KR20150117890A - 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 통해 제조된 척수 손상 동물모델 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill)을 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계; 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계; 및 상기 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 척수 손상 동물모델에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 척수 손상 동물모델을 이용하여 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법 및 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법은 기존 고가의 장비를 이용하여 척수 손상을 주는 경우보다 인간 척수 손상을 유사하게 재현할 수 있으며 동물 모델의 생존율이 높고 만성적인 관찰이 가능한 제조방법으로, 특히 시술자의 기술이나 노하우에 영향을 거의 받지 않는 제조방법으로 척수 손상 치료제의 개발 및 효과 확인 분야에서 널리 사용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill) 등의 미세구멍(microhole)을 형성할 수 있는 수술용 기기를 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계; 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴 등의 미세구멍을 형성할 수 있는 수술용 기기를 이용하여 척수실질에 닿을 수 있는 깊이의 구멍을 뚫는 단계; 및 상기 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 척수 손상 동물모델에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 척수 손상 동물모델을 이용하여 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법, 척수 손상 치료 후보 물질 또는 치료제를 농도 별, 기간 별로 척수 실질에 도달시키는 방법 및 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법에 관한 것이다.
척수는 척추 내에 위치하는 중추 신경의 일부분으로 감각, 운동신경들을 모두 포함하며, 목에서부터 엉치까지 척추의 몸통 뼈 뒤를 따라 존재한다. 위치에 따라 목척수, 등척수 허리척수, 엉치척수로 구분된다. 척수는 숨뇌와 맞닿아 있으며 허리뼈 1~2번 높이까지 위치한다. 척수는 수막으로 둘러싸여 있게 되며 바깥쪽으로 경막(dura mater)라는 구조물에 의해 다시 둘러싸이게 되며 그 사이의 공간에 뇌척수액이 흐르게 된다. 척수는 뇌와 말초신경의 중간 다리 역할을 하는 신경계로 운동, 감각신경들이 모두 모여 있는 부위라고 할 수 있다. 뇌에서부터 아래로 내려가는 운동신경은 사지의 모든 근육들의 운동 기능을 담당하고 반대로 말단부의 감각 수용기로부터 위로 올라가는 감각신경은 우리 몸 전체의 감각을 담당한다. 또한 일부 자율신경 기능을 담당한다는 신경다발도 포함이 되어 있어 방광 조절이나 항문 조임근 조절 등의 기능도 하고 있다. 척수는 뇌와 똑같이, 중추신경계의 일부로서 척추의 골절, 탈구 등의 외상에 의하여 용이하게 비가역성의 변화를 일으켜 심한 기능장애를 남기는 경우가 많다.
척수손상은 전세계적으로 2백 5십만 명 이상의 사람들이 겪고 있으며, 매년 13만의 새로운 임상증례가 보고되고 있다 (척수손상에 대한 국제 캠페인, International campaign for spinal cord injury). 비록 연구를 통해 진전이 되어 왔지만, 현재 척수손상에 대하여 완전히 회복할 수 있는 치료법이 없으며, 이에 특히 스포츠 산업에서는 새로운 사고, 즉 임상증례가 생기는 위험성을 줄이려는 간접적인 안전조치들이 시행되어 왔다. 척수 손상은 거의 영구적인 손상으로 이어지며, 환자의 염증과 고통을 감소시키는 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone)만이 인간 급성 척수손상의 유일한 치료제로 사용되고 있을 뿐이다.
척수손상을 겪는 환자의 예상 수명은 현저히 감소하며, 무엇보다 환자의 삶의 질이 현저히 저하된다. 또한, 증상이 심각하거나 상태가 나빠지면, 수입 감소로 이어진다. 환자의 일차적인 간호와 관련되어 고비용이 들고, 이와 더불어 경제적인 충격을 받게 된다. 척수손상 후, 손상 병소(Lesion) 부위의 병리학적 변화는 궁극적으로 신경 전도 손실과 지연된 탈수초화(Demyelination, 축삭(Axon)을 둘러싸고 있는 수초(Myelin)가 손상되는 병리학적 현상)을 일으킨다. 이러한 변화들은 증가된 염증, 혈액-척수 장벽(Blood-Spinal cord barrier, BSCB) 및 괴사(Necrosis), 아폽토시스(Apoptosis), 공동화(Cavitation), 허혈(Ischemia)을 동반하는 확장된 출혈(Haemorrhage)을 포함한다. 상기 모든 요인들은 손상 후 축삭 재생에서 유해한 효과로 이어진다.
