CN111494054B - 可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用，该构建方法包括：S1、暴露T13椎板，剪开黄韧带显露硬脊膜；S2、定量压迫T13硬脊膜，以使得脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻；S3、去除椎板及压迫物进行减压，以使得硬膜下脑脊液重新恢复。本发明通过显微手术将定量棉条填充到大鼠T13椎板内侧，通过硬膜外压迫阻断脑脊液流动，使得大鼠出现脊髓空洞，之后手术解除压迫，逆转脊髓空洞，实现了大鼠脊髓空洞逐渐减少，该方法建立了一个可逆非生化破坏引起的脊髓空洞症的动物模型，且实现了MRI动态观察动物脊髓空洞症的可行性验证,本发明构建的空洞为可逆性空洞，为脊髓空洞及脊髓损伤的相关研究提供了模型基础。
Description
技术领域
本申请涉及动物模型构建技术领域，具体而言，特别涉及一种可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用。
背景技术
脊髓空洞症是由脑脊液动力学紊乱造成的一种脊髓形态学病变，分为交通性和非交通性脊髓空洞，前者多见于Chiari畸形，后者多见于脊髓损伤、肿瘤及炎症等。Chiari畸形患者小脑扁桃体向下疝入枕大孔，造成枕大孔相对狭窄，阻碍四脑室、椎管蛛网膜下腔和脊髓中央管内的脑脊液循环，最终导致脊髓中央管的局部扩大。脊髓损伤中，局部损伤导致自身免疫破坏脊髓实质，进而形成实质内的空洞。肿瘤及炎症可以导致蛛网膜下腔阻塞或粘连，阻碍脑脊液循环，导致中央管内与蛛网膜下腔脑脊液压力不相等，进而导致中央管扩张，形成空洞。MRI显示脊髓中央管内有一囊性高信号，并向周围挤压脊髓，形状似一空洞，因而得名“脊髓空洞”。脊髓空洞症是一种发病率较高的临床疾病，其致残率高，社会经济负担重。
目前关于脊髓空洞症的发病机制、临床转归研究尚不深入，尤其对于经手术解除致空洞因素后脊髓空洞及神经功能的转归机制尚不清楚。同时，脊髓空洞可导致脊髓神经功能受损，但程度相较典型的脊髓损伤(如外伤所致)更轻，脊髓实质破坏程度较轻。从疾病发生机制及转归看，脊髓空洞可视为一种破坏更小并在一定程度上可逆的脊髓损伤。
既往脊髓损伤相关研究均基于脊髓打击及横断模型，该研究方法具有很大局限性：①脊髓损伤程度很重，脊髓实质及室管膜区均严重破坏，内源性干细胞破坏严重，可能丧失大部分增殖、分化及迁移能力。②该模型为急性损伤模型，脊髓内发生急性炎症反应，微环境骤然变化，脊髓神经细胞及干细胞无法适应。③脊髓打击后不可逆，神经功能无法恢复，无法在体内观察脊髓损伤自然修复的过程，无法动态观察脊髓内源性神经干细胞的增殖、分化及迁移特性。因此有必要构思建立一种脊髓空洞动物模型，并以此为基础进行相关研究。
目前构建脊髓空洞的方法包括：①脊髓蛛网膜下腔注射高岭土，造成蛛网膜粘连，但高岭土为强致炎性物质，能迅速损伤脊髓细胞，引起免疫应答，破坏脊髓自身微环境。②脊髓实质内注射高岭土或使君子酸，通过破坏脊髓实质或致炎诱发空洞，但该方法会导致脊髓内炎症细胞明显增生，炎症是否会对ENSCs的生长造成影响，并未有研究对此进行探索。因此上述两种方法均存在较大的局限性，会对脊髓实质造成不可逆的损伤，破坏脊髓原有的生理环境，而不仅仅是脊髓空洞症的形成，这对脊髓空洞症的分子机制研究和治疗实验都有很大的不利影响。同时，上述两种方法构建的空洞均不可逆，无法模拟人类中Chairi畸形等梗阻性病变导致的压迫，及手术解除压迫后的恢复情况。此外，以往动物模型中形成的脊髓空洞主要位于脊髓实质，而非中央管。而在人类疾病中发现的大多数脊髓空洞症位于脊髓的中央管。
