CN112384248A - 预防或治疗突触核蛋白病的包含c-src的表达或活性抑制剂的药物组合物 - Google Patents

预防或治疗突触核蛋白病的包含c-src的表达或活性抑制剂的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于抑制α‑突触核蛋白(α‑syn)的聚集和/或迁移的组合物，并且更具体而言，涉及用于抑制α‑syn的聚集和/或迁移的包含c‑src的表达或活性抑制剂的组合物，或者用于预防或治疗突触核蛋白病的包含c‑src的表达或活性抑制剂的药物组合物。本发明的c‑src蛋白的表达或活性抑制剂可以抑制通过α‑syn迁移至相邻细胞诱导的信号转导，从而减轻α‑syn对相邻细胞的细胞毒性影响；并且可以抑制单体α‑syn变性为聚集的α‑syn(这可能是突触核蛋白病的主要病因)，并且因此可以有益地用作突触核蛋白病的治疗剂。

Description

预防或治疗突触核蛋白病的包含C-SRC的表达或活性抑制剂 的药物组合物
技术领域
本发明涉及用于抑制阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，并且更具体而言涉及包含针对c-src的表达或激活的抑制剂的用于抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，以及包含针对c-src的表达或激活的抑制剂的用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物。
背景技术
随着衰老人群的增多，患有退行性脑病如帕金森病和阿尔茨海默病的患者数量正在快速增加，并且解决这个问题的医疗成本也在快速增加。在退行性脑病中，帕金森病是次于阿尔茨海默病的第二常见的退行性脑病，并且是最常见的退行性运动疾病。估计患有所述疾病的患者的数量超过世界范围内所有超过60岁者的1％，并且韩国的患者数量从2004年的40,000名持续增加至2008年的66,000名以及2012年的93,000名，并且预计未来会甚至更快地增加。
帕金森病的确切病因仍然未知，但是已知家族性帕金森病是由各种基因突变引起的，所述突变涉及例如α-突触核蛋白、帕金蛋白(parkin)、PINK1、DJ-1和LRRK2。另外，就目前所知，据推断帕金森病是由氧化应激、线粒体异常以及细胞蛋白质去除功能中的问题引起的(Lees,A J等人,Lancet,373:2055-66,2009)，并且是由环境影响以及遗传因素引起的。帕金森病的发作是基于临床症状来检测，并且治疗限于减轻症状而不是消除病因的保守治疗。因此，急切需要准确鉴定病因学并找到适合于其的治疗方法。
阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)是在帕金森病患者体内发现的胞质路易体(Lewy body)的主要组成蛋白，主要分布在神经细胞的突触前的末端，并且已知在整体神经组织中大量表达。α-突触核蛋白还参与其他退行性疾病的发病机制，所述其他退行性疾病如路易体痴呆和多系统萎缩症，以及帕金森病。与α-突触核蛋白的异常积累相关的所有疾病统称为“突触核蛋白病”，并且人们对作为所述疾病的常用治疗靶标的α-突触核蛋白积极进行了大量研究。
另外，α-突触核蛋白能够形成聚集物，并且其中单体α-突触核蛋白转化为聚集的α-突触核蛋白的变性过程可能是帕金森病的主要病因的可能性是已知的(Eschbach,J.,Danzer,K.M.,Neurodegener.Dis.,14:1-17,2013)，之后在家族性帕金森病中鉴定出基因的倍增和三倍化，因此已付出更多努力来找到α-突触核蛋白的功能。作为据此靶向聚集的α-突触核蛋白的药物组合物，已经开发出用于治疗帕金森病的药物组合物，所述药物组合物含有龙眼肉(Longan Arillus)提取物作为活性成分，所述龙眼肉提取物可以显著保护多巴胺能神经元免受由α-突触核蛋白的聚集引起的神经毒性的影响(韩国专利号1189191)。然而，尚未阐明α-突触核蛋白所作用于的特异性受体和与其相关的机制。
同时，其中蛋白质单体转化为聚集物的变性过程不仅发生在帕金森病的α-突触核蛋白中，还发生在阿尔茨海默病的淀粉样蛋白β(Aβ)、τ蛋白、亨廷顿病的突变的亨廷顿蛋白(huntingtin)以及朊病毒病的朊病毒中，并且这种退化过程被视为许多退行性脑病的常见病因，并且对通过抑制该过程治疗退行性脑病积极进行研究。
从那之后，对α-突触核蛋白的细胞内递送的可能性的兴趣迅速增加，并且逐渐揭示了聚集的α-突触核蛋白还进入相邻细胞并参与路易体的产生和相邻细胞的细胞凋亡的可能性，例如，朊病毒病的朊病毒与正常神经元中表达的正常朊蛋白组合形成聚集物(Costanzo,M.,Zurzolo,C.,Biochem.J.452:1-17,2013；Goedert,M.等人,TrendsNeurosci.33:317-25,2010；Lee,S.J.等人,Nat.Rev.Neurol.6:702-6,2010)。在由此推断由位于细胞外的α-突触核蛋白引起的帕金森病的发病机制时，细胞分泌的各种类型的α-突触核蛋白通过作用于并激活相邻的神经胶质细胞来参与神经细胞毒性，并且所述神经细胞毒性通过迁移(转移)至相邻神经元而表现为直接毒性，或者通过诱导路易体的发展而表现为一系列细胞毒性。
因此，通过位于细胞外的α-突触核蛋白参与细胞内信号传导过程的受体或构建体可能是揭示许多类型的退行性脑病的发病机制的重要线索。另外，保证了巨大兴趣，因为此类受体或构造可以用于建立与过去的治疗策略不同的新型治疗策略，但是还没有积极地进行与其相关的研究。
因此，作为鉴定α-突触核蛋白迁移至相邻细胞中的作用机制的大量研究努力的结果，诸位发明人确认，c-src的激活参与α-突触核蛋白的聚集物形成和迁移，并且确认，可以通过抑制c-src的表达或激活来预防和治疗由α-突触核蛋白引起的突触核蛋白病，具体而言退行性脑病，如帕金森病、路易体痴呆(DLB)或多系统萎缩症(MSA)，从而完成本发明。
此背景技术章节中公开的信息仅为加强对本发明背景的理解而提供，并且因此所述信息可能不包括形成对本领域技术人员而言已经清楚的现有技术的信息。
发明内容
本发明的目标是提供用于抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，其包含针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂，所述抑制剂能够抑制α-syn迁移至相邻细胞以及α-syn单体变性为α-syn聚集物。