척수손상은 궁극적으로 조직 손상으로 이어지는 다음과 같은 3가지 주요 원인들에 의해 일어날 수 있다. (1) 척수를 누르는 척수 디스크 또는 골 물질에 의해 야기되는 압박, (2) 직접적인 외상으로부터의 손상, (3) 예를 들어, 허혈과 같은 초기 손상으로부터의 혈류의 감소가 있다. 척수손상은 일차 손상단계와 이차 손상단계로 이루어지는 2단계 과정으로 일어난다. 일차 손상은 외상을 받았을 때 축삭 또는 혈관들에 가해지는 충격의 힘을 통하여 신경 요소들에 의해 지속되는 손상을 말한다. 이차 손상단계는 일차 손상에 대한 체내 반응을 말하며, 손상 후 즉시 발생하는 세포 반응 과정의 주체와 관련이 있으며, 수개월에서 수년까지 지속한다.
척수손상은 2가지 주요 카테고리로 더 나눌 수 있는데, 완전 척수손상과 불완전 척수 손상이다. AASCIN의 신경 분류(2004년)에 의하면, 완전 손상은 '손상 척수 부위 아래로 3 척수 부위(척추 뼈) 이상에서 운동 및/또는 감각 기능이 보전되지 않는 상태'인 반면에, 불완전 손상은 '손상 척수 부위 아래로 3 척수 부위(척추 뼈) 이상에서 운동 및/또는 감각 기능이 일부 보전된 상태'로 정의하고 있다.
척수 손상이 일어나면 부위에 따라 감각, 운동신경 외에 방광과 대장기능을 조절하는 자율신경의 기능을 상실하게 되며, 다양한 임상증상을 보이게 된다. 지각장애, 운동장애, 방광직장장애 증세가 나타나는 것이 일반적이고, 완전히 또는 부분적으로 사지마비 또는 하지 마비가 일어난다. 척수의 상부가 침해될수록 장애의 범위도 넓고 중증이 된다고 알려져 있으며, 일단 손상된 척수에 대해서는 영구히 기능 회복을 기대할 수 없다고 알려져 왔다.
기존에는 척수 손상이 일어난 환자에 대해, 신체-심리 치료법(physical-psychological), 전기-충격 요법(electrical-stimulatory), 약물치료 및 수술 등을 이용해서 치료하고자 노력해왔다. 이러한 방법들은 드물게 호전되는 경우가 보고되었으나 이는 어디까지나 특정 사례에 국한되었으며 일반적으로 사용될 수 있는 우수한 치료법이 존재하지 않았다. 이러한 치료법들은 척수 신경의 재생을 유도하는 능력이 매우 낮아 척수손상을 완전히 회복시킬 수는 없었다. 최근 줄기세포 등을 이용하여 치료불가능한 질환이었던 척수 손상에 대하여 영구적인 치료법을 찾고자하는 노력이 계속되고 있다.
이러한 척수 손상에 대한 치료제 또는 치료 방법에 대해 관심이 집중된 가운데 이를 실험하기 위한 척수 손상 동물모델을 제조하기 위한 노력도 증가하였다. 동물모델은 척수손상의 해부학적 및 생물학적 결과들을 이해할 수 있도록 완전 척수 손상 또는 불완전 척수 손상의 특징들을 다시 만들어 내려는 목적으로 발달되어 왔다. 동물모델들은 인간모델들에 비해 여러 가지 현저한 장점들이 있는데, 예를 들면, 특정 조직이 필요한 경우에 동물모델에 사용할 수 있고, 조직학적 목적으로 조직을 가공해 관심을 갖고 있는 단백질들의 공동 분포(Co-localization)를 조사할 수 있으며, mRNA 분석(마이크로어레이, Microarray)으로 단백질 발현을 조사할 수 있고, 단백질 분석(웨스턴 블럿팅, Western blotting)으로 단백질의 수준을 조사할 수 있다. 랫트 모델은 비싸지 않으며, 수술적 감염이 거의 없고, 간호하기 쉬우며, 많은 수를 연구할 수 있어서, 척수 손상을 연구하기 위하여 가장 널리 이용된다. 최근에는 척수손상 연구에서 마우스 모델 또한 점점 더 많이 도입되고 있다. 그러나, 개와 고양이 같은 큰 포유동물은 척수손상 연구의 관점에서 봤을 때는 매우 드물게 사용되며, 이에 대한 연구 경험이 부족한 실정이고, 간호하고 사육하는 데 비용이 많이 소모되며, 윤리적으로 더욱 엄격하게 수행되어야 하는 문제가 있다.
