WO2021132996A1 - 뇌하수체 기능부전 동물모델 - Google Patents
뇌하수체 기능부전 동물모델 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2021132996A1 WO2021132996A1 PCT/KR2020/018657 KR2020018657W WO2021132996A1 WO 2021132996 A1 WO2021132996 A1 WO 2021132996A1 KR 2020018657 W KR2020018657 W KR 2020018657W WO 2021132996 A1 WO2021132996 A1 WO 2021132996A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- pituitary
- hormone
- animal
- insufficiency
- animal model
- Prior art date
Links
- 206010021067 Hypopituitarism Diseases 0.000 title claims abstract description 65
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 46
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 claims description 36
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 36
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 claims description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 27
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 23
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 23
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 claims description 22
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 claims description 22
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 claims description 22
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 22
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 22
- 239000000275 Adrenocorticotropic Hormone Substances 0.000 claims description 21
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 claims description 21
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 claims description 21
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 12
- 102100027467 Pro-opiomelanocortin Human genes 0.000 claims description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 4
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 claims description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 abstract description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 18
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 15
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 11
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 6
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 4
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 4
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 4
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 4
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 3
- 210000003935 rough endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 210000004739 secretory vesicle Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 2
- 102000009025 Endorphins Human genes 0.000 description 2
- 108010049140 Endorphins Proteins 0.000 description 2
- 108010092674 Enkephalins Proteins 0.000 description 2
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N Leu-enkephalin Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-VABKMULXSA-N 0.000 description 2
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 2
- 101800000992 Melanocyte-stimulating hormone beta Proteins 0.000 description 2
- GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N Vasopressin Natural products N1C(=O)C(CC=2C=C(O)C=CC=2)NC(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C1CC1=CC=CC=C1 GXBMIBRIOWHPDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004977 Vasopressins Proteins 0.000 description 2
- 102000002852 Vasopressins Human genes 0.000 description 2
- KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N argipressin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N1)=O)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NCC(N)=O)C1=CC=CC=C1 KBZOIRJILGZLEJ-LGYYRGKSSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000002657 hormone replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 230000006584 pituitary dysfunction Effects 0.000 description 2
- 229960003726 vasopressin Drugs 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000599 Acromegaly Diseases 0.000 description 1
- 208000003200 Adenoma Diseases 0.000 description 1
- 206010001233 Adenoma benign Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101100256850 Drosophila melanogaster EndoA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 208000010228 Erectile Dysfunction Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010018265 Gigantism Diseases 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003450 Neurogenic Diabetes Insipidus Diseases 0.000 description 1
- 206010053159 Organ failure Diseases 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031951 Oxytocin-neurophysin 1 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 208000028235 central diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010064 diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002296 eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000006676 mitochondrial damage Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 201000005119 neurohypophyseal diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 210000002747 omentum Anatomy 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
Definitions
- the present invention relates to a method for manufacturing an animal model of pituitary insufficiency and a method for verification thereof.
- the endocrine system is regulated by the hypothalamic-pituitary-organ axis. After the hypothalamus sends the correct signal to the pituitary, various hormones (adrenocorticotropic hormone, beta-melanocyte-stimulating hormone, endorphins, enkephalins, follicle-stimulating hormone, growth hormone, luteinizing hormone, prolactin, and thyroid-stimulating hormone) are released from the pituitary gland. secreted to stimulate and regulate target organs.
- the pituitary gland is often referred to as the master gland because it regulates the functions of most other endocrine glands (Reichlin S. Neuroendocrinology of the pituitary gland. Toxicol Pathol.
- the hypothalamus can determine how much stimulation the target gland needs by detecting the level of a hormone produced by a gland under the control of the pituitary gland (the target gland).
- the pituitary gland is distinctly divided into two parts, the anterior lobe and the posterior lobe, which account for 80% of the pituitary's weight.
- the lobe is connected to the hypothalamus by a stem containing blood vessels and nerve cell projections (nerve fibers or axons).
- the hypothalamus controls the anterior lobe by releasing hormones through the connected blood vessels, and controls the posterior lobe through nerve impulses.
- the anterior lobe contains growth hormone, thyroid-stimulating hormone, adrenocorticotropic hormone (ACTH), also called corticotropin, follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone (gonadotropin), prolactin, beta-melanocyte-stimulating hormone, enkephalin and endo It produces and releases (secreses) endorphins, and the posterior pituitary produces vasopressin and oxytocin (produced by the hypothalamus and then secreted by the pituitary).
- ACTH adrenocorticotropic hormone
- follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone gonadotropin
- prolactin prolactin
- beta-melanocyte-stimulating hormone enkephalin and endo It produces and releases (secreses) endorphins
- the posterior pituitary produces vasopressin and oxytocin (produced by the hypothalamus and then secreted by the pituitary).
- Hypopituitarism in which the pituitary gland does not work properly, is usually caused by overproduction or underproduction of one or more pituitary hormones by a noncancerous tumor (adenoma) or by causing the pituitary gland to enlarge.
