常是细分的固体，其与一种或多种细分的活性组分混合。在一些实施方案中，对于片剂，将活性成分与具有必要粘结性质的载体以合适的比例混合并压制成所需的形状和大小。
在一些实施方案中，为了制备栓剂形式的药物组合物，首先将诸如脂肪酸甘油酯和可可脂的混合物的低熔点蜡熔融，并且通过例如搅拌将活性成分分散在其中。然后将熔融的均匀混合物倒入合适尺寸的模具中并使其冷却并固化。
在一些实施方案中，粉剂和片剂含有约5重量％至约70重量％的本发明技术的活性剂的活性成分。合适的载体包括例如碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等等。
在一些实施方案中，本发明技术的药物组合物可以包括活性成分的活性化合物与作为载体的包封材料的配制剂，提供其中活性成分(有或没有其他载体)被载体包围使得载体因此与化合物相关的胶囊剂。以类似的方式，还可以包括扁囊剂。在一些实施方案中，片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊剂可以用作适合口服施用的固体剂型。
液体药物组合物包括例如适合口服或肠胃外施用的溶液剂、混悬剂和适合口服施用的乳剂。活性组分(例如，任选地与另外活性剂组合的诸如IL-33的活性剂)的无菌水溶液或活性组分在包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适合肠胃外施用的液体组合物的实例。根据需要，组合物可以含有药学上可接受的辅助物质以接近生理学条件，诸如pH调节和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、洗涤剂等等。
在一些实施方案中，用于肠胃外、皮内或皮下应用的溶液或悬浮液，包括适合注射使用的本发明技术的组合物，可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水(其中水溶性)、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。在一些实施方案中，配制用于静脉内施用的本发明技术的组合物包含载体，该载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor(BASF,Parsippany,N.J.,USA)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，用于肠胃外施用的组合物都必须是无菌的，并应该配制成易于注射。在制造和储存条件下，组合物应该是稳定的，并且必须防止被诸如细菌和真菌微生物污染。在一些实施方案中，可以用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调整pH。制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在一些实施方案中，为了患者或治疗医师的方便，剂量配制剂可以提供在包含治疗过程需要的所有设备(例如，药物小瓶、稀释剂小瓶、注射器和针)的试剂盒中。
在一些实施方案中，稳定剂包括氨基酸，诸如甘氨酸；低聚糖，诸如蔗糖、tetralose、乳糖；或葡聚糖。另选地，稳定剂可以包括糖醇，诸如甘露糖醇。在一些实施方案中，稳定剂或稳定剂的组合构成配制组合物重量的约0.1重量％至约10重量％。
在一些实施方案中，表面活性剂包括非离子表面活性剂(诸如聚山梨酸酯)、阴离子表面活性剂(诸如二辛基磺基琥珀酸钠)、阳离子表面活性剂(诸如十六烷基氯化吡啶鎓)或其组合。合适的非离子表面活性剂的实例包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(例如，Tween-20和Tween-80)、对-叔辛基酚聚氧乙烯(例如，Triton X-45、Triton X-100、Triton X-114和Triton X-305)、聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(诸如Pluronic F-68)、壬基苯氧基聚氧乙烯(例如，Igepal CO系列)和聚氧乙烯醚(例如，Brij 36T、Brij 52、Brij 56、Brij 76、Brij 96、Texaphor A6、Texaphor A14和Texaphor A60)，以约0.001％(w/v)至约10％(w/v)。
在一些实施方案中，盐或缓冲剂包括任何盐或缓冲剂，诸如分别为氯化钠或磷酸钠/磷酸钾。在一些实施方案中，缓冲剂将药物组合物的pH保持在约5.5至约7.5的范围内。盐和/或缓冲剂也可用于将渗透压保持在适合施用到人或动物的水平。在一些实施方案中，盐或缓冲剂以约150mM至约300mM的大致等渗的浓度存在。
VII.剂量
本文所述的剂量范围和方案是示例性的，而并非意图加以限制。
本发明技术的试剂的剂量、毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药物学程序来确定，例如用于确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。在毒性作用与治疗作用之间的剂量比为治疗指数，且其可以表示为LD50/ED50的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。尽管可以使用表现出毒性副作用的化合物，但应注意设计一种将此类化合物靶向受影响组织的位点的递送系统，以尽量使对未受影响细胞的潜在损坏最小化，减少副作用。
从细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。这类化合物的剂量优选处于包括ED50同时具有极小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于在本文所述方法中使用的本发明技术的任何试剂，治疗有效剂量都可以由细胞培养物测定初始估计。可以在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养物中确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。这一信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱来测量。
在一些实施方案中，含有本发明技术的一种或多种活性剂的药物组合物为了预防性和/或治疗性治疗而施用。在一些实施方案中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减慢或阻止病症及其并发症的症状的量作为治疗性应用施用到已经患有病症的患者。在一些实施方案中，将组合物施用到患有诸如AD、MCI或PD的发作、进展和恶化的可以通过神经形成减轻的病症的患者。足以实现此的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种使用有效的量将取决于疾病或病症的严重程度以及患者的体重和一般状态。
在一些实施方案中，含有本发明技术的一种或多种活性剂的药物组合物为了预防性和/或治疗性治疗而施用。在一些实施方案中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减慢或阻止病症及其并发症的症状的量作为治疗性应用施用到已经患有病症的患者。在一些实施方案中，将组合物施用到患有诸如AD、MCI或PD的发作、进展和恶化的可以通过神经形成减轻的病症的患者。足以实现此的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种使用有效的量将取决于疾病或病症的严重程度以及患者的体重和一般状态。在一些实施方案中，治疗有效剂量范围为每千克体重每天约0.000001mg至约10,000mg。在一些实施方案中，治疗有效剂量范围为每千克体重每天约0.000001mg至约0.0001mg、约0.001mg、约0.01mg、约0.05mg、约0.1mg、约0.5mg、约1.0mg、约5.0mg、约10mg、约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,500mg、约2,000mg、约3,000mg、约4,000mg、约5,000mg、约6,000mg、约7,000mg、约8,000mg、约9,000mg或约10,000mg。
例如，在一些说明性实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.0001mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.0002mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.0005mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.001mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.01mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约0.1mg至约2,500mg的一种或多种活性剂。在一些实施方案中，对于70kg的患者，剂量范围为每天约2.5mg至约500mg的一种或多种活性剂。
在一些实施方案中，在载体或稀释剂中的IL-33浓度为每递送1毫升中约0.01μg至约0.1μg、约0.5μg、约1.0μg、约5μg、约10μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约100μg、约200μg、约300μg、约400μg、约500μg、约600μg、约700μg、约800μg、约900μg、约1000μg、约1500μg、约2000μg。