한편, 척수 손상 동물모델은 추궁절제술을 이용하여 척수를 노출시켜 손상을 주는 방법이 일반적으로 많이 사용되나, 이는 고도의 숙련된 기술자에 의해 수행될 수 있으며 그나마도 생존율이 매우 낮다. 또한 타박 손상 모델(contusion model)은 대부분 흉추 부분에 손상을 유도하게 되는데 이는 경추에 유도할 경우 생명을 위협하게 되기 때문이다. 프로그램화되어 조절되는 타박 모델 제조용 기계를 이용하여 제조할 수는 있으나 해당 기계는 매우 고가의 장비에 해당하며, 매우 복잡한 기구에 해당하여 숙련자만이 사용가능하다. 한편, 전횡절개 손상 모델(complete transection model)의 경우에는 생체물질 등의 재생에 미치는 영향을 확인하는데 널리 사용되나 이는 매우 넓은 상처를 남겨 수술 후 시술 자체의 후유증 care에 많은 노력이 필요하고 생존율이 낮은 단점이 있다. 부분절개 손상 모델(hemisection model)의 경우엔 손상 정도를 조절하는데 문제가 있다는 것이 알려져 있다(Sarina Kundi, et al.,American Journal of Neuroscience 4 (1): 1-12, 2013).
상기 설명한 척수 손상 모델들은 대부분 척수 손상의 정도를 정밀하게 유도하지 못함으로 인해서 일률적인 척수 손상을 일으킬 수 없고 척수가 전체적으로 손상될 수 있어 부분적인 척수 손상이 대부분인 인간의 척수 손상 병증을 제대로 재현하지 못하였다. 또한, 상기 척수 손상 모델들은 척수를 노출시키는 방법으로 동물의 생존율이 낮고, 척수액이 역류하여 약제 투입이나 조직 이식이 어려우며, 용량 및 투여기간에 따라 정량화하기 힘들고 부작용이 크다는 등의 문제점을 갖고 있다. 무엇보다 척수 손상 부위에 약제 등을 투입하고자 할 때 척수를 지속적으로 노출시켜야 하는 단점이 있었다. 이에 따라, 인간 척수 손상을 유사하게 재현하면서도, 손상 정도를 정밀하게 유도하여 동물 모델의 생존율을 높이고 치료 과정을 만성적으로 관찰할 수 있는 척수 손상 동물 모델을 제조하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 인간 척수 손상을 유사하게 재현할 수 있으며 동물 모델의 생존율이 높고 만성적인 관찰이 가능한 척수 손상 동물 모델을 제조하는 방법을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 마이크로 드릴 등의 마이크로 수술용 기기를 이용하여 가시돌기(spinous process)를 마모시키고 추궁 부분에 천공한 후, 주사바늘로 척수 손상을 주는 것을 통해 정밀하게 척수 손상 모델을 제조할 수 있음을 확인하였으며 시술 후 동물 모델의 생존율을 100%로 올렸으며, 해당 천공 구멍을 통해 치료제나 치료 후보 물질을 안정적으로 용량별, 기간별로 투여할 수 있어 치료제 등의 만성적인 효과를 무리없이 관찰할 수 있는 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill), 마이크로 수술용 드라이버(micro surgical driver), 마이크로 수술용 톱 (micro saws) 및 마이크로 수술용 절단 액세서리(micro cutting accessories) 등을 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계; 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴 등을 이용하여 척수 실질에 닿을 수 있는 깊이의 구멍을 뚫는 단계; 및 상기 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 제조한 척수 손상 동물모델을 이용하여 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 제조한 척수 손상 동물모델을 이용하여 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill), 마이크로 수술용 드라이버(micro surgical driver), 마이크로 수술용 톱 (micro saws) 및 마이크로 수술용 절단 액세서리(micro cutting accessories)로 이루어진 군으로부터 선택된 수술용 기기를 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계; 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 구멍을 뚫는 단계; 및 상기 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 이용하여 제조한 척수 손상 동물모델을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법은, a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill)을 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계; b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 척수 실질에 닿도록, 예를 들어 동물모델로 랫트를 이용할 경우 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법일 수 있다.
본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법은, 상기 a) 단계에 앞서 척수 손상 모델용 동물의 척추기립근(erector spinae) 절개 후 가시돌기를 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 d) 단계의 척수 손상이 완료된 후 구멍을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
척추 뼈는 크게 추체(verebral body)와 추궁(vertebral arch)으로 구분된다. 추체는 고정시키는 역할을 한다. 추궁은 그 안에 척수(spinal cord)가 담겨져 있으며 추체 부분에 비해 상대적으로 동적인 역할을 한다. 추궁은 척추 뼈의 뒷부분으로 추궁근(pedicle of vertebral arch, 척추뼈고리뿌리)과 추궁판(lamina of vertebral arch, 척추뼈고리판)으로 이루어져 있으며, 추체 부분에 추궁근 부분을 통해 부착되어 있다. 구체적으로 인간의 경우, 추궁은 7개의 돌기를 가지고 있으며, 이들은 1개의 가시돌기, 2개의 가로돌기 및 4개의 관절돌기에 해당한다.
본 발명에서 시술의 대상인 가시돌기(spinous process)는 일명 극돌기라고도 불리우며, 추궁판이 양쪽에서 서로 만나는 지점에 직후방으로 뻗어나온 구조물로 살짝 아래로 기울어져 있는 뼈 구조를 의미한다. 가시돌기에는 여러 근육과 인대가 부착되어 있다.
본 발명에서는 동물의 등 쪽에서부터 척추 신경에 접근하기 위해서 먼저 등쪽으로 뻗어나와 있는 가시돌기를 마모시킨 다음, 추궁의 본체를 드러내어 해당 부위에 구멍을 뚫는 방법을 이용하였다. 본 발명의 가시돌기 및 추궁은 경추, 요추, 천추부 등 다양한 척추에 위치하는 것일 수 있다. 척수 손상은 경추, 요추, 천추부 등 자양하게 위치별로 유발해야 할 필요가 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 척추 T10 내지 T12 영역에 위치하는 것에 척수 손상을 일으켰으며, 특히 T11 영역에 위치하는 것에 대하여 척수 손상을 일으켰다.
본 발명에서 사용되는 마이크로 수술용 드릴은 손상의 정도와 주사바늘이나 카데터의 지름을 고려하여 0.5 내지 2 mm의 지름을 가지는 구멍(hole)을 형성할 수 있는 것들이며, 주사바늘은 상기 구멍에 해당하는 지름을 가지는 것일 수 있으며, 특히 랫트를 사용하는 경우에는 18 내지 24 게이지의 주사바늘일 수 있다.
본 발명의 용어, "척수 손상 모델용 동물"은 척수 손상 및 척수 손상 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 예컨대, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물이면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 특히 비인간 척추 동물일 수 있다. 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 포유 동물은 일정한 성질을 지닌 개체가 안정적으로 공급되고, 실험할 때에 사육이나 처리가 쉽다는 등의 이유 때문에 모델 동물로서 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 랫트를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다. 모델 동물을 제작하기 전의 사육 조건은 통상적인 방법에 따라 선택하면 되고 특별히 한정되지 않지만, 균질의 모델 동물을 얻기 위해서는 가능한 각 개체를 동일한 조건 하에서 사육하는 것이 바람직하다.
기존 척수 손상 동물모델 제조방법은 laminectomy 기계를 이용하여 척수 신경을 온전히 노출시키고 이에 손상을 가하는 방법이 일반적이다. 이는 매우 고가의 기계일 뿐만 아니라 해당 기계를 다루는데 있어 숙련된 기술을 필요로 한다. 그에 비하여 본원발명의 척수 손상 동물모델 제조방법은 당업자라면 숙련된 기술없이도 일반적인 기구를 이용하여 수행할 수 있으며, 이를 통해 제조한 척수 손상 동물모델은 척수 신경을 드러내지 않고 만들어질 수 있어 시술 자체의 후유증은 매우 적어 생존율이 100%에 달하였다. 또한, 구멍을 뚫기 때문에 약물 투여용 카데터 연결이 매우 용이하며, 카데터를 이용하여 정확한 부위에 정량된 양의 약물을 투여할 수 있다. 아울러 해당 부위에 구멍이 뚫려있기 때문에 카데터를 연결한 채로 동물모델을 관찰하여 약물의 만성적인 효과를 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 통해서 동물모델을 제조하였으며, 척수 손상 후 생존율이 100%에 이르는 것을 확인하였으며, 21일이 지난 후까지 척수 손상 효과가 유지되는 것을 방광내압측정 및 척수 신경 조직 염색을 통하여 확인하였다(도 3 및 도 4).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 이용하여 제조한 동물모델을 이용한, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법 또는 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기를 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 추궁에 닿을 때까지 마모시키는 단계; b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계; c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계; d) 상기 c) 단계에서 생성된 구멍에 카데터를 이용하여 척추 손상 치료 후보 물질을 주입하는 단계; e) 상기 d) 단계에서 척수 손상 치료 후보 물질을 주입한 실험군 동물과 척수 손상 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 방광직장조절 능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및 f) 상기 e) 단계에서 실험군 동물의 방광직장조절 능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 척수 손상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기를 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 추궁에 닿을 때까지 마모시키는 단계; b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계; c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 넣어 척수 손상을 유발하는 단계; d) 상기 c) 단계에서 생성된 구멍에 카데터를 이용하여 검정 목적인 척추 손상 치료제 또는 기존 척수 손상 치료제를 주입하는 단계; e) 상기 d) 단계에서 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 척수 손상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 방광직장조절 능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및 f) 상기 e) 단계에서 실험군 동물의 방광직장조절 능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 양성 대조군 동물에 비교하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제는 세포, 화합물 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 카데터는 척수 손상 부위에 특정 물질이나 대조군 물질을 투여하기 위해 사용되며, 카데터는 추궁에 천공된 구멍의 지름과 동일 또는 유사한 지름을 가짐으로써, 정확한 부위에 정량된 양의 약물을 전달할 수 있다. 본 발명에서는 특히 구멍에 삽입되는 부분이 0.5 내 2 mm의 지름을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에서 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제의 만성적인 효과를 확인하기 위해서 이를 주입하는 단계가 장기간에 걸쳐 이루어질 수 있으며, 예를 들어 4주 내지 4개월의 기간동안 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 정확한 부위에 정량된 양의 약물을 전달할 수 있는 능력이 우수함에 따라 단기간의 효과를 확인하는데에도 유용하나, 추궁에 카데터 연결에 유용한 구멍이 생성되기 때문에 장기간에 수회에 걸쳐 카데터를 연결하는데 용이하여 척수 손상 치료 후보 물질 또는 척수 손상 치료제의 만성적인 효과를 확인하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법은 기존 고가의 장비를 이용하여 척수 손상을 주는 경우보다 인간 척수 손상을 유사하게 재현할 수 있으며 동물 모델의 생존율이 높고 만성적인 관찰이 가능한 제조방법으로, 특히 시술자의 기술이나 노하우에 영향을 거의 받지 않는 제조방법으로 척수 손상 치료제의 개발 및 효과 확인 분야에서 널리 사용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 척수 손상 동물모델을 제조하는 방법을 랫트에 시연하는 과정을 순서대로 촬영한 사진이다. 도 1a는 절개, 가시돌기 노출 및 마모, 추궁 노출 및 천공 과정(① 내지 ⑥)를 촬영한 사진이고, 도 1b는 주사바늘을 이용한 손상, 약물 주입 모습, 구멍 폐쇄, 손상 부위 확인 및 척수 손상 부위의 H&E 염색한 조직을 촬영한 사진이다(⑦ 내지 ⑫).
도 2는 방광내압을 측정하는 도구인 cystometry와 시술 단계를 촬영한 도면과 결과 그래프 도면이다.
도 3은 sham-operation 대조군과 척수 손상 동물모델에서 cystometry를 이용해 방광내압을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4은 sham-operation 대조군과 척수 손상 동물모델의 척수 조직을 H&E 염색한 결과를 비교한 도면이다.
도 2는 방광내압을 측정하는 도구인 cystometry와 시술 단계를 촬영한 도면과 결과 그래프 도면이다.
도 3은 sham-operation 대조군과 척수 손상 동물모델에서 cystometry를 이용해 방광내압을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4은 sham-operation 대조군과 척수 손상 동물모델의 척수 조직을 H&E 염색한 결과를 비교한 도면이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 동물 및 처리
본 실험에서는 13주령 성체 스프라그 다울리 랫트(Sprague-Dawley Rats, 260 ± 10 g)를 사용하였다. 모든 실험은 미국국립보건원(National Institutes of Health, NIH) 및 대한의학회(Korean Academy of Medical Sciences)의 동물 처리 가이드라인에 따라 수행되었다.
랫트는 온도 23 ± 2 ℃ 및 12시간의 명암 조건(8시 내지 20시 lighting)의 온도-습도가 조절된 상태에 두었다. 물과 음식은 자유롭게 섭취하도록 하였다(ad libitum). 랫트들은 척수 손상없이 절개 및 봉합과정을 수행한 Sham-operation 그룹, SCI-유도 그룹 및 SCI-유도 후 oral mucosa 줄기세포 처리 그룹으로 무작위로 나누었다(그룹당 n=10).
실시예
2. 척수 손상의 유도
2-1. 척수 손상 유도 방법
척수 손상의 유도를 위하여, 랫트를 아이소플루레인(Isoflurane)으로 마취시켰다. 구체적으로는 30% 산소(O2) 및 70% 질소(N2)에 2% 아이소플루레인(중외제약, 경기도, 한국)을 혼합하여 랫트를 마취하였다.
상기 마취한 랫트의 10번째에서 12번째 사이의 흉추에 있는 등쪽 피부를 2.5 cm 세로로 절개하여, 11번째 흉추 부위에서 흉추 척주(Vertebral column) 및 척추 가시돌기(spinous processes)를 노출시켰다.
노출된 11번째 척추 뼈의 가시돌기를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill)을 이용하여 갈아서, 추궁(Verterbral arch) 부위를 드러내었다. 이렇게 드러낸 추궁 부위에 마이크로 수술용 드릴(직경 1 mm)를 이용하여 2 mm 깊이로 구멍을 만들었다. 상기 마이크로 수술용 드릴로 천공한 구멍에 22 게이지 주사바늘을 삽입하여 척수 신경에 손상을 주었다. 주사바늘을 뺀 후에 구멍을 막았다. 피부의 층을 겹겹이 봉합하여 닫았다 (비단사 3-0).
척수 손상 동안 체온유지를 위한 담요를 이용하여 랫트의 몸통과 머리부위의 체온을 36 ± 0.5 ℃로 유지하였다 (Homeothermic blanket control unit, Harvard apparatus, Massachusetts, MA, USA). 회복 후에, 저체온증(Hypothermia)을 방지하기 위하여 동물을 추가적으로 2시간 동안 관찰하였다.
2-2. 척수 손상 동물모델 제조율 및 생존율
상기 실시예 2-1을 통하여 제조한 척수 손상 동물모델은 생존율이 100%에 해당하였으며, 손상 후 하지 마비, 방광직장조절장애 증상을 보였다. 상기 하지 마비 및 방광직장조절장애 증상은 별도의 치료제를 가하지 않은 경우 최소 21일간 동안은 유지되는 것을 확인하였다.
즉, 상기 실시예 2-1의 방법을 통하여 제조한 척수 손상 동물모델이 100%의 생존율을 가지는 것을 확인했으며, 증상도 일률적인 하지 마비 및 방광직장조절장애를 보이는 것을 확인하였다.
이는 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 이용할 경우 인간 척수 손상 모델과 유사한 부분 척수 손상을 일으킬 수 있으며, 생존율이 100%로 기존에 30 내지 50%에 불과하던 방법들에 비해 월등한 방법임을 보여주는 것이다. 또한, 손상 후 증상도 전신 마비, 하지 마비 등으로 손상의 정도가 일률적이지 못하던 기존 방법들에 비하여 비교적 일률적인 하지 마비 증상을 보이는 것을 확인하여 척수 손상 동물모델 제조시에 매우 유용하게 쓰일 수 있음을 나타낸다.
실시예
3.
방광내압측정법
(
cytometry
) 이용한 방광기능장애 측정
방광 내 일정량의 액에 걸리는 내압을 측정하는 방광내압측정법을 통하여, 상기 실시예 2-1에서 제조한 척수 손상 동물모델의 방광기능장애를 측정하였다.
구체적으로 천수 손상을 유도한 21일 후에 상기 대조군 동물모델(Sham-operation 그룹), 척수 손상 동물모델 및 줄기세포 투여 동물모델의 랫트를 Zoletil을 이용해서 마취한 후, 멸균한 폴리에틸렌 카데터(Polyethylene catheter, PE50)를 방광 천장(bladder dome)을 통하여 요도에 삽입하였다. 해당 카데터는 압력변환기(pressure transducer, Havard Apparatus, Holliston, MA, USA) 및 주사기 펌프(Syringe pump)에 연결되어 요도내 압력을 측정하였다. Labscribe(iWork System Inc., Dover, NH, USA)를 이용하여 수축압 및 수축시를 모니터하였다(도 2).
그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이, Sham-operation 동물 모델에서는 특정 시간에 방광의 수축압이 증가하였으며, 수축되는 시간은 몰려있었다. 그에 비해 척수 손상 동물모델에서는 수축압이 증가하는 빈도수가 매우 빈번함을 확인할 수 있다. 이는 상기 실시예 2-1의 척수 손상 방법을 통해 방광직장 조절장애가 일어남을 확인한 것이며, 그 증상이 유도 후 21일이 되기까지 만성적으로 이어지는 것을 나타낸다.
실시예
4. 척수 신경 조직 검사
4-1. 조직 채취
상기 실시예 2-1에서 제조한 척수 손상 동물모델의 척수 신경을 확인하였다. 척수 손상을 유도하고 21일 후에 상기 실시예 3의 랫트의 방광기능장애를 측정한 직후 랫트를 모두 희생하여 척수 신경을 채취하였다.
구체적으로, 척수 손상 유도 후 21일째에 Zoletil 50® (10 mg/kg, i.p.; Vibac Labotatories)을 50 mM 인산완충식염수(PBS)과 함께 동물에 경심관류로 투여하여 마취시킨 후, 4% 파라포름알데하이드(100 mM 인산완충액, PB, pH7.4)로 고정시켰다. 뇌와 척수(spinal cord)는 잘라내어 동일한 고정용액에 하룻밤동안 후고정을 한 후, 30% 수크로즈 용액에 동결보호(cryoprotection)을 하였다.
Freezing microtome (Leica, Nussloch, Germany)을 이용하여 뇌 조직은 40 ㎛의 두께로 관상절편을 제조하였고, 척수는 20㎛의 두께로 횡단면을 제조하였다. 하나의 랫트에서 각 영역당 평균 10개의 슬라이스 절편을 채취하였다. 척수 손상 부위를 확인하기 위해서 척수는 T10에서 T12위치에서 채취하였다.
4-2. H&E 염색
상기 실시예 4-1에서 채취한 조직절편의 조직학적인 분석을 위하여 H&E 염색(Hematoxylin and eosin staining)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 슬라이스 절편이 붙은 슬라이드를 Mayer's hemaoxylin에 30초간 담근 뒤, 물로 세척하였다. 이 후 eosin에 30초간 담근 뒤, 다시 물로 헹궈내었다. 이렇게 제조한 슬라이드를 상온에서 공기 건조시킨 후 95% 에탄올에 2번 담근 뒤, 100% 에탄올에 두번 담궜다. 이후, 50% 에탄올/50% 자일렌 용액에 두번 담근 뒤, 100% 자일렌에 두번 담궜다. 상기 과정을 거친 슬라이드를 최종적으로 Permount®(Fisher Scientific, New Jersey, NJ, USA) 마운팅 용액을 이용하여 커버슬립을 올려 슬라이드를 완성하였다.
이를 광학 현미경으로 관찰한 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, 척수 신경이 부분적으로 손상된 것을 확인할 수 있으며, 21일이 지나도록 척수 조직의 손상이 유지되는 것을 확인할 수 있다.
이는, 본 발명의 척수 손상 동물모델 제조방법을 이용하면 인간 척수 손상과 유사한 부분 척수 손상 모델을 만들 수 있음을 확인한 것이며, 그 증상이 유도 후 21일이 되기까지 만성적으로 이어지는 것을 확인한 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기(spinous process)를 마이크로 수술용 드릴(micro surgical drill), 마이크로 수술용 드라이버(micro surgical driver), 마이크로 수술용 톱 (micro saws) 및 마이크로 수술용 절단 액세서리(micro cutting accessories)로 이루어진 군으로부터 선택된 수술용 기기를 이용하여 추궁(vertebral arch)에 닿을 때까지 마모시키는 단계;
b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 척수 실질에 닿도록 구멍을 뚫는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상인 비인간 척추 동물인 것을 특징으로 하는, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 비인간 척추 동물은 랫트인 것을 특징으로 하는, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 a)의 가시돌기 및 추궁은 경추, 요추 및 천추부로 이루어진 군으로부터 선택된 부위에 위치하는 것인, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 b)의 척수 실질에 닿도록 구멍을 뚫는 단계는 동물모델로 랫트를 이용할 경우 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 것인, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마이크로 수술용 드릴은 0.5 내지 2 mm의 지름을 가지는 것인, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 c)의 주사바늘은 18 내지 24 게이지의 주사바늘인 것인, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- 제1항에 있어서, d) 상기 c) 단계의 척수 손상이 완료된 후 구멍을 폐쇄하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 척수 손상 동물모델 제조방법.
- a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기를 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 추궁에 닿을 때까지 마모시키는 단계;
b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 삽입하여 척수 손상을 유발하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 생성된 구멍에 카데터를 이용하여 척추 손상 치료 후보 물질을 주입하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 척수 손상 치료 후보 물질을 주입한 실험군 동물과 척수 손상 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 방광직장조절능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및
f) 상기 e) 단계에서 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 척수 손상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 카데터는 구멍에 삽관되는 부분이 0.5 내지 2 mm의 지름을 가지는 것인, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 d) 단계는 4주 내지 4개월의 기간 동안 수행되어 척수 손상 치료 후보 물질의 만성적인 효과를 확인하는 것에 특징이 있는, 척수 손상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- a) 척수 손상 모델용 동물의 노출된 가시돌기를 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 추궁에 닿을 때까지 마모시키는 단계;
b) 상기 추궁에 마이크로 수술용 드릴을 이용하여 1 내지 2.5 mm 깊이의 구멍을 뚫는 단계;
c) 상기 b) 단계에서 생성된 구멍에 주사바늘을 넣어 척수 손상을 유발하는 단계;
d) 상기 c) 단계에서 생성된 구멍에 카데터를 이용하여 검정 목적인 척추 손상 치료제 또는 기존 척수 손상 치료제를 주입하는 단계;
e) 상기 d) 단계에서 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 척수 손상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 방광직장조절능력, 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 측정하는 단계; 및
f) 상기 e) 단계에서 실험군 동물의 운동능력 또는 척수 신경의 회복 정도를 양성 대조군 동물에 비교하는 단계를 포함하는, 척수 손상 치료제의 효과를 검정하는 방법.
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180032827A (ko) * | 2016-09-23 | 2018-04-02 | 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 | 동물척수손상모델 생성방법 |
| KR20180120433A (ko) * | 2017-04-27 | 2018-11-06 | 제주대학교 산학협력단 | 불완전 척수 손상 모델의 제조방법 |
| CN111494054A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-08-07 | 首都医科大学宣武医院 | 可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用 |
| KR20210081061A (ko) * | 2019-12-23 | 2021-07-01 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 뇌하수체 기능부전 동물모델 |
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2014
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| CN111494054A (zh) * | 2020-04-10 | 2020-08-07 | 首都医科大学宣武医院 | 可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用 |
| CN111494054B (zh) * | 2020-04-10 | 2023-02-28 | 首都医科大学宣武医院 | 可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用 |
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