本发明的另一个目标是提供用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物，其包含针对c-src的表达或激活的抑制剂。
本发明的另一目标是提供筛选突触核蛋白病的治疗剂的方法，其包括在用突触核蛋白病的治疗剂的候选物质处理的细胞中测量c-src蛋白的表达或激活的水平。
本发明的另一目标是提供用于诊断突触核蛋白病的组合物，其包含能够测量c-src的激活水平的物质；用于诊断突触核蛋白病的试剂盒，其包含用于诊断的组合物；以及提供用于诊断突触核蛋白病的信息的方法，其包括使用所述组合物或所述试剂盒测量c-src的激活水平。
为了实现上述目标，本发明提供了用于抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，其包含针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂。
为了实现上述目标，本发明提供了抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的方法，其包括将针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂施用至受试者。
本发明还提供了用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物，其包含针对c-src的表达或激活的抑制剂。
本发明还提供了治疗突触核蛋白病的方法，其包括将针对c-src的表达或激活的抑制剂施用至受试者。
本发明还提供了针对c-src的表达或激活的抑制剂用于治疗突触核蛋白病的用途以及针对c-src的表达或激活的抑制剂用于制备突触核蛋白病的治疗剂的用途。
本发明还提供了筛选突触核蛋白病的治疗剂的方法，所述方法包括(i)用突触核蛋白病的治疗剂的候选物质处理源自神经组织的细胞，(ii)测量所述细胞中c-src蛋白的表达或激活的水平，并且(iii)选择候选物质，与未用所述候选物质处理的对照组相比，所述候选物质具有降低的c-src蛋白表达或激活水平。
本发明还提供了用于诊断突触核蛋白病的组合物，其包含能够测量c-src的激活水平的物质。
本发明还提供了用于诊断突触核蛋白病的试剂盒，其包含用于诊断的组合物。
本发明还提供了提供用于诊断突触核蛋白病的信息的方法以及诊断突触核蛋白病的方法，每种方法包括使用所述组合物或所述试剂盒在从怀疑患有突触核蛋白病的受试者分离的生物样品中测量c-src的激活水平。
附图说明
图1显示，在以下各项中，聚集的α-syn增加c-src的激活：(A)SHSY5Y细胞系；(B)小鼠原代神经元，其中**P<0.01表示与PBS相比的结果；以及(C)野生型小鼠和A53T TG小鼠的全脑裂解物，其中**P<0.01表示与野生型小鼠(WT)相比的结果。
图2显示在用SHP-1/2、SHP-1和SHP-2的抑制剂处理的SHSY5Y细胞系中对聚集的α-syn造成的c-src激活的抑制，其中**P<0.01表示与PBS相比的结果。
图3显示在SHSY5Y细胞系中对聚集的α-syn造成的c-src激活的抑制，在所述细胞系中SHP-1或SHP-2的表达被抑制，其中**P<0.01表示与对照组(NT)相比的结果。
图4显示，c-src作用于α-syn的细胞间迁移，并且α-syn的迁移通过用作为c-src抑制剂的塞卡替尼或SKI(Src激酶抑制剂)处理SHSY5Y细胞系来减少，其中比例尺表示20μm，并且**P<0.01表示与PBS相比的结果。
图5显示c-src作用于α-syn的细胞间迁移，且显示在将SHSY5Y细胞和具有受抑制的c-src表达的SHSY5Y细胞布置在底部上并将过表达α-syn的SHSY5Y细胞布置在顶部上时，对具有受抑制的c-src表达的SHSY5Y细胞的迁移进行显微观察的结果，其中比例尺表示20μm，并且**P<0.01表示与对照组(NT)相比的结果。
图6是显示关于在用塞卡替尼或SKI处理过表达单体A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系时，c-src是否影响将过表达的单体A53Tα-syn转化为聚集的A53Tα-syn的过程的确定结果的图，其中比例尺表示20μm，并且**P<0.01显示与PBS相比的结果。
图7是用于比较具有受抑制的c-src表达的过表达单体A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系与对照组的图，其中比例尺表示20μm，并且**P<0.01显示与比较组(NT)相比的结果。
图8显示关于c-src的表达和激活是否影响α-syn聚集物的形成的确定结果，并且显示，(A)在src的表达受到抑制的情况下，以及(B)在src的激活受到抑制的情况下，在A53TeGFP过表达时，聚集的α-syn的量减少，其中比例尺表示20μm。
图9是比较在具有受抑制的c-src表达的过表达单体A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系与对照组中，A53Tα-syn的细胞外分泌的图，其中比例尺表示20μm，并且**P<0.01显示与比较组(NT)相比的结果。
图10(A)显示，在将塞卡替尼施用至突变体小鼠之后，通过DAB染色观察到脑组织中的路易体，其是通过将聚集的α-syn注射至A53Tα-syn突变体小鼠的脑中来诱导的(比例尺是50μm)，(B)是用颜色显示路易体的分布水平的图像，并且(C)是通过将路易体分到脑组织的相应区域中并对其进行定量而获得的图，其中**P<0.01显示与比较组(PBS)相比的结果。
图11(A)显示在原代神经元中抑制c-src的表达时α-syn的迁移，并且(B)显示在用c-src抑制剂处理原代神经元时α-syn的迁移。
图12显示根据c-src的激活程度，α-syn的迁移。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与由本发明所属领域中的技术人员所理解的含义相同。通常，本文所用的命名法是本领域中熟知的，并且是通常使用的。
在通过鉴定退行性脑病的发病机制来建立更有效的新治疗策略的各项研究期间，诸位发明人关注α-突触核蛋白(α-syn)。基于从神经细胞分泌的α-突触核蛋白作用于相邻神经元以激活神经细胞并由此引起神经细胞损伤的可能性，发现在细胞外聚集的α-突触核蛋白侵入相邻细胞时涉及蛋白质c-src。另外，已确认，在α-syn变性为聚集物时也涉及c-src，所述变性可能是帕金森病的主要病因。
诸位发明人发现，聚集的α-syn提高c-src的激活，并且在抑制SHP-1或SHP-2的表达时，由α-syn提高的c-src激活受到抑制。此外，已发现，在c-src的表达受到抑制时，α-syn的细胞间迁移减少，这意味着c-src在聚集的α-syn的迁移中具有必要作用。另外，已发现，c-src参与变性形成α-syn聚集物的过程，所述过程表明α-syn退化为聚集物，所述退化是突触核蛋白病的主要病因，可以通过抑制c-src激活来抑制。
因此，聚集的α-syn迁移至相邻细胞的机制和单体α-syn变性为聚集的α-syn的机制是揭示突触核蛋白病的病因的重要线索，在现有技术中是完全未知的，并且由诸位发明人首次确定。
因此，在一方面，本发明涉及用于抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，其包含针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂。
在另一方面，本发明涉及抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的方法，其包括将针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂施用至受试者。
如本文所用，术语“c-src”是指由src基因编码的非受体酪氨酸激酶蛋白，它还称作原癌基因酪氨酸-蛋白激酶Src或原癌基因c-src。c-src将其他蛋白质中的某些酪氨酸残基磷酸化。“c-src”是细胞Src激酶的缩写。已知增加的c-src酪氨酸激酶的激活水平通过促进其他信号与癌症进展相关。这种癌基因还可以在胚胎发育和细胞生长的调节中发挥作用。c-src包括SH2结构域、SH3结构域和酪氨酸激酶结构域。
在本发明中，c-src蛋白的基因序列可以从已知数据库如NCBI的GenBank获得，并且例如，可以是GenBank登录号AAC29427.1表示的基因。
如本文所用，术语“c-src激活”意指c-src的磷酸化，基于本发明的目标，其可以通过聚集的阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)来实现，并且c-src激活可参与提高α-syn的迁移的现象。
如本文所用，术语“阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)”意指已知为胞质中路易体的主要组分的蛋白质，但不限于此，并且基于本发明的目标，可以意指参与退行性脑病的发病机制的蛋白质分子。α-syn基因的核苷酸序列可以从已知数据库如NCBI的GenBank获得，并且可以是例如GenBank登录号NP_0010359161表示的基因。
如本文所用，术语“α-突触核蛋白的迁移”是指如下现象：其中α-突触核蛋白从分泌α-突触核蛋白的细胞移动至位于附近的另一个细胞。虽然不限于此，但是它可能是展现对相邻细胞的直接毒性或者将展现细胞毒性的信号转移到相邻细胞中的现象，并且基于本发明的目标，α突触核蛋白迁移可以通过激活c-src来激活。也就是说，在聚集的α突触核蛋白存在于细胞外时，src的激活有所提高，并且存在于细胞外的α突触核蛋白进入细胞。
如本文所用，术语“SHP-1/-2”是指含有Src同源区2结构域的磷酸酶-1/-2，它也称为PTPN6(酪氨酸-蛋白磷酸酶非受体6型)，并且是一种蛋白质酪氨酸磷酸酶。SHP-1/-2在N末端包括用作蛋白质磷酸化-酪氨酸结合结构域的Src同源物(SH2)结构域，并且已知为调节各种细胞间过程(如细胞生长、分化和有丝分裂周期)的信号传导分子。SHP-1/-2蛋白的基因序列可以从已知数据库如NCBI的GenBank获得。例如，它可以是GenBank登录号AAC360091、AAC360081等表示的基因。
如本文所用，术语“能够抑制c-src的表达或激活的药剂”或“针对c-src的表达或激活的抑制剂”是指能够通过与编码c-src的基因、mRNA或蛋白质直接或间接结合来抑制c-src的表达或激活的物质。在本说明书中，“能够抑制c-src的表达或激活的药剂”可以与“针对c-src的抑制剂(inhibitor)”或“针对c-src的抑制物(suppressor)”以相同的含义互换使用。
在本发明中，能够抑制c-src的表达或激活的药剂可以是通过抑制c-src的表达或激活而展现预防或治疗突触核蛋白病的作用的药物组合物的活性成分，但是所述药剂并不特别限于此，并且在具体例子中，能够抑制c-src的表达的药剂选自可以与c-src基因的mRNA互补结合的miRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸及其组合，并且能够抑制c-src的激活的药剂选自可以与c-src的蛋白质互补结合的抗体、适配体、小分子及其组合。
如本文所用，术语“miRNA、siRNA或shRNA”是指如下核酸分子：其通过与主要从靶基因转录的mRNA结合来抑制mRNA的翻译，以介导RNA干扰或基因沉默。siRNA或shRNA可以在翻译水平上抑制靶基因的表达，并且因此可用于高效的基因敲低方法或基因治疗方法，并且可以出于本发明的目标用于抑制c-src的表达。
在本发明中，shRNA可以由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列表示，但不限于此。
shRNA(c-src KD#1)：
CCGGGCTCGGCTCATTGAAGACAATCTCGAGATTGTCTTCAATGAGCCGAGCTTTTTG(SEQ ID NO:1)
shRNA(c-src KD#2)：
CCGGGACAGACCTGTCCTTCAAGAACTCGAGTTCTTGAAGGACAGGTCTGTCTTTTTG(SEQ ID NO:2)
如本文所用，术语“反义寡核苷酸”是指含有与特定mRNA序列互补的核酸序列的DNA或RNA或其衍生物，其具有通过与mRNA中的互补序列结合来抑制mRNA翻译为蛋白质的作用，并且出于本发明的目标可以用于抑制c-src的表达。
如本文所用，术语“抗体”是指可以与蛋白质或肽分子的抗原位点特异性结合的蛋白质性分子。根据常规方法将每种基因克隆至表达载体中，以获得由标记基因编码的蛋白质，并且可以通过常规方法从所获得的蛋白质产生这种抗体。