在一些实施方案中，本发明技术的组合物的治疗有效剂量或预防有效剂量被定义为IL-33化合物在靶组织中的浓度为10-11至10-6摩尔浓度，例如约10-7摩尔浓度。诸如通过每日或每周单次施用，还包括连续施用来优化剂量方案以保持靶组织处的治疗浓度。
可以以治疗医师选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次施用。适当的剂量可以以单次日剂量或者作为以适当间隔提供的分次剂量施用，例如每天作为两次、三次、四次或更多次亚剂量施用。
在一些实施方案中，用于治疗或预防神经退行性或神经炎性病症的方案包括以规定的间隔施用本发明技术的一种或多种组合物。在一些实施方案中，每天施用组合物一次以上。在一些实施方案中，组合物每1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天施用一次。在一些实施方案中、组合物每1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周施用一次。在一些实施方案中，组合物每1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月施用一次。在一些实施方案中，组合物每1年、2年、3年、4年、5年或更长时间(即，每5年少于一次)施用一次。
在一些实施方案中，用于治疗或预防神经退行性或神经炎性病症的方案包括施用本发明技术的一种或多种组合物，然后休息一段时间，之后额外施用组合物。在一些实施方案中，治疗方案包括多次施用组合物，每次施用后是休息期。在一些实施方案中，组合物作为单次剂量施用，然后是多达1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、1周、2周、3周、4周、5周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月的休息期。
在一些实施方案中，治疗方案包括多次施用组合物，每次施用后是休息期。在一些实施方案中，治疗方案内的休息期可以是可变的。例如，治疗方案可以包括1周的第一休息期、2周的第二休息期和3周的第三休息期。同样，治疗方案可以包括1年的第一休息期、2年的第二休息期和3年的第三休息期。用于休息和组合物施用的合适时间间隔可以使用诸如但不限于在治疗过程期间测量疾病标志物的本领域已知的临床方法在个体基础上确定。
例如，在一些说明性实施方案中，将全剂量(例如，作为单次日剂量或以适当间隔施用的分次剂量)施用到受试者，然后是1天的休息期，之后施用第二全剂量到受试者。在另一说明性实施方案中，在第1天将全剂量(例如，作为单次日剂量或作为以适当间隔施用的分次剂量)施用到受试者，然后是1天的休息期，之后施用第二全剂量到受试者，然后是2天的休息期，之后施用第三全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后施用第四全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后施用第五全剂量到受试者。在另一说明性实施方案中，使用21天的治疗方案。在该方案中，在第1天将全剂量(例如，作为单次日剂量或作为以适当间隔施用的分次剂量)施用到受试者，然后是1天的休息期，之后在第2天施用第二全剂量到受试者，然后是2天的休息期，之后在第5天施用第三全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第7天施用第四全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第9天施用第五全剂量到受试者，然后是3天的休息期，之后在第13天施用第六全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第15天施用第七全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第17天施用第八全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第19天施用第九全剂量到受试者，然后是1天的休息期，之后在第21天施用第十全剂量到受试者。
在一些实施方案中，诸如基于计算机的认知训练方法(参见，例如Hofmann等，JPsychiatr Res.1996年11月-12月；30(6):493-501)与在上述治疗方案中施用至少一种IL-33化合物组合使用。
如通过测量受试者的葡萄糖或胰岛素的血液水平以及相应地调整剂量或施用所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调整剂量以达到所需的空腹葡萄糖或空腹胰岛素浓度。在任何情况下，药物配制剂都应该提供足以有效地治疗性或预防性压制、抑制或甚至逆转患者中的神经退化或神经炎症的发作或发展的量的活性剂(任选地与第二活性剂组合)。
VIII.诊断方法
在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于检测患者中病症的存在或用于评估个体未来发展病症(即使目前还没有这种疾病的指示)的风险的新方法。在一些实施方案中，本发明技术提供一种用于检测患者中神经退行性或神经炎性病症的存在或用于评估个体未来发展神经退行性或神经炎性病症(即使目前还没有这种疾病的指示)的风险的新方法。该方法涉及确定患者的生物学样品中sST2的水平和检测自标准对照的任何增加，这可以指示患者中神经退行性或神经炎性病症的存在或者发展神经退行性或神经炎性病症的风险升高。
为了实践这种方法，人们通常分析在取自正试验的人的样品如血液样品中见到的以蛋白质形式或以mRNA形式的sST2的量。根据医院或诊所通常遵循的标准协议执行从个体的血液采集。采集适量的外周血，例如通常在5mL至50mL之间，并可以在进一步制备之前根据标准程序进行储存。
根据本发明技术对患者样品中见到的sST2蛋白或mRNA的分析可以使用例如全血执行，或者更常见的是在诸如血清或血浆的无细胞样品中执行。可以使用本研究领域已知的标准方法来分离和分析样品中sST2的蛋白质或RNA水平。(参见，例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第3辑，2001)。
为了建立用于实施本发明技术的方法的标准对照，首先选择一组没有任何神经退行性或神经炎性病症并且已知不处于发展这种病症的风险中的健康人。如果适用的话，使这些个体处于适当的参数范围内，目的是使用本发明技术的方法筛选和/或评估这种病症的未来风险。任选地，个体具有相同或相当的性别、年龄、种族背景和病史。所选择的个体的健康状况通过完善的常规采用的方法来确认，这些方法包括但不限于个体的一般身体检查和他们的医疗记录的一般查看。
另外，所选择的健康个体必须具有合理的体型，使得在从该组获得的样品中sST2的平均量/浓度可以被合理地认为代表着没有神经退行性或神经炎性病症且不处于发展神经退行性或神经炎性病症的风险中的一般健康人群之中的正常或平均水平。优选地，所选择的组包含至少10个人受试者。
一旦基于在所选择的健康对照组的每个受试者中见到的单个值建立了sST2蛋白或mRNA的平均值，则将该平均值或中值或代表值或分布视为标准对照。标准偏差也是在同一过程期间确定的。在一些情况下，可以针对具有诸如年龄、性别、种族背景或病历中的任何一个或多个不同的过去事件的不同特性的单独定义的组建立单独的标准对照。
IX.试剂盒
本发明技术提供一种用于诊断或确定受试者的神经退化/神经炎性疾病的风险的试剂盒。该试剂盒通常包含(1)含有用于确定取自受试者的生物学样品中的sST2水平的试剂的容器，该试剂诸如为特异性识别sST2的抗体(其可以或可以不特异性识别ST2L，因为sST2是分泌的并且可以在样品的非细胞部分中见到，而ST2L是膜结合的且因此与细胞一起保留在样品中，使得即使使用识别这两种类型的ST2蛋白质的抗体，也可以容易地区分它们两者)或特异性结合编码sST2而不编码ST2L(例如，编码sST2mRNA而不编码ST2L mRNA)的序列的多核苷酸探针；和(2)含有标准对照的容器，该标准对照指示取自未患神经退化并且没有处于患神经退化的风险中的平均健康受试者的相同类型的生物学样品中的sST2水平(其可以是蛋白质或mRNA)。试剂盒中通常包括指导用户正确执行诊断方法的说明手册。
本发明技术还提供一种用于根据本公开的方法抑制或治疗神经退化或神经炎性病症以便治疗或预防相关疾病和病症的试剂盒。这些试剂盒通常包括容器，该容器含有(1)具有有效量的活性剂(例如，IL-33，任选地与第二或更多种活性成分组合)的药物组合物，和(2)信息材料，其含有关于如何分配药物组合物的说明，包括可以治疗的患者类型(例如，患有AD、MCI、PD、抑郁症、中风或创伤性脑损伤的患者)的描述、时间表(例如，剂量和频率)和施用路径等等。
实施例
以下实施例仅作了说明而提供，而不作为限制。本领域技术人员将容易认识到可以改变或修改以产生基本上相同或类似的结果的各种非关键参数。如所附权利要求所限定的，这些实施例决不应被解释为限制本发明技术的范围。
实施例1-12的材料和方法
