CN113827729B - Pd-1/pd-l1拮抗剂在抗癫痫上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及PD‑1/PD‑L1拮抗剂在抗癫痫上的应用，属于生物医药技术领域。本发明提供的技术方案为PD‑1或PD‑L1拮抗剂在制备抗癫痫药物上的应用；以及蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂在制备抗癫痫药物上的应用。本发明中PD‑1/PD‑L1拮抗剂可以有效抑制致痫剂诱导的癫痫行为及神经元细胞癫痫样放电的发生，通过本发明提供了一种全新的治疗癫痫发作的免疫治疗手段，改变了目前集中于离子通道和GABA抑制性功能的抗癫痫药物靶点筛选，因此极具药物研发价值。

Description

PD-1/PD-L1拮抗剂在抗癫痫上的应用

技术领域

本发明涉及一种PD-1/PD-L1拮抗剂在抗癫痫上的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

癫痫是一种常见病多发病，全球大约有五千万左右的癫痫病人。中国癫痫的总体患病率为7.0‰，年发病率为28.8/10万，目前约有900万左右的癫痫病人，同时每年新增病人约40万。癫痫发病过程痛苦，致残致死率高，不仅严重影响病人的生活质量，同时给社会及家庭带来巨大的经济负担，给国家健康医疗事业带来了巨大的挑战。目前临床癫痫的治疗主要是通过使用抗癫痫药物控制发作症状,没有有效干预机制，给癫痫的长期治疗带来困难。

随着生物医药领域研究的突飞猛进，其中最突出的就是在免疫治疗领域。免疫检查位点PD-1受体与其配体PD-L1的发现及其在肿瘤免疫抑制方面的作用，改变了对肿瘤的治疗。目前为止，无论是基础研究还是临床实践，对于PD-1/PD-L1通路的研究主要集中于肿瘤免疫治疗领域，对于其他疾病的研究资料甚少，尤其是其在神经系统疾病中的作用几为空白。而PD-1/PD-L1在中枢神经系统是存在表达的，PD-1在中枢神经细胞上的表达是对传统认识中一直认为中枢神经系统是免疫“空白区”的一个挑战。那么，在包括海马神经元在内的中枢神经细胞上表达PD-1的作用到底是什么呢？越来越多的研究表明，PD-1/PD-L1通路在中枢神经系统是起到一定的调控作用，而且已有证据显示，PD-1/PD-L1通路是可以通过调控钠离子通道的功能进而调控外周神经系统对痛觉的敏感度。钠离子通道在癫痫的调控作用中也起到至关重要的作用，那么在中枢神经系统PD-1/PD-L1通路是否参与癫痫的调控就非常值得关注，本发明的相关研究从体内及体外两种癫痫模型出发，研究PD-1及PD-L1抗体通过对PD-1/PD-L1通路的封阻性抑制调控，对培养海马神经元以及大鼠癫痫模型痫样放电的抑制作用。该拮抗剂对癫痫调控作用的确定，将为未来以PD-1/PD-L1通路为抗癫痫药物靶点的研发提出一个新的研发方向。

发明内容

本发明的目的是为解决PD-1/PD-L1通路在抗癫痫上应用的技术问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种PD-1或PD-L1拮抗剂在制备抗癫痫药物上的应用。

本发明提供一种蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂在制备抗癫痫药物上的应用。

本发明阐明了一种介导癫痫病理发生发展的机制，确立了中枢海马神经元表达的PD-1/PD-L1信号通路与癫痫的关联性以及PD-1/PD-L1的异常上调是癫痫诱导发生的重要机制之一，确立PD-1及PD-L1拮抗剂对癫痫的调控作用。本发明在整体PTZ诱导癫痫大鼠或小鼠模型上进行研究，经侧脑室注射PD-1抗体SHR-1210或PD-L1抗体SHR-1316研究其是否会影响PTZ诱导的癫痫行为发作以及癫痫脑电(EEG)产生；研究结果明确了通过抑制脑内PD-1受体和/或PD-L1配体能有效抑制PTZ诱发的癫痫行为及脑电，明确了PD-1/PD-L1与癫痫发生具有正相关的关系。进一步利用体外培养神经元模型，记录经CTZ孵育处理的具有痫样放电的神经元，通过急性灌流PD-1抗体SHR-1210/PD-L1抗体SHR-1316，观察痫样放电频率的变化。当急性灌入PD-1抗体SHR-1210或PD-L1抗体SHR-1316后，神经元异常癫痫样放电状态得到抑制，从而进一步表明抑制PD-1/PD-L1对癫痫发作的调控作用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提出PD-1/PD-L1通路在癫痫病理发生发展中可能扮演的角色，其不仅仅可以在外周向T细胞传递负向调控信号，且在中枢系统中亦直接参与神经元兴奋性调控，这表明该通路可能参与神经疾病的病理过程；由于目前市面上绝大多数PD-1/PD-L1抑制剂均局限应用于肿瘤免疫治疗，尚未探讨过PD-1/PD-L1作为中枢神经系统疾病治疗的靶点，本发明中PD-1/PD-L1单克隆抗体可以有效抑制致痫剂诱导的癫痫行为及神经元细胞癫痫样放电的发生，这将提出一种全新的治疗癫痫发作的免疫治疗手段，改变了目前集中于离子通道和GABA抑制性功能的抗癫痫药物靶点筛选，因此极具药物研发价值。

附图说明

图1为PD-1/PD-L1抗体对PTZ致痫C57/BL6小鼠癫痫行为学发作的影响。

小鼠侧脑室注射PD-1抗体(SHR-1210)或PD-L1拮抗剂(SHR-1316),其中A图、B图、C图分别显示对照组、PD-1抗体及PD-L1拮抗剂的脑电监测示意图；D图为与对照组相比，侧脑室注射PD-1及PD-L1拮抗剂明显抑制痫样发作(y轴为癫痫发作级别比例)；E图为与对照组相比，侧脑室注射PD-1及PD-L1拮抗剂抑制，癫痫发作等级评分明显下降(纵坐标为发作等级评分)。

图2为PD-1/PD-L1抗体对PTZ致痫SD大鼠癫痫行为学发作的影响。

在大鼠中验证侧脑室注射PD-1及PD-L1拮抗剂的作用，其中，A图、B图、C图分别显示对照组、PD-1抗体及PD-L1抗体的脑电监测示意图；D图为与对照组相比，PD-L1及PD-1拮抗剂组痫样发作大鼠比例明显降低(y轴为痫样发作大鼠比例)；E图为与对照组相比，PD-L1及PD-1拮抗剂组发作达到5级的比例明显降低(y轴为癫痫发作级别比例)；F图为与对照组相比，PD-L1及PD-1拮抗剂组癫痫发作等级评分明显下降(y轴为大鼠癫痫发作评分)。

图3为PD-1抗体对CTZ诱导培养海马神经元异常痫样放电的影响。

PD-1拮抗剂对体外培养海马神经元痫样放电抑制作用；其中A图为体外培养海马神经元CTZ诱发痫样放电，体外PD-1拮抗剂灌流后与ACSF(人工脑脊液)相比明显抑制痫样放电强度；B图为与ACSF对照组相比，PD-1拮抗剂灌流后异常痫样放电频率明显下降(y轴为异常痫样放电频率)。

图4为PD-L1抗体对CTZ诱导培养海马神经元异常痫样放电的影响。

PD-L1拮抗剂对体外培养海马神经元痫样放电抑制作用；其中A图为体外培养海马神经元CTZ诱发痫样放电，体外PD-L1拮抗剂灌流后与ACSF(人工脑脊液)相比明显抑制痫样放电强度；B图为与ACSF对照组相比，PD-1拮抗剂灌流后异常痫样放电频率明显下降(y轴为异常痫样放电频率)。

图5为PD-1/PD-L1下游通路SHP-1抑制剂SSG(11μM)对神经元癫痫样放电的影响。

抑制PD-1/PD-L1通路下游蛋白SHP-1/SHP-2对神经元癫痫样放电的影响；其中A图为体外培养海马神经元CTZ诱发痫样放电，体外SHP-1抑制剂SSG灌流后与ACSF(人工脑脊液)相比明显抑制痫样放电强度；B图为与ACSF对照组相比，SSG灌流后异常痫样放电频率明显下降(y轴为异常痫样放电频率)。

图6为PD-1/PD-L1下游通路SHP-1抑制剂SSG(11μM)对PTZ致痫C57/BL6小鼠癫痫行为学发作的影响。

小鼠侧脑室注射SHP-1抑制剂SSG，其中A图、B图分别显示对照组、SSG组的脑电监测示意图；C图为与对照组相比，侧脑室注射SSG明显抑制痫样发作(y轴为癫痫发作级别比例)；D图为与对照组相比，侧脑室注射SSG，癫痫发作等级评分明显下降(纵坐标为发作等级评分)。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：

本发明提供PD-1或PD-L1拮抗剂在制备用于治疗癫痫药物上的应用。

实施例

为了更好地理解本发明的实质，探究PD-1/PD-L1通路对神经元兴奋性的影响，通过在体外培养海马神经元细胞模型上和在体实验动物模型上建立癫痫模型，对PD-1/PD-L1通路影响海马神经元异常放电作用的机制进行探究。

实验材料和仪器设备

1.海马神经元的培养：

孕17-19天的雌SD大鼠，将其深度麻醉后剖腹取出子宫内的胚胎，将其迅速置于预冷的解剖液上，并在冷冻环境下通过显微镜将胎鼠的海马组织剥离取出。将海马组织收集后用无菌手术器械捣碎，转移至0.05％胰酶-EDTA中，在37℃的培养箱中用胰蛋白酶消化15-20分钟，待消化接近尾声，加入含10％血清的D12F培养基终止反应。将上述酶溶液进行洗涤，在1000rpm的转速下离心一分钟，每次都小心地吸去上清，不接触组织块，并将此过程重复三次，在最后一次洗涤完毕后，使用全新拆封的移液管加入10ml的D12F全效培养基，并轻轻吹打重悬，使底部组织和培养基混匀，后将其放置沉降2-3分钟。小心吸取沉降后的液体转移至15ml离心管(已灭菌)中，加入D12F进行二次洗涤，在1000rpm的转速下离心8分钟，将此操作重复两遍，将洗涤后的液体上清吸去，并加入2ml NB27的培养基重悬细胞，将液体吹打混匀后，进行细胞计数。根据实验需求选择4×10⁴/cm²的密度种植于含有0.1mg/mLPoly-D-lysine的玻片上，于第二日以及3天后进行半量换培养基操作，置换的培养基都会提前置于培养箱内预热，细胞均置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。为了防止小胶质细胞的增生，使用含有阿糖胞苷的培养基进行48小时的培育，之后再换回NB27培养基。此操作之后每隔三天，均会进行一次半量培养基置换。将培养DIV13-17天的细胞用于电生理膜片钳记录。

2.培养海马神经元经CTZ孵育(5μM/48h)后，使用膜片钳记录神经元电活动：

在全细胞记录原代培养海马神经元的实验过程中，均采用Axonpatch 700B数据采集放大器和AxonDigidata 1440A数模转换器来收集数据，并使用pClamp10.3对收集到的数据进行分析。记录过程中使用的玻璃电极由P-97微电极拉制仪制作，通过设定其温控和速率保持玻璃电极电阻在灌盈电极内液后约为3-5MΩ。将细胞片从细胞房取出置于细胞外液中，后将其放入Leica公司倒置相差显微镜配套的chamber中，通过肉眼能看到粘附在细胞片上的海马神经元，选取胞体透亮且形状呈三角形的细胞作为记录对象。玻璃电极灌完内液准备入水前通过针管给予一定正压防止电极的尖端有异物堵塞，后将镜头抬高找寻到电极，将电极和镜头一起下移使电极移至选定细胞的正上方，后通过观察电极电阻接近细胞时电阻值上升，数值上升约0.2-0.3MΩ后，此时撤去正压并给入电极一点负压和细胞形成高阻封接，高阻封接须达到2GΩ以上，在高阻封接的状态下给予快慢电容补偿，后轻轻吸破细胞形成全细胞记录。所有细胞电生理实验均在电压钳模式下将细胞膜电位钳制于-70mV进行。首先，制定CTZ诱导(55M/48h)的癫痫样放电模型。记录海马神经元动作电位放电时，在电流钳模式下通过注入电流将细胞膜电位钳制在-70mV，在Gap-free模式下记录其自发动作电位，参照之前的发表论文，把具有以下特征这类放电模式定义为癫痫样放电：在一个簇状(burst)放电单位中，其所含单个去极化超过10mV且时长超过300ms并有动作电位数量超过五个。记录10min的自发动作电位，若出现两个以上簇状放电单位，则认为这个细胞是个癫痫样burst放电细胞。

3.小鼠/大鼠埋置电极和套管手术及急性PTZ(戊四唑)癫痫造模：

小鼠、大鼠PTZ癫痫造模：提前半小时以侧脑室埋管给药的方式给予实验组动物PD-1抗体/PD-L1抗体，30分钟后进行PTZ腹腔注射(50mg/kg)给药。对注射完PTZ的动物进行行为学观察，根据Racine标准对每只动物的发作级别进行评定。本发明进一步在动物模型上进行验证，首先，将23-25g左右的C57/BL6小鼠/180-220g左右的SD大鼠进行侧脑室埋管，使用脑部立体定位仪定点(小鼠AP：-0.5mm,ML：1.0mm,DP：-2.10mm；大鼠AP：-0.3mm,ML：1.3mm,DP：-4.0mm)埋置注射导管(小鼠规格：外径0.48mm，内径0.34mm，深度2.20mm；大鼠：外管22GA，内管28GA)。埋管的同时植入颅骨电极(小鼠记录电极位点：AP：1.8mm,ML：-1.4mm；大鼠记录电极位点：AP：3.8mm,ML：-2.0mm)。固定之后的导管需要旋入导管针与导管帽对导管进行保护，避免动物笼中的食物残渣和垫料，以及脑脊液和脑组织增生堵塞导管。手术后，动物均需要在动物房恢复至少4天才能进行后续实验。之后通过注射软管进行侧脑室给药的操作，首先，将埋管动物的导管帽旋掉，注射软管中需要事先充灌药物的溶剂，与药物通过空气泡隔开，防止给药路径中的介质密度不同造成的给药误差。药物通过微量注射器匀速(0.5μL/min)给入侧脑室。为了防止药物回流，给药完毕后需要留针10分钟，从给药完毕开始进行计时，30min后进行急性PTZ(50mg/kg)点燃模型的建立，观察药物对动物Racine行为学发作等级概率

Racine评分标准：

1级：面部抽搐，面部肌肉抖动，伴有咀嚼动作；

2级：点头运动，湿狗样抖动且颈部肌肉有抽搐现象；

3级：出现单侧前肢阵发性痉挛，有弓背竖尾行为；

4级：出现后肢站立且双侧前肢阵发性痉挛；

5级：四肢剧烈抽搐，全身失去平衡，翻滚大发作。

实验结果

1.PD-1/PD-L1抗体对PTZ致痫动物模型的抑制效应

1)PD-1抗体SHR-1210/PD-L1抗体SHR-1316对PTZ诱导C57/BL6小鼠癫痫样行为发作的影响：

该实验的目的是为了探究抑制脑内PD-1受体或抑制PD-L1是否能抑制PTZ诱发的癫痫行为及脑电(EEG)。在整体PTZ癫痫小鼠模型上，通过侧脑室注射PD-1或PD-L1抗体SHR-1210或SHR-1316，研究是否影响PTZ诱导的癫痫发作行为以及癫痫脑电。实验结果发现，对照组小鼠经PTZ痫性诱导能达到的最高发作级别为4.35±0.25(n＝14)，而给药SHR-1210组小鼠达到的Racine发作等级为2.20±0.55(n＝10)(unpaired t-test：P＝0.0014)，而给药SHR-1316组小鼠达到的Racine发作等级为3.00±0.49(n＝7)(unpaired t-test：P＝0.0325)。小鼠脑电记录也显示PTZ诱导的高频高幅癫痫样脑电在SHR-1210或SHR-1316组小鼠中都被抑制。实验结果明确了PD-1/PD-L1确实与癫痫发生之间存在一定关联，抑制PD-1或PD-L1能够减弱致痫剂诱导的癫痫行为的发生。

2)PD-1抗体SHR-1210/PD-L1抗体SHR-1316对PTZ诱导SD大鼠癫痫样行为发作的影响：

该实验的目的是进一步验证C57/BL6小鼠上所呈现的阻断脑内PD-1受体或抑制PD-L1的作用抑制PTZ诱发的癫痫行为及脑电(EEG)的现象是否能在SD大鼠上体现。在SD大鼠PTZ致痫模型上，通过侧脑室注射PD-1或PD-L1抗体SHR-1210或SHR-1316，并用50mg/kg的PTZ进行点燃，研究给药后PTZ诱导的癫痫发作行为以及癫痫脑电。实验结果发现，Saline组大鼠经PTZ痫性诱导能达到的最高发作级别为4.42±0.30(n＝4)，而给药5μg SHR-1316组大鼠达到的Racine发作等级为3.54±0.65(n＝4)(unpaired t-test：P＝0.14)，而给药10μg SHR-1316组大鼠达到的Racine发作等级为2.61±0.30(n＝3)(unpaired t-test：P＝0.0328)，表现了SHR-1316发挥的抑制作用呈浓度依赖性。而给予10μg SHR-1210组大鼠发作达到的Racine发作等级为2.29±0.31(n＝3)(unpaired t-test：P＝0.0415)，说明PD-1被抑制后大鼠经PTZ点燃的癫痫行为也受到抑制。除此之外，大鼠脑电记录也显示PTZ诱导的高频高幅癫痫样脑电在SHR-1210或SHR-1316组中均得到抑制。该实验结果进一步验证了PD-1/PD-L1确实与癫痫发生之间存在一定关联，且无论是在大鼠小鼠癫痫模型上，抑制PD-1或PD-L1均能够减弱致痫剂诱导的癫痫行为的发生。

2.PD-1抗体SHR-1210/PD-L1抗体SHR-1316对CTZ诱导神经元痫样burst放电频率的影响

体外培养海马神经元，在第14天培养海马神经元成熟后，分别使用膜片钳电生理检测神经元经CTZ诱导后的burst放电情况以及急性灌流PD-1抗体/PD-L1抗体处理后的神经元burst放电频率。研究结果显示：经CTZ诱导的海马神经元呈现异常burst放电的频率高达0.109±0.038Hz(个/秒)，而经PD-1抑制剂SHR-1210急性灌流后，burst频率显著降低，降低到0.051±0.021Hz(paired t-test：P＝0.0144)；在PD-L1抑制剂SHR-1316急性灌流后，亦呈现相同的结果，从CTZ诱导的0.061±0.029Hz下降至0.034±0.020Hz(paired t-test：P＝0.0271)。根据以上在离体培养海马神经元上的实验结果，能够得到结论：在CTZ离体致痫模型上，PD-1/PD-L1抗体作用均能削弱CTZ诱导形成的痫样细胞的burst放电频率。

3.抑制PD-1/PD-L1通路下游蛋白SHP-1/SHP-2对神经元癫痫样放电的影响：

在外周免疫细胞中PD-1与SHP-1/SHP-2(蛋白酪氨酸磷酸酶-1/2)直接偶联发挥精确调节作用。然而，在中枢神经系统中SHP-1/SHP-2是否也是PD-1的下游直接信号转导蛋白还需进一步验证。故而在离体培养海马神经元CTZ癫痫模型上，给予SHP-1抑制剂SSG(11μM)，研究是否能抑制致痫剂CTZ(5μM/48h)诱发的癫痫样burst放电。研究结果发现，SSG的急性灌入可以抑制CTZ诱导的神经元癫痫样放电，由CTZ诱导的癫痫样放电频率0.092±0.031Hz减弱至0.038±0.009(paired t-test：P＝0.0313，n＝7)。除此之外，通过侧脑室给药SSG(11μM)观察PTZ点燃C57/BL6小鼠痫样行为发作探究阻断PD-1/PD-L1通路是否通过激活SHP-1通路介导，发现对照组小鼠的最高发作Racine Score由对照组的4.35±0.25降低至1.56±0.58(n＝8，P＝0.0004)基于此，可以认为在中枢神经系统中，PD-1/PD-L1对神经元的兴奋性调控可能是通过激活下游SHP-1所介导的。

本发明阐明了一种介导癫痫病理发生发展的机制，确立了中枢海马神经元表达的PD-1/PD-L1信号通路与癫痫的关联性以及PD-1/PD-L1的异常上调是癫痫诱导发生的重要机制之一，确立PD-1及PD-L1拮抗剂对癫痫的调控作用。本发明在整体PTZ诱导癫痫大鼠或小鼠模型上进行研究，经侧脑室注射PD-1抗体SHR-1210或PD-L1抗体SHR-1316研究其是否会影响PTZ诱导的癫痫行为发作以及癫痫脑电(EEG)产生；研究结果明确了通过抑制脑内PD-1受体和/或PD-L1配体能有效抑制PTZ诱发的癫痫行为及脑电，明确了PD-1/PD-L1与癫痫发生具有正相关的关系。进一步利用体外培养神经元模型，记录经CTZ孵育处理的具有痫样放电的神经元，通过急性灌流PD-1抗体SHR-1210/PD-L1抗体SHR-1316，观察痫样放电频率的变化。当急性灌入PD-1抗体SHR-1210或PD-L1抗体SHR-1316后，神经元异常癫痫样放电状态得到抑制，从而进一步表明抑制PD-1/PD-L1对癫痫发作的调控作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (1)

1.一种蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂SSG在制备抗癫痫药物上的应用。

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