JPS6143996A - ソ−マチンの製造法 - Google Patents
ソ−マチンの製造法Info
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- JPS6143996A JPS6143996A JP60140090A JP14009085A JPS6143996A JP S6143996 A JPS6143996 A JP S6143996A JP 60140090 A JP60140090 A JP 60140090A JP 14009085 A JP14009085 A JP 14009085A JP S6143996 A JPS6143996 A JP S6143996A
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- thaumatin
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/43—Sweetening agents, e.g. thaumatin, monellin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は各種対立変異型ソーマチンをコードするＤＮＡ
配列およびこのＤＮＡ配列を包含するクローニングビー
クルおよび形質転換された微生物におけるそれらの使用
に関する。
配列およびこのＤＮＡ配列を包含するクローニングビー
クルおよび形質転換された微生物におけるそれらの使用
に関する。
ソーマチンはタウマドコツカス・ダニエリ（Ｔｈａｕｍ
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌ Ｉ ｉ ｉ ）の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より１６００倍甘く、分子量基準で
はショ糖より１０５倍甘い。西洋社会において、糖のと
り過ぎは多くの健康問題を起こしている。それ故に糖の
代りに低カロリー甘味料を用いる多くの試みがなされて
いる。しかし、これらの幾つかは副作用の点で最近禁止
された。従って、天然の低カロリー甘味料およびこのよ
うな甘味料の経済的製造法が要望されている。分子生物
学における最近の進歩は特別な真核生物タンパク質をコ
ードする構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、この
遺伝子を形質転換された宿主細胞中で発現させ、それに
より目的のタンパク質を生産することを可能にした。
ａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｎｉｅｌ Ｉ ｉ ｉ ）の
果実の仮種皮に由来するタンパク質である。ソーマチン
は重量基準でショ糖より１６００倍甘く、分子量基準で
はショ糖より１０５倍甘い。西洋社会において、糖のと
り過ぎは多くの健康問題を起こしている。それ故に糖の
代りに低カロリー甘味料を用いる多くの試みがなされて
いる。しかし、これらの幾つかは副作用の点で最近禁止
された。従って、天然の低カロリー甘味料およびこのよ
うな甘味料の経済的製造法が要望されている。分子生物
学における最近の進歩は特別な真核生物タンパク質をコ
ードする構造遺伝子を微生物宿主細胞中に導入し、この
遺伝子を形質転換された宿主細胞中で発現させ、それに
より目的のタンパク質を生産することを可能にした。
自然の状態で修飾形のタンパク質をコードする真核生物
由来の多くの遺伝子は組換えＤＮＡ分子にそのまま適用
できない。その理由は自然の遺伝子はメツセンジャーＲ
ＮＡ （ｍＲＮＡ）に含まれていないイントロンと呼ば
れるＤＮＡ配列を含むからである。これらイントロンに
ある情報はｍＲＮＡの翻訳過程前に真核生物細胞中に移
される。本発明者が知る限り、細菌はこのようなイント
ロンをＲＮＡレベルで除去することができないから、真
核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞に使用する
前に、ＲＮＡレベルでこれらイントロンにある遺伝情報
を除去する必要がある。
由来の多くの遺伝子は組換えＤＮＡ分子にそのまま適用
できない。その理由は自然の遺伝子はメツセンジャーＲ
ＮＡ （ｍＲＮＡ）に含まれていないイントロンと呼ば
れるＤＮＡ配列を含むからである。これらイントロンに
ある情報はｍＲＮＡの翻訳過程前に真核生物細胞中に移
される。本発明者が知る限り、細菌はこのようなイント
ロンをＲＮＡレベルで除去することができないから、真
核生物の自然の遺伝子を原核生物の宿主細胞に使用する
前に、ＲＮＡレベルでこれらイントロンにある遺伝情報
を除去する必要がある。
ｍＲＮＡレベルでイントロンを除去する能力を有する微
生物宿主細胞では、これがこの微生物宿主細胞中で有効
であるレギユロンのＩＩＩ御下に置かれる限り、自然の
遺伝子を原理上適用できる。
生物宿主細胞では、これがこの微生物宿主細胞中で有効
であるレギユロンのＩＩＩ御下に置かれる限り、自然の
遺伝子を原理上適用できる。
本発明においては、真核生物特に植物由来の遺伝情報を
、微生物の特に細菌の宿主細胞中で発現が効果的に起こ
るような状態で導入する組換えＤＮＡ技術を使用する。
、微生物の特に細菌の宿主細胞中で発現が効果的に起こ
るような状態で導入する組換えＤＮＡ技術を使用する。
本発明を更によく理解するため、記述中で用いた最も重
要な用語を定義することにする。
要な用語を定義することにする。
レギユロンはプロモーターとオペレーター領域からなる
ＤＮＡ配列である。
ＤＮＡ配列である。
ｇは鋳型（ｍＲＮＡ）を通して特別な
ポリペプチドに特有のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列である。
配列である。
プロモーターはＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のため
結合するレギユロン内のＤＮＡ配列である。
結合するレギユロン内のＤＮＡ配列である。
オペレーターはリプレッサータンパク質が結合し、従っ
てＲＮＡポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するの
を妨げるレギユロン内のＤＮＡ配列である。
てＲＮＡポリメラーゼが隣接プロモーターへ結合するの
を妨げるレギユロン内のＤＮＡ配列である。
ＬＩＩＬＪｉはリプレッサータンパク質を不活性化し、