- excess cerebrospinal fluid can overproduce or underproduce pituitary hormones by filling the space around the pituitary gland, compressing the pituitary gland, resulting in empty saddle syndrome.
- Pituitary hormonal changes due to pituitary dysfunction cause various and serious diseases/disorders (Kim SY. Diagnosis and Treatment of Hypopituitarism. Endocrinol Metab (Seoul). 2015;30(4):443-455.).
- disorders caused by overproduction of pituitary hormones include acromegaly or gigantism (growth hormone), eclampsia (prolactin), and erectile dysfunction (prolactin).
- Disorders caused by underproduction of pituitary hormones include central diabetes insipidus ( vasopressin), and hypopituitarism (several hormones).
- the present invention provides a method for preparing an animal model of pituitary insufficiency.
- the present invention provides a verification method of an animal model of pituitary insufficiency.
- the present invention provides a method for screening a candidate for the treatment of pituitary insufficiency.
- the present invention provides a method for assaying the effect of a therapeutic agent for pituitary insufficiency.
- the present invention provides an animal model of pituitary insufficiency.
- the present invention relates to a method for manufacturing an animal model of pituitary insufficiency, which can reproduce the symptoms of pituitary insufficiency, and can verify whether an animal model of pituitary insufficiency with symptoms of actual pituitary insufficiency is established, so that the treatment of pituitary insufficiency It can be usefully used to confirm the effect of a candidate substance or a therapeutic agent for pituitary insufficiency.
- Black arrow small remnant of the pituitary gland (sellar fossa);
- Figures 2a to 2e are diagrams showing hormonal changes in each rat to which pituitary resection was well applied.
- Figure 2f is a diagram showing the weight change of each rat to which the pituitary resection was well applied.
- 3A and 3B are diagrams showing how pituitary allografting is performed:
- Black arrowheads pituitary gland packed omental pouch.
- FIG. 4 is a diagram showing an experimental protocol confirming changes in body weight and serum hormones after pituitary resection and pituitary allograft surgery.
- 5A to 5D are diagrams showing hormonal changes in the serum of rats after pituitary resection and pituitary allograft.
- Figure 5e is a diagram showing the weight change of rats after pituitary resection and pituitary allograft.
- FIG. 6 is a diagram confirming the microstructure change of the transplanted pituitary gland by EM:
- the present invention comprises the steps of incision of the front skin of the neck of an animal other than a human pituitary insufficiency model; Penetrating the cranial bone by entering the lower wall of the cranial bone (floor of the cranium) through the omohyoid muscle; And it relates to a method for producing an animal model of pituitary insufficiency, comprising the step of extracting the pituitary gland.
- the manufacturing method of the present invention may further include the step of verifying whether an animal model with pituitary insufficiency is established, and the step of verifying whether an animal model of pituitary insufficiency is established is an animal with a pituitary removed.
- the serum of determining the level of any one selected from the group consisting of growth hormone (GH), adrenocorticotropic hormone (ACTH) and thyroid stimulating hormone (TSH) in serum may include confirming a change in the weight of the pituitary-extracted animal.
- a skin incision is made in the middle part of the front of the neck of anesthetized rats and enters the floor of the cranium through the scapular hyoid muscle located on the lower surface of the sternohyoid muscle, and then the blue complex
- An animal model of pituitary insufficiency was induced by excising the pituitary gland with microscopic membranes after vertically piercing the skull bones together with a bone burr in the middle and front of the line.
- pituitary resection if the pituitary gland is removed too much, the animal will die, and if too little is removed, the pituitary dysfunction effect does not appear.
- a method for verifying whether the model has been established has been added.
- the term "animal for pituitary insufficiency model" is not particularly limited as long as it is suitable for evaluating the efficacy of a test drug in a study of pituitary insufficiency and pituitary insufficiency, and any form can be used.
- any non-human animal such as monkey, dog, cat, rabbit, rat (rat), mouse, cow, sheep, pig, goat, etc. may be used, and for the purpose of the present invention, it may be a non-human animal in particular.
- Mammals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, rats (rat), mice, cattle, sheep, pigs, goats, etc. are stably supplied with individuals with certain characteristics and are easy to breed or handle during experiments.
- a model animal it is preferable as a model animal.
- a rat rat
- Breeding conditions before production of the model animal may be selected according to a conventional method and are not particularly limited, but in order to obtain a homogeneous model animal, it is preferable to breed each individual possible under the same conditions.
- the present invention is selected from the group consisting of growth hormone (GH), adrenocorticotropic hormone (ACTH) and thyroid stimulating hormone (TSH) in the serum of a pituitary-extracted animal measuring the level of any one being; comparing with the corresponding result before pituitary enucleation; And when the level of any one selected from the group consisting of growth hormone, adrenocorticotropic hormone and thyroid-stimulating hormone is decreased, it is determined that the pituitary insufficiency animal model has been established. It's about
- the animal may be one or more non-human animals selected from the group consisting of monkey, dog, cat, rabbit, rat, mouse, cow, sheep, pig and goat.
- the present invention comprises the steps of injecting a pituitary insufficiency therapeutic agent for assay purpose into an animal model of pituitary insufficiency prepared by the method of the present invention; measuring the serum hormone level or body weight of the experimental group animals injected with the pituitary insufficiency therapeutic agent for the purpose of the assay and the control animals not administered with the pituitary insufficiency treatment candidate; And when the level of recovery of hormone levels or body weight in the serum of the animals of the experimental group is increased compared to the control animals, it relates to a method of screening for a pituitary insufficiency treatment candidate, comprising the step of determining as a pituitary insufficiency therapeutic agent.
- the hormone may be any one or more selected from the group consisting of growth hormone, adrenocorticotropic hormone, and thyroid stimulating hormone.
- the present invention comprises the steps of: injecting a therapeutic agent for spinal cord injury for assay purpose into an animal model of pituitary insufficiency prepared by the method of the present invention; measuring the serum hormone level or body weight of the experimental group animals injected with the pituitary insufficiency treatment for the purpose of the assay and the positive control animals administered with the conventional pituitary insufficiency treatment; And it relates to a method for assaying the effect of a therapeutic agent for pituitary insufficiency, comprising the step of comparing the level of recovery of the hormone level or body weight in the serum of the experimental group animal with a positive control animal.
- the hormone may be any one or more selected from the group consisting of growth hormone, adrenocorticotropic hormone, and thyroid stimulating hormone.
- the term “detection” or “measurement” means to quantify the concentration of a detected or measured object.
- the present invention relates to an animal model of pituitary insufficiency prepared by the method of the present invention.
- the animal may be at least one non-human animal selected from the group consisting of monkey, dog, cat, rabbit, rat, mouse, cow, sheep, pig and goat, more preferably a rat.
- IACUC Institutional Animal Care and Use Committees
- rat serum was obtained from the tail vein at 10 am, and serum hormone levels were checked before pituitary resection and 2, 4, 6, 8, 10 or 12 weeks after surgery. Body weight was also checked before pituitary resection and 2, 4, 6, 8, 10, or 12 weeks after surgery.
- TSH thyroid stimulating hormone
- GH growth hormone
- ACTH adrenocorticotropic hormone
- rat serum was obtained from the tail vein at 10 am, and serum hormone levels were checked before pituitary resection and 2, 4, 6, 8, 10 or 12 weeks after surgery.
- Body weight was also checked before pituitary resection and 2, 4, 6, 8, 10, or 12 weeks after surgery.
- the cranial vault was removed and the right hemisphere was retracted. After that, the basic structure of the midline skull was checked under a binocular microscope to determine whether the pituitary gland remained.
- HTK Histindine-triptophan-ketoglutarate
- the transplanted pituitary gland was removed and microstructural changes (nuclear degeneration, mitochondrial damage, rough endoplasmic reticulum (RER) and secretory granules (SGs)) were confirmed by electron microscopy (EM, JEM-1010, Jeol, Japan). Specifically, three days after transplantation, the transplanted pituitary gland was extracted and tissue was prepared, placed in a fixative solution, washed with PBS, and post-fixed in phosphate-buffered 1% osmium tetroxide. After successive dehydration with alcohol, the tissue was embedded with EPON resin.
- Tissues were sectioned using an ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica, Austria) into 70-80 nm ultra-thin sections and stained with uranyl acetate and lead citrate.
- the transplanted pituitary maintained almost normal ultrastructures in EM examination.
- the structures of mitochondria, RER and nucleus were maintained similar to that of the normal pituitary, and the number and structure of SGs were also maintained (Fig. 6).
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 뇌하수체 기능부전 동물 모델의 제조방법 및 이의 검증 방법에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법은 뇌하수체 기능부전 증상을 재현할 수 있으며, 실제 뇌하수체 기능부전의 증상을 가진 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증할 수 있으므로, 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질 또는 뇌하수체 기능부전 치료제의 효과를 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 뇌하수체 기능부전 동물 모델의 제조방법 및 이의 검증 방법에 관한 것이다.
내분비계는 시상하부-뇌하수체-기관 축에 의해 조절된다. 시상하부가 뇌하수체에 정확한 신호를 전달한 후, 다양한 호르몬 (부신피질자극 호르몬, 베타-멜라닌세포 자극 호르몬, 엔도르핀, 엔케팔린, 난포 자극 호르몬, 성장 호르몬, 황체형성 호르몬, 프롤락틴 및 갑상샘 자극 호르몬)이 뇌하수체에서 분비되어 표적 기관을 자극하고 조절한다. 뇌하수체는 대부분의 다른 내분비샘의 기능을 조절하므로 종종 주분비샘으로 불린다 (Reichlin S. Neuroendocrinology of the pituitary gland. Toxicol Pathol. 1989;17(2): 250-255.). 시상하부 또는 뇌하수체는 뇌하수체의 조절 하에 있는 샘 (표적샘)에 의해 생산되는 호르몬 수치를 검출하여 표적샘이 어느 정도의 자극을 필요로 하는지 결정할 수 있다. 뇌하수체는 뇌하수체 무게의 80%를 차지하는 전엽 및 후엽의 두 부분으로 뚜렷하게 나뉘어져 있다. 엽은 혈관과 신경 세포 투사(신경 섬유 또는 축삭)를 함유하는 줄기에 의해 시상하부와 연결된다. 시상하부는 연결된 혈관을 통하여 호르몬을 방출함으로써 전엽을 조절하며, 신경 임펄스를 통해 후엽을 조절한다. 뇌하수체에서 전엽은 성장 호르몬, 갑상샘 자극 호르몬, 코르티코트로핀으로도 불리는 부신피질자극 호르몬(ACTH), 난포 자극 호르몬과 황체형성 호르몬(생식선자극호르몬), 프롤락틴, 베타-멜라닌세포 자극 호르몬, 엔케팔린 및 엔도르, 및 엔도르핀을 생산하고 방출(분비)하며, 뇌하수체의 후엽은 바소프레신 및 옥시토신을 생산한다 (시상하부에서 생성 후 뇌하수체에서 분비).