在本发明中，可以将抗体解释为能够通过与怀疑患上退行性脑病的受试者的激活的c-src蛋白结合来抑制蛋白质激活的手段。作为具体例子，本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、具有抗原结合特性的抗体或其可以与c-src特异性结合的片段，以及所有免疫球蛋白抗体以及特殊抗体如人源化抗体。另外，抗体可以具有包括两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，或者包括抗体分子的功能性片段的部分形式。抗体分子的功能性片段是指至少具有抗原结合功能的片段，并且可以是Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。
如本文所用，术语“适配体”是指具有与预定靶分子的结合活性的核酸分子。适配体可以是RNA、DNA、修饰的核酸或其混合物，并且可以呈线性或环状形式。通常，已知，随着构成适配体的核苷酸序列的长度减小，化学合成和大量生产更容易，成本方面的优势很大，化学修饰更容易，体内稳定性更高，并且毒性更低。
在本发明中，可以将适配体解释为能够通过与激活的c-src蛋白结合来抑制蛋白质激活的手段。
如本文所用，术语“小分子”是指具有小分子量的有机化合物以及与生物聚合物如蛋白质结合以控制其功能的分子。它可以是天然获得的或人工合成的，并且可以抑制蛋白质的功能或干扰蛋白质间的相互作用，但不限于此。
出于本发明的目的，可以没有限制地使用任何小分子，只要其抑制激活的c-src蛋白的激活即可，并且所述小分子的具体例子是与激活的c-src结合以抑制其激活的分子，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物，其包含针对c-src的表达或激活的抑制剂。
如本文所用，术语“突触核蛋白病”是指神经退行性疾病，其特征在于α-syn聚集物在神经元、神经纤维或神经胶质细胞中的异常积累。
在本发明中，突触核蛋白病可以是帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)或多系统萎缩症(MSA)，但不限于此。
如本文所用，术语“神经退行性疾病”是指由神经细胞的损伤引起的疾病，并且估计衰老、遗传变异、应激和与去除细胞中的蛋白质的功能相关的问题将是神经退行性疾病发作的病因，但是其确切的病因仍未可知。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用药物组合物来抑制或延迟神经退行性疾病如突触核蛋白病发作的任何作用，所述药物组合物包含根据本发明的能够抑制c-src的表达或激活的药剂作为活性成分。
如本文所用，术语“治疗”意指可以通过施用药物组合物来改善或有益地改变患上或怀疑患上神经退行性疾病如突触核蛋白病的受试者的症状的任何作用。
根据本发明的针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂对突触核蛋白病的治疗效果可以通过针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂抑制α-突触核蛋白(α-syn)的聚集和/或迁移的功能来实现。
本发明的药物组合物可以按用于治疗突触核蛋白病的药物组合物的形式来制备，所述药物组合物还包含一般用于制备药物组合物的适当载体、赋形剂或稀释剂，并且所述载体可以包括非天然存在的载体。具体而言，药物组合物可以根据常规方法按以下形式来配制：口服配制品，如粉末、颗粒、片剂、胶囊、悬浮液、乳液、糖浆或气溶胶；外用制剂；栓剂；或无菌可注射溶液。
药物组合物中包括的载体、赋形剂或稀释剂的具体例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。
在配制品的情况下，药物组合物可以使用稀释剂或赋形剂如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或表面活性剂来制备。
用于口服施用的固体配制品可以包括片剂、丸剂、粉末、颗粒、胶囊等，并且可以通过将至少一种赋形剂(例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶等)混合来制备。除了简单的赋形剂以外，还使用润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉。
用于口服施用的液体配制品可以是悬浮液、口服液体和溶液、乳液、糖浆等，并且可以含有各种赋形剂，如润湿剂、甜味剂、香味剂、防腐剂等，以及水和液体石蜡(它们是常用的简单稀释剂)。
用于肠胃外施用的配制品可以包括灭菌的水性溶液、非水性溶液、悬浮液、乳液、冷冻干燥的制剂和栓剂。非水性溶液和悬浮液的例子包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯等。
栓剂基质的例子包括Witepsol、聚乙二醇、Tween 61、可可豆油、月桂脂、甘油明胶等。
根据本发明的药物组合物中可含有的用于抑制c-src的表达或激活的药剂的含量没有特别限制，并且基于最终组合物的总重量以重量计为约0.0001％至50％，更具体而言以重量计为0.01％至20％。
本发明的药物组合物可以以药学有效量来施用，并且术语“药学有效量”是指足以以适用于所有医药治疗的合理收益/风险比来治疗疾病的量，并且有效剂量水平可以根据多种因素而变化，所述因素包括疾病的严重程度，药物的活性，患者的年龄、体重、健康状况和性别，患者对药物的敏感性，根据本发明的组合物的施用时间、施用途径和排泄速率，治疗期，与所用组合物混合或与其同时使用的药物，以及制药领域熟知的其他因素。本发明的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂组合施用。考虑到这些因素，重要的是在不产生副作用的情况下施用足以实现最大功效的最小量。
另外，根据本发明的药物组合物的剂量(施用的量)可以由本领域技术人员根据使用目的、疾病的严重程度、患者的年龄、体重、性别、病历或用作活性成分的物质的类型来决定。例如，可以将药物组合物以约0.1ng/kg至约100mg/kg、具体而言约1ng/kg至约10mg/kg的剂量施用至成人。本发明的组合物的施用频率没有特别限制，并且可以将组合物一天施用一次，或者全天分为若干剂量。因此，剂量并非意图在任何方面限制本发明的范围。
在另一方面，本发明涉及预防或治疗突触核蛋白病的方法，其包括将针对c-src的表达或激活的抑制剂施用至受试者。
如本文所用，术语“受试者”旨在包括但不限于可能患上或已经患上突触核蛋白病的哺乳动物(包括小鼠、家畜、人等)、养殖鱼类等。
