KR20180129160A - 추간판 손상 동물모델 - Google Patents
추간판 손상 동물모델 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20180129160A KR20180129160A KR1020170064776A KR20170064776A KR20180129160A KR 20180129160 A KR20180129160 A KR 20180129160A KR 1020170064776 A KR1020170064776 A KR 1020170064776A KR 20170064776 A KR20170064776 A KR 20170064776A KR 20180129160 A KR20180129160 A KR 20180129160A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- animal model
- animal
- disc
- days
- comparative example
- Prior art date
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 230
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 title description 14
- 230000036407 pain Effects 0.000 title description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 92
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 44
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 27
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 12
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 11
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 10
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 claims description 9
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 8
- 230000006399 behavior Effects 0.000 claims description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 claims description 7
- 206010055040 Intervertebral disc injury Diseases 0.000 claims description 6
- 210000004744 fore-foot Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000003194 forelimb Anatomy 0.000 claims description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 241000009328 Perro Species 0.000 claims description 3
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 claims description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 claims description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 64
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 21
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 12
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 208000021600 intervertebral disc degenerative disease Diseases 0.000 description 8
- 210000004705 lumbosacral region Anatomy 0.000 description 8
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 description 5
- 102100025588 Calcitonin gene-related peptide 1 Human genes 0.000 description 5
- 206010061246 Intervertebral disc degeneration Diseases 0.000 description 5
- 208000018180 degenerative disc disease Diseases 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 4
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 4
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 3
- 208000018650 Intervertebral disc disease Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 3
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- JVXZRNYCRFIEGV-UHFFFAOYSA-M dilC18(3) dye Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O.CC1(C)C2=CC=CC=C2N(CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C1=CC=CC1=[N+](CCCCCCCCCCCCCCCCCC)C2=CC=CC=C2C1(C)C JVXZRNYCRFIEGV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 2
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 2
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 2
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L Fast green FCF Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC(O)=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 RZSYLLSAWYUBPE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001503485 Mammuthus Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- KMNTUASVUKNVJS-UHFFFAOYSA-N Ponceau S (acid form) Chemical compound OC1=C(S(O)(=O)=O)C=C2C=C(S(O)(=O)=O)C=CC2=C1N=NC(C(=C1)S(O)(=O)=O)=CC=C1N=NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 KMNTUASVUKNVJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010041591 Spinal osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 210000003489 abdominal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001142 back Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000005115 demineralization Methods 0.000 description 1
- 230000002328 demineralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003195 fascia Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002695 general anesthesia Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 1
- 239000003158 myorelaxant agent Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000004126 nerve fiber Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000862 numbness Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008289 pathophysiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 208000005801 spondylosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002889 sympathetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006200 vaporizer Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/20—Animals treated with compounds which are neither proteins nor nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본 발명은 추간판 손상 동물모델의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조된 동물모델은 실제 추간판 질환을 갖고 있는 환자와 동일한 임상증상을 갖고 있기 때문에, 이에 특화된 연구를 수행하기에 적합하며, 추간판 손상에 대한 약리활성이 알려지지 않은 후보 물질 중에서 추간판 손상에 대한 약리활성을 갖는 물질을 스크리닝 하는데 효과적으로 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 추간판 손상 동물모델의 제조방법에 관한 것이다.
추간판 관련 질환에 대한 동물모델은 병태생리학적인 관점에서나 치료의 목적에 있어서 중요하다. 생체 외(In vitro)와 인 실리코(in silico) 등의 다양한 방법으로 추간판 질환관련 연구를 진행하기도 하지만 인 비보(In vivo) 환경에서 추간판을 연구하는 것은 생화학적, 생체역학적, 영양학적으로 주변의 여러 요소들을 포함하여 신뢰감 있게 사람과 유사한 질병 환경을 반영 할 수 있다. 인 비보(In vivo) 동물 모델은 크게 자연발생적 모델 그리고 인위적으로 유발시키는 모델 두 가지로 나눌 수 있다. 자연발생적 모델은 사막쥐, 중국 햄스터, 비글 등의 동물이 있는데 보통 3개월에서 6개월의 시간이 소요된다.
인위적으로 유발시키는 모델의 제조를 위해 외과적인 수술을 사용하기도 한다. 일예로 앞발을 절단하여 자세를 바꾸게 하는 모델, Ilizarove의 기구를 이용해 척추를 압박하는 모델, 후관절 수술을 통해 요추를 비트는 모델과 섬유륜을 수술칼로 절개하거나 16G~21G의 바늘로 구멍을 뚫는 모델 등이 개발되었다. 상술한 방법을 통해 제조된 동물모델은 단순히 추간판의 구조적 변화 혹은 추간판을 이루고 있는 성분들의 변화만을 고려한 것으로, 실제 사람과 유사한 구조적 변화, 조직적 변화, 행동학적 변화를 나타내는지에 대해서는 전혀 고려하지 않았다.
따라서 추간판의 손상에 따른 퇴행성 추간판 질환을 치료하기 위해서는 이에 대한 적합한 모델을 이용한 치료법적 접근이 필요하다. 그러나 현재까지 개발된 동물모델들 중 성공적으로 퇴행성 추간판 손상을 유도할 수 있는 동물모델은 거의 없는 실정이다.
비특허문헌 1. Silberberg R, Gerritsen G (1976) Aging changes in intervertebral discs and spondylosis in Chinese hamsters. Diabetes 25:477-83.
종래 추간판 손상 동물모델은, 퇴행성 추간판 질환을 앓고있는 환자들에서는 관찰할 수 없는 행동학적 특징(기계적 자극(von-Frey)에 의한 발바닥 민감화)이 발생하는 문제점이 있음을 발견하고, 이를 해결하기 위하여 임상 상황과 동일한 동물모델을 제작하고자 예의 노력하였다.
그 결과, 추간판에 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)을 주입하고, 약물이 주입된 구멍을 의학용 본드로 봉입하여, 약물의 누출을 방지하여 실제 추간판 질환과 동일한 행동학적 특성, 구조적 변화, 및 조직학적 변화를 나타내는 동물모델을 제작할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 추간판 손상 동물모델의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 추간판 손상에 대한 치료 효과를 갖는 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상 동물모델의 제조방법을 제공한다.
(a) 인간을 제외한 동물의 복부를 절개하고 요추 4, 5번의 추간판 사이에 주사기를 이용하여 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)를 투여하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계를 통해 유도된 구멍을 의학용 본드로 봉입하는 단계; 및
(c) 상기 동물을 14 내지 50일 동안 사육하고, 추간판 손상의 발생을 확인하는 단계.
상기 인간을 제외한 동물은 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎인 것을 특징으로 한다.
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 동물의 중량(㎏)당 2 ㎎ 내지 25 ㎎ 투여되는 것을 특징으로 한다.
상기 주사기의 주사바늘은 25 내지 28 게이지인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 동물모델 제조방법을 통해 제조되고, 후근신경절과 추간판 요추 4번, 5번에서 COX-2 발현양이 증가된 것을 특징으로 하는 추간판 손상 동물모델을 제공한다.
상기 동물모델은 정상 동물 또는 생리식염수만 투여한 동물과 비교하여 앞발쪽의 체중부하가 통계학적으로 증가하고, 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간(직립 평가)은 통계학적으로 감소하나, 발바닥의 기계적 감각 민감화는 차이가 발생하지 않는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(i) 제6항의 동물모델에 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 투여 후 추간판 손상에 따른 증상이 감소, 방지 또는 제거되는 지 여부를 확인하는 단계.
상기 (ⅱ) 단계는 동물의 네 발에 대한 체중 부하를 측정하여 비교하는 방법 또는 동물의 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간을 측정하여 비교하는 방법 또는 동물의 추간판에 기계적 자극을 가하여 신경 흥분성을 조사하는 방법 또는 동물의 추간판에 압력 자극을 가하여 신경 흥분성을 조사하는 방법을 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 방법으로 제조된 동물모델은 실제 추간판 질환을 갖고 있는 환자와 동일한 임상증상을 갖고 있기 때문에, 이에 특화된 연구를 수행하기에 적합하며, 추간판 손상에 대한 약리활성이 알려지지 않은 후보 물질 중에서 추간판 손상에 대한 약리활성을 갖는 물질을 스크리닝 하는데 효과적으로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 추간판 손상 동물모델을 42일 동안 사육한 후, 희생시키고 해부한 사진이다.
도 2는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 네발의 체중부하검사 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 3은 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 직립평가(뒷발로 서기) 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 4a는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 추간판 손상 동물모델을 제조하고 난 뒤, 통증 억제 물질로 잘 알려진 모르핀(morphine)의 복강 내 주입 시 통증이 일시적으로 감소한 것을 확인한 그래프이다.
도 5a는 실험예 5. 전기생리학적 신경활성화 측정과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5b는 실시예 2의 동물모델(14일 후)과 비교예 1의 동물모델에서 식염수 주입을 통한 추간판 내 압력전달(100~2500 ㎜Hg, 자극간격 70 초)를 가했을 때, 측정된 활성전위를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아무것도 시행하지 않은 동물모델과 비교예 1의 동물모델 및 14일 또는 42일 동안 사육한 실시예 2의 동물모델에 대한 압력 자극에 대한 반응 곡선 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2 동물모델 및 아무것도 시행하지 않은 동물모델의 p 값이 0.05보다 작을 때는 *, 0.01보다 작을 때는 **로 표기하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2의 동물모델 및 비교예 1의 동물모델의 P 값이 0.05보다 작을 때는 #, 0.01보다 작을 때 ##로 표기하였다.
도 7은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 COX-2 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 NF-kB 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 9는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1) 방법으로 제조됨)을 제조한 후, 이로부터 14일 후 적출한 후근 결절(Dorsal root ganglion, L2)에서 Dil로 염색된 세포체와 CGRP(통증관련 마커)의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 정상 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이고, 도 10b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이다. 좌측부터 횡단면, 시상단면, 관상단면이다.
도 11a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 11b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 11c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 11d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진, 수핵의 사진이다.
도 12a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 12b는 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 13a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 중앙(center) 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 13b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 중앙(center) 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 14a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 수핵의 면적을 적색선으로 표기하였다.
도 14b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 수핵 면적을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 15는 28일이 지난 정상 동물모델(a)과 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(b)에서, 추간판 및 연골조직을 적출한 후 이를 Safranin-O 염색한 사진이다.
도 16은 추간판 손상 동물모델을 제조한 후(비교예 2의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 17b는 2주 후 비교예 2의 동물모델(2W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 17c는 4주 후 비교예 2의 동물모델(4W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 17d는 8주 후 비교예 2의 동물모델(8W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진이다.
도 2는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 네발의 체중부하검사 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 3은 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 직립평가(뒷발로 서기) 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 4a는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 추간판 손상 동물모델을 제조하고 난 뒤, 통증 억제 물질로 잘 알려진 모르핀(morphine)의 복강 내 주입 시 통증이 일시적으로 감소한 것을 확인한 그래프이다.
도 5a는 실험예 5. 전기생리학적 신경활성화 측정과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5b는 실시예 2의 동물모델(14일 후)과 비교예 1의 동물모델에서 식염수 주입을 통한 추간판 내 압력전달(100~2500 ㎜Hg, 자극간격 70 초)를 가했을 때, 측정된 활성전위를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아무것도 시행하지 않은 동물모델과 비교예 1의 동물모델 및 14일 또는 42일 동안 사육한 실시예 2의 동물모델에 대한 압력 자극에 대한 반응 곡선 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2 동물모델 및 아무것도 시행하지 않은 동물모델의 p 값이 0.05보다 작을 때는 *, 0.01보다 작을 때는 **로 표기하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2의 동물모델 및 비교예 1의 동물모델의 P 값이 0.05보다 작을 때는 #, 0.01보다 작을 때 ##로 표기하였다.
도 7은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 COX-2 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 NF-kB 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 9는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1) 방법으로 제조됨)을 제조한 후, 이로부터 14일 후 적출한 후근 결절(Dorsal root ganglion, L2)에서 Dil로 염색된 세포체와 CGRP(통증관련 마커)의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 10a는 정상 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이고, 도 10b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이다. 좌측부터 횡단면, 시상단면, 관상단면이다.
도 11a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 11b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 11c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 11d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진, 수핵의 사진이다.
도 12a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 12b는 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 13a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 중앙(center) 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 13b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 중앙(center) 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 14a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 수핵의 면적을 적색선으로 표기하였다.
도 14b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 수핵 면적을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 15는 28일이 지난 정상 동물모델(a)과 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(b)에서, 추간판 및 연골조직을 적출한 후 이를 Safranin-O 염색한 사진이다.
도 16은 추간판 손상 동물모델을 제조한 후(비교예 2의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 17b는 2주 후 비교예 2의 동물모델(2W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 17c는 4주 후 비교예 2의 동물모델(4W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 17d는 8주 후 비교예 2의 동물모델(8W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상 동물모델의 제조방법을 제공한다.
(a) 인간을 제외한 동물의 복부를 절개하고 요추 4, 5번의 추간판 사이에 주사기를 이용하여 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)를 투여하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계를 통해 유도된 구멍을 의학용 본드로 봉입하는 단계; 및
(c) 상기 동물을 14 내지 50일 동안 사육하고, 추간판 손상의 발생을 확인하는 단계.
상기 추간판성 손상 동물모델이란, 척추뼈와 척추뼈 사이에 있는 척추에 가해지는 충격을 완화하는 쿠션 역할을 하고 있는 구조물인 추간판이 척추와 척추사이에서 주어지는 힘을 적절히 분산시키면서 운동성을 확보해야 하는데, 장기간에 걸쳐 자연발생적으로 나타나는 여러 가지 요인들에 의해 정상적 기능을 하지 못해 요추에 통증이 유발된 동물모델을 의미한다. 특히 사람의 퇴행성 추간판 질환을 재현할 수 있는 자연발생적이고 실용적인 동물모델이 없다는 것이 문제점으로 제기되고 있다. 따라서 퇴행성 추간판에 대한 이해와 치료 약제의 효능을 연구하기 위해서는 재현 가능한 표준화된 동물모델이 요구되고 있다.
이에 본 발명의 추간판 손상 동물모델은 살아있는 상태에서 실제 환자의 임상 상태와 동일한 행동 특성, 신경 흥분의 활동성, 추간판의 구조적 변화 및 조직학적 변화를 실시간으로 관찰 가능하다.
