KR102261005B1 - c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy)의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물 및 c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 알파-시누클레인이 인접한 세포로 전이하여 야기하는 신호전달을 억제할 수 있어서 인접한 세포에 대한 α-syn의 세포독성 영향을 감소시키며, 단량체 α-syn가 시누클레인병증의 주요 원인이 될 수 있는 응집체 α-syn로의 변성을 억제할 수 있으므로, 시누클레인병증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy)의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Synucleinopathy Comprising Expression or Activation Inhibitor of c-src}
본 발명은 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물 및 c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
고령화가 가속화됨에 따라 파킨슨병, 알츠하이머병 등의 퇴행성 뇌질환을 앓고 있는 환자의 수가 급격하게 증가하고 있으며, 이를 해결하기 위한 의료비용 역시 급격히 증가하고 있다. 퇴행성 뇌질환 중 파킨슨병은 알츠하이머병 다음으로 흔한 퇴행성 뇌질환이며, 퇴행성 운동질환 중에서는 가장 흔한 질환으로서, 상기 질환을 앓고 있는 환자의 수는 전 세계적으로 60세 이상 노인의 1% 이상일 것으로 추정되며, 우리나라의 경우도 2004년 4만 여명에서 2008년 6만 6000명, 2012년에는 9만 3000여 명 정도로 계속 증가하고 있어, 향후 환자의 수는 더욱 급격히 증가할 전망이다.
파킨슨병의 정확한 발병원인은 아직 밝혀지지 않은 상태이지만, 유전성 파킨슨병은 알파-시누클레인(α-synuclein), parkin, PINK1, DJ-1, LRRK2 등의 여러 가지의 유전자 변이가 원인이 된다고 알려져 있다. 또한, 지금까지 알려진 바로는 산화스트레스, 미토콘드리아의 이상 및 세포 내 단백질 제거 기능의 문제가 원인이 될 것으로 추측되고 있으며(Lees, A J, et al , Lancet , 373:2055-66, 2009), 유전적인 원인과 더불어 환경적인 영향에 의해 발병되는 질환으로 추정하고 있다. 이러한 파킨슨병의 발병 여부는 임상적인 증상을 토대로 이루어지고 있으며, 치료 또한 원인을 해결하기보다는 증상을 완화하는 보존적 치료에 그치고 있어, 병인을 정확히 파악하여 그에 상응하는 적합한 치료방법을 찾는 것이 시급한 문제로 대두되고 있다.
알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)은 파킨슨병에서 발견되는 세포질 내 루이소체(Lewy body)의 주 구성성분 단백질로서, 신경세포의 전시냅스(presynapse) 말단에 주로 분포하며, 전반적인 뇌조직에서 많은 양이 발현된다고 알려져 있다. 알파-시누클레인은 파킨슨병뿐만 아니라, 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies), 다계통위측증(Multiple system atrophy) 등의 다른 퇴행성 질환의 병인에도 관여하는데, 알파-시누클레인의 비정상적인 침착과 관련된 상기 질환들은 모두 시누클레인병증(synucleinopathy)으로 통칭하며, 상기 질환들의 공통된 치료 표적으로서의 알파-시누클레인에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
또한, 알파-시누클레인은 응집체를 형성할 수 있는 특성을 보이는데, 단량체 알파-시누클레인이 응집체가 되는 변성과정이 파킨슨병의 주원인이 될 수 있을 것이라는 가능성이 대두 되었고(Eschbach, J., Danzer, K M, Neurodegener Dis , 14:1-17, 2013), 그 후, 상기 유전자의 이중중복(duplication) 및 삼중중복(triplication)이 가족성 파킨슨병에서 발견됨으로써 알파-시누클레인의 기능을 찾고자 하는 노력이 더욱 활발히 진행되고 있다. 이에 따른 응집된 알파-시누클레인을 타겟으로 한 약학 조성물로서, 알파-시누클레인의 응집에 의한 신경 독성으로부터 도파민 신경세포를 유의하게 보호할 수 있는, 용안욱 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물이 개발되었다(한국등록특허 제1189191호). 그러나, 알파-시누클레인이 작용하는 구체적인 수용체와 그에 관한 메커니즘에 대하여는 아직도 규명되지 않고 있는 실정이다.
한편, 단백질의 단량체가 응집체로 되는 변성과정은 파킨슨병의 알파-시누클레인 뿐만 아니라, 알츠하이머병의 아밀로이드 베타(Amyloid beta; Aβ), 타우(tau), 헌팅턴병의 변이된 헌팅틴(mutated huntingtin), 프라이온병의 프라이온(prion) 등에서도 일어나는 현상이며, 이러한 변성과정은 많은 퇴행성 뇌질환의 공통적인 원인으로 여겨지고 있으며, 이를 억제하여 퇴행성 뇌질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
이후로, 알파-시누클레인의 세포내 전달 가능성에 대해 관심이 급격히 높아졌으며, 프라이온병에서 프라이온이 정상신경세포에 발현된 정상적인 프라이온과 결합하여 응집체를 형성하는 것처럼, 응집된 알파-시누클레인도 인접세포로 들어가 인접세포의 루이소체 생성 및 세포사멸에 관여할 수 있다는 가능성이 점점 밝혀지고 있다(Costanzo, M, Zurzolo, C, Biochem J 452:1-17, 2013; Goedert, M, et al , Trends Neurosci 33:317-25, 2010; Lee, S J, et al , Nat Rev Neurol 6:702-6, 2010). 이러한 내용을 통해 세포 밖에 위치한 알파-시누클레인에 의한 파킨슨병 관련 병인 기전을 유추해 보면, 세포에서 분비된 다양한 형태의 알파-시누클레인이 인접해 있는 신경교세포에 작용하여 활성화시킴으로써 신경세포 독성에 관여하게 되고, 상기 독성은 인접 신경세포로의 전이를 통해 직접적인 독성을 나타내거나 루이소체의 발생을 유도하여 일련의 세포독성을 보인다고 추측된다.