综合来说，目前尚无能够较好模拟人类脊髓空洞症的动物模型，严重制约了关于脊髓空洞及脊髓损伤的研究。因此，有必要进行探索并构建一种可逆性脊髓空洞动物模型。
发明内容
本发明旨在提供一种可逆性脊髓空洞动物模型及其构建方法和应用，该模型的成功建立为脊髓空洞及脊髓损伤的相关研究提供了可靠的模型基础。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种可逆性脊髓空洞动物模型构建方法，包括以下步骤：S1、暴露T13椎板，剪开黄韧带显露硬脊膜；S2、定量压迫T13硬脊膜，以使得脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻；S3、去除椎板及压迫物进行减压，以使得硬脊膜下脑脊液重新恢复。
根据本发明，步骤S1包括：S11、以T13椎板为中心，沿背部中部作皮肤纵向切口，长度约3厘米，分离皮下组织，剥离肌肉组织，暴露T13椎板；以及S12、分离T12-13椎板间隙，露出黄韧带，用止血钳提起T13棘突，沿T12-13椎板间隙中间位置剪开黄韧带，然后暴露透明的硬脊膜。
根据本发明，所述步骤S2中的定量压迫为物理压迫方式。
根据本发明，所述步骤S2包括剪开大鼠的黄韧带显露硬膜后，采用棉花称重定量压迫硬脊膜，以使得硬膜压平，脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻。
根据本发明，在所述步骤S2中，通过显微手术将定量的棉条填充到大鼠T13椎板内侧，通过硬膜外压迫阻断脑脊液流动。
优选地，在所述步骤S2中，将棉球手工塑形成长条，提起T13棘突，用显微神经剥离子将15mg的棉条从T12-13椎板间隙的黄韧带切口，轻轻塞入T13椎板下的硬膜外间隙，待棉条填满后，受压硬脊膜附着在脊髓上，脑脊液流动受阻。
根据本发明，所述步骤S2中对胸椎脊髓硬膜外定量压迫的压迫时间为4～8周；优选压迫时间为8周。
根据本发明，所述动物为啮齿动物、猫科动物、灵长类动物、犬科动物；优选为大鼠、小鼠、兔子、猴子。
根据本发明的另一方面，还提供了上述任一种方法构建得到的可逆性脊髓空洞动物模型。
根据本发明的又一方面，还提供了一种可逆性脊髓空洞动物模型在脊髓空洞症、脊髓损伤中的应用。
本申请具有如下有益效果：
本申请的模型避免了现有技术中脊髓打击和脊髓空洞模型的缺点，采用硬膜外定量棉条压迫法阻断脑脊液流动，模拟人类疾病中脑脊液循环阻塞的致病因素，同时利用MRI观察脊髓空洞的动态变化，并对脊髓空洞进行病理切片、染色、MRI等综合评价，验证模型建立成功。此外，通过手术解除压迫和脑脊液流动障碍，观察脊髓空洞的转归，模拟脊髓空洞症患者接受手术后的转归。
本发明具有如下显著优势：①建模方法具有可逆性，能较好地模拟Chairi畸形、椎管内肿瘤等梗阻性病变导致的压迫，及手术解除压迫后空洞的恢复。②不对脊髓实质进行明显破坏，不会破坏干细胞巢——室管膜区，不会导致脊髓内炎症细胞增生，不会对ENSCs的生长微环境造成较大影响。该模型的成功建立为脊髓空洞及脊髓损伤的相关研究提供了可靠的模型基础。
附图说明
图1为可逆性脊髓空洞动物模型手术过程示意图。
图2为本发明的实验组和对照组MRI验证脊髓空洞形成示意图。
图3为病理切片中中央管与脊髓面积比值示意图。
图4为切除椎板及去除棉条后以及4周和8周后脊髓空洞变化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明做进一步的详细说明。需要强调，此处描述的具体实施例仅用于更好的阐述本发明，为本发明部分实施例，而非全部实施例，所以并不用作限定本发明。此外，下面描述的本发明实施例中涉及的技术特征，只要彼此间未构成冲突，即可以相互组合。
如图1-4所示，本发明提出了一种可逆性脊髓空洞动物模型构建方法，包括以下步骤：1)暴露T13椎板，剪开黄韧带显露硬脊膜；2)定量压迫T13硬脊膜,以使得脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻；3)去除椎板及压迫物进行减压，以使得硬膜下脑脊液重新恢复。
本申请中的动物可以为啮齿动物、猫科动物、灵长类动物、犬科动物。优选动物为大鼠、小鼠、兔子、猴子。
作为优选，在剪开黄韧带显露硬膜后，采用物理压迫方式进行定量压迫。更优选地，使用棉花称重精确压迫硬脊膜。优选地，显微镜下进行腰椎脊髓硬膜外定量压迫4-8周后，自然形成较长节段的中央管扩张型脊髓空洞，此时给予骨性减压及解除压迫，4周后，部分空洞随之而减小并逐渐消失。
脊髓空洞症是一种常见的脊髓损伤，以往的脊髓空洞动物模型是通过注射生化损伤物质或撞击脊髓建立的，导致脊髓实质空洞，对脊髓造成不可逆的严重损伤，不适合研究脊髓的细胞和分子机制。本申请通过显微手术将定量的棉条填充到大鼠T13椎板内侧，通过硬膜外压迫阻断脑脊液流动，中央管扩张并形成压迫部位头端出现脊髓空洞。在8周后MRI显示82.5％大鼠出现脊髓空洞，脊髓空洞位于脊髓中央，呈串珠状，与人类最常见的脊髓空洞极为相似。脊髓空洞压迫脊髓实质，但syrinx周围脊髓组织解剖结构完整，脊髓实质未见炎性细胞增生。解除压迫后，脊髓空洞症有不同的转归，这与临床上非常相似。证实了脑脊液流通障碍可导致脊髓空洞症，为慢性硬膜外压迫所致脊髓空洞症动物模型的建立提供了一种可复制的动物模型。后续进行手术以解除压迫，逆转脊髓空洞诱导操作，大鼠脊髓空洞逐渐减小，在世界上首次建立起可逆性脊髓空洞动物模型，并通过MRI、病理学等进行了验证,为未来的研究提供模型基础。本申请构建的空洞为可逆性空洞，为脊髓空洞及脊髓损伤的相关研究提供了模型基础。
下面结合具体实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1:大鼠模型
采用中国首都医科大学宣武医院动物房的50只雌性8周龄Sprague-Dawley大鼠作为受试者进行研究，大鼠体重从230克到280克不等。实验组为40只大鼠，接受硬膜外压迫手术。对照组10只行假手术。全麻采用恩氟烷、一氧化二氮和氧气混合麻醉。麻醉诱导在麻醉室内进行，剂量为2％的恩氟烷，含70％的一氧化二氮和30％的氧气。术中使用大鼠呼吸面罩维持麻醉。
大鼠取俯卧位，四肢固定于36℃恒温操作床，剃掉背部毛发后，取1％碘伏溶液用于皮肤消毒。以T13为中心，沿背部中部作皮肤纵向切口，长度约3厘米。仔细分离皮下组织，剥离肌肉组织，暴露T13椎板。仔细分离T12-13椎板间隙，露出黄韧带，然后用止血钳轻轻提起T13棘突，用显微剪沿T12-13椎板间隙中间位置剪开黄韧带。然后暴露透明的硬脊膜。
无菌吸水棉球使用电子分析天平称重(测量范围:1mg～120g)。该棉球为广泛使用的无菌脱脂棉球，不局限于特定生产商。将棉球手工塑形成长条，提起T13棘突，用显微神经剥离子将15mg的棉条从T12-13椎板间隙的黄韧带切口，轻轻塞入T13椎板下的硬膜外间隙。此过程注意不要让剥离子直接接触硬脊膜，因为硬脊膜非常薄，手术过程中，硬脊膜必须完好无损。因为一旦破裂，脑脊液马上大量流出。棉条完全填满后，可见受压硬脊膜附着在脊髓上，脑脊液流动受阻。用生理盐水冲洗后，缝合肌肉和皮肤。对照组10只大鼠假手术，暴露T12-13椎板间隙及硬脊膜，未填塞棉条。所有手术均按照无菌操作原则，在Carl Zeiss手术显微镜下进行。术后2天腹腔注射头孢呋辛预防感染。
在体磁共振成像
所有大鼠术后4周和8周进行了MRI扫描。在体MRI采用7.0特斯拉核磁共振扫描仪(PharmaScan 7T,Bruker公司，Karlsruhe，德国)。快速全身定位扫描后，以手术区域为中心，采用抑脂序列获取矢状位和轴位T2加权像。在轴位T2加权像上，测量脊髓空洞最大位置的前后径，测量同一水平脊髓前后径，计算中央管与脊髓直径之比，以评估MRI中脊髓空洞的大小。
术后8周，实验组和对照组均采用腹腔注射过量戊巴比妥钠(150mg/kg)处死。动物处死后，用4％多聚甲醛灌注后将整个脊柱取出，4％多聚甲醛固定24小时。仔细取出胸腰段脊髓(长约6cm)，保持脊髓的完整。按照常规方法进行石蜡包埋、切片。使用标准操作进行HE染色。在HE染色切片上测量脊髓空洞最大处的中央管面积和脊髓面积，计算中央管与脊髓面积之比。
椎板切除和去除压迫手术
常规麻醉、消毒，按上述方法放置体位，切开第一次手术部位的皮肤、筋膜和肌肉，暴露T13椎板。使用高速磨钻将T13椎板磨除。棉条完全暴露后，用显微镊和显微剪小心地剪开。不要损伤硬脊膜。这样T13椎板和棉花被去除，创造足够的空间来恢复脑脊液的流动。透明硬脊膜下可见蛛网膜下腔中脑脊液重新恢复，说明减压成功。减压4、8周后，进行MRI扫描，观察脑脊液恢复流动情况及脊髓空洞的变化。
本申请采用40只大鼠行脊髓空洞诱导术，T13椎板下填充15mg棉条压迫脊髓硬膜外间隙，阻断脑脊液流动。10只老鼠接受了假手术。
实验组在硬膜外压迫后，第4周和第8周分别有27只(67.5％)和33只(82.5％)大鼠在T2加权MRI上表现为脊髓空洞症，而假手术对照组未见脊髓空洞。在所有患有脊髓空洞症的大鼠中，空洞均位于压迫部位的头端，大约在T10-12之间，长度2-3个脊髓节段。空洞位于脊髓的中央，呈串珠样。实验组中央管与脊髓直径之比第4周时为0.088±0.070，在8周时增加到0.168±0.102。实验组与对照组在两个时间点上均有统计学差异(P<0.0001)。可见，经脊髓空洞诱导手术后，会在脊髓中央形成，并逐渐增大，在我们的结果中，最大的空洞直径达到了32％的脊髓直径。
此外，我们在病理切片上测量了所有大鼠8周时中央管与脊髓面积的比值，以评估空洞的大小，结论表明实验组中央管明显扩张。在8周的脊髓空洞诱导实验中，中央管面积增加了53倍。以中央管区扩大5倍为脊髓空洞形成的标准，90％的大鼠成功诱导脊髓空洞形成，甚至高于MRI阳性率。病理切片均为中央管扩张形成的脊髓空洞。硬脊膜、蛛网膜、脊髓表面无瘢痕形成。脊髓形态完整，脊髓外表面、前正中及后正中沟未见损伤。
此外我们对形成了空洞的大鼠切除了椎板并解除压迫，以实现脊髓空洞诱导术的可逆。术中可见解除压迫后脑脊液重新充盈满蛛网膜下腔，脑脊液流动恢复，显示空洞诱导是可逆的。在短期随访中，术后MRI显示50％大鼠空洞逐渐减小，而50％大鼠空洞逐渐增加，这与人类脊髓空洞解除致空洞因素后空洞的转归非常相似，提示该模型可很好模拟人类疾病。
图1展示了可逆性脊髓空洞动物模型手术过程图。a为俯视图：将大鼠置于俯卧位，通过T12-13椎板间隙向T13椎板下填充棉条。b为侧视图：填充棉条后，脊髓部分受压，脑脊液流动受阻。c为轴位图，棉条位于T13椎板下方，使蛛网膜下腔空间缩小，脑脊液流动受阻。
图2为实验组和对照组MRI验证脊髓空洞形成。a,b,c为矢状位MRI，显示从0到8周，脊髓空洞出现并逐渐增大。d,e,f为轴位MRI，显示脊髓空洞位于中央管，并逐渐增大。g为中央管直径与脊髓直径的比值测定方法。n/m表示MRI上中央管与脊髓的比值。实验组与对照组4、8周时中央管与脊髓的比值见h图。实验组在术后4、8周时比值持续升高，4周时达到0.088±0.070,8周时达到0.168±0.102。这说明了使用硬膜外棉条压迫可以有效诱导脊髓空洞形成，并随着时间推移逐渐增大。对照组所有大鼠MRI均未见中央管成像，比值均为0。第4、8周时，实验组与对照组的比值有统计学差异。****代表P<0.0001。
图3为病理切片中中央管与脊髓面积比值。位于内部的中央管用虚线勾画，面积计算为中央管的横截面积(S1)。脊髓的外边界用虚线勾画，面积的计算代表脊髓的横截面积(S2)。中央管与脊髓面积之比＝S1/S2。b为8周时，实验组中央管面积与脊髓面积之比为0.0287±0.0204，对照组为0.000538±0.000145，这说明了使用硬膜外棉条定量压迫后，大鼠脊髓中央管扩张形成脊髓空洞。****代表P<0.0001。
图4为切除椎板及去除棉条后空洞减小，减压4周后(b)，T13椎板和棉条消失，脊髓空洞缩小。减压8周后(c)，脊髓空洞进一步缩小，几乎消失。
本发明通过显微手术将定量的棉条填充到大鼠T13椎板内侧，通过硬膜外压迫阻断脑脊液流动，进而引起中央管扩张形成脊髓空洞。8周时82.5％大鼠MRI显示有脊髓空洞，位于脊髓中央，呈串珠状，与人类最常见的脊髓空洞极为相似。中央管与脊髓面积之比达0.0287±0.0204，而对照组为0.000538±0.000145，然后切除T13椎板，取出棉条，解除压迫后，脑脊液流动恢复，脊髓空洞有不同的转归。本发明为慢性硬膜外压迫所致脊髓空洞症动物模型，并且操作具有可逆性，为疾病机制的研究和治疗提供了一种可复制的动物模型。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.一种可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、暴露T13椎板，剪开黄韧带显露T13硬脊膜；
S2、定量压迫T13硬脊膜，以使得脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻；
S3、去除T13椎板及压迫物进行减压，以使得硬膜下脑脊液重新恢复；
所述步骤S1包括：
S11、以T13椎板为中心，沿背部中部作皮肤纵向切口，长度约3厘米，分离皮下组织，剥离肌肉组织，暴露T13椎板；以及
S12、分离T12-13椎板间隙，露出黄韧带，用止血钳提起T13棘突，沿T12-13椎板间隙中间位置剪开黄韧带，然后暴露透明的硬脊膜；
所述步骤S2包括剪开大鼠的黄韧带显露硬膜后，采用棉花称重定量压迫硬脊膜，以使得硬膜压平，脑脊液被挤向周围，脑脊液循环受阻；
在所述步骤S2中，通过显微手术将定量的棉条填充到大鼠T13椎板内侧，通过硬膜外压迫阻断脑脊液流动。
2.根据权利要求1所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，所述步骤S2中的定量压迫为物理压迫方式。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将棉球手工塑形成长条，提起T13棘突，用显微神经剥离子将15mg的棉条从T12-13椎板间隙的黄韧带切口，轻轻塞入T13椎板下的硬膜外间隙，待棉条填满后，受压硬脊膜附着在脊髓上，脑脊液流动受阻。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，所述步骤S2中对胸椎脊髓硬膜外定量压迫的压迫时间为4～8周。
5.根据权利要求4所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，压迫时间为8周。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，所述动物为啮齿动物、猫科动物、灵长类动物、犬科动物。
7.根据权利要求6所述的可逆性脊髓空洞动物模型建立方法，其特征在于，所述动物为大鼠、小鼠、兔子、猴子。
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