本发明的用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物可以通过使得所述组合物能够到达靶组织的任何通用途径来施用。本发明的药物组合物没有关于其的特别限制，并且可以通过如下途径来施用：如腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、口服施用、鼻内施用、肺内施用和直肠施用。既然能够抑制c-src的表达或激活的药剂可在口服施用后被胃酸变性，口服组合物可以用活性药物包被或被配制以使其免于在胃中降解。另外，组合物可以使用能够将活性物质递送至靶细胞的任何装置来施用。
在另一方面，本发明涉及针对c-src的表达或激活的抑制剂用于治疗突触核蛋白病的用途。
在另一方面，本发明涉及针对c-src的表达或激活的抑制剂用于制备突触核蛋白病的治疗剂的用途。
在另一方面，本发明涉及筛选突触核蛋白病的治疗剂的方法，所述方法包括(i)用突触核蛋白病的治疗剂的候选物质处理源自神经组织的细胞，(ii)测量所述细胞中c-src蛋白的表达或激活的水平，并且(iii)选择候选物质，与未用所述候选物质处理的对照组相比，所述候选物质具有降低的c-src蛋白表达或激活水平。
在如上所述测量c-src蛋白的表达或激活水平的步骤(ii)中，可以没有限制地使用本领域中使用的测量表达水平的常规方法，并且测量方法可以选自免疫荧光、酶免疫测定(ELISA)、蛋白质印迹、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)和RT-PCR。
另外，用突触核蛋白病的治疗剂的候选物质处理的源自神经组织的细胞没有特别限制，并且可以是例如神经元或神经胶质细胞，并且它的其他例子包括神经胶质细胞，如小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、施万细胞(Schwann cell)和卫星细胞，并且优选地，源自神经组织的细胞是来自多巴胺能神经元细胞系SHSY5Y的细胞。
如本文所用，术语“突触核蛋白病的治疗剂的候选物质”是指预期能够治疗突触核蛋白病的物质，并且可以没有限制地是任何物质，只要预期其可直接或间接改善或减轻突触核蛋白病即可。突触核蛋白病的治疗剂的候选物质包括所有可预测的治疗物质，如化合物、基因或蛋白质。
本发明的筛选方法还可以包括在施用候选物质之前和之后确定c-src是否被激活，并且与施用候选物质之前相比在施用后c-src的激活被抑制时，确定所述候选物质是突触核蛋白病的治疗剂。
在另一方面，本发明涉及用于诊断突触核蛋白病的组合物，其包含能够测量c-src的激活水平的物质。
如本文所用，术语“能够测量c-src的激活水平的物质”是指能够确定c-src是否被磷酸化的药剂，并且出于本发明的目的，能够测量c-src的激活水平的物质是可以用于评价聚集的α-syn对细胞的影响的物质。所述物质没有特别限制，并且在具体例子中可以是能够与激活的c-src特异性结合的抗体或适配体。
如本文所用，术语“抗体”是指可以与蛋白质或肽分子的抗原位点特异性结合的蛋白质性分子。根据常规方法将每种基因克隆至表达载体中，以获得由标记基因编码的蛋白质，并且可以通过常规方法从所获得的蛋白质产生这种抗体。
出于本发明的目的，可以将抗体解释为能够通过与怀疑患上突触核蛋白病的受试者的激活的c-src蛋白结合来确定c-src蛋白是否被激活的手段。作为具体例子，本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、具有抗原结合特性的抗体或其可以与c-src特异性结合的片段，以及所有免疫球蛋白抗体以及特殊抗体如人源化抗体。
另外，抗体可以是包括两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，或者包括抗体分子的功能性片段的部分形式。抗体分子的功能性片段是至少具有抗原结合功能的片段，并且可以是Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv等。
如本文所用，术语“适配体”是指具有与预定靶分子的结合活性的核酸分子。适配体可以是RNA、DNA、修饰的核酸或其混合物，并且可以呈线性或环状形式。通常，已知，随着构成适配体的核苷酸序列的长度减小，化学合成和大量生产更容易，成本方面的优势很大，化学修饰更容易，体内稳定性更高，并且毒性更低。
出于本发明的目的，可以将适配体解释为能够通过与激活的c-src蛋白结合来确定c-src蛋白是否被激活的手段。
如本文所用，术语“诊断”是指检测病理状态的存在或特征的行为，并且出于本发明的目的，是指检测神经退行性疾病如突触核蛋白病的发作的行为，以及检测在治疗神经退行性疾病后受试者的复发过程、转移、药物反应性、抗性等的行为。
如本文所用，术语“受试者”包括但不限于马、犬、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼和鸟，并且意指任何动物(例如，人)。更广泛地，受试者包括但不限于动物的细胞系。
在另一方面，本发明涉及用于诊断突触核蛋白病的试剂盒，其包含组合物。
本发明的用于诊断突触核蛋白病的试剂盒可以包含用于直接测量α-突触核蛋白(用于诊断突触核蛋白病的标记)迁移至相邻细胞或用于测量由α-突触核蛋白激活的c-src的激活的引物或探针，或者用于选择性识别所述蛋白质的抗体，以及适合于测定方法的一种或多种类型的其他组成组合物、溶液或装置。
另外，本发明的试剂盒可以包含底物、适当的缓冲溶液、用显色酶或荧光物质标记的二抗、和用于抗体的免疫检测的显色底物。所述底物可以是硝酸纤维素膜、用聚乙烯树脂合成的96孔板、用聚苯乙烯树脂合成的96孔板、和用玻璃制成的载玻片，显色酶可以是过氧化物酶、碱性磷酸酶等，荧光物质可以是FITC、RITC等，并且显色底物可以是ABTS(2,2'-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或OPD(邻苯二胺)、TMB(四甲基联苯胺)，但不限于此。另外，为了分析蛋白质水平，所述方法可以包括蛋白质印迹、ELISA(酶联免疫吸附测定)、放射免疫测定(otA)、放射免疫扩散、欧氏免疫扩散(Ouchterlony immunodiffusion)、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS、蛋白质芯片等，但不限于此。
在另一方面，本发明涉及提供用于诊断突触核蛋白病的信息的方法，其包括使用用于诊断的组合物或试剂盒在从怀疑患有突触核蛋白病的受试者分离的生物样品中测量c-src的激活水平。
在另一方面，本发明涉及诊断突触核蛋白病的方法，其包括使用组合物或试剂盒在从怀疑患有突触核蛋白病的受试者分离的生物样品中测量c-src的激活水平。
在本发明中，在c-src激活水平与对照组相比增加时，确定发生了突触核蛋白病。
如本文所用，术语“样品”没有特别限制，只要其展现c-src的激活(用于诊断突触核蛋白病的参数)的差异即可，并且可以包括选自以下的至少一种：源自神经组织的细胞、全血、血清、血液、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴、脑脊液和间隙液，但不限于此。
在本发明中，用于测量c-src的激活的方法包括蛋白质印迹、共免疫沉淀测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、实时RT-PCR、电泳、组织免疫染色和荧光激活细胞分选仪(FACS)，但不限于此。
[实施例]
下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言明显的是，以下实施例的提供仅用于说明本发明，并且不应解释为基于本发明的主题限制本发明的范围。
实施例1：重组α-突触核蛋白(α-syn)和聚集的α-syn的制备
制备重组α-突触核蛋白(α-syn)和聚集的α-syn(KR 10-1838802)。重组α-Syn在大肠杆菌(E.coli)菌株BL21(DE3)中过表达，并且通过已知方法纯化重组蛋白(Lee,S.B.等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.381,39-43,2009)。将纯化的α-Syn蛋白储存在-80℃下直至将其作为单体α-Syn使用为止。将2mg/ml单体α-syn在250rpm的连续搅拌下在37℃下孵育2周，通过简单超声处理来消化，然后储存在-80℃下直至将其作为聚集的α-syn使用为止。如上所述制备的聚集的α-syn用于本发明的所有实施例中。
实施例2：SHP-1敲低(KD)的SHSY5Y细胞系和SHP-2敲低(KD)的SHSY5Y细胞系的产生
通过以下方法产生SHP-1表达抑制(敲低；KD)细胞系和SHP-2表达抑制(敲低；KD)细胞系。
SHP-1/2敲低的SHSY5Y是通过已知方法使用表达SHP-1/2的shRNA的慢病毒构建体(Sigma，圣路易，密苏里州)来产生(Yoon,S.等人,Cell Death Dis.5:e1494,2014)，并使用嘌呤霉素进行选择。
然后，通过蛋白质印迹使用SHP-1/2抗体测量所制备的SHP-1/2敲低的SHSY5Y细胞系中SHP-1/2的表达量，并且结果显示，SHP-1/2敲低的SHSY5Y细胞系中SHP-1/2的表达被有效降低。
实施例3：小鼠原代神经元和A53T杂合转基因小鼠的脑裂解物的制备
原代神经元是从一日龄C57BL6小鼠的大脑皮层分离并根据常规文献进行培养(CHA,S.H.等人,Mol Neurodegener.10:63,2015)以获得小鼠的原代神经元。
随后，通过以下方法获得A53T杂合转基因小鼠的脑裂解物，所述A53T杂合转基因小鼠是小鼠模型，其中A53T(在人体中表达的α-突触核蛋白(α-syn)的突变之一)在遗传修饰的小鼠(B6；C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J,M83；，Jackson Laboratory)中过表达。
从9月龄C57BL6 A53Tα-syn杂合转基因小鼠和对照C57BL6小鼠获得脑，如先前文献中所述(Lee,H.J.等人,Exp.Neurobiol.20:181-8,2011)。将脑半球置于600μl含有蛋白质抑制剂与磷酸酶抑制剂的混合物的冷RIPA缓冲液中并进行匀浆。将裂解物在4℃下孵育30分钟，然后以14,000rpm在4℃下离心30分钟。获得上清液并对其进行蛋白质印迹。
实施例4：通过聚集的α-syn增加的c-src激活
使用多巴胺能神经元细胞系(SHSY5Y细胞系)、实施例3的小鼠原代神经元和实施例3的小鼠脑裂解物研究凝集的α-syn对c-src的激活。
将SHSY5Y细胞系和小鼠原代神经元各自使用1μM聚集的α-syn培养10分钟，裂解并进行蛋白质印迹(图1A和图1B)。另外，通过蛋白质印迹对A53T TG小鼠的全脑裂解物与野生型WT C57BL6小鼠的那些全脑裂解物进行比较(图1C)。
蛋白质印迹是通过在冷RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 74，1％Nonidet P-40、0.25％脱氧胆酸钠、150mM NaCl)中裂解单独细胞来进行，所述冷RIPA缓冲液含有蛋白质抑制剂(2mM苯甲基磺酰氟、100μg/ml亮抑蛋白酶肽、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂、1μg/ml抑蛋白酶多肽和2mM EDTA)和磷酸酶抑制剂混合物(GenDEPOT，贝克，德克萨斯州)。在通过超声处理裂解细胞后，将裂解物以14,000rpm在4℃下离心30分钟，并获得上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒来测量蛋白质浓度。使用SDS-PAGE分离蛋白质，将其转移至硝酸纤维素膜，然后使用化学发光(ECL)系统(Thermo，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)进行可视化。
结果是，已确认聚集的α-syn增加c-src激活。
实施例5：通过SHP-1或SHP-2抑制对由聚集的α-syn介导的c-src激活的抑制
将SHSY5Y细胞系用作为SHP-1/2抑制剂的20μM NSC87877、作为SHP-1抑制剂的10μM SSG或作为SHP-2抑制剂的1μM PHPS-1预处理30分钟，并且使用1μM聚集的α-syn孵育10分钟，裂解并进行蛋白质印迹(图2)。
另外，将实施例2中产生的SHP-1敲低的SHSY5Y细胞系和SHP-2敲低的SHSY5Y细胞系用1μM凝集的α-syn处理并培养10分钟，裂解并进行蛋白质印迹(图3)。
结果是，已确认在将SHP-1或SHP-2敲低(抑制)时，由聚集的α-syn介导的src激活降低。
实施例6：c-src对α-syn迁移的作用
使用双室系统将过表达α-突触核蛋白的SHSY5Y细胞以4x104接种于12孔板的插入孔中，并且将SHSY5Y细胞系以4x104接种于盖玻片上。第二天，将插入孔转移至12孔盖玻片，并且在共培养12小时期间，将SHSY5Y细胞系用0.1μM塞卡替尼和10μM SKI(c-src激酶抑制剂I)(它们是c-src抑制剂)处理，然后对盖玻片上的SHSY5Y中的α-突触核蛋白进行免疫染色(α-syn：红色，核：蓝色)，并使用共聚焦显微镜观察以确认，α-突触核蛋白从过表达α-突触核蛋白的SHSY5Y迁移至不过表达α-突触核蛋白的SHSY5Y。
