CN107267438A - 一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 - Google Patents

一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)选取8d的雄性SD大鼠，麻醉处死；(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，无菌条件下取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷PBS液中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；(3)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将脑垂体剪成1mm×1mm碎块；(4)用预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化；(5)终止消化，过滤，收集滤液离心，弃上清，加培养基重悬，重复操作三次；(6)接种到24孔培养板培养；(7)将培养7d的细胞经胰酶消化后再次筛网纯化，离心弃上清，重悬接种于处理后的培养板中；(8)细胞免疫荧光鉴定。本发明提供的一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，操作简单，所得脑垂体细胞存活率高、活性好，可用于建立体外实验模型细胞，满足脑垂体细胞实验的要求。

Description

一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法。
背景技术
脑垂体(pituitary gland)又名脑下腺，是内分泌系统的重要组成部分，位于间脑腹面，视交叉后方，与丘脑下部相连。垂体是生物体内最重要的内分泌腺。垂体前叶由促甲状腺激素细胞、促性腺激素细胞、生长激素细胞等多种细胞构成。垂体受下丘脑和靶器官激素的双重调节，它在机体新陈代谢，保持内环境稳定，机体的生长发育等方面均具有重要作用。体外培养垂体细胞可以被用于研究刺激促黄体素(Luteinizing hormone，LH)合成和分泌机理，促卵泡素(Follicle stimulating hormone，FSH)的分泌调节。目前国内外对于大鼠脑垂体细胞的分离与培养的研究较少，分离方法不成熟，获得的细胞纯度低，数量少。本发明旨在提供一种操作简单、高效的获得生长状态好、纯度高的大鼠脑垂体细胞的方法，建立一套完善可靠的大鼠脑垂体细胞体外培养技术。
发明内容
根据上述问题，本发明提供了一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，该方法操作简单，细胞产量和成活率高，是一种较为理想的大鼠脑垂体细胞原代培养方法。可以满足多种生理生化实验的要求。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)选取8d的雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉；
(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠颈部被毛，无菌条件下十字切口，取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)PBS液(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；
(3)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.008～0.015M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将脑垂体组织剪成1mm×1mm的碎块；
(4)用37℃预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化；
(5)用含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，用吸管吹打重悬，收集脑垂体细胞悬液用300～500钼网筛过滤，所得滤液80～150g离心6分钟，去掉上清液，保留沉淀(脑垂体细胞在沉淀中)，加入15ml的混合培养基并用吸管吹打重悬，重复上述操作3次；
(6)在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞悬液，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被细胞悬液充满为止，置于显微镜下计数四角大方格内的细胞总数(四大格细胞总数/4×104)。计数完成后再加入培养基将细胞密度调至1×105个/ml，接种至铺多聚赖氨酸包被的的24孔培养板中，置于37℃、5％CO2环境中培养，5h后贴壁，2d后换体积分数为5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培养基培养，4d后换体积分数2.5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培养基培养，5d后换无血清培养基培养。每24h观察细胞的生长状况及形态变化；
(7)将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化3～6分钟后再300～500钼筛网纯化，300～400g离心5分钟弃上清，所得细胞沉淀用DMEM/F12(1∶1)培养基重悬后接种于处理后的培养板中；
(8)体外培养4～5d，细胞免疫荧光鉴定。
其中，步骤(1)所选的大鼠体重150±10g，8d雄性大鼠。
其中，步骤(2)所述的PBS已4℃预冷，PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4；培养皿置于冰上。
其中，步骤(4)所述消化温度为37℃，消化过夜(16h)，消化酶混合液由1.0～2.0g/l的III型胶原酶和1.0～2.0g/l的中性酶混合并且搅匀后制得，所述两种酶混合比例1∶1～1∶1.5。
其中，步骤(5)所述培养基为DMEM/F12(1∶1)培养基，含10％大鼠血清，含100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5μg/ml的胰岛素。
其中，步骤(5)所述所得脑垂体细胞悬液用400钼网筛过滤，所得滤液100g离心6分钟。
其中，步骤(7)所述细胞的纯化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后再次400钼筛网纯化，350g离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用DMEM/F12(1∶1)培养基重悬后接种于处理后的培养板中。
本发明建立了一种简单、高效的分离培养大鼠脑垂体细胞的方法，所得细胞数量多、纯度高、活性好，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上；采用SD大鼠为材料，来源广泛；采用胶原酶和中性酶联合消化方法，克服了垂体分离困难的难题，减少了细胞损伤，所得细胞悬液粘度小、易过滤，并且细胞数量多，细胞存活率高；本发明采用多聚赖氨酸包被培养板，细胞生长状态好，可满足脑垂体细胞实验的要求，多聚赖氨酸包被比APES包被制作更简单，更易保存；本方法经济实用，简便易行，有利于建立体外实验模型细胞，研究垂体细胞的分泌特性，用于研究药物、促激素等对垂体激素合成与释放的调节作用。以及靶器官激素对垂体的反馈调控机理研究。
附图说明
图1培养7d的大鼠脑垂体细胞图片(100×)
图2培养7d的大鼠脑垂体细胞图片(200×)
图3培养7d大鼠脑垂体细胞免疫荧光图片(100×)
图4培养7d大鼠脑垂体细胞免疫荧光图片(200×)
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明进行详细说明，本发明的保护内容不限于下述实施例。
本实验所用的实验仪器与试剂如下：
外科手术器械一套，低温离心机(TD24B-WS，上海)，电子分析天平(Sartorius，美国)，超净工作台(HJ-CJ-1D，上海)，二氧化碳细胞培养箱(SANYO MCO-17AI，日本)，血细胞计数板(25×16，上海)。
DMEM/F12(1∶1)购于Corning公司，青霉素-链霉素双抗于Gibco购买，大鼠血清购买于Bioind公司，PBS自制(8.0gNal、0.2gKCl、0.2gKH2PO4、1.44gNa2HPO4溶于1000ml去离子水中，调整PH为7.2～7.4，非特殊指出，本专利所用的PBS皆为此配方)，胰酶购买于Bioind公司，III型胶原酶购买于德国SERVA公司，Nephrin抗体。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)选取体重150±10g，8d雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉；
(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大 鼠颈部被毛，无菌条件下十字切口，取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷无菌含双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)的PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)液中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；
(3)无菌条件下，在预冷的PBS(浓度为0.01M，PH为7.2～7.4)中用眼科剪将脑垂体组织剪成1mm×1mm的碎块；
(4)用37℃预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化，消化过夜(16h)，所述消化酶溶液由1.5g/l的III型胶原酶和1.5g/l的中性酶(1∶1.2)混合并且搅匀后制得；
5)用含10％大鼠血清、双抗(100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素)、5μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)混合培养基(简称混合培养基)终止消化，用吸管反复吹打，收集脑垂体细胞悬液用400钼网筛过滤，所得滤液100g离心6分钟，去掉上清液，所得细胞沉淀加入15ml培养基并用吸管吹打重悬，100g离心6分钟，重复上述操作3次；
(6)在细胞计数板中央放置计数专用的盖玻片，用玻璃虹吸管吸取细胞，让虹吸管在盖玻片上或下侧的计数板凹蹧处流出悬液，至盖玻片被液体充满为止，置显微镜下计数四角大方格内的细胞总数(四大格细胞总数/4×104)。对于压线的细胞只计数在上线和左线者，对于细胞团按单个细胞计数。计数完成后再加入培养基将细胞密度调至1×105个/ml，接种至铺3-4μg/cm2多聚赖氨酸包被的24孔培养版中，置于37℃、5％CO2环境中培养，5h后贴壁，2d后换体积分数为5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培养基培养，4d后换体积分数2.5％大鼠血清DMEM/F12(1∶1)培养基培养，5d后换无血清培养基培养。每24h观察细胞的生长状况及形态变化；
(7)将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后再次400钼筛网纯化，350g 离心5分钟，弃上清，所得细胞沉淀用DMEM/F12(1∶1)培养基重悬后接种于处理后的培养板中；
(8)细胞免疫荧光鉴定：将大鼠脑垂体细胞的悬液滴在涂有多聚赖氨酸的24孔板的玻片上，体外培养4～5d，取出玻片，用PBS冲洗3次，每次3min。用Zamboni液体固定；4％多聚甲醛固定20～30min，PBS洗3次，每次10min，0.2％渗透液Triton-100室温(15-25℃)下孵育10min，PBS洗3次，每次10min，5％BSA室温封闭1h，吸去封闭液。加入Nephrin抗体(用1％BSA稀释)于冰箱4℃过夜孵育，PBS洗3次。滴加羊抗鼠PE荧光二抗IgG(用1％BSA稀释)，在室温下置于湿盒内孵育45min，PBS洗3次，自然晾干后在显微镜下观察。
本发明所得到的大鼠脑垂体细胞数量多，细胞成活率达95％以上，细胞纯度达96％以上。
以上所述，仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此实施实例。任何在本发明的精神和原则之内作出任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种大鼠脑垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取8d的雄性SD大鼠，腹腔注射30mg/ml的戊巴比妥钠麻醉；(2)将大鼠麻醉后腹面向上固定于板上，局部常规消毒，用眼科剪剪去大鼠颈部被毛，无菌条件下十字切口，取出大鼠脑垂体，将脑垂体放入预冷无菌含双抗PBS液中洗涤数次除去血渍，去除垂体包膜；(3)无菌条件下，在预冷的PBS中用眼科剪将脑垂体组织剪成1mm×1mm的碎块；(4)用37℃预热的III型胶原酶结合中性酶混合消化；(5)用含大鼠血清、双抗、胰岛素的混合培养基(简称混合培养基)终止消化，用吸管反复吹打，收集脑垂体细胞悬液用300～500钼网筛过滤，所得滤液80～150g离心6分钟，去掉上清液，加入15ml的混合培养基并用吸管吹打，重复上述操作3次；(6)用细胞计数板计数，再将细胞密度调至1×105个/ml，接种至铺多聚赖氨酸包被的的24孔培养板中，置于37℃、5％CO2环境中培养，5h后贴壁，2d后换体积分数为5％大鼠血清DMEM/F12培养基培养，4d后换体积分数2.5％大鼠血清DMEM/F12培养基培养，5d后换无血清培养基培养，每24h观察细胞的生长状况及形态变化；(7)将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化3～6分钟后再300～500钼筛网纯化，300～400g离心5分钟弃上清，所得细胞沉淀用培养基重悬后接种于处理后的培养板中；(8)体外培养4～5d，细胞免疫荧光鉴定。
2.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于所用预冷的PBS浓度为0.01M，PH为7.2～7.4。
3.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤4所述消化温度为37℃，消化过夜(16h)，消化酶混合液由1.0～2.0g/l的III型胶原酶和1.0～2.0g/l的中性酶混合并且搅匀后制得，所述两种酶混合比例1∶1～1∶1.5。
4.根据权利要求3所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤4所述消化温度为37℃，消化过夜(16h)，消化酶混合液由1.5g/l的III型胶原酶和1.5g/l的中性酶混合并且搅匀后制得，所述两种酶混合比例1∶1.2。
5.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤5所述的培养基为含10％大鼠血清、含100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素的双抗、4～6μg/ml胰岛素的DMEM/F12(1∶1)培养基。
6.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤5所述的网筛为400钼，离心速度100g，每次6min。
7.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤6所述的培养板用3～4μg/cm2的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5％CO2培养箱。
8.根据权利要求1所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤7所述的纯化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后，再次通过400钼的筛网，收集滤液，300～400g离心5分钟弃上清，重悬接种。
9.根据权利要求8所述的大鼠垂体细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤7所述的纯化方法为将培养7d的细胞经胰蛋白酶消化4分钟后，再次通过400钼的筛网，收集滤液，350g离心5分钟弃上清，重悬接种。
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