JPH1066577A

JPH1066577A - 核酸プールおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH1066577A
Application number: JP8208423A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Miyoda; 喜昭御代田; Shiro Fukuyama; 志朗福山
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-08-07
Filing date: 1996-08-07
Publication date: 1998-03-10
Also published as: AU3539497A; WO1998005764A1

Abstract

(57)【要約】【解決課題】天然に存在する塩基配列空間とは大きく
異なった空間に存在する塩基配列の効率的な提供。【解決手段】１個または２個以上の遺伝子の全体また
は一部を３個以上のブロックに分割し、これらのブロッ
クの全部または一部を分割前とは異なる配列で連結して
構成される、２種類以上の核酸を含有する核酸プール、
その製造方法、およびその核酸プールに存在する遺伝情
報を発現させることによって得られる遺伝子産物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ドをランダムに連結することによって生成される核酸プ
ールとその製造方法、及びそのプールの中に存在する核
酸を遺伝子として発現させることによって得られる遺伝
子産物に関する。

【０００２】

【従来技術】天然に存在するタンパク質を人間にとって
より有用に改良するタンパク質工学の１つのアプローチ
として、部位特異的変異によるタンパク質の改良があ
り、いくつかの成果が得られている（特開平5-91876 号
公報）。しかし、これには標的タンパク質の立体構造が
判明していることが必要であり、立体構造の解析に多く
の労力が必要である。また、立体構造が判明していても
構造と機能の関係にはまだ不明なことが多く、狙った機
能を確実に付与することは依然として困難である。

【０００３】これらの困難を回避するために、ランダム
変異とスクリーニングからなる方法や、生物の進化を利
用した進化分子工学が脚光を浴びており、非常に有用で
あることが示されている（Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 83, 576 (1986)）。しかしながら、現在行なわれて
いる方法は、多くて数個のアミノ酸置換が専らである。
WO 95/22625 には、複数の遺伝子をランダムに分割し、
相同的組み換えによって遺伝子を再構築し、新規な遺伝
子を作成する方法が記載されている。しかし、この方法
はキメラ遺伝子作成の一方法であり、作成される遺伝子
は当初の遺伝子と類似しており、塩基配列の大枠は維持
されている。

【０００４】このような既存の方法では生物が進化の過
程で獲得できなかった機能の付与を望むことは困難であ
る。自然界に存在するタンパク質等の遺伝子産物と機能
が大きく異なる遺伝子産物を取得するためには、天然に
存在する塩基配列空間とは大きく異なった核酸のプール
を作り、その中から目的の機能を有する遺伝子産物を取
得することが有効と考えられる。

【０００５】そのための一つの方法として、全ての塩基
の組合せからなる核酸プールを作ることが考えられる。
しかし、１００アミノ酸からなる比較的小さなタンパク
質をコードする塩基配列（３００塩基（ｂｐ））の総数
でさえ、４の３００乗（およそ１０の１８０乗）通りと
いう巨大な数となり、そのすべてを含む核酸プールを調
製することは実際上、不可能である。

【０００６】ある種のタンパク質についてモジュールと
呼ばれるサブ構造に着目し、各モジュールに対応する塩
基配列ブロックの順番を入れ換えて、モジュールの順番
を変えた変異体を作り出す試みもなされている（Viva O
rigino vol. 23, No.1 (1995) 86-87)。しかし、この試
みでは、それぞれの変異体について個別に遺伝子配列の
並べ換えが行われており、順番が入れ替わった全ての分
子種を含む核酸プールを作成すること、およびそのプー
ルから所望の性質の産物を発現する遺伝子を取得するこ
とは未だなされていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、天然
に存在する塩基配列空間とは大きく異なった空間に存在
する塩基配列を効率的に得る方法、およびこのようにし
て得られた天然には存在しない核酸配列を遺伝子として
発現させることによって得られる遺伝子産物を提供する
ことにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】遺伝子の配列空間はＡ、
Ｇ、Ｃ、Ｔの塩基を用いて理論的に作り得る全配列から
なる。例えば、ｎ個のアミノ酸からなるタンパク質をコ
ードする塩基配列は、４つの塩基の中から任意の１つを
３ｎ回選択して順次並べることにより構成され、４の３
ｎ乗通り存在する。１００アミノ酸のタンパク質であれ
ば、前述の通り、およそ１０の１８０乗通りの対応する
塩基配列が存在する。実際にはタンパク質を構成するア
ミノ酸の数に制限は存在しないので、配列空間は無限の
広がりを持つことになる。生物は進化の過程では、この
配列空間のごく一部を試験したにすぎず、それ以外の大
きな配列空間に極めて優れた機能を持つタンパク質をコ
ードする配列がある可能性が大きい。現在多くの研究機
関で行われているタンパク質工学的取り組みも天然に存
在するタンパク質より機能において勝るタンパク質を創
造することを目的としており、その主たるアプローチ
は、上述の通りアミノ酸置換である。しかしながら、ア
ミノ酸置換は進化において生物が行なった主要な手法、
つまり、生物の模倣であり、生物が試験した配列のごく
近傍を探索するにすぎない。また、そうして得られた配
列は過去において淘汰された配列である可能性もある。

【０００９】本発明者らは、生物の試験した配列空間の
近傍から大きく離れるには、生物が行ない得なかったこ
とを実践すれば可能であると考えた。そして、遺伝子を
数個のブロックに分け、それらの順番を変えることが、
生物内で起きるには致死的であることから、この目的に
適した方法であると結論し、鋭意研究を重ねた結果、天
然に存在する塩基配列空間とは大きな隔たりを有するこ
とを確認するとともに、それらの配列からなる分子プー
ルを作成することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。すなわち本発明は以下の記載によって特定される核
酸プール、その製造方法、および当該核酸プールに含ま
れる核酸が遺伝子として発現することにより得られる遺
伝子産物を提供する。

【００１０】１）１個または２個以上の遺伝子の全体
または一部を３個以上のブロックに分割し、これらのブ
ロックの全部または一部を分割前とは異なる配列で連結
して構成される、２種類以上の核酸を含有する核酸プー
ル。２）１０種類以上の核酸を含有する前記１に記載の核
酸プール。３）前記ブロックをｎ個（ｎは分割により生成する相
異なるブロックの個数）再配列することにより構成され
る塩基配列の核酸をすべて含有する前記１または２に記
載の核酸プール。４）遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子であり、
各ブロックによりコードされるアミノ酸配列がもとの遺
伝子上で相当部分によりコードされるアミノ酸配列と一
致する前記１乃至３のいずれかに記載の核酸プール。５）遺伝子が酵素機能をコードする遺伝子またはその
制御遺伝子である前記１乃至４のいずれかに記載の核酸
プール。

【００１１】６）遺伝子がプロテアーゼ、リパーゼ、
セルラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、
オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レ
ダクターゼのうちいずれかをコードする遺伝子である前
記５に記載の核酸プール。７）遺伝子が原核生物由来である前記１乃至６のいず
れかに記載の核酸プール。８）遺伝子がバチルス属細菌由来である前記７に記載
の核酸プール。９）遺伝子がプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子である前
記８に記載の核酸プール。１０）各ブロックがオリゴヌクレオチドである前記１
乃至９のいずれかに記載の核酸プール。１１）核酸が１本鎖ポリヌクレオチドである前記１０
に記載の核酸プール。１２）核酸が２本鎖ポリヌクレオチドである前記１０
に記載の核酸プール。

【００１２】１３）１個または２個以上の遺伝子の全
体または一部を３個以上のオリゴヌクレオチド・ブロッ
クに分割するか、該ブロックに相当するオリゴヌクレオ
チドを合成し、これらのブロックの全部または一部を遺
伝子上での配列とは異なる配列で連結して構成すること
による、２種類以上の核酸を含有する核酸プールの製造
方法。１４）下記ａ）〜ｃ）の工程を有する前記１３に記載
の核酸プールの製造方法：ａ）１個または２個以上の遺
伝子の全体または一部に対応する塩基配列を有する１本
鎖オリゴヌクレオチドからなる３個以上のブロックを、
遺伝子の分割または該塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チド鎖の合成により調製する工程；ｂ）工程ａ）で得られた各オリゴヌクレオチド鎖ブロッ
クについて、３’末端がデオキシリボヌクレオチドであ
るブロックの３’末端にはリボヌクレオチドを、５’末
端が水酸基であるブロックの５’末端にはリン酸基を付
加する工程；ｃ）工程ｂ）で得られたオリゴヌクレオチド鎖ブロック
を、１のブロックの３’末端のリボヌクレオチドと他の
ブロックの５’末端のリン酸基とを反応させることによ
り、任意の配列で連結する工程。１５）工程ａ）で調製されるブロックの数が３個以上
である前記１４に記載の核酸プールの製造方法。１６）工程ｂ）で、少なくとも１個のブロックについ
ては５’末端を水酸基のまま残すことにより、該ブロッ
クを５’末端に有する核酸を選択的に得る前記１４また
は１５に記載の核酸プールの製造方法。

【００１３】１７）工程ｂ）で、少なくとも１個のブ
ロックについては３’末端をデオキシリボヌクレオチド
のまま残すことにより、該ブロックを３’末端に有する
核酸を選択的に得る前記１４乃至１６のいずれかに記載
の核酸プールの製造方法。１８）各ブロックによりコードされるアミノ酸配列が
もとの遺伝子上で相当部分によりコードされるアミノ酸
配列と一致するようにブロックの調製が行なわれる前記
１４乃至１７のいずれかに記載の核酸プールの製造方
法。１９）工程ａ）で、遺伝子上の読み枠の開始点から数
えて（３ｐ＋１）番目から（３ｑ＋２）番目（ｐ，ｑは
ブロックごとに独立して決められる整数。但し、ｐ≦ｑ
である。）までの塩基配列を有するブロックを調製し、
工程ｂ）で、同じく（３ｑ＋３）番目の塩基または当該
位置においてコードするアミノ酸を変えない塩基に対応
するリボヌクレオチドを該ブロックの３’末端に付加す
る、前記１８に記載の核酸プールの製造方法。２０）工程ｃ）の連結が、アデノシン三リン酸及び２
価の金属イオンの存在下、ＲＮＡリガーゼを用いて行な
われる前記１４乃至１９のいずれかに記載の核酸プール
の製造方法。２１）前記１４乃至２０により得られる１本鎖核酸を
ポリメラーゼ反応により２本鎖化してなる２本鎖核酸プ
ールの製造方法。２２）前記１乃至１２記載の核酸プールに存在する遺
伝情報を発現させることによって得られる遺伝子産物。以下、本発明をより詳細に説明する。

【００１４】［核酸プール］本発明において「核酸プー
ル」とは、２種類以上の核酸を高密度で含む混合物を意
味する。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含有する１本鎖
または２本鎖のポリヌクレオチドである。本発明の核酸
プールは、特定の数以上、例えば１０種類以上の相異な
る構造を有する核酸分子を含有するものとすることがで
きる。生化学的な操作ないし反応に混合物のまま使用し
たときに複数の核酸成分について反応が進行し得る状態
にあることが望ましいが、溶液状態、乾燥状態等の状態
は問わない。本発明の核酸プールは、１個または２個以
上の遺伝子の全体または一部を３個以上のブロックに分
割し、これらのブロックの全部または一部を分割前とは
異なる配列で連結して構成される、分割前の塩基配列と
は異なる塩基配列を有する核酸を複数含有することを特
徴とする。ここで、「分割前とは異なる配列で連結す
る」とは、(i) ブロックを分割前とは異なる順番に並べ
換えること、(ii)同一のブロックを連続的にまたは非連
続的に重複して連結すること、(iii) 少なくとも一つの
ブロックを除いて再連結すること、および(iv)これら
(i) 〜(iii) の組み合わせを含む。なお、本発明におけ
る、遺伝子を分割しこれを任意に配列し直す操作を、以
下、シャフリング(shuffling) という。

【００１５】例えば、１個の遺伝子が式 (1)：

【化１】Ａ−ａ₁−ａ₂−……−ａ_n−Ｂ (1) （始端部Ａおよび／または終端部Ｂはなくてもよい。）
のようにｎ個のブロックの連結部分を含む配列で表され
る場合に、本発明のシャフリングは式 (2)：

【化２】Ａ−ａ_1'−ａ_2'−……−ａ_x−Ｂ (2) （式中、ａ_1'，ａ_2'，……，ａ_xは、ａ₁，ａ₂，…
…，ａ_nからなる群よりそれぞれ独立に選ばれるブロッ
クである。但し、ａ_1'，ａ_2'，……，ａ_xのブロックの
総数はａ₁，ａ₂，……，ａ_nのブロックの総数に一致
しなくてもよい。）で表される核酸の混合物を与える。

【００１６】シャフリングが実効をもたらすためには、
１個または２個以上の遺伝子を３個以上に分割する必要
がある。２個のブロックへの分割では、並べ換え体は１
つしか生じないため多様な核酸が得られず、核酸プール
としての有効性が乏しいからである。５個以上のブロッ
クへの分割が好ましい。シャフリングの単位となるブロ
ック（上記式 (1)におけるａ₁，ａ₂，……，ａ_n等）
は、２個以上のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチド（以下、単に「オリゴヌクレ
オチド」という。）である。ブロック長が短すぎると操
作が繁雑になるため、通常は、２１個以上のヌクレオチ
ド単位を含有することが好ましく、４５個以上のヌクレ
オチド単位を含有することがより好ましい。ブロック長
の上限は１遺伝子の長さより短ければ特に限定されない
が、ブロック長が長すぎると変異のない塩基配列部分が
多く含まれることになるため、通常は遺伝子の長さの５
〜３０％以下が好ましい。

【００１７】ブロックへの分割は遺伝子上の任意の部位
で行なうことができる。すなわち、エクソンごとあるい
はコードするタンパク質のドメインまたはモジュールに
対応するセグメントごとへの分割を排除するものではな
いが、このような部位でのシャフリングは過去において
自然界で試験された可能性がある。従来、自然界で試験
されていない塩基配列を得るためには、エクソン内部、
あるいはコードするタンパク質のドメインまたはモジュ
ール内に相当する部位での分割が好ましい。

【００１８】また、シャフリング、特にその連結に際
し、もとの遺伝子に含まれないオリゴヌクレチドブロッ
クの導入、あるいはヌクレオチドの挿入や欠失も許容さ
れる。もっとも、シャフリングされる遺伝子がタンパク
質をコードする遺伝子である場合、遺伝子ブロックであ
るオリゴヌクレオチドは、分割前後で読み枠が合うこと
が望ましい。つまり、シャフルされる遺伝子ブロック
は、シャフリング後、相対的にどの位置に来てもそのブ
ロック部分が翻訳されて生ずるアミノ酸配列は同じであ
るように設計することが望ましい。このような手法を採
ることにより、全体としては天然のタンパク質とは構造
が異なるが、部分的には自然界において有用であること
が確認されているアミノ酸配列を含むタンパク質を得る
ことができ、完全にランダムに合成するよりも有用なタ
ンパク質を得る確率が高くなる。

【００１９】シャフリングにおける再配列は、上述の通
り、ａ₁，ａ₂，……，ａ_nの各ブロックを重複および
省略を許して任意個連結する操作であるが、連結により
得られる核酸プールは、少なくとも分割により生成した
ブロックの数と同一程度の個数のブロックから構成され
る核酸をすべて含むことが好ましい。例えば、５個のブ
ロック、ａ₁，ａ₂，ａ₃，ａ₄およびａ₅に分割した
場合には、５個のブロックからなる組み合わせを実質的
にすべて含むことが好ましい。すなわち、ａ₁−ａ₃−
ａ₂−ａ₄−ａ₅（ａ₂とａ₃が互換されている。）、
ａ₁−ａ₄−ａ₂−ａ₃−ａ₅（ａ₂とａ₃とａ₄が並
べ換えられている。）のような単純な並べ換え体のすべ
て、より好ましくは、このような並べ換え体に加え、ａ
₁−ａ₃−ａ₂−ａ₁−ａ₅のような重複を有する再配
列体を含有することが好ましい。ブロック数ｎに対し、
前者はｎ！個、後者はｎⁿ個存在する。５！（５×４×
３×２×１）でも１２０通り、５⁵ではその総数は3125
通りに及ぶ。このように、本発明にしたがって遺伝子を
シャフリングにすることにより生成した核酸プールは、
もとの遺伝子と異なる塩基配列の核酸分子を極めて多数
含有し得る。

【００２０】シャフリングの対象とする遺伝子の種類は
特に限定されない。ポリヌクレオチド鎖から構成され、
タンパク質またはＲＮＡを発現するのに必要なコード領
域であればよい。ヌクレオチド単位はデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチドのいずれの分子を含む
ものでもよい。有用な塩基配列を見出すという目的から
は、タンパク質、特に酵素をコードする遺伝子または酵
素機能の制御遺伝子が好ましい。このような酵素の例と
しては、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラ
ーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、デヒ
ドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ等が挙げ
られる。

【００２１】遺伝子は生命体からクローニングしたも
の、人工合成したもの、また、生命体からクローニング
し、それに人工的に変異を加えたもの等、それを適当な
宿主に導入すれば当該遺伝子の発現により遺伝子産物を
生産するものであれば種類を問わない。生命体由来とす
る場合には、酵素産生能力の明確な原核生物を用いるこ
とができる。このような原核生物の例としては、バチル
ス属細菌が挙げられ、かかる細菌に由来の遺伝子の例と
しては、バチルスＮＫＳ−２１（受託番号：ＦＥＲＭ
ＢＰ−９３−１）に由来するプロテアーゼAPI 21遺伝子
（特開平 5ー91876号公報）（配列番号１）が挙げられ
る。

【００２２】［核酸プールの製造方法］本発明はまた、
１個または２個以上の遺伝子の全体または一部を３個以
上のブロックに分割し、これらのブロックの全部または
一部を分割前とは異なる配列で連結して構成される、分
割前の塩基配列とは異なる塩基配列を有する核酸を２種
類以上含有することを特徴とする核酸プールの製造方法
を提供する。ブロックへの分割は、核酸プールに対し必
要とされる上述の条件を満たすものであれば任意の方法
により行なうことができる。例えば、遺伝子の分割は制
限酵素を用いて行なうことができる。任意の制限酵素が
使用できるが、例えば、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ III、Ｂ
ａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＫｐｎＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、
ＳａｃＩ、ＣｌａＩ、ＡｌｕＩ、ＨａｅIII 、ＲｓａＩ
等を用いることができる。塩基配列が既知の遺伝子につ
いてシャフリングを行なう場合は、上述の条件にしたが
って各ブロックを合成により得てもよい。再配列はこれ
らのブロックの混合により、連結はリガーゼを用いて行
なうことができる。

【００２３】以下、１本鎖核酸プール、２本鎖核酸プー
ルのそれぞれについて好適な製造方法を詳述する。（１）１本鎖核酸プールの製造方法本発明による核酸プールの好ましい製造方法は、ブロッ
クの３’末端をリボヌクレオチドとし、ＲＮＡリガーゼ
を用いて各ブロックを連結する方法である。この方法
は、以下のａ）〜ｃ）の工程を有する。ａ）１個または２個以上の遺伝子の全体または一部に対
応する塩基配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドから
なる３個以上のブロックを、遺伝子の分割または該塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド鎖の合成により調製す
る工程；ｂ）工程ａ）で得られた各オリゴヌクレオチド鎖ブロッ
クについて、３’末端がリボヌクレオチドを有しないブ
ロックの３’末端にはリボヌクレオチドを、５’末端が
リン酸基を有しないブロックの５’末端にはリン酸基を
付加する工程；ｃ）工程ｂ）で得られたオリゴヌクレオチド鎖ブロック
を、１のブロックの３’末端のリボヌクレオチドと他の
ブロックの５’末端のリン酸基とを反応させることによ
り、任意の配列で連結する工程。

【００２４】図１に、１個の遺伝子のシャフリングにつ
いて上記の各工程を模式的に示す。この例では４つのブ
ロック（ａ₁，ａ₂，ａ₃，ａ₄）への分割例を示して
いる。なお、説明の便宜上、遺伝子および核酸のいずれ
についても、図中では塩基配列のみで表わしている。、
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ等はそれぞれの塩基を含むヌクレオチド
単位である。ｒＧはＧＭＰを、（Ｐ）および（ＯＨ）は
ヌクレオチド鎖の末端に現われているリン酸基および水
酸基をそれぞれ表わす。

【００２５】工程ａ工程ａ）における分割は制限酵素を用いて行なうことが
できる。分割後、熱またはアルカリ等により変性して１
本鎖のオリゴヌクレオチドとする。遺伝子配列が既知の
場合は、慣用の装置および手法を用いて１本鎖のオリゴ
ヌクレオチドブロックを合成する。

【００２６】工程ｂ工程ａ）で得られたブロックの３’末端がデオキシリボ
ヌクレオチドである場合には、その３’末端にリボヌク
レオチドを付加する（工程ｂ）。これは、ヌクレオシド
三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）の存在下
に、前記各ブロックにターミナルデオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを作用させることにより行なうこ
とができる。付加されるリボヌクレオチド（ＡＭＰ、Ｇ
ＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ）は、用いるヌクレオシド三リン
酸に対応する塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）を含む。よって、
ヌクレオシド三リン酸を選択することにより３’末端を
所望のリボヌクレオチドとすることができる。図１で
は、ブロック混合物にＧＭＰ（図中、下線を付したｒＧ
で表わす。）を付加する例を示してあるが、各ブロック
を個別に合成するなど、それぞれのブロックが個別に得
られる場合は、それぞれについて異なるリボヌクレオチ
ドを付加することができる。ヌクレオシド三リン酸は各
ブロックに対しモル比で２〜１０倍程度を用いる。反応
温度は３０〜４０℃程度であり反応時間は３０分〜２時
間程度である。

【００２７】工程ｂ）ではまた、ブロックの５’末端に
リン酸基を付加する。これはＡＴＰの存在下にポリヌク
レオチドキナーゼを作用させて行なうことができる。Ａ
ＴＰは各ブロックに対しモル比で２〜１０倍程度を用い
る。反応温度は３０〜４０℃程度であり、反応時間は１
０分〜１時間程度である。ｐＨ７〜９程度が最適であ
る。

【００２８】工程ｃ工程ｃ）におけるオリゴヌクレオチド鎖ブロックの連結
は、このようにして得られたブロックの混合物に、ＡＴ
Ｐと２価金属イオンの存在下にＲＮＡリガーゼを作用さ
せて行なうことができる（特開平5-292967号公報）。有
用な２価の金属イオンはマグネシウムイオン、マンガン
イオン等で好ましくはマグネシウムイオンである。リガ
ーゼとしてはＲＮＡリガーゼを用いることができる。Ｒ
ＮＡリガーゼは５’リン酸基末端のポリヌクレオチドと
３’水酸基末端のポリヌクレオチドを連結させる酵素で
ある。ＲＮＡリガーゼの基質は本来はＲＮＡであるが、
５’リン酸基末端のポリデオキシリボヌクレオチドと
３’端のみがリボヌクレオチドであるポリデオキシリボ
ヌクレオチドも効率的に連結する。好ましくはＴ４ＲＮ
Ａリガーゼを用いる。反応は、通常、緩衝液中、ｐＨ７
〜９、１０〜４０℃の温度で３０〜１８０分間かけて行
なわれる。例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
8.0）、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、0.1 ｍＭＡＴＰ、１
０ｍｇ／ｌＢＳＡ、１ｍＭヘキサアンミンコバルト
クロライド（ＨＣＣ）、２５％ポリエチレングリコール
６０００溶液中、２５℃で６０分以上反応させる。

【００２９】読み枠の調整工程ａ）で調製されるブロックがコドン単位の整数倍で
ない場合、あるいは工程ｂ）でヌクレオチドの挿入や欠
失が生じる場合は、シャフリング後の位置により各ブロ
ックのコードするアミノ酸配列は異なるものとなる。し
かし、上述のように、シャフリングが個々のブロックの
コードするアミノ酸配列を変化させない方が望ましい場
合もある。この目的のためには図２に模式的に示す変法
が有効である。

【００３０】この方法では、最初の工程（工程ａ′）に
おいて、遺伝子上の読み枠の開始点から数えて（３ｐ＋
１）番目から（３ｑ＋２）番目（ｐ，ｑはブロックごと
に独立して決められる整数。但し、ｐ≦ｑである。）ま
での塩基配列を有するブロックを調製し、工程ｂ）で、
同じく（３ｑ＋３）番目の塩基に対応するリボヌクレオ
チドまたは当該位置においてコードするアミノ酸を変え
ない塩基に対応するリボヌクレオチドを該ブロックの
３’末端に付加する。図２の例では、はじめに、工程
ａ′で、シャフリングする遺伝子からブロックａ₁（ｐ
＝０，ｑ＝２）、ａ₂（ｐ＝３，ｑ＝５）、ａ₃（ｐ＝
６，ｑ＝９）およびａ₄が合成されている（分割して単
離してもよい。）。ａ₄には次項に述べる理由で３’末
端へのリボヌクレオチド付加をしていない。

【００３１】次に、工程ｂ′で、ａ₁とａ₂にはＧＭＰ
（図中、下線を付したｒＧで表わす。）を、ａ₃にはＡ
ＭＰ（下線を付したｒＡで表わす。）を付加する。リボ
ヌクレオチドの付加は、前記の工程ｂ）と同様であり、
ヌクレオシド三リン酸とターミナルデオキシヌクレオチ
ジルトランスフェラーゼ（ＴＤＴ）による。あるいは、
合成時に末端のみリボヌクレオチドとする方法を採って
もよい。この結果、これらのブロックによりコードされ
るアミノ酸配列は、遺伝子上でのそれと同一のものとな
る。しかる後、前記工程ｂ′）と同様にポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ＰＮＫ）を用いてリン酸化を行ない（工程
ｂの後半）、その後、工程ｃ）と同様に再配列・連結す
る（工程ｃ′）。

【００３２】末端配列の特定化図２に示すように、一部のブロック（この例ではａ₄）
については３’端のリボヌクレオチド処理を行なわない
ことも可能である。このようにした上でＲＮＡリガーゼ
を作用させると、当該ブロックの３’端には他のブロッ
クが連結されないため、核酸プール中の核酸の３’末端
は実質的にすべてこのブロックにより占められることに
なる。同様に、特定のブロックについてリン酸化を行な
わないことにより、核酸プール中の核酸の５’末端を実
質的にすべて特定のブロックで占めることができる。

【００３３】かかる方法を採ることにより、特定のブロ
ックを所定の末端位置に配置し、なおかつ、中間部にお
いてはランダムな再配列がなされた核酸からなる核酸プ
ールを調製することが容易に可能となる。このような方
法は、特定のアミノ酸配置を末端に有するタンパク質変
異体の製造や特定の制御機能の発現を図る上で特に有利
である。

【００３４】（２）２本鎖核酸プールの製造方法前節の方法により得られた分子は一本鎖であるが、以後
の遺伝子操作を行なうに当たり２本鎖にすることが可能
である。このためにはまず、ブロック混合物中に、５’
リン酸基を持ち、３’リボヌクレオチド基を有しないオ
リゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＡとする。図２
のａ₄がこれにあたる。）を存在させる。この結果、前
節の最後で述べたように、核酸プールを構成する核酸分
子は実質的に全てが３’末端部分がオリゴヌクレオチド
Ａの配列となる。次いで、オリゴヌクレオチドＡと相補
的な配列を含むデカマー（１０マー）以上好ましくはヘ
プタデカマー（１７マー）以上のオリゴヌクレオチドを
プライマーとし、常法に従いＤＮＡ伸長反応を行う。用
いる酵素はＴａｑポリメラーゼ、クレノー断片（Klenow
Fragment)、ＤＮＡポリメラーゼＩ等ＤＮＡ伸長反応を
触媒する酵素ならば種類を問わない。

【００３５】この目的のためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）を利用しても良い。ＰＣＲを利用する場合に
は、プール作成時に、前記のオリゴヌクレオチドＡに加
えて、５’リン酸基を持たず、３’リボヌクレオチド基
を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドＢと
する。）をブロック混合物中に存在させる。こうするこ
とにより、プールを構成する実質的に全ての分子の３’
端はオリゴヌクレオチドＡとなり、５’端はオリゴヌク
レオチドＢとなる。しかる後、ポリヌクレオチドＡと相
補的な配列を含む１０マ−以上、好ましくは１７マー以
上のポリヌクレオチドとポリヌクレオチドＢと同じ配列
を含む１０マー以上好ましくは１７マー以上のポリヌク
レオチドをプライマーとしてＰＣＲを行えば、二本鎖化
と同時に遺伝子の増幅もでき、後の操作に便利である。
なお、オリゴヌクレオチドＡおよび／またはＢは、もと
の遺伝子上のブロックを利用してもよいし、必要なら
ば、当該遺伝子にはないブロックを用いてもよい。

【００３６】［核酸プール中の遺伝情報の発現］このよ
うにして二本鎖化した核酸を、平滑化後、ＤＮＡリガー
ゼを用い、任意のベクター、好ましくはｐＫＫ２２３−
３の如き発現ベクターに連結する。また、両端に位置す
るポリヌクレオチドＡ、Ｂに適当な制限酵素認識部位を
作ることにより、その制限酵素を利用してベクターに連
結することも可能である。次に、上記の如く作成したベ
クターライブラリーを適当な宿主に導入し、その遺伝情
報を発現させることによって、好ましい性質を持つ遺伝
子産物、およびそれをコードする遺伝子を取得すること
が出来る。宿主は慣用のものでよい。好ましい例として
は、大腸菌E.coli、バチルス属細菌、酵母、乳酸菌等が
挙げられる。

【００３７】但し、試験管内転写系、翻訳系を使用する
ことも可能であり、その場合は、ベクターに連結しなく
ても遺伝情報の発現が可能である。なお、「遺伝情報」
とはＤＮＡまたはＲＮＡによって担われ、それ単独で、
または他の配列からなるＤＮＡまたはＲＮＡと連結する
ことによって、適当な生体内でタンパク質に翻訳され
る、あるいはＲＮＡに転写されるものを言う。本発明の
方法により発現が期待される遺伝情報は特に限定されな
いが、各種の遺伝子産物、例えば、酵素、抗体、ホルモ
ン、レセプタータンパク質、リボザイム等あるいは、各
種の制御機能、例えば、オペレーター、プロモーター、
アテニュエーター等がその例として挙げられる。

【００３８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に説
明するが、これらは本発明を限定するものではない。実施例１：１本鎖核酸プールの製造配列番号１に示すプロテアーゼ API21（バチルスＮＫＳ
ー２１（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−９３−１）からク
ローニングされた野生型アルカリプロテアーゼ（特開平
5-91876 号公報))に基づく核酸プールを以下の手順によ
り製造した。 (1) 工程ａ：オリゴヌクレオチドブロックの調製パーキンエルマー社のＤＮＡ自動合成機モデル３９２を
用い、５種のオリゴヌクレオチド：オリゴＡ（配列番号２。配列表１の４３６〜４５５
番目の塩基配列に相当する。）、オリゴ１（配列番号３。配列表１の４５７〜５０３
番目）、オリゴ２（配列番号４。配列表１の５０５〜５５１
番目）、オリゴ３（配列番号５。配列表１の５５３〜５９６
番目）、およびオリゴＢ（配列番号６。配列表１の５９８〜６１８
番目）を合成した。オリゴＡ、オリゴ１〜３およびオリ
ゴＢは、プロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子の一部である。
その位置関係は上に示す通りである。各オリゴヌクレオ
チドの合成は、ＤＭトリチルオンで行ない（すなわち、
ジメトキシトリチル基で５’水酸基を保護し）、ＯＰＣ
カラムで精製した。試薬はパーキンエルマー社から購入
したものを用いた。

【００３９】(2) 工程ｂ：オリゴヌクレオチドブロック
の処理 (2-1) リボヌクレオチドの付加下記の組成：５０ｍＭトリスーＨＣｌ緩衝液（ｐＨ 8.0）１０ｍＭＭｇＣｌ₂ ５ｍＭＤＴＴ（ジチオスレイトール）２５％ＰＥＧ6000 １ｍＭＨＣＣ（ヘキサアンミンコバルトクロライド）１０μｇ／ｍｌＢＳＡ（牛血清アルブミン）を有する標準溶液に、オリゴＡを５００ｐｍｏｌ、ＵＴ
Ｐを１ｎｍｏｌ及びターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフェラーゼを１０ユニット添加し全量を１０μ
ｌとした。これを３７℃で１時間放置した。同様の操作
をオリゴ１、オリゴ２についても行った。また、オリゴ
３については、ＵＴＰの代わりにＡＴＰを用いて同じ操
作を行った。この操作により３’末端にリボヌクレオチ
ドを付加したオリゴヌクレオチドブロックをそれぞれオ
リゴＡｒ、オリゴ１ｒ、オリゴ２ｒ、オリゴ３ｒと呼
ぶ。

【００４０】(2-2) リン酸化オリゴ１ｒを５００ｐｍｏｌ、ＡＴＰを１ｎｍｏｌ及
び、１０ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを前記と
同じ組成の標準溶液に溶解して全量を１０μｌにした。
この溶液を３７℃で１時間放置した。同様の操作をオリ
ゴ２ｒ、オリゴ３ｒ、オリゴＢについても行なった。こ
の操作で生成したポリヌクレオチドを、それぞれオリゴ
１ｐｒ、オリゴ２ｐｒ、オリゴ３ｐｒ、オリゴＢｐと呼
ぶ。

【００４１】(3) 工程ｃ：オリゴヌクレオチドブロック
の連結前記で得られた、オリゴＡｒ、オリゴ１ｐｒ、オリゴ２
ｐｒ、オリゴ３ｐｒおよびオリゴＢｐを各５００pmol、
ＡＴＰを１nmol及び、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ５０ユニット
を前記標準溶液に添加し全量を１０μｌとして、２５℃
で４時間反応させた。続いて反応産物のポリアクリルア
ミド電気泳動を行ない、鎖長が１８０塩基近傍をゲルか
ら回収した。これによってオリゴＡｒとオリゴＢｐの間
でオリゴ１ｐｒ、オリゴ２ｐｒ、オリゴ３ｐｒがランダ
ムな順番に連結した一本鎖核酸プールが得られた。

【００４２】実施例２：２本鎖核酸プールの製造オリゴＢの相補鎖であるオリゴＢ′（配列番号７にその
配列を示す。）を実施例１と同様にして合成した。実施
例１で得られた一本鎖核酸プールを構成するＤＮＡをま
とめて、すなわち、個別のＤＮＡに分離することなくオ
リゴＢ′１０pmolと混合し、ＭｇＣｌ₂およびＤＴＴ
（ジチオスレイトール）を含むトリス−ＨＣｌ緩衝液に
添加し全量２０μｌとなるように調整した。調整後の最
終濃度は以下の通り：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ7.5)、７ｍＭＭｇＣｌ₂、0.1 ｍＭＤＴＴ。
７５℃５分加熱後、３０℃まで徐冷した。続いて、クレ
ノー断片(Klenow Fragment) １ユニットを加え、３７℃
で２時間維持し、二本鎖化を行なった。これによってオ
リゴＡｒとオリゴＢｐの間でオリゴ１ｐｒ、オリゴ２ｐ
ｒ、オリゴ３ｐｒがランダムな順番に連結した二本鎖核
酸プールが得られた。

【００４３】実施例３：核酸プールによる大腸菌の形質
転換プラスミドｐＨＳＧ３９６のＣｌａＩ切断部位にバチ
ルスＮＫＳー２１からクローニングされた野生型アルカ
リプロテアーゼの遺伝子が挿入されているプラスミドｐ
ＳＤＴ８１２（特開平1-141596号公報）を制限酵素Ｃｌ
ａＩで消化し、市販の平滑化試薬（宝酒造株式会社製Bl
unting Kit）を用いて末端を平滑化した。これを、制限
酵素ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ IIIで消化し上記と同様に末
端を平滑化し、アルカリフォスファターゼ処理をしたヤ
クルト本社製のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫと混合
し、市販のライゲーションキット（宝酒造株式会社製）
を用いて連結した。このＤＮＡを用い、大腸菌ＪＭ１０
５を形質転換し、テトラサイクリン耐性の形質転換体を
選択した。これらの形質転換体から常法によりプラスミ
ドＤＮＡを抽出、精製、分析を行い、ｐＨＹ３００ＰＬ
Ｋと野生型アルカリプロテアーゼが連結したプラスミド
ｐＨＹ８１２（図３）を得た。次に上記で作成したｐＨ
Ｙ８１２を制限酵素Ｈｉｎｄ III及びＳｐｈＩで消化
し、続いて、ＢＡＰ処理した（ａ）。また、実施例３で
作成した二本鎖核酸プールを構成するＤＮＡをまとめて
制限酵素Ｈｉｎｄ III及びＳｐｈＩで消化した（ｂ）。
ａとｂを上記と同様にライゲーションキットを用いて連
結し、これを用いて、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換し
た。形質転換体はアンピシリンを含むＬプレートで選別
した。

【００４４】実施例４実施例３で選別したコロニーからプラスミドＤＮＡを調
製し、Ｈｉｎｄ III、ＳｐｈＩでの消化によって１６０
塩基対程度の断片を生ずるか否かを確認した。目的の長
さの断片を生ずる９５クローンの塩基配列を解析し、オ
リゴ１、２、３に相当する遺伝子部分のシャフリングを
確認した。表１に各シャフルの種類とそれぞれのクロー
ン数を記した。

【００４５】

【表１】シャフルの種類数シャフルの種類数１１１３２２３３１１２４２３１６１１３２２３２２１２１５２３３３１２２３３１１３１２３６３１２５１３１２３１３３１３２７３２１７１３３３３２２３２１１２３２３４２１２３３３１２２１３５３３２５２２１２３３３１２２２１

【００４６】このように、本発明の方法によって遺伝子
中の３つのブロックをシャフリングした場合、これらの
ブロックを重複を許して３個選択してなる全ての組合せ
のクローンが得られることが確認された。

【００４７】実施例５実施例４で調製したプラスミドＤＮＡを混合しこれを用
いて、枯草菌（Bacill us subtilis ）UOTO999 を形質転
換した。テトラサイクリン耐性で形質転換体を選択し
た。形質転換体３００種をスキムミルク含有プレートに
レプリカしたところ、１５形質転換体のコロニーの周り
にクリアゾーンを確認できた。これによって、シャフリ
ングされた遺伝子によってコードされた酵素を活性によ
って選別出来ることが分かる。これらクリアゾーンを形
成する１５形質転換体からプラスミドＤＮＡを調製し、
塩基配列を解析した結果、これらは野生型と同じブロッ
ク順になっていることがわかった。

【００４８】実施例６実施例５で得られた１０形質転換体（うち１つはクリア
ゾーン形成、９つは非形成）及び、プラスミドを持たな
い枯草菌（Bacillus subtilis ）UOTO999 からそれぞれ
全ＲＮＡを調製した。また以後のハイブリダイゼーショ
ンでプラスミドの影響を除くためにリボヌクレアーゼフ
リーのデオキシリボヌクレアーゼ処理をした。続いて、
プローブにオリゴＢ′を用い、常法に従ってノザーンハ
イブリダイゼーションを行った。その結果、形質転換体
のＲＮＡに対応するレーンには、すべてバンドが検出で
きたが、宿主のＲＮＡに対応するレーンにはバンドが検
出できなかった。

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、天然の塩基配列空間と
は大きく離れた多様な塩基配列を含む核酸プールを簡単
な手順で得ることができるため、従来の方法では得られ
ない、また、過去、生物により試験されたことのない優
れた遺伝子産物、例えば、タンパク質や酵素を得ること
が可能である。また、本発明の核酸プール製造方法で
は、必要に応じ、中間部ではランダムなシャフリングを
実行しながら末端配置は所望の配列に固定した核酸の混
合物を得ることが可能であり、また、各ブロックにより
コードされるアミノ酸配列は変更せずにそのシャフリン
グを行なうことが可能であるため、完全にランダムな核
酸プール製造方法と比較して、有用な遺伝子産物を生成
する確率が高い。

【００５０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１１２２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源：バチルスNKS-21（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−９
３−１）配列の特徴特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..93 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：104..1112 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATG AAT CTT CAA AAA ATA GCC TCA GCG TTG AAG GTT AAG CAA TCG GCA 48 Met Asn Leu Gln Lys Ile Ala Ser Ala Leu Lys Val Lys Gln Ser Ala -100 -95 -90 TTG GTC AGC AGT TTA ACT ATT TTG TTT CTA ATC ATG CTA GTA GGT ACG 96 Leu Val Ser Ser Leu Thr Ile Leu Phe Leu Ile Met Leu Val Gly Thr -85 -80 -75 ACT AGT GCA AAT GGT GCG AAG CAA GAG TAC TTA ATT GGT TTC AAC TCA 144 Thr Ser Ala Asn Gly Ala Lys Gln Glu Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Ser -70 -65 -60 -55 GAC AAG GCA AAA GGA CTT ATC CAA AAT GCA GGT GGA GAA ATT CAT CAT 192 Asp Lys Ala Lys Gly Leu Ile Gln Asn Ala Gly Gly Glu Ile His His -50 -45 -40 GAA TAT ACA GAG TTT CCA GTT ATC TAT GCA GAG CTT CCA GAA GCA GCG 240 Glu Tyr Thr Glu Phe Pro Val Ile Tyr Ala Glu Leu Pro Glu Ala Ala -35 -30 -25 GTA AGT GGA TTG AAA AAT AAT CCT CAT ATT GAT TTT ATT GAG GAA AAC 288 Val Ser Gly Leu Lys Asn Asn Pro His Ile Asp Phe Ile Glu Glu Asn -20 -15 -10 GAA GAA GTT GAA ATT GCA CAG ACT GTT CCT TGG GGA ATC CCT TAT ATT 336 Glu Glu Val Glu Ile Ala Gln Thr Val Pro Trp Gly Ile Pro Tyr Ile -5 1 5 10 TAC TCG GAT GTT GTT CAT CGT CAA GGT TAC TTT GGG AAC GGA GTA AAA 384 Tyr Ser Asp Val Val His Arg Gln Gly Tyr Phe Gly Asn Gly Val Lys 15 20 25 GTA GCA GTA CTT GAT ACA GGA GTG GCT CCT CAT CCT GAT TTA CAT ATT 432 Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Val Ala Pro His Pro Asp Leu His Ile 30 35 40 AGA GGA GGA GTA AGC TTT ATC TCT ACA GAA AAC ACT TAT GTG GAT TAT 480 Arg Gly Gly Val Ser Phe Ile Ser Thr Glu Asn Thr Tyr Val Asp Tyr 45 50 55 AAT GGT CAC GGT ACT CAC GTA GCT GGT ACT GTA GCT GCC CTA AAC AAT 528 Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn 60 65 70 TCA TAT GGC GTA TTG GGA GTG GCT CCT GGA GCT GAA CTA TAT GCT GTT 576 Ser Tyr Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Gly Ala Glu Leu Tyr Ala Val 75 80 85 90 AAA GTT CTT GAT CGT AAC GGA AGC GGT TCG CAT GCA TCC ATT GCT CAA 624 Lys Val Leu Asp Arg Asn Gly Ser Gly Ser His Ala Ser Ile Ala Gln 95 100 105 GGA ATT GAA TGG GCG ATG AAT AAT GGG ATG GAT ATT GCC AAC ATG AGT 672 Gly Ile Glu Trp Ala Met Asn Asn Gly Met Asp Ile Ala Asn Met Ser 110 115 120 TTA GGA AGT CCT TCT GGG TCT ACA ACC CTG CAA TTA GCA GCA GAC CGC 720 Leu Gly Ser Pro Ser Gly Ser Thr Thr Leu Gln Leu Ala Ala Asp Arg 125 130 135 GCT AGG AAT GCA GGT GTC TTA TTA ATT GGG GCG GCT GGA AAC TCA GGA 768 Ala Arg Asn Ala Gly Val Leu Leu Ile Gly Ala Ala Gly Asn Ser Gly 140 145 150 CAA CAA GGC GGC TCG AAT AAC ATG GGC TAC CCA GCG CGC TAT GCA TCT 816 Gln Gln Gly Gly Ser Asn Asn Met Gly Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Ser 155 160 165 170 GTC ATG GCT GTT GGA GCG GTG GAC CAA AAT GGA AAT AGA GCG AAC TTT 864 Val Met Ala Val Gly Ala Val Asp Gln Asn Gly Asn Arg Ala Asn Phe 175 180 185 TCA AGC TAT GGA TCA GAA CTT GAG ATT ATG GCG CCT GGT GTC AAT ATT 912 Ser Ser Tyr Gly Ser Glu Leu Glu Ile Met Ala Pro Gly Val Asn Ile 190 195 200 AAC AGT ACG TAT TTA AAT AAC GGA TAT CGC AGT TTA AAT GGT ACG TCA 960 Asn Ser Thr Tyr Leu Asn Asn Gly Tyr Arg Ser Leu Asn Gly Thr Ser 205 210 215 ATG GCA TCT CCA CAT GTT GCT GGG GTA GCT GCA TTA GTT AAA CAA AAA 1008 Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Val Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys 220 225 230 CAC CCT CAC TTA ACG GCG GCA CAA ATT CGT AAT CGT ATG AAT CAA ACA 1056 His Pro His Leu Thr Ala Ala Gln Ile Arg Asn Arg Met Asn Gln Thr 235 240 245 250 GCA ATT CCG CTT GGT AAC AGC ACG TAT TAT GGA AAT GGC TTA GTG GAT 1104 Ala Ile Pro Leu Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Gly Leu Val Asp 255 260 265 GCT GAG TAT GCG GCT CAA 1122 Ala Glu Tyr Ala Ala Gln 270 272

【００５１】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGAGGAGTAA GCTTTATCTC

【００５２】配列番号：３配列の長さ：４７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ACAGAAAACA CTTATGTGGA TTATAATGGT CACGGTACTC ACGTAGC

【００５３】配列番号：４配列の長さ：４７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGTACTGTA GCTGCCCTAA ACAATTCATA TGGCGTATTG GGAGTGGC

【００５４】配列番号：５配列の長さ：４４配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCTGGAGCTG AACTATATGC TGTTAAAGTT CTTGATCGTA ACGG

【００５５】配列番号：６配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGCGGTTCGC ATGCATCCAT T

【００５６】配列番号：７配列の長さ：２１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の長さ：配列 AATGGATGCA TGCGAACCGCT

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の核酸プール製造方法の一態様を説明
する模式図。

【図２】本発明の核酸プール製造方法の他の態様を説
明する模式図。

【図３】バチルスＮＫＳ−２１に由来するアルカリプ
ロテアーゼ遺伝子とプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫが連
結してなるプラスミドｐＨＹ８１２の制限酵素切断点地
図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１個または２個以上の遺伝子の全体また
は一部を３個以上のブロックに分割し、これらのブロッ
クの全部または一部を分割前とは異なる配列で連結して
構成される、２種類以上の核酸を含有する核酸プール。
【請求項２】１０種類以上の核酸を含有する請求項１
に記載の核酸プール。
【請求項３】前記ブロックをｎ個（ｎは分割により生
成する相異なるブロックの個数）再配列することにより
構成される塩基配列の核酸をすべて含有する請求項１ま
たは２に記載の核酸プール。
【請求項４】遺伝子がタンパク質をコードする遺伝子
であり、各ブロックによりコードされるアミノ酸配列が
もとの遺伝子上で相当部分によりコードされるアミノ酸
配列と一致する請求項１乃至３のいずれかに記載の核酸
プール。
【請求項５】遺伝子が酵素機能をコードする遺伝子ま
たはその制御遺伝子である請求項１乃至４のいずれかに
記載の核酸プール。
【請求項６】遺伝子がプロテアーゼ、リパーゼ、セル
ラーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、オキ
シダーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシゲナーゼ、レダク
ターゼのうちいずれかをコードする遺伝子である請求項
５に記載の核酸プール。
【請求項７】遺伝子が原核生物由来である請求項１乃
至６のいずれかに記載の核酸プール。
【請求項８】遺伝子がバチルス属細菌由来である請求
項７に記載の核酸プール。
【請求項９】遺伝子がプロテアーゼＡＰＩ２１遺伝子
である請求項８に記載の核酸プール。
【請求項１０】各ブロックがオリゴヌクレオチドであ
る請求項１乃至９のいずれかに記載の核酸プール。
【請求項１１】核酸が１本鎖ポリヌクレオチドである
請求項１０に記載の核酸プール。
【請求項１２】核酸が２本鎖ポリヌクレオチドである
請求項１０に記載の核酸プール。
【請求項１３】１個または２個以上の遺伝子の全体ま
たは一部を３個以上のオリゴヌクレオチド・ブロックに
分割するか、該ブロックに相当するオリゴヌクレオチド
を合成し、これらのブロックの全部または一部を遺伝子
上での配列とは異なる配列で連結して構成することによ
る、２種類以上の核酸を含有する核酸プールの製造方
法。
【請求項１４】下記ａ）〜ｃ）の工程を有する請求項
１３に記載の核酸プールの製造方法：ａ）１個または２個以上の遺伝子の全体または一部に対
応する塩基配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチドから
なる３個以上のブロックを、遺伝子の分割または該塩基
配列を有するオリゴヌクレオチド鎖の合成により調製す
る工程；ｂ）工程ａ）で得られた各オリゴヌクレオチド鎖ブロッ
クについて、３’末端がデオキシリボヌクレオチドであ
るブロックの３’末端にはリボヌクレオチドを、５’末
端が水酸基であるブロックの５’末端にはリン酸基を付
加する工程；ｃ）工程ｂ）で得られたオリゴヌクレオチド鎖ブロック
を、１のブロックの３’末端のリボヌクレオチドと他の
ブロックの５’末端のリン酸基とを反応させることによ
り、任意の配列で連結する工程。
【請求項１５】工程ａ）で調製されるブロックの数が
３個以上である請求項１４に記載の核酸プールの製造方
法。
【請求項１６】工程ｂ）で、少なくとも１個のブロッ
クについては５’末端を水酸基のまま残すことにより、
該ブロックを５’末端に有する核酸を選択的に得る請求
項１４または１５に記載の核酸プールの製造方法。
【請求項１７】工程ｂ）で、少なくとも１個のブロッ
クについては３’末端をデオキシリボヌクレオチドのま
ま残すことにより、該ブロックを３’末端に有する核酸
を選択的に得る請求項１４乃至１６のいずれかに記載の
核酸プールの製造方法。
【請求項１８】各ブロックによりコードされるアミノ
酸配列がもとの遺伝子上で相当部分によりコードされる
アミノ酸配列と一致するようにブロックの調製が行なわ
れる請求項１４乃至１７のいずれかに記載の核酸プール
の製造方法。
【請求項１９】工程ａ）で、遺伝子上の読み枠の開始
点から数えて（３ｐ＋１）番目から（３ｑ＋２）番目
（ｐ，ｑはブロックごとに独立して決められる整数。但
し、ｐ≦ｑである。）までの塩基配列を有するブロック
を調製し、工程ｂ）で、同じく（３ｑ＋３）番目の塩基
または当該位置においてコードするアミノ酸を変えない
塩基に対応するリボヌクレオチドを該ブロックの３’末
端に付加する、請求項１８に記載の核酸プールの製造方
法。
【請求項２０】工程ｃ）の連結が、アデノシン三リン
酸及び２価の金属イオンの存在下、ＲＮＡリガーゼを用
いて行なわれる請求項１４乃至１９のいずれかに記載の
核酸プールの製造方法。
【請求項２１】請求項１４乃至２０により得られる１
本鎖核酸をポリメラーゼ反応により２本鎖化してなる２
本鎖核酸プールの製造方法。
【請求項２２】請求項１乃至１２記載の核酸プールに
存在する遺伝情報を発現させることによって得られる遺
伝子産物。