JP2022514695A - レシニフェラトキシンを投与することによってパーキンソン病を処置するための方法 - Google Patents
レシニフェラトキシンを投与することによってパーキンソン病を処置するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与によって投与することを含む方法が開示される。一部の実施形態では、ヒト成体に対するＲＴＸの用量は、約０．１μｇから約１００μｇである。本発明は、例えばパーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、ＰＤの処置を必要とする対象に有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与することを含む方法を提供する。
Description
本出願は、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１８年１２月２４日出願の米国仮出願第６２／７８４，６５０号および２０１９年１０月１１日出願の米国仮出願第６２／９１４，１７０号に基づく優先権の利益を主張するものである。
技術分野
本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与によって投与することを含む方法を提供する。
本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与によって投与することを含む方法を提供する。
序論および要旨
ＲＴＸは、トウガラシの主要な辛味成分であるカプサイシンの超強力類似体として作用する。ＲＴＸは、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａのある特定の種から単離される三環式ジテルペンである。ホモバニリル基がカプサイシンの重要な構造的特色であり、また、レシニフェラトキシンと典型的なホルボール関連化合物を区別する最も顕著な特色である。天然のＲＴＸは以下の構造を有する：
ＲＴＸは、トウガラシの主要な辛味成分であるカプサイシンの超強力類似体として作用する。ＲＴＸは、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａのある特定の種から単離される三環式ジテルペンである。ホモバニリル基がカプサイシンの重要な構造的特色であり、また、レシニフェラトキシンと典型的なホルボール関連化合物を区別する最も顕著な特色である。天然のＲＴＸは以下の構造を有する：
ＲＴＸならびにチニアトキシンおよび他の化合物（ジテルペンの２０－ホモバニリルエステル、例えば、１２－デオキシホルボール１３－フェニルアセテート２０－ホモバニレートおよびメゼレイン２０－ホモバニレートなど）などの類似体化合物は、米国特許第４，９３９，１９４号；同第５，０２１，４５０号；および同第５，２３２，６８４号に記載されている。他のレシニフェラトキシン型ホルボイドバニロイドも同定されている（Szallasi et al. (1999) Brit. J. Pharmacol. 128: 428-434）。
ＲＴＸは、ＴｒｐＶ１アゴニストとして公知である。ＴｒｐＶ１は、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１（バニロイド受容体－１（ＶＲ１）としても公知）であり、侵害受容性一次求心性ニューロンにおいて顕著に発現される多量体陽イオンチャネルである（Caterina et al. (1997) Nature 389: 816-824；Tominaga et al. (1998) Neuron 21: 531-543）。ＴｒｐＶ１の活性化は、典型的には、痛みを伴う熱によって印加されることによって神経終末において起こり、特定の型の炎症性刺激の間、上方制御される。末梢組織における化学的アゴニストによるＴｒｐＶ１の活性化により、カルシウムチャネルの開口および痛覚の伝達がもたらされる（Szalllasi et al. (1999) Mol. Pharmacol. 56: 581-587）。しかし、ＴｒｐＶ１を発現するニューロン（神経節）の細胞体にある特定のＴｒｐＶ１アゴニストを直接付与することにより、カルシウムチャネルが開口し、プログラム細胞死（「アポトーシス」）に至る事象のカスケードが誘発される（Karai et al. (2004) J. of Clin. Invest. 113: 1344-1352）。
パーキンソン病は、高齢化集団において発生が増加する運動障害（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である。パーキンソン病は、老年期の一般的な活動不能疾患であり、米国では６０歳を超える集団の約１パーセントに影響を及ぼしている。パーキンソン病の発生率は年齢と共に上昇し、個体が当該疾患を発症する累積的な生涯リスクは約４０名に１名である。症状としては、四肢の著しい振戦、動作緩慢、強剛および姿勢変化が挙げられる。パーキンソン病の認識されている病態生理学的原因は、脳幹に位置する基底核である、黒質の緻密部を含む大脳基底核におけるドーパミン産生細胞の進行性破壊である。ドーパミン作動性ニューロンの喪失により、アセチルコリンの相対的過剰がもたらされる。Jellinger, J. Neural. Transm. 56 (Supp) ; 1-29: 1999。
パーキンソン病は、軽度の四肢の強剛および低頻度の振戦で始まり、１０年またはそれよりも長い期間にわたって、頻繁な振戦および記憶障害まで、制御できない振戦および認知症まで進行する可能性がある、進行性障害である。
パーキンソン病を処置するために使用される薬物としては、Ｌドパ、セレギリン、アポモルヒネおよび抗コリン薬が挙げられる。Ｌドパ（レボ－ジヒドロキシ－フェニルアラニン）（シネメット）は、血液脳関門を横断することができ、脳においてドーパミンに変換され得るドーパミン前駆体である。残念ながら、Ｌドパは体内での半減期が短く、また、長期使用後（すなわち約４～５年後）にＬドパの効果が散発的で予測不可能なものになり、その結果、運動機能の変動、ジスキネジアおよび精神医学的副作用が生じることが典型的である。さらに、Ｌドパは、ビタミンＢ欠損を引き起こす恐れがある。
セレギリン（デプレニル、エルデプリル）は、Ｌドパの代替として使用されており、脳におけるドーパミンの分解を低減することによって作用する。残念ながら、セレギリンは約９カ月間使用後に効果がなくなる。アポモルヒネは、ドーパミン受容体アゴニストであり、パーキンソン病を処置するために使用されているが、それ自体で使用した場合には重症の嘔吐、ならびに皮膚反応、感染、嗜眠状態およびいくらかの精神医学的副作用を引き起こす。
全身投与される抗コリン薬（例えば、ベンズヘキソールおよびオルフェナドリンなど）も、パーキンソン病を処置するために使用されており、これらは、脳で産生されるアセチルコリンの量を減少させ、それにより、パーキンソン病において存在するドーパミン／アセチルコリン不均衡を正すことによって作用する。残念ながら、抗コリン薬の全身投与を受けている患者の約７０％で、幻覚、ならびに運動障害（ｄｙｓｋｉｎｅｔｉｃ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、および視覚への影響、嚥下困難、口渇および尿閉を含めた広範囲の抗コリン薬分布に起因する他の影響を含めた重篤な神経精神医学的副作用が生じる。（Playfer, Postgrad. Med. J., 73; 257-264: 1997およびNadeau, J. Am. Ger. Soc., 45; 233-240: 1997）。
１９６９年にＬドパが取り入れられる前は、パーキンソン病の処置をもたらす少数の処置のうちの１つは定位的外科手術であった。片側性定位的視床破壊術は対側性振戦および強剛の制御に有効な場合があるが、不全片麻痺のリスクがある。両側性視床破壊術は発語障害および嚥下障害が生じるリスクが大きい。定位的蒼球破壊術、淡蒼球（大脳基底核）の一部の外科的アブレーションも使用されており、一部成功している。外科的切除に加えて、一部の場合では、中間腹側核に設置した高周波刺激電極により、異常運動が抑制されることが見いだされている。コンピュータ断層撮影法および磁気共鳴画像法を含めた、プローブの厳密な位置づけを可能にする様々な技法が存在する。残念ながら、これらの外科手技は、パーキンソン病の無動、発語障害および歩行障害の症状にはほとんど役に立たず、これらは全て破壊的脳病変につながる。
振戦および他のパーキンソン病の症状の処置のための淡蒼球およびレンズ核ワナに対する頭蓋内破壊が行われている。淡蒼球破壊術の長期的結果は、時には期待外れのものであった。以下の視床核に破壊を与えることにより振戦の外科的抑止の正の結果が得られている：（１）視床腹中間（Ｖｉｍ）核または後外側腹側（ＶＬｐ）核；（２）前吻側腹側（Ｖｏａ）核（ＶｏａおよびＶｏｐは集合的に前外側腹側核（ＶＬａ）と称されている）；（３）後吻側腹側（Ｖｏｐ）核；（４）視床下核（視床直下部切断術）、ならびに；（５）ＣＭ－Ｐｆ視床核。一般に、パーキンソン病、および全身投与される薬物に抵抗性の他の振戦の処置において選択されている外科的標的は視床腹外側である。ほとんど全ての皮質活性には皮質の視床興奮が必要である。