オペレーターを自由にし、そしてＲＮＡポリメラーゼを
ブ■」モーターへ結合させて転写を開始させる物質であ
る。
オペレーターを自由にし、そしてＲＮＡポリメラーゼを
ブ■」モーターへ結合させて転写を開始させる物質であ
る。
Ｖ−７９＞とは、完全に修＠ （ｐｒｏ（：ｅｓｓｅｄ
）されたタンパク質の対立遺伝子形（表Ａ）の一つを
意味する。
）されたタンパク質の対立遺伝子形（表Ａ）の一つを
意味する。
クローニングビークルは適当な宿主細胞に形質転換した
後自己複製させるＤＮＡ配列（完全なレプリコン）を包
含する非染色体二木調ＤＮＡ、プラスミドまたはファー
ジである。
後自己複製させるＤＮＡ配列（完全なレプリコン）を包
含する非染色体二木調ＤＮＡ、プラスミドまたはファー
ジである。
ファージまたはバクテリオファージは適当な細菌宿主細
胞中で複製できる細菌性ウィルスである。
胞中で複製できる細菌性ウィルスである。
解読わくはｍＲＮＡレベルでコドンからポリペプチドへ
の固有の翻訳が起こるようなわくへ３個ひと続きのヌク
レオチド（コドン）の集合である。
の固有の翻訳が起こるようなわくへ３個ひと続きのヌク
レオチド（コドン）の集合である。
（互は遺伝子からＲＮＡをつくる過程である。
翻訳はｍＲＮＡからポリペプチドをつくる過程である。
■はボリベチドをつくるため構造遺伝子により受ける過
程である。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの
過程の結合である。
程である。これは少なくとも転写と翻訳とを含む多くの
過程の結合である。
成 ソーマチン −子とは、十分に修飾された（成熟し
た）形でソーマチンの種々な対立遺伝子をコードするメ
ツセンジャーＲＮＡの部分と正確に同じ情報量（コドン
の配列順序）を有する二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。便
宜上、ｄｓ ＤＮＡの一本鎖だけを本川ＩＩＩならび
に図面に示した。
た）形でソーマチンの種々な対立遺伝子をコードするメ
ツセンジャーＲＮＡの部分と正確に同じ情報量（コドン
の配列順序）を有する二本鎖ＤＮＡ配列を意味する。便
宜上、ｄｓ ＤＮＡの一本鎖だけを本川ＩＩＩならび
に図面に示した。
本発明によると、
（ｉ） 表ＡおよびＢに記載の各種対立型ソーマチン
をコードする構造遺伝子 ｃｉｉ） この構造遺伝子の発現を調節する特別なり
ＮＡ配列 ２包含する組換えプラスミドが供される。これら特別な
りＮＡ配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何れ
かからなる。特に適当な誘導可能レギユロンはディー・
ブイ・ゴデル（Ｄ、Ｖ、 Ｇｏｅｄｄｅｌ）等、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２１Σ１，５４１−５４８ （１９７８）に
より記述された二重１ａｃ ＬＪＶ５系からなる。
をコードする構造遺伝子 ｃｉｉ） この構造遺伝子の発現を調節する特別なり
ＮＡ配列 ２包含する組換えプラスミドが供される。これら特別な
りＮＡ配列は誘導可能または構成的なレギユロンの何れ
かからなる。特に適当な誘導可能レギユロンはディー・
ブイ・ゴデル（Ｄ、Ｖ、 Ｇｏｅｄｄｅｌ）等、Ｎａｔ
ｕｒｅ ２１Σ１，５４１−５４８ （１９７８）に
より記述された二重１ａｃ ＬＪＶ５系からなる。
表Ａは（成熟）ソーマチンのアミノ酸配列とＤＮＡ配列
を示す。表Ｂはソーマチン遺伝子における対立型変異を
示す。
を示す。表Ｂはソーマチン遺伝子における対立型変異を
示す。
もう一つの適当な誘導可能レギユロンはエフ・リー（Ｆ
、Ｌｅｅ ）等、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、上λユ。
、Ｌｅｅ ）等、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、上λユ。
１９３〜２１７（１９７８）およびケイ・パートランド
（に、 Ｂｅｒｔｒａｎｄ ）等、５ｃｉｅｎｃｅ上旦
ｊ。
（に、 Ｂｅｒｔｒａｎｄ ）等、５ｃｉｅｎｃｅ上旦
ｊ。
２２〜２６ （１９７５）により記述されたトリプトフ
ァン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファ
ン系を修正して、第１図記載の一層適当な系を得た。こ
の修正された系において、ｔｒｐアテニュエータータン
パク質をコードする情報は除かれるが、リポソーム結合
部位を保っている。
ァン系の構成成分である。本発明者はこのトリプトファ
ン系を修正して、第１図記載の一層適当な系を得た。こ
の修正された系において、ｔｒｐアテニュエータータン
パク質をコードする情報は除かれるが、リポソーム結合
部位を保っている。
本発明に係る組換えプラスミドはバクテリオファージＭ
１３、ｆｌおよびｆｄの遺伝子■の修正プロモーター／
リポソーム結合部位からなるＤＮＡ配列を包含する（ビ
ー・エム・ジー・エフ・ファンウエーセンビーク（Ｐ、
Ｈ，Ｇ、 Ｆ、 ＶａｎＷｅｚｅｎｂｅｅｋ ）等、Ｇ
ｅｎｅｌ １ 、１２９〜１４８（１９８０）〕、そし
てこのものは本発明者の知る限り、真核生物遺伝子の発
現のために未だ使ねれていない。
１３、ｆｌおよびｆｄの遺伝子■の修正プロモーター／
リポソーム結合部位からなるＤＮＡ配列を包含する（ビ
ー・エム・ジー・エフ・ファンウエーセンビーク（Ｐ、
Ｈ，Ｇ、 Ｆ、 ＶａｎＷｅｚｅｎｂｅｅｋ ）等、Ｇ
ｅｎｅｌ １ 、１２９〜１４８（１９８０）〕、そし
てこのものは本発明者の知る限り、真核生物遺伝子の発
現のために未だ使ねれていない。
本発明による組換えプラスミドにおいて、レギユロンは
構造遺伝子に直接結合することもでき、又はヌクレオチ
ド配列ＣＡＴ（Ｎ） ＧＡＡＴＴＣ（Ｎ’）。ＡＴＧ
（式中、ｎ＝ｏ、１．２または３であり、そしてＮおよ
びＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＣの何れかであ
るが、ただし二本鎖構造においてＮとＮ′は回転対称構
造が存在するようなものであることを条件とする）から
なるＤＮＡリンカ−を含む新規出発コドンおよびＥｃｏ
ＲＩ一部位を介して間接的に結合することができる。
構造遺伝子に直接結合することもでき、又はヌクレオチ
ド配列ＣＡＴ（Ｎ） ＧＡＡＴＴＣ（Ｎ’）。ＡＴＧ
（式中、ｎ＝ｏ、１．２または３であり、そしてＮおよ
びＮ′はヌクレオチドＡ、Ｔ、ＧまたはＣの何れかであ
るが、ただし二本鎖構造においてＮとＮ′は回転対称構
造が存在するようなものであることを条件とする）から
なるＤＮＡリンカ−を含む新規出発コドンおよびＥｃｏ
ＲＩ一部位を介して間接的に結合することができる。
回転対称構造とは、Ｎが例えば八により表わきれる場合
、Ｎ′は相補的塩ＭＴにより表わされねばならないこと
を意味する。
、Ｎ′は相補的塩ＭＴにより表わされねばならないこと
を意味する。
ある場合には、レギユロンと構造遺伝子との閤の配列Ａ
ＡＴＴが除去されたとき、発現の効率が向上するという
ことになる。
ＡＴＴが除去されたとき、発現の効率が向上するという
ことになる。
本発明に係る各種対立遺伝子型の成熟（完全に修飾され
た）ソーマチンをコードする構造遺伝子を含む微生物ク
ローニングビークルが得られ、種種なソーマチンが幾つ
かの工程を実行することにより生産されるが、そのうち
最も本質的なものは次の通りである： （１） ソーマチンのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ＞の単離および精製、 （２） このｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＡＮ）
に転換、 （３） ポリ−６０尾を有するｄｓ ＤＮＡの組立
て、 （４） ｄｓ ＤＮＡ−ポリ−６０分子のエンドヌ
クレアーゼＰｓｔ Ｔ−切断およびポリーｄＧ−尾ブ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡへの加入、 （５） 形質転換とクローン選択、 （６） ＲＮＡ／ＤＮＡバイブリドおよび生体外翻訳
による挿入部の性質の決定、 （７） ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の分析による挿入部
の性質の二重チェック、 （８） 完全に修飾された成熟ソーマチンをコードす
るＤＮＡの製造、 （９） 特別な転写調節ＤＮＡ配列を包含するプラス
ミドの組立て、およびＤＮＡ−リンカ−およびＤＮＡ−
プライマーの化学的合成、（１０）構成的または誘導可
能レギユロンおよび連結ソーマチン遺伝子を包含するプ
ラスミドの組立て、およ！このプラスミドによる Ｅ、 ｃｏｌｉの形質転換、 （１１）前記組換えプラスミドを含むＥ、 ｃｏ！ｉ細
胞の培養、およびソーマチンの検出と単離。
た）ソーマチンをコードする構造遺伝子を含む微生物ク
ローニングビークルが得られ、種種なソーマチンが幾つ
かの工程を実行することにより生産されるが、そのうち
最も本質的なものは次の通りである： （１） ソーマチンのメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ＞の単離および精製、 （２） このｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＡＮ）
に転換、 （３） ポリ−６０尾を有するｄｓ ＤＮＡの組立
て、 （４） ｄｓ ＤＮＡ−ポリ−６０分子のエンドヌ
クレアーゼＰｓｔ Ｔ−切断およびポリーｄＧ−尾ブ
ラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡへの加入、 （５） 形質転換とクローン選択、 （６） ＲＮＡ／ＤＮＡバイブリドおよび生体外翻訳
による挿入部の性質の決定、 （７） ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の分析による挿入部
の性質の二重チェック、 （８） 完全に修飾された成熟ソーマチンをコードす
るＤＮＡの製造、 （９） 特別な転写調節ＤＮＡ配列を包含するプラス
ミドの組立て、およびＤＮＡ−リンカ−およびＤＮＡ−
プライマーの化学的合成、（１０）構成的または誘導可
能レギユロンおよび連結ソーマチン遺伝子を包含するプ
ラスミドの組立て、およ！このプラスミドによる Ｅ、 ｃｏｌｉの形質転換、 （１１）前記組換えプラスミドを含むＥ、 ｃｏ！ｉ細
胞の培養、およびソーマチンの検出と単離。
下記の詳細な記述は本発明を説明するものである。
皮を液体窒素下で粉砕した。フェノールでタンパク質を
抽出した後、ケイ・ニス・カービイ（に、Ｓ。
抽出した後、ケイ・ニス・カービイ（に、Ｓ。
に１ｒｂＶ ） （１９６５） Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｊ
、 ９６．２６６〜２６９、ニー・ライ−ガース（Ｕ、
Ｗｉｅｇｅｒｓ）およびエッチ・ヒルチ（Ｈ，旧１ｚ
） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２３．７７〜８２によ
り記述された手順に従いＬＩＪによるＲＮＡの選択的沈
澱を行なう。メツセンジャＲＮＡを含むポリ−Ａをオリ
ゴマーｄＴ−セルロースカラムに何回か通すことにより
回収し、このメツセンジャー混合物からソーマチン−コ
ード化ｍＲＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り単離した。これをエッチ・アビブ（Ｈ，ＡＶｉＶ ）
およびビー・レーダー（Ｐ、 Ｌｅｄｅｒ）（１９７２
） 、Ｐｒｏｃ、 Ｗａｔｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ。
、 ９６．２６６〜２６９、ニー・ライ−ガース（Ｕ、
Ｗｉｅｇｅｒｓ）およびエッチ・ヒルチ（Ｈ，旧１ｚ
） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ２３．７７〜８２によ
り記述された手順に従いＬＩＪによるＲＮＡの選択的沈
澱を行なう。メツセンジャＲＮＡを含むポリ−Ａをオリ
ゴマーｄＴ−セルロースカラムに何回か通すことにより
回収し、このメツセンジャー混合物からソーマチン−コ
ード化ｍＲＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り単離した。これをエッチ・アビブ（Ｈ，ＡＶｉＶ ）
およびビー・レーダー（Ｐ、 Ｌｅｄｅｒ）（１９７２
） 、Ｐｒｏｃ、 Ｗａｔｔ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
Ｕ、Ｓ、Ａ。
６９．１４０８〜１４１２およびジエー・ダブリュー・
ディピース（Ｊ、＠、 Ｄａｖｉｅｓ ）およびピー・
カエスベルグ（Ｐ、にａｅｓｂｅｒｏ ） （１９７
３）、Ｊ。
ディピース（Ｊ、＠、 Ｄａｖｉｅｓ ）およびピー・
カエスベルグ（Ｐ、にａｅｓｂｅｒｏ ） （１９７
３）、Ｊ。
ｖｔｒｏ＋、二、１４３４〜１４４１により記述された
ように小麦胚系でｍＲＮＡの翻訳によりチェックした。
ように小麦胚系でｍＲＮＡの翻訳によりチェックした。
２、 ソーマチンｍＲＮＡから二 ＤＮ への精製
ソーマチンｍＲＮＡをジー・エヌ・ブエル（Ｇ、Ｎ、Ｂ
ｕｅｌ）等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｗ、 ２５３ 。
ソーマチンｍＲＮＡをジー・エヌ・ブエル（Ｇ、Ｎ、Ｂ
ｕｅｌ）等、Ｊ、 Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｗ、 ２５３ 。
２４７１〜２４８２ （１９７８）により記述された手
順に従い、ＡＷＶ逆転写酵素で複写して一本鎖ＤＮＡ分
子をつくった。このｃＤＮＡをその後ニー・アール・デ
ィビス（Ａ、 Ｒ，Ｄａｖｉｓ）等、Ｇｅｎｅｌｏ、２
０５〜２１８ （１９８０）により記述された手順に従
い、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡ−ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変えた。この二本鎖ＤＮＡ複写のループ構造を
８１−ヌクレアーゼ消化により除いた。
順に従い、ＡＷＶ逆転写酵素で複写して一本鎖ＤＮＡ分
子をつくった。このｃＤＮＡをその後ニー・アール・デ
ィビス（Ａ、 Ｒ，Ｄａｖｉｓ）等、Ｇｅｎｅｌｏ、２
０５〜２１８ （１９８０）により記述された手順に従
い、Ｅ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡ−ポリメラーゼにより二本
鎖分子に変えた。この二本鎖ＤＮＡ複写のループ構造を
８１−ヌクレアーゼ消化により除いた。
３、 ポリ−６０尾 を する二 ＤＮＡの立ユ
目的の長さのＤＮＡ分子はアール・ロイチョウドフリイ
（Ｒ，Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ）等、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ３．８６３〜８７７
（１９７６）により記述された手順に従い、ポリアクリ
ルアミドゲル−電気泳動、ゲルからの抽出、および末端
トランスフェラーゼによるポリｄｃでの尾部結合により
得た。
（Ｒ，Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙ ）等、Ｎｕｃｌｅｉ
ｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ３．８６３〜８７７
（１９７６）により記述された手順に従い、ポリアクリ
ルアミドゲル−電気泳動、ゲルからの抽出、および末端
トランスフェラーゼによるポリｄｃでの尾部結合により
得た。
プラスミドｐＢＲ３２２をβ−ラクタマーゼ遺伝子にあ
る識別部位のところでプラスミドを切断する制限エンド
ヌクレアーゼｐｓｔ ｌで処理し、その後ｐＢＲ３２
２の直線化されたＤＮＡにポリ−６１９尾部を末端トラ
ンスフェラーゼにより供給した。このポリ−６０尾部を
つけたＤＮＡ分子をアニーリングしてポリーｄＧ尾部を
つけたプラスミドｐＢＲ３２２とした。
る識別部位のところでプラスミドを切断する制限エンド
ヌクレアーゼｐｓｔ ｌで処理し、その後ｐＢＲ３２
２の直線化されたＤＮＡにポリ−６１９尾部を末端トラ
ンスフェラーゼにより供給した。このポリ−６０尾部を
つけたＤＮＡ分子をアニーリングしてポリーｄＧ尾部を
つけたプラスミドｐＢＲ３２２とした。
５、 ノ質転換およびクローン選択
このようにして得たプラスミドをＣａＣｊ！２−処理Ｅ
、 ｃｏｌｉ細胞に転移させた。形質転換後バイブリド
プラスミドＤＮＡ分子を含む細胞をテトラサイクリンに
対する耐性に基づき選択した。陽性コロニイをエッチ・
シー・バーンボイム（Ｈ，Ｃ。
、 ｃｏｌｉ細胞に転移させた。形質転換後バイブリド
プラスミドＤＮＡ分子を含む細胞をテトラサイクリンに
対する耐性に基づき選択した。陽性コロニイをエッチ・
シー・バーンボイム（Ｈ，Ｃ。
Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびジエイ・ドリイ（Ｊ、 Ｄｏ
ｌＶ ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、 ７ 、 １５１３〜１５２３ （１９７９）
により概述された迅速プラスミド抽出法と単離されたＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼＰｓｔ−・Ｉ−消化との組合
わせにより大きい挿入部を有するプラスミドに対してふ
るい分けした。
ｌＶ ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｈ、 ７ 、 １５１３〜１５２３ （１９７９）
により概述された迅速プラスミド抽出法と単離されたＤ
ＮＡのエンドヌクレアーゼＰｓｔ−・Ｉ−消化との組合
わせにより大きい挿入部を有するプラスミドに対してふ
るい分けした。
６、 挿入部（Ｉ）の性質の決定
選ばれたクローンから１０μ９のプラスミドＤＮＡを単
離し、後にこれをジアゾ化（ＤＢＭ）紙円板に固定した
。固定化されたプラスミドＤＮＡ分子を、ＤＮＡＷ１入
部の性質を測定するため、ジエイ・ジー・ウィリアムス
（Ｊ、 Ｇ。
離し、後にこれをジアゾ化（ＤＢＭ）紙円板に固定した
。固定化されたプラスミドＤＮＡ分子を、ＤＮＡＷ１入
部の性質を測定するため、ジエイ・ジー・ウィリアムス
（Ｊ、 Ｇ。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ） 等、 Ｃｅ１ｌニー７、 ９０
３〜９１３（１９７９）に記述されているハイブリッド
形成／試験管内翻訳法に用いた。
３〜９１３（１９７９）に記述されているハイブリッド
形成／試験管内翻訳法に用いた。
ソーマチン挿入部のヌクレオチド配列分析はニー、エム
、マキサム（Ａ、 Ｈ，Ｈａｘａｉ ）およびダブリュ
ー、ギルバート（１４，Ｇ１１ｂｅｒｔ） 、Ｈｅ１ｔ
ｈＯｄＳ １ｎＥｎＺＶＩＯ１００Ｖ、編集者エル、グ
ロスマン（し。
、マキサム（Ａ、 Ｈ，Ｈａｘａｉ ）およびダブリュ
ー、ギルバート（１４，Ｇ１１ｂｅｒｔ） 、Ｈｅ１ｔ
ｈＯｄＳ １ｎＥｎＺＶＩＯ１００Ｖ、編集者エル、グ
ロスマン（し。
Ｇｒｏｓｓｍａｎ ）およびケイ、モルディプ（に、Ｈ
ｏ１ｄａｖｅ）、ニューヨーク、アカデミツク プレス
、１９８０年６５巻（１）、４９９〜５６０頁に概述さ
れた化学分解法により、またジエイ、マート（Ｊ、Ｈａ
ａｔ）およびニー、ジエイ、エッチ、スミス（Ａ、Ｊ、
Ｈ。
ｏ１ｄａｖｅ）、ニューヨーク、アカデミツク プレス
、１９８０年６５巻（１）、４９９〜５６０頁に概述さ
れた化学分解法により、またジエイ、マート（Ｊ、Ｈａ
ａｔ）およびニー、ジエイ、エッチ、スミス（Ａ、Ｊ、
Ｈ。
５１ｔｈ ） 、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ、 Ｍ 。
ｅａｒｃｈ、 Ｍ 。
４５３７〜４５４５ （１９７８）により概説されたジ
デオキシ／ニック翻訳法により行った。ソーマチンｍＲ
ＮＡのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報はデ
ィ、ジムマーン（Ｄ、 Ｚｉ−−ｅｒｎ ）およびビー
、カエスベルグ（Ｐ、にａｅｓｂｅｒｏ ＞、Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７
５ 、４２５７〜４２６１ （１９７８）により概説さ
れたように、連鎖停止阻害剤存在下に、ソーマチンｍＲ
ＮＡ鋳型上でのＡＭＶ−逆トランスクリブターゼによる
プライマー合成によって間接的に誘導された。このスク
リーニングにより、就中ソーマチンｍＲＮＡの殆ど完全
な複製を含むプラスミドｐＵＲ１００を得た。
デオキシ／ニック翻訳法により行った。ソーマチンｍＲ
ＮＡのヌクレオチド配列についてのこれ以上の情報はデ
ィ、ジムマーン（Ｄ、 Ｚｉ−−ｅｒｎ ）およびビー
、カエスベルグ（Ｐ、にａｅｓｂｅｒｏ ＞、Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、 ７
５ 、４２５７〜４２６１ （１９７８）により概説さ
れたように、連鎖停止阻害剤存在下に、ソーマチンｍＲ
ＮＡ鋳型上でのＡＭＶ−逆トランスクリブターゼによる
プライマー合成によって間接的に誘導された。このスク
リーニングにより、就中ソーマチンｍＲＮＡの殆ど完全
な複製を含むプラスミドｐＵＲ１００を得た。
ニーΦジエイφエッチ・スミス、Ｎｕｃｌｅｉｃ＾ｃｉ
ｄｓＲｅｓ、、 ６．８３１〜８４８ （１９７９）に
より概説されたＤＵＲｌｏｏのエキソヌクレアーゼ■処
理により、またはビー・グローネンボン（Ｂ、 ａｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎ ）およびジエイ壷メツシング（Ｊ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、ＭａｔｕｒｅＬＬ２．、、 ２７
５〜２７７（１９７８）により概説されたＭ１３におけ
るクローニングにより一本鎖ＤＮＡを得た。ソーマチン
ｍＲＮＡと同じ極性を有する一本鎖ＤＮＡを、プライマ
ーとして役立つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
（５°） ｐＴｃＡＧＧｃＡＧＴ＾ＧＧＧＣＡｏＨ（３
°）を用いる相補的ＤＮＡ合成のための鋳型として用い
た。二本鎖ＤＮＡの熱変性俊、化学的に合成さ的ＤＮＡ
がＤＮＡ合成のための鋳型として役立った。次にこの二
本鎖ＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理した。成熟ソーマ
チン遺伝子の組立てを第２図に示す。
ｄｓＲｅｓ、、 ６．８３１〜８４８ （１９７９）に
より概説されたＤＵＲｌｏｏのエキソヌクレアーゼ■処
理により、またはビー・グローネンボン（Ｂ、 ａｒｏ
ｎｅｎｂｏｒｎ ）およびジエイ壷メツシング（Ｊ、
Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、ＭａｔｕｒｅＬＬ２．、、 ２７
５〜２７７（１９７８）により概説されたＭ１３におけ
るクローニングにより一本鎖ＤＮＡを得た。ソーマチン
ｍＲＮＡと同じ極性を有する一本鎖ＤＮＡを、プライマ
ーとして役立つ化学的に合成されたオリゴヌクレオチド
（５°） ｐＴｃＡＧＧｃＡＧＴ＾ＧＧＧＣＡｏＨ（３
°）を用いる相補的ＤＮＡ合成のための鋳型として用い
た。二本鎖ＤＮＡの熱変性俊、化学的に合成さ的ＤＮＡ
がＤＮＡ合成のための鋳型として役立った。次にこの二
本鎖ＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理した。成熟ソーマ
チン遺伝子の組立てを第２図に示す。
９ａ、 プラスミド Ｕ ２０１の 立て二重ｌａｃ
レギユロン（ｌａｃ ＵＶ５）を包含する２８５塩基
対を含む断片をｐＫ８２６８の制限エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩ切断により得た〔ケイ・バックマン（に、Ｂ
ａｃｋｉａｎ ）およびエム・ブタシュン（Ｈ，Ｐｔａ
ｓｈｎｅ） 、Ｃｅ１ｌ上３．６５〜７１ （１９７８
））。この断片をｐＢＲ３２２ＤＮＡのＥｃｏＲ１部位
に連結した。右方向にｌａｃレギユロンを有するプラス
ミドＤＮＡ （第３図）をＥ、 ｃｏｌｉ ＲＮＡポリ
メラーゼの存在下ＥｃｏＲ１により部分的に切断した。
レギユロン（ｌａｃ ＵＶ５）を包含する２８５塩基
対を含む断片をｐＫ８２６８の制限エンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩ切断により得た〔ケイ・バックマン（に、Ｂ
ａｃｋｉａｎ ）およびエム・ブタシュン（Ｈ，Ｐｔａ
ｓｈｎｅ） 、Ｃｅ１ｌ上３．６５〜７１ （１９７８
））。この断片をｐＢＲ３２２ＤＮＡのＥｃｏＲ１部位
に連結した。右方向にｌａｃレギユロンを有するプラス
ミドＤＮＡ （第３図）をＥ、 ｃｏｌｉ ＲＮＡポリ
メラーゼの存在下ＥｃｏＲ１により部分的に切断した。
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄｎ［切断部位からち最
も遠いＥｃｏＲＩ切断部位が優先的に攻撃した。直線化
されたＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、アガロース
ゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡ−リガーゼによ
る連結により環状にし、その後Ｅ、 ｃｏｌｉの転換に
用いた。
も遠いＥｃｏＲＩ切断部位が優先的に攻撃した。直線化
されたＤＮＡを８１ヌクレアーゼで処理し、アガロース
ゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡ−リガーゼによ
る連結により環状にし、その後Ｅ、 ｃｏｌｉの転換に
用いた。
テトラサイクリン耐性転換体から正しい構造（第３図）
を有するｐＬＪＲ２０１を得た。
を有するｐＬＪＲ２０１を得た。
９ｂ、 プラスミドｐＵＲ３０１の組立て約５１０塩
基対のＤＮＡ断片が、ｐｔｒｐＥＤ５の制限エンドヌク
レアーゼ旧ｎｆ Ｉ切断により得た〔アール・ニー・ハ
ルジーウエル・（Ｒ，Ａ。
基対のＤＮＡ断片が、ｐｔｒｐＥＤ５の制限エンドヌク
レアーゼ旧ｎｆ Ｉ切断により得た〔アール・ニー・ハ
ルジーウエル・（Ｒ，Ａ。
Ｈａｌｌｅｗｅｌｌ ）およびニス・エムテージ（ｓ、
Ｅｇｉｔａｏｅ＋、Ｇｅｎｅ９，２７〜４７ （１９８
０））、この断片をＥ、 ｃｏｌｉ ＲＮ Ａポリメラ
ーゼの存在下制限エンドヌクレアーゼＴａｑ Ｉで切
断した。ｔｒｐレギユロンにおけるＴａｑ １部位〔
ケイ・パートランド（に、 Ｂｅｒｔｒａｎｄ ）等、
５ｉｅｎｃｅ１ Ｂ ９ 、２２〜２６ （１９７５）
およびエフ・リー（Ｆ、 Ｌｅｅ）等、Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、 １２１ 、１９３〜２１７（１９７８
）により記述〕を選択的に保護し、このようにしてｔｒ
ｐレギユロン（第１図）からなる２３４塩基対を含む断
片を得た。次にこの断片を８１ヌクレアーゼで処理し、
ＥｃｏＲＩリンカ−（５°） ｐＧＧＡＡＴＴＣＣｏ
ｌｌ（３°）で平滑末端を連結し、ＥｃｏＲＩで切断し
、その後ｐＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩ 一部位でクローニ
ングした。
Ｅｇｉｔａｏｅ＋、Ｇｅｎｅ９，２７〜４７ （１９８
０））、この断片をＥ、 ｃｏｌｉ ＲＮ Ａポリメラ
ーゼの存在下制限エンドヌクレアーゼＴａｑ Ｉで切
断した。ｔｒｐレギユロンにおけるＴａｑ １部位〔
ケイ・パートランド（に、 Ｂｅｒｔｒａｎｄ ）等、
５ｉｅｎｃｅ１ Ｂ ９ 、２２〜２６ （１９７５）
およびエフ・リー（Ｆ、 Ｌｅｅ）等、Ｊ、 Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ、 １２１ 、１９３〜２１７（１９７８
）により記述〕を選択的に保護し、このようにしてｔｒ
ｐレギユロン（第１図）からなる２３４塩基対を含む断
片を得た。次にこの断片を８１ヌクレアーゼで処理し、
ＥｃｏＲＩリンカ−（５°） ｐＧＧＡＡＴＴＣＣｏ
ｌｌ（３°）で平滑末端を連結し、ＥｃｏＲＩで切断し
、その後ｐＢＲ３２２のＥＣ０ＲＩ 一部位でクローニ
ングした。
正しい方向にあるｔ ｒ ｐレギユロンを有するプラス
ミドｐＵＲ３００（第１図）を単離した。
ミドｐＵＲ３００（第１図）を単離した。
Ｈｉｎｄｌｌ［部位から最も遠いＥｃｏＲＩ−切断部位
をエチジウムブＯミドの存在下ＥｃｏＲ１によるｐＵＲ
３００ＤＮＡの部分切断によりそして＄１ヌクレアーゼ
処理により除去した。線状ＤＮＡ分子をＴ４［）ＮＡリ
ガーゼにより再環化した。テトラサイクリン耐性転換体
から第１図に概説された構造をもつｐＵＲ３０１を得た
。
をエチジウムブＯミドの存在下ＥｃｏＲ１によるｐＵＲ
３００ＤＮＡの部分切断によりそして＄１ヌクレアーゼ
処理により除去した。線状ＤＮＡ分子をＴ４［）ＮＡリ
ガーゼにより再環化した。テトラサイクリン耐性転換体
から第１図に概説された構造をもつｐＵＲ３０１を得た
。
９ｃ、 プラスミド ＵＲ４０１の組立て２６９１！
Ｉ基対を含む断片（ＤＮＡ配列１１２８〜１３７９）を
制限エンドヌクレアーゼＴａｑｌおよびＨａｅ ＩＩ
Ｉを用いるＲＦ Ｍ１３ ＤＮＡ〔ピー・エム・ジ
ー・エフ・ブイ・ウェーぜンビーク（Ｐ、Ｈ，Ｇ、Ｆ、
Ｖ、 Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ）等、Ｇｅｎｅｌ １ 。
Ｉ基対を含む断片（ＤＮＡ配列１１２８〜１３７９）を
制限エンドヌクレアーゼＴａｑｌおよびＨａｅ ＩＩ
Ｉを用いるＲＦ Ｍ１３ ＤＮＡ〔ピー・エム・ジ
ー・エフ・ブイ・ウェーぜンビーク（Ｐ、Ｈ，Ｇ、Ｆ、
Ｖ、 Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ）等、Ｇｅｎｅｌ １ 。
１２９〜１４８ （１９８０））の消化により得、その
Ｔａｑ １部位をＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いる修復反応により平滑末端とし、断片をその後制
限酵素Ｍｎ１ｌで部分消化した。この部分的生成物を７
４ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ１ヌクレアーゼの連続作
用で処理し、その後ＥｃｏＲ１−リンカ−（５°）
ｐＧＧＡＡＴＴＣＣｏ、 （３°）で平滑末端を連結し
、次にＥｃｏＲｌで処理し、そしてｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲ１部位で連結した。制限酵素分析およびＤＮＡ配列
分析により、ＥｃｏＲＩ切断部位がＭ１３遺伝子■ＤＮ
Ａ配列のリポソーム結合部位を７度越えて位隨するプラ
スミドが得られた。本発明者等はＭ１３レギユロンを有
するプラスミド（ヌクレオチド１１２８からヌクレオチ
ド１２９１〜１２９７）が発現に適したレギユロンであ
ることを見出した。Ｈｉｎｄｕ［部位から最も遠いＥｃ
ｏＲｌ ｔＪ）断部位はｐＵＲ３０１に対して本質的に
記述したようにして除いた。ｐＵＲ４０１の完全な組立
てを第４図に示す。
Ｔａｑ １部位をＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
を用いる修復反応により平滑末端とし、断片をその後制
限酵素Ｍｎ１ｌで部分消化した。この部分的生成物を７
４ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ１ヌクレアーゼの連続作
用で処理し、その後ＥｃｏＲ１−リンカ−（５°）
ｐＧＧＡＡＴＴＣＣｏ、 （３°）で平滑末端を連結し
、次にＥｃｏＲｌで処理し、そしてｐＢＲ３２２のＥｃ
ｏＲ１部位で連結した。制限酵素分析およびＤＮＡ配列
分析により、ＥｃｏＲＩ切断部位がＭ１３遺伝子■ＤＮ
Ａ配列のリポソーム結合部位を７度越えて位隨するプラ
スミドが得られた。本発明者等はＭ１３レギユロンを有
するプラスミド（ヌクレオチド１１２８からヌクレオチ
ド１２９１〜１２９７）が発現に適したレギユロンであ
ることを見出した。Ｈｉｎｄｕ［部位から最も遠いＥｃ
ｏＲｌ ｔＪ）断部位はｐＵＲ３０１に対して本質的に
記述したようにして除いた。ｐＵＲ４０１の完全な組立
てを第４図に示す。
９ｄ、 リンカ−およびブライマーの ４オリゴ
デキシヌクレオチドの合成は５’ −０−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−３’−０−２゜２．２．−トリク
ロロエチル−２−クロロフェニルホスフェートをデオキ
シヌクレオシド−３′−０−２，２，２−トリクロロエ
チル−２−クロロフェニルホスフェートとのカップリン
グにより行なった。ホスホトリエステル法として知られ
るこの方法は（ジエイ・エフ・エム・ド・ルーイ（Ｊ。
デキシヌクレオチドの合成は５’ −０−レブリニルデ
オキシヌクレオシド−３’−０−２゜２．２．−トリク
ロロエチル−２−クロロフェニルホスフェートをデオキ
シヌクレオシド−３′−０−２，２，２−トリクロロエ
チル−２−クロロフェニルホスフェートとのカップリン
グにより行なった。ホスホトリエステル法として知られ
るこの方法は（ジエイ・エフ・エム・ド・ルーイ（Ｊ。
Ｆ、Ｈ，ｄｅ Ｒｏｏｉｊ ）等、Ｒｅｃｌ、 Ｔｒａ
ｖ、 Ｃｈｉｎ、 Ｐａｙｓ −Ｂａｓ ９８．５３７
〜５４Ｂ （１９７９）により記述）、活性亜鉛による
トリクロロエチル基の開裂除去とそれに続＜２．４．６
−ｔ−リイソブロピルベンゼンスルホニル−３−二トロ
ー１．２．４−トリアゾールにより実際のカップリング
反応を含む。デオキシアデノシン、デオキシシチジンお
よびデオキシグアノシンにおけるアミン基はそれぞれベ
ンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基およびベンゾイ
ル基により保護される。末端ヌクレオシド３′−ヒドロ
キシ基の保護にはベンゾイル基が用いられる。最後の工
程ですべての保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアン
モニウムおよび濃アンモニア水との反応により除去され
る。
ｖ、 Ｃｈｉｎ、 Ｐａｙｓ −Ｂａｓ ９８．５３７
〜５４Ｂ （１９７９）により記述）、活性亜鉛による
トリクロロエチル基の開裂除去とそれに続＜２．４．６
−ｔ−リイソブロピルベンゼンスルホニル−３−二トロ
ー１．２．４−トリアゾールにより実際のカップリング
反応を含む。デオキシアデノシン、デオキシシチジンお
よびデオキシグアノシンにおけるアミン基はそれぞれベ
ンゾイル基、４−メトキシベンゾイル基およびベンゾイ
ル基により保護される。末端ヌクレオシド３′−ヒドロ
キシ基の保護にはベンゾイル基が用いられる。最後の工
程ですべての保護基はそれぞれフッ化テトラブチルアン
モニウムおよび濃アンモニア水との反応により除去され
る。
リンカ−（５°） ｐＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧｏＨ
（３°）の組立ての一例を第５図に示づ−０ ８に記載のソーマチンコード化ＤＮＡ断片を７４ＤＮＡ
リガーゼを用いて合成ＥＣ０ＲＩ−リンカ−（５°）
ｐＣＡＴ（Ｎ） ＧＡ＾ＴＴＣ（Ｎ’ ）
ＡＴＧｏ、、（３’）ｎ。
（３°）の組立ての一例を第５図に示づ−０ ８に記載のソーマチンコード化ＤＮＡ断片を７４ＤＮＡ
リガーゼを用いて合成ＥＣ０ＲＩ−リンカ−（５°）
ｐＣＡＴ（Ｎ） ＧＡ＾ＴＴＣ（Ｎ’ ）
ＡＴＧｏ、、（３’）ｎ。
により平滑末端を連結し、ＥｃｏＲＩで切断し、その後
プラスミドｐＵＲ２０１、ｐＵＲ３０１およびｐ Ｕ
Ｒ４，０１およびＥｃｏＲＩ−切断部位に連結し、第６
図に示したような方向でソーマチンコード化挿入部を有
する組換えプラスミドを、Ｅ、 ｃｏｌｉの形質転換お
よびテトラサイクリン耐性転換体の選択後に単離した。
プラスミドｐＵＲ２０１、ｐＵＲ３０１およびｐ Ｕ
Ｒ４，０１およびＥｃｏＲＩ−切断部位に連結し、第６
図に示したような方向でソーマチンコード化挿入部を有
する組換えプラスミドを、Ｅ、 ｃｏｌｉの形質転換お
よびテトラサイクリン耐性転換体の選択後に単離した。
上記プラスミドにおいて、化学的に合成されたリンカ−
に由来するＡＡＴＴ配列はエチジウムプロミドの存在化
ＥｃｏＲＩを用いるプラスミドの切断により削除でき、
線状部分はアガロースゲル電気泳動により単離し、Ｓ１
ヌクレアーゼで処理し、モしてＴ４リガーゼ作用により
再環化した。
に由来するＡＡＴＴ配列はエチジウムプロミドの存在化
ＥｃｏＲＩを用いるプラスミドの切断により削除でき、
線状部分はアガロースゲル電気泳動により単離し、Ｓ１
ヌクレアーゼで処理し、モしてＴ４リガーゼ作用により
再環化した。
ＡＡＴＴの欠失後に得たプラスミドを制限酵素分析によ
り検出した。
り検出した。
正しい方向と解読わく中にレギユロンと成熟ソーマヂン
遺伝子どの間のリンカ−にＡＡＴＴ配列を有する、ある
いは有しないプラスミドｐＵＲ５２０または１）ＵＲ５
３０またはｐＵＲ５４０を含むＥ、 ｃｏｌｉ細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養した。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するが、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これらの条件下でプラスミドｐＵＲ５２０または１）
ＵＲ５３０または１）ＵＲ５４０の何れかを含む細胞は
かなりな量の成熟ソーマチンを生産した。
遺伝子どの間のリンカ−にＡＡＴＴ配列を有する、ある
いは有しないプラスミドｐＵＲ５２０または１）ＵＲ５
３０またはｐＵＲ５４０を含むＥ、 ｃｏｌｉ細胞をそ
の発育に最適の条件下で培養した。これら培養条件は細
胞中に存在するプラスミドの型により変化するが、常に
選択圧を維持するため適当な抗生物質の存在下で行なう
。これらの条件下でプラスミドｐＵＲ５２０または１）
ＵＲ５３０または１）ＵＲ５４０の何れかを含む細胞は
かなりな量の成熟ソーマチンを生産した。
タンパク質ソーマヂンの存在は、定性的にはＳ、 Ｄ、
Ｓ、電気泳動によりまた甘味に関する生理学的試験に
より、そして定量的には酵素結合した免疫吸収剤分析（
ＥＬＩＳＡ）により実証された。
Ｓ、電気泳動によりまた甘味に関する生理学的試験に
より、そして定量的には酵素結合した免疫吸収剤分析（
ＥＬＩＳＡ）により実証された。
次のプラスミドを含有するＥ、 ｃｏｌｉ菌体はＡＴＣ
Ｃに寄託されている。
Ｃに寄託されている。
ｐＵＲ５２０−ＡＴＣＣ３９０１４
ｐＵＲ５３０−ＡＴＣＣ３９０１３
第１図はＤＵＲ３０１への転換とその構造を示した図で
あり、第２図は成熟ソーマチンをコードするＤＮＡ配列
の組立てを示し、第３図は１）ＵＲ２０１の構造を示し
、第４図はプラスミドｐＵＲ４、０１の完全な組立てを
示し、第５図はＤＮＡリンカ−の組立てを示し、第６図
はプラスミドｐＵＲ５２０，１）ＵＲ５３０およびｐＵ
Ｒ５４０の組立てを示す。
あり、第２図は成熟ソーマチンをコードするＤＮＡ配列
の組立てを示し、第３図は１）ＵＲ２０１の構造を示し
、第４図はプラスミドｐＵＲ４、０１の完全な組立てを
示し、第５図はＤＮＡリンカ−の組立てを示し、第６図
はプラスミドｐＵＲ５２０，１）ＵＲ５３０およびｐＵ
Ｒ５４０の組立てを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）Ａ）下式のＤＮＡ配列： 【ＤＮＡ配列があります】 に記載のソーマチンをコードするＤＮＡ配列、および下
式の各種対立変異型ソーマチン遺伝子：▲数式、化学式
、表等があります▼（この変異体は上記ｉ）に示した式
と実質的に同じであるが、１３８位のヌクレオチド「Ｇ
」はヌクレオチド「Ｃ」と置換されているか又は１８７
位のヌクレオチド「Ｃ」はヌクレオチド「Ａ」と、又は
１９９−２００位のヌクレオチド「ＣＧ」はヌクレオチ
ド「ＡＡ」と、又は２２７位のヌクレオチド「Ａ」はヌ
クレオチド「Ｇ」と、又は３３７位のヌクレオチド「Ｇ
」はヌクレオチド「Ａ」と置換されているか、あるいは
これらの置換の２つ以上の組み合わせである）に記載の
各種対立変異型ソーマチンをコードするＤＮＡ配列およ
びこの配列の発現を調節する誘導可能な又は構成的なレ
ギユロンから成る組換えプラスミドをＣａＣｌ＿２−処
理Ｅ．ｃｏｌｉ細胞含有培地に添加して、Ｅ．ｃｏｌｉ
細胞に導入し、その後プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ細胞に
より取り出し（形質転換）、 Ｂ）形質転換したＥ．ｃｏｌｉをその最適生育条件下、
例えば生育促進化合物に富んだ培地中、アンピシリン又
はテトラサイクリン等の抗生物質の選択的圧力下、ある
いはトリプトファン又はヒスチジンンの不存在下の如き
生育制限因子下培養し、ついで Ｃ）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を分解し、この細胞により生産さ
れるソーマチンをタン白分離法例えば免疫学的操作又は
イオン交換クロマトグラフィ法により単離することを特
徴とする、ソーマチンの製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8039855 | 1980-12-12 | ||
| GB8039855 | 1980-12-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6143996A true JPS6143996A (ja) | 1986-03-03 |
| JPH0441999B2 JPH0441999B2 (ja) | 1992-07-10 |
Family
ID=10517943
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56200803A Granted JPS584799A (ja) | 1980-12-12 | 1981-12-12 | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 |
| JP60140090A Granted JPS6143996A (ja) | 1980-12-12 | 1985-06-26 | ソ−マチンの製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56200803A Granted JPS584799A (ja) | 1980-12-12 | 1981-12-12 | 成熟ソ−マチンの遺伝暗号を有するｄｎａ配列 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4891316A (ja) |
| EP (1) | EP0054330B1 (ja) |
| JP (2) | JPS584799A (ja) |
| AT (1) | ATE22327T1 (ja) |
| BR (1) | BR8108074A (ja) |
| CA (1) | CA1192151A (ja) |
| DE (1) | DE3175357D1 (ja) |
| IE (1) | IE52417B1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) * | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| DK489481A (da) * | 1980-11-10 | 1982-05-11 | Searle & Co | Plasmidvektor og frmgangsmaade til fremstilling deraf |
| US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
| BR8205954A (pt) * | 1981-10-14 | 1983-09-13 | Unilever Nv | Sequencia de dna,plasmidio recombinante,cultura bacteriana e microorganismos |
| IE55817B1 (en) | 1982-05-19 | 1991-01-30 | Gist Brocades Nv | Cloning system for kluyveromyces species |
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