结果显示，在PBS对照组中观察到α-syn的迁移，但是α-syn的该迁移通过用塞卡替尼和SKI处理而降低(图4)。
随后，使用双室系统将使用SEQ ID NO:1和2的shRNA构建(使用慢病毒)的c-src敲低的SHSY5Y细胞系(KD#1和KD#2)和过表达α-syn的多巴胺能神经元细胞系SHSY5Y共培养12小时。将简要描述共培养。将SHSY5Y细胞以4x104个细胞/孔的浓度接种于12孔盖玻片上。孵育一天后，将其中接种过表达α-syn的SHSY5Y细胞的transwell转移至12孔盖玻片，在所述盖玻片上接种src敲低的SHSY5Y细胞，之后共培养12小时，进行免疫染色(α-syn：红色，核：蓝色)，并用共聚焦显微镜进行观察。
在正常对照组(NT；非靶向)SHSY5Y细胞系和c-src敲低的SHSY5Y组(具有受抑制的c-src表达的SHSY5Y)中α-syn的迁移的观察结果显示，α-syn的迁移通过抑制c-src表达而降低(图5)。
实施例7：c-src对α-syn单体变性为α-syn聚集物的影响
存在其中单体α-syn转化为聚集的α-syn的变性过程可能是帕金森病的主要病因的可能性。因此，使单体A53Tα-syn在SHSY5Y细胞系中过表达，并且确定c-src是否参与其中过表达的单体A53Tα-syn转化为聚集的A53Tα-syn的过程。
用eGPF标记的过表达A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系和用mcherry标记的过表达A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系各自以与实施例2中相同的方式使用慢病毒来产生。然后，将用eGPF标记的过表达A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系和用mcherry标记的过表达A53Tα-syn的SHSY5Y细胞系混合并共培养。在共培养的第5天，用共聚焦显微镜观察eGFP与mcherry在用eGFP标记的A53Tα-syn的细胞中的合并分布，并且也观察eGFP与mcherry在用mcherry标记的A53Tα-syn的细胞中的合并分布。
图6显示用作为c-src抑制剂的SKI和塞卡替尼处理所产生的SHSY5Y细胞系的共培养细胞的结果。另外，图7显示在将A53Tα-syn eGFP与A53Tα-syn mcherry共培养后的观察结果，其使用SEQ ID NO:1和2的shRNA抑制c-src表达。
使A53T eGFP在Src KD SHSY5Y(使用SEQ ID NO:1和2的shRNA)中过表达，并且通过FACS选择展现eGFP信号的细胞，培养，用50μM视黄酸处理，使其分化5天，然后用共聚焦显微镜成像。结果显示，在src的表达受抑制的细胞中，聚集的α-syn的量减少(图8A)。
另外，将过表达A53T eGFP的SHSY5Y各自用10μM c-src激酶抑制剂I(SKI)和0.5μM塞卡替尼处理，并用50μM RA(视黄酸)分化，并且用共聚焦显微镜观察聚集的α-syn。结果显示，在src的激活受抑制时，聚集的α-syn的量减少(图8B)。
最后，与正常对照组(NT；非靶向)相比，其中c-src表达受抑制的SHSY5Y细胞系在细胞外展现降低的A53Tα-syn eGFP的迁移(图9)。
实施例8：α-Syn突变体A53T的转基因小鼠中的α-syn迁移的观察
发现突变体小鼠中α-syn的迁移是由聚集的α-syn引起的。
作为模型小鼠，将过表达A53T(在人体中表达的α-突触核蛋白(α-syn)的突变之一)的8周龄至12周龄转基因小鼠(B6；C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J,M83；，JacksonLaboratory)通过以每20g体重200μl的剂量向其施用Evertin来麻醉，然后将其固定至立体定位手术仪器，然后基于小鼠的前囟点在前侧1.0mm、右侧1.8mm和3.0mm深的坐标使用Hamilton注射器将聚集的α-syn以10μg的剂量注射至小鼠纹状体中(图10)。
然后，在护理3天后，在总计4周内每天一次以10mg/kg的浓度口服施用塞卡替尼。然后，通过以每20g体重200μl的剂量施用尿烷来麻醉小鼠，切开胸腔，使灌注液流经左心室3分钟以切开右心房，去除血液，并通过使4％甲醛流动3分钟来固定小鼠的组织。然后，取出脑，在4％甲醛固定剂中浸没一天，然后脱水直至其沉降至30％糖水的底部。然后，在观察到脑沉降至底部时，将脑装载于固定板上，并且用OCT复合物使复合物在-20℃下冷冻，然后在-80℃下再次冷冻30分钟，以产生厚度为35μm的脑切片。将脑切片储存在组织储存液中。
在使用脑切片进行组织免疫染色时，取出脑切片并用PBS洗涤三次持续10分钟(下文中，在与每种特定溶液反应后，洗涤三次)，然后用3％过氧化氢溶液经5分钟去除组织中的过氧化物酶。在洗涤并用封闭溶液(1％BSA、0.2％Triton X-100)封闭1小时后，使靶向聚集的α-syn的pSyn#64一抗(wako#01525191)以1:5,000的浓度反应，并且使二抗以1:5,000的浓度反应，使附着至组织的抗体与ABC复合物反应，然后用3'3-二氨基联苯胺诱导颜色反应。然后，使组织附着至微玻璃，干燥，并用100％、70％和20％乙醇水合，然后将核用苏木素染色，并依次在70％、80％、90％和100％乙醇中脱水。然后，使组织与二甲苯反应约一天，将其置于玻璃上，在其上放置封固溶液，并用盖玻片覆盖所得物，并且使用解剖显微镜在400x的放大率下分析。
通过上述方法获得其中将10μg聚集的α-syn和PBS各自施用至α-Syn突变体A53T的转基因小鼠持续4周的组和其中施用聚集的α-syn并每天以10mg/kg注射塞卡替尼的组的脑组织，然后通过DAB染色方法将路易体染色，并且观察每个部位的α-syn的迁移。结果显示于图10(A)中。图10(B)和(C)是显示脑组织中每个区域的α-syn迁移程度的图像和图表。
实施例9：通过抑制c-src表达或激活降低α-syn迁移的确定
从大鼠TP18(妊娠第18天的胎鼠)分离皮层，并将原代神经元在神经基础培养基中培养14天。在第14天，使用慢病毒(使用NT和src KD#1病毒)抑制src的表达。
