CN107638489A - 华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用，华佗再造丸通过减少脑组织内沉积的Aβ、发挥神经突触可塑性的保护作用，从而促进阿尔茨海默病认知功能障碍的恢复。本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对华佗再造丸的功能进行了初步研究，发现华佗再造丸具有针对神经突触蛋白及功能的保护作用，进而发现华佗再造丸具有改善阿尔茨海默病患者认知功能障碍的用途，可以将华佗再造丸设计为靶向药物来促进阿尔茨海默病患者的认知功能恢复，对促进阿尔茨海默病的治疗有着潜在的巨大应用价值。

Description

华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及可促进突触结构和功能恢复的相关蛋白，即 华佗再造丸通过保护突触可塑性、减少Aβ沉积进而改善阿尔茨海默病的认知功 能。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年痴呆最常见的类型，是 一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，其患 病率随年龄增长而上升，已成为当前老年医学面临的最为严峻的问题之一。AD病 因不明，发病机制复杂，寻找新型抗AD药一直是国内外研究的热点。

阿尔茨海默病(Alzheimer‘s disease，AD)是病理过程复杂的脑退行性 疾病，临床上以认知能力损害为主。AD患者海马区神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles,NFT)和胞外淀粉样蛋白斑块(老年斑，senile plaques,SP)的形成是其典型病理改变。但相对以上两种特征性改变而言，突 触结构的异常改变更早出现，并与认知功能的下降密切相关。Aβ导致的突触损 害包括NMDAR和AMPAR与树突棘数量的减少。AD患者和动物模型均证实大量 树突棘缺失，影响正常突触递质的传递，抑制LTP，即突触可塑性的损害，最后 导致学习记忆障碍。因此，逆转突触可塑性损害，可逆转LTP损害，可逆转海 马依赖的学习记忆损害，即可改善AD患者或动物模型的海马依赖的相关认知损 害。

传统中医学无痴呆的病名，但可归为“呆病”范畴。呆病的发生是由于脏腑 功能和气血运行失常，体内浊毒蕴积过多而不能及时排除，进而损伤脑络所致。 随着我国人口老龄化逐步加剧，AD发病率逐渐上升，其医疗和护理给社会和家 庭带来沉重的经济和心理负担。目前，西医治疗AD的特点是，干预特定病理环 节，有针对性地进行治疗，但西药大多药效单一。中药作为传统治疗药物具有 多组分、多靶点杂的发病机制更有利于从多方面干预其发病过程

华佗再造丸(HTZZW)的配方来源于建国初期“京城四大名医”之一冉雪峰祖传治疗中风的 秘方。经过多年的深入研究显示其具有以下药理作用：①可减少模型动物的梗死体积；②减 少脑细胞凋亡；③抑制毒性物质兴奋性氨基酸合成；④可调节脑组织病变局部和血液中一氧 化氮与内皮素的含量,保护脑细胞免受毒性损伤；⑤提高中风大鼠的神经功能缺损积分；⑥可 保护缺血时脑细胞的功能形态和细胞器完整,以增加突触的数量；⑦可增加脑组织神经生长因 子、成纤维细胞生长因子、脑源神经营养因子等神经营养因子家族物质的合成；⑧促进中风 时神经干细胞的增殖、分化和迁移；⑨可选择性阻滞脑细胞及其突触体膜的钙通道,对缺血后 脑细胞内钙离子增加有明显的抑制作用,从而保护脑细胞免受钙超载的损伤。

鉴于华佗再造丸有多靶点作用，前期多集中于脑卒中方面的研究，关于阿尔 茨海默病的研究尚未见报道。根据中医“方即是法”，“异病同治”理论，我们分 别对Aβ制备小鼠AD模型及APP/PS1转基因小鼠AD模型予以华佗再造丸灌胃， 通过各种行为学测试，包括旷场实验、新物体识别试验、Morris水迷宫试验， 评估其学习认知功能；其次，在APP/PS1转基因AD小鼠上，进一步通过神经电 生理判断突触功能，免疫组化观察海马形态结构，免疫荧光及Western Blot测 定突触相关蛋白表达。结果显示该复方药小剂量对于Aβ制备以及APP/PS1转基 因两种AD小鼠模型均有改善认知功能的作用，同时从神经电生理、相关蛋白角 度亦证实药物的有效性和可能作用环节，为临床提供治疗的思路，有助于中药方 的深入研究和开发。