機能亢進性淡蒼球および視床下核を標的とする進行した薬剤抵抗性パーキンソン病の管理には定位的外科手術（神経画像処理および電気生理学的記録により補助される）が使用されている。コンピュータ断層撮影法または磁気共鳴画像法による脳イメージングの補助を用い、脳地図を参照として使用して電極またはプローブを脳内に設置する。パーキンソン病の運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するために淡蒼球の異なる部分（すなわち、後腹側淡蒼球）、大脳基底核、視床および視床下核の破壊が行われている。残念ながら、外科的脳破壊では、発語、視覚および認知脳領域の機能障害のリスクが生じる。薬物抵抗性パーキンソン病振戦を処置するためには、外科的アブレーションまたは刺激に加えて、外部放射線療法（Ｇａｍｍａ Ｋｎｉｆｅ Ｒａｄｉｏｓｕｒｇｅｒｙ）も限られた程度に使用されている。この手順の欠点は、振戦の減少が放射線外科療法後１週間後から８カ月後の間に遅延すること、および長期的利益ならびに放射線副作用が現在のところ分かっていないことである。
したがって、当技術分野において、パーキンソン病に対する改善された処置が必要とされている。
機能亢進性淡蒼球および視床下核を標的とする進行した薬剤抵抗性パーキンソン病の管理には定位的外科手術（神経画像処理および電気生理学的記録により補助される）が使用されている。コンピュータ断層撮影法または磁気共鳴画像法による脳イメージングの補助を用い、脳地図を参照として使用して電極またはプローブを脳内に設置する。パーキンソン病の運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するために淡蒼球の異なる部分（すなわち、後腹側淡蒼球）、大脳基底核、視床および視床下核の破壊が行われている。残念ながら、外科的脳破壊では、発語、視覚および認知脳領域の機能障害のリスクが生じる。薬物抵抗性パーキンソン病振戦を処置するためには、外科的アブレーションまたは刺激に加えて、外部放射線療法（Ｇａｍｍａ Ｋｎｉｆｅ Ｒａｄｉｏｓｕｒｇｅｒｙ）も限られた程度に使用されている。この手順の欠点は、振戦の減少が放射線外科療法後１週間後から８カ月後の間に遅延すること、および長期的利益ならびに放射線副作用が現在のところ分かっていないことである。
したがって、当技術分野において、パーキンソン病に対する改善された処置が必要とされている。
Szallasi et al. (1999) Brit. J. Pharmacol. 128: 428-434
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Playfer, Postgrad. Med. J., 73; 257-264: 1997
Nadeau, J. Am. Ger. Soc., 45; 233-240: 2004
本開示は、パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与によって投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、ヒト成体に対するＲＴＸの用量は、約０．１μｇから約１００μｇである。
実施形態１は、パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、ＰＤの処置を必要とする対象に有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）髄腔内または大槽内投与することを含む方法である。
実施形態２は、パーキンソン病（ＰＤ）の処置を必要とする対象を処置する方法における使用のための、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を含む組成物である。
実施形態３は、方法が、組成物を対象に髄腔内または大槽内投与することを含む、実施形態２に記載の使用のための組成物である。
実施形態４は、対象がヒト成体である、実施形態１に記載の方法または実施形態２または３に記載の使用のための組成物である。
実施形態５は、ＲＴＸが、約０．１μｇから約１００μｇの用量で投与される、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態６は、用量が、約０．１μｇから約１μｇ、約１μｇから約５μｇ、約５μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２０μｇ、約２０μｇから約５０μｇ、または約５０から約１００μｇである実施形態５に記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態７は、方法が、髄腔内投与を含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態８は、方法が、大槽内投与を含む、実施形態１から６までのいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態９は、ＲＴＸが、ＲＴＸおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤として投与される、前述の実施形態のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態１０は、薬学的に許容される担体が、水を含む、実施形態９に記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態１１は、薬学的に許容される担体が、生理食塩水を含む実施形態９に記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態１２は、ＲＴＸが、医薬製剤中に１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、実施形態９から１１のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物である。
実施形態１３は、ＲＴＸが、医薬製剤中に１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、実施形態１２に記載の方法または使用のための組成物である。
詳細な説明
定義
本明細書で使用される場合、「髄腔内に」または「髄腔内投与」とは、薬物または医薬製剤をくも膜下腔としても公知の髄腔内空間の脳脊髄液中に送達することを指す。
定義
本明細書で使用される場合、「髄腔内に」または「髄腔内投与」とは、薬物または医薬製剤をくも膜下腔としても公知の髄腔内空間の脳脊髄液中に送達することを指す。
本明細書で使用される場合、「大槽内に」または「大槽内投与」とは、薬物または医薬製剤を脳心室の脳脊髄液中に送達することを指す。
「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、広範に理解されるべきであり、例えば、ＰＤに付随する症状の悪化を遅延させる、緩徐化する、もしくは静止すること、またはそのような症状を少なくとも部分的に軽減することを含めた、あらゆる有益な効果を包含する。処置することは、以下に詳細に考察されている通り患者機能の任意の形態の改善をもたらすことも包含する。
「または（ｏｒ）」は、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、包括的な意味で使用される、すなわち、「および／または」と同等である。
「約」という用語は、組成物の活性または安定性に対していかなる有意な影響も及ぼさない、組成物の構成成分の数量の微弱な変動を示す。一部の実施形態では、「約」は、規定された値の１０％以内、５％以内、２％以内、１％以内、または０．５％以内の変動を包含する。
範囲は全て、「終点を含まず」などの除外表現がない場合には終点を包含するものと解釈されるべきである；したがって、例えば、「１から１０の範囲の」は、１および１０の値ならびに１よりも大きく１０よりも小さい全ての整数値および（適切な場合には）非整数値を含む。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、限定するものではない。
典型的な方法および使用のための組成物
典型的な方法および使用のための組成物
ＲＴＸを髄腔内にまたは大槽内に送達する、パーキンソン病（ＰＤ）の処置方法および処置に使用するための組成物が本明細書で提供される。本明細書に記載の方法は、ＲＴＸが有効である、例えば、ＲＴＸがＴｒｐＶ１またはそのホモログに結合し、それを活性化することができ、ＰＤの処置を必要としている任意の対象に使用するためのものである。一部の実施形態では、ＲＴＸを０．１～１００μｇの用量で投与する。一部の実施形態では、ＲＴＸの用量は、０．１～０．５μｇ、０．５～１μｇ、１～２μｇ、２～５μｇ、５～１０μｇ、１０～２０μｇ、２０～３０μｇ、３０～４０μｇ、４０～５０μｇ、５０～６０μｇ、６０～７０μｇ、７０～８０μｇ、８０～９０μｇ、または９０～１００μｇの範囲である。
製剤中のＲＴＸの濃度は、意図された用量を送達するための任意の適切な値であり得る。一部の実施形態では、医薬製剤中のＲＴＸの濃度は、０．１～３００μｇ／ｍｌの範囲内に入る。一部の実施形態では、医薬製剤中のＲＴＸの濃度は、０．１～１μｇ／ｍｌ、１～５μｇ／ｍｌ、５～１０μｇ／ｍｌ、１０～２０μｇ／ｍｌ、１０～３０μｇ／ｍｌ、２０～３０μｇ／ｍｌ、２０～５０μｇ／ｍｌ、５０～１００μｇ／ｍｌ、１００～１５０μｇ／ｍｌ、１５０～２００μｇ／ｍｌ、２００～２５０μｇ／ｍｌ、または２５０～３００μｇ／ｍｌの範囲内に入る。一部の実施形態では、医薬製剤中のＲＴＸの濃度は、５～５０μｇ／ｍｌ、または８～２５μｇ／ｍｌの範囲内に入る。
対象に送達するためのＲＴＸの製剤を、濃縮ストック溶液から出発して、生理食塩水などの適当な希釈剤中に希釈することによって調製することができる。
一部の実施形態では、ＲＴＸおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤のｐＨは、６～７．６の範囲内である。製剤は、ポリソルベート８０およびブドウ糖をさらに含む。一部の実施形態では、ポリソルベート８０の濃度は２～４％ｗ／ｖであり、かつ／またはブドウ糖の濃度は４～６％ｗ／ｖである。一部の実施形態では、ポリソルベート８０の濃度は３％ｗ／ｖであり、かつ／またはブドウ糖の濃度は５％ｗ／ｖである。前述の製剤のいずれかの一部の実施形態では、ＲＴＸの濃度は１０～３０μｇ／ｍｌ、例えば、１０μｇ／ｍｌまたは２５μｇ／ｍｌなどであり得る。一部の実施形態では、製剤は、リン酸緩衝液を、例えば表１にリン酸緩衝液に関して示されている濃度およびｐＨでさらに含む。一部の実施形態では、製剤は、ＮａＣｌを、例えば表１においてＮａＣｌに関して示されている濃度でさらに含む。リン酸緩衝液およびＮａＣｌの両方が存在する場合、個々の製剤に関して示されている濃度およびリン酸緩衝液ｐＨの組合せで存在し得る（必ずではない）。
ＰＤを処置するためのＲＴＸを髄腔内にまたは大槽内に投与することができる。髄腔内投与に関しては、ＰＤ処置の重点が手の運動協調性である場合（手の運動協調性はＰＤ患者に関して頻度の高い問題である）、髄腔内投与は、脊柱の頸部または胸部領域に焦点を合わせるべきである。ＰＤ処置のための全身手法に関しては大槽内投与が好ましい。あるいは、ＲＴＸを脊柱の上部のＣ１～Ｃ５に対して髄腔内投与することができる。
重要なことに、本開示の範囲内に入る方法は、患者機能の改善をもたらすことができるものである。「患者機能の改善」は、疼痛の軽減、ベッドで過ごす時間の減少、異所運動の増加、より健康的な姿勢、より変動的な生活様式および／また正常な筋緊張によって可能になるは治癒などの１つまたは複数の因子のいずれかによって測定される改善と定義することができる。患者機能の改善は、生活の質（ＱＯＬ）の改善と同義である。ＱＯＬは、例えば、公知のＳＦ－１２またはＳＦ－３６健康調査スコアリング手順を使用して評価することができる。ＳＦ－３６では、身体機能、身体的問題に起因する役割の制限、社会生活機能、体の痛み、一般的な心の健康、感情的問題に起因する役割の制限、活力、および全体的健康感の８つのドメインにおいて患者の体および心の健康を評価する。得られたスコアを、種々の一般集団および患者集団に関して入手可能な公開された値と比較することができる。
（実施例１）
パーキンソン病様（ＰＤ）病態のＡＡＶ－Ａ５３Ｔマウスモデルに対するＲＴＸの単回髄腔内投与の効果
パーキンソン病（ＰＤ）についてのｉｎ ｖｉｖｏマウス試験を使用し、まず、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスにおいて、脳の右半球の黒質（ＳＮ）への片側性アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）注入によって疾患状態を誘導した。ベクターは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性および線条体におけるドーパミンレベルの低下を導く突然変異型ヒトＡ５３Ｔ－アルファ－シヌクレインを過剰発現するように構成された構築物を含有していた。これにより、運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔ）を含めたＰＤ様症状が導かれることが示されている。
パーキンソン病様（ＰＤ）病態のＡＡＶ－Ａ５３Ｔマウスモデルに対するＲＴＸの単回髄腔内投与の効果
パーキンソン病（ＰＤ）についてのｉｎ ｖｉｖｏマウス試験を使用し、まず、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスにおいて、脳の右半球の黒質（ＳＮ）への片側性アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）注入によって疾患状態を誘導した。ベクターは、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性および線条体におけるドーパミンレベルの低下を導く突然変異型ヒトＡ５３Ｔ－アルファ－シヌクレインを過剰発現するように構成された構築物を含有していた。これにより、運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔ）を含めたＰＤ様症状が導かれることが示されている。
試験開始時に２カ月齢であったＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウス総計１４２匹（雄１２６匹、雌１６匹）を、標準温度（２２±１℃）および明制御環境（午前７時から午後８時まで明かりを付ける）で、食物および水を自由に摂取できる状態で飼育した。
本試験の目的は、ＰＤ様病態のＡＡＶ－Ａ５３Ｔマウスモデルに対するＲＴＸの単回髄腔内投与の効果を調査することであった。本試験の開始前に、パイロット忍容性試験を行い、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスの雄１６匹、雌１６匹にＲＴＸを２つの用量（０．０４μｇまたは０．１２５μｇのいずれか）で注入し、その後２４時間にわたって追跡調査して、処置のあらゆる可能性のある有害効果を観察した。
パイロット研究群（ａｒｍ）に使用した総計３２匹のマウスのうち、総計４匹のマウスがＲＴＸの髄腔内注入後２４時間のモニタリング期間中に死亡した。０．１２５μｇ用量を用いた処置を受けた雌２匹は、注入後４～２４時間以内に原因不明でケージ内で死亡しているのが見つかった。さらに、同じ投薬群の雌１匹および雄マウス１匹はＲＴＸの注入直後に死亡した。残りのマウスには著しい有害効果は観察されなかった。
本試験に関して、２カ月齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス合計１１０匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ（９０匹のマウス）またはＡＡＶ－ヌル（２０匹のマウス）のいずれかを、それぞれＰＤ様病態を誘導するため、またはニセ対照として機能させるために、黒質内に片側性に注入した。ＡＡＶ－ヌル（空）ベクターを注入したマウス（「ニセ注入」マウス）は、ウイルス注入の影響に関する対照とするために使用した。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ媒介性疾患モデル誘導の７日後または１４日後、マウスを、ＲＴＸ（０．０４μｇまたは０．１２５μｇ）（体積５μＬ、０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート８０、０．０５％ｗ／ｖのブドウ糖、３０ｍＭのリン酸緩衝液、および０．５４％ｗ／ｖ、ｐＨ７．２のＮａＣｌを含有する２５μｇ／ｍｌのＲＴＸ溶液から調製し、必要に応じて生理食塩水中に希釈したもの）を用い、腰髄領域への単回髄腔内注入によって処置した。各時点でＡＡＶ－ヌル注入群およびＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入群の１つをＲＴＸの代わりにビヒクルを用いて処置した。
次いで、マウスを、ＡＡＶ注入の７日後または１４日後に、ＲＴＸまたはビヒクルを用いて髄腔内注入によって処置した。マウスを以下の通り、処置群に割り当てた：
群１：雄マウス１０匹に、ＡＡＶ－ヌルを用いてニセ注入を行い、Ｄ７にビヒクルを投与した。
群２：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７にビヒクルを投与した。
群３：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７に０．０４μｇのＲＴＸを投与した。
群４：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７に０．１２５μｇのＲＴＸを投与した。
群５：雄マウス１０匹に、ＡＡＶ－ヌルを用いてニセ注入を行い、Ｄ１４にビヒクルを投与した。
群６：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４にビヒクルを投与した。
群７：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４に０．０４μｇのＲＴＸを投与した。
群８：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４に０．１２５μｇのＲＴＸを投与した。
群１：雄マウス１０匹に、ＡＡＶ－ヌルを用いてニセ注入を行い、Ｄ７にビヒクルを投与した。
群２：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７にビヒクルを投与した。
群３：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７に０．０４μｇのＲＴＸを投与した。
群４：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ７に０．１２５μｇのＲＴＸを投与した。
群５：雄マウス１０匹に、ＡＡＶ－ヌルを用いてニセ注入を行い、Ｄ１４にビヒクルを投与した。
群６：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４にビヒクルを投与した。
群７：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４に０．０４μｇのＲＴＸを投与した。
群８：雄マウス１５匹に、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入し、Ｄ１４に０．１２５μｇのＲＴＸを投与した。
動物の体重を、週２回モニタリングした。ＡＡＶ注入の７週間後に微細運動運動力学分析を実施した。ＡＡＶ注入の８週間後に、マウスを安楽死させ、組織試料採取に供した。同側性線条体および対側性線条体由来のドーパミンおよびその代謝産物を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析した。
外科手技は全て無菌条件下で実施し、適用可能な場合には滅菌材料、溶液および設備を使用した。ウイルス性材料の取扱いおよび定位的注入は、バイオセーフティレベル２（ＢＳＬ－２）層流フード（ＢｉｏＷｉｚａｒｄ Ｇｏｌｄｅｎ ｌｉｎｅ １３０、Ｋｏｊａｉｒ）内で実施し、試験に関連する行動試験はＢＳＬ－１ステータスの施設で実施した。ＡＡＶベクター注入の１週間後までのマウスの外科手技および飼育はＢＳＬ－２レベルの安全性規制（Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９０／６７９／ＥＥＣ）および施設に従って実施した。
まず、マウスを５％イソフルラン（７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２中；流速毎分３００ｍｌ）で麻酔し、定位フレームに置いた。操作中、麻酔薬の濃度を１～１．５％まで低下させた。直腸温度を恒温ブランケットシステムで３７．０±１．０℃に維持した。皮膚を正中切開によって開き、側方に引っ込めた。頭蓋骨の小さな部分切除によって右脳半球を露出させた。細かいピンセットを用いて硬膜を慎重に取り除き、ＡＡＶ－ヌル空（５．１×１０１２ｖｇ／ｍＬ）、またはＡＡＶ－Ａ５３Ｔ（５．１×１０１２ｖｇ／ｍＬ）のいずれかの定位固定注射を、以下の通り実施した：デジタルでガイドされる注入ユニット（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｌａｂ Ｓｔａｎｄａｒｄ（商標）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）およびポンプ（Ｐｕｍｐ １１、Ｅｌｉｔｅ Ｎａｎｏｍｉｔｅ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に取り付けられた１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジに接続された太くて短い注射針（３０Ｇ）を黒質のレベルまで下した。ＡＡＶ材料を黒質に以下の座標（ブレグマに対して）で片側性に注入した：頭蓋骨表面に対してＡＰ＝３．０ｍｍ後側；ＭＬ＝１．３ｍｍ；ＤＶ＝４．２ｍｍ。合計２μＬのベクターを毎分０．４μＬの速度で注入した。注入後、カニューレをさらに５分間定位置に置いた後、取り除いた。その後、皮膚を閉じ、消毒した。次いで、マウスを麻酔から回復させ、可能性のある手術後の併発症について慎重にモニタリングした。最初の回復後、動物をホームケージに戻し、食物および水を自由に摂取させた。
マウスに、ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後にＲＴＸまたはビヒクルを髄腔内投与した。まず、マウスを、２～５％イソフルランを使用して麻酔し、外科手術プラットフォームに腹臥位でセットした。皮膚の標的領域の毛をそった後、キシロカインゲル（２％リドカイン）をその領域に導入した。５分後にゲルを除去し、皮膚切開のための消毒調製としてヨウ素溶液によるこすり洗いを行った。
椎弓切除術を腰部（Ｌ５）レベルで実施し、硬膜を乱すことなく脊髄を露出させた。微量注入システム（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に取り付けられた、１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに付着させたカニューレをくも膜下腔に挿入し、針の開口部が所望の位置にくるように硬膜下１０～１５ｍｍまで慎重に下げることによってＬ５～Ｌ６のレベルまで進めた。針と硬膜開口部の接合部を、組織密封接着剤（Ｔｉｓｓｅｅｌ（登録商標）Ｄｕｏ Ｑｕｉｃｋ、Ｂａｘｔｅｒ）で密閉し、注入を開始した。製剤化されたレシニフェラトキシン５μＬを毎分０．５μＬの速度で注入し、その後、カニューレを、５分間の安定化期間の後、髄腔内空間から取り除いた。取り除いた直後に、別の薄層の組織密封接着剤を適用して、硬膜の開口部を閉じて漏出を回避した。その後、筋肉および皮膚を層に閉じ、消毒した。マウスを恒温ケージ内で回復させた後、ホームケージに戻した。
ＡＡＶおよび髄腔内注入外科手術の前に、マウスに、ブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）、０．０６ｍｇ／ｋｇ、２ｍＬ／ｋｇ）を与えた。ブプレノルフィンの追加的な投薬をその後の４８時間の間に１日２回施行し、結果、総じて５回の投与を行った。全てのマウスについて脱水に関するモニタリングも行い、外科手術後、およびさらに必要に応じて、０．９％滅菌生理食塩水（ｉ．ｐ．）を与えた。
試験の持続時間全体にわたって、マウスの体重を週２回測定した（月曜日および金曜日）。
ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の８週間後、マウスに、ペントバルビタール（Ｍｅｂｕｎａｔ（登録商標）、Ｏｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ）の腹腔内注射を用いて終末麻酔を行った。次いで、終末心臓穿刺によって血液を約５００μＬ採取し、予め冷却したＫ２－ＥＤＴＡ管に移した。その後すぐに、遠心分離（２０００ｇ、１０分間＋４℃）によって血漿を分離した。その後、血漿１５０μＬを２．０ｍＬのポリプロピレン管中に採取し、ドライアイス上で凍結させた。血漿試料を、Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．へ出荷するまでドライアイス上、－８０℃で保管した。血液採取後、マウスに対して、脳から血液を除去するためにヘパリン添加（２．５ＩＵ／ｍＬ）生理食塩水を用いた経心的灌流を行った。灌流の直後に、脳を氷上で解剖した。
ドーパミンおよびその代謝産物のＨＰＬＣ分析のために、同側性線条体および対側性線条体を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中に採取し、ドライアイス上でスナップ凍結させ（すなわち、左と右を別々に）、秤量し、－８０℃で保管した。
マウス線条体組織試料中のドーパミン（ＤＡ）、３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）およびホモバニリン酸（ＨＶＡ）濃度を、電気化学的検出を伴う高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって決定した。氷上で解凍した後、組織試料を、ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０超音波ディスインテグレーター（ＭＳＥ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用いて０．１Ｍの過塩素酸中でホモジナイズした（１：１０、ｗ／ｖ）。組織ホモジネートを４℃、１５０００ｇで１５分間遠心分離した。上清をポリプロピレン膜（ＧＨＰ Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３ ０．４５μｍ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）を通して濾過し、０．１Ｍ過塩素酸で希釈した（１：１）。試料をプラスチックバイアルに移し、すぐに分析した。
ＥＳＡ ＨＰＬＣシステム（ＥＳＡ Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、５８２溶媒送達系、ＤＧ－１２１０真空脱気器、５４２オートサンプラー、８８０サーモスタットチャンバー、２チャネル５０１４Ｂ微小透析セルを備えた８チャネルＣｏｕｌＡｒｒａｙ（登録商標）５６００電気化学的アレイ検出器およびウィンドウズ（登録商標）データ取得モジュール（バージョン１．００）用のＣｏｕｌＡｒｒａｙ（登録商標）からなる。適用される電位は－１７５ｍＶ（チャネル１）、＋２２５ｍＶ（チャネル２）、＋３５０ｍＶ（チャネル３）および＋４５０ｍＶ（チャネル４）である。ＤＡおよびＤＯＰＡＣがチャネル２で検出され、ＨＶＡがチャネル３で検出される。注入量は１０μｌである。
分析物をＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ａｑ逆相カラム（２．１×１００ｍｍ、３．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｌｉｔｔｌｅ Ｆａｌｌｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）でＺｏｒｂａｘ ＳＢ－Ａｑプレカラム（２．１×１２．５ｍｍ、５μｍ）を用い、定組成で流して分離した。カラムを３５℃に維持した。移動相は、４．７５ｍＭのクエン酸一水和物、７ｍＭの１－オクタンスルホン酸および５０μＭの二ナトリウムＥＤＴＡ－アセトニトリル混合物（９８：２、ｖ／ｖ）を含有する１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムであった。ｏ－リン酸を用いて移動相のｐＨを２．２に調整した。流速は毎分０．３ｍＬであった。ＤＡ、ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡのレベルを湿組織１ｇ当たりのｎｍｏｌ数で表した。
マウスの微細運動技能を、注入の７週間後にウォーキングモードを使用して評価した（ＭｏｔｏＲａｔｅｒ、ＴＳＥ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｏｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。試験日に、データ解析プロセスを容易にするために、マウスに、肢の関節および尾部の一部などの体の適当な点に印をつけた。高速カメラ（毎秒３００フレーム）を使用し、前面および両側面からの３つの異なる側面から動作データを捕捉した。異なる歩行パターンおよび動作を、特注の自動化分析システムを使用して解析した。分析したパラメーターには以下が含まれる：１）一般的な歩行パターンパラメーター（重複歩時間および速度、歩隔、重複歩の間の立脚時間および遊脚時間、肢間協調）、２）体位および平衡（トゥクリアランス、腸骨稜および股関節の高さ、後肢の前方運動および後方運動、尾部の位置および動作）、ならびに３）微細運動技能（重複歩の間の遊脚速度、遊脚相の間の痙攣メトリック、異なる関節の角度の範囲および偏り、垂直方向および水平の頭部動作）。
歩行パラメーターは常にいくらかの（および複雑な）相関を有する。例えば、重複歩持続時間が短く歩幅が長いほど、速度が大きくなる。高度に相関するパラメーターのセットで顕在化する異なる「歩行特色」を、主成分分析（ＰＣＡ）を使用して同定することができる。主成分分析は、情報を多変量データセットに圧縮し、元の変数間の相関を明らかにし、最終的に、新しいおよび高感度の無相関パラメーターである主成分（ＰＣ）の小さなセットを創出する統計学的ツールである。
ＰＣＡは、主成分係数および固有ベクトルに基づく線形変換である。変換された新しい無相関変数はＰＣスコアと称される。第１の主成分（ＰＣ）は、最も大きな可能性のある分散を有するデータの線形結合に対応する。第２のＰＣもまた、第１のＰＣの割合が棄却される場合に残るものの最も大きな可能性のある分散を有し、残りのＰＣに関しても同様である。固有ベクターによってもデータの内部構造に関する情報、すなわち、相互に相関するパラメーターが明らかになる。各ＰＣスコアは、対応するＰＣにおいて強調される全てのパラメーターの複合情報を表す。使用するＰＣの数を、カイザー基準を使用して決定した（固有値＞１．０）。
固有ベクトル回転技法を使用してＰＣ結果の解釈を簡易化した。回転は、単純な構造が実現されるように固有ベクトルを操作する、または各固有ベクトルの明白にゼロでない要素の数が合理的に可能な限り少なくなるように最適化する手順である。本試験では、直交性保存、バリマックス回転手順を使用した。
最後に、ＰＣＡに基づく全体的な歩行分析スコアを決定した。スコアは、全てのＰＣスコア（歩行全体的スコア（Ｇａｉｔ Ｏｖｅｒａｌｌ Ｓｃｏｒｅ））に関する、または大きな効果量を実証するＰＣ（歩行判別スコア（Ｇａｉｔ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ｓｃｏｒｅ））に関するＡＡＶ－ヌルビヒクル群とＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群の差異に基づく。したがって、そのスコアの目的は、疾患モデルを最良の可能性のあるやり方で特徴付け、２つの群を識別する、元の変数の疾患モデルに特異的な組合せ－「指紋」を同定することである。「指紋」、または判別方向ベクターが決定された後、個々のマウスそれぞれの（正規化）パラメーターデータを判別方向ベクターに投影することにより、全体的な歩行分析スコアを得ることができる。最終的に、薬理学的物質の全体的な運動力学効果を高感度様式で見ることができる。
研究室の人員が毎日動物をモニタリングした。動物の全体的な健康状態が著しく悪化した場合には、その動物を過剰用量のＣＯ２によって屠殺し、断頭した。許容される終点の定義には以下が含まれた：２４時間の観察期間中に自発運動がなく、飲食できないこと、大量出血、自発性炎症、解剖学的構造の欠損、２０ｍｍよりも大きな腫脹または腫瘍、および３０秒の期間にわたって自立できないこと。
試験中、群１、２、３、４、５および８からマウスが１匹失われた。群３、４および８のマウスは麻酔下での注入中または注入直後に死亡した。群１、２および５のマウスは髄腔内投与の１日後に、終点基準を満たしたことから安楽死させた。
ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のＲＴＸの０．０４μｇまたは０．１２５μｇでの単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの体重に対する効果が図１に示されている。８週間の試験の持続時間の間に群間に有意差は認められなかった（二元配置ＡＮＯＶＡ）。
片側性ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のレシニフェラトキシンの２つの用量での単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの同側線条体および対側線条体におけるドーパミンおよびその代謝産物レベルに対する効果が、図２～５に示されている。ＨＰＬＣを用いて分析を実施した。統計解析のために、ＡＡＶ－ヌル注入群をまず髄腔内にビヒクルを用いて処置したＡＡＶ－Ａ５３Ｔ群と比較して、Ａ５３Ｔアルファ－シヌクレイン導入遺伝子挿入物のみの影響を観察した。その後、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群を０．０４μｇまたは０．１２５μｇのレシニフェラトキシンで処置したＡＡＶ－Ａ５３Ｔ群と比較して、怒り得るレシニフェラトキシン処置の効果を観察した。７日目群と１４日目群を別々に解析した。
片側性ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のＲＴＸの２つの用量での単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの同側線条体および対側線条体におけるドーパミン（ＤＡ）レベルに対する効果が、図２に示されている。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の結果、ビヒクルを用いて髄腔内処置したどちらの時点においても、同側性線条体におけるドーパミンレベルの有意な低下がもたらされた。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の７日後に高用量のレシニフェラトキシンを用いて処置したマウスにおけるドーパミンレベルがより高いという軽微な傾向があった。しかし、この差は統計学的には有意ではなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。これに反して、１４日目にレシニフェラトキシンを用いて処置した群ではドーパミンレベルがより低いという、逆の有意でない軽微な傾向が観察された。
片側性ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のＲＴＸの２つの用量での単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの同側線条体および対側線条体における３，４－ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）のレベルに対する効果が、図３に示されている。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入により、ビヒクルを用いて髄腔内処置したどちらの時点においても、同側性線条体におけるＤＯＰＡＣレベルの有意な低下がもたらされた。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の７日後に高用量のレシニフェラトキシンを用いて処置したマウスにおけるＤＯＰＡＣレベルがより高いという軽微な傾向があった。しかし、この差は統計学的には有意ではなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。１４日目にレシニフェラトキシンを用いて処置した群ではＤＯＰＡＣレベルがより低いという、逆の有意でない軽微な傾向が観察された。
片側性ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のＲＴＸの２つの用量での単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの同側線条体および対側線条体におけるホモバニリン酸（ＨＶＡ）のレベルに対する効果が、図４に示されている。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入により、ビヒクルを用いて髄腔内処置したどちらの時点においても、同側性線条体におけるＨＶＡレベルの有意な低下がもたらされた。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の７日後に高用量のレシニフェラトキシンを用いて処置したマウスにおける濃度がより高いという軽微な傾向があった。しかし、この差は統計学的には有意ではなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。１４日目にレシニフェラトキシンを用いて処置した群ではＨＶＡレベルがより低いという、逆の有意でない軽微な傾向が観察された。
片側性ＡＡＶ－Ａ５３ＴまたはＡＡＶ－ヌル注入の７日後または１４日後のＲＴＸの２つの用量での単回投与の、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスの同側線条体および対側線条体におけるドーパミンターンオーバーに対する効果が、図５に示されている。ドーパミンターンオーバーは、代謝産物であるＤＯＰＡＣおよびＨＶＡの濃度の合計をドーパミンの濃度で割ったものと定義される。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入により、ビヒクルを用いて髄腔内処置したどちらの時点においても、同側性線条体におけるドーパミンのターンオーバーの有意な増大がもたらされた。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の７日後および１４日後にレシニフェラトキシンで処置したマウスでは、どちらの用量を用いた場合でも、ターンオーバー速度がはるかに大きいという軽微な傾向があった。しかし、これらの処置による効果は、統計学的には有意ではなかった（クラスカル・ワリス検定）。
片側性ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ－ａＳｙｎ注射により運動障害（ｍｏｔｏｒ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）が生じるかどうかを調査するために、ＡＡＶ１／２注入の７週間後に運動力学歩行分析を使用して微細運動技能および歩行欠陥を測定した。
まず、各分析された歩行サイクルの９５個の歩行パラメーターを評価した。左側および右側のパラメーター値を最初に可能であれば別々に決定した。ＡＡＶ１／２－ヌル対照群（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定、不等分散の仮定）に関して最も明確なＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ誘導性歩行差異は、肢間協調および全体的な速度の低下に関連するものであった：後肢（Ｄ７およびＤ１４）および前肢（Ｄ１４）の立脚時間が増加し、同側性歩行（歩調）が増大し（Ｄ７およびＤ１４）、対角肢歩行（速足）が減少し（Ｄ７およびＤ１４の両方、対角二本肢支持パラメーターに見られた）、両脚支持およびデューティサイクルが特に後肢において増加し（Ｄ７およびＤ１４）、３肢での支持時間が増加した（Ｄ７）。さらに、例えば以下などの、微細運動機能を記載するパラメーターの有意な変化も観察された：後肢トゥクリアランスの減少（Ｄ７）、股関節角度可動域の偏りの増大（Ｄ７）、頭部動作の増加（Ｄ１４）、前肢爪先の離地角度の低下（Ｄ７）、および後肢の軌道の高さプロファイルの低下（Ｄ１４）。
ビヒクルで処置したＡＡＶ１／２－Ａ５３ＴマウスにおけるＡＡＶ１／２－ヌル対照群と比較したＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ誘導性歩行欠陥を評価するために、左右非対称に重点を置いて全体的な歩行分析スコアを確立した。全体的な歩行スコアを、ＰＣＡを使用して構築した判別ベクトルによって、および２つの群（Ｄ７およびＤ１４ビヒクル処置群からプールしたもの）のＰＣスコアの差異を利用することによって決定した。ＰＣＡに使用したデータセットは、７６個の選択されたパラメーターからなるものであった；両側性に決定されたパラメーターは全て、左側と右側の差異として表した。全てのパラメーターを、標準得点に対して正規化した。判別ベクトルの棒グラフ（図６Ｂ）は、以下の通り解釈することができる、ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔにより誘導される歩行の変化を最良に特徴付け、捕捉する変数の組合せを例示する：全体的な速度（重複歩時間、距離、および速度）がより遅く、特に後肢において両脚支持相が増大した。また、対角肢支持の割合が低下し、三本肢支持および四本肢支持（３つまたは４つの肢が同時に接地する）が増加した。最も明確な左右非対称は股関節角度（最大および範囲）、前肢トゥクリアランス、後肢後方運動、および後肢遊脚速度に見られた。
強調されるこれらの歩行変数を全て一緒に判別ベクトルに凝縮すると、全体的な歩行分析スコアは、Ｄ７およびＤ１４ビヒクル処置群のどちらに関しても高度に有意なＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ－ａＳｙｎ誘導性表現型を示す（対応のないｔ検定、ＡＡＶ－ヌル対ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル；ｐ＜０．０００１（Ｄ７）、ｐ＜０．０１（Ｄ１４））。
早期ＲＴＸ処置（Ｄ７）のＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ誘導性運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔ）に対する効果の分析により、全体的な歩行分析スコアがＡＡＶ１／２－ヌル群の方に向かってシフトしたことによって示される、運動機能のＲＴＸ用量依存的な回復が示された。低用量および高用量でのＲＴＸ処置後の全体的な歩行スコアの回復は、ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔビヒクルで処置した対照群と比較して有意に改善され（一元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００１３、その後、ダネット検定：ｐ＝０．００６３（ＲＴＸ０．０４μｇ）、ｐ＝０．００１１（ＲＴＸ０．１２５μｇ））、それにより、有益な処置効果が示唆される（図６Ａ）。Ｄ１４群に対する処置効果は、統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５；一元配置ＡＮＯＶＡ）。しかし、どちらのＲＴＸ処置群においても、ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔビヒクルマウスと比較した場合にＡＡＶ１／２－ヌル群の方に向かう傾向があった。
次に、全体的なスコアの差異の原因となる、ＲＴＸ処置によって有意に回復した別の歩行パラメーターを調査した（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。ＲＴＸ処置群では、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群と比較して、以下に関して変化が観察された：重複歩時間および後肢立脚時間（Ｄ７、高用量）、対角肢歩行（Ｄ７、両方の用量）および対角二本肢支持（Ｄ７、高用量）、三本肢支持（Ｄ７、高用量）、同側性および相同歩行（Ｄ７、高用量）、股関節ＲＯＭ（Ｄ７、両方の用量、Ｄ１４、高用量）および股関節ＲＯＭの偏り（Ｄ７、高用量）、最小膝角度（Ｄ７、高用量）、頭部回転（Ｄ１４、両方の用量）、ならびに片脚支持および両脚支持（Ｄ７、高用量）。全体的な歩行スコアと同様に、単一の歩行パラメーターにおいて観察されたこれらのＲＴＸ誘導性差異もＡＡＶ－ヌル「健康」対照群の方に向かうものであった。重要なことに、これらのパラメーターの改善に関する観察されたＲＴＸの有効性は、ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ送達により最初に影響を受けたものとほとんど同じであり、これにより、動物の機能的運動が回復したことが示される。
Ｄ１４ ＡＡＶ－ヌル群のマウス４匹が、それらの歩行動作から髄腔内外科的操作に起因する脊髄損傷が示唆されたので、歩行分析から除外された。また、Ｄ１４ ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群の動物２匹が除外された。これらの動物はどちらも歩行機能障害の徴候は有さず、他方は、同側性線条体のドーパミン濃度が健康な動物のレベルであることによって示される通り、ＡＡＶ１／２－Ａ５３Ｔ形質導入が上手くいかなかった可能性があることが確認された。
１０個のバリマックス回転主成分を使用した、Ｄ７投薬群およびＤ１４投薬群の歩行パラメーターのＰＣＡが図７に示されている。ヒートマップ（右側に示されている）は、１０個の主成分のそれぞれに示差的に影響を及ぼす元のパラメーターを例示する。ヒートマップの各列はまた、パラメーターがどのように相関するかも示す：白色＝正相関、灰色＝負の相関、黒色＝相関なし。微細運動試験のＰＣスコアＰＣ＃１～ＰＣ＃１０が左側に示されている（群平均＋／－ＳＥＭ）。ＰＣスコアは、ヒートマップの右側に示されるＰＣに対応する。例えば、ＰＣ＃２は、対角ＩＬＣおよび対角二本肢支持（対角、すなわち、速足歩行率）の両方の増加、および他の歩行率型の減少を含めた「対角肢間協調」と解釈することができる。各パネルの上部のＰＣの後ろの角括弧内の％は、それぞれのＰＣによって説明される元のデータの変動のパーセンテージを指す。＃ｐ＜０．０５、ＡＡＶ－Ａ５３ＴビヒクルＤ１４対ＡＡＶ－ヌルビヒクルＤ１４（対応のないｔ検定）；＃＃＃ｐ＜０．００１、ＡＡＶ－Ａ５３ＴビヒクルＤ７対ＡＡＶ－ヌルビヒクルＤ７（対応のないｔ検定）；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、ＡＡＶ－Ａ５３ＴビヒクルＤ７対ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ ＲＴＸ０．１２５μｇ、Ｄ７。ＰＣ＝主成分、ＩＬＣ＝肢間協調。
考察。本試験では、８週齢のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスにおいて、脳の右半球の黒質（ＳＮ）への片側性アデノウイルスベクター（ＡＡＶ）注入によってパーキンソン病様の状態を最初に誘導した。ベクターの注入は、突然変異型ヒトＡ５３Ｔ－アルファ－シヌクレインを過剰発現させ、それにより、黒質のドーパミン作動性ニューロンの変性および線条体におけるドーパミンレベルの低下を導くことを目的とするものであった。これにより、運動障害（ｍｏｔｏｒ ｄｅｆｉｃｉｔ）を含めたパーキンソン病様症状が導かれることが示されている。ウイルス注入自体の影響についての対照とするために、対照群であるＡＡＶ－ヌル（空）ベクターを注入したマウスを使用した。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ媒介性疾患モデル誘導の７日後または１４日後、マウスをビヒクルまたはレシニフェラトキシン（ＲＴＸ、０．０４μｇまたは０．１２５μｇ）を用い、腰髄領域への単回髄腔内注入によって処置した。ＡＡＶ－ヌルで処置した健康な対照マウスを、７日目または１４日目にビヒクルで処置した。
本試験では、低用量または高用量において髄腔内ＲＴＸ投与の著しい有害効果は示されなかった。本試験の死亡率（マウス１１０匹のうち６匹が失われた）は、群間で一様に分散した－ビヒクルで処置したマウス２匹を含む。さらに、これらのマウスのうち３匹は、投与中または投与後の麻酔中に死亡した。死亡率の残りは髄腔内注入後２４時間以内に観察された。マウスのモニタリングにより、嗜眠性および受動的挙動によって示されるように、これらのマウスが外科手術から適切に回復しなかったことが明らかになった。死亡率はビヒクルならびにＲＴＸ低用量および高用量群の両方の間で一様に拡散したので、これらの死亡は、浸潤性外科手技および麻酔の併発症によって引き起こされた可能性が高い。残りのマウスにおいて有害効果は観察されなかった。また、試験の間、ビヒクル群およびＲＴＸ処置群において同様に安定した体重増加が観察された。
ＡＡＶ注入の７週間後、かつＲＴＸを用いた処置の６週間後または５週間後に、微細運動技能の分析を実施した。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ媒介性疾患状態が、ＡＡＶ－ヌルとそれぞれのＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群の間の高度な有意差として観察された。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群とレシニフェラトキシンで処置した群を比較することにより、ＲＴＸで処置した群がＡＡＶ－ヌル（「健康」）群の方にシフトしたので、早期（Ｄ７）処置群における低用量および高用量の両方のＲＴＸの有意な処置効果も明らかになった。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の１４日後にＲＴＸを用いて処置した群では、同様であるが統計学的に有意でない、それぞれのＡＡＶ－ヌル群の方に向かう傾向があった。主成分分析によって個々のパラメーターを分離すると、これらの歩行レスキュー効果は、肢間協調に関連するパラメーターおよびパラメーターに関して最も強く、これにより、例えば股関節角度範囲の増大として示された非対称の変化を補償しようとしていることが示される。また、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクルで処置したマウスの歩行サイクルは著しくより「ひきつった動き」を有し、これにより、ヒトＰＤに典型的な平滑な歩行の低減が示される。歩行の非対称の変化は、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを片側性に注入したマウスにおいて予測される。
ＡＡＶ－ヌル群は同側性線条体および対側性線条体において同様のレベルのドーパミン、ＤＯＰＡＣおよびＨＶＡを有し、それに反して、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔを注入したマウスは、突然変異型Ａ５３Ｔ－アルファ－シヌクレインを伴うウイルスベクターで処置した同側性側面において、有意により低いレベルのドーパミンおよび代謝産物レベルを有した。これらの結果から、Ｄ７群およびＤ１４群のどちらにおいても疾患モデルが首尾よく誘導されたことが示される。しかし、ビヒクルを投薬したＡＡＶ－Ａ５３Ｔ群とＲＴＸで処置した対応する群の間でドーパミンおよびその代謝産物のレベルを比較した場合に、ＲＴＸ処置の有意な効果は見られなかった。これにより、歩行機能障害の有意な緩和が黒質線条体ドーパミン作動性経路に直接は関連しない機構を通じて伝達されたことが示唆される。神経炎症がＰＤにおいて重要な役割を果たすことが公知であり、それが減弱したことが、観察されたＲＴＸの有益な効果１つの可能性のある説明になり得ることが示唆され得る。
結論として、運動技能をＡＡＶ注入の７週間後に分析した場合に、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ雄マウスにおけるＡＡＶ－Ａ５３Ｔモデル誘導の７日後のＲＴＸの髄腔内投与には有意なレスキュー効果があった。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔ注入の１４日後にＲＴＸを用いて処置した群においても同様の統計学的に有意でない効果の傾向が観察された。しかし、モデル誘導の８週間後の線条体から分析されたドーパミンおよび代謝産物レベルからは有意な処置効果は示されず、これにより、作用機序が黒質線条体ドーパミン作動性経路に直接関連するものではないことが示唆される。ＲＴＸ処置の有意な有害効果は観察されなかった。
（実施例２）
左右非対称を説明する歩行の分析
（実施例２）
左右非対称を説明する歩行の分析
両側性に生じ、「正常な」全体的な歩行スコアに捕捉される変化を評価する代わりに、左右非対称がどのように運動力学パラメーターに顕在化するかを決定するために、上記の試験からのＤ７微細運動歩行分析データを再度評価した。
一般には、動物の左側および右側の両方を試験パラメーターおよび全体的なスコアについて評価し、判別ベクトルは、特定のパラメーターについての左側および右側の両方の値の平均に基づく。例えば、最大股関節角度は左側の角度と右側の角度の平均によって決定され、ＡＡＶ－ヌルビヒクル群とＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群の両方で同様である。しかし、図８Ａ～８Ｃに示されている通り、最大股関節角度の左側と右側の測定値を別々に分析した場合、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクルで処置したマウスの最大股関節角度は、ＡＡＶ－ヌルマウスと比較した場合に左側（図８Ａ）では右側（図８Ｂ）と比べて小さい。図８Ｃは、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクルで処置したマウスにおける最大股関節角度の左右の差異が最大であることを示す。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔおよび０．０５μｇのＲＴＸで処置したマウス（ｎ＝１４）ならびにＡＡＶ－Ａ５３Ｔおよび０．１２４μｇのＲＴＸで処置したマウス（ｎ＝１４）では、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔで処置したマウスおよびビヒクルで処置したマウスと比較して最大差異の減少が示された。
変換データセットを使用して判別ベクトルを創出することによって微細運動歩行分析を実施し、ここで、左側と右側の平均の代わりに左右の差異を使用する。図９Ａに示されている通り、棒の長さは、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群においてＡＡＶ－ヌル群と比較して顕著なパラメーターの左右非対称に対応する。ＰＣＡ分析のために使用した個々の歩行パラメーターが、７日目に投薬した群について示されている。図９Ｂでは、左右の歩行差異判別スコアにより、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群における有意な表現型が示される。ＲＴＸを用いて処置したどちらの群でもＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群と比較して有意に低い判別ベクトルスコアが示された（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
左右非対称を、肢間協調、股関節機能、遊脚速度、および前肢トゥクリアランスなどの他の歩行パラメーターについても分析した。対角肢間協調に顕在化した左右非対称が、図１０Ａ～１０Ｃに示されている。左側および右側についての対角肢間協調のパーセンテージのグラフが、それぞれ図１０Ａおよび１０Ｂに示されている。対角肢間協調は、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群では右側よりも左側の方が低い。左右の差異が図１０Ｃに示されており、低ＲＴＸ用量群および高ＲＴＸ用量群のどちらのマウスでも示される対角肢間協調の差異が小さく、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクルで処置したマウスの範囲内に入るものであるので、ＲＴＸ処置効果が明らかになる。前肢トゥクリアランスパラメーターに関しては、体位および平衡の態様が図１０Ｄ～１０Ｆに示されている。左側、右側および左右の差異がそれぞれ図１０Ｄ、１０Ｅ、および１０Ｆに示されている。ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクルマウスでは、左側（図１０Ｄ）で右側（図１０Ｅ）よりも大きなトゥクリアランスが示された。左右の差異のグラフ（図１０Ｆ）から、ＲＴＸで処置したマウスの両群でＡＡＶ－ヌルビヒクルマウスと同様であり、ＡＡＶ－Ａ５３Ｔビヒクル群とは別個のトゥクリアランスが示された。
図１１Ａ～１１Ｆに示されている通り、後肢ピーク遊脚速度および遊脚速度メトリックの左右非対称を調査することによって微細運動技能をさらに評価した。左側および右側についての後肢ピーク遊脚速度（ｃｍ／ｓ）のグラフが、それぞれ図１１Ａおよび１１Ｂに示されている。図１１Ｃに示されている通り、ピーク遊脚速度の左右の差異は、ＲＴＸ処置群の両方でＡＡＶ－Ａ５３ＴビヒクルＤ７群と比較して減少した。左側および右側についての後肢遊脚速度（ｃｍ／ｓ）のグラフが、それぞれ図１１Ｄおよび１１Ｅに示されている。図１１Ｅに示されている通り、左右の差異はＲＴＸ処置群の両方で、ＡＡＶ－Ａ５３ＴビヒクルＤ７群と比較して減少した。
Claims (13)
- パーキンソン病（ＰＤ）を処置するための方法であって、ＰＤの処置を必要とする対象に有効量のレシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を髄腔内または大槽内投与することを含む方法。
- パーキンソン病（ＰＤ）の処置を必要とする対象を処置する方法における使用のための、レシニフェラトキシン（ＲＴＸ）を含む組成物。
- 前記方法が、前記組成物を前記対象に髄腔内または大槽内投与することを含む、請求項２に記載の使用のための組成物。
- 前記対象がヒト成体である、請求項１に記載の方法または請求項２または３に記載の使用のための組成物。
- 前記ＲＴＸが、約０．１μｇから約１００μｇの用量で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記用量が、約０．１μｇから約１μｇ、約１μｇから約５μｇ、約５μｇから約１０μｇ、約１０μｇから約２０μｇ、約２０μｇから約５０μｇ、または約５０から約１００μｇである、請求項５に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記方法が、髄腔内投与を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記方法が、大槽内投与を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ＲＴＸが、前記ＲＴＸおよび薬学的に許容される担体を含む医薬製剤で投与される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記薬学的に許容される担体が、水を含む、請求項９に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記薬学的に許容される担体が、生理食塩水を含む、請求項９に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ＲＴＸが、前記医薬製剤中に１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ＲＴＸが、前記医薬製剤中に１μｇ／ｍｌから５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌから２０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ、または５０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在する、請求項１２に記載の方法または使用のための組成物。
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