KR20020036665A

KR20020036665A - 한쪽방향성의 단일가닥 디엔에이 절편들을 이용하는재조합 디엔에이 라이브러리의 제조방법

Info

Publication number: KR20020036665A
Application number: KR1020010041549A
Authority: KR
Inventors: 이시형; 신용철; 전영중; 정경화; 류은정; 이고운
Original assignee: 양동수; 아미코젠주식회사
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2001-07-11
Publication date: 2002-05-16
Also published as: KR100446417B1; US20030152943A1; US6955879B2; JP3777158B2; AU2001274635A1; WO2002038757A1; JP2004513633A

Abstract

본 발명은 한쪽방향성을 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들을 중합효소 연쇄반응의 주형으로 이용하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제조방법 및 이를 이용한 재조합 DNA 라이브러리의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두 종류 이상의 상동성 폴리뉴클레오티드로부터 한쪽방향성을 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들의 풀(pool)을 제조하고, 상기 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들을 주형으로 하고 특정 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 이용하여 여러 주기의 연장 반응을 포함하는 중합 반응을 수행함으로써 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 적어도 하나의 시발물질을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 상기의 재조합 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계들을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제조 방법; 및 상기 방법으로 제조한 재조합 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하고, 제조된 벡터로 발현세포를 형질전환시켜 다수의 변이체 클론을 제조하는 것을 포함하는 재조합 DNA 라이브러리의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법들은 두 종류 이상의 상동성 있는 폴리뉴클레오티드 간에 무작위적인 재조합이 가능하여, 유전자 수준에서 활성이 증가 또는 변형되거나 새로운 기능을 갖는 다양한 돌연변이 단백질을 암호화하는 돌연변이 재조합 DNA를 시험관 내에서 제조할 수 있기 때문에 신규한 유전자의 제조 또는 목적 유전자의 선별 등에 효과적으로 이용할 수 있다.

Description

한쪽방향성의 단일가닥 디엔에이 절편들을 이용하는 재조합 디엔에이 라이브러리의 제조방법{METHOD FOR GENERATING RECOMBINANT DNA LIBRARY USING UNIDIRECTIONAL SINGLE-STRANDED DNA FRAGMENTS}

본 발명은 돌연변이 단백질을 코드하는 재조합 DNA의 풀(pool)을 제조하는 방법 및 이를 포함하는 재조합 DNA 라이브러리에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 이용하면 시험관내(in vitro) 재조합에 의해 의도대로 단백질을 진화시킬 수 있다.

생체내의 유전정보는 궁극적으로 단백질을 만들게 함으로써 그 대부분의 기능을 수행하게 된다. 즉, 단백질은 생물체 세포나 조직 내에서 아주 정교한 특이성을 가지고 모든 생화학반응을 일으키고 조절하며, 세포나 조직을 구성하는 성분역할을 하고 있다. 이러한 생체 고분자 화합물인 단백질은 20종류의 아미노산으로 구성된 중합물로서 단백질의 1차, 2차 구조와 더불어 공간상의 입체 형태를 이루는 3차, 4차 구조에 의해 독특한 기능이 결정된다. 특히, 유전자 염기서열에 의해 암호화되는 단백질의 1차구조인 아미노산 서열자체가 단백질의 구조와 기능에 대한정보를 함유하고 있다. 따라서 개개의 아미노산 서열상의 변이는 단백질의 구조와 기능을 포함한 여러 가지 정보를 변화시킬 수 있다(Shao, Z. and Arnold F. H.,Curr. Opin. Sturct. Biol.,6: 513-518 (1996)).

생물체의 다양성은 DNA 또는 RNA에 코드된 유전정보의 다양성을 반영한다. 자연계에서 유전정보는 돌연변이, 유성생식 및 자연선택을 포함하는 자연적 진화 과정에 의해 서서히 그리고 지속적으로 변화한다. 예를 들어, 유성생식시 감수분열(meiosis)동안 두 개체로부터 유래된 상동염색체(homologous chromosome) 사이에 상동성 재조합(homologous recombination)이 일어날 수 있는데 이때 유전물질이 무작위적으로 교환되고 이러한 재조합 유전자는 생물이 더욱 빠르게 진화할 수 있는 기회를 제공하게 된다. 하지만 자연계에서 이런 형태의 진화는, 부분적으로는 이것이 너무 우연히 일어나므로, 오랜 시간을 거쳐 느리게 진행된다. 따라서, 시험관내(in vitro) 돌연변이유발 및 적절한 선별기법을 함께 사용하여 원하는 목적으로 진화된 유전자 및 변이단백질을 단기간에 얻기 위해 많은 노력을 기울여왔다(Eigen, M.,Naturwissenschaften,58: 465-523 (1971); Brady, R.M.,Nature,317: 804-806 (1985); 및 Pal, K.F.,Bio. Cybern.,69: 539-546 (1993)).

유전자를 조작하여 변이단백질을 얻어내는 기술로 현재 가장 많이 이용되는 것이 시험관내에서 수행하는 올리고뉴클레오티드를 이용한 부위특이 돌연변이 기법(oligonucleotide-directed site-specific mutagenesis)(Sambrook, J.et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y.)이다. 상기 기법은 돌연변이 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 이용해서 DNA상의 특정 부위를 치환시킬 수 있어 정확히 원하는 부위에 DNA 변형을 일으킬 수 있기 때문에 이로부터 특정 아미노산이 변화된 새로운 변이단백질을 합성할 수 있는 기술이다. 그러나, 이 방법은 치환시키고자 하는 단백질 특정부위의 구조나 기능 등에 대한 정보를 미리 알아야 한다는 점 때문에 제한적으로 이용되고 있다.