为了确认c-src表达抑制对α-syn迁移的作用，在使过表达A53T eGFP的SHSY5Y在50μM RA(视黄酸)中分化5天后进行双室测定。为了确认c-src激活抑制对α-syn迁移的作用，在第14天将原代神经元用10μM SKI和0.5μM塞卡替尼处理，并进行双室测定。
结果显示，当在原代神经元培养物中使用慢病毒抑制c-src的表达时，α-syn的迁移降低(图11(A))。另外，已发现，用c-src抑制剂处理降低α-syn的迁移(图11(B))。
实施例10：c-src激活程度对α-syn迁移的作用
在SHSY5Y中过表达模拟物、WT c-src GFP、CA(Y527F，激酶活性突变体形式)c-srcGFP或DA(K295F，激酶死亡突变体形式)c-src GFP之后，确定α-syn迁移的程度。
结果显示，与不过表达WT和CA的细胞相比，在过表达WT和CA的细胞中，α-syn迁移的程度增加(图12)。也就是说，已发现，α-syn的迁移与c-src的激活程度成比例地增加。
工业实用性
本发明的针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂能够抑制通过阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)迁移至相邻细胞引起的信号传导，从而降低α-Syn对相邻细胞的细胞毒性作用并抑制单体α-syn变性为聚集的α-syn(这可能是突触核蛋白病的主要病因)，因此可用作突触核蛋白病的治疗剂。
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，本说明书是为了阐述用于说明性目的的优选实施方案而提供，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表自由文本
附有电子文件。
<110> 亚洲大学校产学协力团
<120> 预防或治疗突触核蛋白病的包含C-SRC的表达或活性抑制剂的药物组合物
<130> PP-B2232
<150> KR 10-2018-0066005
<151> 2018-06-08
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shRNA
<400> 1
ccgggctcgg ctcattgaag acaatctcga gattgtcttc aatgagccga gctttttg 58
<210> 2
<211> 58
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> shRNA
<400> 2
ccgggacaga cctgtccttc aagaactcga gttcttgaag gacaggtctg tctttttg 58

Claims (15)

1.一种用于抑制阿尔法-突触核蛋白(α-突触核蛋白；α-syn)的聚集和/或迁移的组合物，所述组合物包含针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中针对所述c-src蛋白的表达的所述抑制剂选自可以与c-src基因的mRNA互补结合的miRNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸及其组合。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述shRNA由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列表示。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中针对所述c-src的激活的所述抑制剂选自可以与所述c-src蛋白互补结合的抗体、适配体、小分子及其组合。
5.一种用于预防或治疗突触核蛋白病的药物组合物，所述药物组合物包含针对c-src蛋白的表达或激活的抑制剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述突触核蛋白病是帕金森病(PD)、路易体痴呆(DLB)或多系统萎缩症(MSA)。
7.一种筛选突触核蛋白病的治疗剂的方法，所述方法包括：
(i)用突触核蛋白病的治疗剂的候选物质处理源自神经组织的细胞；
(ii)测量所述细胞中c-src蛋白的表达或激活水平；并且
(iii)选择候选物质，与未用所述候选物质处理的对照组相比，所述候选物质具有降低的c-src蛋白表达或激活水平。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述源自神经组织的细胞是多巴胺能神经元细胞系SHSY5Y。
9.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(ii)中所述c-src的表达或激活水平是通过选自以下的任何一项来测量：免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、流式细胞术(FACS)、免疫组织化学、免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)和RT-PCR。
10.一种用于诊断突触核蛋白病的组合物，所述组合物包含能够测量c-src的激活水平的物质。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中能够测量c-src的激活水平的所述物质是可以与激活的c-src特异性结合的抗体或适配体。
12.一种用于诊断突触核蛋白病的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求10所述的组合物。
13.一种提供用于诊断突触核蛋白病的信息的方法，所述方法包括使用根据权利要求10所述的组合物或根据权利要求12所述的试剂盒在从怀疑患有突触核蛋白病的受试者分离的生物样品中测量c-src的激活水平。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在c-src的激活水平与对照组相比增加时，确定发生了突触核蛋白病。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物样品包含选自以下的至少一种：源自神经组织的细胞、全血、血清、血液、血浆、唾液、尿液、痰、淋巴、脑脊液和间隙液。
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