본 발명은 추간판 손상 구체적으로 퇴행성 추간판 진행 양상 또는 추간판 손상에 대한 치료제의 치료 효능의 분석, 또는 스크리닝하는데 있어 필요한 추간판 손상 동물모델에 관한 것이다. 종래에는, 이러한 방법으로 제작된 동물모델은 제시 된 바 없다.
본 발명은 신규한 추간판 손상 동물모델의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다:
(a) 인간을 제외한 동물의 복부를 절개하고 요추 4, 5번의 추간판 사이에 주사기를 이용하여 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)를 투여하는 단계로, 우선, 본 발명의 추간판 손상 동물모델을 제조하기 위해서는 먼저 상기 동물을 배와위 자세로 유지시킨 후, 복부를 절개하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
상기 동물의 요추 4번 및 5번 추간판을 천공하는 과정은 실험동을 마취시킨 후, 동물의 복부를 절개(배와위 자세, supine posion)하여, 추간판 주변을 주행하는 신경 및 근육의 손상을 최소화하여 진행하는 것이 바람직하기 때문이다.
이후, 요추 4번, 5번의 추간판 사이에 주사기를 이용해 모노소듐 아이도아세테이트를 투여한다.
본 발명에서 이용하는 동물은 제한되지 않으며, 바람직하게는 인간을 제외한 동물, 보다 바람직하게는 인간을 제외한 포유류, 보다 더 바람직하게는 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 포유류, 가장 바람직하게는 마우스이다.
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎로 주입되는 것이 퇴행성 추간판 진행을 야기하는데 바람직하다. 가장 바람직하게는 동물의 중량(㎏)당 2 ㎎ 내지 25 ㎎ 투여되는 것일 수 있다. 만약 상기 하한치와 상한치를 벗어난 범위로 모노소듐 아이도아세테이트가 투여될 경우, 임상 상황과 동일하지 않은 전혀 다른 병태생리적 기전에 의한 동물모델이 제조되는 문제가 발생한다.
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 주입의 용이성을 확보하기 위해 ~ 내지 ~ 점도를 유지하도록, 용매를 더 포함할 수 있다. 상기 용매는 생체 내에서 부작용 또는 독성을 나타내지 않는 물질이라면 이에 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 pH 6.5-7.5의 생리식염수를 이용할 수 있다.
상기 주사기의 주사바늘은 25 내지 28 게이지인 것을 사용하는 것이 바람직한데, 25 게이지 미만인 것을 사용할 경우 주입시 발생하는 압력이 높아져, 추간판에 외부압력이 가해질 수 있고, 약물이 새어나와 다른 장기들에 영향을 미칠 수 있다.상기 주사바늘이 28 게이지를 초과하는 경우에는 의학용 본드로 봉입하더라도 누출되는 약물이 발생하게 되므로 부적절하다.
본 발명의 상기 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)의 투여기간은 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 주 이상의 적응기간을 거친 후 투여한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)를 1주 이하의 적응기간을 거친 후, 투여한 동물그룹에서는 적응과정에서 발생하는 스트레스로 인해, 장시간에 의해 발생되어야할 추간판 손상이 단시간에 발생하는 등, 임상상황이 일정하지 않고, 각 그롭간에 유의미한 차이가 발생하였다.
(b) 상기 (a) 단계를 통해 유도된 구멍을 의학용 본드로 봉입하는 단계
이어서, 상기 (a) 단계를 통해 동물의 추간판 내에 유도된 구멍을 의학용 본드로 봉입한다.
봉입하는 과정은 숙련된 기술없이도 일반적인 기구를 이용하여 수행할 수 있다. 다만 의학용 본드가 아닌 열 등의 방법을 통해 봉입하는 경우 추간판에 다른 손상이 가해져, 자연발생적인 추간판 손상 동물모델을 재현하는데 문제가 있고, 시술 후 생존율이 현저히 저하되는 문제가 발생할 수 있으므로, 의학용 본드를 사용하여 봉입하는 것이 바람직하다.
본 발명은 추간판 내에 약물을 주입한 후, 이를 의학용 본드로 봉입하기 때문에, 약물이나 추간판의 수핵이 복부쪽으로 누출되는 문제를 해결함으로써, 복부의 내장쪽의 통각 신경들로 인해 발생되던 통증 행동 반응을 방지하고, 종래 퇴행성 추간판 임상 상태와 유사한 통증 행동을 갖는 동물모델을 제조할 수 있다.
즉, 실제 추간판 손상에 의한 질환은 복부쪽이 아닌 등쪽으로 일어난 경우에만 방사통이 일어나게 되어, 둔부나 뒷다리 발 부분에 저린 감각을 주게되는 것이 일반적이고, 발바닥이 예민하여 통증반응이 있는 경우는 없다. 따라서 약물과 수행의 누출을 막아 복부쪽 신경들에 영향을 최소화함으로써 실제 임상상황과 거의 동일한 임상상황을 나타내는 추간판 손상 동물모델을 제공하였다.
또한, 본 발명의 제조방법을 통해 제조된 동물모델은 척추 후관절에 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate) 약물을 주입하여 제조된 동물모델과는 전혀 상이한 변화양상을 가지는데, 첫 번째는 약물 주입 부위가 다르기 때문에 추간판에는 어떠한 영향을 가하지 못하여 유발 기전이 다르다. 두 번째는 행동 변화 양상이 다른데 상기 모델의 발바닥 회피반사는 대조군과 차이가 없었지만 후관절 모델에서는 발바닥 회피반사검사 시 통증이 7주 이상 지속되는 것으로 실제 요통이 발생한 환자에서는 볼 수 없는 통증 패턴을 보인다. 즉, 동일한 약물의 주입 부위에 따라, 제조된 동물모델은 실제 임상상황과 전혀 상이한 통증반응을 동반하는 경우가 발생하기 때문에, 본원 발명과 다른 부위 다른 방법으로 동물모델을 제조할 경우 전혀 다른 임상상황을 갖는 동물모델이 제공되는 문제가 발생하게 된다.
(c) 상기 동물을 14 내지 50일 동안 사육하고, 추간판 손상의 발생을 확인하는 단계
최종적으로 상기 동물을 14 내지 50일 동안 사육하고, 추간판 손상의 발생을 확인하였다. 상기와 같은 과정을 통해 제조된 추간판 손상 동물모델은 14일이후부터 실제 임상상황과 유사한 통증 행동, 추간판의 구조적 조직적 변화가 관찰되는 것을 확인하였다.
구체적으로 상기 동물모델은 후근신경절과 추간판 요추 4번, 5번에서 COX-2 발현양이 증가하고, 앞발쪽의 체중부하가 통계학적으로 증가하고, 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간(직립 평가)은 통계학적으로 감소하나, 발바닥의 기계적 감각 민감화는 관찰되지 않음을 통해 추간판 손상의 발생을 확인할 수 있다.
본 발명에 따른 동물은 다시 절개된 복부를 봉합하고, 상처치료를 수행한 후, 마취에서 회복될 때까지 또는 마취에서 회복된 후 일정 시간 동안 상기 실험동물을 사육하기 위한 최적 조건 또는 상기 동물에 적합한 조건에서 안정을 취하게 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 추간판 손상 동물모델을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 제조방법으로 제조된 동물모델은 후근신경절과 추간판 요추 4번, 5번에서 COX-2 발현양이 증가되어 있다.
상기 동물모델은 정상 동물 또는 생리식염수만 투여한 동물과 비교하여 앞발쪽의 체중부하가 통계학적으로 증가하고, 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간(직립 평가)은 통계학적으로 감소하나, 발바닥의 기계적 감각 민감화는 차이가 발생하지 않는 특성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(i) 상기 동물모델에 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 투여 후 추간판 손상에 따른 증상이 감소, 방지 또는 제거되는 지 여부를 확인하는 단계.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용한 용어, "후보 물질"은 추간판 손상 특히 퇴행성 추간판 질환을 감소, 방지 또는 제거시키는 활성이 있는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질(예를 들어, 각종 천연물, 화합물 라이브러리, 유전자 또는 단백질 라이브러리 등)이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "추간판 손상 치료제"는 추간판 손상에 대한 약리활성을 나타내는 것으로 알려진, 혹은 나타내는 것으로 확인된 약물(약제학적 조성물), 건강기능식품 또는 식이요법을 의미한다. 일예로, 본 발명에서는 추간판 손상 특히 퇴행성 추간판 손상에 대한 약리활성을 가진 것으로 당업계에 알려진 약물과 기능성 식품을 사용하여, 이에 대한 추간판 손상, 바람직하게는 퇴행성 추간판 질환으로 진단받은 대상체의 민감성을 진단하거나, 예후를 예측할 수 있다. 다른 예로, 본 발명은 추간판 손상에 대한 약리활성이 알려지지 않은 후보 물질 중에서 추간판 손상에 대한 약리활성을 갖는 물질을 스크리닝 하는데 적용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1 및
실시예
2. 동물모델(MIA 0.4 ㎎, MIA 4 ㎎) 제조
1) 실험동물 준비 및 사육
7주령의 수컷 Sprague Dawley(SD) 랫트(rat)(오리엔트 바이오, 경기도, 한국)를 실험동물로 사용하였다. 실험동물을 받아 동물 실로 옮긴 뒤 반투명 아크릴 사육 통에 옮겨 넣고, 사료와 물을 자유롭게 제공한다. 공급받은 랫트들은 인 비보(in vivo) 실험인 행동 실험에 사용하기 전까지, 실내온도가 22-24 ℃ 유지되고 12 시간의 light/dark(LD) 사이클이 조절되는 사육 장소에서 새로운 환경에 적응시키기 위해 약 1∼2주 동안 사육을 한다. 사육 장소는 zeitgeber time(ZT) 0:00 시에 조명이 켜지고, ZT 12:00 시에 불이 꺼지도록 설정되어 있다. 본 실험은 고려대학교 실험동물 윤리 위원회 운영규칙에 따라서 수행하였다.
2) 동물모델 제조
사육장에서 일주일 정도 적응시킨 약 200g - 250g 정도의 수컷 Sprague Dawley(SD) 랫트를 약물 주입 전에 iso-flurane 전용 농도 조절 기화기를 이용하여 3.5%정도로 호흡 전신 마취를 시키고 마취를 유지시키는 상황 하에서 수술을 시행한다. 수술자는 수술 등(fiber light)이 준비된 깨끗한 수술대 위에서 수술용 장갑(medical glove)과 마스크를 착용하고 수술에 임한다. 포비돈으로 수술할 부분을 미리 소독한 후 복부를 절개하고 거즈를 생리식염수에 적셔서 오른쪽의 내장을 꺼내어 올려놓은 다음, 간 쪽으로 생리식염수를 적신 솜을 넣는다. 혈관을 따라서 보이는 근육위치에서 근육이 손상 받지 않도록 근막을 벌리면서 요추 4, 5번의 디스크를 찾는다. 생리식염수, MIA 약물(0.4 ㎎(실시예 1), 4 ㎎(실시예 2))을 혼합한 용액 5 ㎕ 준비하고, 이를 해밀턴(Hamilton) 주사기 26 G로 추간판 중간에 천천히 주입하여 요추 4, 5에 각각 시행한다. 주입한 약물과 생리식염수가 빠져 나오지 않게 본드로 구멍을 막는다. 주입이 끝난 후, 내장을 원래 자리로 되돌려 놓고 복근(실 굵기 5)과 표피(실 굵기 4)를 수술용 실로 잘 꿰매고 포비돈으로 수술된 부분을 소독해준다.
시술이 끝나고 마취에서 깨어나는 동안에는 수술된 실험동물을 사육용 케이지에 눕히고 수건으로 덮어주어 체온을 유지시킨다.
비교예
1. 동물모델(대조군, sham)) 제조
추간판의 요추 4, 5번에 MIA와 생리식염수 혼합액을 주입하는 대신에 생리식염수만을 5 ㎕ 주입하는 것을 제외하고는 실시예 1와 모두 동일하게 수행하여, 동물모델을 제조한다.
비교예
2. CFA 동물모델 제조
추간판의 요추 4, 5번에 MIA와 생리식염수 혼합액을 주입하는 대신에 추간판 요추 5, 6번에 26-게이지의 주사기로 추간판 앞쪽에서 왼쪽 부위에 구멍을 내어 CFA(Complete Freund's Adjuvant/Sigma, St. Louis, MO) 10 ㎕ 주입하는 것을 제외하고는 실시예 1과 모두 동일하게 수행하여, 동물모델을 제조한다.
다만 비교예 2는 동물모델을 제조하고 나서, 2 주(2 W; 14일) 후 측정한 결과는 2W로, 4 주(4 W; 28일)가 지난 후 측정한 결과는 4W로, 8 주(8 W; 56일)가 지난 후 측정한 결과는 8 W로 표시하였다.
실험예
1. 제조과정의 안정성
실시예 1로부터 제조된 추간판 손상 동물모델을 제조할 때, MIA와 생리식염수 혼합액에 메틸렌블루를 첨가하여 육안으로 약물을 확인할 수 있도록 한 것을 제외하고는 실시예 1과 모두 동일하게 동물모델을 제조하였다.
상술한 과정으로 제조된 동물모델을 42일동안 사육한 후, 42일째 되는 날, 희생시키고, 이를 해부하여 추간판 내에 봉입한 약물이 새어나왔는지 여부를 육안을 확인하였다(도 1).
도 1은 본 발명에 따른 추간판 손상 동물모델을 42일 동안 사육한 후, 희생시키고 해부한 사진이다.
도 1에 나타난 바와 같이, MIA와 생리식염수 및 메틸렌블루 혼합액을 추간판 내에 주입된 후, 몬드로 구멍을 막고 42일째에 이를 다시 해부하였을 때 메틸렌 블루가 외부로 전혀 흘러나오지 않았음을 확인할 수 있었다. 즉 MIA는 추간판 외에 다른 장기에 영향을 전혀 미치지 않았음을 알 수 있다.
실험예
2. 인 비보(
in
vivo
) 상에서, 체중부하검사(weight bearing test).