현재 라이브러리 형태로 DNA상에서 돌연변이를 만드는 방법으로 에러 유발성 중합효소 연쇄반응(error-prone PCR)(Leung, D. W.et al.,Technique,1: 11-15, (1989); 및 Caldwell, R.C. and Joyce, G.F.,PCR Methods and Applications,2: 28-33 (1992))이 많이 이용되고 있다. 이 방법은 중합반응시 반응조건을 조절함으로써 중합효소의 중합반응 에러율을 변화시켜 돌연변이 라이브러리를 만드는 것이다. 하지만 이 방법은 중합효소의 낮은 진행성(low processivity) 때문에 많은 제약을 받고 있으며 또한 짧은 길이의 DNA 부위 안에서 다수의 돌연변이들이 함께 일어날 빈도가 낮아서 다중 돌연변이(multiple mutation)를 유발시키기에 충분하지 못하다는 단점을 가지고 있다.

한편, 상동성 있는 유전자들을 뒤섞어 수많은 유전자 재조합체를 만들고, 이로부터 다양한 돌연변이 DNA 라이브러리를 구축하는 기술이 개발되었다. 이러한 기존의 기술로서 맥시젠(Maxygen)사의 DNA 셔플링(DNA Shuffling) 기법(미국 특허 제5,605,793호, 제6,117,679호, 제6,132,970호)과 디벌사(Diversa Corporation)사의 유전자 재결합(GeneReassembly) 기법(미국 특허 제5,965,408호), 아놀드(Frances H. Arnold)의 재조합 기법(미국 특허 제6,153,410호) 등이 있다.

맥시젠의 DNA 셔플링 기법(미국 특허 제5,605,793호, 제6,117,679호 및 제6,132,970호; Stemmer, W. P. C.,Nature,370: 389-391 (1994); 및 Stemmer, W. P. C.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,91: 10747-10751 (1994))은 재조합하고자 하는 적어도 한 종류 이상의 이중가닥 DNA를 더 작은 절편으로 절단하고 이들 절편을 모아서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행했을 때 이종간의 상동성을 갖는 절편들이 서로 접합(annealing)한 후 부분적으로 접합된 DNA 절편(overlapping segments)들이 만들어지고 이때 각각의 DNA 가닥은 주형(template)이자 시발물질(primer)로 작용하여 DNA 합성이 일어남으로써 무작위적인 재조합 DNA 라이브러리를 만들 수 있는 기법이다. 그러나, 상기 방법은 DNA 절편들을 만들기 위해 비교적 많은 양의 DNA가 필요하며, 절단시 대개의 경우 DNA 절단효소 I (DNase I)를 이용하기 때문에 다음과정에서 DNase I을 제거해야 하며, 또한 DNase I의 경우 주로 퓨린 염기보다는 피리미딘 염기를 가지는 뉴클레오티드 잔기의 3'-말단 포스포다이에스테르 결합을 더 잘 절단하므로 완전히 무작위적인 DNA 절편들의 풀을 얻기 어렵다는 단점을 가지고 있다(Shao, Z.et al.,Nucleic Acids Res.,26:681-683 (1998)).

디벌사의 유전자 재결합(Gene Reassembly) (미국특허 제5,965,408호) 기법은 재조합하고자 하는 적어도 한 종류 이상의 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 시키고 여기서 만들어진 부분 합성된 절편들을 모아서 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 무작위적인 재조합 DNA 라이브러리를 만드는 기법이다. 상기 방법에서 부분 합성된 DNA 절편들은 폴리뉴클레오티드에 자외선이나 DNA 결합 혹은 반응 물질을 처리하여 이들 DNA를 주형으로 이용한 DNA 중합반응시 중합반응을 정지시킴으로써 얻어지게 된다. 그러나 이 방법에서 이용되는 자외선이나 DNA 결합물질들은 인체에 해로운 돌연변이 유발물질로서 사용에 주의를 기해야 하며 무작위적인 작은 크기의 DNA 절편을 만들기 위해서는 중합반응 정지물질의 적합한 처리조건을 찾아야만 하는 번거로움이 수반될 뿐만 아니라, 자외선을 이용하는 경우 DNA상에서 피리미딘 염기가 연이어 존재하는 경우 피리미딘 이중체(pyrimidine dimer)-대개의 경우는 티미딘 이중체(TT dimer)-를 만들기 때문에 중합반응이 이들 피리미딘 이중체에서 끝나는 빈도가 높으므로 DNA 절편들이 완전히 무작위적으로는 만들어지지 않는 단점도 가지고 있다.

DNA 셔플링(shuffling) 및 유전자 재결합(GeneReassembly)기법은 모두 반응물에서 부분적으로 접합되는 DNA 절편(overlapping segments)들이 형성되는 것이 필수조건이고, 이때 재조합될 출발 DNA로부터 유래된 각각의 DNA 가닥은 중합반응시 주형이자 시발물질로써 작용하는 특징이 있다.