化学品和抗体。对IL-33具有特异性的抗体(克隆Nessy-1)和对APP具有特异性的抗体分别购自Biolegend和Abcam；Iba1抗体来自Wako；抗小鼠CD11b的APC缀合抗体(克隆M1/70)和抗CD45的FITC缀合抗体(克隆30-F11)来自eBioscience；Aβ17-24抗体(克隆4G8)来自Covance；胰岛素降解酶(IDE)抗体来自Calbiochem；脑啡肽酶(NEP)抗体来自SantaCruz；肌动蛋白抗体来自Sigma-Aldrich。可溶性ST2(sST2)-Fc重组蛋白购自R&D Systems；荧光素缀合(FAM)-Aβ1-42单体来自rPeptide；甲氧基-X04(MeX04)购自TocrisBioscience；Hoechst 34580、人Aβx-40和Aβx-42商业ELISA试剂盒和Alexa Fluor二次抗体购自Life Technologies。
动物操纵。所有动物实验均经香港科技大学动物管理委员会批准。APP/PS1双转基因小鼠通过掺入携带瑞典双重突变和外显子-9缺失的PSEN1突变(APPswe+PSEN1/dE9)的人/小鼠APP构建体来产生。所有体内分析都是对性别和年龄匹配的组执行；使用两种性别的小鼠进行实验，不同的是对于行为任务，只使用雄性小鼠。将APP/PS1转基因小鼠及其野生型(WT)对照随机分配至各个实验条件。基因型通过尾部活组织检查的PCR分析证实。每个具有12小时光照/黑暗周期的笼安置四至五只同性别的小鼠，其中随意进食进水。样品量主要基于类似类型实验的经验来选择。
每天将小鼠重组IL-33(200ng/小鼠)腹膜内(i.p.)注射到APP/PS1小鼠(7-17月龄)中。IL-33的施用范例对于每个实验是不同的。用于研究淀粉样斑块负荷、Aβ的小神经胶质细胞吞噬和长时程增强(LTP)的小鼠每日施用IL-33，历时2天。对于动物行为试验，在开始开场试验之前连续两天对小鼠每天腹膜内注射IL-33一次，且然后在行为实验过程期间隔日注射一次。
sST2通过微型渗透泵以0.11μL/h(1004型；Alzert)递送至10-11月龄的APP/PS1小鼠中。将在人工脑脊液(aCSF)中的小鼠重组sST2蛋白质(每泵240ng；10μg/mL)或媒介物溶剂装载到泵中。在sST2递送2天之后，再对小鼠腹膜内施用IL-33两天。在治疗结束时，将小鼠用杜比可磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)(DPBS)灌注，并用4％多聚甲醛固定。
免疫组织化学。为了检查淀粉样斑块负荷，将灌注的小鼠脑部冠状切片(20μm)用于免疫组织化学。简言之，通过微波加热在柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸三钠，0.5％Tween-20，在H2O中，[pH 6.0])中的脑切片10分钟，然后用在H2O中的3％H2O2温育20分钟以抑制内源性过氧化物酶活性来执行抗原修复。用在Tris缓冲盐水(TBS)中的2％山羊血清阻断切片20分钟，且随后在4℃下用在阻断缓冲液中的Aβ17-24抗体(1:1000稀释)标记过夜。随后在室温下用Dako HRP连接的山羊抗小鼠IgG抗体标记小鼠脑切片50分钟，并且随后根据制造商的说明使用Dako DAB色原体试剂盒显影。使用与Leica HC PL FLUOTAR 10×/0.30物镜组合的Leica DM6000B全自动竖式复合显微镜系统执行成像。为了确定脑切片的皮质和海马中Aβ斑块的数量和密度，使用Stereo Investigator软件(mbf Bioscience)通过立体细胞计数法分析全脑切片的拼接图像。计数框架和采样网格分别为180×180μm和400×400μm。所分析图像的误差系数均小于0.1，以确保无偏随机采样，因此精确估计。
为了检查淀粉样斑块和小胶质细胞的共定位，在室温下将灌注的小鼠脑用在DPBS中的1％牛血清白蛋白、4％山羊血清和2.5％Triton X-100阻断30分钟，且随后在4℃下用在阻断缓冲液中的Iba1(1:500稀释)和Aβ17-24(1:1000稀释)抗体温育过夜。然后通过Alexa Fluor二次抗体(1:1000稀释)标记脑切片。为了标记细胞核，将切片用Hoechst34580(5μg/mL)温育。使用与Leica HC PL APO 63×/1.40oil CS2物镜组合的Leica TCSSP8共焦系统执行成像。
对于Aβ和人ST2的ELISA。从小鼠皮质或海马的可溶性部分和不溶性部分中依次提取Aβ。简言之，将小鼠皮质在含有250mM蔗糖、20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1mM EDTA、1mM EGTA和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的缓冲液中匀浆。通过二乙胺(DEA；可溶)，接着甲酸(FA；不溶)依次提取Aβ。根据制造商的说明，通过ELISA(Invitrogen)分析Aβx-40和Aβx-42。采集MCI、AD和对照患者的血浆并进行ST2 ELISA。
FAM-Aβ1-42制备。将单体Aβ1-42溶解于无水DMSO中，并在冰冷的不含酚红的F-12培养基中稀释以产生100μM的最终浓度。将FAM-Aβ1-42溶液在4℃下温育24小时，且然后以14,000×g离心10分钟。将上清液在液氮中冻结并在-20℃下储存多达1个月。
小鼠小胶质细胞的分离。从成年小鼠中分离小胶质细胞。简言之，将小鼠麻醉并用冰冷的DPBS灌注。将分离的皮质切成小段，且随后根据制造商的说明使用具有gentleMACSTM解离剂系统(Miltenyi Biotec)的基于木瓜蛋白酶的神经解离试剂盒酶促且机械地解离。使用30％Percoll梯度(Sigma-Aldrich)除去髓磷脂。所得单核细胞悬浮液用于流式细胞术分析或建立小胶质细胞培养物。
流式细胞术。连续两天对17月龄的APP/PS1小鼠每天腹膜内注射在DPBS中的IL-33或者单独的DPBS一次。第二天，对小鼠腹膜内注射10mg/kg MeX04。还对两只WT C57小鼠注射MeX04作为对照。在注射MeX04三小时后，将小鼠处死。然后将来自小鼠脑皮质的分离的单核细胞悬浮液用小鼠FcR阻断剂(Miltenyi Biotec)温育，并用APC缀合的小鼠CD11b(1:100稀释)和FITC缀合的CD45(1:100稀释)抗体标记。通过Becton Dickinson FACSAria IIIu流式细胞仪分析悬浮液中的细胞群。根据前向散射参数和侧向散射参数，将细胞碎片选通以便分析悬浮液中的单核细胞。骨髓细胞(即，CD11b+细胞)基于更高的APC荧光强度来鉴定。另外，在CD11b+群体之中，根据FITC荧光强度进一步区分CD45表达水平，其中CD11b+CD45lo和CD11b+CD45hi群体分别被鉴定为小胶质细胞和巨噬细胞。
体外小神经胶质细胞吞噬测定。将由1.5-2月龄的ST2+/+或ST2-/-小鼠制备的分离的小胶质细胞用CD11b抗体(克隆M1/70)缀合的微珠(1:20稀释)温育，并通过附接到磁性夹持器的MS柱(Miltenyi Biotec)分离。将CD11b+细胞(小神经胶质细胞)在具有补充有10％胎牛血清(Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(Life Technologies)的DMEM/F12培养基(LifeTechnologies)的8孔腔室载玻片(每孔30,000个细胞；SPL Life Sciences)洗脱并接种。在体外6至7天，将小胶质细胞用IL-33预处理20小时，然后用2μM FAM-Aβ1-42预处理1小时。然后将细胞用多聚甲醛固定，并用Iba1抗体和Hoechst 34580免疫染色。通过使用IN细胞分析仪6000系统(GE Healthcare)执行宽视场荧光显微术。在每个孔中在由软件分配的16个对应位置处获取图像。在不同样品上使用相同的阈值标准对每个通道应用强度分段。根据Iba1+标记强度确定小胶质细胞的边界，并且量化在每个Iba1+细胞中的FAM-Aβ1–42。在治疗组之间比较吞噬的FAM-Aβ1-42的量。将吞噬的FAM-Aβ1-42的面积除以相应的细胞面积以获得给定细胞中FAM-Aβ1-42的相对面积。随后将数据归一化到对照。
实时PCR、定量PCR和数字PCR。使用Transcriptor First Strand cDNA SynthesisKit(Roche)将来自小神经胶质细胞的总RNA逆转录为cDNA，同时使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara)将来自皮质的总RNA逆转录。同时，使用以下特异性引物通过实时定量PCR(Life Technologies)和数字PCR(Biorad)检测sST2和膜锚定的ST2(ST2L)：sST2正向，5′-TCG AAA TGA AAG TTC CAG CA-3′(SEQ ID NO:5)；sST2反向，5′-TGT GTG AGG GAC ACTCCT TAC-3′(SEQ ID NO:6)；ST2L正向，5′-CAT GGC ATG ATA AGG CAC AC-3′(SEQ ID NO:7)；ST2L反向，5′-GTA GAG CTT GCC ATC GTT CC-3′(SEQ ID NO:8)。通过实时定量PCR确定的候选基因的RNA序列通过使用Universal ProbeLibrary System(Roche)验证。
小胶质细胞的转录组分析。对于用于转录组分析的RNA测序，从施用IL-33或对照媒介物(腹膜内)两天的12月龄WT和APP/PS1小鼠的皮质中收获分离的小胶质细胞(即，CD11b+细胞)(每组，n＝2)。随后从整个大脑/皮质中分离小胶质细胞用于RNA提取。根据制造商的规程通过RNA XS(Macherey-Nagel)提取总RNA，并且使用Agilent2100 BioAnalyzer评估RNA完整性。进一步加工RIN>8的样品以构建文库，其中用NanoDrop3300荧光谱仪定标的1ng总RNA作为起始材料。扩增的全长cDNA根据制造商规程自UltraTMLow RNA Kit(Clontech)获得，并用Low Input Library Prep Kit(Clontech)进一步定标到1ng用于文库构建。在illumina NextSeq 500对于2×150bp高通量测序(300个循环)执行测序。
为了分析测序数据，将具有约18Gb/样品数据的8个样品(每组，n＝2)与具有STAR-2nd通道管线的mm10基因组组装(UCSC)对齐。对齐的BAM文件通过Cufflinks管线进一步加工用于转录组组装和差异表达分析。基因表达的缺失值被设定为0.001，平均值0.5FPKM作为截断以消除小胶质细胞中的低丰度基因。
使用R统计软件包执行下游统计学分析，R统计软件包包括单因素ANOVA、t检验、K均值聚类以及平均值和倍数变化的计算，以及注释Gene本体的DAVID、用于富集分析的GSEA和分类蛋白质网络的STRINGdb。所有曲线图都通过R脚本构建。
西方印迹分析。在放射免疫沉淀测定缓冲液(1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、150mM NaCl、10mM磷酸钠、2mM EDTA和0.2％钒酸钠)中用各种蛋白酶抑制剂裂解冻结的脑组织。执行西方印迹分析。使用NIH ImageJ程序执行来自西方印迹分析的蛋白质谱带强度的密度量化。
长时程增强。简言之，处死小鼠，且立即切除整个大脑并将其浸泡在补充有95％O2/5％CO2的冰冷的aCSF中。脑切片(300μm厚)使用振动切片机(HM650V，Thermo)制备，并在32℃下在含氧的缓冲液中浸泡2小时。将小鼠海马切片放置于在用具有100-μm电极间距离的8×8电极阵列(20×20μm，氧化铟锡和铂黑)制造的MED-P210A探针(PanasonicInternational Inc.)上的预涂的聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich)上。在显微镜(MIC-D,Olympus,Tokyo,Japan)下，将电极手动放置在CA3-CA1区域。将每个切片浸入并用含氧的aCSF以1.3-1.5mL/min灌注。通过选择谢弗侧枝(Schaffer collateral)途径中的电极作为刺激电极，记录来自CA1神经元的树突层的fEPSP。基于刺激-反应曲线，选择以30-40％的最大反应诱发fEPSP的刺激强度。LTP由3列高频刺激(100Hz，1秒，间隔30秒递送)诱导。记录破伤风后的场电位反应60分钟。将LTP的量值量化为在LTP诱导后60分钟内fEPSP的平均斜率的百分比变化。
开场试验。通过使用来自San Diego Instruments的光束活性系统和软件来记录并跟踪开场试验中的小鼠的运动活性。简言之，将实验小鼠放置在开顶式腔室(16×16×15英寸)的中心中，周边有光束阵列。连续3天每天允许小鼠探查腔室15分钟。通过光束记录3次训练试验中的自主活动，且随后确定移动的距离。每次试验后，用70％乙醇清洗腔室。
统计学分析。执行电生理学、免疫组织化学、流式细胞术和行为试验的研究人员对小鼠的基因型和治疗条件不知情。所有数据均表示为算术平均值±SEM。统计分析通过使用GraphPad Prism v5.0执行。差异的显著性通过学生t检验或者单因素或双因素ANOVA评估，然后通过如所指示的邦弗朗尼事后检验评估。显著水平设定在p<0.05下。
实施例1：IL-33减轻APP/PS1小鼠的突触损伤。
对APP/PS1和WT小鼠(约7.5月龄)腹膜内(i.p.)施用IL-33历时2天，且通过长时程增强(LTP)检查突触功能。图1A-1B中提供的数据显示，腹膜内注射重组IL-33(200ng)两天显著逆转APP/PS1小鼠的LTP损伤。
实施例2：IL-33减轻APP/PS1小鼠的行为缺陷。
对APP/PS1小鼠(14月龄)腹膜内施用IL-33并且通过开场(OF)探索性试验和筑巢(NB)试验来评估其行为性能的变化。结果提供在图2A-2C中。在探索性开场(OF)试验中，注射媒介物的WT小鼠和注射IL-33的WT小鼠在训练过程期间在新试验环境中表现出类似的习惯化能力(图2B)。APP/PS1小鼠对试验环境表现出比WT小鼠慢的习惯化；然而，相对于未治疗的对照而言，IL-33治疗的APP/PS1小鼠显示出对试验环境改善的习惯化(图2B)。相对于未治疗的对照而言，IL-33治疗的APP/PS1小鼠也显示出改善的筑巢评分(图2C)。
实施例3：IL-33施用减小APP/PS1小鼠的Aβ斑块负荷。将可溶性ST2输注到APP/PS1 小鼠的脑中废除IL-33的作用。
APP/PS1小鼠(10月龄)通过渗透泵脑室内输注可溶性ST2受体且腹膜内施用IL-33两天。然后对小鼠脑灌注PFA并将其切片。使用DAB试剂盒将脑切片用抗Aβ抗体(4G8)免疫染色。在显微镜下检查斑块密度。结果提供在图3A-3B中。在IL-33治疗2天后，在10月龄的APP/PS1小鼠的皮质中4G8-标记的淀粉样斑块减少(图3A右上图；图3B)。然而，脑室内施用sST2废除了在APP/PS1小鼠中IL-33介导的4G8-染色的淀粉样斑块的减少(图3A右下图；图3B)。
实施例4：IL-33施用减小APP/PS1小鼠中的可溶性Aβ水平。
对APP/PS1小鼠(10月龄)腹膜内施用IL-33两天。然后采集小鼠脑并将其分级。Aβ蛋白通过AβELISA试剂盒(Life Technologies)确定。结果提供在图4A-4B中。IL-33注射减少10月龄APP/PS1小鼠的皮质中可溶性Aβx–40和Aβx–42物质的量(图4A)。
实施例5：IL-33增强小胶质细胞的Aβ摄取。
由于小胶质细胞的Aβ吞噬活性直接影响Aβ清除，因此检查在IL-33施用后APP/PS1小鼠脑中由常驻小胶质细胞/浸润单核细胞引起的Aβ吞噬和降解的变化。对APP/PS1小鼠(10月龄)腹膜内施用IL-33两天。然后对小鼠脑灌注PFA并将其切片。将脑切片用抗-Aβ和Iba1(小胶质细胞标志物)抗体免疫染色。在显微镜下检查脑切片。结果提供在图5A-5C中。
发现Iba1+骨髓细胞的簇邻近在APP/PS1小鼠的皮质中的淀粉样斑块(图5A)。IL-33注射增强Iba1+骨髓细胞向这些皮质中的淀粉样斑块的募集(图5A右下图)。3D分析证实IL-33治疗的APP/PSA1小鼠脑中骨髓细胞和淀粉样斑块的共定位增加(图5B-5C)，支持了IL-33增强在骨髓细胞与淀粉样斑块之间的接近性的观点。
实施例6：IL-33增强APP/PS1小鼠中Aβ的小胶质细胞吞噬摄取。
为了展示IL-33促进骨髓细胞的Aβ吞噬作用，对APP/PS1小鼠(17月龄)腹膜内施用IL-33两天并通过腹膜内注射用甲氧基-X04(MeX04)(一种穿过血脑屏障并特异性结合Aβ的荧光染料)标记小胶质细胞的Aβ摄取。将小胶质细胞分离并用CD11b和CD45抗体标记。执行流式细胞术分析以确定小神经胶质细胞的Aβ吞噬活性。
图6A-6F中提供的数据显示IL-33增强常驻小胶质细胞的Aβ摄取。流式细胞术分析检测在来自APP/PS1小鼠的皮质的约33％的CD11b+骨髓细胞中的MeX04标记的Aβ(图6A-6B)，但未检测WT小鼠的那些(图23A-23C)。IL-33注射进一步增加了表现出MeX04荧光的CD11b+细胞的比例(约47％；图6A-6B)。
提示常驻小神经胶质细胞和浸润性单核细胞在清除在神经退化和脑损伤中的不想要的材料方面发挥吞噬作用。检查在IL-33治疗的APP/PS1小鼠脑中表现出增加的Aβ吞噬活性的CD11b+骨髓细胞的亚组。图24A-24G中提供的数据显示IL-33不增加APP/PS1小鼠的脑中外周单核细胞的吞噬活性的浸润。常驻小胶质细胞和浸润的单核细胞可以分别通过低CD45(CD45lo)和高CD45(CD45hi)表达分化。WT小鼠中的大多数CD11b+骨髓细胞是常驻小胶质细胞，如由低CD45表达(>90％CD45lo；图24A)表征。与WT小鼠(图24A-24D)相比，APP/PS1小鼠表现出约3.6倍的浸润性单核细胞(CD11b+CD45hi骨髓细胞)。在APP/PS1小鼠中，约10％的CD11b+CD45lo常驻小神经胶质细胞吞噬Aβ(图6C-6D)，且约80％的CD11b+CD45hi浸润性单核细胞摄取MeX04-标记的Aβ(图6E-6F)。IL-33施用使常驻小胶质细胞的Aβ吞噬摄取显著增加80％，而含有Aβ的浸润性单核细胞的百分比保持相对稳定(图6C-6F)。
实施例7：IL-33/ST2信号传导介导小胶质细胞吞噬活性。
通过从成年ST2-野生型和ST2-缺陷型小鼠脑中分离小胶质细胞产生原代小胶质细胞培养物。将培养物用IL-33预温育，然后暴露于荧光标记的Aβ治疗。然后通过定量细胞内的荧光评价小胶质细胞摄取Aβ的能力。然后将细胞用多聚甲醛固定，并用Iba1抗体和Hoechst34580免疫染色。通过使用IN细胞分析仪6000系统(GE Healthcare)执行宽视场荧光显微术以检查Aβ摄取。比较在对照(Con)和IL-33治疗的ST2+/+和ST2-/-培养物之间FAM-Aβ1–42摄取量的差异。
图7中提供的数据显示ST2-缺陷型小胶质细胞废除了IL-33刺激的Aβ摄取；然而，IL-33以剂量依赖的方式增强在WT小鼠中培养的小胶质细胞中荧光标记的低聚Aβ1–42的摄取(图25C)。与ST2在小胶质细胞中的显著表达一致(图26A)，在IL-33治疗时ST2受体的下游信号传导分子(p38和ERK1/2MAPK)在培养的小胶质细胞中被激活(图26B-26D)。这些结果指示小胶质细胞中的ST2信号传导介导APP/PS1小鼠脑中的Aβ吞噬作用的IL-33相关增强。
实施例8：IL-33增强APP/PS1小鼠中Aβ的降解活性。
可溶性Aβ可以被包括脑啡肽酶和胰岛素降解酶的Aβ-降解酶降解。对APP/PS1小鼠(10月龄)腹膜内施用IL-33两天。采集皮质用于西方印迹分析以确定脑啡肽酶(NEP)和胰岛素降解酶(IDE)表达。
图8A-8C中提供的数据显示，尽管在APP/PS1小鼠的脑中观察到降低的脑啡肽酶表达(图8A)，但在APP/PS1小鼠中，IL-33施用增加脑啡肽酶(NEP)蛋白表达(图8B)，但不增加胰岛素降解酶(IDS)表达(图8C)。总之，这些数据展示，IL-33施用通过可能通过增加脑啡肽酶水平来增强Aβ清除而减轻在APP/PS1小鼠中的淀粉样斑块病理。
实施例9：小鼠中IL-33和美金刚的组合治疗衰减急性海马切片的Aβ介导的突触损 伤。
为了研究IL-33和美金刚的共同治疗在AD进展期间是否发挥协同作用以缓解突触损伤，对C57小鼠共同施用1mg/kg/天的美金刚(通过口服施用)和50ng/天的IL-33(通过腹膜内施用)。先前，确定需要以至少200ng/天的剂量施用IL-33来挽救APP/PS1小鼠中的LTP损伤。
在共同治疗2天之后，自治疗的小鼠脑制备海马切片并对其进行LTP分析。具体地讲，将分离的海马切片在含氧的缓冲液中更新2小时，且然后在LTP刺激之前用500nM Aβ温育2小时。图9和图35A-35B中提供的结果指示，与单独用美金刚治疗相比，IL-33和美金刚组合治疗在挽救LTP损伤方面具有协同作用。
实施例10：IL-33调节APP/PS1小鼠中的小神经胶质细胞的转录组标签。
对WT和APP/PS1小鼠(12月龄)腹膜内注射IL-33或对照媒介物(Con)2天(每组，n＝2)。提取来自小鼠皮质的小胶质细胞的总RNA并对其进行低输入RNA测序以鉴定转录组标签。
图10A-10C显示IL-33改变APP/PS1小鼠中的小胶质细胞转录组标签。在每个基因集中的上调基因的相应网络根据STRING数据库进行分类。结果在图10D-10O中指示。显示在APP/PS1小鼠的小胶质细胞中响应于IL-33的顶部六种网络：胆固醇平衡(图10D和图10G)；IL-6/JAK/STAT3信号传导(图10E和图10H)、IFN-α反应(图10F和图10I)；IFN-γ反应(图10J和图10M)；细胞周期的G2M期(图10K和图10N)；和TNF-α反应(图10L和图10O)。分析还显示IL-33增加具体是Toll样受体2(TLR2)(图10P)、低密度脂蛋白受体(LDLR)(图10Q)和巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)(图10R)的Aβ受体的转录。
实施例11：可溶性ST2浓度在MCI患者血清中增加。
使用人ST2ELISA试剂盒(R&D systems)，测量在从患有阿尔茨海默氏病(AD)和轻度认知损伤(MCI)的患者以及健康对照中获得的血清中的可溶性ST2(sST2)水平(ng/ml)。图11和图27A中提供的结果显示与来自AD患者和对照的血清相比，在来自MCI患者的血清中sST2水平增加。
实施例12：APP/PS1小鼠皮质中可溶性ST2和膜锚定的ST2mRNA表达增加。
通过定量PCR检查野生型和APP/PS1小鼠皮质(12月龄)中的sST2的mRNA表达和膜锚定形式的ST2(ST2L)的mRNA表达。图12中提供的数据显示，在APP/PS1小鼠的皮质中sST2和ST2L均升高。
实施例13-21的材料和方法
试剂。小鼠重组IL-33(mIL-33)(#580506)自BioLegend获得。人重组IL-33(hIL-33)(#581802)自BioLegend获得。sST2-Fc重组蛋白(1004-MR-050)和ST2/IL-1 R4Quantikine ELISA试剂盒(DST200)自R&D Systems购买。对IL-33具有特异性的抗体(克隆Nessy-1，ab54385)和对APP具有特异性的抗体(克隆DE2B4，ab11132)购自Abcam；Iba1抗体(019-19741)来自Wako；抗CD11b的APC缀合抗体(克隆M1/70)和抗CD45的FITC缀合抗体(克隆30-F11)来自eBioscience；CD68抗体(FA-11)来自AbD Serotec；用于免疫组织化学的单克隆4G8抗体(识别Aβ17–24；SIG-39220)和用于西方印迹分析的6E10抗体(识别Aβ1–16；SIG-39320)来自Covance；P-p38(#4511)、p38(#9212)、P-ERK1/2(#4377)和ERK1/2(#9102)抗体来自Cell Signaling Technology；肌动蛋白抗体(克隆AC-40；A4700)来自Sigma-Aldrich。荧光素-β-淀粉状蛋白(1-42)(A-1119-1)来自rPeptide；甲氧基-X04(#4920)来自TocrisBioscience；DAB来自DAKO；Hoechst34580(H21486)、人Aβx-40(KHB3481)和Aβx-42(KHB3441)商业ELISA试剂盒(ENZ-KIT140-0001)以及Alexa Fluor二次抗体来自Life Technologies；并且组胺ELISA试剂盒从Enzo获得。
低聚荧光素-Aβ1-42制备。将单体Aβ1-42溶解于无水DMSO中，并在冰冷的不含酚红的F-12培养基中稀释以达到100μM的最终浓度。将荧光素-Aβ1-42溶液在4℃下温育24小时，且然后以14,000×g离心10分钟。将上清液作为等分试样在液氮中冻结并在-20℃下储存多达1个月。
人受试者。所有病例都涉及汉族患者。临床诊断根据国立神经病学语言功能障碍和中风研究所/阿尔茨海默氏病和相关病症协会标准建立。人类轻度认知功能损伤(MCI)病例从浙江大学医学院附属第二医院神经科门诊或住院门诊收集，且没有痴呆症的对照组在2014-2015年从健康检查中心招募。
还记录了关于年龄、性别、教育程度、病史和家族史的资料(图27)。采集混合性别的17名健康对照(NC)和18名MCI患者的血清。招募的NC和MCI患者≥60岁。患有其他神经或精神病症或临床显著的医学病症的患者被排除在外。患者没有关于头部创伤、酒精或药物滥用的病史。本研究经浙江大学医学院附属第二医院和香港科技大学的伦理委员会批准。参与本研究的知情同意书直接或由法定监护人获得。
小鼠。通过掺入携带瑞典双重突变和外显子-9缺失的PSEN1突变(APPswe+PSEN1/dE9)的人/小鼠APP构建体产生的APP/PS1双转基因小鼠从Jackson Laboratory(B6C3-Tg[APPswe,PSEN1dE9]85Dbo/J)获得。先前已经描述了过度表达在人APP(695)中的K670N/M671L(瑞典)、I716V(佛罗里达)和V717I(伦敦)突变以及在人PS1中的M146L和L286V突变的5XFAD小鼠的产生(Oakley,H.等，J.Neurosci.26(40):10129-10140(2006))。5XFAD小鼠由香港大学Sookja Kim Chung博士友情提供。St2-/-小鼠自Dr.Andrew McKenzie(Xu,D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105(31):10913-10918(2008))获得。基因型通过尾部或耳部活组织检查的PCR分析证实。野生型C57BL/6小鼠自Jackson Laboratory获得。
所有小鼠都被安置在香港科技大学(HKUST)的动物与植物保育中心。所有的动物实验都得到了HKUST的动物伦理委员会的批准。每个具有12小时光照/黑暗周期的笼安置四只同性别的小鼠，并且随意进食进水。所有体内实验都对性别和年龄匹配的组执行。使用两种性别的小鼠进行实验。将小鼠随机分配至实验条件。样品量主要基于类似类型实验的经验来选择。所有的动物实验都在光照阶段进行。
体内实验。对6-25月龄的小鼠腹膜内注射小鼠重组IL-33(200ng/小鼠)。为了研究淀粉样斑块负荷、Aβ的小神经胶质细胞吞噬作用、mRNA表达和LTP，连续两天对小鼠注射IL-33。使用MED64多通道记录系统(Panasonic International Inc.)记录场兴奋性突触后电位。对于行为实验，如图13和图14A中所指示，对小鼠腹膜内注射IL-33。开场试验和情境性恐惧条件反射如先前所述进行(Sananbenesi,F.等，Nat.Neurosci.10(8):1012-1019(2007)；Ip,FC.等，Neuropsychopharmacology 40(8):1877-1887(2015))。可溶性ST2(sST2)通过微型渗透泵(1004型，Alzet)以0.11μL/h递送至APP/PS1小鼠中。微型渗透泵在右半球脑室内调整。用在人工脑脊液(aCSF；119mM NaCl、2.5mM KCl、2.5mM CaCl2·2H2O、1mM NaH2PO4·2H2O、1.3mM MgCl2·6H2O、26.2mM NaHCO3、11mM d-葡萄糖)中的小鼠重组sST2蛋白(每个泵，240ng；10μg/mL)或媒介物装载泵。在sST2递送2天后，再对小鼠腹膜内施用IL-33两天。在治疗结束时，处死小鼠，并用4％多聚甲醛固定脑。
LTP。简言之，处死小鼠，并立即切除整个大脑并将其浸泡在补充95％O2/5％CO2的冰冷的aCSF中。脑切片(300μm)然后使用振动切片机(HM650V，Thermo)制备，并在32℃下在含氧的aCSF中浸泡2小时。将小鼠海马切片放置于在用具有100-μm电极间距离的8×8电极阵列(20×20μm，氧化铟锡和铂黑)制造的MED-P210A探针(Panasonic InternationalInc.)上的预涂的聚乙烯亚胺(Sigma-Aldrich)上。在显微镜(MIC-D,Olympus)下，将电极手动放置在CA3-CA1区域。将每个切片浸入并用含氧的aCSF以1.3-1.5mL/min灌注。通过选择谢弗侧枝途径中的电极作为刺激电极，记录来自CA1神经元的树突层的场兴奋性突触后电位(fEPSP)。基于刺激-反应曲线，选择以30-40％的最大反应诱发fEPSP的刺激强度。LTP由3列高频刺激(100Hz，1秒，间隔30秒递送)诱导。记录破伤风后的场电位反应60分钟。将LTP的量值量化为在LTP诱导后60分钟内fEPSP的平均斜率的百分比变化。
开场试验。通过使用光束活性系统和软件(San Diego Instruments)来记录并跟踪开场试验中的小鼠的自主活动。简言之，将实验小鼠放置在开顶式腔室(16×16×15英寸)的中心，周边具有光束阵列。连续3天每天允许小鼠探查腔室15分钟。通过光束记录3次训练试验中的自主活动，且随后确定移动的距离。每次试验后，用70％乙醇清洗腔室。
情境性恐惧条件反射。在训练当天，允许小鼠在具有连线到电击发生器的地板的封闭训练室中探查180秒。然后将小鼠暴露于纯音30秒，接着是2秒的足底电击(0.8mA)。在递送第二次电击后60秒，使小鼠返回窝笼。在电击之后1天和7天评估恐惧反应(冻结)。将小鼠再次暴露于原始腔室5分钟，并通过Contextual NIR Video Fear Conditioning System(Med Associates Inc.)测量冻结时间。
免疫组织化学。将灌注的小鼠脑的冠状冷冻切片(20μm)用于免疫组织化学。对于4G8免疫染色，通过微波加热在柠檬酸钠缓冲液(10mM柠檬酸三钠，0.5％Tween-20，在H2O中，[pH 6.0])中的切片10分钟，然后用在H2O中的3％H2O2温育5分钟以抑制内源性过氧化物酶活性来执行抗原修复。用在Tris缓冲盐水中的2％山羊血清阻断切片20分钟，且随后在4℃下用在阻断缓冲液中的4G8抗体(1:500稀释)标记过夜。随后在室温下用Dako HRP连接的山羊抗小鼠/兔IgG抗体标记切片50分钟，并且用Dako DAB色原体试剂盒显影。使用LeicaDM6000B复合显微镜系统执行成像。通过Image J(National Institutes of Health)的“Analyze Particles”功能分析脑切片的皮质中的Aβ斑块的面积。用于淀粉样斑块分析的皮质的区域在海马之上。分析每只小鼠的三个脑切片(相隔约200-300μm)，并且计算淀粉样斑块占据的皮质面积的平均百分比。
为了检查淀粉样斑块和小胶质细胞的共定位，在室温下用在DPBS中的1％牛血清白蛋白、4％山羊血清和0.4％Triton X-100阻断脑切片30分钟，且然后在4℃下用Iba1抗体(1:500稀释)和4G8抗体(1:1000稀释)温育过夜。使用Leica TCS SP8共焦系统执行成像。
为了确定IL-33的血脑屏障渗透性，对11月龄的APP/PS1小鼠腹膜内注射在DPBS中的IL-33(200ng)或单独的DPBS。采集小鼠皮质和血清用于IL-33ELISA。
Aβ提取、西方印迹分析和ELISA。从小鼠皮质的可溶性部分和不溶性部分中依次提取Aβ。在指定的裂解缓冲液中用各种蛋白酶抑制剂裂解冻结的脑组织。简言之，将小鼠皮质在含有250mM蔗糖、20mM Tris-HCl(pH 7.4)、1mM EDTA、1mM EGTA和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)的缓冲液中或在放射免疫沉淀测定缓冲液中匀浆。使用NIH ImageJ程序执行来自西方印迹分析的蛋白质谱带强度的密度量化。通过二乙胺(可溶)，接着甲酸(不溶)依次提取可溶性Aβ。使用西方印迹分析确定可溶性Aβ和不溶性Aβ的水平。可溶性Aβx–40和Aβx–42通过ELISA分析。
小鼠小胶质细胞的分离。将成年小鼠麻醉并用冰冷的DPBS灌注。将分离的皮质切成小段，并且根据制造商的说明使用具有gentleMACS解离剂系统(Miltenyi Biotec)的基于木瓜蛋白酶的神经解离试剂盒(130-092-634,Miltenyi Biotec)酶促且机械地解离。使用Percoll梯度(30％，Sigma-Aldrich)除去髓磷脂。所得单核细胞悬浮液用于流式细胞术分析或建立小胶质细胞培养物。如通过荧光染色CD11b和流式细胞术分析所确定，小胶质细胞/浸润性单核细胞分离的纯度通常>90％。
Aβ的小胶质细胞吞噬作用的分析。对于体内分析，如所述执行实验(Zhang,GX等，Exp.Mol.Pathol.73(1):35-45(2002))。连续两天对APP/PS1或WT小鼠(17月龄)每天腹膜内注射在PBS中的IL-33或单独的PBS。第二天，对小鼠腹膜内注射甲氧基-X04(10mg/kg)。在甲氧基-X04注射之后3小时深度麻醉小鼠，并用冰冷的PBS在左心室中灌注。然后将来自小鼠脑皮质的分离的单核细胞悬浮液用小鼠FcR阻断剂(Miltenyi Biotec)温育，并用APC缀合的小鼠CD11b抗体(1:100稀释)和FITC缀合的CD45抗体(1:100稀释)标记并且通过BectonDickinson FACSAria IIIu流式细胞仪分析。骨髓细胞被鉴定为CD11b+细胞，并分别通过低CD45表达(CD11b+CD45lo)和高CD45表达(CD11b+CD45hi)进一步分类为小胶质细胞或浸润性单核细胞。
对于体外小神经胶质细胞吞噬测定，小胶质细胞由St2+/+或St2-/-小鼠(1.5-2月龄)制备，并且在体外培养6-7天。然后将细胞用IL-33预处理20小时，接着用荧光素-Aβ1-42(2μM)预处理1小时。然后将细胞用多聚甲醛固定，并用Iba1抗体和Hoechst 34580免疫染色。使用IN细胞分析仪6000系统(GE Healthcare)执行宽视场荧光显微术。在每个孔中在由软件分配的16个对应位置处获取图像。在不同样品上使用相同的阈值标准对每个通道应用强度分段。根据Iba1+标记强度确定小胶质细胞的边界，并且量化在每个Iba1+细胞中的荧光素-Aβ1-42。将吞噬的荧光素-Aβ1-42的面积除以相应的细胞面积以获得给定细胞中荧光素-Aβ1-42的相对面积。
微滴数字PCR(ddPCR)和RT-qPCR。对于ddPCR，来自小鼠皮质的RNA使用TRIzol(Invitrogen)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)提取，并使用BioDropμLITE微体积分光光度计(BioDrop)量化，并且等量的RNA使用PrimeScript RT-PCR试剂盒(TaKaRa)反向转录。ddPCR根据制造商规程(Bio-Rad)执行。样品的拷贝数在重复数据中取平均值。将靶基因的拷贝数归一化到GAPDH或β-肌动蛋白的拷贝数。对于RT-qPCR，在RT之后的cDNA使用TaqManPreAmp Master Mix(Invitrogen)预扩增。PCR产物的PCR扩增和实时检测使用TaqMan基因表达测定(Applied Biosystems)和Premix Ex Taq qPCR测定(TaKaRa)执行。在含有2μL预扩增产物的20μL总体积中进行PCR。将mRNA表达值归一化到CD11b的水平。使用以下TaqMan探针：NLRP3(Mm00840904_m1)、IL-1β(Mm01336189_m1)、IL-6(Mm00446190_m1)、IL-13(Mm00434204_m1)、TGFβ(Mm01178820_m1)、GAPDH(Mm99999915_g1)、β-肌动蛋白(Mm02619580_g1)、总ST2(Mm00516117_m1)、Fizz1(Mm00445109_m1)、Arg1(Mm00475988_m1)和CD11b(Mm00434455_m1)。
统计学分析。执行电生理学、免疫组织化学、RNA表达和流式细胞术分析以及行为试验的研究人员对小鼠的基因型和治疗条件不知情。除了人sST2血清水平外，所有数据均以算术平均值±SEM表示。统计分析通过使用GraphPad Prism 6.0版执行。差异的显著性通过未配对的学生t检验或者单因素或双因素ANOVA评估，然后通过如所指示的邦弗朗尼事后检验评估。显著水平设定在p<0.05下。记录NC受试者和MCI受试者的可溶性ST2水平，数据分析使用R(版本3.2.2)执行。使用Shapiro-Wilk检验评估连续测量的归一化。使用双样品t检验比较两个受试者组中ST2水平的统计学比较。
实施例13：在3天探索性开场(OF)试验中IL-33治疗的APP/PS1小鼠表现出改善的 习惯化。
在探索性开场(OF)试验中，注射媒介物的WT小鼠和注射IL-33的WT小鼠在3天训练过程期间在新试验环境中表现出类似的习惯化能力。图13中提供的数据显示，APP/PS1小鼠对试验环境表现出比WT小鼠慢的习惯化；然而，IL-33治疗的APP/PS1小鼠显示出对试验环境显著改善的习惯化。
实施例14：IL-33治疗逆转APP/PS1小鼠中的情境性记忆缺陷。
使用情境性恐惧条件反射(FC)试验通过评价在施用电击之后1天和7天小鼠的冻结反应来评估IL-33治疗的APP/PS1小鼠的记忆形成和修复能力(图14A-14D)。不同实验组的小鼠在电击后立即作出的冻结反应方面没有表现出任何显著差异(图14B)。与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠在电击之后1天和7天表现出降低的冻结行为，指示恐惧记忆的情境性修复受损(图14C-14D)。而IL-33治疗的APP/PS1小鼠在电击之后1天没有表现出冻结性能的改善(图14C)，IL-33治疗能够恢复在电击之后7天APP/PS1小鼠的冻结反应受损(图14D)。
实施例15：IL-33治疗减轻APP/PS1小鼠中的淀粉样斑块病理。
在IL-33治疗之后两天，在12月龄的APP/PS1小鼠的皮质中，4G8-标记的淀粉样斑块显著减少(图15A-15B)。重要的是，sST2的脑室内施用废除了APP/PS1小鼠中IL-33介导的4G8-染色的淀粉样斑块的减少(图15A-15B)，展示IL-33/ST2信号传导的骨髓细胞的中枢激活在减轻脑淀粉样病理中的特异性。IL-33施用两天也减少在另一转基因小鼠模型5XFAD小鼠中4G8-染色的淀粉样斑块(图22A-22B)。
实施例16：IL-33增加Aβ斑块中的CD68表达。
CD68是溶酶体/核内体相关膜糖蛋白家族的跨膜糖蛋白，充当用于碎片清除的清道夫受体。在APP/PS1小鼠中，围绕淀粉样斑块的Iba1+骨髓细胞簇表现出弥漫性CD68分布(图16A)。IL-33施用增加在与淀粉样斑块紧密接触的Iba1+骨髓细胞中的CD68表达(图16B)。这些发现提示IL-33施用增加骨髓细胞的吞噬Aβ摄取。
实施例17：在APP/PS1小鼠中，IL-33驱使小胶质细胞进入另选的激活状态。
脑中的炎症反应在AD病理学中起重要作用。小胶质细胞极化与CNS中的免疫反应相关。在IL-33施用之后，在从WT和APP/PS1小鼠脑两者中分离的CD11b+骨髓细胞中，与抗炎作用相关的Arg1和Fizz1的mRNA表达显著增加(图17A-17B)。这些结果提示，IL-33驱动APP/PS1小鼠脑中的小胶质细胞/巨噬细胞朝向另选的激活表型，这可能有助于神经保护功能。
实施例18：IL-33压制APP/PS1小鼠中的促炎性基因。
IL-33可以减轻APP/PS1小鼠的大脑皮质中的全身炎症。在APP/PS1小鼠中，包括IL-1β、IL-6和NLRP3(NOD样受体家族，含热蛋白结构域3，炎性小体级联中的关键组分)的促炎基因显著位于脑皮质中(图18A-18C)。IL-33压制这些促炎基因的表达增加(图18A-18C)。这些结果提示IL-33调控APP/PS1小鼠脑中的炎症反应。
实施例19：IL-33在APP/PS1小鼠中腹膜内注射30分钟内到达大脑。
对APP/PS1小鼠(11月龄)腹膜内注射小鼠IL-33(200ng)30分钟。通过ELISA测量皮质(图19A)和血浆(图19B)中的IL-33水平。在腹膜内注射之后30分钟内IL-33到达大脑(图19A)，这与APP/PS1小鼠和AD患者的血脑屏障损害的早期发现一致。
实施例20：IL-33不影响APP/PS1小鼠中的血浆组胺水平。
连续两天对WT和APP/PS1小鼠(8月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)或媒介物对照。通过ELISA确定血浆组胺水平。在所使用的浓度(每天200ng，腹膜内，2天)下，IL-33不影响WT小鼠或APP/PS1小鼠中的血浆组胺水平(图20)。
实施例21：IL-33降低APP/PS1小鼠中的可溶性Aβ含量。
对APP/PS1小鼠(25月龄)腹膜内注射IL-33(200ng)三次，历时7天。图21中所示的西方印迹分析的结果展示，IL-33注射降低在25月龄的APP/PS1小鼠的皮质中的可溶性Aβ的量。
实施例22：APP/PS1小鼠中mIL-33的施用路径。
材料和方法。通过腹膜内注射(200ng，以300微升/小鼠/天)或皮下注射(s.c.；200ng，以500微升/小鼠/天)对APP/PS1小鼠(8-9.5月龄)注射IL-33。为了增强通过皮下注射实现的IL-33的吸收效率，对于每次注射在三个位点(下背部和肩部两侧)施用IL-33。在连续两天注射之后，半数小鼠脑在海马中谢弗侧枝-CA1突触处进行长时程增强(LTP)分析。简言之，将小鼠海马切片放置在用8×8电极阵列制造的MED-P210A探针(PanasonicInternational Inc.)上。将电极手动放置在CA3-CA1区域，并且从CA1神经元的树突层记录场兴奋性突触后电位(fEPSP)。LTP由3列高频刺激(100Hz，1秒，间隔30秒递送)诱导。记录破伤风后的场电位反应60分钟。另一半的小鼠皮质用于检查Aβ的水平。分别使用二甲胺和甲酸从小鼠皮质的可溶性部分和不溶性部分中依次提取Aβ。
结果。数据显示，皮下施用IL-33减轻淀粉样蛋白病理(图28A-28B)并挽救APP/PS1小鼠中的突触损伤(图29A-29B)。
实施例23：IL-33在APP/PS1小鼠中的耐久性。
材料和方法。为了研究IL-33在AD中的治疗潜力，对WT和APP/PS1小鼠(13月龄)进行3周IL-33治疗(200ng；腹膜内施用)。IL-33的治疗范例示于图30中。在治疗过程期间，使用包括探索性旷场试验(OF)和筑巢试验(NB)的行为试验评估IL-33对APP/PS1小鼠行为缺陷的有益作用(图30)。在这些试验之后，处死小鼠用于免疫组织化学分析和炎症基因表达分析。
对于OF试验，使用光束活性系统和软件(San Diego Instruments)记录并追踪小鼠的自主活动。将实验小鼠置于开顶式腔室的中心，并允许连续3天每天探查腔室15分钟。通过光束记录3次训练试验中的自主活动，且随后确定移动的距离。对于NB试验，将小鼠个别地安置在地板上铺有约1cm玉米芯床铺的新塑料笼中。在照明周期的黑暗阶段开始之前，向每只小鼠供应小窝挤压的棉方块(每个约3g)。在第1天使用5分量表对窝巢构建进行评分(1指示完整的小窝>90％，5表示撕坏的小窝>90％和清楚的巢坑)。所有的试验都是在光照阶段期间执行。
为了检查淀粉样斑块负荷，从灌注的小鼠脑切下20μm厚的冠状冷冻切片，并进行4G8(Aβ抗体)免疫染色。通过在柠檬酸钠缓冲液中微波加热切片，然后用在H2O中的3％H2O2温育5分钟以抑制内源性过氧化物酶活性来执行抗原修复。然后将切片用4G8抗体(1:500稀释)标记，然后用Dako HRP连接的山羊抗小鼠IgG抗体标记，并用Dako DAB色原体试剂盒显色。使用Leica DM6000B复合显微镜系统执行成像。通过Image J(National Institutes ofHealth)的“Analyze Particles”功能分析脑切片的皮质中的Aβ斑块的面积。用于淀粉样斑块分析的皮质面积是在海马上方的区域。对每只小鼠的三个脑切片(相隔约200-300μm)进行分析，并且计算由淀粉样斑块占据的皮质面积的平均百分比。
对于实时-qPCR分析，在RT之后的cDNA使用TaqMan PreAmp Master Mix(Invitrogen)预扩增。PCR产物的PCR扩增和实时检测使用TaqMan基因表达测定(AppliedBiosystems)和Premix Ex Taq qPCR测定(TaKaRa)执行。在含有2μL预扩增产物的20μL总体积中进行PCR。将mRNA表达值归一化到β-肌动蛋白的水平。
结果。在IL-33注射之后，APP/PS1小鼠在行为试验中表现出更好的性能(图31A-31B)。当与DPBS(Con)治疗的APP/PS1小鼠(图31A-31B)相比时，施用IL-33的APP/PS1小鼠在两个行为试验(即，OF试验和NB试验)中显示出性能改善的趋势。IL-33的长期治疗也减轻了APP/PS1小鼠中的淀粉样斑块负荷(图32A-32B)。另外，IL-33通过降低APP/PS1小鼠的脑皮质中的炎性基因的表达来调节全身炎症(图33A-33C)。
实施例24：人类IL-33在APP/PS1小鼠中的功效。
材料和方法。为了检查人IL-33(hIL-33)是否发挥与小鼠IL-33在AD中类似的有益作用，使用8-9.5月龄的APP/PS1小鼠。特定地讲，通过连续两天腹膜内注射(200ng，300微升/小鼠/天)对WT或APP/PS1小鼠施用从BioLegend(581802)获得的重组hIL-33。解剖海马，并在海马中谢弗侧枝-CA1突触处进行LTP分析。LTP由3列高频刺激(100Hz，1秒，间隔30秒递送)诱导。
结果。图34A-34B中提供的数据显示hIL-33表现出减轻APP/PS1小鼠中突触缺陷的生物活性。
结论
本文公开的发现说明本文公开的方法和组合物对于治疗或预防由神经退化和/或神经炎症引起的或以其他方式与神经退化和/或神经炎症相关的疾病或病症是有效的。
等同物
本发明技术不受在本申请中描述的特定实施方案的限制，这些实施方案旨在作为本发明技术的单个方面的单一说明。如本领域技术人员所显而易见的，本发明技术的许多修改和变化可以在不脱离其精神和范围的情况下进行。本领域技术人员从前面的描述中将显而易见除了本文列举的那些方法和装置外的在本发明技术范围内的功能上等同的方法和装置。这样的修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本发明技术仅由所附权利要求的权项以及这样的权利要求所提到的等同物的全部范围来限制。应该理解，本发明技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物学系统，其当然可以变化。还将理解，本文所使用的术语仅是用于描述特定实施方案的目的，并且不意图具限制性。
此外，在根据马库什组(Markush group)描述本公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开内容也由此根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组来描述。
如本领域技术人员将理解的，为了任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围以及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被容易地识别为充分描述相同的范围并使相同的范围能够被分解成至少相等的两等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围都可以被容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员也将理解的，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所列举的数字，并且是指可以随后分解成如上讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每一单个成员。因此，例如，具有1至3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1至5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。
本文提到或引用的包括GenBank登录号在内的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容(包括所有图和表格)都通过引用并入本文，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾即可。
其他实施方案在以下权利要求中阐述。

Claims (34)

1.一种用于治疗或降低在有需要的受试者中的神经退化的风险的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含IL-33的组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症或者处于患阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症的风险之中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述组合物经皮下、腹膜内、静脉内、皮内、脑室内、鞘内、口服、吸入、透皮或透粘膜施用。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述组合物与一种或多种另外的治疗活性剂共同施用。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述IL-33为重组IL-33蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述IL-33重组蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的多肽和与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的多肽。
8.一种用于确定受试者中神经退化的风险的方法，其包括：
(a)确定在取自所述受试者的生物学样品中分泌的可溶性ST2(sST2)水平；
(b)对所述sST2水平与标准对照进行比较；以及
(c)当在步骤(a)中获得的所述sST2水平大于所述标准对照时，确定所述受试者具有增加的神经退化的风险。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物学样品是血液、血清、血浆或脑脊髓液(CSF)样品。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中步骤(a)包括使用抗sST2的抗体的免疫学测定。
11.一种用于鉴定神经退化的调节剂的方法，其包括：
(a)在容许IL-33/ST2L结合或IL-33/sST2结合的条件下，使候选试剂与IL-33和全长ST2(ST2L)或sST2接触；
(b)检测IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平；以及
(c)当步骤(b)中获得的所述IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平大于或小于在相同条件下但在缺乏所述候选试剂的情况下的所述IL-33/ST2L或IL-33/sST2结合水平时鉴定所述候选试剂为神经退化的调节剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(a)包括体外蛋白质结合测定。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中步骤(a)包括在表达ST2L的细胞的表面上的蛋白质结合测定。
14.一种用于治疗或抑制受试者中的神经退化的药物，其包含：有效量的IL-33和药学上可接受的赋形剂。
15.根据权利要求14所述的药物，其还包含一种或多种另外的治疗活性剂。
16.根据权利要求15所述的药物，其中所述一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的药物，其中将所述药物配制成用于皮下、透皮、皮内、透粘膜、肌内、静脉内、腹膜内、颅内、脑室内、鞘内、局部或口服施用。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中将所述药物配制成用于皮下施用。
19.一种用于确定受试者中的神经退化的风险的试剂盒，其包含(1)用于确定取自所述受试者的生物学样品中的sST2水平的试剂；和(2)标准对照，其指示取自未患神经退化并且并未处于患神经退化的风险中的受试者的相同类型的生物学样品中的sST2水平。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述生物学样品是血液、血清、血浆或CSF样品。
21.根据权利要求19或20所述的试剂盒，其中所述试剂是对sST2具有特异性的抗体。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的试剂盒，其还包括用于确定神经退化的风险的说明手册。
23.一种用于检测受试者中分泌的可溶性ST2(sST2)的方法，其包括：
(a)通过使取自所述受试者的生物学样品与抗-ST2抗体接触并检测在所述sST2与所述抗体之间的结合来检测在所述样品中的sST2水平；以及
(b)对所述sST2水平与标准对照进行比较。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物学样品是血液、血清、血浆或脑脊髓液(CSF)样品。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中步骤(a)包括使用抗sST2的抗体的免疫学测定。
26.一种用于增加有需要的受试者中Aβ受体的转录的方法，其包括向所述受试者施用有效量的包含IL-33的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述Aβ受体包括选自Toll样受体2(TLR2)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和巨噬细胞清道夫受体1(MSR1)的受体。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述受试者患有阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症或者处于患阿尔茨海默氏病、轻度认知损伤、帕金森氏病或多发性硬化症的风险之中。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述组合物经皮下、腹膜内、静脉内、皮内、脑室内、鞘内、口服、吸入、透皮或透粘膜施用。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述组合物与一种或多种另外的治疗活性剂共同施用。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗活性剂选自多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、美金刚、阿杜单抗、罗格列酮、贝沙罗汀、氯沙坦和钩藤碱。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述IL-33为重组IL-33蛋白。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述IL-33重组蛋白包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的多肽和与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的多肽。
34.一种用于确定受试者中神经退化的风险的方法，其包括：
(a)确定在取自所述受试者的生物学样品中分泌的可溶性ST2(sST2)水平；
(b)对所述sST2水平与标准对照进行比较；
(c)当在步骤(a)中获得的所述sST2水平大于所述标准对照时，确定所述受试者具有增加的神经退化的风险；
(d)确定ST2的遗传变体，并将所述数据与取自所述受试者的生物学样品中的所述sST2水平组合；
(e)对所述sST2水平与同生群内的标准对照进行比较；以及
(f)当步骤(d)中获得的所述sST2水平大于所述标准对照时，确定所述受试者具有增加的神经退化的风险。
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