따라서, 세포 밖에 위치하는 알파-시누클레인에 의해 세포 내 신호전달과정에 관여하게 되는 수용체 혹은 구조물들은 많은 종류의 퇴행성 뇌질환의 병인기전을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서가 될 수 있다. 더불어, 지금까지와는 다른 새로운 치료전략을 세울 수 있다는 점에서 매우 큰 관심을 가질만한 일이지만, 그에 관련한 연구는 많이 수행되지 않은 실정이다.
이에, 본 발명자들은 알파-시누클레인이 인접 세포로 전이되는 작용기전을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, c-src의 활성화가 알파-시누클레인의 응집체 형성 및 전이에 관여한다는 것을 확인하였으며, 상기 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 경우, 알파-시누클레인에 의해 유발되는 시누클레인병증(synucleinopathy), 구체적으로는 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환, 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies; DLB) 또는 다계통위축(multiple system atrophy; MSA) 등을 예방 및 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
본 발명의 목적은 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 인접 세포로의 전이 억제 및 단량체 α-syn의 응집체로의 변성을 억제할 수 있는 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시누클레인병증 치료제의 후보물질을 처리한 세포에서 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 c-src의 활성 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 시누클레인병증 진단용 조성물, 상기 진단용 조성물을 포함하는 시누클레인병증 진단용 키트 및 상기 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 c-src의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시누클레인병증 진단을 위한 정보제공 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 알파-시누클레인의 응집 및/또는 전이 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, c-src의 발현 또는 활성 억제제를 투여하는 것을 특징으로 하는 시누클레인병증 치료방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 시누클레인병증 치료를 위한 c-src의 발현 또는 활성 억제제의 용도 및 시누클레인병증 치료용 약제 제조를 위한 c-src의 발현 또는 활성 억제제의 사용을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 신경조직 유래 세포에 시누클레인병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; (ii) 상기 세포에서 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 시누클레인병증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, c-src의 활성 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 시누클레인병증 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 진단용 조성물을 포함하는 시누클레인병증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 시누클레인병증이 의심되는 대상체(subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 c-src의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시누클레인병증 진단을 위한 정보제공 방법 및 시누클레인병증 진단방법을 제공한다.
본 발명의 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)이 인접한 세포로 전이하여 야기하는 신호전달을 억제할 수 있어서 인접한 세포에 대한 α-syn의 세포독성 영향을 감소시키며, 단량체 α-syn가 시누클레인병증의 주요 원인이 될 수 있는 응집체 α-syn로의 변성을 억제할 수 있으므로, 시누클레인병증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 응집된 α-syn에 의해서 c-src의 활성이 증가하는 것을 보여주는 것으로, (A) SHSY5Y 세포주 및 (B) 마우스 일차신경세포에서 확인한 것이다. ** P < 0.01는 PBS와 비교한 결과를 나타낸다. (C)는 야생형 마우스 및 A53T TG 마우스의 전체 뇌 용해물에서 확인한 것이다. ** P < 0.01는 야생형 마우스(WT)와 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 SHP-1/2, SHP-1, SHP-2의 저해제를 처리한 SHSY5Y 세포주에서 응집된 α-syn에 의해서 c-src의 활성 억제를 확인한 것이다. ** P < 0.01은 PBS와 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 SHP-1 또는 SHP-2의 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주에서 응집된 α-syn에 의해서 c-src의 활성 억제를 확인한 것이다. ** P < 0.01는 대조군(NT)과 비교한 결과를 나타낸다.
도 4는 α-syn의 세포간의 전이현상에 c-src가 작용한다는 것을 보여주는 것으로, SHSY5Y 세포주에 c-src의 저해제인 사라카티닙 또는 SKI(Src kinase inhibitor)를 처리하여 α-syn의 전이가 감소를 확인한 것이다. 스케일바는 20μm을 나타내고, ** P < 0.01는 PBS와 비교한 결과를 나타낸다.
도 5는 α-syn의 세포간의 전이현상에 c-src가 작용한다는 것을 보여주는 것으로, SHSY5Y, c-src의 발현이 억제된 SHSY5Y 세포를 밑에 깔고 α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포를 위에 깔아서 c-src이 발현이 억제된 SHSY5Y세포에서 전이현상을 현미경으로 확인한 것이다. 스케일바는 20μm을 나타내고, ** P < 0.01는 대조군(NT)과 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 단량체 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주에 사라카티닙 또는 SKI를 처리하여 과발현된 단량체 A53T α-syn이 응집체로 변형되는 과정에 c-src가 영향을 주는지 확인한 것이다. 스케일바는 20μm을 나타내고, ** P < 0.01는 PBS와 비교한 그래프이다.
도 7은 c-src의 발현이 억제된 단량체 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주를 대조군과 비교한 것이다. 스케일바는 20μm을 나타내고, ** P < 0.01는 비교군(NT)과 비교한 그래프이다.
도 8은 c-src의 발현과 활성이 α-syn의 응집체 형성에 영향을 미치는 것을 확인한 것으로, (A) src 의 발현이 억제된 경우, (B) src의 활성을 억제시킨 경우, A53T eGFP가 과발현되었을 때 응집되는 α-syn의 양이 감소되는 것을 확인한 결과이다. 스케일바는 20μm을 나타낸다.
도 9는 c-src의 발현이 억제된 단량체 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주에서 A53T α-syn의 세포외 분비를 대조군과 비교한 것이다. 스케일바는 20μm을 나타내고, ** P < 0.01는 비교군(NT)과 비교한 그래프이다.
도 10의 (A)는 A53T α-syn 돌연변이 마우스 뇌에 응집된 α-syn을 주입한 돌연변이 마우스에 사라카티닙을 투여한후, 뇌조직에서 루이소체를 DAB 염색으로 확인한 것이며(스케일바는 50μm), (B)는 루이소체의 분포정도를 색으로 표시한 그림이고, (C)는 루이소체를 뇌조직의 구역별로 나눠서 수치화한 그래프를 나타낸 것이다. ** P < 0.01는 비교군(PBS)과 비교한 그래프이다.
도 11의 (A)는 primary neuron에서 c-src의 발현을 억제시킨 경우 α-syn의 전이를 나타낸 것이며, (B)는 primary neuron에서 c-src inhibitor를 처리한 경우 α-syn의 전이를 나타낸 것이다.
도 12는 c-src의 활성 정도에 따른 α-syn의 전이를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 퇴행성 뇌질환의 병인기전을 밝힘으로써 보다 효과적인 새로운 치료전략을 세우기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)에 주목하게 되었다. 신경세포에서 분비된 알파-시누클레인이 인접해 있는 신경세포들에 작용하여 상기 세포를 활성화시킴으로써 신경세포의 손상에 관여한다는 가능성을 바탕으로, 세포 밖의 응집된 알파-시누클레인이 인접한 세포 내로 들어가는데 관여하는 단백질 c-src를 밝혀내었다. 또한, 상기 c-src는 파킨슨 병의 주요 원인이 될 가능성이 있는 α-syn의 응집체 변성에도 관여함을 확인하였다.
본 발명자들은 응집된 α-syn에 의해서 c-src의 활성화가 증가된다는 것을 확인하였으며, SHP-1 또는 SHP-2의 발현이 억제되면 α-syn에 의한 c-src의 활성화 증가가 억제됨을 확인하였다. 나아가, c-src의 발현이 억제됨에 따라 α-syn의 세포 간 전이현상이 감소함을 확인하고, 응집된 α-syn의 전이에 c-src가 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 또한, 이러한 응집체 α-syn으로 변성 과정에 c-src가 관여함을 확인하였으므로, c-src의 활성 억제를 통해 시누클레인병증의 주요 원인으로 작용하는 α-syn의 응집체로의 변성을 억제하는 것을 알 수 있었다.
이처럼 시누클레인병증의 발병원인을 밝혀낼 수 있는 중요한 단서인 응집된 α-syn의 인접 세포로의 전이 메커니즘 및 단량체 α-syn의 응집체로의 변성 메커니즘은 종래에 전혀 공지되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 대상에 투여하는 단계를 포함하는 알파-시누클레인의 응집 및/또는 전이 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명의 "c-src"란 proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src 또는 proto-oncogene c-src로도 알려져 있으며, src 유전자에 의해 코딩되는 non-receptor tyrosine kinase protein이다. 상기 c-src는 다른 단백질의 특정 타이로신 잔기를 인산화시킨다. "c-src"는 cellular Src kinase의 약자이다. c-src 티로신 키나아제의 증가 된 활성 수준은 다른 신호를 촉진함으로써 암의 진행과 관련이있는 것으로 알려져 있다. 이 발암 유전자는 배아 발달 및 세포 성장의 조절에도 역할을 할 수 있다. c-src는 SH2 도메인, SH3 도메인 및 티로신 키나아제 도메인을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 c-src 단백질의 유전자 서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession AAC29427.1로 표시되는 유전자일 수 있다.
본 발명의 용어 "c-src 활성화"란 c-src의 인산화를 의미하고, 본 발명의 목적상, 응집된 알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)에 의해 달성되는 것일 수 있으며, 상기 c-src 활성화는 α-syn의 전이를 증가시키는 현상에 관여할 수 있다.
본 발명의 용어 "알파-시누클레인(α-synuclein; α-syn)"이란, 세포질 내 루이소체(Lewy body)의 주 구성성분으로 알려진 단백질을 의미하며, 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 목적상 퇴행성 뇌질환의 병인에 관여하는 단백질 분자일 수 있다. 상기 α-syn 유전자의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession NP_0010359161 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.