아놀드의 StEP(staggered extension process)(미국 특허 제6,153,410호; Zhao, H.et al.,Nat. Biotechnol., 16: 258-261 (1998); 및 Encell, L. P. and Loeb, L. A.,Nature Biotech., 16: 234-235 (1998))은 재조합하고자 하는 타겟 이중가닥 DNA들을 한 시험관에 넣고 여기에 무작위적 또는 특정 시발물질(primers)을 넣은 후 중합효소 연쇄반응(PCR)을 할 때 반응조건을 조절하여 각 주기마다 시발물질로부터 부분 신장된 DNA 절편들이 만들어지고 이들이 계속되는 중합효소 연쇄반응동안 주형교환(template switching)을 통해서 유전자들간의 재조합을 이룩하는 기법이다. 중합효소 반응시 염기서열이 다른 타겟 DNA에는 각기 특정한 중합지연부위(sequence-specific pause sites)가 존재한다. 따라서 이 기법을 이용할 때 각기 다른 주형 DNA의 동일부위에 시발물질이 접합한다고 하더라도 시발물질로부터 비롯되어 신장되어 나오는 DNA 절편들의 신장속도가 서로 다르기 때문에 DNA 절편들이 완전히 무작위적으로는 만들어지지 않는 결점을 가지고 있다(Encell, L. P. and Loeb, L. A.,Nature Biotech., 16: 234-235 (1998)). 또한 StEP에서는 프라이머의 부분 신장으로부터 짧은 DNA 절편들을 만들기 위해서 중합반응의 시간을 줄이고 온도를 낮춤으로써 PCR 조건을 엄격히 조절해야 하는 단점이 있다. 또한 DNA 중합효소의 중합속도를 떨어뜨리기 위해서 온도를 과도하게 낮출 경우 비특이적 접합(non-specific annealing)이 일어나 불필요한 재조합체가 생겨날 수 있는 문제점이 있다.

상기한 방법들의 결점을 보완 혹은 제거하면서 두 종류 이상의 폴리뉴클레오티드들 사이에 무작위적인 재조합 라이브러리를 구축할 수 있는 기법은 유용한 돌연변이 단백질을 만드는데 있어 매우 중요한 수단이 될 것이다.

본 발명은 두 종류 이상의 DNA 가닥 사이의 시험관내(in vitro) 재조합 방법에 관한 것으로, 이는 한쪽방향성을 갖는 단일가닥 DNA 절편들을 제조하고, 상기 DNA 절편들을 특정 프라이머와 혼합한 후 중합반응을 수행하고, 추가로 상기 단계들을 반복함으로써 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다.

본 발명의 목적은 두 종류 이상의 폴리뉴클레오티드 사이의 무작위적인 재조합을 통해 다양한 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 삽입한 발현벡터를 발현세포에 도입하여 복수의 돌연변이 클론을 제조하는 것을 포함하는 재조합 DNA 라이브러리의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 기능적 특성을 갖는 재조합 폴리뉴클레오티드를 선발함으로써 개선된 돌연변이 유전자를 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기와 같은 단계를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제조방법이 제공된다:

(a) 재조합시키고자 하는 한 종류 이상의 상동성있는 출발 폴리뉴클레오티드로부터 다양한 길이를 갖는 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들의 풀(pool)을 제조하는 단계;

(b) 복수의 주기적인 연장 반응을 포함하는 중합과정을 수행하는 단계로서,

단계 (a)에서 제조된 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들이 순차적으로 주형으로 작용하고, 여기에 특정 올리고뉴클레오티드가 시발물질로서 첨가되며, 이 프라이머들이 주형교환(template switching)을 통해 연장되어 적어도 한 종류 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 생산하고, 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드는 출발 폴리뉴클레오티드와 염기서열이 상이한 것을 특징으로 하는 단계; 및

(c) 한 종류 이상의 특정 시발물질을 사용하여 상기 (b) 단계에서 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 연쇄중합반응을 수행하는 단계.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법에 의해 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 이 재조합 벡터를 발현세포에 도입하여 복수의 돌연변이 클론을 제조하는 단계를 포함하는 재조합 DNA 라이브러리의 제조 방법이 제공된다.

상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 방법에 의해 제조된 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 기능적 특성을 지닌 재조합 폴리뉴클레오티드를 선발하는 과정을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 원하는 성질을 갖도록 진화시키는 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 원리인 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들을 중합효소 연쇄반응의 주형으로 이용하는 재조합 DNA 라이브러리 제조방법을 도식적으로 나타낸 그림이다.

도 2는 본 발명을 구체화하기 위해 실험에 이용된 세라티아 리큐파션스 키티나아제 유전자(l-chi)(서열번호: 1)와 세라티아 마르세센스 키티나아제 유전자(m-chi)(서열번호: 2)의 염기서열을 서로 배열한 것이다(배열된 두 유전자들 사이에서 서로 동일하지 않은 염기부위는 소문자로 표시하였다).