1) 평가방법
추간판 손상을 유발하기 전 모든 실험동물들은 예비실험(pretest) 과정을 통해 측정 장치에 적응시키는 과정을 거쳐야 한다. 아크릴로 제작된 출발지와 통로 그리고 도착지로 구성되어 복도식이며 통로의 발판은 무게 감지 센서인 load cells(Dana load cell, strain gauge type, working range 0-1000g, Dana load cell LTD. Korea)를 부착하여 각 발판에 부하되는 무게를 기록한다. 발판 밑에 부착된 각각의 load cell은 증폭기(DN-AM300, Dana load cell LTD., Korea)와 디지털 변환기(1716, Dana load cell LTD., Korea)를 통해 컴퓨터로 전송하고 특정한 소프트웨어(WBT, Korea)에 의해서 시간 축을 가지는 무게의 변화곡선을 확인한다. 체중부하 검사는 측정 장치의 출발지에서 도착지까지 2∼3회 통과하며 요통을 유발하여 앞발에 실리는 체중부하의 정도를 통증관련행동으로 간주한다. 뒷발과 앞발의 값을 5개 이상 구하여 그 값의 평균을 각각 뒷발과 앞발의 무게 값으로 정해서 평가한다. 값의 도출은 뒷발 대비 앞발의 값을 퍼센트로 표기한다.
2) 결과
도 2는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 네발의 체중부하검사 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 동물모델(n=12)은 실시예 1의 동물모델(n=8) 및 비교예 1의 동물모델(n=10)에 비하여 앞발 쪽으로 체중부하가 20% 증가한 것을 확인하였다.
실험예
3. 인 비보(
in
vivo
)에서, 직립 평가(rearing test)
1) 방법
실시예 1, 실시예 2 및 비교예 1로부터 제조된 동물모델은 시술 후에 어둡게 조명을 한 격리된 방에서 투명한 원통의 아크릴 원형 공간(arena, 지름 80 cm)에 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일에 10분 동안 비디오 카메라로 녹화함과 동시에 실험자가 같이 들어가서 뒷다리 두발로 서기 행동의 총 횟수와 지속시간을 초시계를 이용하여 직접(manually) 측정하였다. 이때 실험자는 소음과 다른 외부의 큰 자극이 없도록 통제함을 원칙으로 한다.
2) 결과
도 3은 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 직립평가(뒷발로 서기) 결과를 나타낸 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. p 값이 0.05보다 작을 때 통계적으로 유의하다고 정의하였고, 그래프 상에는 *로 표기하였다.
도 3에 나타난 바와 같이 실시예 2의 동물모델(n=12)은 실시예 1의 동물모델(n=8) 및 비교예 1의 동물모델(n=10)에 비하여 2일째부터 뒷발로 선 총 횟수(total number, 10 min)가 통계적으로 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다.
실험예
4. 인 비보(
in
vivo
)에서, 회피 평가(withdrawal test)
1) 방법
실시예 1 및 비교예 1로부터 제조된 동물모델의 발 회피반응을 측정하기 위해서 흰쥐를 격자가 3㎜ 철망 위에 올려진 투명한 아크릴 통(28 × 28 × 10 ㎝)에 넣고 30분 정도 안정화를 시키고 자극 크기가 각각 다른 von Frey(Stoelting, Wood Dale, IL, USA; 0.41, 0.70, 1.20, 2.00, 3.63, 5.50, 8.50, 15.10g)와 같은 유리섬유로 된 자극체로 발바닥에 기계적인 자극을 가한 뒤 발바닥에서 유발된 회피반응 역치를 'up and down' 측정 방법으로 평가한다. 이는 동물모델의 발바닥의 기계적 감각 민감화를 측정하는 방법이다.
2) 결과
도 4a는 추간판 손상 동물모델을 제조하기 전, 후(실시예 1, 2 및 비교예 1의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a에 나타난 바와 같이 실시예 2의 동물모델(n=12)은 실시예 1의 동물모델(n=8) 및 비교예 1의 동물모델(n=10)와 비교하였을 때 통계적으로 차이가 없었다. 본래 퇴행성 추간판 질환을 앓고 있는 환자들(사람)에서는 발바닥 민감화가 발생하지 않기 때문에, 정확한 추간판 손상 동물모델을 제안하기 위해서는 사람의 병리학적 상태와 유사하여야 한다. 따라서 본 발명에 따른 동물모델은 사람에서 발생하는 추간판 질환과 동일한 행동학적 특성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
그러나 종래 추간판 손상 동물모델에서는 대부분 발바닥 민감화가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
실험예
5. 전기생리학적 신경활성화 측정
1) 방법
우레탄(Urethane)(1 ㎖/200 g)으로 마취된 동물(rat)을 기도확보를 위해 기관 삽관을 시행하고 수액과 마취제의 주입이 용이하도록 피부정맥(vein)에 폴리에틸렌 튜브(polyethylene tube)를 삽입했다. 좌측 경동맥에 폴리에틸렌 튜브를 삽입하여 압력전달기(blood pressure monitor, WPI, model BP-1, USA)를 통하여 수술 중 혈압을 감시 기록하고, 식도 내 온도를 측정하여 항온 통제기(Homeothermic blanket control unit)에 연결하여 체온을 37˚C로 유지시켰다. 또한 호기 끝의 탄산가스분압(End exporatory carbon dioxide)을 4.0 vol%로 유지시키고, 근육운동으로 인한 기록전극에 발생할 수 있는 노이즈를 제거하기 위하여 근이완제를 일정시간에 주입하여 신경-근 접합부를 차단하였다. 추간판에 연결되어 있다고 알려져 있는 구심성 섬유 중 척추주위 교감신경줄기 중의 단일 신경섬유를 백금선 위에 올려놓았다. 증폭기(DAM 80, WPI)를 이용하여 10000~20000배 증폭된 활동전위를 계속적으로 오실로스코프(Oscilloscope)로 모니터링 하며, 증폭된 활동전위는 A/D converter(CED1401, England)에서 디지털 신호로 변환되어 컴퓨터의 소프트웨어(spike2)에서 실시간으로 기록되고 분석되었다.
추간판에 대한 압력은 매 실험마다 압력센서의 수치를 PRSIM Pressure Stimulator(WPI, calibrator)로 교정(calibration)한 후, 23G 주사바늘과 식염수가 채워진 튜빙을 통해 추간판 내 압력자극(100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500 mmHg; 자극 지속시간: 10sec; 자극간 간격: 70sec)을 전달하였다. 측정 수치는 압력자극에 반응하여 나타나는 감각신경의 단위 시간당 흥분된 활동전위의 최대발사개수(peak spikes per second) 및 자극 역치값(threshold)을 조사하였다.
2) 결론
도 5a는 실험예 5. 전기생리학적 신경활성화 측정과정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5b는 실시예 2의 동물모델(14일 후)과 비교예 1의 동물모델에서 식염수 주입을 통한 추간판 내 압력전달(100~2500 ㎜Hg, 자극간격 70 초)를 가했을 때, 측정된 활성전위를 나타낸 그래프이다.
도 6은 아무것도 시행하지 않은 동물모델과 비교예 1의 동물모델 및 14일 또는 42일 동안 사육한 실시예 2의 동물모델에 대한 압력 자극에 대한 반응 곡선 그래프이다. 그룹 간 비교는 One-way ANOVA and post hoc correction(Tukey)를 사용하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2 동물모델 및 아무것도 시행하지 않은 동물모델의 p 값이 0.05보다 작을 때는 *, 0.01보다 작을 때는 **로 표기하였다. 14 일 또는 28일 째의 실시예 2의 동물모델 및 비교예 1의 동물모델의 P 값이 0.05보다 작을 때는 #, 0.01보다 작을 때 ##로 표기하였다.
도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이 압력 자극에 대한 반응 곡선 그래프를 비교하였을 때, 14일 또는 28일 째의 실시예 2 동물모델(n=15, 14)은 아무것도 시행하지 않은 동물모델(n=15) 및 비교예 1의 동물모델(n=17)에 비해 통계적으로 유의미하게 증가한 양상을 보이는 것을 확인하였다.
추간판 내 압력자극에 대한 역치 값의 경우에도 14일 또는 28일째의 실시예 2 동물모델은 아무것도 시행하지 않은 동물모델과 비교예 1의 동물모델과 요추 추간판을 비교했을 때 통계적으로 유의미하게 낮은 양상을 보이고 있음을 확인하였다.
실험예
6.
웨스턴
블롯
(western blot)
1) 방법
실험에 사용할 추간판 조직, 후근신경절을 분리하기 위해 실시예 2 및 비교예 1로부터 제조된 동물모델을 마취(isoflurane, 0.5-2%/㎏)하고 등의 털을 제거한 후, 피부를 절개하여 추궁절제술을 시행하고 흉추 수준 13번, 요추 수준 1, 2, 3, 4, 5 번의 왼쪽, 오른쪽의 후근신경절과 배측으로 접근하여 추간판 요추 수준 4, 5 번을 적출 하였다.
적출된 왼쪽, 오른쪽의 후근신경절과 추간판을 120 ㎕ cell lysis buffer(50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40)를 사용하여 절취된 조직을 잘게 균질화한 후 볼텍스를 사용하여 30분 섞어준다. 원심분리(14000rpm, 4℃)를 20분간 수행한 뒤, 분리된 상층액에서 총 단백질량을 BSA (Bovine Serum Albumin)를 이용하여 Bradford방법으로 정량하였다.
통증에 주요 매개 인자로 잘 알려진 COX-2와 염증 관련 인자인 NF-kB를 단백질수준에서 변화량을 측정하기 위한 방법으로 웨스턴 블롯을 사용하였다. 10% separating gel와 5% stacking gel을 running buffer(25mM Tris-HCl, 192mM Glycine, 0.1% SDS, pH 8.3)에 담가 준비 한 후, 정량을 마친 단백질을 총 단백질량 30 ㎍을 기준으로 증류수와 해당 단백질, 5X Sample Buffer를 섞어서 겔에 로딩하여 단백질 사이즈 마커와 함께, 95 V로 90 분간 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 뒤 겔을 Transfer buffer(25mM Tris, 192mM Glycine, 10% MeOH, pH 8.3)에 적신 nitrocellulose membrane(Whatman protran, 0.45μm, Thermo Fisher Scientific Inc., Barrington, IL, USA) 위에 올리고 Whatman 3M paper를 차례로 겹친 후, Mini trans-blot module(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에 장치하고 50V로 4시간 동안 단백질을 막으로 이동시켰다. 단백질 이동(transfer)이 끝난 후 ponceau S 용액(sc-301558, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA)을 사용하여 단백질의 이동을 확인 한 뒤, 1시간 동안 막을 5% skim milk용액으로 Blocking 하였다. Blocking 후, COX-2, NF-kB(Santa Cruz, Delaware, CA, USA)의 1차 항체를 1:1000으로 2.5%의 BSA가 첨가된 TBST(0.5% Tween-20, 20 mM Tris, 137 mM NaCl) 용액에 첨가하여서, 4 ℃에서 12∼16시간 반응시킨다. 그런 다음, 막을 TBST 용액으로 3회 washing한 후, 다시 2차 항체(goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA)를 blocking용액에 1:2000로 희석한 후 orbital shaker 위에서 2시간 동안 실온 상태에서 반응한다. 반응이 끝난 후 TBST로 4번 세척한 후, ECL substrate 용액(PierceㄾECLsolution,ThermoScientificInc.,Rockford,IL,USA)을 넣고 x-ray film(Agfa, Mortsel, Belgium)위에 노출시켜서 결과를 얻는다.
2) 결과
도 7은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 COX-2 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 8은 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)과 비교예 1의 동물모델에서의 추간판 조직, 왼쪽 및 오른쪽 후근결절에서 NF-kB 발현량을 웨스턴 블롯으로 측정한 결과이다.
도 7, 8에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일 혹은 28일)은 비교예 1의 동물모델에 비해 COX-2 발현량이 증가하였음을 확인하였다. 또한 NF-kB 발현량은 실시예 2의 동물모델이 시술 후 14일일 경우에는 비교예 1의 동물모델보다는 증가하였으나, 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델에서는 오히려 감소하였음을 확인할 수 있다.
실험예
7.
후근신경절의
면역화학염색법
1) 방법
생리식염수와 MIA 4 ㎎을 인지질을 선택적으로 염색하는 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate(DiI)를 혼합한 혼합액(total 5ul)을 주입한 것을 제외하고는 실시예 2와 모두 동일하게 동물모델을 제조하고, 시술 후 14일 째에 후근 결절 흉추 13번에서부터 요추 1, 2, 3, 4 번까지 적출한다. 그 중 추간판 요추 수준 4번, 5번과 연결되어 있다고 보고된 수준인 후근 결절 요추 2번을 선택하여 냉동 절편기(cryo-section)를 이용하여 두께 12 ㎛로 박절하였다. PBS에 3번 세척 후에 blocking buffer으로 30분 동안 담가 두었고, 다시 PBS로 3번 수세하였다. 1차 항체인 CGRP(donkey anti-rabbit, 1:500)에 조직절편들을 4 ℃에서 밤새 반응시키고 난 뒤, 다음날에 PBS로 15 분간 3 회 세척하였다. 또한 2차 항체인 anti-rabbit(Dylight 488, 1:500)을 실내온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 마지막으로 PBS로 3회 세척 후, 슬라이드에 조직절편을 옮겨두고 충분히 건조시킨 다음 커버슬라이드로 덮어 주었다. 완료된 슬라이드는 Confocal Laser Scanning Microscope(LSM 700 Exciter, Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 육안으로 확인하였다.
2) 결과
도 9는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1) 방법으로 제조됨)을 제조한 후, 이로부터 14일 후 적출한 후근 결절(Dorsal root ganglion, L2)에서 Dil로 염색된 세포체와 CGRP(통증관련 마커)의 면역화학염색 결과를 나타낸 것이다.
도 9a는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1)로부터 적출된 후근 결절의 요추 수준 2 번째에서의 Dil에 표시된 세포체(red)이고, 도 9b는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1)로부터 적출된 후근 결절의 요추 수준 2 번째에서의 CGRP의 면역화학반응 시킨 세포체(green)이며, 도 9c는 MIA, 생리식염수 및 Dil를 혼합한 혼합액을 약물로 주입한 동물모델(실험예 7의 1)로부터 적출된 후근 결절의 요추 수준 2 번째에서의 CGRP와 Dil의 공동 위치한 세포체(Arrow)를 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 추간판의 MIA 주입과 같은 조작으로 충분히 추간판 손상이 야기됨을 확인하였다.
실험예
8. Micro-CT를 통한 추간판의 구조적 변화 측정
1) 방법
실시예 2 및 비교예 1로부터 제조된 동물모델을 반드시 누운 상태로 정중시상면(midsagittal sections)으로 픽셀크기 (17.8um)로 촬영하여 구조분석 시행 후, micro-CT 스캐너(Skysacn 1176, Skysacn, Kontich, Belgium)을 사용하여 360도로 60 KV의 전압 및 160 ㎂의 전류와 0.5 알류미늄 필터로 642~1200 장의 2 차원 영상을 스캔 한다. 스캔 된 2차원 영상은Three-dimensional(3D) reconstructions은 NRecon(NRecon software version 1.5, Skyscan, Belgium)으로 3차원 구조로 재구성된다. 이 재구성된 자료는 구조지수가 자동계산 되게 하는 CT-Analyzer (SkyScan-10) 분석 프로그램을 이용하여 분석을 시행하였다.
2) 결과
도 10a는 정상 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이고, 도 10b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이며, 도 10d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판을 micro-CT로 촬영한 사진이다. 좌측부터 횡단면, 시상단면, 관상단면이다.
도 10에 나타난 바와 같이 정상 동물모델과 비교예 1의 동물모델에서는 추간판의 손상이 관찰되지 않았으나, 시술 후 14 또는 28일 지난 실시예 2의 동물모델은 퇴행성 추간판 손상이 점차 진행되고 있음을 척추변화를 통해 확인할 수 있었다.
실험예
9. H & E,
Safranin
-O 염색을 통한 추간판 조직의 변화
실시예 2 및 비교예 1로부터 제조된 동물모델을 14일째와 28일째에 실험에 사용하였다. 마취 상태의 흰쥐를 관류고정 후, 요추 수준 4, 5번이 포함된 척추 분절 조직을 4% 파라포름알데하이드에 후 고정 시킨다. 탈회용액에 2주간 담근 후 탈회 척추 조직을 탈수와 파라핀침투 및 포매 과정을 통해 파라핀 블록을 만든다. 조직절편 제작기(microtome)을 이용해 추간판 조직을 5~7um의 두께로 썰고 난 뒤, xylene을 통한 탈파라핀 과정, 함수과정, hematoxylin-eosin 염색, 탈수과정, xylene에 담 후 커버슬라이드를 덮고 조직을 관찰한다. 반면, Safranin-O staining은 함수된 조직 슬라이드에 hematoxyline-, fast green, safranin-o, 마지막으로 탈수 과정을 통해 조직 염색 슬라이드를 완성하였다.
2) 결과
도 11a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 11b는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 11c는 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 11d는 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진, 수핵의 사진이다.
도 12a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 12b는 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 바깥쪽(lateral side)의 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 12에 나타난 바와 같이 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)이 다른 조건으로 제조된 동물모델과 통계적으로 유의미한 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
도 13a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 중앙(center) 간격을 적색선으로 표기하였다.
도 13b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 중앙(center) 간격을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)이 다른 조건으로 제조된 동물모델과 통계적으로 유의미한 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
또한, 실시예 2의 동물모델(시술 후 14일)은 정상 동물모델에 비해 유의미한 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
도 14a는 생리식염수를 주입한 비교예 1의 동물모델의 추간판의 전체 사진에서 추간판의 수핵의 면적을 적색선으로 표기하였다.
도 14b은 정상 동물모델(normal)과 비교예 1의 동물모델(sham), 실시예 2의 동물모델(시술 후 14 또는 28일) 각각에서 측정된 추간판의 수핵 면적을 나타낸 그래프이다. (One-way ANOVA and post hoc correction (Tukey); 정상 동물모델(naㅿve), 비교예 1의 동물모델(sham) and 시술 후 14일이 지난 실시예 2의 동물모델(14D MIA 4mg) vs 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(28D MIA 4mg), *: p < 0.05)
도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 동물모델(시술 후 28일)이 다른 조건으로 제조된 동물모델과 통계적으로 유의미한 차이를 나타내고 있음을 확인하였다.
도 15는 28일이 지난 정상 동물모델(a)과 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델(b)에서, 추간판 및 연골조직을 적출한 후 이를 Safranin-O 염색한 사진이다.
도 15에 나타난 바와 같이 시술 후 28일이 지난 실시예 2의 동물모델의 척추조직에서 화살표가 가르키는 부분인 성장판(epiphyseal growth plates, EGP)까지 손상된 것을 확인할 수 있다.
실험예
10. CFA 동물모델의 통증 행동 및 조직학적 양상
도 16은 추간판 손상 동물모델을 제조한 후(비교예 2의 동물모델)의 7일부터 42일 동안 측정한 회피평가 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 실험은 실험예 4의 회피 평가 방법으로 수행하였다.
도 16에 나타난 바와 같이 비교예 2의 동물모델(n=23)들은 발바닥 통증이 발생하고 있음을 확인하였다. 즉 CFA 약물을 MIA 대신 사용한 경우 사람에서 발생하는 추간판 질환과 전혀 상이한 행동학적 특성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
도 17a는 정상 동물모델의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이고, 도 17b는 2주 후 비교예 2의 동물모델(2W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, 도 17c는 4주 후 비교예 2의 동물모델(4W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이며, 도 17d는 8주 후 비교예 2의 동물모델(8W)의 추간판의 조직학적 결과를 나타내는 것이다. 좌측부터 추간판 전체 사진, 섬유륜의 사진이다. 이는 실험예 8의 H & E, 염색 방법과 동일하게 수행하였다. 이때 실시예 1, 2의 동물모델은 약물을 투여한 후 42일 까지 확인한 것으로, 도 17에서는 2 주와 4 주가 지난 후의 조직을 관찰하였다.
도 17에 나타난 바와 같이 비교예 2의 동물모델은 본원 발명의 MIA 약물을 투여한 동물모델(실시예 1, 2)과 전혀 다른 조직학적 변화가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 2주에서 8주가 지난후 측정한 비교예 2의 추간판 조직 모두에서 척삭 세포의 수가 감소하고, 수핵의 공간이 줄어들고 있음을 관찰할 수 있었다. 이를 통해 CFA 약물을 사용한 경우, 수핵이 섬유연골조직으로 대체되어 나타나는 특징을 보이는 것으로 여겨진다.
그러나, 본원 발명의 MIA 약물을 투여한 추간판 조직은 수핵 영역의 감소뿐만 아니라 수핵내 세포의 감소와 추간판 및 척추 연골판과 골단판영역 모두에 영향이 미치는 것으로 확인되었으며, 섬유륜의 비정상적인 소실의 형태도 관찰하였다. 즉, 실제 임상현상과 매우 동일한 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상 동물모델의 제조방법:
(a) 인간을 제외한 동물의 복부를 절개하고 추간판 사이에 주사기를 이용하여 모노소듐 아이도아세테이트(MIA, nosodium Iodoacetate)를 투여하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계를 통해 유도된 구멍을 의학용 본드로 봉입하는 단계; 및
(c) 상기 동물을 14 내지 50일 동안 사육하고, 추간판 손상의 발생을 확인하는 단계. - 제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서의 추간판 사이는 요추 4, 5번의 추간판 사이인 것을 특징으로 하는 추간판 손상 동물모델의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 인간을 제외한 동물은 래트, 마우스, 모르모트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 0.5 ㎎ 내지 5 ㎎인 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 모노소듐 아이도아세테이트는 동물의 중량(㎏)당 2 ㎎ 내지 25 ㎎ 투여되는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 주사기의 주사바늘은 25 내지 28 게이지인 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따라 제조되고, 후근신경절과 추간판 요추 4번, 5번에서 COX-2 발현양이 증가된 것을 특징으로 하는 추간판 손상 동물모델.
