KR20210107086A - 레시니페라톡신의 투여에 의한 파킨슨병의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

수막내 또는 수조내 투여에 의해 유효량의 레시니페라톡신(RTX)을 투여함을 포함하는 파킨슨병(PD)을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 일부 양태에서, 성인 인간에 대한 RTX의 용량은 약 0.1 내지 약 100㎍이다.

Description

레시니페라톡신의 투여에 의한 파킨슨병의 치료 방법

본 출원은 2018년 12월 24일에 출원된 미국 가특허출원 제62/784,650호 및 2019년 10월 11일에 출원된 미국 가특허출원 제62/914,170호에 대해 우선권을 주장하며, 상기 가특허출원 각각의 내용은 이들의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 파킨슨병(Parkinson's disease: PD)의 치료 방법으로서, 수막내(intrathecally) 또는 수조내(intracisternally) 투여에 의해 유효량의 레시니페라톡신(RTX)을 투여함을 포함하는 방법을 제공한다.

RTX는 레드 페퍼(red pepper)의 자극성 주요 성분인 캡사이신의 초강력 유사체로서 작용한다. RTX는 유포르비아(Euphorbia)의 특정 종으로부터 단리된 트리사이클릭 디테르펜이다. 호모바닐릴 그룹은 캡사이신의 중요한 구조적 특징적 구성(feature)이고, 레시니페라톡신을 전형적인 포르볼-관련 화합물과 구별하는 가장 두드러진 구조적 특징이다. 자연(native) RTX의 구조는 다음과 같다:

RTX 및 유사 화합물, 예를 들면, 티냐톡신 및 기타 화합물(디테르펜의 20-호모바닐릴 에스테르, 예를 들면, 12-데옥시포르볼 13-페닐아세테이트 20-호모바닐레이트 및 메제레인 20-호모바닐레이트)은 미국 특허 제4,939,194호, 제5,021,450호 및 제5,232,684호에 기재되어 있다. 기타 레시니페라톡신형 포르보이드 바닐로이드도 확인되어 있다(Szallasi et al. (1999) Brit. J. Pharmacol. 128:428-434).

RTX는 TrpV1 작용제로도 알려져 있다. 일시적 수용체 전위 양이온 채널 서브패밀리 V 구성원 1인 TrpV1(바닐로이드 수용체-1(VR1)로도 알려짐)은 통각 수용성 1차 구심성 뉴런에서 현저하게 발현되는 다량체 양이온 채널이다(Caterina et al. (1997) Nature 389:816-824; Tominaga et al. (1998) Neuron 21:531-543). TrpV1의 활성화는 일반적으로 고통스러운 열의 적용을 통해 신경 종말에서 발생하며, 특정 유형의 염증 자극 동안 상향 조절된다. 화학적 작용제에 의한 말초 조직에서의 TrpV1 활성화는 칼슘 채널의 개방 및 통증 감각의 전달을 초래한다(Szalllasi et al. (1999) Mol. Pharmacol. 56:581-587). 그러나, TrpV1을 발현하는 뉴런(신경절)의 세포체에 특정 TrpV1 작용제를 직접 적용하면, 칼슘 채널이 개방되고 프로그래밍된 세포 사멸("아폽토시스")로 이어지는 일련의 사건이 촉발된다(Karai et al. (2004) J. of Clin. Invest. 113:1344-1352).

파킨슨병은 노인 인구에서 증가하는 운동 장애이다. 파킨슨병은 미국에서 60세 이상 인구의 약 1%에 영향을 미치는 노년기의 흔한 장애 질환이다. 파킨슨병의 발병률은 나이가 들수록 증가하며, 질환이 발병하는 개인의 평생 누적 위험은 약 40분의 1이다. 증상에는 사지의 현저한 떨림, 운동완만, 경직 및 자세 변화가 포함된다. 파킨슨병의 인지된 병태생리학적 원인은 기저핵의 도파민 생성 세포의 점진적인 파괴이며, 도파민 생성 세포는 뇌간에 위치한 기저핵인 흑색질을 구성하는 부분을 포함한다. 도파민성 뉴런의 손실은 아세틸콜린의 상대적 과잉을 초래한다. 문헌[Jellinger, J. Neural. Transm. 56(Supp);1-29:1999].

파킨슨병은 경미한 사지 경직 및 드문 떨림으로 시작하여 10년 이상의 기간에 걸쳐 빈번한 떨림 및 기억 손상, 제어할 수 없는 떨림 및 치매로 진행될 수 있는 진행성 장애이다.

파킨슨병 치료에 사용되는 약물은 L-도파, 셀레길린, 아포모르핀 및 항콜린제를 포함한다. L-도파(레보-디하이드록시-페닐알라닌)(시네메트)는 혈액-뇌 장벽을 가로질러 뇌에서 도파민으로 전환될 수 있는 도파민 전구체이다. 불행히도, L-도파는 체내에서 반감기가 짧고, 장기간 사용 후(즉, 약 4 내지 5년 후) L-도파의 효과가 산발적이고 예측할 수 없게 되어 운동 기능의 변동, 운동이상증 및 정신과적 부작용을 초래하는 것이 일반적이다. 또한, L-도파는 B 비타민 결핍을 유발할 수 있다.

셀레길린(데프레닐, 엘데프릴)은 L-도파의 대안으로 사용되어 왔으며, 뇌에서 도파민의 분해를 감소시킴으로써 작용한다. 불행히도, 셀레길린은 약 9개월의 사용 후에는 효과가 없어진다. 도파민 수용체 작용제인 아포모르핀은 파킨슨병 치료에 사용되어 왔지만, 단독으로 사용시 심한 구토 및 피부 반응, 감염, 졸음 및 일부 정신과적 부작용을 유발한다.

전신 투여된 항콜린성 약물(예를 들면, 벤즈헥솔 및 오르페네드린)도 파킨슨병을 치료하기 위해 사용되어 왔으며, 뇌에서 생성되는 아세틸콜린의 양을 감소시킴으로써 작용하여 파킨슨병에 존재하는 도파민/아세틸콜린 불균형을 교정한다. 불행히도, 전신 투여된 항콜린제를 복용하는 환자의 약 70%는 환각을 포함하는 심각한 신경정신병적 부작용 및 운동이상 운동, 및 시각 효과, 연하 곤란(difficulty swallowing), 구내 건조 및 소변 정체를 포함하는 광범위한 항콜린성 분포로 인한 기타 영향을 나타낸다(Playfer, Postgrad. Med. J., 73;257-264:1997 and Nadeau, J. Am. Ger. Soc., 45;233-240:1997).

1969년에 L-도파가 도입되기 전, 정위 수술은 파킨슨병에 대한 몇 안 되는 치료를 제공했다. 편측 정위 시상파괴술은 대측 떨림 및 경직을 조절하는 데 효과적일 수 있지만 반부전마비의 위험이 있다. 양측 시상파괴술은 언어 장애 및 연하 장애 발생의 위험을 증가시킨다. 창백핵(기저핵)의 일부를 외과적으로 절제하는 방법인 정위 창백핵절단술도 어느 정도 성공적으로 사용되었다. 외과적 절제 이외에도 복측 중간핵에 배치된 고주파 자극 전극이 일부 경우에는 비정상적인 운동을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 컴퓨터 단층 촬영 및 자기 공명 이미징을 포함하여 프로브의 정확한 위치를 허용하는 다양한 기술이 존재한다. 불행히도, 파킨슨병의 운동 장애, 언어 장애 및 보행 장애 증상은 이러한 수술 절차는 거의 도움이 되지 않으며, 이들 모두는 파괴적인 뇌 병변을 초래한다.

떨림 및 기타 파킨슨병 증상의 치료에 대한 두개내 병변이 창백핵 및 렌즈 고리에 만들어졌다. 창백핵절단술의 장기적인 결과는 종종 실망스러웠다. 떨림의 외과적 정지에 대한 긍정적인 결과는 다음의 시상핵의 병변에 의해 얻어졌다: (1) 복외중간물(Vim) 또는 복측측 후방(VLp)핵; (2) 복측구강 전방(Voa)핵(Voa 및 Vop는 집합적으로 복측측 전방핵(VLa)이라고 함); (3) 복외구강 후방(Vop)핵; (4) 시상하핵(포렐절제술) 및 (5) CM-Pf 시상핵. 일반적으로, 복외측 시상은 파킨슨병의 치료 및 기타 전신 투여되는 약물 내성 떨림에서 선택되는 외과적 표적이었다. 피질의 시상 흥분은 거의 모든 피질 활성에 필요하다.

정위 수술(신경이미징 및 전기생리학적 기록에 의해 보조됨)은, 과활동성 창백핵 및 시상하핵을 표적으로 하는 진행성 약물내성 파킨슨병의 관리에 사용되어 왔다. 컴퓨터 단층 촬영 또는 자기 공명 이미징에 의한 뇌 이미징의 도움으로 참조용 뇌 지도를 사용하여 전극 또는 프로브를 뇌 내에 배치한다. 창백핵(즉, 후복측 창백핵), 기저핵, 시상핵 및 시상하핵의 상이한 부분들에 있는 병변이 파킨슨병의 운동 장애의 치료가 수행되었다. 불행히도, 외과적 뇌 병변은 언어, 시각 및 인지 뇌 영역에 손상을 줄 위험을 생성한다. 외과적 절제 또는 자극 이외에 외부 방사선 요법(감마 나이프 방사선수술)도 약물 내성 파킨슨성 떨림의 치료를 위해 제한된 정도로 사용되어 왔다. 이러한 절차의 단점은 떨림의 감소가 방사선수술 1주일 후 내지 8개월 후로 지연되고, 장기적인 이익 및 방사선 부작용이 현재 알려져있지 않다는 것이다.

따라서, 파킨슨병에 대한 개선된 치료를 당업계에서 필요로 한다.

본원은 파킨슨병(PD)의 치료 방법으로서, 수막내 또는 수조내 투여에 의해 유효량의 레시니페라톡신(RTX)을 투여함을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 성인 인간에 대한 RTX의 용량은 약 0.1 내지 약 100㎍이다.

양태 1은 파킨슨병(PD)의 치료 방법으로서, PD의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 레시니페라톡신(RTX)을 수막내 또는 수조내 투여함을 포함하는 방법이다.

양태 2는 파킨슨병(PD)의 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한, 레시니페라톡신(RTX)을 포함하는 조성물이다.

양태 3은 상기 방법이 상기 대상체에게 상기 조성물을 수막내 또는 수조내 투여함을 포함하는, 양태 2에 기재된 조성물이다.

양태 4는 상기 대상체가 성인 인간인, 양태 1 내지 양태 3 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 5는 상기 RTX가 약 0.1 내지 약 100㎍의 용량으로 투여되는, 양태 1 내지 4 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 6은 상기 용량이 약 0.1 내지 약 1㎍, 약 1 내지 약 5㎍, 약 5 내지 약 10㎍, 약 10 내지 약 20㎍, 약 20 내지 약 50㎍ 또는 약 50 내지 약 100㎍인, 양태 5의 방법 또는 조성물이다.

양태 7은 상기 방법이 수막내 투여를 포함하는, 양태 1 내지 6 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 8은 상기 방법이 수조내 투여를 포함하는, 양태 1 내지 6 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 9는 상기 RTX가, 상기 RTX 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형으로 투여되는, 양태 1 내지 8 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 10은 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 물을 포함하는, 양태 9의 방법 또는 조성물이다.

양태 11은 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 식염수를 포함하는, 양태 9의 방법 또는 조성물이다.

양태 12는 상기 RTX가 1 내지 100㎍/ml의 범위의 농도로 상기 약제학적 제형에 존재하는, 양태 9 내지 11 중 어느 하나의 방법 또는 조성물이다.

양태 13은 상기 RTX가 1 내지 5㎍/ml, 5 내지 10㎍/ml, 10 내지 20㎍/ml, 20 내지 50㎍/ml 또는 50 내지 100㎍/ml의 범위의 농도로 상기 약제학적 제형에 존재하는, 양태 12의 방법 또는 조성물이다.

도 1은 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후의 0.04㎍의 저용량 또는 0.125㎍의 고용량에서 레시니페라톡신(RTX)의 단일 투여가, C57Bl/6J 수컷 마우스의 체중(g)에 미치는 영향을 도시한다. 8주의 연구 기간 동안 그룹들 간에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(투-웨이 ANOVA).
도 2는 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후의 0.04㎍의 저용량 또는 0.125㎍의 고용량의 레시니페라톡신의 단일 투여가, C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민 수준(ng/g)에 미치는 영향을 도시한다. AAV-A53T의 주입은 비히클로 수막내 치료된 시점 둘 다에서 동측 선조체에서 도파민 수준의 유의한 감소를 초래했다. ***: p < 0.0001, AAV1/2-Null 비히클 D7 대 AAV1/2-A53T 비히클(비쌍(unpaired) t-검정); **: p = 0.016, AAV1/2-Null 비히클 D14 대 AAV1/2-A53T 비히클 D14(비쌍 t-검정).
도 3은 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후의 저용량 및 고용량의 레시니페라톡신의 단일 투여가, C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 3,4-디히드록시페닐아세트산(DOPAC)의 수준(ng/g)에 미치는 영향을 도시한다. ***: p = 0.003, AAV1/2-Null 비히클 D7 대 AAV1/2-A53T 비히클(비쌍 t-검정); *: p < 0.05, AAV-Null+비히클 D14 대 AAV-A53T+비히클 D14(비쌍 t-검정).
도 4는 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후의 저용량 및 고용량의 레시니페라톡신의 단일 투여가, C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 호모바닐산(HVA)의 수준(ng/g)에 미치는 영향을 도시한다. ***: p = 0.0007, AAV1/2-Null 비히클 D7 대 AAV1/2-A53T 비히클(비쌍 t-검정).
도 5는 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후의 저용량 및 고용량의 레시니페라톡신의 단일 투여가, C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민 회전율(turnover)에 미치는 영향을 도시한다. 도파민 회전율은 대사물인 DOPAC 및 HVA 농도의 합을 도파민의 농도로 나눈 값으로 정의된다. ****: p < 0.0001, AAV1/2-Null 비히클 D7 대 AAV1/2-A53T 비히클 D7(만-휘트니(Mann-Whitney) U 검정); **: p = 0.0011, AAV1/2-Null 비히클 D14 대 AAV1/2-A53T 비히클 D14(만-휘트니 U 검정).
도 6a 및 6b는 전체 보행 분석 점수 및 판별 벡터를 도시한다. 도 6a에 도시된 AAV1/2 전달 D7 후 및 D14 후에 RTX/비히클을 투여한 그룹의 전체 보행 점수는, 모든 양측 측정된 보행 변수의 차등 값을 사용하여, 둘 다 D7 및 D14 투여 그룹인 AAV1/2-A53T 비히클과 AAV1/2-Null 비히클 사이의 모든 PC 점수의 차이에 기초한다. 점수는 "개인이 평균 AAV1/2-Null로부터 평균 AAV1/2-A53T 방향으로 얼마나 멀리 떨어져 있는지"로 해석될 수 있다. 그룹 평균+/-95% CI가 도시된다. 그래프의 좌측 및 우측 절반은 각각 D7 및 D14에 RTX/비히클을 투여한 그룹에 대한 결과를 도시한다. #: p < 0.01, AAV1/2-A53T 비히클 D7/D14 대 AAV1/2-Null 비히클 D7/D14(비쌍 t-검정); *: p < 0.05, AAV1/2-A53T 비히클 D7 및 AAV1/2-A53T RTX 0.04㎍ D7 및 AAV1/2-A53T 비히클 D7 및 AAV1/2-A53T RTX 0.125㎍ D7(비쌍 t-검정). AAV1/2 전달 D7 후 및 D14 후에 RTX/비히클을 투여한 그룹의 판별 벡터가 도 6b에 도시된다. 각각의 개별 운동학적 파라미터에 대한 막대 길이는 판별 점수(도 7)에서 각각의 변수에 가중치가 부여된 정도를 나타내고, 막대 방향은 AAV1/2-Null과 비교하여 파라미터 값의 증가 또는 감소를 나타낸다(예를 들면, 활보 속도의 감소 또는 좌측이 우측보다 작은 엉덩이 각 범위의 비대칭).
도 7은 10개의 베리맥스(Varimax)-회전된 주요 구성 요소을 사용하는 D7 및 D14 투여 그룹의 보행 파라미터의 PC 점수를 도시한다. 히트맵은 10개의 주요 구성 요소 각각에 차등적으로 영향을 미치는 본래 파라미터를 도시한다. 히트맵의 각각의 열은 파라미터들이 얼마나 상관되는지도 도시한다. 적색 = 양의 상관 관계, 청색 = 음의 상관 관계, 흑색 = 상관 관계 없음. 미세 운동 시험의 PC 점수 PC #1 내지 PC #10이 좌측에 제시된다(그룹 평균+/-SEM). PC 점수는 히트맵 우측에 나타낸 PC에 해당한다. 예를 들면, PC #2는, ILC 대각선 및 지지 대각선(대각선, 즉, 속족 케이던스) 둘 다의 증가 및 다른 케이던스 유형의 감소를 포함하여 "대각선 사지간 협응"으로 해석할 수 있다. 각각의 패널 상단의 PC 뒤 괄호 안의 %는 각각의 PC에서 설명되는 본래 데이터의 변동 퍼센티지를 나타낸다. # p < 0.05, AAV-A53T 비히클 D14 대 AAV-Null 비히클 D14(비쌍 t-검정); ### p < 0.001, AAV-A53T 비히클 D7 대 AAV-Null 비히클 D7(비쌍 t-검정); * p < 0.05, ** p < 0.005, AAV-A53T 비히클 D7 대 AAV-A53T RTX 0.125㎍ D7. PC = 주요 구성 요소, ILC = 사지간 협응.
도 8a 내지 도 8c는 D7 투여 그룹에서 최대 엉덩이 각 운동학적 파라미터에 대한 좌-우 비대칭의 존재를 도시한다. 도 14a 및 14b는 각각 좌측 및 우측 최대 엉덩이 각을 도시한다. 좌-우 차이는 도 14c에 도시된다. 그룹 평균+/-SEM이 도시된다.
도 9a 및 9b는 보행의 좌-우 비대칭의 편측 변화에 중점을 둔 D7 투여 그룹의 미세 운동 전체 보행 분석 점수를 도시한다. 도 9a는 76가지 개별 운동학적 파라미터에 대해 변환된 데이터 세트를 사용하여 생성된 판별 벡터를 도시하며, 여기서 좌측과 우측의 평균 대신 좌-우 차이가 사용된다. 도 9b는 D7 투여 그룹의 보행 판별 점수를 도시한다. 점수는 "개인이 평균 AAV-Null로부터 평균 AAV-A53T 비히클 방향으로 얼마나 멀리 떨어져 있는지"로 해석할 수 있다. 그룹 평균+/-SEM이 도시된다. #: p < 0.05(AAV-A53T 비히클 D7과 AAV-Null 비히클 D7 사이의 비쌍 t-검정).
도 10a 내지 도 10f는 보행의 좌-우 비대칭을 사용하는 D7 투여 그룹의 미세 운동 보행 분석을 도시한다. 좌측(도 10a), 우측(도 10b) 및 좌-우 차이(도 10c)에 대한 대각선 사지간 조정(또는 속족)으로 예시되는 일반 보행 패턴이 도시된다. 신체 자세 및 균형 메트릭(metric)인 전지 발가락 간격이 좌측(도 10d), 우측(도 10e) 및 좌-우 차이(도 10e)에 대해 도시된다. 그룹은 평균+/-SEM이 도시된다.
도 11a 내지 도 11f는 보행의 좌-우 비대칭을 사용하여 D7 투여 그룹의 미세 운동 기술 분석을 도시한다. 미세 운동 능력은 좌측(도 11a), 우측(도 11b) 및 좌-우 차이(도 11c)에 대한 후지 피크 스윙 속도를 평가했다. 좌측(도 11d), 우측(도 11e) 및 좌-우 차이(도 11f)에 대한 후지 스윙 속도 메트릭. 그룹 평균+/-SEM이 도시된다.

정의

본원에서 사용되는 "수막내로" 또는 "수막내 투여"는 지주막하 공간으로도 알려진 수막내 공간의 뇌척수액 내로의 약물 또는 약제학적 제형의 전달을 나타낸다.

본원에서 사용되는 "수조내로" 또는 "수조내 투여"는 뇌실의 뇌척수액 내로의 약물 또는 약제학적 제형의 전달을 나타낸다.

"치료하는"은 광범위하게 이해되어야 하며, 예를 들면 PD와 관련된 증상의 악화를 지연, 감속 또는 정지시키거나 이러한 증상을 적어도 부분적으로 치유(remedy)하는 것을 포함하는 임의의 유익한 효과를 포함한다. 치료는 또한 아래에 자세히 논의되는 바와 같이 모든 형태의 개선된 환자 기능을 가져오는 것을 포함한다.

"또는"은 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 포괄적인 의미로, 즉 "및/또는"과 동등하게 사용된다.

용어 "약"은 조성물의 활성 또는 안정성에 어떠한 유의한 영향도 미치지 않는 조성물의 성분의 양의 미미한 변화를 나타낸다. 일부 양태에서, "약"은 명시된 값의 10%, 5%, 2%, 1% 또는 0.5% 이내의 변동을 포함한다.

모든 범위는, "종점을 포함하지 않음"과 같은 명시적인 배제가 없는 경우 종점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 따라서, 예를 들면 "1 내지 10의 범위"는 값 1 및 10 및 1 초과 10 미만의 모든 정수 및 (적절한 경우) 비-정수 값을 포함한다.

용어 "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하다(contain)", "함유하다(contains)", "함유하는(containing)", "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함하는(includes)"는 제한하고자 하는 것이 아니다.

사용하기 위한 예시적인 방법 및 조성물

RTX가 수막내 또는 수조내 전달되는 파킨슨병(PD)의 치료 방법 및 파킨슨병 치료용 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기술된 방법은 RTX가 효과적인, 예를 들면 TrpV1 또는 이의 동족체에 결합 및 이를 활성화할 수 있고, PD에 대한 치료를 필요로 하는 임의의 대상체에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, RTX는 0.1 내지 100㎍의 용량으로 투여된다. 일부 양태에서, RTX의 용량은 0.1 내지 0.5㎍, 0.5 내지 1㎍, 1 내지 2㎍, 2 내지 5㎍, 5 내지 10㎍, 10 내지 20㎍, 20 내지 30㎍, 30 내지 40㎍, 40 내지 50㎍, 50 내지 60㎍, 60 내지 70㎍, 70 내지 80㎍, 80 내지 90㎍ 또는 90 내지 100㎍의 범위이다.

본 발명의 제형 중 RTX의 농도는 의도된 용량을 전달하기 위한 임의의 적합한 값일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 제형 중 RTX의 농도는 0.1 내지 300㎍/ml의 범위이다. 일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 제형 중 RTX의 농도는 0.1 내지 1㎍/ml, 1 내지 5㎍/ml, 5 내지 10㎍/ml, 10 내지 20㎍/ml, 10 내지 30㎍/ml, 20 내지 30㎍/ml, 20 내지 50㎍/ml, 50 내지 100㎍/ml, 100 내지 150㎍/ml, 150 내지 200㎍/ml, 200 내지 250㎍/ml 또는 250 내지 300㎍/ml의 범위이다. 일부 양태에서, 본 발명의 약제학적 제형 중 RTX의 농도는 5 내지 50㎍/ml 또는 8 내지 25㎍/ml의 범위이다.

농축된 스톡 용액으로부터 출발하여, 대상체 내로 전달하기 위한 RTX의 제형은 식염수와 같은 적절한 희석제에 희석하여 제조할 수 있다.

일부 양태에서, RTX 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 본 발명의 약제학적 제형의 pH는 6 내지 7.6의 범위이다. 본 발명의 제형은 폴리소르베이트 80 및 덱스트로스를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 폴리소르베이트 80의 농도는 2 내지 4% w/v이고/이거나 덱스트로스의 농도는 4 내지 6% w/v이다. 일부 양태에서, 폴리소르베이트 80의 농도는 3% w/v이고/이거나 덱스트로스의 농도는 5% w/v이다. 일부 양태에서, 임의의 상기 제형에서, RTX의 농도는 10 내지 30㎍/ml, 예를 들면, 10㎍/ml 또는 25㎍/ml일 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 제형은 예를 들면 표 1에 포스페이트 완충액에 대해 나타낸 농도 및 pH의 포스페이트 완충액를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명의 제형은 예를 들면 표 1에 NaCl에 대해 나타낸 농도의 NaCl을 추가로 포함한다. 포스페이트 완충액 및 NaCl 둘 다가 존재하는 경우, 포스페이트 완충액 및 NaCl은 개별 제형에 대해 나타낸 농도와 포스페이트 완충액 pH의 조합으로 존재할 수 있다(반드시 그렇지는 않음).

PD를 치료하기 위한 RTX는 수막내 또는 수조내 투여될 수 있다. 수막내 투여의 경우, PD 치료가 손의 운동 협응에 중점을 둘 때(손 운동 협응은 PD 환자에게 빈번한 문제임) 수막내 투여는 척주의 경부 또는 흉부 영역에 초점을 맞추어야 한다. 수조내 투여는 PD 치료를 위한 전신 접근법에 대해 선호된다. 다르게는, RTX는 C1-C5에서 척주의 상부에 수막내 투여될 수 있다.

중요하게는, 본원의 범위 내의 방법은 개선된 환자 기능을 제공할 수 있다. "개선된 환자 기능"은 감소된 통증, 감소된 침대에서 보내는 시간, 증가된 보행(ambulation), 보다 더 건강한 태도, 보다 다양한 생활 방식 및/또는 정상적인 근긴장도에 의해 허용되는 치유와 같은 임의의 하나 이상의 요인에 의해 계측되는 개선으로 정의될 수 있다. 개선된 환자 기능은 개선된 삶의 질(QOL)과 동의어이다. QOL은 예를 들면 알려진 SF-12 또는 SF-36 건강 설문 조사 점수 절차를 사용하여 평가할 수 있다. SF-36은 신체 기능, 신체 문제로 인한 역할 제한, 사회적 기능, 신체 통증, 일반 정신 건강, 감정 문제로 인한 역할 제한, 활력 및 일반 건강 인식의 8개 영역에서 환자의 신체적 건강 및 정신적 건강을 평가한다. 획득한 점수는 다양한 일반 모집단 및 환자 모집단에 사용할 수 있는 공개된 값과 비교할 수 있다.

실시예 1. 파킨슨병-유사(PD) 병리의 AAV-A53T 마우스 모델에 대한 RTX의 단일 수막내 투여의 효과

파킨슨병(PD)에 대한 생체내 마우스 연구를 사용하여, 뇌의 우측 반구의 흑색질(SN)에 대한 편측 아데노바이러스 벡터(AAV) 주입에 의해 8주령의 C57Bl/6J 수컷 마우스에 질환 상태가 먼저 유도되었다. 벡터는 돌연변이된 인간 A53T-α-시누클레인을 과발현하도록 구성된 컨스트럭트(construct)를 함유하고 있어, 이는 흑색 도파민성 뉴런의 퇴화 및 선조체에서의 도파민 수준의 감소를 초래한다. 이는 운동 결손을 포함하는 PD-유사 증상으로 이어지는 것으로 나타났다.

연구 시작시 총 142마리의 2개월령의 C57Bl/6J 마우스(수컷 126마리 및 암컷 16마리)를 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 표준 온도(22±1℃) 및 광 제어 환경(조명은 오전 7시부터 오후 8시까지 켜짐)에서 하우징했다.

본 연구의 목적은 PD-유사 병리의 AAV-A53T 마우스 모델에 대한 RTX의 단일 수막내 투여의 효과를 조사하는 것이었다. 본 연구를 시작하기 전에, 16마리의 수컷 및 16마리의 암컷 C57Bl/6J 마우스에 두 가지 용량(0.04㎍ 또는 0.125㎍)의 RTX를 주입한 후 24시간 동안 추적 관찰하여 치료의 모든 가능한 부작용을 관찰하는 파일럿 내약성 연구가 수행되었다.

파일럿 연구 암(arm)에서 사용된 총 32마리의 마우스 중, 총 4마리의 마우스가 RTX의 수막내 주입 후 24시간의 모니터링 기간 동안 사망했다. 0.125㎍ 용량으로 처리된 2마리의 암컷은 알 수 없는 이유로 주입 후 4 내지 24시간 이내에 케이지에서 사망한 채로 발견되었다. 또한, 동일한 투여 그룹에서 암컷 1마리와 수컷 1마리가 RTX 주입 직후 사망했다. 나머지 마우스에서는 유의한 부작용이 관찰되지 않았다.

본 연구를 위해, 총 110마리의 2개월령의 수컷 C57Bl/6J 마우스에 AAV-A53T(90마리 마우스) 또는 AAV-Null(20마리 마우스)을 흑색질에 편측 주입하여 각각 PD-유사 병리를 유도하거나 샴(sham) 대조군 역할을 하게 한다. 바이러스 주입의 효과를 제어하기 위해 AAV-Null(엠프티(empty)) 벡터가 주입된 마우스("샴-주입된" 마우스)를 사용하였다. AAV-A53T 매개 질환 모델 유도 7일 후 또는 14일 후, 마우스를 요추 척수 부위에서의 단일 수막내 주입에 의해 RTX(0.04㎍ 또는 0.125㎍)(5μL 용적, 0.03% w/v의 폴리소르베이트 80, 0.05% w/v의 덱스트로스, 30mM의 포스페이트 완충액 및 0.54% w/v의 NaCl을 함유하는 pH 7.2의 25㎍/ml RTX 용액으로 제조하고, 필요에 따라 식염수로 희석)로 처리했다. 각각의 시점당 하나의 AAV-Null 및 AAV-A53T 주입 그룹은 RTX 대신 비히클 처리되었다.

이어서, AAV 주입 7일 후 또는 14일 후에 마우스를 수막내 주입에 의해 RTX 또는 비히클로 처리했다. 마우스를 다음과 같이 처리 그룹들로 할당했다.

그룹 1: AAV-null을 샴-주입하고 D7에 비히클을 투여한 10마리 수컷 마우스.

그룹 2: AAV-A53T를 주입하고 D7에 비히클을 투여한 15마리 수컷 마우스.

그룹 3: AAV-A53T를 주입하고 D7에 0.04㎍의 RTX를 투여한 15마리 수컷 마우스.

그룹 4: AAV-A53T를 주입하고 D7에 0.125㎍의 RTX를 투여한 15마리 수컷 마우스.

그룹 5: AAV-null을 샴-주입하고 D14에 비히클을 투여한 10마리 수컷 마우스.

그룹 6: AAV-A53T를 주입하고 D14에 비히클을 투여한 15마리 수컷 마우스.

그룹 7: AAV-A53T를 주입하고 D14에 0.04㎍의 RTX를 투여한 15마리 수컷 마우스.

그룹 8: AAV-A53T를 주입하고 D14에 0.125㎍의 RTX를 투여한 15마리 수컷 마우스.

동물의 체중을 주당 2회 모니터링했다. 미세 운동 운동학적 분석을 AAV 주입 7주 후에 수행했다. AAV 주입 8주 후, 마우스를 안락사시키고 조직 샘플 수집에 적용했다. 도파민 및 이의 대사물을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 동측 및 대측 선조체로부터 분석했다.

모든 수술 절차는 무균 조건 하에 수행되었으며 적용 가능한 경우 멸균 물질, 용액 및 장비가 사용되었다. 바이러스 물질의 취급 및 정위 주입은 생물 안전성 수준 2(BSL-2) 층류 후드(laminar hood)(BioWizard Golden line 130, Kojair)에서 수행되었으며, 연구 관련 행동 시험은 BSL-1 상태 시설에서 수행되었다. AAV-벡터 주입 후 최대 1주일까지 마우스의 수술 절차 및 하우징은 BSL-2 수준 안전 규정(Council Directive 90/679/EEC) 및 시설에 따라 수행되었다.

먼저, 마우스를 5% 이소플루란(70% N₂O 및 30% O₂ 중, 유속 300ml/min)으로 마취하고 정위 프레임에 배치했다. 수술 동안 마취제의 농도는 1 내지 1.5%로 감소되었다. 직장 온도는 항온 블랭킷 시스템으로 37.0±1.0℃로 유지되었다. 피부를 내측 절개에 의해 개방하고 측으로 당겼다. 우뇌 반구를 두개골에 대한 소형 두개절제술을 통해 노출시켰다. 경막을 미세 포셉으로 조심스럽게 제거하고 AAV-Null 엠프티(5.1 x 1,012vg/mL) 또는 AAV-A53T(5.1 x 1,012vg/mL)로의 정위 주사를 다음과 같이 수행했다: 디지털 유도 주입 유닛(Digital Lab Standard™, Harvard Apparatus) 및 펌프(Pump 11, Elite Nanomite, Harvard Apparatus)에 마운팅된 10μL Hamilton 마이크로시린지에 연결된 블런트 주사 니들(30G)을 흑색질 수준으로 낮추었다. AAV 물질을 다음 좌표(브레그마에 대해 상대적)에서 흑색질에 편측 주입했다: AP = 3.0mm 후방; ML = 1.3mm; DV = 두개골 표면까지 4.2mm. 총 2μL의 벡터를 0.4μL/min의 속도로 주입했다. 주입 후, 캐뉼라를 추가로 5분 동안 제자리에 둔 후에 빼었다. 그 후 피부를 폐쇄하고 소독했다. 이후 마우스를 마취에서 회복시키고, 발생 가능한 수술 후 합병증에 대해 주의 깊게 모니터링했다. 초기 회복 후, 동물을 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 홈 케이지로 되돌렸다.

AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후에 마우스에게 RTX 또는 비히클을 수막내 투여했다. 먼저, 마우스를 2 내지 5% 이소플루란을 사용하여 마취시키고 수술 플랫폼 상에 엎드린 자세로 세트했다. 피부의 대상 영역을 면도한 후, 자일로카인 겔(2% 리도카인)을 상기 부위에 도포했다. 5분 후, 겔을 제거하고 피부 절개를 위한 소독 제제로서 요오드 용액으로 스크러빙했다.

척추후궁절제술을 경막을 파괴하지 않으면서 척수를 노출시키는 요추(L5) 수준에서 수행했다. 미세주입 시스템(Harvard Apparatus)에 마운팅된 10μL Hamilton 시린지에 부착된 캐뉼라를 지주막하 공간에 삽입하고, 경막 아래 10 내지 15mm까지 조심스럽게 낮춰 L5-L6 수준으로 진행하여 니들의 개구를 원하는 위치에 두었다. 니들과 경막 개구부 사이의 접합부를 조직 밀봉 접착제(Tisseel® Duo Quick, Baxter)로 밀봉하고 주입을 시작했다. 5μL의 제형화된 레시니페라톡신을 0.5μL/min의 속도로 주사한 후, 5분의 안정화 기간 후 캐뉼라를 수막내 공간으로부터 빼냈다. 회수 직후에 조직 밀봉 접착제의 또 다른 얇은 층을 도포하여 누출을 방지하기 위해 경막의 개구부를 폐쇄했다. 그 후, 근육과 피부를 층으로 폐쇄하고 소독했다. 마우스를 항온 케이지에서 회복되게한 후 홈 케이지로 되돌렸다.

AAV 및 수막내 주입 수술 전에, 마우스에 부프레노르핀(Temgesic®, 0.06mg/kg, 2mL/kg)을 제공했다. 추가의 용량의 부프레노르핀은 다음 48시간 동안 1일 2회 투여하여 총 5회 투여했다. 모든 마우스는 또한 탈수에 대해 모니터링했고, 수술 후 그리고 필요에 따라 추가로 0.9% 멸균 식염수(i.p.)를 제공했다.

전체 연구 기간 동안 마우스의 체중을 주 2회(월요일 및 금요일) 계측했다.

AAV-A53T 주입 8주 후, 마우스를 펜토바르비탈(Mebunat®, Orion Pharma)의 복강내 주사로 말기 마취시켰다. 이후 말기 심장 천자에 의해 약 500μL의 혈액을 수집하여 미리 냉각된 K₂-EDTA 튜브로 옮겼다. 원심분리(2,000g, 10분 +4℃)에 의해 혈장을 즉시 분리했다. 그 후, 150μL의 혈장을 2.0mL 폴리프로필렌 튜브에 수집하고 드라이아이스에서 동결시켰다. 혈장 샘플은 Sorrento Therapeutics, Inc.로 배송될 때까지 드라이아이스에서 -80℃에서 보관했다. 혈액 수집 후, 뇌에서 혈액을 제거하기 위해, 마우스를 헤파린 처리된(2.5IU/mL) 식염수로 경심 관류했다. 관류 직후, 뇌를 얼음 위에서 해부했다.

동측 및 대측 선조체를 1.5mL Eppendorf 튜브에 수집하고, 드라이아이스에서 급속 동결하고(즉, 좌측 및 우측 별도로), 칭량하고, 도파민 및 이의 대사물의 HPLC 분석을 위해 -80℃에서 보관했다.

마우스 선조체 조직 샘플에서의 도파민(DA), 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC) 및 호모바닐산(HVA)의 농도는 전기화학적 검출로의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 방법에 의해 측정했다. 얼음 위에서 해동한 후, 조직 샘플을 MSE Soniprep 150 초음파 붕해기(MSE Scientific Instruments, Crawley, UK)를 사용하여 0.1M 과염소산에 균질화(1:10, w/v)했다. 조직 균질물을 4℃에서 15,000g에서 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 폴리프로필렌 막(GHP Acrodisc 13 0.45㎛, Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA)을 통해 여과하고 0.1M 과염소산으로 희석(1:1)했다. 샘플을 플라스틱 바이알에 옮겨 즉시 분석했다.

ESA HPLC 시스템(ESA Inc., Chelmsford, MA, USA)은 582 용매 전달 시스템, DG-1210 진공 탈기 장치, 542 오토샘플러, 880 항온 챔버, 2채널 5014B 미세투석 셀 및 Windows 데이터 수집 모듈용 CoulArray®(버전 1.00)가 장착된 8채널 CoulArray® 5600 전기화학 어레이 검출기 장치로 구성된다. 인가되는 전위는 -175mV(채널 1), +225mV(채널 2), +350mV(채널 3) 및 +450mV(채널 4)이다. DA 및 DOPAC은 채널 2에서, HVA는 채널 3에서 감지된다. 주입 용적은 10μl이다.

분석물은 등용매 실시에서 Zorbax SB-Aq 예비 컬럼(2.1x12.5mm, 5㎛)으로 Zorbax SB-Aq 역상 컬럼(2.1×100mm, 3.5㎛, Agilent Technologies Inc., Little Falls, Wilmington, DE, USA)에서 분리했다. 컬럼을 35℃에서 유지했다. 이동상은 4.75mM 시트르산 1수화물, 7mM 1-옥탄설폰산 및 50μM 디나트륨 EDTA-아세토니트릴 혼합물(98:2, v/v)을 함유하는 100mM 1염기성 인산나트륨이었다. 이동상의 pH는 o-인산을 사용하여 2.2로 조정되었다. 유속은 0.3mL/분이었다. DA, DOPAC 및 HVA의 수준은 nmol/g 습윤 조직으로 표현되었다.

마우스의 미세 운동 기술은 보행 모드를 사용하여 주입 7주 후에 평가했다(MotoRater, TSE Systems, Homburg, Germany). 시험 당일 마우스는 데이터 분석 과정을 용이하게 하기 위해 신체의 적절한 지점들, 예를 들면, 사지의 관절 및 꼬리의 일부에 마킹했다. 운동 데이터는 고속 카메라(300frames/second)를 사용하여 3차원, 아래 및 양쪽에서 캡처했다. 맞춤형 자동 분석 시스템을 사용하여 다양한 보행 패턴 및 운동을 분석했다. 분석된 파라미터는 1) 일반 보행 패턴 파라미터(활보 시간 및 속도, 보폭, 활보 동안의 자세 및 유각 시간, 사지간 협응), 2) 신체 자세 및 균형(발가락 간격, 장골능 및 엉덩이 높이, 후지 내전 및 후퇴, 꼬리 위치 및 운동), 및 3) 미세 운동 기술(활보 동안의 유각 속도, 유각기 동안의 반사 메트릭, 상이한 관절들의 각 범위 및 편차, 수직 및 수평 머리 운동)을 포함한다.

보행 파라미터는 항상 여러(복잡한) 상호상관을 갖는다. 예를 들면, 보폭 기간이 짧고 보폭이 길수록 속도가 빨라진다. 주요 구성 요소 분석(PCA: principal component analysis)를 사용하여 상관관계가 높은 파라미터 세트로 나타나는 상이한 "보행 피처(feature)"를 식별할 수 있다. 주요 구성 요소 분석은 다변량 데이터 세트의 정보를 압축하고 원래 변수들 간의 상관관계를 밝혀, 궁극적으로는 새롭고 민감한 상관관계가 없는 파라미터들의 작은 세트인 주요 구성 요소(PC)를 생성하는 통계 도구이다.

PCA는 주요 구성 요소 계수 및 고유 벡터에 기초한 선형 변환이다. 변환된, 새로운 상관관계가 없는 변수를 PC 점수라고 한다. 제1 주요 구성 요소(PC)는 가능한 가장 큰 분산을 갖는 데이터의 이러한 선형 조합에 해당한다. 제2 PC는 제1 PC의 비율이 버려질 때 다시 남은 것의 가능한 가장 큰 분산을 가지며, 나머지 PC에 대해서도 마찬가지이다. 고유 벡터는 데이터의 내부 구조, 즉 상호 상관된 파라미터에 대한 정보도 나타낸다. 각각의 PC 점수는 해당하는 PC에서 강조되는 모든 파라미터의 조합된 정보를 나타낸다. 사용된 PC의 수는 Kaiser 기준(고유 값 > 1.0)을 사용하여 측정했다.

PC 결과 해석은 고유 벡터 회전 기술을 사용하여 단순화되었다. 회전은 고유 벡터가 간단한 구조를 달성하기 위해 조작되거나 각각의 고유 벡터의 분명히 0이 아닌 요소의 수가 합리적으로 가능한 한 낮게 최적화되는 절차이다. 본 연구에서 본 발명자는 직교성 보존 베리맥스 회전 절차를 사용했다.

마지막으로, PCA에 기초한 전체 보행 분석 점수를 측정했다. 점수는 모든 PC 점수(보행 전체 점수)에서 또는 큰 효과 크기를 나타내는(보행 판별 점수) PC에서의 AAV-null 비히클과 AAV-A53T 비히클 그룹 간의 차이를 기반으로 한다. 따라서, 상기 점수의 목적은 원래 변수의 질환 모델 특정 조합인 "핑거프린트"를 식별하는 것이며, 이는 질환 모델을 가능한 한 최상의 방식으로 특성화하고 두 그룹을 구별한다. "핑거프린트" 또는 판별 방향 벡터가 측정된 후, 각각의 개별 마우스의 (정규화된) 파라미터 데이터를 판별 방향 벡터에 투영하여 전체 보행 분석 점수를 얻을 수 있다. 궁극적으로는, 약리학적 제제의 전체 운동학적 효과를 매우 민감한 방식으로 확인할 수 있다.

동물은 실험실 직원에 의해 매일 모니터링했다. 동물의 일반 건강 상태가 크게 악화된 경우, CO₂ 과다 복용으로 희생시켜 단두했다. 허용 가능한 종점의 정의는 다음을 포함한다: 자발적인 운동이 없고, 24시간의 관찰 기간 동안 마시거나 먹을 수 없음, 대량 출혈, 자발적 염증, 해부학적 손실, 20mm보다 큰 부종 또는 종양, 30초의 기간 동안 스스로 교정할 수 없음.

연구 동안, 그룹 1, 2, 3, 4, 5 및 8에서 1마리의 마우스가 사라졌다. 그룹 3, 4 및 8의 마우스는 마취 하에 주입하는 동안 또는 주입 직후에 사망했다. 그룹 1, 2 및 5의 마우스는 종점 기준을 충족하기 때문에 수막내 투여 1일 후에 안락사시켰다.

C57Bl/6J 수컷 마우스의 체중에 대한 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 0.04㎍ 또는 0.125㎍ RTX의 단일 투여 효과가 도 1에 제시되어 있다. 8주의 연구 기간 동안 그룹들 사이에 상당한 차이가 관찰되지 않았다(투-웨이 ANOVA).

C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민 및 이의 대사물 수준에 대한, 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 두 가지 용량의 레시니페라톡신의 단일 투여 효과가 도 2 내지 5에 제시되어 있다. 분석은 HPLC로 수행했다. 통계적 분석을 위해, AAV-Null 주입 그룹은, A53T α-시누클레인 형질전환 유전자 삽입만의 효과를 관찰하기 위해, 먼저 비히클로 수막내 처리된 AAV-A53T 그룹과 비교했다. 그 후, AAV-A53T 비히클 그룹을 0.04㎍ 또는 0.125㎍의 레시니페라톡신으로 처리한 AAV-A53T 그룹과 비교하여, 레시니페라톡신의 가능한 치료 효과를 관찰했다. 7일 그룹 및 14일 그룹을 별도로 분석했다.

C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민(DA) 수준에 대한, 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 두 가지 용량의 RTX 단일 투여 효과가 도 2에 제시되어 있다. AAV-A53T 주입은 비히클로 수막내 처리된 시점 둘 다에서 동측 선조체에서의 도파민 수준의 유의한 감소를 초래했다. AAV-A53T 주입 7일 후에 고용량의 레시니페라톡신으로 처리된 마우스에서 더 높은 도파민 수준으로의 경미한 경향이 있었다. 그러나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(원-웨이 ANOVA). 반면, 14일에 레시니페라톡신으로 처리된 그룹에서 도파민 수준이 더 낮은 경미한 반대이고 유의하지 않은 경향이 관찰되었다.

C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 3,4-디하이드록시페닐아세트산(DOPAC) 수준에 대한, 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 두 가지 용량의 RTX의 단일 투여 효과가 도 3에 제시되어 있다. AAV-A53T 주입은 비히클로 수막내 처리한 시점 둘 다에서 동측 선조체에서의 DOPAC 수준의 상당한 감소를 초래했다. AAV-A53T 주입 7일 후에 고용량의 레시니페라톡신으로 처리된 마우스에서 더 높은 DOPAC 수준으로의 경미한 경향이 있었다. 그러나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(원-웨이 ANOVA). 14일에 레시니페라톡신으로 처리된 그룹에서 DOPAC 수준이 더 낮은 경미한 반대이고 유의하지 않은 경향이 관찰되었다.

C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 호모바닐산(HVA) 수준에 대한, 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 두 가지 용량의 RTX 단일 투여 효과가 도 4에 제시되어 있다. AAV-A53T 주입은 비히클로 수막내 처리한 시점 둘 다에서 동측 선조체에서의 HVA 수준을 유의하게 감소시켰다. AAV-A53T 주입 7일 후에 고용량의 레시니페라톡신으로 처리된 마우스에서 더 높은 농도로의 경미한 경향이 있었다. 그러나, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(원-웨이 ANOVA). 14일에 레시니페라톡신으로 처리된 그룹에서 HVA 수준이 더 낮은 경미한 반대이고 유의하지 않은 경향이 관찰되었다.

C57Bl/6J 수컷 마우스의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민 회전율에 대한, 편측 AAV-A53T 또는 AAV-Null 주입 7일 후 또는 14일 후 두 가지 용량의 RTX 단일 투여 효과가 도 5에 도시되어 있다. 도파민 회전율은 대사물 DOPAC 및 HVA 농도의 합을 도파민 농도로 나눈 값으로 정의된다. AAV-A53T 주입은 비히클로 수막내 처리된 시점 둘 다에서 동측 선조체에서의 도파민의 전환율을 유의하게 증가시켰다. AAV-A53T 주입 7일 후 및 14일 후 용량 둘 다의 레시니페라톡신으로 처리된 마우스에서 훨씬 더 높은 회전율로의 약간의 경향이 있었다. 그러나, 이러한 치료 효과는 통계적으로 유의하지 않았다(크러스컬-월리스(Kruskal-Wallis) 검정).

편측 AAV1/2-A53T-aSyn 주사가 운동 장애를 초래했는지 여부를 조사하기 위해, AAV1/2 주입 7주 후에 운동학적 보행 분석을 사용하여 미세 운동 기술 및 보행 결함을 계측했다.

먼저, 각각의 분석된 보행 사이클의 95개의 보행 파라미터를 평가했다. 좌측 및 우측의 파라미터 값은 가능한 경우 초기에 별도로 측정했다. AAV1/2-Null 대조군 그룹과 관련하여 가장 뚜렷한 AAV1/2-A53T-유도 보행 차이(p < 0.05, 비쌍 t-검정, 불균등 분산 가정)는 사지간 협응 및 전체 속도 감소와 관련이 있다: 후지(D7 및 D14) 및 전지(D14) 입각 시간이 증가됨, 동측 보행(페이스)가 증가됨(D7 및 D14), 대각선 보행(속족)이 감소됨(D7 및 D14 둘 다, 지지 대각선 파라미터에서 확인됨), 특히 후지의 이중 지지 및 동작 사이클이 증가됨(D7 및 D14), 세 지(three limb)의 지지 시간이 증가됨(D7). 또한, 미세 운동 기능을 설명하는 파라미터, 예를 들면, 후지 발가락 간격의 감소(D7), 운동의 엉덩이 각 범위의 편차의 증가(D7), 머리 운동의 증가(D14), 전지 발가락 들어올리기 각의 감소(D7), 후지 궤적 높이 프로파일의 감소(D14)도 상당한 변화가 관찰되었다.

전체 보행 분석 점수는 비히클-처리된 AAV1/2-A53T 마우스에서의 AAV1/2-A53T-유도 보행 장애를 AAV1/2-Null 대조군 그룹과 비교하여 평가하기 위해 확립되었으며, 좌-우 비대칭에 중점을 두었다. 전체 보행 점수는 PCA를 사용하여 구성된 판별 벡터에 의해 그리고 두 그룹(D7 및 D14 비히클 처리 그룹에서 풀링됨)의 PC 점수 차이를 활용하여 측정했다. PCA에 사용된 데이터 세트는 76개의 선택된 파라미터로 구성되었고, 모든 양측 측정된 파라미터는 좌측과 우측의 차이로 표현되었다. 모든 파라미터는 표준 점수에 대해 정규화되었다. 판별 벡터 막대 그래프(도 6b)는 다음과 같이 해석될 수 있는 AAV1/2-A53T 유도 보행 변화를 가장 잘 특성확인하고 포착하는 변수들의 조합을 보여준다: 전체 속도(보폭 시간, 거리 및 속도)는 더 느려지고, 이중 지지 단계는 특히 후지에서 증가했다. 또한, 대각선 지지의 비율이 감소하고 지지 3 및 4(3개 또는 4개의 지가 동시에 지면에 접촉)가 증가했다. 가장 뚜렷한 좌-우 비대칭은 엉덩이 각(최대 및 범위), 전지 발가락 간격, 후지 후퇴 및 후지 유각 속도에서 나타났다.

판별 벡터에서 강조되는 이러한 보행 변수 모두를 함께 압축하면, 전체 보행 분석 점수는 D7 및 D14 비히클 처리된 그룹 둘 다에서 매우 유의한 AAV1/2-A53T-aSyn 유도 표현형을 나타낸다(비쌍 t-검정, AAV-Nell 대 AAV-A53T 비히클; p < 0.0001(D7), p < 0.01(D14)).

AAV1/2-A53T 유도된 운동 결핍에 대한 초기 RTX 치료(D7) 효과의 분석은, AAV1/2-Null 그룹으로의 전체 보행 분석 점수의 이동으로 표시되는, 운동 기능의 RTX 용량 의존적 회복을 보였다. 저용량 및 고용량의 RTX 처리 후 전체 보행 점수의 회복은 AAV1/2-A53T 비히클 처리 대조군 그룹과 비교하여 유의하게 개선되었으며(원-웨이 ANOVA, p = 0.0013에 이어 던넷(Dunnett) 시험: p = 0.0063(RTX 0.04㎍), p = 0.0011(RTX 0.125㎍)), 이는 유익한 치료 효과를 시사한다(도 6a). D14 그룹의 치료 효과는 통계적으로 유의하지 않았다(p > 0.05; 원-웨이 ANOVA). 그러나, AAV1/2-A53T 비히클 마우스와 비교시 RTX 처리 그룹 둘 다에서 AAV1/2-Null 그룹으로의 경향이 있었다.

다음으로, 본 발명자는 RTX 치료에 의해 유의하게 회복된 별도의 보행 파라미터(p < 0.05, 비쌍 t-검정)를 조사했으며, 이는 전체 점수의 차이를 설명한다. 본 발명자는 AAV-A53T 비히클 그룹과 비교하여 RTX 처리 그룹에서 다음의 차이를 관찰했다: 활보 시간 및 후지 입각 시간(D7 고용량), 대각선 보행(D7 용량 둘 다) 및 지지 대각선(D7 고용량), 지지 3(D7 고용량), 동측 및 상동 보행(D7 고용량), 엉덩이 ROM(D7 용량 둘 다, D14 고용량) 및 엉덩이 ROM 편차(D7, 고용량), 최소 무릎 각(D7 고용량), 머리 회전(D14, 용량 둘 다) 및 단일 및 이중 지지(D7 고용량). 전체 보행 점수와 유사하게, 단일 보행 파라미터에서의 이러한 관찰된 RTX-유도된 차이는 AAV-Null "건강한" 대조군 그룹의 방향에 있었다. 중요하게는, 이러한 파라미터의 개선에서 관찰된 RTX의 효능은, 처음에 AAV1/2-A53T 전달에 의해 영향을 받은 것과 대부분 동일했으며, 이는 동물의 기능적 운동 회복을 나타낸다.

D14 AAV-Null 그룹의 4마리 마우스는 이들의 보행 성능이 수막내 외과 수술로 인한 척수 손상을 시사했기 때문에 보행 분석에서 제외되었다. 또한, D14 AAV-A53T 비히클 그룹의 2마리의 동물이 제외되었다. 상기 동물 둘 다 보행 장애의 징후가 없었고, 다른 동물은 건강한 동물 수준의 동측 선조체 도파민 농도에 의해 나타난 바와 같이 AAV1/2-A53T 형질도입에 실패했을 가능성이 있는 것으로 확인되었다.

10개의 베리맥스 회전 주요 구성 요소를 사용하는 D7 및 D14 투여 그룹의 보행 파라미터의 PCA가 도 7에 도시되어 있다. 히트맵(우측에 도시됨)는 10개의 주요 구성 요소 각각에 차등적으로 영향을 미치는 본래 파라미터를 예시한다. 히트맵의 각각의 열은 파라미터들이 얼마나 상관하는지도 보여준다: 백색 = 양의 상관관계, 회색 = 음의 상관관계, 흑색 = 상관관계 없음. 미세 운동 시험의 PC 점수 PC #1 내지 PC #10은 좌측에 제시된다(그룹 평균+/-SEM). PC 점수는 우측 히트맵에 도시된 PC에 해당한다. 예를 들면, PC #2는 ILC 대각선 및 지지 대각선(대각선, 즉, 속족 케이던스) 둘 다의 증가 및 다른 케이던스 유형의 감소를 포함하여 "대각선 사지간 협응"으로 해석될 수 있다. 각각의 패널 상단의 PC 뒤 괄호 안의 %는 해당 PC에서 설명하는 본래 데이터의 변동 퍼센티지를 나타낸다. # p < 0.05, AAV-A53T 비히클 D14 대 AAV-Null 비히클 D14(비쌍 t-검정); ### p < 0.001, AAV-A53T 비히클 D7 대 AAV-Null 비히클 D7(비쌍 t-검정); * p < 0.05, ** p < 0.005, AAV-A53T 비히클 D7 대 AAV-A53T RTX 0.125㎍ D7. PC = 주요 구성 요소, ILC = 사지간 협응.

토의. 본 연구에서, 파킨슨병-유사 상태는 뇌의 우측 반구의 흑색질(SN)에 대한 편측 아데노바이러스 벡터(AAV) 주입에 의해 8주령의 C57Bl/6J 수컷 마우스에서 먼저 유도되었다. 돌연변이된 인간 A53T-α-시누클레인을 과발현하는 것을 목표로 하는 벡터의 주입은 흑색질 도파민성 뉴런의 퇴화 및 선조체에서의 도파민 수준의 감소를 유도한다. 이것은 운동 결손을 포함하는 파킨슨병-유사 증상으로 이어지는 것으로 나타났다. 바이러스 주입 자체의 효과를 제어하기 위해, AAV-Null(엠프티) 벡터 주입된 마우스의 대조군 그룹을 사용했다. AAV-A53T 매개 질환 모델 유도 7일 후 또는 14일 후, 마우스를 요추 척수 영역에서의 단일 수막내 주입에 의해 비히클 또는 레시니페라톡신(RTX, 0.04㎍ 또는 0.125㎍)으로 처리했다. AAV-Null-처리된 건강한 대조군 마우스를 7일 또는 14일에 비히클로 처리했다.

연구는 저용량 또는 고용량의 수막내 RTX 투여의 유의한 부작용을 나타내지 않았다. 연구에서의 사망(110마리 중 6마리 쥐)은 그룹들 간에 고르게 분산되었으며, 2마리의 비히클 처리된 마우스를 포함했다. 또한, 이들 중 3마리는 투여 동안 또는 투여 후에 마취 동안 사망했다. 사망의 나머지는 수막내 주입 후 24시간 이내에 관찰되었다. 마우스를 모니터링한 결과, 이러한 마우스가 수술에서 제대로 회복되지 않은 것으로 나타났으며, 이는 무기력하고 수동적인 행동으로 나타낸다. 사망이 비히클과 RTX 저용량 및 고용량 둘 다의 그룹 사이에 고르게 퍼졌기 때문에, 이는 침습적 수술 절차 및 마취 합병증으로 인해 발생했을 가능성이 크다. 나머지 마우스에서는 부작용이 관찰되지 않았다. 또한, 연구 동안 비히클 및 RTX 처리된 그룹에서 유사하게 꾸준한 체중 증가가 관찰되었다.

미세 운동 능력의 분석은 AAV 주입 7주 후 및 RTX로의 치료 6주 후 또는 5주 후에 수행되었다. AAV-A53T-매개된 질환 상태는 AAV-Null 및 각각의 AAV-A53T 비히클 그룹 사이에서 매우 유의미한 차이로 관찰되었다. AAV-A53T 비히클 그룹을 레시니페라톡신 처리 그룹과 비교하면, RTX-처리된 그룹이 AAV-Null("건강한") 그룹으로 이동함에 따라, 저용량 및 고용량 둘 다의 초기(D7) 치료 그룹에서 RTX의 상당한 치료 효과도 나타냈다. AAV-A53T 주입 14일 후 RTX로 처리한 그룹에서, 각각의 AAV-Null 그룹으로의 유사하지만 통계적으로 유의하지 않은 경향이 있었다. 주요 구성 요소 분석에 의해 개별 파라미터들을 분리할 때, 이러한 보행 구조 효과는 사지간 협응과 관련된 파라미터 및 예를 들면 증가된 엉덩이 각 범위로 나타내는 비대칭 변화를 보상하려는 시도를 나타내는 파라미터에서 가장 강력했다. 또한, AAV-A53T 비히클-처리된 마우스의 보행 사이클은, 인간 PD에 대해 전형적인 덜 부드러운 보행을 나타내는 상당히 더 많은 "반사 움직임"을 가졌다. AAV-A53T를 편측 주입한 마우스에서 비대칭적인 보행 변화가 예상된다.

AAV-Null 그룹은, 돌연변이된 A53T-α-시누클레인을 갖는 바이러스 벡터로 처리된 동측측에서 상당히 더 낮은 수준의 도파민 및 대사물 수준을 갖는 AAV-A53T 주입 마우스에 대하여 유사한 수준의 동측 및 대측 선조체에서의 도파민, DOPAC 및 HVA를 가졌다. 이러한 결과는 질환 모델이 D7 및 D14 그룹 둘 다에서 성공적으로 유도되었음을 나타낸다. 그러나, 비히클이 투여된 AAV-A53T 군과 RTX로 처리된 상응하는 군 사이에서 도파민 및 이의 대사물 수준을 비교시, RTX 치료의 유의한 효과는 나타내지 않았다. 이는 보행 장애의 상당한 완화가 흑색질 선조체 도파민성 경로와 직접 관련되지 않은 메커니즘을 통해 전달되었음을 시사한다. 신경 염증은 PD에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이의 감쇠는 RTX의 관찰된 유익한 효과에 대한 가능한 설명 중 하나일 수 있다.

결론적으로, AAV-A53T 모델 유도 7일 후의 RTX의 수막내 투여는, AAV 주입 7주 후에 운동 능력을 분석했을 때 C57Bl/6J 수컷 마우스에서 유의한 구조 효과를 가졌다. AAV-A53T 주입 14일 후에 RTX로 처리한 그룹에서 유사한 통계적으로 유의하지 않은 경향 효과가 관찰되었다. 그러나, 모델 유도 8주 후에 선조체에서 분석된 도파민 및 대사물 수준은 흑색질 선조체 도파민성 경로와 직접적으로 관련되지 않은 작용 기전을 시사하는 유의한 치료 효과를 나타내지 않았다. RTX 치료의 유의한 부작용은 관찰되지 않았다.

실시예 2. 좌-우 비대칭을 설명하는 보행 분석

상기 설명된 연구로부터의 D7 미세 운동 보행 분석 데이터를, 양측에서 발생하고 "정상" 전체 보행 점수에서 포착되는 변화를 평가하는 대신, 운동학적 파라미터에서 좌-우 비대칭이 어떻게 나타나는지를 측정하기 위해 재평가했다.

일반적으로, 동물의 좌측 및 우측 둘 다 시험 파라미터에 대해 평가되었고, 전체 점수 및 판별 벡터는 특정 파라미터에 대한 좌측 값 및 우측 값 둘 다의 평균에 기초한다. 예를 들면, 최대 엉덩이 각은 좌측 각과 우측 각의 평균으로 측정되며, AAV-Null 비히클 그룹 및 AAV-A53T 비히클 그룹 둘 다에서 유사하다. 그러나, 도 8a 내지 8c에 도시된 바와 같이, 최대 엉덩이 각의 좌측 계측 및 우측 계측이 별도로 분석되었을 때, AAV-A53T 비히클 처리된 마우스의 최대 엉덩이 각은 AAV-Null 마우스와 비교시 우측(도 8b)에서보다 좌측(도 8a)에서 더 작다. 도 8c는 AAV-A53T 비히클 처리된 마우스에서 엉덩이 각의 최대 좌-우 차이가 가장 크다는 것을 도시한다. AAV-A53T 및 0.05㎍ RTX(n = 14) 및 AAV-A53T 및 0.124㎍ RTX(n = 14)로 처리된 마우스는 AAV-A53T 및 비히클 처리된 마우스와 비교시 최대 차이의 감소를 나타냈다.

미세 운동 보행 분석은 변환된 데이터 세트를 사용하여 판별 벡터를 생성함으로써 수행되었으며, 여기서 좌측과 우측의 평균 대신 좌-우 차이가 사용되었다. 도 9a에 도시된 바와 같이, 막대의 길이는 AAV-Null 그룹과 비교하여 AAV-A53T 비히클 그룹에서 두드러진 파라미터의 좌-우 비대칭에 해당한다. PCA 분석에 사용된 개별 보행 파라미터는 7일에 투여된 그룹에 대해 도시된다. 도 9b에서, 좌-우 보행 차이 판별 점수는 AAV-A53T 비히클 그룹에서 유의한 표현형을 도시한다. RTX로 처리된 그룹 둘 다는 AAV-A53T 비히클 그룹과 비교하여 유의하게 더 낮은 판별 벡터 점수를 나타내었다(p < 0.05, 비쌍 t-검정).

좌-우 비대칭은 또한 사지간 협응, 엉덩이 기능, 유각 속도 및 간격을 둔 전지와 같은 다른 보행 파라미터에 대해 분석되었다. 대각선 사지간 협응에서 나타나는 좌-우 비대칭은 도 10a 내지 10c에 도시된다. 좌측 및 우측에 대한 대각선 사지간 협응의 퍼센티지 그래프는 각각 도 10a 및 10b에 도시된다. AAV-A53T 비히클 그룹의 경우, 우측보다 좌측의 대각선 사지 협응이 더 낮다. 좌-우 차이는 도 10c에 도시되어 있으며, RTX 저용량 그룹 및 고용량 그룹 둘 다의 마우스가 AAV-A53T 비히클 처리된 마우스의 범위에 있는 대각선 사지간 협응의 차이보다 더 적은 차이를 나타내기 때문에, RTX 치료 효과를 나타낸다. 신체 자세 및 균형의 측면인 앞발가락 간격 파라미터가 도 10d 내지 10f에 도시된다. 좌측, 우측 및 좌-우 차이가 각각 도 10d, 10e 및 10f에 도시되어 있다. AAV-A53T 비히클 마우스는 우측(도 10e)보다 좌측(도 10d)에서 더 큰 발가락 간격을 보여준다. 좌-우 차이 그래프(도 10f)는 RTX 처리된 마우스 그룹 둘 다가 AAV-Null 비히클 마우스와 유사하고 AAV-A53T 비히클 그룹과 구별되는 발가락 간격을 나타냄을 도시한다.

도 11a 내지 11f에 도시된 바와 같이, 후지 피크 유각 속도 및 유각 속도 메트릭의 좌-우 비대칭을 조사함으로써 미세 운동 능력을 추가로 평가했다. 좌측 및 우측에 대한 후지 피크 유각 속도(cm/s)의 그래프가 각각 도 11a 및 11b에 도시되어 있다. RTX 처리된 그룹 둘 다의 피크 유각 속도 좌-우 차이는, 도 11c에 도시된 바와 같이 AAV-A53T 비히클 D7 그룹에 비해 감소된다. 좌측 및 우측에 대한 후지 유각 속도(cm/s)의 그래프가 각각 도 11d 및 11e에 도시되어 있다. RTX 처리된 그룹 둘 다의 좌-우 차이는 도 11e에 도시된 바와 같이 AAV-A53T 비히클 D7 그룹에 비해 감소된다.

Claims (13)

1. 파킨슨병(Parkinson's disease: PD)의 치료 방법으로서, PD의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 레시니페라톡신(RTX)을 수막내(intrathecally) 또는 수조내(intracisternally) 투여함을 포함하는, 방법.
2. 파킨슨병(PD)의 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한, 레시니페라톡신(RTX)을 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 방법이 상기 대상체에게 상기 조성물을 수막내 또는 수조내 투여함을 포함하는, 조성물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 성인 인간인, 방법 또는 조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RTX가 약 0.1 내지 약 100㎍의 용량으로 투여되는, 방법 또는 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 용량이 약 0.1 내지 약 1㎍, 약 1 내지 약 5㎍, 약 5 내지 약 10㎍, 약 10 내지 약 20㎍, 약 20 내지 약 50㎍ 또는 약 50 내지 약 100㎍인, 방법 또는 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 수막내 투여를 포함하는, 방법 또는 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 수조내 투여를 포함하는, 방법 또는 조성물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RTX가, 상기 RTX 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형으로 투여되는, 방법 또는 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 물을 포함하는, 방법 또는 조성물.
11. 제9항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 담체가 식염수를 포함하는, 방법 또는 조성물.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RTX가 1 내지 100㎍/ml의 범위의 농도로 상기 약제학적 제형에 존재하는, 방법 또는 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 RTX가 1 내지 5㎍/ml, 5 내지 10㎍/ml, 10 내지 20㎍/ml, 20 내지 50㎍/ml 또는 50 내지 100㎍/ml의 범위의 농도로 상기 약제학적 제형에 존재하는, 방법 또는 조성물.

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