도 3은 1 % 아가로우스 젤 전기영동 결과로서, (a)의 레인 1은 표준 DNA 크기 표지(위로부터 23, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.5 kb), 레인 2는 세라티아 마르세센스 키티나아제 유전자의 체외전사 반응물, 레인 3은 세라티아 리큐파션스 키티나아제 유전자의 체외전사 반응물; (b)의 레인 1은 표준 DNA 크기 표지(위로부터 23, 9.4, 6.6, 4.4, 2.3, 2.0, 0.5 kb), 레인 2는 역전사 반응을 통해 만들어진 단일가닥 DNA 절편들; (c)의 레인 1은 표준 DNA 크기 표지(위로부터 23, 9.4, 6.6,4.4, 2.3, 2.0, 0.5 kb), 레인 2는 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들을 주형으로 한 중합효소 연쇄반응 결과물이다.

도 4는 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 DNA 라이브러리로부터 14 개의 클론을 무작위적으로 선택하여 플라스미드 DNA를 추출한 후 제한효소인NotI,PstI,HincII를 함께 처리하여 절단한 반응물을 1% 아가로우스 젤 전기영동한 결과로서, 레인 1은 표준 DNA 크기 표지이고, 레인 2 내지 15는 무작위적으로 선택한 14개의 클론으로부터 추출한 플라스미드 DNA의 제한효소 절단 반응물이다.

도 5a 내지 5e는 본 발명의 방법에 의해 제조된 재조합 DNA 라이브러리로부터 10 개의 클론을 무작위적으로 선택하여 돌연변이 재조합 DNA 염기서열(서열번호: 3 내지 12)을 두 야생형 유전자, 즉,l-chi유전자(서열번호: 1) 및m-chi유전자(서열번호: 2)의 염기서열과 비교한 것이다.

도 6은 도 5의 돌연변이 재조합체 DNA를 두 야생형 키티나아제 유전자와 비교하여 간략하게 도식화한 것이다.

도 7은 앰피실린 100 ㎍/ml 및 팽윤된 키틴(swollen chitin) 0.5%를 함유하는 LB-한천(agar) 배지에서 키티나아제 재조합 유전자들을 발현하는 각 콜로니들의 키틴 분해능의 차이에 따른 투명환의(clear zone) 차이를 보여주는 사진이다.

도 8a 및 8b는 R-24 키티나아제 유전자의 염기서열(서열번호: 13)을 두 야생형 유전자, 즉,l-chi유전자(서열번호: 1) 및m-chi유전자(서열번호: 2)의 염기서열과 비교한 것이다.

도 9는 R-24 키티나아제 유전자를 두 야생형 키티나아제 유전자와 비교하여간략하게 도식화한 것이다

도 10은 바실러스 속 KCTC 0377에서 유래한 야생형 키토산아제 유전자의 염기서열(서열번호: 14)과 M-13 변이체(서열번호: 15), M-20 변이체(서열번호: 16)의 염기서열을 비교한 것이다.

도 11은 바실러스 속 KCTC 0377BP에서 유래한 야생형 키토산아제와 변이체 M-13 및 M-20의 열안정성의 차이를 보이는 그래프이다.

본 발명자들은 상기한 종래 기술의 단점을 보완 또는 대체할 수 있는 새로운 기법을 연구 시험한 결과, 종래의 기술과는 상이한 원리에 의하여 무작위성을 향상시켜 다양한 재조합 DNA를 보다 쉽게 수득할 수 있는 새로운 재조합 DNA 라이브러리 제조방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기한 맥시젠사의 DNA 셔플링 방법(미국 특허 제5,605,793호, 제6,117,679호, 제6,132,970호)과 디벌사의 유전자 재결합 기법(미국 특허 제5,965,408호)은 공통적으로 재조합을 유도하고자 하는 두 종류 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 얻어진 이중 가닥 DNA 절편들이 중합효소 연쇄반응동안 단일가닥으로 변형된 부분적으로 접합되는 DNA 절편들(overlapping segments)을 형성하여 중합효소 연쇄반응(미국 특허 제4,683,202호 및 제4,683,195호)에서 뉴클레오티드 합성을 위한주형(template)인 동시에 시발물질(primer)로 이용되고 매회의 동일한 형태의 중합반응을 거쳐 길이가 신장된다는 특징이 있다. 이와 대조적으로, 본 발명의 방법은 재조합을 유도하고자 하는 적어도 한 종류 이상의 폴리뉴클레오티드에서 유래된 한쪽방향성의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들을 사용하기 때문에 이들 사이에는 부분적으로 접합되는 DNA 절편(overlapping segments)이 만들어지지 않고 이들은 오직 주형으로만 이용되며, 시발물질로 첨가한 올리고뉴클레오티드만 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편을 주형으로 삼아 한쪽방향성을 가지고 순차적으로 신장되며 이 과정에서 주형 바꾸기(template switching)에 의해서 재조합이 도입되는 특징이 있기 때문에 종래 기술과는 재조합 DNA를 제조하는 방법에 있어서 근본적인 차이점이 존재한다. 또한 아놀드의 StEP방법(미국 특허 제6,153,410호)이 이중가닥의 타겟 DNA를 주형으로 삼아 부분신장된 DNA 절편들을 만들기 위해 온도와 반응시간을 조절하는 엄격한 조건을 이용하는 것과는 달리, 본 발명에서는 단일가닥 DNA 절편들이 주형으로 이용되기 때문에 통상의 중합반응 조건을 이용하여 주형 DNA 절편의 크기만큼 신장된 DNA 절편을 얻을 수 있으며, 또한 특정 중합지연부위(sequence-specific pause sites)에서 중합효소의 신장속도가 지연되는 것에 영향을 받지 않으므로 무작위성을 크게 향상시킬 수 있다.

본 발명의 돌연변이 재조합 폴리뉴클레오티드 제조방법은 상동성이 있는 한 종류 이상의 유전자의 일부를 교환하여 다양한 재조합 유전자군을 제조할 수 있는 방법을 제공하며, 하기와 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다;

이때, 상기 (b)단계의 중합반응에서 시발물질인 올리고뉴클레오티드로부터 부분적으로 신장된 DNA 절편들이 다음 단계에서 다른 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 주형 DNA와 접합하여 중합반응이 일어나면 서로 다른 상동유전자로부터 유래된 서열이 하나의 폴리뉴클레오티드내에 존재하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 만들게 된다. 이러한 PCR 과정을 계속적으로 반복하게 되면 최종적으로는 도 1에서처럼 유전자 A 및 유전자 B의 염기서열이 무작위적으로 재조합된 다양한 재조합 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같이 제조된 돌연변이 재조합 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 이 재조합 벡터를 발현세포에 도입하여 복수의 돌연변이 클론을 제조하는 단계를 포함하는 재조합 DNA 라이브러리의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 방법으로 구축된 다양한 재조합 DNA 라이브러리로부터 적절한 방법으로 유용한 유전자를 선별할 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상기 방법에 의해 제조된 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 기능적 특성을 지닌 재조합 폴리뉴클레오티드를 선발하는 과정을 포함하는, 개선된 돌연변이 유전자를 동정하는 방법이 제공된다.

본 발명은 두 가지 이상의 유전물질 사이에 무작위적인 재조합을 통해 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 시험관 내에서 무작위적 재조합에 의해 다양한 종류의 재조합 유전자를 합성할 수 있으며, 이를 적당한 발현벡터 및 숙주세포를 이용하여 제작한 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 클론을 선별하고 발현시킴으로써 원하는 목적의 신규한 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편(unidirectional single-stranded DNA fragments)"은 상보적 수소결합을 형성할 수 있는 역평형 (antiparallel) 관계가 아닌, 상보적으로 서로 결합할 수 없는 평행(parallel) 관계에 있으므로 서로 섞어도 상보적인 접합을 할 수 없음을 의미한다. 예컨대 이중가닥 DNA의 전체 염기서열이

5'-AGGTCCAGTTAGCATTCGGAAAGGCCGTTTGAGAGAG-3' (서열번호: 17)

3'-TCCAGGTCAATCGTAAGCCTTTCCGGCAAACTCTCTC-5' (서열번호: 18)

이라고 할 때 이러한 DNA로부터 유래된 3'-TCCAGGTCAATCGTAAG-5'(서열번호:19), 3'-AAACTCTCTC-5'(서열번호: 20), 3'-TTTCCGGCAAACTCTCTC-5'(서열번호: 21), 3'-CCTTTCCGGCAAACTCTCTC-5'(서열번호: 22), 3'-TCAATCGTAAGCCTTTCCGGCAAACTCTCT C-5'(서열번호: 23) 등의 단일가닥 DNA들은 한쪽방향성만을 갖는다고 할 수 있다. 본 발명에서 중합효소 연쇄반응의 주형으로만 이용되는 이들 한쪽방향성의 단일가닥 DNA는 재조합시키고자하는 폴리뉴클레오티드의 크기에 따라 다양한 길이로 만들어 질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "재조합 DNA(recombinant DNA)"는 "동일하지는 않지만 실질적으로 상동성이 있는 염기서열을 갖는 두 종류 이상의 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 한 분자 내에 조합적으로 포함하여, 염기서열 모자이크를 형성한 키메라 DNA(chimeric DNA)"를 의미한다(이 때, 키메라 DNA는 원래의 염기서열 영역 및 돌연변이된 염기서열 영역을 포함하게 된다). 본 발명의 방법을 사용하여 무작위적인 시험관내 DNA 재조합(in vitrorecombination)을 수행한 결과 합성된 이러한 재조합 DNA는 도 5 및 도 6에 잘 예시되어 있다. 본 발명의 방법에 의한 재조합 DNA는 유성생식시 감수분열 과정에서 상동성 염색체간의 교차에 의해 유전자 교환이 일어나 자연적으로 생성되는 재조합 DNA와는 달리, 시험관에서 상동성이 있는 DNA 가닥간의 무작위적 재조합에 의해 단기간 내에 다양한 염기서열을 갖도록 제조되어지며, 이는 벡터에 삽입되어 형질전환된 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 이로부터 다양한 재조합 DNA를 포함하는 클론으로 구성된 재조합 DNA 라이브러리를 구축하고, 원하는 특성을 갖는 재조합 DNA를 선별할 수 있다. 이와 같이 시험관에서 상동성을 갖는 두 가지 이상의 DNA 사이에 무작위적인 재조합 DNA 라이브러리를 만들고 자연선택을 모방할 수 있는 선별기법을 가미하게 되면 원하는 목적으로 단시간에 진화된 유전자 또는 돌연변이 단백질을 얻을 수 있는 장점이 있다.