- 제7항에 있어서,
상기 동물모델은 정상 동물 또는 생리식염수만 투여한 동물과 비교하여 앞발쪽의 체중부하가 통계학적으로 증가하고, 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간(직립 평가)은 통계학적으로 감소하나, 발바닥의 기계적 감각 민감화는 차이가 발생하지 않는 것을 특징으로 하는 동물모델. - 하기의 단계를 포함하는 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보물질의 스크리닝 방법:
(i) 제7항의 동물모델에 추간판 손상에 대해 치료 효과를 갖는 후보 물질을 투여하는 단계; 및
(ⅱ) 상기 투여 후 추간판 손상에 따른 증상이 감소, 방지 또는 제거되는 지 여부를 확인하는 단계. - 제9항에 있어서,
상기 (ⅱ) 단계는 동물의 네 발에 대한 체중 부하를 측정하여 비교하는 방법 또는 동물의 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간을 측정하여 비교하는 방법 또는 동물의 추간판에 기계적 자극을 가하여 신경 흥분성을 조사하는 방법 또는 동물의 추간판에 압력 자극을 가하여 신경 흥분성을 조사하는 방법을 수행하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 (ⅱ) 단계는 앞발쪽의 체중부하가 통계학적으로 감소하고, 두발로 서는 행동의 횟수와 지속시간(직립 평가)은 통계학적으로 증가하는지 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170064776A KR102009384B1 (ko) | 2017-05-25 | 2017-05-25 | 추간판 손상 동물모델 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170064776A KR102009384B1 (ko) | 2017-05-25 | 2017-05-25 | 추간판 손상 동물모델 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180129160A true KR20180129160A (ko) | 2018-12-05 |
| KR102009384B1 KR102009384B1 (ko) | 2019-08-09 |
Family
ID=64744239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170064776A KR102009384B1 (ko) | 2017-05-25 | 2017-05-25 | 추간판 손상 동물모델 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102009384B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102266308B1 (ko) * | 2020-09-15 | 2021-06-16 | 재단법인 자생의료재단 | 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델 |
| KR102293426B1 (ko) * | 2020-07-07 | 2021-08-26 | 재단법인 자생의료재단 | 척추관 협착증 동물모델 및 이의 제조방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130026783A (ko) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | 한림대학교 산학협력단 | 골관절염 모델 동물 |
| KR20160095352A (ko) * | 2015-02-03 | 2016-08-11 | 고려대학교 산학협력단 | 추간판성 요통 모델 동물 및 이의 제조방법 |
-
2017
- 2017-05-25 KR KR1020170064776A patent/KR102009384B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130026783A (ko) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | 한림대학교 산학협력단 | 골관절염 모델 동물 |
| KR20160095352A (ko) * | 2015-02-03 | 2016-08-11 | 고려대학교 산학협력단 | 추간판성 요통 모델 동물 및 이의 제조방법 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 대한영상의학회지 vol.62, pp.483-490(2010) * |
| 문참삼의 고려대학 학위논문 '전단력기기를 이용한 척추추간판통증 동물모델의 개발과 척추추간판성 통증의 기전 연구'(2010년) * |
| 비특허문헌 1. Silberberg R, Gerritsen G (1976) Aging changes in intervertebral discs and spondylosis in Chinese hamsters. Diabetes 25:477-83. |
| 이용수의 고려대학교 석사학위 논문 'Monosodium iodoacetate(MIA)로 유발된 관절염 흰쥐의 행동학적 조직학적 변화'(2008년) * |
| 한국과학재단 연구보고서 '전단력을 이용한 퇴행성 디스크통증 동물모델 개발 및 통증기전 연구'(2007년) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102293426B1 (ko) * | 2020-07-07 | 2021-08-26 | 재단법인 자생의료재단 | 척추관 협착증 동물모델 및 이의 제조방법 |
| KR102266308B1 (ko) * | 2020-09-15 | 2021-06-16 | 재단법인 자생의료재단 | 추간판 탈출증 동물모델의 제조방법 및 이로 제조된 동물모델 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102009384B1 (ko) | 2019-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RYDEVIK et al. | Effects of acute, graded compression on spinal nerve root function and structure: an experimental study of the pig cauda equina | |
| Lyman et al. | Effect of roentgen rays on the central nervous system: Results of large doses on the brains of adult dogs | |
| Goldman et al. | Co-delivery of a laminin-111 supplemented hyaluronic acid based hydrogel with minced muscle graft in the treatment of volumetric muscle loss injury | |
| Shi et al. | Development of an in vivo mouse model of discogenic low back pain | |
| KR20180129160A (ko) | 추간판 손상 동물모델 | |
| KR20210107086A (ko) | 레시니페라톡신의 투여에 의한 파킨슨병의 치료 방법 | |
| Williams | The principles and practice of veterinary surgery | |
| Sakimoto et al. | Proximodistal heterogeneity in learning-promoted pathway-specific plasticity at dorsal CA1 synapses | |
| US7388124B2 (en) | Non-traumatic model for neurogenic pain | |
| Roballo et al. | Long‐term neural regeneration following injury to the peroneal branch of the sciatic nerve in sheep | |
| Guth et al. | The roles of disuse and loss of neurotrophic function in denervation atrophy of skeletal muscle | |
| Biedl | The internal secretory organs: their physiology and pathology | |
| KR20150117890A (ko) | 척수 손상 동물모델 제조방법 및 이를 통해 제조된 척수 손상 동물모델 | |
| Liang et al. | TBI-induced nociceptive sensitization is regulated by histone acetylation | |
| KR101731625B1 (ko) | 피질하 내포성 뇌졸중 동물모델 및 이의 제조방법 | |
| KR101794203B1 (ko) | 추간판성 요통 모델 동물 및 이의 제조방법 | |
| Boyce | VI. A contribution to the study of descending degenerations in the brain and spinal cord, and of the seat of origin and paths of conduction of the fits in absinthe epilepsy | |
| DE69836830T2 (de) | Verwendung von proteinen der midkine-familie in der behandlung von ischämischen krankheiten | |
| Kalderon et al. | Fractionated radiation facilitates repair and functional motor recovery after spinal cord transection in rat | |
| Arabzadeh et al. | Resistance exercise promotes functional test via sciatic nerve regeneration, and muscle atrophy improvement through GAP-43 regulation in animal model of traumatic nerve injuries | |
| EP1283047A1 (de) | Methode zur herstellung einer bioaktiven substanz aus blutserum | |
| Singh et al. | Arthrogryposis and cleft palate in a Charolais calf. | |
| Rawson et al. | Effect of avian neurotensin on motility of chicken (Gallus domesticus) lower gut in vivo and in vitro | |
| Schönfeld et al. | Motor cortex stimulation does not lead to functional recovery after experimental cortical injury in rats | |
| Lonowski et al. | Effects of cholinergic brain injections on mouse killing or carrying by rats |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |