KR20190099596A - Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법. - Google Patents

Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법. Download PDF

Info

Publication number
KR20190099596A
KR20190099596A KR1020180019223A KR20180019223A KR20190099596A KR 20190099596 A KR20190099596 A KR 20190099596A KR 1020180019223 A KR1020180019223 A KR 1020180019223A KR 20180019223 A KR20180019223 A KR 20180019223A KR 20190099596 A KR20190099596 A KR 20190099596A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gaba
sciatica
cci
treatment
brain
Prior art date
Application number
KR1020180019223A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102087492B1 (ko
Inventor
문형철
박영석
Original Assignee
충북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 충북대학교 산학협력단 filed Critical 충북대학교 산학협력단
Priority to KR1020180019223A priority Critical patent/KR102087492B1/ko
Publication of KR20190099596A publication Critical patent/KR20190099596A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102087492B1 publication Critical patent/KR102087492B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A61K31/515—Barbituric acids; Derivatives thereof, e.g. sodium pentobarbital
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 본 발명은 좌골신경통 환자의 ZI에 직접 주입할 수 있는 GABA 또는 GABA 작용제를 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 이용한 치료 방법에 대한 것이다. 본 연구 결과, 좌골신경통 환자의 뇌의 불확정구역(ZI, zona incerta)에서 신경전달 물질인 GABA의 신호가 감소됨을 확인하였으므로, 뇌의 불확정영역에 GABA 또는 GABA 작용제를 직접 투여함으로써, 좌골신경통을 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

GABA 및 GABA 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법.{Composition for treatment or improvement of sciatica that comprising GABA or GABA agonist}
본 발명은 좌골신경통 환자의 ZI에 직접 주입할 수 있는 GABA 또는 GABA 작용제를 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물 및 상기 조성물을 이용한 치료 방법에 대한 것이다. 좌골신경통 환자의 뇌의 불확정구역(ZI, zona incerta)에서 신경전달 물질인 GABA의 신호가 감소되므로, 본 발명에서는 ZI에 주입하여 상기 질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물 및 이와 같은 치료 방법을 포함한다.
신경병성 통증은 일반적으로 말초 신경 손상 (예 : 수술 후 통증 또는 방사선으로 인한), 중추 신경계 손상 (예 : 다발성 경화증, 척수 손상), 바이러스 감염 (예 : 대상 포진 후 신경통), 종양 등에 의하여 유발될 수 있다. 신경병성 통증은 중증도와 지속 기간에 있어 다른 유형의 만성 통증보다 심한 경우가 존재하며, 환자의 5%는 진통제를 투여함에도 불구하고 통증을 호소한다. 따라서 신경병성 통증은 가장 힘든 임상 결과 중 하나이며 표준 통증 약물로 조절할 수 없고 수 많은 약물에 대한 내성을 가지게 된다. 말초 신경 손상으로 인한 만성 신경 병증 통증은 현재의 치료법에 의하면 불응증으로 판명 될 수 있다는 점이 문제점으로 파악된다. 신경병성 통증 환자는 총격과 화상, 전기 충격과 같은 통증, 따끔거림, 마비, 감각장애, 손발 저림, 이질통 및 통각과민과 같은 증상을 호소한다. 좌골 신경의 만성 협착 손상 (CCI, chronic constriction injury)은 일반적으로 신경병성 통증의 쥐 모델을 생성하는데 사용된다. CCI에 의해 유발 된 통증의 원인은 정확하게 알려지지 않았지만, 만성 신경병성 통증은 시상에서 비정상적인 불확정영역(zona incerta, ZI)에서 매개되는 GABA(γ-Aminobutyric acid, GABA)의 억제로 인한 것으로 생각된다. 뇌의 각 영역에서 GABA의 작용 정도가 다양하기 때문에 GABA의 작용으로 인한 통증 상태 조절에 대한 메카니즘을 규명하는 것은 매우 복잡하다.
이전의 많은 연구에서 뇌 불확정영역(ZI)와 만성 통증 사이에 서로 연관성이 있음이 보고되어 있다. ZI는 하부 시상에 위치한 GABA성('GABAergic') 신경핵으로, 뇌간의 세분화된 부분이며, 대부분의 ZI 뉴런은 GABA성이다. 인터뉴런은 ZI의 시냅스 전달에서 흥분성 및 억제성 뉴런 간의 균형에 영향을 주는 GABA성 경로와 같은 억제 경로를 가지고 있다. 최근 Masri 등은 가장 세포구축학적이면서 신경화학적으로 시상에서 세포군이 분열하는 ZI와 같이 후부시상(posterior thalamus)에서 자극성 또는 감각성 정보의 흐름을 억제하는 자극 반응 프로세스의 조절을 위한 새로운 시스템에 대하여 설명하였다. 즉, ZI는 후부시상에서 자발적 활동과 유발된 활동을 모두 조절하며, ZI 불활성화는 시상 후 핵의 하위 집합에서 반응 대기 시간을 감소시키며, ZI는 체성 감각 시스템과 내부 감각 수용 시스템을 조율하는 경로(1차 및 2차)를 모두 포함한다.
따라서 GABA성 신호 전달 체계를 연구하여, 신경병성 통증, 그 중에서도 좌골신경통의 진단 및 이를 치료하기 위한 방법(조성물)에 대한 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은 GABA 및 GABA 성 신호를 시험하기 위해, 본 연구는 좌골 신경 CCI의 생쥐(rat) 모델을 사용하여 생체 내에서 GABA 농도 및 GABA 성 ZI 뉴런 활성의 변화를 조사 하였다. 쥐의 좌골 신경 CCI는 인간의 말초 신경 손상으로 인한 신경병성 통증을 모방하는 비교적 일관된 신경병성 통증 행동을 나타낸다. ZI에 GABA 수용체에 대한 작용제 및 길항제를 주입한 후 통증 관련 행동 및 신경 세포 활성을 평가 하였다
-The role of GABA in the mediation and perception of pain, Enna SJ et al -GABA mechanisms and antinociception in mice with ligated sciatic nerve, Zarrindast MR et al.
본 발명의 목적은 GABA 또는 GABA 작용제를 유효성분으로 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 성분을 포함하는 조성물을 뇌 불확정영역(ZI)에 주입하는 단계를 포함하는 좌골신경통 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 GABA 또는 GABA 작용제를 유효성분으로 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양태로서 본 발명은 GABA 또는 GABA 작용제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 뇌 불확정영역에 주입하는 단계를 포함하는, 좌골신경통의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 GABA 또는 GABA 작용제를 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물 또는 상기 약학적 조성물을 뇌의 불확정 영역에 주입하는 단계를 포함하는 좌골신경통 치료 방법은 상기 질환과 관련하여 GABA 또는 GABA 작용제가 작용하는 뇌의 특정 영역을 지정하고, 이에 대한 정확한 치료 방법을 제시하고 있다. 따라서, 기존에 공지된 발명에 비하여, 좌골신경통에 대한 치료 효과가 우수한 특징을 가진다.
도 1은 본 연구의 전체적인 흐름을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 CCI를 유발한 동물 모델에서 PWT(움츠림역치)의 변화(A) 및 PWL(발바닥숨김)의 변화(B)를 측정한 결과를 나타낸 것이다. PWT의 경우, CCI를 유발한 경우 시간이 지날수록 역치값이 낮아졌으며, 등측성 허벅지 신경 손상시, 통증과민이 유발된 것을 확인할 수 있다. PWL의 경우에도 시간이 지남에 따라 감소된 것을 확인하였다.
도 3은 생체 내 미세투석법을 이용하여 ZI의 신경전달물질을 분석한 결과이다.
도 4는 CCI 유발 동물 모델 및 위약치료군에서, 작용제, 길항제 또는 식염수로 유발된 통증과민의 변화를 보여주는 결과이다.
도 5는 CCI 유발 및 위약치료된 동물 모델의 ZI에서 자발적인 신경 활성을 보여주는 것이다.
본 연구는 뇌의 불활성영역에서 신경전달 물질의 GABA성의 뉴런 활성에 관련된 신경병증성 통증에 대한 것이다. 연구에 의하면, ZI에서의 신경 세포 활동은 좌골 신경에 CCI(chronic constriction injury)를 유발한 쥐가 위약 처리군과 비교하여 유의하게 낮다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, GABAA 작용제에 의한 치료는 허벅지 신경이 손상된 쥐 모델에서 PWT 및 PWL을 감소시키고, ZI의 발화율을 증가시킨다. 이 모든 데이터는 GABA 신경 세포 활성 억제가 CCI에 의한 신경병적 통증의 주요 원인이 됨을 시사하는 것이다.
이전의 연구들은 ZI에서 시상 하부 릴레이를 포함한 시상 릴레이에 이르는 신경 회로를 제시하였다. ZI는 많은 수의 시상 핵으로 돌출되어 있으며, 시상에서 강장억제 피드 포워드(feed-forward)에 영향을 준다. 척수 손상에 의하여 신경병적 통증이 유발된 쥐 모델에서 ZI에서 신경활성이 감소되는 것은 이전 연구를 통해 입증되었다. ZI 활성의 감소는 후시상(posterior thalamus) 및 침해 수용성 정보 처리에 중요한 체성 감각성(somatosensory) 시상핵의 신경 활성의 병리학적 증가와 마찬가지로 관련성이 있다. ZI의 발화율과 시냅스성 GABA 농도의 조절은 컴퓨터에 의한 연구에서 incerto-thalamic 회로의 조절에 효과적인 수단이 될 것으로 보여진다. 이는 ZI에서 GABA성 조절이 생체 내에서 신경병증성 통증을 경감시키는 것을 나타내는 것이다.
이러한 경로는 억제성(GABA성)이고, 시상 하부 전달의 조절자로 작용할 가능성이 있다. ZI는 뇌의 상구(superiorcolliculus)의 깊은 층 감각성의 삼차신경핵 복합체 및 배측삭핵(dorsal column nuclei)으로부터 지형학적으로 체계화된 투영(projection)을 수신하며, 주로 뇌의 상구와 pretectal nuclei,대측성 ZI와 같은 고차원의 시상핵 등이 주로 GABA성의 신경에 포함된다. ZI 뉴런은 시상 배핵과 대뇌 피질과 같은 다양한 뇌의 영역을 자극하며, GABA성의 불확정 뉴런은 극초단파의 자극 또는 뮤시몰 등의 주입으로 뇌의 불확정 투사성 영역에서 일시적인 탈억제를 유발할 수 있다. ZI 말단의 복합 활성 영역은 시상 뉴런의 발화 특성의 영향을 매우 강하게 받는 것으로 확인되었으며, 이는 전달성 세포를 통해 다양한 뇌의 피질 영역으로 전달되는 것이며, 신피질(neocortex)로 광범위하게 투사된다. ZI의 GABA성 말단은 주로 시상의 고차원적 핵에서 연합 뉴런의 근위성 수상돌기를 선택적으로 자극한다. ZI는 시상 하부 아래쪽에 쐐기 모양으로 가로지르는 좁은 영역인 간뇌의 중심을 형성하며, 감각적 자극(신체 및 근육)에 대한 즉각적인 반응(본능, 흥분, 집중, 또는 자세-운동)을 생성한다.
좌골 신경의 CCI는 말초의 만성적 신경병증성 모델에 널리 사용된다. 이는 손상 이후 최소한 1개월 이후부터 안정적인 과민성 통증을 나타내도록 한다. 좌골 신경의 CCI를 유발한 이후, 동물 모델은 자발적으로 통증의 존재를 확인하기 위하여 손상된 뒷발에서 비정상적인 자세(ie. 발가락 모음, 족저굴곡 변형, 외번 등)를 보이거나, 발바닥의 반복된 떨림 현상을 보이거나, 발바닥을 보호하고 핥는 행동을 나타내었다. CCI는 개별적으로, 또는 상승작용으로 인하여 신경성 과민반응에 의한 척수후뿔(spinal dorsal horn)에서 부적응성의 시냅스성 회로를 만드는데 영향을 준다. 이러한 신경성 과민반응 또는 중추 감작은 말초수용영역에 제공되는 외부적 자극에 대한 자발적이거나 혹은 유발된 신경적 반응을 강화시키고, 활성에 의한 역치값을 낮추며, 말초 수용영역의 크기를 증가시키고, 후 반응 활성을 증가시키는 특징을 보인다.
논의된 바에 의하여, ZI 뉴런은 시상핵의 활성에 의해 자극된다. 앞선 연구에 따르면, 신경병증성 통증은 ZI 뉴런의 감소를 수반한다. 감소된 GABA성 억제의 전달은 신경병증성 통증의 발달에 대한 원인이 된다. 따라서, 좌골신경의 CCI에 대한 근본적인 메카니즘은 CCI 병변이 보여주는 ZI에서 GABA성 뉴런의 점진적인 사멸(apoptosis)의 억제를 통해 연구중에 있다. 미세투석법은 ZI 뉴런의 불활성화가 GABA성 신경 뉴런의 억제와 관련성이 있기 때문에 ZI의 신경 활성이 GABA 치료에 의해 제어된다는 것을 입증하였다. 좌골신경 CCI 유발 동물 모델에서 GABA와 세로토닌의 수치는 매우 낮은 것으로 확인되었다. 신경병증성 통증이 있는 동물의 경우, 복저시상 내의 세로토닌 수치가 감소하였다. 추정컨대, 이러한 변화를 매개하는 매커니즘은 GABA성의 신경계 변화를 포함하며, 이러한 신경전달물질인 GABA 및 세로토닌에 의한 치료법이 신경병성 통증을 치료할 수 있다고 가정할 수 있다.
시냅스 외부의 GABA 활성은 뉴런을 과분극시키는 반면 이러한 리셉터들을 차단함으로써 발화를 촉진하게 된다. 그러나, 다른 연구에서, 시상의 연속적 세포의 발화 촉진은 통각수용기성 통증과 관련되며, 발화의 촉진은 통각수용기의 정보의 억제와 연관된다고 하였다. ZI에서 GABA성의 전달은 복잡하다. Cha 등은 ZI로 뮤시몰을 주입함으로써 ZI 뉴런의 불활성화를 억제할 수 있다고 하였으나, Moon 등에 의한 결과는 이와 다르다. 그것은, ZI 복합체 자체 또는 후 시상을 타겟으로 했을 때, 가능한 것이다. Petronilho 등은 ZI로 글루타메이트를 주입하여 항통각수용성을 만들어낼 수 있다고 하였다. 그들은 글루타메이트 투여 후 일시적인 항통각수용성을 조사하기 위하여, 급성 통증모델을 사용하였으나, 본 연구에서는 만성 통증 모델을 사용하였다. 그들은 세로토닌 작용성, α-아드레날린 작용성 및 내인성 오이포이드(oipoid) 기반의 메카니즘을 사용하여 후외측 섬유단(dorsolateral funiculus)을 따라 척수로 내려오는 통증 억제 경로에 초점을 맞추었으나, 우리는 GABA의 영향에 따른 시상 내부의 억제에 중점을 두었다.
신경병증성 통증의 원인은 아직 규명되지는 않았으나, 만성 신경병증성 통증은 시상에서 비정상적인 억제로 인한 것이라 가정하였다. GABA성의 전달은 흥분과 통증의 상태를 조절하는 것으로 알려져 있으나, 뇌의 관련 부위가 광범위하고, GABA성의 신경 전달이 매우 복잡하기 때문에, 근본적인 매커니즘의 연구가 필요하다. 국소적 통증에 중요한 신호를 전달하는 척수시상로(spinothalamic tract)와, 통증의 감정적인 측면에 관여하는 척수망상체로(spinoreticular tract)는 주요한 통증 경로들이다. ZI는 척수시상로를 통해 조밀한 침해수용성 입력(nociceptive input)을 받아 독점적으로 강장 억제 피드 포워드만을 시상핵, 특히 시상 하부의 후방핵에 보낸다. ZI 는 일반적으로 시상핵을 강력하게 억제하나, CCI 유발 후 신경병증성 통증은 ZI의 신경 활성이 감소되기 때문인 것으로 여겨진다. 따라서, ZI의 활성 억제는 통각 정보를 처리하는데 중요한 체성감각 시상핵인 후부시상에서의 신경세포 활동의 병리학적 증가와 관련이 있다.
위와 같은 연구 결과, 본 발명자들은 신경병증성 통증을 억제하기 위하여, ZI 영역에서 신경전달물질인 GABA에 의한 작용이 중요한 것을 새롭게 밝혀내었고, GABA의 농도를 향상시킬 수 있는 GABA의 작용제(agonist)를 ZI에 주입함으로써 신경병증성 통증의 증상을 완화시킬 수 있다는 점에, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 ZI에 주입되는 것을 특징으로 하는, GABA 또는 GABA 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 GABA 작용제는 이에 제한되는 것은 아니나, 벤조디아제핀, 디아제팜, 클로로디아제프옥사이드, 바르비트루산, 피크로톡신, 스테로이드, 뮤시몰 등이 포함되며, 바람직하게는 뮤시몰일 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물은 유효 성분의 활성을 최대한 유지시키기 위하여, 적절량의 염 및 완충 용액 등을 포함할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제, 윤활제, 습윤제, 유화제, 보존제 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 또한, 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태일 수 있다.
또한 본 발명은, 뇌의 ZI에 GABA 또는 GABA 작용제를 주입하는 과정을 포함하는, 신경병증성 통증의 치료 방법을 제공한다.
상기 주입은, 정맥내 주입, 경구 또는 피하 내 투여, 뇌내 직접 주입하는 방법을 포함하며, 그 방법에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 뇌의 ZI에 직접 주입하는 것을 의미한다. 또한, 뇌내 직접 주입을 위하여 특화된 약물 주입기구를 사용할 수 있으며, 구체적으로, 약물주입기구(Ommaya reservoir) 및 약물주입 카테터를 포함한다.
또한 상기 본 발명의 치료 방법에 있어서, 상기 약물의 적합한 투여량은 약제학적 조성물의 투여방법을 적용할 수 있으며, 이에 따라 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 GABA 또는 GABA 작용제는 0.1 내지 1.0 mmol/㎕ 의 농도로, 1회 투여량은 1 ㎕ 내지 5 ㎕ 이다. 본 발명의 실시예에서는 상기 GABA 또는 GABA 작용제를 0.5 mmol/㎕(저농도) 또는 5mmol/㎕(고농도)의 농도로 주입하였으며, 1회 투여량은 2㎕으로 주입하였다. 상기 범위의 농도 및 주입량보다 적게 주입될 경우, 통증 치료에 대한 효과가 미미하며, 상기 범위를 초과하여 주입될 경우, GABA성 반응이 과도하게 유발되어 부작용이 발생할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험 재료 및 실험 방법>
1. 실험 동물의 선정 및 디자인
모든 동물 실험은 충북 대학교 동물 실험 윤리 심의위원회에서 정한 승인 된 국가 지침에 따라 수행되었다. 통증 연구 협회 (International Association of Pain of Study)의 지침에 따라 무균 동물 수술 장비, 장갑 및 무균 커튼 및 면봉이 사용되었다. 피부를 70% 에탄올로 소독하고 모피를 수술 부위에서 면도한 다음 멸균 드레이프로 덮었다.
Sprague Dawley 수컷 쥐(250-300g, 대한 바이오링크, 한국, 음성군)는 표준 주거 조건 (12:12 시간 명암주기) 하에서 동물 복지에 관한 국립 보건원의 지침에 따라 사육되고 실험실 내에서 먹이 및 물을 자유롭게 식이하였다. 각각의 쥐는 임의적이고 이중맹검으로 컨트롤된 지침에 따라, 기도폐쇄를 방지하기 위해 평평한 종이 침구가 있는 별도의 케이지에 사육하였다. 실험의 타임 라인은 도 1에 나와 도시한 바와 같다. 샘플 크기는 PASS 14 소프트웨어에 의해 설정하였다. (NCSS Inc, USA, UT, Kaysville. alpha = 0.05, power = 0.8)
2. CCI 수술
본 연구에서는 CCI (n = 20)와 대조군으로서 허위 처리된(n = 10) 쥐를 사용 하였다. 모든 동물들은 같은 날에 수술을 시행하였다. 케이지는 모든 풀에서 무작위로 선택되어 그룹으로 선정하였다. 케이지에는 일시적으로 숫자가 지정되었으며, 생쥐는 등록 기관에 의해 번호가 부여되었다. 모든 동물들은 동일한 마취, 준비, 진정 작용 및 예비 수술 절차를 받았으며, 수술 후 눈을 멀게 했다. 이 연구를 위하여 케이지에서 동물을 꺼내 기록원에서 영구적인 지정을 받았다.
3. 행동 분석
기계적 통각 과민은 Dynamic Plantar Aesthesiometer (모델 37450, Ugo Basile, Varese, Italy)로 측정하였다. 쥐(n=30)를 격자 바닥이 있는 Plexiglas 케이지(20×20×14cm)에 넣고 최소 40 분간 안정시켰다. CCI 병변에 동측성 및 대측성의 발바닥 앞꿈치 부분에 지속적으로 증가하는 압력 (5g/s)을 가하여 기계적 자극을 주었다. 생리 식염수, GABA 작용제인 뮤시몰(muscimol) (0.5 mmol/μL [0.28525μg] 또는 5 mmol/μL[2.8525μg])및 GABA 길항제 bicuculline (0.5μmol/μL [0.0009185μg] 또는 5μmol/μL [0.009185μg])를 각각 2μL씩 주입 한 후 Paw Withdrawal Threshold (PWT)와 Paw Withdrawal Latency(PWL)를 측정하였다. 농도의 최소치 및 최대치는 공지된 내용에 기초하여 결정하였다.
약물 투여 후 2 시간이 지난 후에 행동 검사를 시행하였으며, 각 값은 세 번 독립적으로 측정한 값의 평균을 나타내는 것이다.
4. 가이드 캐뉼러의 삽입
미세 투석을 시행하고 GABA 계 약물을 투여하기 위해 실험 4 일 전에 생쥐에 가이드 캐뉼러를 이식 하였다. 브레그마와 람다를 노출시키기 위해 두개골 정중선을 따라 세로 절개를 하였다. 기록 및 약물 주입을 위한 미세 가이드 튜브 (Eicom, Kyoto, Japan)를 2 개의 뼈 나사와 아크릴 수지(Ortho-Jet; Lang Dental, Wheeling, IL, USA)를 사용하여 고정시켰다. 15mg/kg tiletamine/zolazepam과 9mg /kg xylazine을 투여하여 마취시킨 후, 스테인레스 스틸 가이드 캐뉼라 (외경, 0.5 mm, AG-8, Eicom)를 ZI의 다음 좌표에 정위적으로 삽입 하였다 : Paxinos와 Watson의 아틀라스에 따라 정중선에서 2.8 mm, 뇌 표면에서 6.8 mm 아래.
위와 같이 유도 캐뉼라를 삽입한 후, 더미 캐뉼라 (외경 0.5 mm)를 조심스럽게 삽입 하였다.
5. 생체 미세투석법
미세 투석 전날, 내부 탐침(stylet)을 1.0mm 길이의 반투막 (외경, 0.31mm; A-I-8-02; Eicom)을 갖는 투석 프로브로 대체 하였다.
2 채널 유체 회전 장치 (SSU-20, Eicom)를 프로브 입구와 출구에 연결하고 인공 뇌척수액 (147 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.2 mM CaCl2, 0.9 mM MgCl2)을 펌프를 사용하여 1 μL/min의 속도로 주입하여 프로브를 세척하였다. 하룻밤 동안 평형 상태를 유지 한 후, 에틸렌디아민 테트라아세트산(200μM) 및 아세트산 용액 (40mM)이 동일 부피(36μL)로 들어있는 유리병에서 36μL의 투석액을 30 분마다 채취하여 투석을 실시하였다. 검체가 채취 될 때까지 시료를 -70 ℃에서 보관 하였다. GABA, 글루타민산 및 세로토닌을 위약 처리군(n = 10) 및 CCI 유발 군(n = 10)에서 각각 측정 하였다.
6. 미세주입 절차
텔레스코핑 스틸 튜브 시스템에 의해 보호되는 미세 투석 프로브를 사용하여 약제 또는 식염수를 ZI에 주입하였다. 상기 튜브 어셈블리를 미세주입 전에 가이드 캐뉼러에 삽입하고 바늘을 가이드 캐뉼러 팁에서 3 mm 돌출되도록 하였다.
ZI (~ 3 mm2)의 면적이 전방 핵 (~ 2 mm2)의 면적보다 크기 때문에 0.25 μL/min의 속도로 주입되었다. 용액을 2분 동안 동일한 속도로 전달되고, 절차 완료 후, 주사 바늘을 20초 동안 제거 하였다.
7. 생체 세포외 리코딩
좌골 신경 손상 후 10 경과 후, 위약으로 처리 한 CCI 쥐(그룹당 6 마리)를 15mg/kg tiletamine/zolazepam과 9mg /kg xylazine을 투여하여 마취시킨 후. ZI에서 석영 절연 탄소 전극(Kation Scientific, Minneapolis, MN, USA)을 통해 세포외 리코딩을 얻었다. 이 연구는 디지털 Lynx SX 데이터 수집 시스템 (Neuralynx Inc., Bozeman, MT, USA)을 사용하여 파형을 디지털화 (40kHz)하고, 상기 unit를 이중 임계값 및 주성분 분석(PCA)으로, Neuralynx SpikeSort 3D 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 분류하는 것이다. NeuroExplorer 소프트웨어(Neuralynx)를 사용하여 발화 속도(스파이크/초) 및 연축시간 히스토그램 (PSTH)을 생성하여 단일 유닛에서 기록된 것을 확인하였다.
8. 신경전달물질 분석
LC-MS를 사용하여 GABA, 글루타메이트 및 세로토닌을 검출하였다. 크로마토그래피 분석은 G1322A 탈기장치, G1311A 4급펌프, G1313A 웰-플레이트 자동 시료 채취기 및 G1316A 자동 온도 조절 컬럼(G1316A thermostated column)을 포함하는 Agilent 1100 고속 액체 크로마토 그래피(HPLC) 시스템 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)에 의해 수행되었다. 전기분무 소스 인터페이스를 이용한 G1946D 질량 분석기(Agilent Technologies)를 MS 검출에 사용 하였다. LC/MS 검출을 위해 애질런트 ChemStation을 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행하였다.(version B.02.01). Agilent XDB-C18 컬럼 (3.0 mm x 50 mm, 1.8 μm)에서 크로마토그래피 분석을 수행하고, 아세토니트릴:0.1% 포름산 수용액 (24:76, v/v)를 이동상으로 0.3 mL/min의 속도로 용리하였다. 컬럼 온도는 25℃, 오토샘플러는 4℃, 부피는 5㎕로 유지 하였다. 분석 시간은 샘플 당 4.5분이었다. HPLC 시스템은 전기 분무 이온화 (ESI) 인터페이스를 통해 질량 분석기에 연결하였다. ESI의 질량 조건은 아래와 같이 음이온 검출 모드에서 최적화되었다 : 모세관 3,500V, 분무기 40 psi, 건조 가스 8L/min, 가스 온도 350℃ 및 프래그먼트 80V. 선택된 이온 모니터링을 사용하였으며, 단편 전이는 curculigoside 의 경우 m/z 511.1이고 naringin의 경우 m/z 579.1이었다.
9. 전극 및 프로브 배치의 조직학적 검증
실험이 완료된 후, 전극 및 탐침 부위는 사후 검증되었다. 전해 병변은 10 초 동안 0.05 mA 전류를 기록된 전극에 통과시킴으로써 심장 관류 전에 만들어졌다. 쥐를 tiletamine/zolazepam으로 완전히 마취시키고 0.1M 인산염 완충 식염수를 4% 파라포름알데하이드로 심장을 통해 관류시켰다. 쥐를 생리 식염수 및 10% 포르말린과 식염수로 함께 경막 외 관류시켰다. 뇌를 추출하여 절편화하기 전에 24시간 동안 10 % 포르말린에서 추가로 고정시켰다. Microtome cryostat (Microm, Walldorf, Germany)를 사용하여 시상형성체를 통해 관상면(5 μm)을 절단하고 뇌의 표적 부위를 neutral red로 염색 하였다. 전극과 탐침 부위는 Paxinos와 Watson의 뇌 지도를 기반으로 하는 광학 현미경을 통해 위치시켰다.
10. 통계학적 분석
분석은 통계 소프트웨어 프로그램 Prism 7.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) 및 미세 투석 농도의 비 시험 t- test를 통한 행동의 양방향 분석(ANOVA)으로 수행 하였다. 주사 후 약물의 효과를 조사하기 위해, 행동 및 신경 활동 기록에 대한 일원 분산 분석 (ANOVA) 테스트가 매번 수행되었다. 모든 실험에서 P <0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 데이터는 행동 테스트에 대한 '평균±표준 편차'(SD)와 신경 신호 및 생화학 분석에 대한 평균의 '평균±표준 오차'를 나타낸다.
<결과 분석>
1. 통증에 대한 과민 반응의 행동 확인
CCI 유발 군(n = 20) 및 위장치료군 (n = 10)에서 신경 병성 통증에 대한 감수성을 평가하기 위하여, PWT 및 PWL을 찾는 행동 분석을 수행 하였다. 수술 후 10 일 이상 경과 후, CCI 유발군의 동측 뒷발의 PWT는 반대쪽 뒷발과 위장치료군 동물에 비해 35.66±2.85 (평균±표준 편차)에서 16.84±4.98g (반복 양방향 ANOVA, F=51.21, P=0.0001)로 유의하게 감소했다(그림 2A). 이전의 보고와 일치되게, 좌골 신경 손상을 동반 한 36-38 마리 동물은 수술 후 기계적 자극에 대한 반응으로 PWT가 감소한 것으로 나타났다.
또한 수술 후 10일 이상 처리한 동물 중, CCI 유발군 쥐의 동측 뒷발의 PWL은 반대쪽 뒷발과 허벅지 뒷다리와 비교하여 6.81±1.57에서 3.31±1.01 (반복된 양방향 ANOVA, F=65.99, P=0.0001)로 감소된 것을 확인하였다(도 2B). 중요하게도, CCI 유발된 래트의 PWT 및 PWL은 동일한 시간 동안 위장치료된 래트의 PWT 및 PWL보다 유의하게 낮았다. 위장치료된 쥐는 이 기간 동안 PWT 및 PWL에서 차이를 보이지 않았다. (도 2)
2. ZI 의 생체 내 미세 투석
신경 전달 물질 수준의 변화를 평가하기 위해 미세 투석 (microdialysis) 프로브를 CCI 처리군(n = 10) 및 위장치료군(n = 10)의 ZI에 각각 이식 하였다. 두 그룹의 쥐에서 GABA 수준을 측정한 결과, CCI 처리군은 2.31±0.61μg/L, 위장치료군은 5.38±0.43μg/L (P<0.05)로서, CCI 처리군에서 보다 유의하게 낮은 GABA 수치를 보임을 확인할 수 있었다(도 3). 글루탐산의 수준은 CCI 처리군 및 위장치료군에서 유사한 수준으로 나타났으며, 또한, CCI 처리군과 위장치료군의 세로토닌 수준은 CCI 처리군의 경우, 0.25±0.07μg/L, 위장치료군의 경우 0.46±0.05μg/L (P<0.05) 로서, CCI 처리군이 유의하게 낮은 세로토닌 수준을 보였다.
3. ZI에서 GABA 자극 주사의 움추림 역치(withdrawal thresholds)에 대한 효과
ZI에서 GABA가 통증 조절에 미치는 영향을 조사하기 위해 CCI 처리군(n = 10) 및 위장치료군 (n = 10)의 쥐의 ZI에 2㎕의 식염수, muscimol(0.5또는 5 mmol/μL) 또는 bicuculline(0.5 또는 5μmol/μL)을 분당 0.25 μL의 속도로 미세 투석 프로브를 사용하여 미세 주입 하였다. muscimol주입량이 많을수록 동측 뒷발의 PWT (one-way ANOVA, F=3.86, P<0.05)와 PWL (일원 분산 분석, F=3.60, P <0.05)이 증가 하였지만, bicuculline의 경우, PWT 또는 PWL에 대한 영향이 없었다. (그림 4A 및 B).
4. 좌골 신경 손상 후 ZI에서의 신경 세포 활동
ZI 뉴런의 출력에 좌골 신경 손상의 영향을 평가하기 위해, CCI 유발군의 ZI (n=6)와 위장치료군(n = 6) 쥐의 연결 활동을 기록했다. 표적 ZI는 관상면(도 5A)의 개략도에 도시되어있다. ZI 뉴런의 평균 발화율은 위장치료군의 쥐보다 CCI유발군에서 더 낮았다 (그림 5B). 더욱이, 자연 발화율은 위장치료군 (7.73±0.15 spikes/s, unpaired t-test, P<0.001)보다 CCI 유발군 (5.80±0.12spikes/s)에서 유의하게 낮았다. ZI의 GABA 조절이 뉴런의 활동에 미치는 영향을 분석하기 위해, muscimol또는 bicuculline으로 치료한 위장치료군 및 CCI 유발군에 대하여 자발적 발화 속도를 30 분 동안 측정하였다. 위장치료군 쥐의 발화율은 매 시간 일원분산분석(one-way ANOVA)에 기초한 대조군인 식염수 주입군에 비해 muscimol 또는 bicuculline 주입 후 유의하게 증가 하였다(도 5C, P <0.05; 표 S1). 발화율은 muscimol 주입 후 CCI유발 쥐의 기준선 이상으로 증가했다. 반면에 bicuculline의 주입 후에는 일원분산분석에 근거하여 발화율에 영향을 미치지 않았다 (그림 5D, P <0.05; 표 S1). PSTH에 의해 입증 된 바와 같이, GABA 약물 치료 후 CCI 유발군에서 발화율의 전반적인 변화를 도 5E 및 F에 나타내었다. 12마리의 쥐로부터 신경 세포 기록을 모니터링 하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

  1. 뇌의 불확정영역에 주입되는 것을 특징으로 하는, GABA 또는 GABA 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 GABA 작용제는 벤조디아제핀, 디아제팜, 클로로디아제프옥사이드, 바르비트루산, 스테로이드 및 뮤시몰로 이루어지는 군으로부터 일 이상 선택되는 것인, 좌골신경통 치료 및 완화용 약학적 조성물.
  3. 뇌의 불확정영역에 GABA 또는 GABA 작용제를 포함하는 약물을 주입하는 과정을 포함하는, 인체를 제외한 포유동물의 좌골신경통의 치료 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 GABA 및 GABA 작용제를 포함하는 약물을 약물주입기구(Ommaya reservoir) 및 미세주입 카테터를 사용하여 뇌의 불확정 영역에 직접 주입하는 것을 특징으로 하는, 좌골신경통의 치료 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 GABA 또는 GABA 작용제는 전체 약물 중 0.1 내지 1.0 mmol/㎕ 의 농도로 포함되도록 투여하는, 좌골신경통의 치료 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 약물은 1일 1회, 1 ㎕ 내지 5 ㎕ 의 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 좌골신경통의 치료 방법.
KR1020180019223A 2018-02-19 2018-02-19 Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법. KR102087492B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180019223A KR102087492B1 (ko) 2018-02-19 2018-02-19 Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180019223A KR102087492B1 (ko) 2018-02-19 2018-02-19 Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법.

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190099596A true KR20190099596A (ko) 2019-08-28
KR102087492B1 KR102087492B1 (ko) 2020-03-10

Family

ID=67775001

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180019223A KR102087492B1 (ko) 2018-02-19 2018-02-19 Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법.

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102087492B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115998673A (zh) * 2023-02-10 2023-04-25 南通大学 一种γ-氨基丁酸水凝胶及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006509031A (ja) * 2002-12-06 2006-03-16 ゼノポート，インコーポレイテッド Ｇａｂａ類似体のプロドラッグ、その組成物及び使用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006509031A (ja) * 2002-12-06 2006-03-16 ゼノポート，インコーポレイテッド Ｇａｂａ類似体のプロドラッグ、その組成物及び使用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
-GABA mechanisms and antinociception in mice with ligated sciatic nerve, Zarrindast MR et al.
Neuroscience Letters, 632, pp.55-61(2016) 1부.* *
-The role of GABA in the mediation and perception of pain, Enna SJ et al

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115998673A (zh) * 2023-02-10 2023-04-25 南通大学 一种γ-氨基丁酸水凝胶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR102087492B1 (ko) 2020-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bassi et al. Modulation of experimental arthritis by vagal sensory and central brain stimulation
Yang et al. Developing a neuronal model for the pathophysiology of schizophrenia based on the nature of electrophysiological actions of dopamine in the prefrontal cortex
Tanida et al. Olfactory stimulation with scent of essential oil of grapefruit affects autonomic neurotransmission and blood pressure
Hoskin et al. Central activation of the trigeminovascular pathway in the cat is inhibited by dihydroergotamine: a c-Fos and electrophysiological study
Tai et al. Modulation of subthalamic T-type Ca 2+ channels remedies locomotor deficits in a rat model of Parkinson disease
Guo et al. DBS of nucleus accumbens on heroin seeking behaviors in self-administering rats
Crochet et al. Effects of microdialysis application of monoamines on the EEG and behavioural states in the cat mesopontine tegmentum
Jin et al. Acupuncture reduces relapse to cocaine‐seeking behavior via activation of GABA neurons in the ventral tegmental area
Zhang et al. Effects of neonatal inflammation on descending modulation from the rostroventromedial medulla
Travers et al. Suppression of third ventricular NPY-elicited feeding following medullary reticular formation infusions of muscimol.
Lopez et al. Directional deep brain stimulation of the posteromedial hypothalamus for refractory intermittent explosive disorder: a case series using a novel neurostimulation device and intraoperative microdialysis
Gey et al. Continuous bilateral infusion of vigabatrin into the subthalamic nucleus: Effects on seizure threshold and GABA metabolism in two rat models
Liu et al. Determining 5HT7R’s involvement in modifying the antihyperalgesic effects of electroacupuncture on rats with recurrent migraine
Xu et al. Geraniol enhances inhibitory inputs to the paraventricular thalamic nucleus and induces sedation in mice
Aroni et al. Repeated binge ethanol drinking enhances electrical activity of central amygdala corticotropin releasing factor neurons in vivo
Abraham et al. Investigating deep brain stimulation of the habenula: a review of clinical studies
KR102087492B1 (ko) Gaba 및 gaba 작용제를 포함하는 좌골신경통의 치료 및 완화용 조성물 및 치료 방법.
Macia et al. Neuronal activity in the monkey motor thalamus during bicuculline‐induced dystonia
TW544311B (en) Therapeutic or preventive agent for intractable epilepsies
Fu et al. A visual circuit related to the habenula mediates the prevention of cocaine relapse by bright light treatment
Lai et al. Excitatory action of lead on rat sympathetic preganglionic neurons in vitro and in vivo
Zhang et al. Responses of spinohypothalamic tract neurons in the thoracic spinal cord of rats to somatic stimuli and to graded distention of the bile duct
Qin et al. Amplified P2X3 pathway activity in muscle afferent dorsal root ganglion neurons and exercise pressor reflex regulation in hindlimb ischaemia–reperfusion
Wang et al. The effects of centrally administered fluorocitrate via inhibiting glial cells on working memory in rats
Lancon The role of dopaminergic modulation of the anterior cingulate cortex in chronic pain

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
X091 Application refused [patent]
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant