JPH0441999B2 - - Google Patents
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Description
本発明は各種対立変異型ソーマチンをコードす
るDNA配列およびこのDNA配列を包含するクロ
ーニングビークルおよび形質転換された微生物に
おけるそれらの使用に関する。 ソーマチンはタウマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）の果実の仮種皮に
由来するタンパク質である。ソーマチンは重量基
準でシヨ糖より1600倍甘く、分子量基準ではシヨ
糖より105倍甘い。西洋社会において、糖のとり
過ぎは多くの健康問題を起こしている。それ故に
糖の代りに低カロリー甘味料を用いる多くの試み
がなされている。しかし、これらの幾つかは副作
用の点で最近禁止された。従つて、天然の低カロ
リー甘味料およびこのような甘味料の経済的製造
法が要望されている。分子生物学における最近の
進歩は特別な真核生物タンパク質をコードする構
造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、この遺伝
子を形質転換された宿主細胞中で発現させ、それ
により目的のタンパク質を生産することを可能に
した。 自然の状態で修飾形のタンパク質をコードする
真核生物由来の多くの遺伝子は組換えDNA分子
にそのまま適用できない。その理由は自然の遺伝
子はメツセンジヤーRNA（mRNA）に含まれて
いないイントロンと呼ばれるDNA配列を含むか
らである。これらイントロンにある情報は
mRNAの翻訳過程前に真核生物細胞中に移され
る。本発明者が知る限り、細菌はこのようなイン
トロンをRNAレベルで除去することができない
から、真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主
細胞に使用する前に、RNAレベルでこれらイン
トロトンにある遺伝子情報を除去する必要があ
る。 mRNAレベルでイントロンを除去する能力を
有する微生物宿主細胞では、これがこの微生物宿
主細胞中で有効であるレギユロンの制御下に置か
れる限り、自然の遺伝子を原理上適用できる。 本発明においては、真核生物特に植物由来の遺
伝情報を、微生物の特に細菌の宿主細胞中で発現
が効果的に起こるような状態で導入する組換え
DNA技術を使用する。 本発明を更によく理解するため、記述中で用い
た最も重要な用語を定義することにする。 レギユロンはプロモーターとオペレーター領域
からなるDNA配列である。 構造遺伝子は鋳型（mRNA）を通して特別な
ポリペプチドに特有のアミノ酸配列をコードする
DNA配列である。 プロモーターはRNAポリメラーゼが転写の開
始のための結合するレギユロン内のDNA配列で
ある。 オペレーターはリプレツサータンパク質が結合
し、従つてRNAポリメラーゼが隣接プロモータ
ーへ結合するのを妨げるレギユロン内のDNA配
列である。 誘導物質はリプレツサータンパク質を不活性化
し、オペレーターを自由にし、そしてRNAポリ
メラーゼをプロモーターへ結合させて転写を開始
させる物質である。 成熟ソーマチンとは、完全に修飾（processed）
されたタンパク質の対立遺伝子形（表Ａ）の一つ
を意味する。 クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質
転換した後自己複製させるDNA配列（完全なレ
プリコン）を包含する非染色体二本鎖DNA、プ
ラスミドまたはフアージである。 フアージまたはバクテリオフアージは適当な細
菌主細胞中で複製できる細菌性ウイルスである。 解読わくはmRNAレベルでコドンからポリペ
プチドへの固有の翻訳が起こるようなわくへ３個
ひと続きのヌクレオチド（コドン）の集合であ
る。 転写は遺伝子からRNAをつくる過程である。 翻訳はmRNAからポリペプチドをつくる過程
である。 発現はポリペチドをつくるため構造遺伝子によ
り受ける過程である。これは少なくとも転写と翻
訳とを含む多くの過程の結合である。 成熟ソーマチン遺伝子とは、十分に修飾された
（成熟した）形でソーマチンの種々な対立遺伝子
をコードするメツセンジヤーRNAの部分と正確
に同じ情報量（コドンの配列順序）を有する二本
鎖DNA配列を意味する。便宜上、da DNAの一
本鎖だけを本明細書ならびに図面に示した。 本発明によると、 () 表ＡおよびＢに記載の各種対立型ソーマチ
ンをコードする構造遺伝子 () この構造遺伝子の発現を調節する特別な
DNA配列 を包含する組換えプラスミドが供される。これら
特別なDNA配列は誘導可能または構成的なレギ
ユロンの何れかからなる。特に適当な誘導可能レ
ギユロンはデイー・ブイ・ゴデル（D.V.
Goeddel）等、Nature281、544−548（1978）に
より記述された二重lac UV5系からなる。
るDNA配列およびこのDNA配列を包含するクロ
ーニングビークルおよび形質転換された微生物に
おけるそれらの使用に関する。 ソーマチンはタウマトコツカス・ダニエリ
（Thaumatococcus daniellii）の果実の仮種皮に
由来するタンパク質である。ソーマチンは重量基
準でシヨ糖より1600倍甘く、分子量基準ではシヨ
糖より105倍甘い。西洋社会において、糖のとり
過ぎは多くの健康問題を起こしている。それ故に
糖の代りに低カロリー甘味料を用いる多くの試み
がなされている。しかし、これらの幾つかは副作
用の点で最近禁止された。従つて、天然の低カロ
リー甘味料およびこのような甘味料の経済的製造
法が要望されている。分子生物学における最近の
進歩は特別な真核生物タンパク質をコードする構
造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、この遺伝
子を形質転換された宿主細胞中で発現させ、それ
により目的のタンパク質を生産することを可能に
した。 自然の状態で修飾形のタンパク質をコードする
真核生物由来の多くの遺伝子は組換えDNA分子
にそのまま適用できない。その理由は自然の遺伝
子はメツセンジヤーRNA（mRNA）に含まれて
いないイントロンと呼ばれるDNA配列を含むか
らである。これらイントロンにある情報は
mRNAの翻訳過程前に真核生物細胞中に移され
る。本発明者が知る限り、細菌はこのようなイン
トロンをRNAレベルで除去することができない
から、真核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主
細胞に使用する前に、RNAレベルでこれらイン
トロトンにある遺伝子情報を除去する必要があ
る。 mRNAレベルでイントロンを除去する能力を
有する微生物宿主細胞では、これがこの微生物宿
主細胞中で有効であるレギユロンの制御下に置か
れる限り、自然の遺伝子を原理上適用できる。 本発明においては、真核生物特に植物由来の遺
伝情報を、微生物の特に細菌の宿主細胞中で発現
が効果的に起こるような状態で導入する組換え
DNA技術を使用する。 本発明を更によく理解するため、記述中で用い
た最も重要な用語を定義することにする。 レギユロンはプロモーターとオペレーター領域
からなるDNA配列である。 構造遺伝子は鋳型（mRNA）を通して特別な
ポリペプチドに特有のアミノ酸配列をコードする
DNA配列である。 プロモーターはRNAポリメラーゼが転写の開
始のための結合するレギユロン内のDNA配列で
ある。 オペレーターはリプレツサータンパク質が結合
し、従つてRNAポリメラーゼが隣接プロモータ
ーへ結合するのを妨げるレギユロン内のDNA配
列である。 誘導物質はリプレツサータンパク質を不活性化
し、オペレーターを自由にし、そしてRNAポリ
メラーゼをプロモーターへ結合させて転写を開始
させる物質である。 成熟ソーマチンとは、完全に修飾（processed）
されたタンパク質の対立遺伝子形（表Ａ）の一つ
を意味する。 クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質
転換した後自己複製させるDNA配列（完全なレ
プリコン）を包含する非染色体二本鎖DNA、プ
ラスミドまたはフアージである。 フアージまたはバクテリオフアージは適当な細
菌主細胞中で複製できる細菌性ウイルスである。 解読わくはmRNAレベルでコドンからポリペ
プチドへの固有の翻訳が起こるようなわくへ３個
ひと続きのヌクレオチド（コドン）の集合であ
る。 転写は遺伝子からRNAをつくる過程である。 翻訳はmRNAからポリペプチドをつくる過程
である。 発現はポリペチドをつくるため構造遺伝子によ
り受ける過程である。これは少なくとも転写と翻
訳とを含む多くの過程の結合である。 成熟ソーマチン遺伝子とは、十分に修飾された
（成熟した）形でソーマチンの種々な対立遺伝子
をコードするメツセンジヤーRNAの部分と正確
に同じ情報量（コドンの配列順序）を有する二本
鎖DNA配列を意味する。便宜上、da DNAの一
本鎖だけを本明細書ならびに図面に示した。 本発明によると、 () 表ＡおよびＢに記載の各種対立型ソーマチ
ンをコードする構造遺伝子 () この構造遺伝子の発現を調節する特別な
DNA配列 を包含する組換えプラスミドが供される。これら
特別なDNA配列は誘導可能または構成的なレギ
ユロンの何れかからなる。特に適当な誘導可能レ
ギユロンはデイー・ブイ・ゴデル（D.V.
Goeddel）等、Nature281、544−548（1978）に
より記述された二重lac UV5系からなる。
【表】
表Ａは（成熟）ソーマチンのアミノ酸配列と
DNA配列を示す。表Ｂはソーマチン遺伝子にお
ける対立型変異を示す。 もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ・
リー（F.Lee）等、J.Mol.Biol.121、193〜217
（1978）およびケイ・バートランド（K.
Bertrand）等、Science189、22〜26（1975）によ
り記述されたトリプトフアン系の構成成分であ
る。本発明者はこのトリプトフアン系を修正し
て、第１図記載の一層適当な系を得た。この修正
された系において、trpアテニユエータータンパ
ク質をコードする情報は除かれるが、リボソーム
結合部位を保つている。 本発明に係る組換えプラスミドはバクテリオフ
アージM13、flおよびfdの遺伝子の修正プロモ
ーター／リボゾーム結合部位からなるDNA配列
を包含する〔ピー・エム・ジー・エフ・フアンウ
エーゼンビーク（P.M.G.F.Van Wezenbeek）
等、Gene11、129〜148（1980）〕、そしてこのもの
は本発明者の知る限り、真核生物遺伝子の発現の
ために未だ使われていない。 本発明による組換えプラスミドにおいて、レギ
ユロンは構造遺伝子に直接結合することもでき、
又はヌクレオチド配列CAT（Ｎ）oGAATTC（N′）
oATG（式中、ｎ＝０、１、２または３であり、
そしてＮおよびN′はヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇま
たはＣの何れかであるが、ただし二本鎖構造にお
いてＮとN′は回転対称構造が存在するようなも
のであることを条件とする）からなるDNAリン
カーを含む新規出発コドンおよびEcoR−部を
介して間接的に結合することができる。 回転対称構造とは、Ｎが例えばＡにより表わさ
れる場合、N′は相補的塩基Ｔにより表わされね
ばならないことを意味する。 ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との間
の配列AATTが除去されたとき、発現の効率が
向上するということになる。 本発明に係る各種対立遺伝子型の成熟（完全に
修飾された）ソーマチンをコードする構造遺伝子
を含む微生物クローニングビークルが得られ、種
種なソーマチンが幾つかの工程を実行することに
より生産されるが、そのうち最も本質的なものは
次の通りである： (1) ソーマチンのメツセンジヤーRNA（mRNA）
の単離および精製、 (2) このmRNAを二本鎖DNA（dsDAN）に転
換、 (3) ポリ−dC尾を有するds DNAの組立て、 (4) ds DNA−ポリ−dC成分のエンドヌクレア
ーゼPst −切断およびポリ−dG−尾プラス
ミドpBR322DNAへの加入、 (5) 形質転換とクローン選択、 (6) RNA／DNAハイブリドおよび生体外翻訳に
よる挿入部の性質の決定、 (7) DNAおよびRNA配列の分析による挿入部の
性質の二重チエツク、 (8) 完全に修飾された成熟ソーマチンをコードす
るDNAの製造、 (9) 特別な転写調節DNA配列を包含するプラス
ミドの組立て、およびDNA−リンカーおよび
DNA−プライマーの化学的合成、 (10) 構成的または誘導可能レギユロンおよび連結
ソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立
て、およびこのプラスミドによるE.coliの形質
転換、 (11) 前記組換えプラスミドを含むE.coli細胞の
培養、およびソーマチンの検出と単離。 下記の詳細に記述は本発明を説明するものであ
る。 １ mRNA（ソーマチン）の単離および精製 タウマトコツカス、ダニエリイの単離した仮
種皮を液体窒素下で粉砕した。フエノールでタ
ンパク質を抽出した後、ケイ・エス・カービイ
（K.S.Kirby）（1965）Biochem.J.96、266〜
269、ユー・ウイーガース（U.Wiegers）およ
びエツチ・ヒルチ（H.Hilz）FEBS Letters
23、77〜82により記述された手順に従いLiClに
よるRNAの選択的沈澱を行なう。メツセンジ
ヤRNAを含むポリ−ＡをオリゴマーdT−セル
ロースカラムに何回か通すことにより回収し、
このメツセンジヤー混合物からソーマチン−コ
ード化mRNAをポリアクリルアミドゲル電気
泳動により単離した。これをエツチ・アビブ
（H.Aviv）およびピー・レーダー（P.Leder）
（1972）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、1408
〜1412およびジエー・ダブリユー・デイビース
（J.W.Davies）およびピー・カエスベルグ（P.
Kaesberg）（1973）、J.Virol.12、1434〜1441に
より記述されたように小麦胚系でmRNAの翻
訳によりチエツクした。 ２ ソーマチンmRNAから二本鎖DNAへの変換 精製ソーマチンmRNAをジー・エヌ・ブエ
ル（G.N.Buel）等、J.Biol Chem 253．2471
〜2482（1978）により記述された手順に従い、
AWV逆転写酵素で複写して一本鎖DNA分子
をつくつた。このcDNAをその後エー・アー
ル・デイビス（A.R.Davis）等、Gene10、205
〜218（1980）により記述された手順に従い、E.
coliDNA−ポリメラーゼにより二本鎖分子に
変えた。この二本鎖DNA複写のループ構造を
S1−ヌクレアーゼ消化により除いた。 ３ ポリ−dC尾部を有する二本鎖DNAの組立て 目的の長さのDNA分子はアール・ロイチヨ
ウドフリイ（R.Roychoudhry）等、Nucleic
Acids Research3、863〜877（1976）により記
述された手順に従い、ポリアクリルアミドゲル
−電気泳動、ゲルから抽出、および末端トラン
スフエラーゼによるポリdcでの尾部結合によ
り得た。 ４ プラスミドpBR322におけるdsDNA−dc分
子の結合 プラスミドpBR322をβ−ラクタマーゼ遺伝
子にある識別部位のところでプラスミドを切断
する制限エンドヌクレアーゼPst Ｉで処理し、
その後pBR322の直線化されたDNAにポリ−
dG尾部を末端トランスフエラーゼにより供給
した。このポリ−dc尾部をつけたDNA分子を
アニーリングしてポリ−dG尾部をつけたプラ
スミドpBR322とした。 ５ 形質転換およびクローン選択 このようにして得たプラスミドをCaCl2−処
理E.coli細胞に転移させた。形質転換後ハイブ
リドプラスミドDNA分子を含む細胞をテトラ
サイクリンに対する耐性に基づき選択した。陽
性コロニイをエツチ・シー・バーンボイム
（H.C.Birnboim）およびジエイ・ドリイ（J.
Doly）、Nucleic Acids Research、７、1513
〜1523（1979）により概述された迅速プラスミ
ド抽出法と単離されたDNAのエンドヌクレア
ーゼPst−Ｉ−消化との組合わせにより大きい
挿入部を有するプラスミドに対してふるい分け
した。 ６ 挿入部（）の性質の決定 ハイブリツド形成／試験管内翻訳 選ばれたクローンから10μｇのプラスミド
DNAを単離し、後にこれをジアゾ化（DBM）
紙円板に固定した。固定化されたプラスミド
DNA分子を、DNA挿入部の性質を測定するた
め、ジエイ・ジー・ウイリアムス（J.G.
Williams）等、Cell17、903〜913（1979）に記
述されているハイブリツド形成／試験管内翻訳
法を用いた。 ７ DNA／RNA配列分析により挿入部（）の
性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析は
エー．エム．マキサム（A.M.Maxam）および
ダブリユー．ギルバート（W.Gilbert）、
Methods in Enzymology、編集者エル．グロ
スマン（L.Grossman）およびケイ．モルデイ
ブ（K.Moldave）、ニユーヨーク、アカデミツ
ク プレス、1980年65巻(1)、499〜560頁に概述
された化学分解法により、またジエイ．マート
（J.Maat）およびエー．ジエイ．エツチ．スミ
ス（A.J.H.Smith）、Nucleic Acids
Research、５、4537〜4545（1978）により概説
されたジデオキシ／ニツク翻訳法により行つ
た。ソーマチンmRNAのヌクレオチド配列に
ついてのこれ以上の情報はデイ．ジムマーン
（D.Zimmern）およびピー．カエスベルグ（P.
Kaesberg）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75、
4257〜4261（1978）により概説されたように、
連鎖停止阻害剤存在下に、ソーマチンmRNA
鋳型上でのAMV−逆トランスクリプターゼに
よるプライマー合成によつて間接的に誘導され
た。スクリーニングを行なつて、ソーマチン
mRNAのほぼ完全なコピーを有するpUR100を
単離した。このpUR100は、上記３〜４に記載
されている通り、dCTPとターミナルヌクレオ
チジルトランスフエラーゼを用いて3′末端にポ
リdC尾部を与えたソーマチンの二本鎖cDNA
を得（上記３参照）、別途にpBR322のβ−ラ
クタマーゼ（アンピシリン耐性遺伝子）をPstI
で切断し、切断された3′末端の一本鎖部分に
dGTPとターミナルヌルレオチジルトランスフ
エラーゼポリを用いてポリdG尾部を付加させ
（上記４参照）、これに、上記のポリdC尾部を
有するソーマチン二本鎖cDNAを連結したもの
であり、上記５〜７のスクリーニングを経て選
択したものである。 ８ 成熟、完全に修飾されたソーマチンをコード
するDNAを組立て エー・ジエイ・エツチ・スミス、Nucleic
Acids Res.、６、831〜848（1979）により概説
されたpUR100のエキソヌクレアーゼ処理に
より、またはビー・グローネンボン（B.
Gronenborn）およびジエイ・メツシング（J.
Messing）、Nature272、275〜277（1978）によ
り概説されたM13におけるクローニングにより
一本鎖DNAを得た。ソーマチンmRNAと同じ
極性を有する一本鎖DNAを、プライマーとし
て役立つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチ
ド（5′）pTCAGGCAGTAGGGCAOH（3′）を用
いる相補的DNA合成のための鋳型として用い
た。二本鎖DNAの熱変性後、化学的に合成さ
れたオリゴヌクレオチド（5′）
pGCCACCTTCGOH（3′）をプライマーとして使
用することにより相補的DNAがDNA合成のた
めの鋳型として役立つた。次にこの二本鎖
DNAをS1ヌクレアーゼで処理した。成熟ソー
マチン遺伝子の組立てを第２図を参照して記述
する。第２図に示す通り、上記７で得たソーマ
チンmRNAのコピーを有するプラスミド
pUR100を制限酵素PstIで処理した。図には、
比較のため、プレプロソーマチンのアミノ酸配
列をソーマチンの末端部分のアミノ酸配列と共
に示した。かかるPstI処理によつて、ATG
コドンで始まるプレプロソーマチンのプレ部分
の配列（22残基のアミノ酸をコードする）、
プレプロソーマチンのプロ部分（Leu−Glu−
Leu−Glu−Ala−Glu）をコードする配列
（CTT GAA CTT GAA GAG GAG）、ソ
ーマチンの最初の４残基のアミノ酸（Ala
Thr Phe Glu）をコードする配列（GCC ACC
TTC GAG）、ソーマチンの最後の４残基の
アミノ酸（Cys Pro Thr Ala）をコードする
配列（TGC CCT ACT GCC）及び終止コ
ドン（TAA）を含んでなるプレプロソーマチ
ン全体をコードする二本鎖DNAを得た。この
二本鎖DNAを変性処理に付して、二本鎖の分
離を行なつた。次いで、得られた一本鎖DNA
に、上記配列（ソーマチンの最後の４残基の
アミノ酸のコード配列（TGC CCT ACT
GCC））と相補的な15量体の合成プライマー
（5′TCA GGC AGT AGG GCA3′）をアニー
ルした（ただし、このプライマーの「TCA」
トリプレツト部分は終止コドン（CTT）とは
相補対を形成しない）。この過程は、第２図で
はプライミングＩと示してある。続いてDNA
合成を行なつて、プライマーを3′末端方向に伸
長させた（鋳型の5′末端まで合成を進めた）。
これを再び変性処理に付して、プライマーから
新たに合成した鎖に、12量体の合成プライマー
（5′GCC ACC TCC GAC3′）をアニールした。
この過程はプライミングと示してある。再び
DNA合成を行なつて、プライマーを3′末端方
向に伸長させた。この伸長反応は鋳型の5′末端
の3′ACT5′（ソーマチンの終止コドン「TCA」
の逆向き）で終わる。S1ヌクレアーゼで処理
して、はみ出した一本鎖部分を切断して、ソー
マチンのコード鎖と終止コドン「TGA」とか
らなる二本鎖DNAを得た。かかるソーマチン
をコードする二本鎖DNAは、常法によつて反
応混合物から単離することができる。 9a プラスミドpUR201の組立て 二重lacレギユロン（lac UV5）を包含する
285塩基対を含む断片をpKB268の制限エンド
ヌクレアーゼEcoRI切断により得た〔ケイ・バ
ツクマン（K.Backman）およびエム・プタシ
ユン（M.Ptashne）、Cell13、65〜71（1978）〕。
この断片をpBR322DNAのEcoRI部位に連結し
た。右方向にlacレギユロンを有するプラスミ
ドDNA（第３図）をE.coliRNAポリメラーゼ
の存在下EcoRIにより部分的に切断した。制限
エンドヌクレアーゼHind切断部位から最も
遠いEcoRI切断部位が優先的に攻撃した。直線
化されたDNAをS1ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースゲル電気泳動により精製し、T4DNA
−リガーゼによる連結により環状にし、その後
E.coliの転換に用いた。テトラサイクリン耐性
転換体から正しい構造（第３図）を有する
pUR201を得た。 9b プラスミドpUR３０１の組立て 約510塩基対のDNA断片が、ptrpED5の制限
エンドヌクレアーゼHinf Ｉ切断により得た
〔アール・エー・ハルレーウエル・（R.A.
Hallewell）およびエス・エムテージ（S.
Emtage）、Gene９、27〜47（1980）〕。この断片
をE.coliRNAポリメラーゼの存在下制限エン
ドヌクレアーゼTaq Ｉで切断した。trpレギユ
ロンにおけるTaq Ｉ部位〔ケイ・バートラン
ド（K.Bertrand）等、Sience189、22〜26
（1975）およびエフ・リー（F.Lee）等、J.
Mol.Biol.121、193〜217（1978）により記述〕
を選択的に保護し、このようにしてtrpレギユ
ロン（第１図）からなる234塩基対を含む断片
を得た。次にこの断片をS1ヌクレアーゼで処
理し、EcoRIリンカー（5′）pGGAATTCCOH
（3′）で平滑末端を連結し、EcoRIで切断し、
その後pBR322のEcoRI−部位でクローニング
した。 正しい方向にあるtrpレギユロンを有するプ
ラスミドpUR300（第１図）を単離した。Hind
部位から最も通いEcoRI−切断部位をエチジ
ウムブロミドの存在下EcoRIによる
pUR300DNAの部分切断によりそしてS1ヌク
レアーゼ処理により除去した。線状DNA分子
をT4DNAリガーゼにより再環化した。テトラ
サイクリン耐性転換体から第１図に概説された
構造をもつpUR301を得た。 9c プラスミドpUR401の組立て 269塩基対を含む断片（DNA配列1128〜379）
を制限エンドヌクレアーゼTaq およびHae
を用いるRF M13 DNA〔ピー・エム・ジ
ー・エフ・ブイ・ウエーゼンビーム（P.M.G.
F.V.Wezenbeek）等、Gene11、129〜148
（1980）〕の消化により得、そのTaq Ｉ部位を
E.coliDNAポリメラーゼを用いる復飾反応に
より平滑末端とし、断片をその後制限酵素
Mn1Iで部分消化した。この部分的生成物を
T4DNAポリメラーゼおよびS1ヌクレアーゼの
連続作用で処理し、その後EcoRI−リンカー
（5′）pGGAATTCCOH（3′）で平滑末端を連結
し、次にEcoRIで処理し、そしてpBR322の
EcoRI部位で連結した。制限酵素分析および
DNA配列分析により、EcoRI切断部位がM13
遺伝子DNA配列のリボソーム結合部位を了
度越えて位置するプラスミドが得られた。本発
明者はM13レギユロンを有するプラスミド（ヌ
クレオチド1128からヌクレオチド1291〜1297）
が発現に適したレギユロンであることを見出し
た。Hind部位から最も遠いEcoRI切断部位
はpUR301に対して本質的に記述したようにし
て除いた。pUR401の完全な組立てを第４図に
示す。 9d リンカーおよびプライマーの化学的合成 オリゴデキシヌクレオチドの合成は5′−Ｏ−
レブリニルデオキシヌクレオシド−3′−Ｏ−
２，２，２，−トリクロロエチル−２−クロロ
フエニルホスフエートをデオキシヌクレオシド
−3′−Ｏ−２，２，２−トリクロロエチル−２
−クロロフエニルホスフエートとのカツプリン
グにより行なつた。ホスホトリエステル法とし
て知られるこの方法は〔ジエイ・エフ・エム・
ド・ルーイ（J.F.M.de Rooij）等、Recl.
Trav.Chim.Pays−Bas98、537〜548（1979）に
より記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチル
基の開裂除去とそれに続く２，４，６−トリイ
ソプロピルベンゼンスルホニル−３−ニトロ−
１，２，４−トリアゾールにより実際のカツプ
リング反応を含む。デオキシアデノシン、デオ
キシシチジンおよびデオキシグアノシンにおけ
るアミノ基はそれぞれベンゾイル基、４−メト
キシベンゾイル基およびベンゾイル基により保
護される。末端ヌクレオシド3′−ヒドロキシ基
の保護にはベンゾイル基が用いられる。最後の
工程ですべての保護基はそれぞれフツ化テトラ
ブチルアンモニウムおよび濃アンモニア水との
反応により除去される。 リンカー（5′）pCATGAATTCATGOH（3′）
の組立ての一例を第５図に示す。 10 二重lac UV5−（pUR520）、trp−（pUR530）
およびM13またはf1またはfd遺伝子レギユロ
ン （pUR540）の転写制限下の成熟ソーマチン遺
伝子による発現プラスミドの組立てと前記プラ
スミドによるE.coliの形質転換 ８に記載のソーマチンコード化DNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて合成EcoRI−リンカ
ー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）oATGOH
（3′）により平滑末端を連結し、EcoRIで切断
し、その後プラスミドpUR201、pUR301およ
びpUR401およびEcoRI−切断部位に連結し、
第６図に示したような方向でソーマチンコード
化挿入部を有する組換えプラスミドを、E.coli
の形質転換およびテトラサイクリン耐性転換体
の選択後に単離した。上記プラスミドにおい
て、化学的に合成されたリンカーに由来する
AATT配列はエチジウムブロミドの存在化
EcoRIを用いるプラスミドの切断により削除で
き、線状部分はアガロースゲル電気泳動により
単離し、S1ヌクレアーゼで処理し、そしてT4
リガーゼ作用により再環化した。 AATTの欠失後に得たプラスミドを制限酵
素分析により検出した。 11 組換えプラスミドを含むE.coli細胞の培養と
ソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと成熟
ソーマチン遺伝子との間のリンカーにAATT
配列を有する、あるいは有しないプラスミド
pUR520またはpUR530またはpUR540を含むE.
coli細胞をその発育に最適の条件下で培養し
た。これら培養条件は細胞中に存在するプラス
ミドの型により変化するが、常に選択圧を維持
するため適当な抗生物質の存在下で行なう。こ
れらの条件下でプラスミドpUR520または
pUR530またはpUR540の何れかを含む細胞は
かなり量の成熟ソーマチンを生産した。タンパ
ク質ソーマチンの存在は、定性的にはS.D.S.電
気泳動によりまた甘味に関する生理学的試験に
より、そして定量的には酵素結合した免疫吸収
剤分析（ELISA）により実証された。 蛍光標識で検出したSDS電気泳動の結果を第
７図に示す。ソーマチン（レーン１）について
非常に薄いバンドが検出され、大腸菌内でソー
マチンが発現することが実証された。プレプロ
ソーマチン（レーン４）、プロソーマチン（レ
ーン３）、及びプレソーマチン（レーン２）に
ついては非常に強いバンドが見られた。レーン
５は、上記プラスミドpUR301を保有する大腸
菌から調製した対照試料である。下記の表に
ELISA法で得られた結果を示す。上記プラス
ミドpUR530を含む大腸菌294株を、610nｍに
おける吸光度が0.5となるまで増殖させて集菌
し、フレンチプレスで菌体を破壊し、常法に従
つてELISA法を行なつた。同様に、trpレギユ
ロンの制御の下でプレプロソーマチン、プロソ
ーマチン又はプレソーマチンをコードするプラ
スミドについても同様の実験を行なつた。 表Ｃ表現型 菌体当りの分子数 プレプロソーマチン 500 プロソーマチン 100 プレソーマチン 100 ソーマチン 50 以下のプラスミドを含有する大腸菌はATCC
（American Type Culture Collection）に寄託
されている。 pUR520−ATCC39014 （ブダペスト条約に基づく国際寄託） pUR530−ATCC39013 （ブダペスト条約に基づく国際寄託）
DNA配列を示す。表Ｂはソーマチン遺伝子にお
ける対立型変異を示す。 もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ・
リー（F.Lee）等、J.Mol.Biol.121、193〜217
（1978）およびケイ・バートランド（K.
Bertrand）等、Science189、22〜26（1975）によ
り記述されたトリプトフアン系の構成成分であ
る。本発明者はこのトリプトフアン系を修正し
て、第１図記載の一層適当な系を得た。この修正
された系において、trpアテニユエータータンパ
ク質をコードする情報は除かれるが、リボソーム
結合部位を保つている。 本発明に係る組換えプラスミドはバクテリオフ
アージM13、flおよびfdの遺伝子の修正プロモ
ーター／リボゾーム結合部位からなるDNA配列
を包含する〔ピー・エム・ジー・エフ・フアンウ
エーゼンビーク（P.M.G.F.Van Wezenbeek）
等、Gene11、129〜148（1980）〕、そしてこのもの
は本発明者の知る限り、真核生物遺伝子の発現の
ために未だ使われていない。 本発明による組換えプラスミドにおいて、レギ
ユロンは構造遺伝子に直接結合することもでき、
又はヌクレオチド配列CAT（Ｎ）oGAATTC（N′）
oATG（式中、ｎ＝０、１、２または３であり、
そしてＮおよびN′はヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇま
たはＣの何れかであるが、ただし二本鎖構造にお
いてＮとN′は回転対称構造が存在するようなも
のであることを条件とする）からなるDNAリン
カーを含む新規出発コドンおよびEcoR−部を
介して間接的に結合することができる。 回転対称構造とは、Ｎが例えばＡにより表わさ
れる場合、N′は相補的塩基Ｔにより表わされね
ばならないことを意味する。 ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との間
の配列AATTが除去されたとき、発現の効率が
向上するということになる。 本発明に係る各種対立遺伝子型の成熟（完全に
修飾された）ソーマチンをコードする構造遺伝子
を含む微生物クローニングビークルが得られ、種
種なソーマチンが幾つかの工程を実行することに
より生産されるが、そのうち最も本質的なものは
次の通りである： (1) ソーマチンのメツセンジヤーRNA（mRNA）
の単離および精製、 (2) このmRNAを二本鎖DNA（dsDAN）に転
換、 (3) ポリ−dC尾を有するds DNAの組立て、 (4) ds DNA−ポリ−dC成分のエンドヌクレア
ーゼPst −切断およびポリ−dG−尾プラス
ミドpBR322DNAへの加入、 (5) 形質転換とクローン選択、 (6) RNA／DNAハイブリドおよび生体外翻訳に
よる挿入部の性質の決定、 (7) DNAおよびRNA配列の分析による挿入部の
性質の二重チエツク、 (8) 完全に修飾された成熟ソーマチンをコードす
るDNAの製造、 (9) 特別な転写調節DNA配列を包含するプラス
ミドの組立て、およびDNA−リンカーおよび
DNA−プライマーの化学的合成、 (10) 構成的または誘導可能レギユロンおよび連結
ソーマチン遺伝子を包含するプラスミドの組立
て、およびこのプラスミドによるE.coliの形質
転換、 (11) 前記組換えプラスミドを含むE.coli細胞の
培養、およびソーマチンの検出と単離。 下記の詳細に記述は本発明を説明するものであ
る。 １ mRNA（ソーマチン）の単離および精製 タウマトコツカス、ダニエリイの単離した仮
種皮を液体窒素下で粉砕した。フエノールでタ
ンパク質を抽出した後、ケイ・エス・カービイ
（K.S.Kirby）（1965）Biochem.J.96、266〜
269、ユー・ウイーガース（U.Wiegers）およ
びエツチ・ヒルチ（H.Hilz）FEBS Letters
23、77〜82により記述された手順に従いLiClに
よるRNAの選択的沈澱を行なう。メツセンジ
ヤRNAを含むポリ−ＡをオリゴマーdT−セル
ロースカラムに何回か通すことにより回収し、
このメツセンジヤー混合物からソーマチン−コ
ード化mRNAをポリアクリルアミドゲル電気
泳動により単離した。これをエツチ・アビブ
（H.Aviv）およびピー・レーダー（P.Leder）
（1972）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69、1408
〜1412およびジエー・ダブリユー・デイビース
（J.W.Davies）およびピー・カエスベルグ（P.
Kaesberg）（1973）、J.Virol.12、1434〜1441に
より記述されたように小麦胚系でmRNAの翻
訳によりチエツクした。 ２ ソーマチンmRNAから二本鎖DNAへの変換 精製ソーマチンmRNAをジー・エヌ・ブエ
ル（G.N.Buel）等、J.Biol Chem 253．2471
〜2482（1978）により記述された手順に従い、
AWV逆転写酵素で複写して一本鎖DNA分子
をつくつた。このcDNAをその後エー・アー
ル・デイビス（A.R.Davis）等、Gene10、205
〜218（1980）により記述された手順に従い、E.
coliDNA−ポリメラーゼにより二本鎖分子に
変えた。この二本鎖DNA複写のループ構造を
S1−ヌクレアーゼ消化により除いた。 ３ ポリ−dC尾部を有する二本鎖DNAの組立て 目的の長さのDNA分子はアール・ロイチヨ
ウドフリイ（R.Roychoudhry）等、Nucleic
Acids Research3、863〜877（1976）により記
述された手順に従い、ポリアクリルアミドゲル
−電気泳動、ゲルから抽出、および末端トラン
スフエラーゼによるポリdcでの尾部結合によ
り得た。 ４ プラスミドpBR322におけるdsDNA−dc分
子の結合 プラスミドpBR322をβ−ラクタマーゼ遺伝
子にある識別部位のところでプラスミドを切断
する制限エンドヌクレアーゼPst Ｉで処理し、
その後pBR322の直線化されたDNAにポリ−
dG尾部を末端トランスフエラーゼにより供給
した。このポリ−dc尾部をつけたDNA分子を
アニーリングしてポリ−dG尾部をつけたプラ
スミドpBR322とした。 ５ 形質転換およびクローン選択 このようにして得たプラスミドをCaCl2−処
理E.coli細胞に転移させた。形質転換後ハイブ
リドプラスミドDNA分子を含む細胞をテトラ
サイクリンに対する耐性に基づき選択した。陽
性コロニイをエツチ・シー・バーンボイム
（H.C.Birnboim）およびジエイ・ドリイ（J.
Doly）、Nucleic Acids Research、７、1513
〜1523（1979）により概述された迅速プラスミ
ド抽出法と単離されたDNAのエンドヌクレア
ーゼPst−Ｉ−消化との組合わせにより大きい
挿入部を有するプラスミドに対してふるい分け
した。 ６ 挿入部（）の性質の決定 ハイブリツド形成／試験管内翻訳 選ばれたクローンから10μｇのプラスミド
DNAを単離し、後にこれをジアゾ化（DBM）
紙円板に固定した。固定化されたプラスミド
DNA分子を、DNA挿入部の性質を測定するた
め、ジエイ・ジー・ウイリアムス（J.G.
Williams）等、Cell17、903〜913（1979）に記
述されているハイブリツド形成／試験管内翻訳
法を用いた。 ７ DNA／RNA配列分析により挿入部（）の
性質の決定 ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析は
エー．エム．マキサム（A.M.Maxam）および
ダブリユー．ギルバート（W.Gilbert）、
Methods in Enzymology、編集者エル．グロ
スマン（L.Grossman）およびケイ．モルデイ
ブ（K.Moldave）、ニユーヨーク、アカデミツ
ク プレス、1980年65巻(1)、499〜560頁に概述
された化学分解法により、またジエイ．マート
（J.Maat）およびエー．ジエイ．エツチ．スミ
ス（A.J.H.Smith）、Nucleic Acids
Research、５、4537〜4545（1978）により概説
されたジデオキシ／ニツク翻訳法により行つ
た。ソーマチンmRNAのヌクレオチド配列に
ついてのこれ以上の情報はデイ．ジムマーン
（D.Zimmern）およびピー．カエスベルグ（P.
Kaesberg）、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75、
4257〜4261（1978）により概説されたように、
連鎖停止阻害剤存在下に、ソーマチンmRNA
鋳型上でのAMV−逆トランスクリプターゼに
よるプライマー合成によつて間接的に誘導され
た。スクリーニングを行なつて、ソーマチン
mRNAのほぼ完全なコピーを有するpUR100を
単離した。このpUR100は、上記３〜４に記載
されている通り、dCTPとターミナルヌクレオ
チジルトランスフエラーゼを用いて3′末端にポ
リdC尾部を与えたソーマチンの二本鎖cDNA
を得（上記３参照）、別途にpBR322のβ−ラ
クタマーゼ（アンピシリン耐性遺伝子）をPstI
で切断し、切断された3′末端の一本鎖部分に
dGTPとターミナルヌルレオチジルトランスフ
エラーゼポリを用いてポリdG尾部を付加させ
（上記４参照）、これに、上記のポリdC尾部を
有するソーマチン二本鎖cDNAを連結したもの
であり、上記５〜７のスクリーニングを経て選
択したものである。 ８ 成熟、完全に修飾されたソーマチンをコード
するDNAを組立て エー・ジエイ・エツチ・スミス、Nucleic
Acids Res.、６、831〜848（1979）により概説
されたpUR100のエキソヌクレアーゼ処理に
より、またはビー・グローネンボン（B.
Gronenborn）およびジエイ・メツシング（J.
Messing）、Nature272、275〜277（1978）によ
り概説されたM13におけるクローニングにより
一本鎖DNAを得た。ソーマチンmRNAと同じ
極性を有する一本鎖DNAを、プライマーとし
て役立つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチ
ド（5′）pTCAGGCAGTAGGGCAOH（3′）を用
いる相補的DNA合成のための鋳型として用い
た。二本鎖DNAの熱変性後、化学的に合成さ
れたオリゴヌクレオチド（5′）
pGCCACCTTCGOH（3′）をプライマーとして使
用することにより相補的DNAがDNA合成のた
めの鋳型として役立つた。次にこの二本鎖
DNAをS1ヌクレアーゼで処理した。成熟ソー
マチン遺伝子の組立てを第２図を参照して記述
する。第２図に示す通り、上記７で得たソーマ
チンmRNAのコピーを有するプラスミド
pUR100を制限酵素PstIで処理した。図には、
比較のため、プレプロソーマチンのアミノ酸配
列をソーマチンの末端部分のアミノ酸配列と共
に示した。かかるPstI処理によつて、ATG
コドンで始まるプレプロソーマチンのプレ部分
の配列（22残基のアミノ酸をコードする）、
プレプロソーマチンのプロ部分（Leu−Glu−
Leu−Glu−Ala−Glu）をコードする配列
（CTT GAA CTT GAA GAG GAG）、ソ
ーマチンの最初の４残基のアミノ酸（Ala
Thr Phe Glu）をコードする配列（GCC ACC
TTC GAG）、ソーマチンの最後の４残基の
アミノ酸（Cys Pro Thr Ala）をコードする
配列（TGC CCT ACT GCC）及び終止コ
ドン（TAA）を含んでなるプレプロソーマチ
ン全体をコードする二本鎖DNAを得た。この
二本鎖DNAを変性処理に付して、二本鎖の分
離を行なつた。次いで、得られた一本鎖DNA
に、上記配列（ソーマチンの最後の４残基の
アミノ酸のコード配列（TGC CCT ACT
GCC））と相補的な15量体の合成プライマー
（5′TCA GGC AGT AGG GCA3′）をアニー
ルした（ただし、このプライマーの「TCA」
トリプレツト部分は終止コドン（CTT）とは
相補対を形成しない）。この過程は、第２図で
はプライミングＩと示してある。続いてDNA
合成を行なつて、プライマーを3′末端方向に伸
長させた（鋳型の5′末端まで合成を進めた）。
これを再び変性処理に付して、プライマーから
新たに合成した鎖に、12量体の合成プライマー
（5′GCC ACC TCC GAC3′）をアニールした。
この過程はプライミングと示してある。再び
DNA合成を行なつて、プライマーを3′末端方
向に伸長させた。この伸長反応は鋳型の5′末端
の3′ACT5′（ソーマチンの終止コドン「TCA」
の逆向き）で終わる。S1ヌクレアーゼで処理
して、はみ出した一本鎖部分を切断して、ソー
マチンのコード鎖と終止コドン「TGA」とか
らなる二本鎖DNAを得た。かかるソーマチン
をコードする二本鎖DNAは、常法によつて反
応混合物から単離することができる。 9a プラスミドpUR201の組立て 二重lacレギユロン（lac UV5）を包含する
285塩基対を含む断片をpKB268の制限エンド
ヌクレアーゼEcoRI切断により得た〔ケイ・バ
ツクマン（K.Backman）およびエム・プタシ
ユン（M.Ptashne）、Cell13、65〜71（1978）〕。
この断片をpBR322DNAのEcoRI部位に連結し
た。右方向にlacレギユロンを有するプラスミ
ドDNA（第３図）をE.coliRNAポリメラーゼ
の存在下EcoRIにより部分的に切断した。制限
エンドヌクレアーゼHind切断部位から最も
遠いEcoRI切断部位が優先的に攻撃した。直線
化されたDNAをS1ヌクレアーゼで処理し、ア
ガロースゲル電気泳動により精製し、T4DNA
−リガーゼによる連結により環状にし、その後
E.coliの転換に用いた。テトラサイクリン耐性
転換体から正しい構造（第３図）を有する
pUR201を得た。 9b プラスミドpUR３０１の組立て 約510塩基対のDNA断片が、ptrpED5の制限
エンドヌクレアーゼHinf Ｉ切断により得た
〔アール・エー・ハルレーウエル・（R.A.
Hallewell）およびエス・エムテージ（S.
Emtage）、Gene９、27〜47（1980）〕。この断片
をE.coliRNAポリメラーゼの存在下制限エン
ドヌクレアーゼTaq Ｉで切断した。trpレギユ
ロンにおけるTaq Ｉ部位〔ケイ・バートラン
ド（K.Bertrand）等、Sience189、22〜26
（1975）およびエフ・リー（F.Lee）等、J.
Mol.Biol.121、193〜217（1978）により記述〕
を選択的に保護し、このようにしてtrpレギユ
ロン（第１図）からなる234塩基対を含む断片
を得た。次にこの断片をS1ヌクレアーゼで処
理し、EcoRIリンカー（5′）pGGAATTCCOH
（3′）で平滑末端を連結し、EcoRIで切断し、
その後pBR322のEcoRI−部位でクローニング
した。 正しい方向にあるtrpレギユロンを有するプ
ラスミドpUR300（第１図）を単離した。Hind
部位から最も通いEcoRI−切断部位をエチジ
ウムブロミドの存在下EcoRIによる
pUR300DNAの部分切断によりそしてS1ヌク
レアーゼ処理により除去した。線状DNA分子
をT4DNAリガーゼにより再環化した。テトラ
サイクリン耐性転換体から第１図に概説された
構造をもつpUR301を得た。 9c プラスミドpUR401の組立て 269塩基対を含む断片（DNA配列1128〜379）
を制限エンドヌクレアーゼTaq およびHae
を用いるRF M13 DNA〔ピー・エム・ジ
ー・エフ・ブイ・ウエーゼンビーム（P.M.G.
F.V.Wezenbeek）等、Gene11、129〜148
（1980）〕の消化により得、そのTaq Ｉ部位を
E.coliDNAポリメラーゼを用いる復飾反応に
より平滑末端とし、断片をその後制限酵素
Mn1Iで部分消化した。この部分的生成物を
T4DNAポリメラーゼおよびS1ヌクレアーゼの
連続作用で処理し、その後EcoRI−リンカー
（5′）pGGAATTCCOH（3′）で平滑末端を連結
し、次にEcoRIで処理し、そしてpBR322の
EcoRI部位で連結した。制限酵素分析および
DNA配列分析により、EcoRI切断部位がM13
遺伝子DNA配列のリボソーム結合部位を了
度越えて位置するプラスミドが得られた。本発
明者はM13レギユロンを有するプラスミド（ヌ
クレオチド1128からヌクレオチド1291〜1297）
が発現に適したレギユロンであることを見出し
た。Hind部位から最も遠いEcoRI切断部位
はpUR301に対して本質的に記述したようにし
て除いた。pUR401の完全な組立てを第４図に
示す。 9d リンカーおよびプライマーの化学的合成 オリゴデキシヌクレオチドの合成は5′−Ｏ−
レブリニルデオキシヌクレオシド−3′−Ｏ−
２，２，２，−トリクロロエチル−２−クロロ
フエニルホスフエートをデオキシヌクレオシド
−3′−Ｏ−２，２，２−トリクロロエチル−２
−クロロフエニルホスフエートとのカツプリン
グにより行なつた。ホスホトリエステル法とし
て知られるこの方法は〔ジエイ・エフ・エム・
ド・ルーイ（J.F.M.de Rooij）等、Recl.
Trav.Chim.Pays−Bas98、537〜548（1979）に
より記述〕、活性亜鉛によるトリクロロエチル
基の開裂除去とそれに続く２，４，６−トリイ
ソプロピルベンゼンスルホニル−３−ニトロ−
１，２，４−トリアゾールにより実際のカツプ
リング反応を含む。デオキシアデノシン、デオ
キシシチジンおよびデオキシグアノシンにおけ
るアミノ基はそれぞれベンゾイル基、４−メト
キシベンゾイル基およびベンゾイル基により保
護される。末端ヌクレオシド3′−ヒドロキシ基
の保護にはベンゾイル基が用いられる。最後の
工程ですべての保護基はそれぞれフツ化テトラ
ブチルアンモニウムおよび濃アンモニア水との
反応により除去される。 リンカー（5′）pCATGAATTCATGOH（3′）
の組立ての一例を第５図に示す。 10 二重lac UV5−（pUR520）、trp−（pUR530）
およびM13またはf1またはfd遺伝子レギユロ
ン （pUR540）の転写制限下の成熟ソーマチン遺
伝子による発現プラスミドの組立てと前記プラ
スミドによるE.coliの形質転換 ８に記載のソーマチンコード化DNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて合成EcoRI−リンカ
ー（5′）pCAT（Ｎ）oGAATTC（N′）oATGOH
（3′）により平滑末端を連結し、EcoRIで切断
し、その後プラスミドpUR201、pUR301およ
びpUR401およびEcoRI−切断部位に連結し、
第６図に示したような方向でソーマチンコード
化挿入部を有する組換えプラスミドを、E.coli
の形質転換およびテトラサイクリン耐性転換体
の選択後に単離した。上記プラスミドにおい
て、化学的に合成されたリンカーに由来する
AATT配列はエチジウムブロミドの存在化
EcoRIを用いるプラスミドの切断により削除で
き、線状部分はアガロースゲル電気泳動により
単離し、S1ヌクレアーゼで処理し、そしてT4
リガーゼ作用により再環化した。 AATTの欠失後に得たプラスミドを制限酵
素分析により検出した。 11 組換えプラスミドを含むE.coli細胞の培養と
ソーマチンの検出 正しい方向と解読わく中にレギユロンと成熟
ソーマチン遺伝子との間のリンカーにAATT
配列を有する、あるいは有しないプラスミド
pUR520またはpUR530またはpUR540を含むE.
coli細胞をその発育に最適の条件下で培養し
た。これら培養条件は細胞中に存在するプラス
ミドの型により変化するが、常に選択圧を維持
するため適当な抗生物質の存在下で行なう。こ
れらの条件下でプラスミドpUR520または
pUR530またはpUR540の何れかを含む細胞は
かなり量の成熟ソーマチンを生産した。タンパ
ク質ソーマチンの存在は、定性的にはS.D.S.電
気泳動によりまた甘味に関する生理学的試験に
より、そして定量的には酵素結合した免疫吸収
剤分析（ELISA）により実証された。 蛍光標識で検出したSDS電気泳動の結果を第
７図に示す。ソーマチン（レーン１）について
非常に薄いバンドが検出され、大腸菌内でソー
マチンが発現することが実証された。プレプロ
ソーマチン（レーン４）、プロソーマチン（レ
ーン３）、及びプレソーマチン（レーン２）に
ついては非常に強いバンドが見られた。レーン
５は、上記プラスミドpUR301を保有する大腸
菌から調製した対照試料である。下記の表に
ELISA法で得られた結果を示す。上記プラス
ミドpUR530を含む大腸菌294株を、610nｍに
おける吸光度が0.5となるまで増殖させて集菌
し、フレンチプレスで菌体を破壊し、常法に従
つてELISA法を行なつた。同様に、trpレギユ
ロンの制御の下でプレプロソーマチン、プロソ
ーマチン又はプレソーマチンをコードするプラ
スミドについても同様の実験を行なつた。 表Ｃ表現型 菌体当りの分子数 プレプロソーマチン 500 プロソーマチン 100 プレソーマチン 100 ソーマチン 50 以下のプラスミドを含有する大腸菌はATCC
（American Type Culture Collection）に寄託
されている。 pUR520−ATCC39014 （ブダペスト条約に基づく国際寄託） pUR530−ATCC39013 （ブダペスト条約に基づく国際寄託）
第１図はpUR301への転換とその構造を示した
図であり、第２図は成熟ソーマチンをコードする
DNA配列の組立てを示し、第３図はpUR201の
構造を示し、第４図はプラスミドpUR401の完全
な組立てを示し、第５図はDNAリンカーの組立
てを示し、第６図はプラスミドpUR520、
pUR530およびpUR540の組立てを示す。第７図
は、蛍光標識法で検出した大腸菌抽出タンパク質
のSDS電気泳動図である。
図であり、第２図は成熟ソーマチンをコードする
DNA配列の組立てを示し、第３図はpUR201の
構造を示し、第４図はプラスミドpUR401の完全
な組立てを示し、第５図はDNAリンカーの組立
てを示し、第６図はプラスミドpUR520、
pUR530およびpUR540の組立てを示す。第７図
は、蛍光標識法で検出した大腸菌抽出タンパク質
のSDS電気泳動図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (A) 下式のDNA配列： 【表】 【表】 【表】 【表】 に記載のソーマチンをコードするDNA配列、
および下式の各種対立変異型ソーマチン遺伝
子： （この変異体は上記ｉ）に示した式と実質的に
同じであるが、138位のヌクレオチド「Ｇ」は
ヌクレオチド「Ｃ」と置換されているか又は
187位のヌクレオチド「Ｃ」はヌクレオチド
「Ａ」と、又は199−200位のヌクレオチド
「CG」はヌクレオチド「AA」と、又は227位
のヌクレオチド「Ａ」はヌクレオチド「Ｇ」
と、又は337位のヌクレオチド「Ｇ」はヌクレ
オチド「Ａ」と置換されているか、あるいはこ
れらの置換の２つ以上の組み合わせである）に
記載の各種対立変異型ソーマチンをコードする
DNA配列およびこの配列の発現を調節する誘
導可能な又は構成的なレギユロンから成る組換
えプラスミドをCaCl2−処理E.coli細胞含有培
地に添加して、E.coli細胞に導入し、その後プ
ラスミドをE.coli細胞により取り出し（形質転
換）、 (B) 形質転換したE.coliをその最適生育条件下、
例えば生育促進化合物に富んだ培地中、アンピ
シリン又はテトラサイクリン等の抗生物質の選
択的圧力下、あるいはトリプトフアン又はヒス
チジンンの不存在下の如き生育制限因子下培養
し、ついで (C) E.coli細胞を分解し、この細胞により生産さ
れるソーマチンをタン白分離法例えば免疫学的
操作又はイオン交換クロマトグラフイ法により
単離することを特徴とする、ソーマチンの製造
法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB8039855 | 1980-12-12 | ||
| GB8039855 | 1980-12-12 |
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Family Applications (2)
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