CN101301227A - 大鼠硬脊膜外腔和蛛网膜下腔置管方法 - Google Patents
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Abstract
大鼠硬脊膜外腔和蛛网膜下腔置管方法。本发明在置管过程中，利用勾针将脊柱提起，从而可以不必剥离脊柱旁边的肌肉和筋膜等组织就能充分暴露胸9与胸10之间的椎间隙；利用胸8－9之间的椎板间天然小孔，用勾针将脊柱提起，从而不需要剥离和剪除脊柱两旁的肌肉就能充分暴露椎间小孔，且不需要钳咬椎骨就能准确地较长时间置管于鼠硬脊膜外腔；在进行鼠蛛网膜下腔置管时，也只需钳咬掉天然椎间小孔周边少许骨性组织。本发明之大鼠硬脊膜外和蛛网膜下腔置管方法，具有操作简便、对动物伤害性较小、定位准确和置管成功率高的优点。可应用于该类新药研发过程中，临床前药效学、药理学及毒理学等各类动物实验。
Description
技术领域
本发明涉及一种大鼠硬脊膜外腔和蛛网膜下腔置管方法。
背景技术
从天然毒素中提取活性物质尤其是活性多肽、蛋白质类物质，并开发成药物，是当前医学和生物学界的研究热点。但在天然活性多肽、蛋白质类新药开发研究中，需要对实验动物的硬脊膜外腔和蛛网膜下腔置管用药，而实验动物的硬脊膜外腔和蛛网膜下腔置管用药(尤其是长期置管用药)问题一直未得到有效解决。
本发明者在2002年参考人类硬脊膜外腔和蛛网膜下腔临床穿刺法和x线造影术定位，并根据动物的不同种类和差异进行适配和改进，建立了大动物(兔、犬、猴)脊髓硬膜外腔和蛛网膜下腔短、长期(＞5个月)置管方法，保证了本单位拥有我国自主知识产权的国家I类镇痛新药虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I)的药效学、药理学和毒理学实验研究圆满完成。
大白鼠是医学和生物学研究中最常用的实验动物之一，由于其具有与人类较高的相似性以及操作、饲养方便和价格较为经济的特点，广泛应用于各类动物实验。以往国内外少数实验室仅能进行大白鼠蛛网膜下腔短期置管，采用的方法主要有两种：一种是Yaksh等人建立的枕骨大孔置管法，另一种为我国陈军博士等人改进的胸椎咬骨置管法。这些方法操作较复杂，对动物伤害较大，置管时间短且成功率不够高。
发明内容
本发明的目的在于为天然活性多肽、蛋白质类新药研究和开发，提供一种损伤性小、定位准确和操作简便的小动物(大鼠)硬脊膜外和蛛网膜下腔置管方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明者通过研究发现，作为动物实验中的小动物类，如大鼠的椎管结构尽管细小，其组织结构和椎管的负压特征均不明显，但其硬脊膜外和蛛网膜下腔置管部位的定位仍然可以像较大动物一样，采用临床造影技术和x线监测来确定；并且，在置管过程中可以利用勾针将脊柱提起，从而可以不用剥离脊柱旁边的肌肉和筋膜等组织就能充分暴露胸9与胸10之间的椎间隙，使置管过程伤害性更小，操作更简便，准确性和成功率更高；此外，本发明者利用胸8-9之间的椎板间天然小孔，用勾针将脊柱提起，从而不需要剥离和剪除脊柱两旁的肌肉就能充分暴露椎间小孔，且不需要钳咬椎骨就能准确地较长时间置管于鼠硬脊膜外腔；在进行鼠蛛网膜下腔置管时，也只需钳咬掉天然椎间小孔周边少许骨性组织。
本发明包括胸椎插入和枕骨大孔插入法，前者适宜于短期置管法，后者适宜于长期置管法，现分述于下。
一、大鼠硬脊膜外腔置管法
(一)胸椎置管法
(1)使实验动物处于麻醉状态下，操作者用手指在麻醉动物的背部沿头端向尾部触摸胸椎的棘突，胸椎区域最突出的棘突为胸8。以此为中心，用毛剪将面积为8-12cm2范围内的鼠毛剪净，用络合碘棉签擦拭消毒此皮肤区域2-3次；(2)在无菌条件下进行以下操作：以胸8棘突为中心，平行于脊柱做一个约1-2厘米长的皮肤切口，用开口器依次张开皮肤和皮下脂肪，清楚地暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移动张开器，通过辨认肌腱连接点来确定胸13肋，然后从头端方向上数找到胸9与胸10之间的椎间隙；(4)用勾针从脊柱侧面扎进胸10棘突内，向上提起脊柱，充分暴露胸9与胸10之间的椎间隙；(5)靠近胸10棘突前沿，在胸9与胸10棘突之间，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的横切口，暴露椎管外侧附着的白色骨膜；(6)用勾针轻轻挑开骨膜，看到位于胸8与胸9椎间隙之间的一个椭圆形小孔，通过该孔可看到乳白色的脊髓随呼吸起伏；(7)用眼科镊子夹住专用PE-10聚乙烯管(总长5-7cm)，先通过一肌肉隧道，然后顺椎管腔使之插入硬脊膜外腔，插入深度为1.5-2.0cm，至脊髓腰膨大处。PE-10管预先在1.5-2.0cm处用封口膜缠成一个小结球以控制插入深度；(8)将小结球缝合固定在切口处肌肉上，络合碘擦拭消毒切口处肌肉、皮肤，依次缝合切开的肌肉和皮肤层，用淋巴造影针将少量的0.9％NaCl注射液通过PE-10管开口端注入留置的PE-10管内，以防PE-10管被组织液堵塞，加热封闭PE管开口，并于大鼠腿部肌肉处注射抗感染药物，以避免伤口感染。
药物注射方法：将受试药品溶于生理盐水中，用淋巴造影针通过留置的PE-10管注入鼠脊髓硬脊膜外腔中，注射体积为：1ul/10g鼠体重，再用10ul 0.9％NaCl注射液冲洗PE-10管。
置管部位的定位采用造影技术和x线监测确定。将麻醉动物固定于底板上，头部朝上置于x线机透视台上。用玻璃微量注射器针尖插入留置的PE-10管内，缓慢均匀注入造影剂如碘必乐250μl。在x线监控下，可见造影剂呈不典型的“圆锥形”沉积于硬脊膜外腔。
(二)枕骨大孔置管法
使实验动物处于麻醉状态下，于枕骨下沿背正中线切1.2-1.8cm长的切口，暴露第一颈椎，暴露寰枕后膜，将蛛网膜小心勾破一小孔，插入PE10管至蛛网膜下腔，PE10管进管深度6-8cm，至脊髓腰膨大处。外端留4-6cm长，埋管，缝合切口。其余操作步骤与(一)胸椎置管法相同。
二、大鼠蛛网膜下腔置管法
(一)胸椎置管法
与硬脊膜外腔置管法基本相同。当暴露位于胸8与胸9之间的椭圆形小孔后，用眼科小剪刀通过该椭圆形小孔插入椎管中，小心剪去圆孔周边骨性组织，略为扩大该圆孔，以充分暴露脊髓；用勾针勾破硬脊膜，此时可见少许清亮脑脊液流出；用眼科镊夹住专用PE-10管先通过一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜孔插入大鼠蛛网膜下腔，插入深度约为1.5-2.0cm，直达脊髓腰膨大处；其余操作步骤与“一、大鼠硬脊膜外腔置管法(一)胸椎置管法”相同。
将麻醉动物固定于手术板，头部朝上置于x线机透视台上。用玻璃微量注射器插入留置的PE-10管内，缓慢均匀注入造影剂碘必乐250μl。在x线监控下，可见到造影剂在推管内呈细柱状分布于蛛网膜下腔。
(二)枕骨大孔置管法
操作方法与所述“一、大鼠硬脊膜外腔置管法(二)枕骨大孔置管法”基本相同。只是暴露寰枕后膜，不需将其勾一小孔，沿着寰枕膜插入PE-10管至蛛网膜下腔，PE-10管进管深度6-8cm，至脊髓腰膨大处。外端留4-6cm长，埋管，缝合切口。其余操作及造影剂图像同前述“一、大鼠硬脊膜外腔置管法(二)枕骨大孔置管法”。
本发明之大鼠硬脊膜外和蛛网膜下腔置管方法，具有操作简便、对动物伤害性较小、定位准确和置管成功率高的优点。
本发明置管方法，可解决活性多肽和蛋白质新药研究开发的动物实验用药途径问题。可应用于该类新药研发过程中，临床前药效学、药理学及毒理学等各类动物实验。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：大白鼠硬脊膜外腔胸椎置管法实施例
(1)使大白鼠于麻醉状态下，操作者用手指在麻醉动物的背部沿头端向尾部触摸胸椎的棘突，胸椎区域最突出的棘突为胸8，以此为中心，用毛剪将直径约5×2cm范围内的鼠毛剪净，用络合碘棉签擦拭消毒此皮肤区域3次；(2)在无菌条件下，以胸8棘突为中心，平行于脊柱做一个约1.5厘米长的皮肤切口，用开口器依次张开皮肤和皮下脂肪，清楚地暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移动张开器，通过辨认肌腱连接点确定胸13肋，然后从头端方向上数找到胸9与胸10之间的椎间隙；(4)用勾针从脊柱侧面扎进胸10棘突内，向上提起脊柱，充分暴露胸9与胸10之间的椎间隙；(5)靠近胸10棘突前沿，在胸9与胸10棘突之间，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的横切口，暴露椎管外侧附着的白色骨膜；(6)用勾针轻轻挑开骨膜，看到位于胸8与胸9椎间隙之间的一个椭圆形小孔；(7)用眼科镊子夹住专用PE-10聚乙烯管(总长6cm)，先通过一肌肉隧道然后顺椎管腔使之插入硬脊膜外腔，插入深度为1.8cm，至脊髓腰膨大处，PE-10管预先在1.8cm处用封口膜缠成一个小结球以控制插入深度；(8)将小结球缝合固定在切口处肌肉上，络合碘擦拭消毒切口处肌肉、皮肤，依次缝合切开的肌肉和皮肤层，用淋巴造影针将少量0.9％NaCl注射液通过PE-10管开口端注入留置的PE-10管内，以防PE-10管被组织液堵塞，加热封闭PE管开口，并于大鼠腿部肌肉处注射16万单位青霉素。
使用本实施例置管法研究多肽类神经毒素HWTX-I经大鼠脊髓硬脊膜外腔用药对福尔马林结肠壁(c.w.)粘膜下注射诱导的大鼠急性炎性内脏疼痛的抑制性效应。实验过程为：5％福尔马林溶液150μl快速注入SD大鼠乙状结肠壁粘膜下层，产生几种可评估的反映内脏疼痛的固定性行为。在此伤害性刺激反应前30分钟，经留置的PE-10导管向大白鼠硬脊膜外腔分别注入各待测药品和试剂，观察其对该模型疼痛行为的影响。与生理盐水阴性对照组比较，美国同类镇痛新药ω-芋螺毒素CTX-MVIIA(硬脊膜外腔给药)和吗啡(肌肉注射给药)两个阳性对照组比较，10，20，50，75和100μg/kg五个剂量组HWTX-I，进行大鼠硬脊膜外腔注药，均能以剂量依赖方式明显抑制福尔马林c.w.注射诱导的伤害性行为反应。
实施例2：大白鼠硬脊膜外腔枕骨大孔置管法实施例
使大白鼠处于麻醉状态下，于枕骨下沿背正中线切约1.5cm长的切口，暴露第一颈椎，暴露寰枕后膜，将蛛网膜小心勾一小孔，插入PE10管至蛛网膜下腔，PE10管进管深度约7cm，至脊髓腰膨大处。外端约留5cm长，埋管，缝合切口。其余操作步骤同实施例1。
实施例3：大白鼠蛛网膜下腔胸椎置管法实施例
当暴露位于胸8与胸9之间的椭圆形小孔后，用眼科小剪刀通过该椭圆形小孔插入椎管中，小心剪去圆孔周边骨性组织，扩大该圆孔，以充分暴露脊髓；用勾针勾破硬脊膜，此时可见少许清亮脑脊液流出；用眼科镊夹住专用PE-10管先通过一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜孔插入大鼠蛛网膜下腔，插入深度约为1.8cm，直达脊髓腰膨大处；其余操作步骤同实施例1。
实施例4：大白鼠蛛网膜下腔枕骨大孔置管法实施例
暴露寰枕后膜(不需将其勾一小孔)，沿着寰枕膜插入PE-10管至蛛网膜下腔，PE-10管进管深度7cm，至脊髓腰膨大处。外端约留5cm长，埋管，缝合切口。其余操作步骤同实施例1。
Claims (2)
1、一种大鼠硬脊膜外腔置管方法，其特征在于，包括大鼠胸椎置管法和枕骨大孔置管法，
所述胸椎置管法包括以下步骤：(1)使实验动物处于麻醉状态下，操作者用手指在麻醉动物的背部沿头端向尾部触摸胸椎的棘突，胸椎区域最突出的棘突为胸8，以此为中心，用毛剪将面积为8-12cm2范围内的鼠毛剪净，用络合碘棉签擦拭消毒此皮肤区域2-3次；(2)在无菌条件下进行以下操作：以胸8棘突为中心，平行于脊柱做一个约1-2厘米长的皮肤切口，用开口器依次张开皮肤和皮下脂肪，清楚地暴露大白鼠的背部肌肉、肌腱；(3)向大白鼠腰椎方向移动张开器，通过辨认肌腱连接点来确定胸13肋，然后从头端方向上数找到胸9与胸10之间的椎间隙；(4)用勾针从脊柱侧面扎进胸10棘突内，向上提起脊柱，充分暴露胸9与胸10之间的椎间隙；(5)靠近胸10棘突前沿，在胸9与胸10棘突之间，垂直于脊柱方向做一背部肌肉和肌腱的横切口，暴露椎管外侧附着的白色骨膜；(6)用勾针轻轻挑开骨膜，看到位于胸8与胸9椎间隙之间的一个椭圆形小孔，通过该孔可看到乳白色的脊髓随呼吸起伏；(7)用眼科镊子夹住专用PE-10聚乙烯管(总长5-7cm)，先通过一肌肉隧道，然后顺椎管腔使之插入硬脊膜外腔，插入深度为1.5-2.0cm，至脊髓腰膨大处。PE-10管预先在1.5-2.0cm处用封口膜缠成一个小结球以控制插入深度；(8)将小结球缝合固定在切口处肌肉上，络合碘擦拭消毒切口处肌肉、皮肤，依次缝合切开的肌肉和皮肤层，用淋巴造影针将少量的0.9％NaCl注射液通过PE-10管开口端注入留置的PE-10管内，以防PE-10管被组织液堵塞，加热封闭PE管开口，并于大鼠腿部肌肉处注射抗感染药物；
所述枕骨大孔置管法为：使实验动物处于麻醉状态下，于枕骨下沿背正中线切1.2-1.8cm长的切口，暴露第一颈椎，暴露寰枕后膜，将蛛网膜小心勾破一小孔，插入PE10管至蛛网膜下腔，PE10管进管深度6-8cm，至脊髓腰膨大处。外端留4-6cm长，埋管，缝合切口；其余操作步骤与所述胸椎置管法相同。
2、一种大鼠蛛网膜下腔置管方法，其特征在于，包括大鼠胸椎置管法和枕骨大孔置管法，
所述胸椎置管法为：当暴露位于胸8与胸9之间的椭圆形小孔后，用眼科小剪刀通过该椭圆形小孔插入椎管中，小心剪去圆孔周边骨性组织，略为扩大该圆孔，以充分暴露脊髓；用勾针勾破硬脊膜，此时可见少许清亮脑脊液流出；用眼科镊夹住专用PE-10管先通过一肌肉隧道，沿挑破的硬脊膜孔插入大鼠蛛网膜下腔，插入深度约为1.5-2.0cm，直达脊髓腰膨大处；其余操作步骤与权利要求1所述胸椎置管法相同；
所述枕骨大孔置管法为：暴露寰枕后膜，不需将其勾一小孔，沿着寰枕膜插入PE-10管至蛛网膜下腔，PE-10管进管深度6-8cm，至脊髓腰膨大处；外端留4-6cm长，埋管，缝合切口；其余操作步骤与权利要求1所述枕骨大孔置管法相同。
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