뇌하수체가 제대로 작동하지 않는 뇌하수체 기능부전(hypopituitarism)은 보통 비암성 종양(샘종)에 의해 하나 이상의 뇌하수체 호르몬을 과잉 생산하거나 과소 생산되거나 뇌하수체의 비대를 유발함으로써 발생한다. 또는 과도한 뇌척수액이 뇌하수체 주위의 공간을 채워 뇌하수체를 압박하여 빈안장 증후군을 초래함으로써 뇌하수체 호르몬을 과잉 생산하거나 과소 생산되게 할 수 있다. 뇌하수체 기능부전에 의한 뇌하수체 호르몬 변화는 다양하고 심각한 질병/장애를 유발한다 (Kim SY. Diagnosis and Treatment of Hypopituitarism. Endocrinol Metab (Seoul). 2015;30(4): 443-455.). 뇌하수체 호르몬의 과잉생산으로 인해 초래되는 장애들은 말단비대증 또는 거인증 (성장 호르몬), 유루증 (프롤락틴), 발기 장애 (프롤락틴) 등이 있으며, 뇌하수체 호르몬의 과소생산으로 인해 초래되는 장애들은 중추성 요붕증 (바소프레신), 뇌하수체기능저하증 (여러 호르몬) 등이 있다. 이와 같은 뇌하수체 기능부전 환자들은 평생 호르몬 대체 요법이 필요하지만 장기적인 호르몬 대체는 심각한 부작용이 수반될 수 있다 (Smith JC. Hormone replacement therapy in hypopituitarism. Expert Opin Pharmacother. 2004;5(5): 1023-1031.). 말기 장기 부전을 위한 유일한 치료법이 많은 경우에 여전히 장기 이식이기 때문에, 뇌하수체 기능부전의 치료를 위한 이론적인 치료법인 뇌하수체 이식은 이러한 심각한 합병증을 생리적으로 극복할 수 있다 (Maxwell M, Allegra C, MacGillivray J, et al. Functional transplantation of the rat pituitary gland. Neurosurgery. 1998;43(5): 1157-1163.). 1908년에 최초의 뇌하수체 이식이 시행된 뒤 (Pendleton C, Zaidi HA, Pradilla G, Cohen-Gadol AA, Quinones-Hinojosa A. Harvey Cushing's attempt at the first human pituitary transplantation. Nat Rev Endocrinol. 2010;6(1): 48-52.), 여러 연구자들이 실험적인 뇌하수체 이식을 조사하였다 (Harris GW, Jacobsohn D. Functional grafts of the anterior pituitary gland. J Physiol. 1951;113(4): 35p-36p.).
본 발명의 목적은 뇌하수체 기능부전 동물모델을 제작하고, 뇌하수체의 적절한 절제 여부를 확인하기 위한 지표 및 검증 방법을 개발하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 뇌하수체 기능부전 동물모델의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌하수체 기능 부전 동물모델의 검증 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌하수체 기능부전 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 뇌하수체 기능부전 동물모델을 제공한다.
본 발명은 뇌하수체 기능부전 동물모델 제조방법에 관한 것으로, 뇌하수체 기능부전 증상을 재현할 수 있으며, 실제 뇌하수체 기능부전의 증상을 가진 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증할 수 있으므로, 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질 또는 뇌하수체 기능 부전 치료제의 효과를 확인하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 뇌하수체 절제술 후 뇌하수체의 적절한 제거 또는 불충분한 제거를 확인한 도이다:
A: 뇌하수체의 적절한 제거;
검은색 화살표: 뇌하수체의 작은 잔해 (sellar fossa);
B: 뇌하수체의 불충분한 제거; 및
흰색 화살표: 잔여 뇌하수체.
도 2a 내지 도 2e는 뇌하수체 절제술이 잘 적용된 각 래트들의 호르몬 변화를 나타낸 도이다.
도 2f는 뇌하수체 절제술이 잘 적용된 각 래트들의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 뇌하수체 동종이식술을 수행하는 모습을 나타낸 도이다:
흰색 화살표: 공여자 래트로부터 적출한 뇌하수체;
검은색 화살표: 수여자 래트의 장막; 및
검은색 화살촉: 뇌하수체가 패킹된 장막 파우치(omental pouch).
도 4는 뇌하수체 절제술 및 뇌하수체 동종이식술 후 체중 및 혈청 내 호르몬 변화를 확인한 실험 프로토콜을 나타낸 도이다.
도 5a 내지 도 5d는 뇌하수체 절제술 및 뇌하수체 동종이식술 후 래트들의 혈청 내 호르몬 변화를 나타낸 도이다.
도 5e는 뇌하수체 절제술 및 뇌하수체 동종이식술 후 래트들의 체중 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 이식된 뇌하수체의 미세 구조 변화를 EM으로 확인한 도이다:
A: 1500배율; 및
B: 6000배율.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 인간을 제외한 뇌하수체 기능부전 모델용 동물의 목의 전면 피부를 절개하는 단계; 견갑설골근(omohyoid muscle)을 통해 두개골 뼈의 하벽(floor of the cranium)으로 들어가 두개골 뼈를 뚫는 단계; 및 뇌하수체를 적출하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 제조방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 제조방법은 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증하는 단계는, 뇌하수체가 적출된 동물의 혈청을 수득하고; 혈청 내 성장 호르몬(growth hormone, GH), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH) 및 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준을 확인하며; 및 뇌하수체가 적출된 동물의 체중 변화를 확인하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서는 마취한 래트의 목의 앞쪽의 중간 부분에서 피부 절개하고 흉골설골근(sternohyoid muscle)의 하단면에 위치한 견갑설골근을 통해 두개골 뼈의 하벽(floor of the cranium)으로 들어간 후, 청색 복합선 중간 및 앞에서 뼈 버(bone burr)와 함께 두개골 뼈를 수직으로 뚫은 뒤, 미세한 막이 있는 뇌하수체를 적출함으로써 뇌하수체 기능부전 동물모델을 유도하였다. 뇌하수체 절제술의 경우 뇌하수체 부분을 너무 많이 제거하면 동물이 폐사하고, 너무 적게 제거하면 제거에 따른 뇌하수체 기능부전 효과가 나타나지 않으므로, 뇌하수체 절제/적출/제거 여부에 대한 검증 기준이 필요하므로, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증하는 방법을 추가하였다.
본 발명의 용어, "뇌하수체 기능부전 모델용 동물"은 뇌하수체 기능부전 및 뇌하수체 기능부전 연구의 피험 약제의 약효 평가에 적합한 것이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이어도 사용할 수 있다. 예컨대, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트(쥐), 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물이면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 본 발명의 목적상 특히 비인간 동물일 수 있다. 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 랫트(쥐), 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 포유 동물은 일정한 성질을 지닌 개체가 안정적으로 공급되고, 실험할 때에 사육이나 처리가 쉽다는 등의 이유 때문에 모델 동물로서 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 랫트(쥐)를 사용하였으나, 이에 제한되지 않는다. 모델 동물을 제작하기 전의 사육 조건은 통상적인 방법에 따라 선택하면되고 특별히 한정되지 않지만, 균질의 모델 동물을 얻기 위해서는 가능한 각 개체를 동일한 조건 하에서 사육하는 것이 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 뇌하수체가 적출된 동물의 혈청 내 성장 호르몬(growth hormone, GH), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH) 및 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준을 측정하는 단계; 뇌하수체 적출 전의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준이 감소한 경우 뇌하수체 기능부전 동물모델이 수립된 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 검증 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 동물일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델에 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입하는 단계; 상기 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입한 실험군 동물과 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중을 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 뇌하수체 기능부전 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 호르몬은 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계; 상기 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 뇌하수체 기능부전 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중을 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중의 회복 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 치료제의 효과를 검정하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 호르몬은 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델에 관한 것이다.
일 구현예에서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 동물일 수 있으며, 래트인 것이 더욱 바람직하다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 뇌하수체 기능 부전 동물 모델 제작
1-1. 뇌하수체 절제술
뇌하수체 절제술을 수행할 래트들로, 160-280g의 수컷 SCID Sprague Dawley 래트 (Koatech, Pyungtaek, Korea)들이 사용되었다 (n=10). 수술에 앞서, 래트들을 12시간 명암 주기로 유지되는 제어된 온도의 실험실에서 사육하였으며, 음식과 물은 임의로 제공되었다. 또한, 모든 동물을 이용하는 프로토콜은 카톨릭대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인 하에 진행되었다 (SVH IRB 17-5). 모든 SCID 래트들을 이소플루란으로 마취시킨 뒤, 목의 앞쪽의 중간 부분에서 피부 절개하고 흉골설골근(sternohyoid muscle)의 하단면에 위치한 견갑설골근(omohyoid muscle)을 통해 두개골 뼈의 하벽(floor of the cranium)으로 들어갔다. 흉골설골근, 기관 및 식도를 측면으로 리트랙션(retraction)한 후, 청색 복합선 중간 및 앞에서 뼈 버(bone burr)와 함께 두개골 뼈를 수직으로 뚫었다. 두개골 뼈의 마지막 층을 원형 조각으로 분리하였다. 아래에 있는 뇌하수체가 대부분 드러날 때까지 구멍을 넓혔다. 그 후 미세한 포셉으로 미세한 막이 있는 뇌하수체를 적출하였다.
1-2. 뇌하수체 절제술 성공 확인 지표
뇌하수체 절제술을 수행한 후, 래트의 체중을 확인하고, TSH(thyroid stimulating hormone), GH(growth hormone) 및 ACTH(adrenocorticotropic hormone)를 포함하는 혈청 내 호르몬의 수준을 ELISA 분석으로 확인하였다. 구체적으로, 래트의 혈청을 아침 10시에 꼬리 정맥으로부터 수득하고, 뇌하수체 절제술 전, 수술 2, 4, 6, 8, 10 또는 12주 후에 혈청 호르몬 수준을 확인하였다. 체중도 뇌하수체 절제술 전, 수술 2, 4, 6, 8, 10 또는 12주 후에 확인하였다. 또한, 구조적으로도 확인하기 위해, 래트들을 희생시킨 뒤, 두개원개(Cranial vault)를 제거하고 우측 반구를 리트랙션하였다. 그 후 양안 현미경으로 중앙 선 두개골 기본 구조를 확인하여 뇌하수체가 남아 있는지 확인하였다.
현미경으로 확인한 결과에서, 뇌하수체 절제술을 받은 10마리의 래트 중 6마리 (70%) 이상이 뇌하수체가 적절히 제거된 것으로 나타났다 (도 1). 한 래트는 뇌하수체 절제술 2주 후 6.8%의 체중 감소를 나타냈고 며칠 후 폐사하였다. 6마리의 래트 중 5마리가 뇌하수체 절제술 2주 후 1) 3% 이상의 체중 감소 또는 2) 혈청 내 GH 수준의 감소 (80% 이상)과 함께 2% 미만의 체중 변화를 나타냈다 (도 2). 구체적으로, 뇌하수체가 제대로 제거된 래트에서, 혈청 내 TSH 수준이 점차 감소하였고 수술 4-6주 후에는 아예 검출되지 않았다. 또한, 혈청 내 GH 수준이 수술 2주 후 급격히 감소하였고 8주차까지 유지되었다. 또한, 혈청 내 ACTH 수준이 수술 4-6주 후까지 유지되다가 수술 6-8주 후 급격히 감소하였다. 아울러, 체중은 수술 14주 후까지 거의 변하지 않았다. 반면, 뇌하수체가 제대로 제거되지 않은 래트들에서는 1) 점진적인 체중 증가 또는 2) 혈청 내 호르몬 수준 변화가 없는 것으로 나타났다.
실시예 2. 뇌하수체 동종이식
2-1. 뇌하수체 동종이식술
뇌하수체를 이식할 래트의 형제 래트로부터 뇌하수체를 적출한 뒤 HTK(Histindine-triptophan-ketoglutarate) 용액에 보존하였다. 그 후, 뇌하수체가 상기 실시예 1에서와 같이 제거된 형제 래트를 가스 마취 (3% 이소플루란 in 500 Ml/min O2)를 이용하여 마취시켜 양와위(supine position)로 놓고 복부를 면도하고 포비돈 요오드로 멸균하였다. 그 후 약 2cm의 개복술을 시행하여 장막(omentum)을 꺼내고, 상기에서 적출해서 보존한 뇌하수체를 꺼낸 장막에 놓아 비계(scaffold) 형태로 패킹하였다 (도 3). 그 후 이식편을 복강으로 다시 넣고, 복막 및 피부를 층별로 봉합하였다 (n=4).
2-2. 뇌하수체 동종이식술 성공 확인 지표
4 마리의 래트에 상기 실시예 2-1에서와 같이 뇌하수체 동종이식술을 수행한 후 2주마다 혈청 내 호르몬 수준 및 체중을 도 4와 같이 확인하였다. 그 결과, 뇌하수체 절제술 2주 후 혈청 내 TSH 및 GH 수준이 기준 호르몬 수준 (혈청 내 1.0ng/ml 미만)의 80% 이상 감소하고 체중 변화가 없던 래트들에서, 뇌하수체 동종이식 수술 1주 후 TSH 수준이 기준 수준으로 증가하였고, 11주 후까지 유지되었다. 또한, 혈청 내 GH 수준은 이식 1주 후 급증하였으나 시간이 지남에 따라 감소하였다. 또한, 뇌하수체 절제술 후 검출되지 않던 ACTH 수준은 회복되지 않았다. 아울러, 뇌하수체 이식을 받은 모든 래트는 수술 1주까지 빠른 체중 증가를 나타냈으며, 이식 7주 후까지 점차 체중이 증가하였다 (도 5).
2-3. 이식된 뇌하수체의 미세 구조 변화 확인
이식 3일 후 이식된 뇌하수체를 적출하여 전자현미경 (EM, JEM-1010, Jeol, Japan)으로 미세 구조 변화 (핵 퇴행, 미토콘드리아 손상, RER(rough endoplasmic reticulum) 및 분비 과립(SGs))를 확인하였다. 구체적으로, 이식 3일 후 이식된 뇌하수체를 적출하여 조직을 준비한 뒤, 고정액에 놓고 PBS로 세척하고, 인산-완충된 1% 사산화오스뮴에서 후-고정시켰다. 알코올로 연속적으로 탈수시킨 뒤, 조직을 에폰 수지로 임베딩하였다. 조직을 ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica, Austria)으로 70-80 nm의 초박절편으로 섹션한 뒤 초산우라닐(uranyl acetate) 및 시트르산납(lead citrate)으로 염색하였다. 그 결과, 이식된 뇌하수체는 EM 검사에서 거의 정상적인 초구조(ultrastructures)를 유지하였다. 특히, 미토콘드리아, RER 및 핵의 구조가 정상 뇌하수체와 유사하게 유지되었으며, SGs의 수 및 구조 또한 유지되었다 (도 6).
Claims (10)
- (a) 인간을 제외한 뇌하수체 기능부전 모델용 동물의 목의 전면 피부를 절개하는 단계;(b) 견갑설골근(omohyoid muscle)을 통해 두개골 뼈의 하벽(floor of the cranium)으로 들어가 두개골 뼈를 뚫는 단계; 및(c) 뇌하수체를 적출하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 제조방법.
- 제 1항에 있어서, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증하는 단계를 추가로 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 제조방법.
- 제 2항에 있어서, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 수립 여부를 검증하는 단계는:(a) 뇌하수체가 적출된 동물의 혈청을 수득하고;(b) 혈청 내 성장 호르몬(growth hormone, GH), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH) 및 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준을 확인하며; 및(c) 뇌하수체가 적출된 동물의 체중 변화를 확인하는 것을 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 제조방법.
- (a) 뇌하수체가 적출된 동물의 혈청 내 성장 호르몬(growth hormone, GH), 부신피질자극호르몬(adrenocorticotropic hormone, ACTH) 및 갑상선 자극 호르몬(thyroid stimulating hormone, TSH)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준을 측정하는 단계;(b) 뇌하수체 적출 전의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및(c) 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 수준이 감소한 경우 뇌하수체 기능부전 동물모델이 수립된 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 검증 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 래트, 마우스, 소, 양, 돼지 및 염소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 비인간 동물인, 뇌하수체 기능부전 동물모델의 검증 방법.
- (a) 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델에 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입하는 단계;(b) 상기 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입한 실험군 동물과 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중을 측정하는 단계; 및(c) 상기 실험군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중의 회복 정도가 대조군 동물에 비하여 증가된 경우, 뇌하수체 기능부전 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- 제 6항에 있어서, 호르몬은 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 뇌하수체 기능부전 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
- (a) 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델에 검정 목적 척수 손상 치료제를 주입하는 단계;(b) 상기 검정 목적 뇌하수체 기능부전 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 뇌하수체 기능부전 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중을 측정하는 단계; 및(c) 상기 실험군 동물의 혈청 내 호르몬 수준 또는 체중의 회복 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌하수체 기능부전 치료제의 효과를 검정하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 호르몬은 성장 호르몬, 부신피질자극호르몬 및 갑상선 자극 호르몬으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 뇌하수체 기능부전 치료제의 효과를 검정하는 방법.
- 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 뇌하수체 기능부전 동물모델.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190173250A KR102446148B1 (ko) | 2019-12-23 | 2019-12-23 | 뇌하수체 기능부전 동물모델 |
| KR10-2019-0173250 | 2019-12-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2021132996A1 true WO2021132996A1 (ko) | 2021-07-01 |
Family
ID=76575611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/KR2020/018657 WO2021132996A1 (ko) | 2019-12-23 | 2020-12-18 | 뇌하수체 기능부전 동물모델 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102446148B1 (ko) |
| WO (1) | WO2021132996A1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150117890A (ko) * | 2014-04-11 | 2015-10-21 | 가천대학교 산학협력단 | 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 통해 제조된 척수 손상 동물모델 |
| CN107267438A (zh) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 |
-
2019
- 2019-12-23 KR KR1020190173250A patent/KR102446148B1/ko active IP Right Grant
-
2020
- 2020-12-18 WO PCT/KR2020/018657 patent/WO2021132996A1/ko active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20150117890A (ko) * | 2014-04-11 | 2015-10-21 | 가천대학교 산학협력단 | 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 통해 제조된 척수 손상 동물모델 |
| CN107267438A (zh) * | 2016-04-08 | 2017-10-20 | 江苏齐氏生物科技有限公司 | 一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BYOUNG-HEE LEE, YOUNG-JO KIM, JONG-HYUK LEE, KYON-YUN KIM, HYO-SIL LEE, CHANG-HWAN KIM, JONG-HWAN PARK, EUN-SIL CHOI, JOO-HO TAE, : "Effect of Recombinant Human Growth Hormone(rhGH) on the Premotion of Body Weight Gain in the Hypophysectomized Rats", KOREAN JOURNAL OF LABORATORY ANIMAL SCIENCE, vol. 14, no. 1, June 1998 (1998-06-01), pages 77 - 79, XP009528801, ISSN: 1225-813X * |
| CHOI JAI HO; LEE JUNG EUN; KIM SE HOON; KIM HONG-LIM; JEUN SIN SOO; YANG SEUNG HO: "Functional survival of rat pituitary gland in hypothermic storage for pituitary transplantation", PITUITARY, KLUWER, BOSTON, US, vol. 22, no. 4, 15 April 2019 (2019-04-15), US, pages 353 - 361, XP036834489, ISSN: 1386-341X, DOI: 10.1007/s11102-019-00959-7 * |
| KIM SEONG YEON: "Diagnosis and Treatment of Hypopituitarism", ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, vol. 30, no. 4, 1 January 2015 (2015-01-01), pages 443 - 5978, XP055824991, ISSN: 2093-596X, DOI: 10.3803/EnM.2015.30.4.443 * |
| PRABHAKAR V K B, SHALET S M: "Aetiology, diagnosis, and management of hypopituitarism in adult life", POSTGRADUATE MEDICAL JOURNAL., MCMILLAN PRESS, BASINGSTOKE., GB, vol. 82, no. 966, 1 April 2006 (2006-04-01), GB, pages 259 - 266, XP055824992, ISSN: 0032-5473, DOI: 10.1136/pgmj.2005.039768 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102446148B1 (ko) | 2022-09-22 |
| KR20210081061A (ko) | 2021-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Arletti et al. | Oxytocin stimulates lordosis behavior in female rats | |
| Numan et al. | A lesion and neuroanatomical tract‐tracing analysis of the role of the bed nucleus of the stria terminalis in retrieval behavior and other aspects of maternal responsiveness in rats | |
| Papadopoulos et al. | Somatostatinlike immunoreactive neurons in the hedgehog (Erinaceus europaeus) and the sheep (Ovis aries) central nervous system | |
| Sternini et al. | Calcitonin gene-related peptide neurons innervating the canine digestive system | |
| Bridges et al. | Human placental lactogen infusions into the medial preoptic area stimulate maternal behavior in steroid-primed, nulliparous female rats | |
| Goepel et al. | Muscarinic receptor subtypes in porcine detrusor: comparison with humans and regulation by bladder augmentation | |
| Pulina et al. | Non-nutritional factors affecting lactation persistency in dairy ewes: a review | |
| Zhice et al. | Regional suppression by water intake of c-fos expression induced by intraventricular infusions of angiotensin II | |
| DeNardo et al. | Ovarian remnant syndrome: revascularization of free-floating ovarian tissue in the feline abdominal cavity | |
| Morehead et al. | Effect of treatment with LHRH analogue on oocyte maturation, plasma sex steroid levels and egg production in female striped trumpeter Latris lineata (Latrididae) | |
| Kobayashi et al. | The caudal neurosecretory system in fishes | |
| Kaleczyc et al. | Distribution and immunohistochemical characteristics of neurons in the porcine caudal mesenteric ganglion projecting to the vas deferens and seminal vesicle | |
| Shangguan et al. | Seasonal variations in sperm production and sperm quality in male winter flounder, Pleuronectes americanus: the effects of hypophysectomy, pituitary replacement therapy, and GnRH-A treatment | |
| Wilson et al. | Thyroid Hormone Acts Centrally to Programme Photostimulated Male American Tree Sparrows (Spizella arborea) for Vernal and Autumnal Components of Seasonality [sup 1]. | |
| WO2021132996A1 (ko) | 뇌하수체 기능부전 동물모델 | |
| Alexander et al. | Vasoactive intestinal peptide stimulates ACTH and corticosterone release after injection into the PVN | |
| Brawer et al. | Effects of estradiol-induced lesions of the arcuate nucleus on gonadotropin release in response to preoptic stimulation in the rat | |
| McCown et al. | Brainstem localization of a thyrotropin-releasing hormone-induced change in respiratory function | |
| Csaba et al. | FSH-TSH Functional Overlap in Cockerel Testicle | |
| Mulders et al. | The hypothalamic paraventricular nucleus in two types of Wistar rats with differebt stress responses. II. Differential Fos-expression | |
| Rekawek et al. | Distribution and chemical coding patterns of cocaine-and amphetaminer-egulated transcript-like immunoreactive (CART-LI) neurons in the enteric nervous system of the porcine stomach cardia | |
| Goldman et al. | Induction of infertility in male rats by treatment with gonadotropin antiserum during neonatal life | |
| Murphy et al. | Induction of luteinizing hormone release by electrochemical stimulation of the medial preoptic area in Δ9-tetrahydrocannabinol-blocked proestrous rats | |
| Wang et al. | Corticotropin-releasing hormone-immunopositive nerve elements in apposition to chicken gonadotropin-releasing hormone I-containing perikarya in Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) brain | |
| Bailhache et al. | Effects of neurochemical lesions of the preoptic area on male sexual behavior in the Japanese quail |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20907026 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 20907026 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |