KR20180120433A

KR20180120433A - 불완전 척수 손상 모델의 제조방법

Info

Publication number: KR20180120433A
Application number: KR1020170054358A
Authority: KR
Inventors: 신태균; 심기범; 안미정; 김정태
Original assignee: 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2018-11-06
Also published as: KR102053770B1

Abstract

본 발명은 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 이용한 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법에 관한 것으로, 클립-압박 군에 비해 불완전한 인간 척수 손상을 유사하게 재현할 수 있으며 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제의 효과를 확인하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

불완전 척추 손상 모델의 제조방법{MANUFACTURING METHOD OF INCOMPLETE SPINAL CORD INJURY MODEL}

본 발명은 불완전 척추 손상 모델의 제조방법에 관한 것이다.

척수손상모델은 손상의 정도에 따라서는 불완전 척수손상과 완전척수손상으로 구분할 수 있다. 임상적으로 발생되는 척수 손상의 가장 많은 유형은 외상으로 인한 척추체의 방출성 골절(burst fracture) 및 추간판 탈출 등으로 인한 폐쇄된 공간에서의 부분적인 좌상(closed partial contusion injury)이며 척수의 절단으로 인한 완전 척수손상은 많지 않다.

AASCIN의 신경분류(2004년)에 의하면, 완전 손상은 '손상 척수 부위 아래로 3 척수 부위(척추 뼈) 이상에서 운동 및/또는 감각 기능이 보전되지 않는 상태'인 반면에, 불완전 손상은 '손상 척수 부위 아래로 3 척수 부위(척추 뼈) 이상에서 운동 및/또는 감각 기능이 일부 보전된 상태'로 정의하고 있다.

척수 손상이 일어나면 부위에 따라 감각, 운동신경 외에 방광과 대장기능을 조절하는 자율신경의 기능을 상실하게 되며, 다양한 임상증상을 보이게 된다. 지각장애, 운동장애, 방광직장장애 증세가 나타나는 것이 일반적이고, 완전히 또는 부분적으로 사지마비 또는 하지 마비가 일어난다. 척수의 상부가 침해될수록 장애의 범위도 넓고 중증이 된다고 알려져 있으며, 일단 손상된 척수에 대해서는 영구히 기능 회복을 기대할 수 없다고 알려져 왔다.

이러한 척수 손상에 대한 치료제 또는 치료 방법에 대해 관심이 집중된 가운데 이를 실험하기 위한 척수 손상 동물모델을 제조하기 위한 노력도 증가하였다. 동물모델은 척수손상의 해부학적 및 생물학적 결과들을 이해할 수 있도록 완전 척수 손상 또는 불완전 척수 손상의 특징들을 다시 만들어 내려는 목적으로 발달되어 왔다.

현재까지 개발된 완전 척수손상모델로는, 설치류에서 기계적인 척수 손상(spinal cord injury, SCI) 모델로 뉴욕 대학(NYU)의 impact device injury(충격 장치 손상), 오하이오 주립 대학(OSU)의 충격 장치 손상(impact device injury) 및 클립 압박 손상(clip-compression injury) 모델이 있다.

상기와 같은 SCI의 동물 모델이 인간 SCI를 이해하기 위해 개발되었지만, 임상적 또는 병리생리학적인 문제를 다루거나 임상 적용을 통한 치료 전략을 설계하는 데 광범위하게 사용되지 못했다.

또한, 이외 척수 손상 모델로는 1)Transection models로, 척수 신경섬유 절단을 통한 Transection models(Basso et al., 1996), 2)Contusion models로, 다양한 무게의 추를 활용한 weight drop model(Basso et al., 1995), 공기압을 활용한 강한 압박 수술(Rivlin and Tator, 1978)이 있으며, 3)Compression Models로 Balloon을 활용한 압박 수술 (Tarlov, 1954), Clip을 이용한 압박 수술(Shin et al., 2002), Laminaria를 활용한 압박 수술(Fukuoka et al., 1998) 등이 있다.

그러나, 이러한 모델은 추간판탈출증에 대한 독립적인 실험동물 모델이 아니였으며, 만성 척수 손상에 대한 실험모델이 되지 못했다. 또한, 재현 가능한 불완전 혹은 부분 척수손상의 실험 모델이 되지 못하였으며, 오히려 충격 혹은 압박 모델에서는 대부분 척수의 완전 손상을 초래하고 불완전 혹은 부분 척수 손상을 일정하게 유도하지 못하였다. 또한, contusion model에서는 "Shock wave"의 영향이 동반되어 병변의 인근부위에 이차적 영향을 미쳤으며, Laminectomy(척추후궁절제)를 동반한 모델의 경우 사람의 실제 상황과 다르며 척추후궁절제(추궁절제술)에 의한 영향을 고려하여야 하는 문제점이 있었다. Laminectomy를 하지 않고 balloon 등을 이용한 경우 dural puncture에 의한 CSF dynamics 영향이 있었다. 뿐만 아니라, 실제 사람에서 발생하는 척수손상의 상황을 동일하게 반영하는 모델이 없었다.

따라서, 현재까지 개발된 모델은 대부분 척수 손상의 정도를 정밀하게 유도하지 못함으로 인해서 일률적인 척수손상을 일으킬 수 없고 척수가 전체적으로 손상될 수 있어 부분적인 척수 손상이 대부분인 인간의 척수 손상 병증을 제대로 재현하지 못하였다. 이에 따라, 인간 척수 손상을 유사하게 재현하면서도, 손상 정도를 정밀하게 유도하여 치료 과정을 관찰할 수 있는 척수 손상 동물 모델을 제조하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다. 즉, 사람에서 발생하는 추간판탈출증과 유사한 동물모델을 확립할 필요가 있다. 상기 추간판 탈출증은 척추의 추간 연골이 섬유륜을 뚫고 헤르니아를 일으키면서 주로 후측방으로 탈출하여 척추 신경근을 압박함으로써 각종의 신경증상을 일으키는 것을 말하며, 수핵 탈출증이라고도 한다. 추간판탈출증의 발생원인은 외상력이 가장 중요하고 그 외 퇴행(노화), 선천성 요인, 역학적 요소로 작업장에서 비틀거나 반복적인 행동을 하는 것, 앉아서 일하는 직업, 비만, 흡연, 추락, 심한 육체적 노동, 격렬한 운동. 허약한 복부와 등근육을 동반한 경우 등 아주 다양하다. 추간판탈출증에 의한 척수 손상은 주로 경추와 흉추부에서 발생하여 사지마비, 호흡마비, 배변 및 배뇨 장애 등 심각한 신경학적 증상을 초래하여 환자 개인의 신체적, 정신적 문제 뿐만 아니라, 가정, 학교 그리고 사회에서도 윤리적, 경제적, 의료적 그리고 사회적 문제를 야기시킨다. 이에, 추간판탈출증에 의한 척수손상의 기본적 생물학적 현상과 병태생리학적 과정을 동물 실험을 통해 충분히 이해하고 효과적인 치료 기전을 확립하여 이들 과정에 대한 다양한 치료방법으로 장애를 예방하거나 최소화하는 전략을 개발하여 기초 및 임상 연구에 활용하고자 할 필요가 있다.

한편, 척수병증(Myelopathy)은 불완전하거나 완전한 마비와 관련된 척수의 기능적 장애 및/또는 병리학적 변화를 정의하는 데 사용되는 광범위한 용어이다. 추간판탈출증(lumbar herniated intervertebral disc)는 다양한 정도의 마비를 동반하여 척수를 기계적으로 압박하여 급성 척수병증을 유발할 수 있다. 추간판이 파열되면, 디스크 핵의 젤리 같은 연성 조각(jelly-like soft fragment of the disc nucleus)이 고리(annulus)에서 척추관(spinal canal)의 후방으로 돌출된다.

한편, 클립에 의한 압박 모델은 추궁 절제술(laminectomy) 후 척수 동맥류 클립에 의해 손상이 유발되는데, 클립 압박 손상 후 뒷다리(hind-limbs)와 관련이 있는 운동 장애 및 기능 회복은 클립 압박의 힘, 방향 및 지속 기간에 따라 다양하다. 클립 압박 손상의 주요 병리학적 변화는 (1) 초기 염증 단계, (2) 제거 단계 및 (3) 반응성 신경교증(gliosis) 단계의 3 단계로 임의로 분류할 수 있다. 임상 증상 및 조직병리학적 변화는 클립 위치, 클립 삽입 조작 및 추궁절제술의 사용을 포함하여 수술 기법에 크게 의존한다. 일반적으로, 추궁절제술이 없으면 동물 모델에서 척수를 골고루 압박하는 것이 쉽지 않다.

추간판(intervertebral disc) 문제로 인해 흔히 발생하는 특정 척수병증의 신경병리학적 및 행동학적 변화를 조사하기 위해, 클립 압박 손상을 포함한 직접적인 기계적 손상이 아닌 부분적인 압박을 특징으로 하는 신뢰할 수 있는 척수 손상(SCI) 모델이 개발되어야 한다. 또한 추궁절제술을 동반한 압박 모델의 경우, 인간의 실제 상황과 다르며 척추후궁절제(추궁절제술)에 의한 영향까지 고려해야 하는 문제점이 있다.

이에 본 발명에서는 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제의 효과를 확인하는데 매우 유용하게 사용될 수 있는 불완전 손상의 부위, 정도, 크기 등을 다양하게 유도하면서, 일정하게 재현할 수 있는, 추궁절제술에 의한 압박을 유도하지 않은 불완전 압박 척수 손상(SCI)의 동물 모델을 개발하고자 하였다.

본 발명의 목적은 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 불완전 척추 손상 동물모델을 이용한 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 불완전 척추 손상 동물모델을 이용한 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는 추간판의 전위에 의해 유발된 불완전 압축 척수 손상(SCI)의 동물 모델을 개발하고자 하였으며, Medtronic Xomed(Jacksonville, FL 32216, U.S.A.)사의 물을 흡수하는 폴리머 스폰지 MEROCEL®을 사용하여 쥐에서 추간의(척추사이의) 압박 손상을 유도하고 손상의 정도를 클립 압박 손상 모델에 의해 유발된 손상 정도와 비교한 결과, MEROCEL®-압박 군의 BBB 점수는 클립-압박 군의 BBB 점수보다 유의하게 높았으며(도 5). MEROCEL®-압박 군의 척수에서의 출혈, 염증 세포의 침윤, 척수조직 손상으로 생성되는 공간 형성(cavity formation), 수초 손상 및 소교세포의 활성화와 같은 신경 병리학적 결과는 클립-압박 군의 척수에서보다 유의하게 덜 심하였으며(도 6, 도 7). MEROCEL®-압박 군에서 CGRP 양성의 일차 감각 섬유와 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 양성 운동 뉴런의 수는 클립-압박 군에서보다 유의하게 더 많음을 확인하고, 상기와 같은 MEROCEL®-압박 모델이 불완전한(부분적인) SCI를 지속적으로 유도하여 인간의 추간판성 척수병증(discogenic myelopathy)을 반영하는 모델임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 척수 손상 모델용 동물의 피부를 흉추(thoracic vertebrae) 8번 내지 10번 수준에서 절개하는 1단계; 경막외 공간(epidural space)에 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 삽입하고 압박을 유도하여 흉추(thoracic vertebrae) 8번 내지 10번의 척수 손상을 유발하는 단계; 및 추궁절제술을 실시하여 삽입된 폴리머 스폰지를 제거하여 감압을 유도하는 단계를 포함하는, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 척수 손상 모델용 동물의 피부를 흉추(thoracic vertebrae) 8번(T8) 내지 10번(T10) 수준에서 절개하여 T8에서 T10이 노출될 수 있도록 한 후, 경막외 공간(epidural space)에 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 삽입하고 압박을 유도하여 흉추(thoracic vertebrae) 8번(T8) 내지 10번(T10)의 척수 손상을 유발하였으며, 불완전 척수손상을 유도하기 위해 삽입한지 1분후에 추궁절제술을 실시하여 삽입된 폴리머 스폰지를 제거하여 감압을 유도하였다. 이후 피부를 봉합하여 불완전 척추 손상 동물모델을 유도하였다. 상기와 같은 스폰지를 삽입하여 손상을 유발한 군의 경우, 운동능력을 평가하는 BBB 점수는 클립-압박 군의 BBB 점수보다 유의하게 높았으며(도 5). 출혈, 염증 세포의 침윤, 척수조직 손상으로 생성되는 공간 형성(cavity formation), 수초 손상 및 소교세포의 활성화와 같은 신경 병리학적 결과는 클립-압박 군의 척수에서보다 유의하게 덜 심하였으며(도 6, 도 7). CGRP 양성의 일차 감각 섬유와 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 양성 운동 뉴런의 수는 클립-압박 군에서보다 유의하게 더 많음을 확인하고, 상기와 같은 MEROCEL®사의 스폰지를 이용한 압박 모델이 불완전한 SCI를 지속적으로 유도하여 인간의 추간판성 척수병증(discogenic myelopathy)을 반영하는 모델임을 확인하였다.

본 발명에서, 용어 "추궁절제술(laminectomy)"은 척추의 추궁을 절제하여 척주관을 여는 수술을 말한다. 척수종양 등 척주관내의 병변에 대한 수술조작을 행하기 위한 전단계로 되는 수술이지만, 척수에 대한 감압(decompression)을 목적으로 이 수술이 단독으로 이루어질 수 있다. 1 내지 여러 추체에 걸쳐서 극상돌기를 포함하여 양측의 추궁(椎弓)을 절제하는 것이 보통이지만, 경우에 따라서는 반측의 추궁절제(반측추궁절제술)나 추궁의 일부분만의 절제(부분적 추궁절제술)를 행하는 일도 있다.

본 발명에서는 경막외 공간(epidural space)에 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 삽입하고 압박을 유도하여 척수 손상을 유발하였고, 척수 손상이 추가적으로 발생하지 않도록 척수에 대한 감압의 목적으로 폴리머 스폰지로 압박 1분 후에 추궁절제술을 수행하여 삽입된 폴리머 스폰지를 제거하여, 불완전한 척수 손상 동물모델을 제조하였다.

도 1은 기존의 클립 압박 손상 모델과 본 발명의 손상 모델을 나타낸 것이다. 기존의 Compression injury model은 추궁절제술(Laminectomy)(척추후궁절제)를 실시하여, Clip을 이용하여 1분간 손상하였으며, 척수의 lateral 부분이 압박되게 된다. 그러나, 본 발명의 MEROCEL을 이용한 손상 모델은 손상 시간을 조절하여 급성과 만성 척수 손상 모델로 이용이 가능하며, dorsal 부분이 압박되게 된다. 본 발명의 MEROCEL을 이용한 척수 손상(추간판 탈출증의 동물 모델)은 기존 척수손상 모델에서 추궁절제술을 시행하지 않고 제조된 압박 모델이다.

또한, 기존의 클립을 이용한 압박 모델은 급성 척수 손상인데 반하여, 본 발명의 MEROCEL을 이용한 손상 모델은 압박 시간에 따라 급성 그리고 만성 척수 손상의 모델로 제조가 가능하며, 기존의 압박 모델은 hard compression에 의한 척수의 완전 손상인데 비하여, 본 발명의 모델은 soft compression에 의한 부분 손상 모델에 해당한다. 또한, 본 발명의 척수 손상 모델은 MEROCEL의 크기와 제거 시기를 다양하게 하여 척수 손상의 정도와 치료 시기에 대한 결과를 비교 분석할 수 있다.

한편, 척수손상에서 운동 기능의 평가는 해부학적으로 피질척수로와 연관되어 있으므로 이에 대한 정확한 평가가 필요한데, 피질척수로(corticospinal tract)는 대뇌 피질에서 기원하여 연수의 피라미드를 지나 척수에서 종지하는 가장 크고 중요한 신경로로 직접, 또는 중간 신경원을 거쳐 전각신경원(anterior horn cell)을 지배하며 신체의 운동기능을 직접적으로 담당하고 있다. 사람의 경우는 운동기능을 주로 담당하는 피질척수로(corticospinal tract) 중 90%는 lateral corticospinal tract로서 척수의 측면 부위(lateral portion)에 위치하고 10%는 anterior corticospinal tract로 anterior(앞쪽)에 위치한다. 반면, 백서(쥐)의 경우는 피질척수로(corticospinal tract)가 척수의 등쪽 부위(dorsal portion)에 위치하여 사람의 경우와 다르다. 즉, 사람에서 발생하는 추간판탈출증은 척수의 ventral 쪽(배쪽)을 압박하는 반면에, 쥐를 대상으로 한 추간판탈출증 모델에서는 dorsal 쪽(등쪽)을 압박하게 된다. 도 2는 인간과 쥐에서 피질척수로(corticospinal tract)의 위치를 나타낸 것이다. 인간의 경우 피질척수로가 척수의 측면 부위(lateral portion)에 위치하고 있으며, 쥐의 경우 피질척수로(corticospinal tract)가 척수의 등쪽 부위(dorsal portion)에 위치하고 있다.

따라서, 상기와 같은 피질척수로의 위치를 고려하였을 때 본 발명의 MEROCEL을 이용한 손상 모델은 dorsal 부분이 압박되게 되므로, 인체에서 발생하는 추간판탈출증의 실제 상황을 매우 유사하게 반영하게 된다. 그러나, 쥐에서 클립을 이용한 압박 모델은 척수의 lateral 부분이 압박되게 되는 바, 피질척수로의 위치를 고려하였을 때, 인간의 추간판탈출증과 유사한 재현이 불가능한 단점이 있다.

본 발명에서 척수 손상 동물모델 제조에 사용되는 상기 스폰지는 가로 × 세로 × 높이가 0.5 mm × 0.5 mm × 1.2 cm 내지 1.5 mm × 1.5 mm × 2.2 cm 인 직육면체일 수 있으며, 보다 구체적으로, 가로 × 세로 × 높이가 1 mm × 1 mm × 1.7 cm 인 직육면체일 수 있다. 본 발명에서 스폰지는 압축하고자 하는 부위에 따라 다양한 크기로 제조하여 사용할 수 있으며, 본 발명의 불완전 척수 손상 모델을 제조하기 위해서는 가로 × 세로 × 높이가 0.5 mm × 0.5 mm × 1.2 cm 내지 1.5 mm × 1.5 mm × 2.2 cm 인 직육면체를 경막외 공간에 삽입할 수 있다.

본 발명에서 상기 스폰지는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)로 이루어져 있으며, 비강내 출혈시 압박지혈용으로 사용되는 스폰지로 본 발명에서는 Medtronic Xomed사의 스폰지 MEROCEL를 사용하였다. 상기 스폰지는 생체적합성 스폰지로 물을 장기간 보유할 수 있으며, 내구성이 뛰어나다. 또한 상기 스폰지는 물을 흡수하게 되면, 부드럽고 부피가 확장되게 된다. 상기 스폰지가 경막에 공간에 이식이 되면, 스폰지는 확장하게 되고 이에 의해 척수를 압박하여 불완전 척수 손상 동물의 제조가 가능하게 된다. 도 10은 본 발명의 불완전 척수 손상 동물모델 제조방법에 의해 척수 안에 MEROCEL 스폰지를 삽입하여, 스폰지가 부풀어서 척수가 눌러진 현미경 사진을 나타낸다.

도 3은 본 발명의 불완전 척수 손상 모델 제조에 사용된 Medtronic Xomed사의 스폰지 MEROCEL을 나타낸다.

(A) MEROCEL는 압축된 스폰지로서 수분을 흡수하여 수배로 커지는(확대되는) 성질을 이용하여 다양한 신체부위의 지혈용으로 사용되며, 값싸고 간편하게 구입하여 사용할 수 있다. (B) MEROCEL을 일정 크기로 간격으로 균일하게 자른 후, 한쪽 끝에 봉합사를 이용하여 끝에 매듭을 만들고 봉합사를 가는 needle에 연결한 것을 나타낸다. 먼저 needle을 T8의 척추후궁의 정중앙 아래와 경막 사이로 통과시키고 봉합사를 견인하여 MEROCEL이 척추 후궁과 경막사이의 경막외 공간에 위치하도록 하였다. 척추강내의 MEROCEL은 척수의 컴프라이언스(compliance)와 균형을 이루어 척수의 반정도까지 압박할 수 있다. (C)는 (B)가 수분을 흡수하였을 때 팽창된 사진으로 척수내 (B)가 삽입이 되면 팽창하여 척수를 압박하게 된다. (D)는 MEROCEL 스폰지의 주사전자현미경 사진을 나타낸다. MEROCEL 스폰지는 100% open pores 구조로, 스폰지의 독특한 망상 형태와 함께 흡수성과 친수성을 모두 가진다. MEROCEL 스폰지의 소재는 매우 강력하고 내구성이 뛰어나다. 또한 수화될때, 부드러워지므로 척수를 압박할 때 불완전 척수 손상을 유발할 수 있게 된다.

앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 척수손상 모델은 인간의 추간판탈출증 모델을 정확하게 재현할 수 있으며, MEROCEL을 이용한 손상 모델은 쥐의 dorsal 부분이 압박되게 되므로, 인체에서 발생하는 추간판탈출증의 실제 상황을 매우 유사하게 반영하게 된다. 또한, 수술 방법이 매우 간단하며, 실험재료(MEROCEL)가 저렴하고 쉽게 구입하여 사용할 수 있으며, 재현성이 뛰어나며, 척수손상의 정도(압박의 정도, 병변의 크기, 압박기간, 압박 부위 등)를 임의로 조절할 수 있으며, 급성 그리고 만성 추간판탈출증 모델이 될 수 있다. 뿐만 아니라, 수술시 척추후궁절제(추궁절제술) 및 뇌척수액 유출이 없어 이로 인한 artificial injury를 제외시킬 수 있다. MEROCEL은 스폰지로 인간에서 척수를 압박하는 디스크의 성질과 매우 유사하다. 또한, 인간의 추간판탈출증 치료를 위한 수술과 유사하게 쥐에서 후궁절제술(추궁절제술)을 시행하여 척수를 압박하는 MEROCEL 스폰지를 임의로 제거함으로써, 인간의 경우와 동일하게 치료 상황을 재현할 수 있다.

본 발명에서 상기 불완전 척수 손상은 척수병증(myelopathy)일 수 있으며, 보다 구체적으로 추간판탈출증(통상 디스크)이 될 수 있다.

상기 척수병증은 척수에 발생한 병적인 변화로 인해 척수를 지나가는 감각신경 및 운동신경이 손상되어 발생하는 질환이다. 척수병증은 그 원인 및 병리적 변화의 위치, 그리고 침범된 계통의 종류에 따라 매우 다양한 증상을 보인다. 가장 일반적인 운동장애의 증상으로는 병리적 변화가 나타난 부위 이하의 하지마비(병리적 변화의 위치에 따라 양측마비 혹은 단측마비가 나타날 수 있다)가 있으며, 이에 동반하여 병리적 변화가 나타난 부위 이하로 운동신경세포 손상징후가 나타날 수 있다. 감각장애의 증상은 병리적 변화가 발생한 부위 이하에서 다양한 형태의 감각기능 장애로 나타난다. 운동장애와 마찬가지로 병적인 변화가 발생한 위치에 따라 통증, 온도, 위치, 진동 감각 모두 혹은 일부의 기능이 저하될 수 있다. 자율신경장애는 주로 방광과 직장의 조임근기능 이상으로 인한 요실금, 변실금 등으로 나타날 수 있고, 체온조절장애, 혈관운동 불안정성 등의 증상이 나타나기도 한다. 이러한 운동장애, 감각장애 및 자율신경장애는 환자에 따라 다양한 조합으로 발현된다.

본 발명의 용어, "척수 손상 모델용 동물"은 척수 손상 및 척수 손상 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 예컨대, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트(쥐), 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물이면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 특히 비인간 척추 동물일 수 있다. 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트(쥐), 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 포유 동물은 일정한 성질을 지닌 개체가 안정적으로 공급되고, 실험할 때에 사육이나 처리가 쉽다는 등의 이유 때문에 모델 동물로서 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 랫트(쥐)를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다. 모델 동물을 제작하기 전의 사육 조건은 통상적인 방법에 따라 선택하면되고 특별히 한정되지 않지만, 균질의 모델 동물을 얻기 위해서는 가능한 각 개체를 동일한 조건 하에서 사육하는 것이 바람직하다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 이용하여 제조한 동물모델을 이용한, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법 또는 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 불완전 척수 손상 동물모델 제조방법에 의해 제조된 척수 손상 동물 모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계; 상기 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 척수 손상 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 척수 손상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 불완전 척수 손상 동물모델 제조방법에 의해 제조된 척수 손상 동물 모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계; 상기 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 척수 손상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 제조방법에 의해 제조된 불완전 척추 손상 동물모델을 제공한다.

본 발명에서 용어 "불완전 척수 손상 동물모델"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명은 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 이용한 불완전 척추 손상 모델의 제조방법에 관한 것으로, 클립-압박 군에 비해 불완전한 인간 척수 손상을 유사하게 재현할 수 있으며 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제의 효과를 확인하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 기존의 클립 압박 손상 모델과 본 발명의 MEROCEL을 이용한 손상 모델을 나타낸 것이다.
도 2는 인간과 쥐에서 피질척수로(corticospinal tract)의 위치를 나타낸 것이다. 인간의 경우 피질척수로가 척수의 측면 부위(lateral portion)에 위치하고 있으며, 쥐의 경우 피질척수로(corticospinal tract)가 척수의 등쪽 부위(dorsal portion)에 위치하고 있다.
도 3은 본 발명의 불완전 척수 손상 모델 제조에 사용된 Medtronic Xomed사의 스폰지 MEROCEL을 나타낸다.
도 4는 쥐의 피부를 흉추(thoracic vertebrae) T8-T10 수준에서 절개하고, 경막외 공간(epidural space)에 MEROCEL®의 직육면체(1mm × 1mm × 1.7cm) 스폰지를 삽입하고(Medtronic Xomed Inc., Jacksonville, FL, USA), 피부를 봉합하는 수술과정을 나타낸 것이다.
도 5는 MEROCEL®-삽입 또는 혈관 클립-압박-유도된 SCI(spinal cord injuryI) 쥐의 뒷다리에서의 운동 결과(Locomotor outcomes)를 Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 점수를 사용하여 평가한 것이다.
도 6은 MEROCEL®-압박 군과 클립-압박-유도된 SCI(spinal cord injury)에서, 출혈, 염증 세포 축적, 부종과 출혈, 척수조직 손상으로 생성되는 공간 면적(cavitary area)을 비교한 것이다.
도 7은 MEROCEL®-압박 군과 클립-압박-유도된 SCI 수술 후 척수에서 백질(white matter)이 차지하는 비율을 평가하기 위해, 4 일째에 두개골(cranial), 코어(core) 및 꼬리(caudal) 영역을 염색을 시행한 결과이다.
도 8은 MEROCEL®-압박 군과 클립-압박-유도된 SCI 쥐에서 염증 세포의 침윤과 소교세포 반응을 평가하기 위한 면역조직화학 염색 결과이다.
도 9는 MEROCEL®-압박 군과 클립-압박-유도된 SCI 쥐에서 일차 감각 섬유 및 운동 뉴런(신경섬유)의 활성을 평가하기 위한 면역조직화학 염색 결과이다.
도 10은 본 발명의 불완전 척수 손상 동물모델 제조방법에 의해 척수 안에 MEROCEL 스폰지를 삽입하여, 스폰지가 부풀어서 척수가 눌러진 현미경 사진이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

1. 동물

숫컷과 암컷의 Sprague Dawley rats(200-250 g, 8-10 주령)를 사용하였다(Daehan Biolink, Cheongju, Korea). 모든 실험 절차는 제주대학교 실험 동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었다. 동물의 관리 및 취급에 관한 프로토콜은 현 국제법 및 정책((NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publication No. 85-23, 1985, revised 1996)을 준수하였다. 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다.

2. 외과적 시술

동물을 chloral hydrate(Fluka, Buchs, Switzerland; 375 mg/kg body weight, intraperitoneal injection)로 마취시켰다. 피부를 흉추(thoracic vertebrae) T8-T10 수준에서 절개하여 T8에서 T10이 노출될 수 있게 절개하였고, 척추후궁과 경막사이의 경막외 공간(epidural space)에 MEROCEL®의 직육면체(1mm × 1mm × 1.7cm) 스폰지를 삽입하고 압박을 유도하여 T8 내지 T10의 척수 손상을 유발하였으며(Medtronic Xomed Inc., Jacksonville, FL, USA), 척수손상이 추가적으로 발생하지 않도록 추궁절제술을 실시하여 삽입된 폴리머 스폰지를 제거하여 감압을 유도하였으며, 이 후, 피부를 봉합하였다(closed)(도 4). 상기 스폰지는 폴리비닐 알코올로 이루어져 있다. MEROCEL®에 의한 압박 후 1분 뒤에, 압박에 의한 추가적인 척수 손상이 발생하지 않도록 추궁 절제술(laminectomy)을 실시하여 삽입된 MEROCEL® 스폰지를 제거하여, 감압하였으며, 근육과 피부 층은 봉합하였다. 대조군으로서, 동일한 절차에 따라 실크가 있는 바늘만 통과시켰다.

척수의 신경 병리학을 비교하기 위해 추궁절제술 후, 혈관 클립 압박 손상(vascular clip-compression injury)이 시행되었다. 간단히 말하면, 마취 후 동물들은 T9 및 T10에서 추궁 절제술을 시행받았다. 절제술 직후, 척수를 혈관 클립 (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)으로 압박하여 노출된 척수에 수직으로 15-20g의 교합 압력(occlusion pressure)으로 1 분 동안 가했다. 압박 후, 근육 및 피부층을 봉합하였다. 대조군(sham-operated control rats)에서는 추궁 절제술(laminectomy)만 시행되었다. 수술 후 척추 손상을 입은 쥐(spinally injured rats)를 하루 2 회 이상 마사지하여 방광을 비웠다.

참고로, 혈관클립을 이용한 손상 모델에서는 강제배뇨(방광 마시지)를 실시해야 하나, 본 발명의 MEROCEL을 이용한 불완전 마비를 유도한 압박성 손상인 경우, 배뇨장애가 유발되지 않아 강제배뇨가 불필요하였다.

3. 행동 테스트

MEROCEL®-삽입 또는 혈관 클립-압박-유도된 SCI(spinal cord injuryI)로 인한 쥐의 뒷다리에서의 운동 결과(Locomotor outcomes)는 Basso, Beattie 및 Bresnahan(BBB) 점수를 사용하여 평가되었다. 평가는 이중 맹검법을 사용하여 수행되었으며, 각 군의 평균 점수를 계산하여 뒷다리 마비의 정도를 비교하였다.

4. 조직 검사

수술후 1 일, 4 일, 7 일에 쥐의 조직을 4 % paraformaldehyde를 함유하는 phosphate-buffered saline(PBS; pH 7.2)에서 심근 관류(transcardial perfusion )로 고정시켰다. 관류 후, 상해 부위를 포함하여 척수의 T8-T10 영역을 수집하여 10 %(v/v) 중성 완충 포르말린에서 48 시간 동안 고정시켰다. 코어(core) 병변의 위치와 중심지(epicenters) (두개 및 꼬리 모두)로부터 3 mm 지점에서의 횡단면을 조직 병리학적으로 검사하였다. 척추 섹션(sections)(5 μm 두께)은 hematoxylin과 eosin(H-E)로 염색하고, 제거하고(cleared), Canada balsam으로 고정시켰다.

손상 후 척수에서 수초 손상을 조사하기 위해 Luxol fast blue(LFB, Acros, NJ; 0.1% in 95% ethanol with 10% acetic acid) 염색을 56℃에서 24 시간 동안 탈 파라핀 섹션에 적용하고, 95 % 에탄올과 증류수로 헹구었다. 이를 0.05 % 탄산 리튬으로 분화하고(differentiated), 70 % 에탄올에서 세정하고, 99 % 에탄올에서 탈수되고, 크실렌으로 제거하고, 커버 글라스로 덮었다.

5. 면역 조직 화학

척수의 초기 반응을 평가하기 위해, MRIOCEL®에서 소교세포 반응(microglial reactions)과 손상 후 4 일 및 7 일 동안의 클립 압박 손상을 비교했다. 이는 소교세포 반응이 1 주일 내에 두드러지게 나타나기 때문이다. 또한 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP)와 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT)를 포함하는 특정 마커를 이용하여 일차 감각 섬유 및 운동 신경 세포를 조사하였다. 파라핀 왁스 함유 조직(paraffin wax-embedded tissues)의 섹션(5㎛)을 탈파라핀화하고 전자레인지로 3 분 동안 구연산 완충액(0.01M, pH 6.0)에서 가열하였다. 그 후 0.3 % 과산화수소를 함유하는 메틸알콜에서 20 분 동안 배양하여 내인성 퍼옥시다아제 활성(endogenous peroxidase activity)을 차단시켰다. PBS로 3 회 세척한 후, 섹션을 PBS로 희석한 블로킹 혈청(10% normal goat or rabbit serum, Vector ABC Elite kit; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA)으로 항온 배양한 다음, 활성화 된 소교 세포 및 대식세포에 대한 마커인 rabbit anti-ionized calcium-binding protein-1(Iba-1; 1:800; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan), 일차 감각 섬유에 대한 마커인, CGRP(1:20,000; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 및 운동 신경섬유(neuron)에 대한 마커인 goat anti-ChAT(1:3,000; Millipore, Frankfurt, Darmstadt, Germany)로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. PBS에서 3 번 더 세척한 후, 섹션을 적절한 비오티닐화 된 2차 항체(1:200 희석; Vector)로 45 분 동안 실온에서 항온 배양하였다. PBS에서 3 회 추가로 세척 한 후, 섹션을 제조자의 프로토콜에 따라 제조된 아비딘-비오틴 퍼옥시다아제 복합체(벡터)와 함께 45 분 동안 실온에서 항온 배양하였다. 퍼옥시다아제 반응은 제조자의 지시에 따라 제조된 디아미노벤지딘 기질 키트(Vector)를 사용하여 전개시켰다.

6. Semi-quantitative analysis

반 정량적 평가를 위해, 섹션을 HE 염색, LFB 염색, CGRP 염색, ChAT 염색 및 Iba-1 면역 염색(n=3)을 시행하고 광학 현미경(Olympus BX53/U-LH 100HG, Olympus Corp., Tokyo, Japan)이 부착된 디지털 카메라(Olympus DP72)를 사용하여 4 배율로 촬영하였다. 염색을 Image J 소프트웨어(NIH, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 반정량화 하였다. 출혈 부위, cavitation area, 및 Iba-1 양성 부위의 비율을 측정하였다. 여분의 백질(spared white matter)의 퍼센티지를 [파란색 픽셀의 면적/총 면적] × 100(%)로 계산했다. 결과는 평균에 대한 평균±표준오차(SEM)로 나타내었다.

7. 통계 분석

모든 측정은 세 번의 독립적인 실험에서 이루졌다. 모든 값은 평균±SEM으로 표시했다. 결과는 다중 비교를 위해, one-way analysis of variance(ANOVA)와 Student-Newman-Keuls post hoc test를 사용하여 분석했다. 모든 경우에서 p 값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성을 나타냈다.

<실험결과>

1. 운동 결과(Locomotor outcomes)

도 5는 MEROCEL® 삽입 및 혈관 클립 압박 손상에 대한 수술 후 BBB 점수를 보여준다. 1 일째, MEROCEL®-압박 군에서 5.6±1.3, 클립-압박 군에서 1.2±0.5였다. 7 일째, MEROCEL®-압박 군(12.4±1.6)의 BBB 점수는 클립-압박 군 (2.4±0.7, p<0.01)보다 유의하게 높았다. 28 일째, MEROCEL®-압박 군에서 BBB 점수는 19.4±0.9, 클립-압박 군에서 8.6±0.8이었다. 손상 후 28 일 동안의 BBB 점수는 MEROCEL®-압박 군에서 클립-압박 군보다 높았으며, 클립 압박 손상을 입은 쥐와 비교하여 운동력의 회복이 빠른 것을 의미한다. 또한, MEROCEL®-압박 군에서는 불완전 손상 모델로 배뇨 장애가 관찰되지 않았으나, 클립-압박군에서는 완전 손상 모델로 배뇨 장애로 인해 강제배뇨를 실시하였다. 상기와 같은 결과를 통해 MEROCEL을 이용해 불완전 척수 손상 모델의 제조가 가능한 것을 확인하였다.

2. 조직학적 소견

sham control groups(도 6A, E)에서는 척수의 코어 영역에 기계적 변화가 없었다. MEROCEL®-압박 군에서, 출혈은 손상 후 1일째에(도 6B, arrows), 손상 후 4 일째에 염증 세포가 축적되었고(도 6C, arrowheads), 손상 후 7 일째에 세포 밀도가 증가하였다(도 6D). 대조적으로 심한 부종과 출혈은 손상 후 1 일째에 클립-압박 군에서 나타났다(도 6F, arrows). 또한 4 일째와 7일째에 클립-압박 군에서 척수 코어 영역에서 round-type 염증 세포의 축적(도 6G, arrowheads), 활성화된 소교세포, 작고 둥근 액포(vacuoles)가 분명하게 나타냈다(도 6G, 6H). 손상 후. MEROCEL®-압박 군(6.65±1.98 %)의 출혈 면적 백분율은 손상 후 1 일째 클립-압박 군(18.32±2.70 %, p<0.01)보다 유의하게 낮았다(도 6I). MEROCEL®-압박 군의 코어 병변(4.34±0.80 %)에서의 척수조직 손상으로 생성되는 공간 면적(cavitary area) 비율은 클립-압박 군의 병변(13.56±4.81 %, p<0.05)보다 유의하게 낮았다(도 6J).

수술 후 척수에서 백질(white matter)이 차지하는 비율을 평가하기 위해, 4 일째에 두개골(cranial), 코어(core) 및 꼬리(caudal) 영역에서 LFB 염색을 시행했다(도 7). MEROCEL®-압박 군(도 7A, C)과 클립-압박 군(도 7D, F)의 척수에서 두개 및 꼬리 영역은 조직학적으로 유사하고 LFB 양성 수초를 나타내는 퍼센티지영역은 거의 유사했다(도 7G). 그러나, 클립-압박 손상된 척수의 코어 영역(도 7E)은 MEROCEL-압박 군(도 7B)의 경우보다 백질에서 더 심한 수초 파괴를 나타냈다(도 7E). 또한, MEROCEL®-압박 군(24.29±0.23 %)의 코어 영역에서 백질의 퍼센티지는 클립-압박 군(18.99±0.87 %, p<0.01)보다 유의하게 높았다(도.7G).

즉, MEROCEL®-압박 군의 척수에서의 출혈, 염증 세포의 침윤, 척수조직 손상으로 생성되는 공간 형성(cavity formation), 수초 손상 및 소교세포의 활성화와 같은 신경 병리학적 결과는 클립-압박 군의 척수에서보다 유의하게 덜 심한 것을 관찰하였는 바, 상기와 같은 결과를 통해 MEROCEL을 이용해 불완전 척수 손상 모델의 제조가 가능한 것을 확인하였다.

3. 염증 세포의 소교세포 반응 및 침윤

염증 세포의 침윤과 소교세포 반응을 평가하기 위해, 활성화 된 소교 세포 및 대식세포에 대한 마커인 Iba-1에 대한 면역 조직 화학 염색을 시행하고 MEROCEL®-압박 sham 대조군(4.90±0.42 %, 도 8A)과 클립-압박 sham 대조군(5.64±1.08 %, 도. 8D)에서 Iba-1 양성의 비율을 계산하였다. 백질과 회백질을 포함한 모든 지역에서 Iba-1 양성 소교 세포가 검출되었다. 그러나 염증 세포는 없었다. 4 일째, MEROCEL®-압박(12.71±2.31 %, 도 58B) 및 클립-압박(15.66±4.88 %, 도 8E)의 코어 영역에서 분지 된(ramified) 소교 세포 및 많은 염증 세포가 분명하게 나타났다. 7 일째, MRIOCEL®-압박 군(14.00±1.79 %, 도. 8C)의 코어 영역에서 Iba-1-반응성 및 Iba-1-양성 영역이 클립-압박 군 (24.85 ± 5.19 %, p<0.05,도 8F)에 비해 현저하게 낮았다. MEROCEL®-압박 군에서 활성화 된 소교 세포 및 대식세포에 대한 마커인 Iba-1-반응성 및 Iba-1-양성 영역이 클립-압박 군에 비해 현저하게 낮았는 바, 상기와 같은 결과를 통해 MEROCEL을 이용해 불완전 척수 손상 모델의 제조가 가능한 것을 확인하였다.

4. 일차 감각 섬유 및 운동 뉴런

MEROCEL®-압박 군에서는 CGRP(일차 감각 섬유에 대한 마커) 양성 섬유가 등쪽뿔(dorsal horn) 래미너(laminae) I과 II에서 검출되었다(도 9A, B). CGRP 섬유의 면역 조직 화학 반응은 7 일째에 클립 손상 군에서 더 낮았다(도 9C, D). 또한, 많은 ChAT(운동 신경섬유에 대한 마커) 양성 운동 뉴런은 MEROCEL®-압박 군의 배쪽뿔(ventral horn)에서 명백하였다(도 9E, F), 반면 클립 손상 그룹에서는 단지 일부의 ChAT 양성 운동 뉴런이 관찰되었다(도 9G, H). CGRP 양성 영역은 클립-압박 군(25.11±4.46%, p<0.05, 도 9I)과 비교하여 MEROCEL®-압박 군(37.47±1.36%)에서 유의하게 더 컸다. MEROCEL®-압박 군(24±4.7)에서 ChAT 양성 운동 뉴런의 수는 클립-압박 군(5 ± 1.7, p<0.05,도 9J)보다 유의하게 더 컸다. MEROCEL®-압박 군에서 CGRP 양성의 일차 감각 섬유와 콜린 아세틸트랜스퍼라아제 양성 운동 뉴런의 수는 클립-압박 군에서보다 유의하게 더 많음을 확인하였는 바, 상기와 같은 결과를 통해 MEROCEL을 이용해 불완전 척수 손상 모델의 제조가 가능한 것을 확인하였다.

결론적으로, 본 발명에서는 상기와 같은 MEROCEL®사의 스폰지를 이용한 압박 모델이 불완전한 SCI를 지속적으로 유도하여 인간의 추간판성 척수병증(discogenic myelopathy)을 반영하는 모델임을 규명하였다.

Claims

척수 손상 모델용 동물의 피부를 흉추(thoracic vertebrae) 8번 내지 10번 수준에서 절개하는 단계;
경막외 공간(epidural space)에 물을 흡수하는 폴리머 스폰지를 삽입하고 압박을 유도하여 흉추(thoracic vertebrae) 8번 내지 10번의 척수 손상을 유발하는 단계; 및
추궁절제술을 실시하여 삽입된 폴리머 스폰지를 제거하여 감압을 유도하는 단계를 포함하는, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 스폰지는 가로 × 세로 × 높이가 0.5 mm × 0.5 mm × 1.2 cm 내지 1.5 mm × 1.5 mm × 2.2 cm 인 직육면체인 것인, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 스폰지는 가로 × 세로 × 높이가 1 mm × 1 mm × 1.7 cm 인 직육면체인 것인, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 스폰지는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)이루어진 것인, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 불완전 척수 손상은 척수병증(myelopathy)인 것인, 불완전 척추 손상 동물모델의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 쥐, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 척추 동물인 것인, 불완전 척수 손상 동물모델 제조방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 척수 손상 동물모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계;
상기 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 척수 손상 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및
상기 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 척수 손상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 불완전 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 불완전 척수 손상 동물모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계;
상기 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 척수 손상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및
상기 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 불완전 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법.
제1항의 제조방법에 의해 제조된 불완전 척추 손상 동물모델.