본 명세서에서 사용되는 "상동성을 갖는 또는 상동성 있는(homologous)"이란 하나의 단일가닥 핵산서열이 상보적인 단일가닥 핵산서열에 하이브리다이제이션 (hybridization)할 수 있음을 의미한다. 이 때, 하이브리다이제이션의 정도는 두 핵산서열의 동일하거나 유사한 정도, 온도 및 염 농도와 같은 하이브리다이제이션 수행조건 등을 포함하는 여러 인자들에 의해 좌우된다.

본 명세서에서 사용되는 "돌연변이(mutation)"란 원래의 핵산 염기서열의 변화 또는 이로부터 만들어지는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 변화된 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "DNA 라이브러리(DNA library)"는 두개 이상의 폴리뉴클레오티드로 이루어지고 무작위적인 재조합 방법에 의해 만들어지는 폴리뉴클레오티드 염기서열들의 세트 또는 재조합 DNA 절편들의 세트를 의미한다. 그렇기 때문에 DNA 라이브러리는 다양한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드들의 집합 또는 다양한 염기서열을 갖는 DNA 또는 클로닝된 DNA들의 총합, 또는 광의적으로는 이들 DNA를 포함하는 클론들의 집합까지도 포함한다. 이러한 DNA 라이브러리로부터 원하는 특성의 단백질을 암호화하는 재조합 DNA를 선별하여 단백질 발현에 활용할 수 있다.

본 발명은 보다 구체적으로 다음과 같은 단계에 의해 자연계에 존재하거나 인위적으로 만들어진 상동성을 갖는 두 종류 이상의 유전자 DNA로부터 무작위적으로 인위 돌연변이된 다양한 염기서열의 재조합 DNA를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 시험관내 DNA 재조합 방법을 도 1에 도시하였다.

제 1 단계 : 재조합하고자 하는 적어도 한 종류 이상의 상동적인 염기서열을 갖는 출발 폴리뉴클레오티드로부터 한쪽 방향성의 다양한 길이를 갖는 무작위적인 단일가닥 폴리뉴클레오티드(DNA) 절편들을 만든다(도 1의 1단계). 본 발명의 방법을 적용하기 위해 필요한 출발 폴리뉴클레오티드들의 염기서열 상동성은 50 % 이상일 수 있으며, 80 % 이상의 상동성을 갖는 출발 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 상동성있는 이종의 폴리뉴클레오티드로부터 각각 생산된 이들 단일가닥 DNA 절편들은 모두 동일한 한쪽 방향성만을 가지기 때문에 서로 상보적 수소결합을 형성할 수 있는 역평행 (antiparallel) 관계가 아닌, 상보적으로 접합할 수 없는 평행(parallel) 관계에 있으므로 서로 섞어도 상보적인 접합(annealing)을 하지 못한다.

본 발명에 사용되는 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들의 제조방법은 RNA로부터 역전사 반응을 이용하여 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들을 제조하는 방법, 순차적으로 한쪽방향이 절단된 단일가닥 DNA를 제조하는 방법 및 상보적인 단일가닥 DNA 주형으로부터 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들을 제조하는 방법등 여러 가지 기법에 의해 수득이 가능하다. RNA로부터 혹은 단일가닥 DNA로부터 한쪽방향성 DNA 절편들은 무작위성 시발물질(Feinberg, A. P. and Vogelstein, B.,Anal. Biochem.,132: 6-13 (1983))로부터 역전사효소(Gerard, G. F.et al.,Mol. Biotechnol.,8: 61-77 (1997)), 박테리오파아지 T4 DNA 중합효소(Nossal, N. G.,J. Biol. Chem.,249: 5668-5676 (1974)), 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소(Tabor, S. and Richardson, C. C.,J. Biol. Chem.,264: 6447-6458 (1989)), 클레노우(Klenow) 효소(Klenow, H. and Henningsen, I.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,65: 168 (1970)) 등을 이용하여 제조할 수 있다. 이때 무작위성 시발물질의 농도를 조절하거나 반응물에 적절한 농도의 다이데옥시뉴클레오타이드(2',3'-dideoxyadenosine 5'-triphosphate, 2',3'-dideoxyguanosine 5'-triphosphate, 2',3'-dideoxycytidine 5'-triphosphate, 2',3'-dideoxythymidine 5'-triphosphate)를 첨가하여 무작위성 시발물질로부터 순차적으로 길이가 신장된 단일가닥 DNA 절편들을 얻음으로써 단일가닥 DNA 절편들의 크기를 조절할 수 있다. 순차적으로 한쪽방향이 절단된 단일가닥 DNA는 단일가닥 DNA의 5' 말단에서부터 순차적으로 뉴클레오타이드를 절단할 수 있는 엑소뉴클레아제를 처리함으로써 얻을 수 있다.