发明内容

本发明的目的在于提供华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用，华佗 再造丸能够增强神经突触蛋白含量及功能的保护作用，减少脑组织内的Aβ沉积， 促进阿尔茨海默病的认知功能障碍的恢复。

本发明提供的技术方案是：

华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用：华佗再造丸通过减少脑组织 内沉积的Aβ，从而改善阿尔茨海默病的认知功能障碍；华佗再造丸通过发挥神 经突触可塑性的保护作用，从而促进阿尔茨海默病认知功能障碍的恢复。

华佗再造丸通过促进神经突触保护作用进而改善阿尔茨海默病的认知功能 障碍，具有保护神经突触蛋白浓度及突触功能、减少脑组织内Aβ沉积的作用， 因此可将华佗再造丸设计为靶向药物来改善阿尔茨海默病的认知功能障碍。

所述华佗再造丸改善认知障碍、促进神经突触保护作用的检测方法选自但不 限于：行为学检测方法、神经电生理及细胞分子生物学检测方法；

所述行为学检测方法可选自Morris Water Maze(水迷宫实验)；

所述神经电生理方法可选用MultiClamp 700B仪器；

所述细胞分子生物学检测方法可选自蛋白印迹杂交电泳(WB)、免疫荧光染 色(IF)。

本发明的主要优点在于：

1.华佗再造丸是一种成品复合药物，且具有多靶点作用。

2.作用于阿尔茨海默病的病理过程，符合当今研制治疗阿尔茨海默病药物的决策；通过促进对神经突触可塑性的保护作用，减少脑组织内的Aβ沉积，进而 改善阿尔茨海默病带来的认知功能障碍。

本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。

本发明利用现代生物学技术和生物信息学分析对华佗再造丸的功能进行了 初步研究，发现华佗再造丸具有针对神经突触蛋白及功能的保护作用，同时应用 两种AD小鼠模型在行为学上反复验证，进而发现华佗再造丸具有改善AD小鼠认 知功能障碍的用途，为华佗再造丸设计为靶向药物进行临床转化促进阿尔茨海默 病患者的认知功能恢复，治疗阿尔茨海默病有着潜在的巨大应用价值。

附图说明

图1——Aβ制备小鼠AD模型Morris水迷宫行为学实验结果：

A——对照组、Aβ组及华佗再造丸(HTZZW)各剂量组小鼠造模后测试 期穿越平台次数统计图；

B——对照组、Aβ组及HTZZW各剂量组小鼠造模后测试期穿越平台潜伏 期时长统计图；

C——对照组、Aβ组及HTZZW各剂量组小鼠造模后测试期在目标象限停 留时长统计图；

D——对照组、Aβ组及HTZZW各剂量组小鼠造模后训练期在登上平台前 潜伏期时长统计图。

图2——APP/PS1转基因AD小鼠的Morris水迷宫实验结果：

A——对照组、HTZZW组和美金刚(MEM)组小鼠测试期穿越平台潜伏 期时长统计图；

B——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠测试期穿越平台次数统计图；

C——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠测试期在目标象限停留时长统计 图；

D——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠测试期游泳速度情况统计图。

图3——神经电生理方法及WB方法检测APP/PS1小鼠脑组织中突触结构和 功能情况：

A——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠在神经电生理实验中EPSP电位 变化示意图；

B——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠脑组织中突触蛋白的WB结果示 意图；

C——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠脑组织中突触蛋白的WB结果统 计图。

图4——免疫荧光染色方法对APP/PS1小鼠脑组织中Aβ的染色结果：

A——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠脑组织染色示意图；

B——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠皮层区域Aβ沉积情况统计图；

C——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠海马区域Aβ沉积情况统计图。

D——对照组、HTZZW组和MEM组小鼠海马区域Aβ沉积情况统计图。

具体实施方式

本发明的技术思路是：

从整体到分子水平，系统探讨华佗再造丸对AD小鼠认知功能的改善作用及 其可能的机制。本发明首先，从整体角度，采用了两种AD小鼠模型(小鼠海马 内注射Aβ导致AD模型，APP/PS1转基因AD小鼠)，通过行为学检测方法(Morris 水迷宫)证明华佗再造丸改善两种AD小鼠的认知功能；再从整体到离体水平， 用电生理、分子生物学等技术研究，结果发现：华佗再造丸可减少Aβ在脑内的 沉积，华佗再造丸改善AD小鼠的神经突触可塑性以及突触蛋白的变化，以证明 华佗再造丸可作为治疗阿尔茨海默病的潜在靶点药物。

下面是本发明的具体实施例说明:

一、行为学

1、Aβ介导的AD小鼠模型制备:

A、配置Aβ溶液：将Aβ_1-40溶于无菌生理盐水，使1μL溶液中含有400pmol 的Aβ_1-40，37℃恒温水浴4d；

B、麻醉，10％水合氯醛，4uL/g，待其麻醉后将其固定在手术台上；

C、剪毛、消毒、剪开顶部皮肤，钝性分离皮下组织、脑膜，暴露颅骨前 囟；

D、选择注射位置在前囟后2.3mm，中线左右各旁开1.8mm，用微量注射器 自脑表面进针2mm，每侧注射Aβ_1-40溶液0.5μL；

E、停留1min，拔针，骨蜡封口。缝合皮肤，回笼饲养。

2、Morris Water Maze(Morris水迷宫)：

用于检测动物空间位置学习记忆能力的行为学实验方法。水迷宫由黑色圆形 水池和可移动的有机玻璃平台组成，水池直径122cm,高75cm,平台高度50cm, 直径10cm,平台低于水面1cm,水温控制范围为23±2℃。

1)实验步骤：

A、实验分为训练期及测试期，实验前1天让每只小鼠熟悉水迷宫的环境 1min；

B、训练期持续4d，每天将每只小鼠分别从水池的东、西、南、北四个象限 面向池壁放入水中，记录小鼠找到平台的逃避潜伏时间，若小鼠超过1min仍未 找到平台，则将其引导至平台上停留15s；

C、第5d为测试期，将水池中的平台撤去，将小鼠分别放入各个象限，利用 Any-maze软件监测小鼠运动轨迹，记录1min内，小鼠穿越平台位置的次数及逃 避潜伏期，计算小鼠平均游泳速度及探索路程。

2)结果说明：在Aβ制备小鼠AD模型及APP/PS1转基因小鼠AD模型中，华 佗再造丸组小鼠训练期找到平台的潜伏期均较未给药组小鼠明显缩短，而测试时 华佗再造丸组小鼠穿过平台次数较未给药小鼠模型组明显增加，说明华佗再造丸 可改善AD小鼠的空间认知功能障碍，且各组小鼠游泳速度没有明显差异，说明 华佗再造丸改善AD认知功能并不是通过运动功能的影响。

3、海马脑片神经电生理

1)实验步骤：

A、配置人工脑脊液(ACSF),分为切片脑脊液(cutting ACSF)和孵育及记 录脑脊液(incubation and recording ACSF)。

切片脑脊液：75mM蔗糖，87mM NaCl，2.5mM KCl，7.0mM MgCl₂，21.4mM NaHCO₃，0.5mM CaCl₂，1.25mM NaH₂PO₄和20mM D-葡萄糖。

孵育及记录脑脊液：119mM NaCl，2.5mM CaCl₂，2.5mM KCl，1.3mM MgSO₄， 26.2mMNaHCO₃，1.0mM NaH₂PO₄和11mM D-葡萄糖。

在实验之前对两种脑脊液通以95％O₂/5％CO₂至少一小时，使它们的pH稳定在7.2-7.4之间。切片前，切片脑脊液至于-80摄氏度冰箱中冻至冰水混合状态。

B、麻醉，10％水合氯醛，4uL/g，迅速取脑置与切片脑脊液中

C、使用振荡切片机在切片脑脊液的冰浴中将大脑切成350μm的脑片，切片 及孵育过程不断通入95％O₂/5％CO₂的混合气体。

D、海马脑片连续回收，在32℃下在孵育脑脊液中孵育60分钟。

E、兴奋性突触后电位(EPSP)记录在0.5-3MΩ使用放置在CA1层状辐射区 域的ACSF填充玻璃微电极。将脑片吸入记录槽，使双极刺激电极位于Schaffer 侧支的辐射层，使记录电极位于海马CA1脑区的辐射层，调节刺激强度及刺激电 极和记录电极的位置，使脑片场电位的最大响应至少为2mV。使用在2kHz滤波 并以10kHz数字化的MultiClamp 700B放大器收集数据。

F、等到场电位大小稳定约20分钟，给予配对脉冲刺激，两次刺激之间分别 间隔10ms,20ms，50ms开始每30s给一次刺激，记录其场电位，记录十分钟后给 予诱导刺激长时程增强(long-term potentiation-LTP)诱导采用两次TBS(theta burst stimulation)方式，具体为在一秒内给予4串间隔200ms的刺激，每串 刺激包含五次100HZ的刺激，20秒后重复一次。诱导过后，继续记录场电位， 记录40分钟。使用pCLAMP系统(Axon Instrument，CA)分析。

2)结果说明：在华佗再造丸的作用下，APP/PS1小鼠的EPSP增强，说明华 佗再造丸对神经突触的功能有保护性作用。

二、分子生物学

1、组织蛋白提取

1)实验步骤：

A、将组织样本称重后，按1mg组织加入10μl RIPA及PMSF(v/v，100:1) 混合液，冰上裂解30min。

B、利用超生匀浆仪将组织均浆后以13200rpm转速，4℃，离心30min。

C、取上清，利用BCA试剂盒进行蛋白定量。

D、将各组蛋白样品浓度调整一致后，加入loading buffer，金属浴100℃ 蛋白5min，蛋白样品保存于-80℃冰箱备用。

2、Western blot(WB技术)

A、配胶

分离胶常用配方如下：

分离胶浓度	12％	10％	8.5％
				总体积(ml)	15	15	15
H2O	4.9	5.9	6.65
				30％Arc-Bis	6	5	4.25
1.5MTris(PH＝8.8)	3.8	3.8	3.8
				10％SDS	0.15	0.15	0.15
10％AP	0.15	0.15	0.15
				TEMED	0.06	0.006	0.006

B、恒压60V电泳，当蛋白maker出现明显的分离条带后将电压改为 105-110V。

C、电泳结束后，以100V电压，4℃，转膜120min，将蛋白从胶上转移到PVDF 膜上。

D、转膜结束后，取出PVDF膜，将其浸泡在5％的脱脂牛奶(TBST配置)中 进行抗原封闭，置于摇床上，室温封闭1小时。

E、用一抗稀释液配置一抗，稀释比例参考抗体说明书推荐浓度，4℃孵育 一抗过夜。

F、洗一抗，将PVDF膜浸泡于TBST中漂洗3次，每次10min。

G、室温孵育二抗2h。

H、洗二抗，TBST中漂洗3次，每次10min。

I、利用Bioworld公司ECL化学发光试剂盒，将发光剂均匀浸透PVDF膜， 利用Tanon5200全自动化学发光仪进行条带曝光；

J、利用Image J软件对蛋白条带进行灰度值测定。

2)结果说明：在华佗再造丸的作用下，APP/PS1小鼠的突触蛋白表达增加， 说明华佗再造丸通过增加突触蛋白水平对AD模型小鼠具有保护作用。

3、组织免疫荧光染色

1)具体实验步骤：

A、冰冻切片复温：37度，1h。

B、PBS(PH：7.4，NaCl:8g；KCl:0.2g；Na2HPO4:3.63g；KH2PO4:0.24g) 冲洗玻片3次，10min/次

C、0.2％Triton破膜20min；

D、PBS冲洗3次,10min/次；

E、封闭液(2％BSA+0.2％Triton)1h；

F、直接甩去加抗体加一抗Aβ(1:500，Biolegend)；4度过夜。

G、第二天复温半小时；

H、PBS冲洗，3次，10min/次；

I、二抗Donkey anti mouse 594(1：500,Life)；室温2h；

J、PBS冲洗3次，10min/次；

K、DAPI稀释液(1:1000)染10min；

L、PBS冲洗3次，10min/次；

M、封片，显微镜下观察，拍片。

2)结果说明：在华佗再造丸组小鼠中，Aβ在脑组织的沉积明显减少，说明 华佗再造丸可减少Aβ对脑组织的损伤作用。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制， 任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技 术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本 发明技术方案的保护范围之内。

Claims (3)

1.华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用。

2.根据权利要求1所述的华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用，其特征在于：华佗再造丸通过减少脑组织内沉积的Aβ，从而改善阿尔茨海默病的认知功能障碍。

3.根据权利要求1所述的华佗再造丸作为改善阿尔茨海默病药物的应用，其特征在于：华佗再造丸通过发挥神经突触可塑性的保护作用，从而促进阿尔茨海默病认知功能障碍的恢复。