본 발명의 용어 "알파-시누클레인의 전이"란, 알파-시누클레인이 알파-시누클레인을 분비하는 세포로부터 인접한 곳에 위치한 다른 세포로 이동하는 현상을 의미한다. 이에 제한되지 않지만, 본 발명의 목적상 인접한 세포에 직접적인 독성을 나타내거나, 인접한 세포 내로 세포독성을 나타내는 신호를 전달하는 현상일 수 있으며, 상기 c-src의 활성화에 의해서 알파 시누클레인이 전이가 활성화될 수 있다. 즉, 응집된 알파 시누클레인이 세포밖에 존재하면, src의 활성화가 증가가 되어서 세포밖에 존재하는 알파 시누클레인이 세포 안으로 들어간다.
본 발명의 용어 "SHP-1/-2"이란, Src 상동성영역 2 도메인-포함 포스파타아제-1/-2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1/-2)로서, PTPN6(Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 6)으로도 알려져 있으며, 일종의 단백질 티로신(tyrosine) 포스파타아제를 의미한다. 상기 SHP-1/-2는 N-말단(Nterminal)에 단백질 인산화-티로신 결합 도메인으로서 작용하는 Src 상동(Src homolog; SH2) 도메인을 포함하며, 세포 성장, 분화 및 유사분열 주기 등의 다양한 세포 내 과정을 조절하는 신호전달분자로 알려져 있다. 상기 SHP-1/-2 단백질의 유전자서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있는데, 그 예로서, GenBank Accession AAC360091, AAC360081 등으로 표시되는 유전자일 수 있다.
본 발명의 용어 "c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제" 또는 "c-src의 발현 또는 활성 억제제"란, c-src를 코딩하는 유전자, mRNA 또는 단백질에 직접 또는 간접적으로 결합하여 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 c-src의 저해제 또는 c-src의 억제제와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제는 c-src의 발현 또는 활성을 억제함으로써 시누클레인병증을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 약학 조성물의 유효성분인 것일 수 있는데, 상기 제제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, c-src의 발현을 억제할 수 있는 제제는 c-src 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 c-src의 활성을 억제할 수 있는 제제는 c-src의 단백질에 상보적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 소분자 화합물(small molecules) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "miRNA, siRNA 또는 shRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다 상기 siRNA 또는 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있으며, 본 발명의 목적상, c-src의 발현을 억제을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
shRNA(c-src KD #1):
CCGGGCTCGGCTCATTGAAGACAATCTCGAGATTGTCTTCAATGAGCCGAGCTTTTTG (서열번호 1)
shRNA(c-src KD #2):
CCGGGACAGACCTGTCCTTCAAGAACTCGAGTTCTTGAAGGACAGGTCTGTCTTTTTG (서열번호 2)
본 발명의 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하는데, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 효과를 나타내며, 본 발명의 목적상, c-src의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 퇴행성 뇌질환의 발병이 의심되는 개체의 활성화된 c-src 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, c-src에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 활성화된 c-src 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "소분자 화합물(small molecules)"이란, 분자량이 작은 유기 화합물로, 단백질 등의 생체 고분자에 결합하여 그 기능을 조절하는 분자를 의미한다. 천연유래이거나 인공적으로 합성될 수 있으며, 단백질의 기능을 저해하거나 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 소분자 화합물은 활성화된 c-src 단백질의 활성을 억제하는 분자라면 제한 없이 포함하며, 구체적인 예로 활성화된 c-src에 결합하여 활성을 억제하는 분자를 의미하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, c-src의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어 “시누클레인병증(synucleinopathy)”이란, 뉴런, 신경 섬유 또는 신경 교세포에서 α-syn 응집체의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 시누클레인병증은 파킨슨병(Parkinson’s disease; PD), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies; DLB) 또는 다계통위축(multiple system atrophy; MSA)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "퇴행성 신경질환"이란, 신경세포의 손상에 의해 야기되는 질환을 의미하며, 노화, 유전적 변이, 스트레스, 세포 내 단백질 제거 기능의 문제 등이 발병 원인이 될 것으로 추측되고 있지만, 정확한 원인은 밝혀지지 않았다.
본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 투여에 의해 시누클레인병증과 같은 퇴행성 신경질환의 발병을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 시누클레인병증과 같은 퇴행성 신경질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 시누클레인병증(synucleinopathy) 치료효과는 c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn) 응집 및/또는 전이 억제 기능을 통해 달성될 수 있음을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 시누클레인병증 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 구체적인 예로, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏, 구체적으로 약 1 ng/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, c-src의 발현 또는 활성 억제제를 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 시누클레인병증의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "개체"란 시누클레인병증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 시누클레인병증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 c-src의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 제제가 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 시누클레인병증 치료를 위한 c-src의 발현 또는 활성 억제제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 시누클레인병증 치료용 약제 제조를 위한 c-src의 발현 또는 활성 억제제의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (i) 신경조직 유래 세포에 시누클레인병증 치료제의 후보물질을 처리하는 단계; (ii) 상기 세포에서 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (iii) 상기 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도가 후보물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 감소한 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 (ii) 단계의 c-src 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계는 상기 기술한 바와 같이 당업계에서 이용되는 통상의 발현 수준 측정 방법이 제한 없이 사용될 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 구체적인 예로 면역형광법, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blot), 유세포 분석법(FACS), 면역조직화학, 면역침강법(immunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA) 및 RT-PCR로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 시누클레인병증 치료제의 후보물질이 처리되는 상기 신경조직 유래 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서, 신경세포 또는 신경교세포가 될 수 있고, 다른 예로서, 미세아교세포(microglia), 성상교세포(astrocyte), 희돌기교세포(oligodendrocyte), 상의세포(ependymal cell), 슈반세포(Schwann cell), 위성세포(satellite cell) 등의 신경교세포가 될 수 있으며, 바람직하게는 상기 신경조직 유래 세포는 도파민성 신경세포주 SHSY5Y인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "시누클레인병증 치료제의 후보물질"이란, 시누클레인병증을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질로, 직접 또는 간접적으로 시누클레인병증을 호전 또는 개선 시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 모든 치료가능 예상물질을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 상기 후보물질 투여 전후에 c-src의 활성화 여부를 측정하는 한편, 상기 c-src의 활성화가 후보물질 투여 전에 비해 투여 후에 억제된 경우, 해당 후보물질을 시누클레인병증의 치료제로서 결정할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, c-src의 활성 수준을 측정할 수 있는 물질을 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, "c-src의 활성 수준을 측정할 수 있는 물질"이란, "c-src의 인산화 여부를 측정할 수 있는 제제를 의미하며, 본 발명의 목적상, 세포에 대한 응집된 α-syn의 영향을 평가하는데 이용될 수 있는 물질을 의미한다. 상기 물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적인 예로, 활성화된 c-src에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 항체는 시누클레인병증의 발병이 의심되는 개체의 응집된 α-syn에 의해 활성화된 c-src 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성화 여부를 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다. 구체적인 예로, c-src에 특이적으로 결합될 수 있는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다.
아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함하는 형태가 될 수도 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.
본 발명의 목적상 상기 앱타머는 c-src 단백질에 결합함으로써, 상기 단백질의 활성화 여부를 측정할 수 있는 수단으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것으로서, 본 발명의 목적상, 시누클레인병증과 같은 퇴행성 신경질환의 발병 여부를 확인하는 것뿐만 아니라 퇴행성 신경질환의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 경과를 판단하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란, 말, 개, 고양이, 돼지, 염소, 토끼, 햄스터, 원숭이, 기니피그(guinea pigs), 래트, 마우스, 도마뱀, 뱀, 양, 소, 물고기 및 새를 제한 없이 포함하며, 임의의 동물(예컨대, 인간)을 의미한다 보다 넓게는 상기 동물의 세포주까지 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 시누클레인병증 진단용 키트는 시누클레인병증을 진단하는 표지자인 알파-시누클레인(α-Synuclein)의 인접세포로의 전이를 직접 측정하거나, 또는 알파-시누클레인에 의해 활성화된 c-src의 활성을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 상기 단백질을 선택적으로 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
또한, 상기 본 발명의 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96-웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96-웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 더불어, 단백질 수준을 분석하기 위하여, 웨스턴블롯(Western blot), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 방사선면역분석(otA: badioimmunoassay), 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 및 단백질 칩 등의 방법을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 진단용 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 시누클레인병증이 의심되는 대상체(subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 c-src의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시누클레인병증(synucleinopathy) 진단을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물 또는 상기 키트를 이용하여 시누클레인병증이 의심되는 대상체(subject)로부터 분리된 생물학적 시료에서 c-src의 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시누클레인병증 진단방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 c-src가 활성 수준이 대조군에 비해 증가한 경우 시누클레인병증이 발병한 것으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"는 시누클레인병증 진단의 지표인 c-src의 활성화 여부에 차이를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 신경조직 유래 세포, 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간질액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 시료일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 c-src의 활성화 여부를 측정하기 위한 방법으로는 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 실시간 RT-PCR, 전기영동, 조직 면역염색(immunostaining) 및 FACS(Fluorescence activated cell sorter) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재조합 α- 시누클레인 (α- Synuclein ; α- Syn ) 및 응집된 α- syn 제조
재조합 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn) 및 응집된 α-syn을 준비하였다(KR 10-1838802). 재조합 α-Syn을 대장균주 BL21(DE3)에서 과발현시키고, 상기 재조합 단백질을 공지된 방법으로 정제하였다(Lee, S B, et al , Biochem Biophys Res Commun 381, 39-43, 2009). 정제한 α-Syn 단백질을 단량체 α-Syn로서 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 2 ㎎/㎖의 단량체 α-syn을 37℃에서 250 rpm으로 연속적인 교반을 하면서 2주 동안 배양하였고, 간단하게 초음파 처리하여 분해한 후, 응집된 α-syn로서 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 본 발명의 모든 실시예에서 상기 제조한, 응집된 α-syn을 사용하였다.
실시예 2: SHP -1 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주 및 SHP -2 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주의 제조
SHP-1 발현억제(knockdown; KD) 세포주 및 SHP-2 발현억제(knockdown; KD) 세포주는 다음과 같은 방법으로 제작하였다.
SHP-1/2의 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 구성체(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 공지된 방법으로 SHP-1/2 발현억제 SHSY5Y 제조하였고(Yoon, S., et al ., Cell Death Dis . 5:e1494, 2014), 퓨로마이신(puromycin)을 이용하여 선발하였다.
그 다음, 상기 제조한 SHP-1/2 발현억제 SHSY5Y 세포주에서 SHP-1/2의 발현양을 SHP-1/2 항체를 이용하여 웨스턴블롯을 통해 조사하였고, 그 결과, 제조한 SHP-1/2 발현억제 SHSY5Y 세포주에서 SHP-1/2의 발현이 효율적으로 감소함을 확인하였다.
실시예 3: 마우스 일차신경세포 및 A53T 이형접합 형질전환 마우스의 뇌 용해물 준비
C57BL6 마우스 1일령의 대뇌겉질(cerebral cortices)에서 분리하여 기존 문헌(CHA, S. H., et al ., Mol neurodegener . 10:63, 2015)에 기재된 바에 따라 배양해서 마우스의 일차신경세포를 수득하였다.
다음으로, 인간에서 발현하는 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 돌연변이 중 하나인 A53T를 유전자 변형 마우스에서 과발현시킨 모델(B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J, M83;, Jackson Laboratory)의 마우스인 A53T 이형접합 형질전환 마우스의 뇌 용해물은 다음과 같은 방법으로 수득하였다.
9개월령 된 C57BL6 A53T α-syn 이형 형질전환 마우스 및 대조군 C57BL6 마우스로부터 기존 문헌(Lee, H J, et al , Exp Neurobiol 20:181-8, 2011)에 기재된 바에 따라 뇌를 획득하였다. 두뇌 반구를 단백질 억제제 및 포스파타아제 억제제 칵테일이 포함된 600㎕의 차가운 RIPA 버퍼 안에 넣고 균질화하였다. 용해물을 4℃에서 30분 동안 배양하였고, 상기 용해물을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 획득하여 웨스턴블롯을 수행하였다.
실시예 4: 응집된 α- syn에 의한 c- src의 활성화 증가
도파민성 신경세포주인 SHSY5Y 세포주, 실시예 3의 마우스 일차신경세포 및 실시예 3의 마우스 뇌 용해물을 이용하여 응집된 α-syn에 의한 c-src의 활성화를 조사하였다.
상기 SHSY5Y 세포주 및 마우스 일차신경세포는 모두 각각 1 μM의 응집된 α-syn을 이용하여 10분 동안 배양한 후, 용해하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 1A 및 1B). 또한, A53T TG 마우스는 야생형 WT(wild type) C57BL6 마우스의 전체 뇌 용해물과 웨스턴 블롯으로 비교하였다(도 1C).
웨스턴블롯은 각 세포를 단백질 억제제(2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 100 ㎍/ml leupeptin, 10 ㎍/ml pepstatin, 1 ㎍/ml aprotinin 및 2 mM EDTA) 및 포스파타아제 억제제 칵테일(GenDEPOT, Baker, TX)이 포함된 차가운 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 74, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl)로 용해하였다. 초음파처리를 통해 세포를 용해한 후, 용해물을 4℃에서 30분 동안 14,000 rpm으로 원심분리하였고, 상층액을 수득하였다. 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트를 이용하여 측정하였다. 단백질들을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)으로 전이시킨 후, ECL(chemiluminescence) 시스템(Thermo, Waltham, MA)을 이용하여 상기 단백질을 가시화하였다.
그 결과, 응집된 α-syn에 의해 c-src의 활성이 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5: SHP -1 또는 SHP -2 억제에 의한 응집된 α- syn 매개 c- src 활성 억제
SHSY5Y 세포주를 SHP-1/2 저해제인 20 μM의 NSC87877, SHP-1 저해제인 10 μM SSG 또는 SHP-2 저해제인 1 μM PHPS-1로 30분 동안 미리 처리한 후, 1 μM의 응집된 α-syn을 이용하여 10분 동안 배양한 다음, 용해하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 2).
또한, 실시예 2에서 제조한 SHP-1발현이 억제된 SHSY5Y 세포주 및 SHP-2 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주에 1 μM의 응집된 α-syn을 처리하여 10분 동안 배양한 후, 용해하여 웨스턴 블롯을 수행하였다(도 3).
그 결과, SHP-1 또는 SHP-2가 억제되면 응집된 α-syn 매개 src 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 6: α- syn 전이에 대한 c- src의 영향
Two chamber 시스템을 이용해서 12웰 플레이트에 알파시누클레인이 과발현한 SHSY5Y cell을 인서트웰(insert well)에 4 x 104으로 깔고 커버글라스에는 SHSY5Y세포주를 4 x 104으로 깔은뒤 그 다음날 인서트웰을 12웰 커버글라스가 있는 곳으로 옮겨서 12h동안 공동배양하는 동안에 SHSY5Y 세포주에 c-src 저해제인 0.1μM 사라카티닙과 10μM SKI(c-src kinase inhibitor I)을 처리한 다음, 커버글라스에 있는 SHSY5Y에서 알파시누클레인을 면역염색법을 이용해서 알파시누클레인이 과발현된 SHSY5Y에서 알파시누클레인이 과발현이 되지 않은 SHSY5Y로 이동한 것을 확인한 것을 면역염색(α-syn: 붉은색, 핵: 푸른색)하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, PBS 대조군에서는 α-syn의 전이가 관찰되지만, 사라카티닙과 SKI를 처리하면 α-syn의 전이가 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
다음으로, 서열번호 1 및 서열번호 2의 shRNA를 이용(letivirus를 이용)해서 만든 c-src 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주(KD #1 및 KD #2)와 α-syn이 과발현된 도파민성 신경세포주 SHSY5Y를 Two chamber를 이용하여 12시간 동안 공동배양(Co-culture)을 수행하였다. 상기 공동배양을 간략히 정리하면, SHSY5Y 세포를 12-웰 커버글라스(cover glass)위에 웰당 4 x 104 세포의 농도로 분주하였다. 각각 하루 동안 배양한 이후, α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포가 분주되어 있는 트렌스웰을 src 발현이 억제된 SHSY5Y 세포가 분주된 12-웰 커버글라스로 옮겨 12시간 동안 공동배양을 수행하였고, 그 이후, 면역염색(α-syn: 붉은색, 핵: 푸른색)하여 공초점현미경으로 관찰하였다.
정상 대조군(NT; non-targeting) SHSY5Y 세포주와 c-src의 발현이 억제된 SHSY5Y에서 α-syn의 전이를 확인한 결과, c-src의 발현이 억제됨에 따라 α-syn의 전이현상이 감소된다는 것을 알 수 있었다(도 5).
실시예 7: 단량체 α- syn의 응집체 변성에 대한 c- src의 영향
단량체 α-syn이 응집체가 되는 변성과정이 파킨슨의 주된 원인이 될 수 있는 가능성이 있다. 따라서, SHSY5Y 세포주에서 단량체 A53T α-syn을 과발현시키고, 이 과발현된 단량체 A53T α-syn이 응집체로 변형되는 과정에 c-src가 관여하는 지를 확인하였다.
실시예 2의 방법으로 eGPF로 표지된 A53T α-syn 및 mcherry로 표지된 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주를 lentivirus을 이용하여 각각 제작하였다. 그 다음, eGPF로 표지된 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주 및 mcherry로 표지된 A53T α-syn이 과발현된 SHSY5Y 세포주를 섞어서 공동배양(Co-culture)을 수행하였다. 공동배양을 진행한 5일째에 공초점 현미경을 이용해서 eGFP로 표지된 A53T α-syn의 세포 안에서의 eGFP와 mcherry가 합쳐진 분포도를 확인하였으며, 또한 mch로 표지된 A53T α-syn의 세포 안에서의 mcherry와 eGFP가 합쳐진 분포도도 각각 확인였다.
도 6은 상기 제조된 SHSY5Y 세포주의 공배양 세포에 c-src 저해제인 SKI와 사라카티닙을 처리한 결과이다. 또한, 도 7은 서열번호 1 및 서열번호 2의 shRNA를 이용하여 c-src 발현을 억제시킨 A53T α-syn eGFP 및 A53T α-syn mcherry를 공배양한 후 확인하였다.
Src KD SHSY5Y(서열번호 1 및 서열번호 2의 shRNA를 이용)에서 A53T eGFP을 과발현시켜 FACS로 eGFP 신호를 띄는 것을 선별하여 배양한 뒤, retinoid acid 50μM을 처리하고 5일동안 분화시킨 후 공초점현미경을 이용해서 사진을 찍었다. 그 결과, src의 발현이 억제된 세포에서 응집된 α-syn의 양이 감소되는 것을 확인하였다(도 8A).
또한, A53T eGFP의 과발현된 SHSY5Y에서 각각 SKI(c-src kinase inhibitor I) 10μM, 사라카티닙 0.5μM을 처리하고, RA(retioid acid) 50μM로 분화시켜서 응집된 α-syn을 공초점현미경으로 확인한 결과, src의 활성을 억제시켰을 때 응집된 α-syn의 양이 감소됨을 확인하였다(도 8B).
마지막으로, 정상 대조군(NT; non-targeting)와 비교하여 c-src 발현이 억제된 SHSY5Y 세포주는 A53T α-syn eGFP가 세포 밖으로의 이동이 감소된 것을 확인하였다(도 9).
실시예 8: α- Syn 돌연변이 A53T의 유전자 변형 마우스에서 α- syn의 전이 확인
응집된 α-syn에 의해 돌연변이 생쥐에서 α-syn의 전이가 일어난다는 것을 확인하였다.
인간에서 발현하는 α-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 돌연변이 중 하나인 A53T를 유전자 변형 마우스에서 과발현시킨 모델(B6;C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J, M83;, Jackson Laboratory)의 마우스 8주~12주령을 에버틴(Avertin)으로 체중 20g당, 200μl의 용량으로 투여하여 마취시킨 후, 스테레오택식(Stereotaxic) 수술 기구에 고정을 시키고, 생쥐의 정수리점(Bregma)을 기준으로 전방 1.0mm, 우측 1.8mm, 깊이 3.0mm의 좌표로, 해밀턴 실린지(Hamilton syringe)를 사용하여, 응집된 α-syn을 10μg의 용량으로 생쥐의 선조체(Striatum)에 주입하였다(도 10).
그 다음, 3일 정도 간호 후에 사라카티닙을 10mg/kg의 농도로 매일 1회씩, 총 4주 동안 구강투여 하였다. 그 후, 생쥐를 우레탄(Urethane)으로 체중 20g당, 200μl의 용량으로 투여하여 마취시킨 후, 흉부를 절개하여 심장의 좌심실을 통해서 3분간 관류액을 흘려보내서 우심방을 절단 후, 혈액을 제거하고 3분간 4%의 포름알데히드를 흘려보내 생쥐의 조직을 고정(fixation) 시켰다. 그 다음, 뇌를 추출해서 4% 포름알데히드 고정액에 하루 담근 후 30% 설탕물에서 바닥까지 가라앉을 때까지 탈수과정을 진행하였다. 이후 바닥에 가라앉은 것이 확인되면, 고정판에 뇌를 올려놓고, 오씨티 컴파운드(O.C.T Compound)로 -20℃에서 컴파운드를 얼린 후, 다시 -80℃에서 30분간 냉동하여 35μm의 두께로 뇌절편을 만들었다. 뇌절편은 조직보관액에 보관하였다.
뇌절편을 조직면역염색에 사용 시, 건져내어 PBS로 10분씩 3회 세척 후(이하 각 특정 용액에 반응 후, 무조건 3회 세척)에, 3% 과산화수소수로 5분간 조직 내의 과산화 효소를 제거하였다. 세척 후에 블로킹 용액(1% BSA, 0.2% Triton X-100)으로 1시간 동안 블로킹 후, 응집된 α-syn을 표적으로 하는 pSyn#64 1차 항체(wako #01525191)를 1:5,000의 농도 및 2차 항체를 1:5,000의 농도로 반응시키고, 조직에 반응하여 붙어있는 항체들을 ABC 콤플렉스로 반응하고, 3’3-Diaminobenzidine으로 발색반응을 시켰다. 이후 조직을 마이크로 글래스에 붙여서 건조시켜 100%, 70%, 20% 에탄올로 수화시킨 후, 헤마톡실린(Hematoxylin)으로 핵을 염색하고 70% 에탄올을 시작으로 80, 90, 100% 에탄올에 순차적으로 탈수반응을 진행시켰다. 이후 자일렌(Xylene)에 하루 정도 반응 후, 이를 꺼내서 글래스 위에 마운트 용액을 올린 후 커버 글래스로 덮고, 해부현미경을 사용해서 배율 400x로 분석하였다.
상기 α-Syn 돌연변이 A53T의 유전자 변형 마우스에 4주 동안 PBS, 10μg의 응집된 α-syn 각각을 주입한 군, 응집된 α-syn을 주입하고 사라카티닙을 10mg/kg로 매일 주사한 군의 뇌조직을 상기 방법으로 수득한 다음, DAB 염색법으로 루이소체를 염색하여, 각 부위에서 α-syn 전이 여부를 확인한 결과를 도 10의 (A)에 나타내었다. 도 10의 (B) 및 (C)는 α-syn 전이된 정도를 뇌조직의 구역별로 표시한 그림 및 그래프를 나타낸 것이다.
실시예 9: c- src 발현 억제 또는 활성 억제에 따른 α- syn 전이 감소 현상 확인
Rat TP18(임신 18일째 새끼)에서 cortex를 분리하여 14일동안 neural basal media에서 primary neuron을 배양하였다. 14일째에 lentivirus(NT와 src KD #1 virus 이용)를 이용하여 src의 발현을 억제시켰다.
c-src 발현 억제의 α-syn 전이에 대한 효과를 확인하기 위하여, A53T eGFP가 과발현된 SHSY5Y을 5일동안 50μM RA(Retinoid acid)로 분화시킨 후 dual chamber assay를 수행하였다. c-src 활성 억제의 α-syn 전이에 대한 효과를 확인하기 위하여, 14일째 primary neuron에서 10μM SKI, 0.5μM Sara을 처리하고 dual chamber assay를 수행하였다.
그 결과, primary neuron culture에서 lentivirus을 이용하여 c-src의 발현을 억제시킨 경우, α-syn의 전이 감소를 확인하였다(도 11(A)). 또한, c-src inhibitor를 처리한 경우, α-syn의 전이 감소를 확인하였다(도 11(B)).
실시예 10: α- syn 전이에 대한 c- src 활성화 정도의 영향
SHSY5Y에 mock, WT c-src GFP, CA(Y527F, kinase active mutant form) c-src GFP 또는 DA(K295F, kinase death mutant forom) c-src GFP를 과발현시킨 후, α-syn이 이동하는 정도를 확인하였다.
그 결과, 과발현되지 않은 세포에 비해서 WT와 CA가 과발현된 세포에서 α-syn의 전이 정도가 증가됨을 확인하였다(도 12). 즉, c-src의 활성화 정도에 따라 α-syn의 전이가 증가됨을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical Composition for Preventing or Treating Synucleinopathy Comprising Expression or Activation Inhibitor of c-src <130> P19-B050 <150> KR 10-2018-0066005 <151> 2018-06-08 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 1 ccgggctcgg ctcattgaag acaatctcga gattgtcttc aatgagccga gctttttg 58 <210> 2 <211> 58 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 2 ccgggacaga cctgtccttc aagaactcga gttcttgaag gacaggtctg tctttttg 58

Claims (15)

  1. c-src 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 포함하는 알파-시누클레인(α-Synuclein; α-Syn)의 응집 및/또는 전이 억제용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 c-src 단백질의 발현 억제제는 c-src 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 miRNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 c-src의 활성 억제제는 c-src의 단백질에 상보적으로 결합할 수 있는 항체, 앱타머, 소분자 화합물 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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