보다 구체적으로, 상기의 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들은 다음의 방법들 중 어느 하나에 의해 제조할 수 있다:

(i) 적어도 한 종류의 출발 폴리뉴클레오티드로부터 RNA를 제조하기 위해 전사 과정을 수행하는 단계, 및 (ii) 무작위 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 하고 상기 (i)단계에서 얻어진 RNA 전사물을 주형으로 하여 역전사반응(reverse transcription)을 수행하는 단계를 포함하는 방법;

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 폴리뉴클레오티드의 두 말단중 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계,(ii) 상기 (i)단계의 반응 혼합물에 엑소뉴클레아제-Ⅲ를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제 Ⅲ의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조의 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계, (iii) 돌출된 5' 말단 구조를 갖는 상기 (ii)단계에서 생성된 이중가닥 폴리뉴클레오티드에 S1 뉴클리아제와 DNA 중합효소를 처리하여 평활(blunt) 말단을 갖도록 전환시키는 단계, (iv) (i)단계에서 돌출된 3' 말단 구조를 가졌던 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 동일한 말단을 새로운 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계, 및 (v) 상기 (iv)단계의 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여 이중가닥 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편을 제조하는 단계를 포함하는 방법;

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계, (ii) 상기 (i)단계에서 생성된 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계, 및 (iii) 무작위 프라이머를 사용하여 상기 (ii)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법;

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계, (ii) 상기 (i)단계에서 생성된 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계, 및 (iii) (ii)단계에서 얻어진 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 단일가닥 특이적 5'→3' 엑소뉴클레아제를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조를 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계를 포함하는 방법;

(i) 정방향(forward) 혹은 역방향(reverse) 중 한 종류의 올리고뉴클레오티드 시발물질만을 사용하여 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계, (ii) 생성된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 분리하는 단계, 및 (iii) 무작위 시발물질을 사용하여 상기 (ii)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법;

(i) 정방향(forward) 혹은 역방향(reverse) 중 한 종류의 올리고뉴클레오티드 시발물질만을 사용하여 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계, (ii) 생성된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 분리하는 단계, 및 (iii) (ii)단계에서 얻어진 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 단일가닥 특이적 5'→3' 엑소뉴클레아제를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조를 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계를 포함하는 방법; 및

(i) 적어도 한 종류 이상의 출발 폴리뉴클레오티드가 삽입된 바이러스 벡터나 플라스미드 벡터로부터 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 추출하는 단계, 및 (ii) 무작위 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 하여 상기 (i)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 일으키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 2 단계 : 본 발명의 방법의 두 번째 단계는 (i) 적어도 한 주기의 중합반응에서 시발물질이 주형으로 이용된 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편의 말단까지 중합반응을 통해 길이가 신장되는 단계; (ii) 다음에 계속되는 적어도 한 주기의 연쇄중합반응에서 (i)단계에서 신장된 각 폴리뉴클레오티드가 주형교환을 통해 (i)단계에서 사용된 주형 폴리뉴클레오티드 절편과는 다른 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편의 말단까지 길이가 더 신장되는 단계; 및 (iii) 목적하는 길이의 재조합 폴리뉴클레오티드가 얻어질 때까지 상기 (ii)단계를 반복하는 단계를 포함한다.

구체적으로는, 상기 제 1 단계에서 제조된 한쪽 방향성만을 갖는 다양한 길이의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 절편들을 섞은 다음, 여기에 상기 단일가닥에 상보적인 염기서열을 갖는 특정 올리고뉴클레오티드를 시발물질(primer)로서 넣은 다음 적당한 스트린전시(stringency)를 유지하면서 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하게되면 이들 올리고뉴클레오티드가 중합반응의 시발물질이 되어 매회의 반응을 거칠 때마다 점차 한쪽방향(5'→3')으로 길이가 신장되면서 재조합 반응이 일어난다. 합성되는 폴리뉴클레오티드들은 변성에 의해 단일가닥으로 분리되고 재접합(re-annealing)하게 되는데, 이때 상동성이 있는 서열을 갖는 다른 가닥의 폴리뉴클레오티드와 접합할 수 있다.

보다 구체적으로, 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 혼합군은 열에 의해 변성될 수 있으며, 이에 따른 중합효소 연쇄반응은 다음 3개의 과정으로 이루어진다; 우선 90℃∼98℃로 10초∼5분 정도 주형 DNA를 처리하여 이중가닥 DNA를 단일가닥으로분리한다(변성: denaturation). 그 후 온도를 내리면 사전에 첨가해 놓은 시발물질이 상보적인 주형 DNA 단일가닥에 상보적으로 결합한다(시발물질 접합: annealing). 이 과정은 40∼72℃에서 10초∼2분 정도 시행한다. 시발물질 접합 후 온도를 70℃∼78℃로 조정하면 반응액 중 dNTP 4종(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)이 반응하기 시작하여 주형 DNA와 상보적인 DNA가 신장 합성된다. 반응에 필요한 시간은 합성되는 DNA의 길이에 따라 달라진다.

이와 같은 방식으로 상동성있는 염기서열을 갖는 적어도 한 종류 이상의 폴리뉴클레오티드로부터 다양한 재조합 DNA를 생성하는 경우, 적어도 하나의 출발 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 하여 합성되는 폴리뉴클레오티드 절편들은 매 주기의 합성과정에서 주형으로 이용되는 단일가닥 DNA 절편의 5' 말단의 끝에서 합성을 멈추게되고, 다음 주기의 합성과정에서 이전 주기에 이용했던 주형 DNA 절편과는 출발 폴리뉴클레오티드가 다른 단일가닥 DNA 절편을 주형으로 이용하게 되면 이때 서로 다른 두 폴리뉴클레오티드 사이에 재조합 경계가 형성된다.

폴리뉴클레오티드 신장을 유도하는 제 2 단계에 있어서, 상기 제 1 단계에서 제조된 한쪽방향성의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들은 재조합 DNA를 만들기 위한 주형으로만 이용되므로 처음에 첨가한 시발물질이 이를 주형으로 반복적인 중합효소 연쇄반응에 의해 한쪽방향(5'→3')으로 길이가 점차적으로 신장되어 재조합 폴리뉴클레오티드가 생성된다.

제 2 단계에서, DNA 재조합은 DNA 중합효소 존재 하에서변성(denaturation), 접합(annealing) 및 신장(extension) 과정을 원하는 시간동안 주기적으로 반복함으로써 수행된다. 이때 재조합의 정도는 상이한 출발 폴리뉴클레오티드로부터 유래된 단일가닥 폴리뉴클레오티드군 간의 상동성(homology) 정도에 좌우된다.

제 3 단계 : 상기 제 2 단계의 PCR 과정을 충분히 반복한 후 생성된 돌연변이 재조합 폴리뉴클레오티드들을 정상적인 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭을 하게되면 이중가닥 재조합 DNA 라이브러리가 제조된다. 이렇게 만들어지는 재조합 DNA 라이브러리는 DNA 재조합 전 주형이 된 폴리뉴클레오티드와 동일(identical) 또는 이질적(heterogenous) 영역을 한 분자내에 혼합적으로 포함하는 다양한 종류의 돌연변이 재조합 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 재조합 DNA의 염기서열은 예컨대, 맥삼-길버트법 (Maxam, A. M. and Gilbert, W.,Mol. Biol.(Mosk) 20: 581-638 (1986)), 디데옥시법(Messing, J.et al.,Nucleic Acids Res.,24: 309-321(1981)), 또는 DNA 형광표지와 자동 DNA 염기서열 분석기를 이용하는 방법에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에서는 또한 상기 방법으로 제조된 재조합 DNA를 이용하여 원하는 유전자를 선별하기 위해 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 제 3 단계에서 제조된 이중가닥의 돌연변이 재조합 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하고, 상기 발현벡터를 발현세포에 도입하여 복수의 클론을 함유하는 라이브러리를 제조한 후, 이들 클론들로부터 원하는 폴리뉴클레오티드를 선별하고, 통상적인 기법에 의해 단백질을 발현한다. 적당한 발현방법으로는 세포내에서 유전자 생성물을 제조 또는 축적하는 것, 유전자 생성물을 세포 밖으로 분비시키고 이들을 배지내에 축적하는 것 및 유전자 생성물을 페리플라즘 속으로 분비하는 것 등이 포함된다. 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 산물을 스크리닝하기 위하여 당업계에 공지된 방법, 예컨대 면역화학법, 방사선화학법, 표면발현시스템을 이용한 스크리닝 방법 및 유전자 칩 탐색방법 등을 선택적 또는 조합적으로 이용할 수가 있다. 상기 재조합 DNA 라이브러리 제조에 있어서 발현벡터는 선택된 숙주내에서 작용하는 한 어떠한 벡터도 사용할 수 있는데, 예컨대 당업계에 공지된 통상적인 발현벡터인 파아지(phage), 플라스미드 (plasmid), 파아지미드(phagemid), 바이러스 벡터(viral vector), 인공염색체 (artificial chromosome) 등이 이용될 수 있다. 발현벡터를 구축하는 방법은 그 자체가 공지되어 있고, 예컨대 문헌(Sambrook, J.et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2 ^nd ed., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.)에 개시되어 있다. 그렇게 하여 제조된 발현벡터로 적당한 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 재조합 DNA의 적당한 발현세포로는 E. 콜라이, B. 서브틸리스, B. 브레비스 등과 같은 세균, 스트렙토마이세스 리비단스와 같은 방선균류, S. 세레비시애와 같은 효모, A. 오리자에, A. 니듈란스 및 A. 니거와 같은 곰팡이, COS-7, CHO, Vero, 생쥐 L 세포와 같은 동물세포, 곤충세포, 또는 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 방법은 관심있는 유전자 염기서열을 얻기 위하여, 무작위적으로 빠른 시간 내에 다양한 서열을 갖는 돌연변이 재조합 DNA를 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상동성이 있는 핵산서열 또는 폴리뉴클레오티드로부터 각각 합성한 동일한 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들 혼합물에 시발물질로 올리고뉴클레오티드를 첨가한 후 반복적인 중합효소연쇄반응을 수행하면 이들 단일가닥 절편 염기서열들이 무작위적으로 재조합된 돌연변이 재조합 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 수득할 수 있다.

본 발명 방법에 의해 제조되는 재조합 DNA는 효소, 항체, 백신(항원), 호르몬, 성장인자, 결합단백질, 혈장단백질 등과 같은 다양한 단백질 암호화 유전자일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 DNA는 효소를 암호화하는 것일 수 있으며, 상기 효소는 가수분해효소(hydrolase), 분해효소(lyase), 전달효소(transferase), 산화환원효소 (oxidoreductase), 연결효소(ligase) 및 이성화효소(isomerase)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 한 실시예에 있어서는, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 키티나아제 효소 유전자(서열번호: 1; 이하, "m-chi"라고 한다)와 세라티아 리큐파션스 (Serratia liquefaciens) 키티나아제 효소 유전자(서열번호: 2; 이하, "l-chi"라고 한다)들간의 무작위적인 재조합 돌연변이 유전자(재조합 DNA)를 제조하고, 이를 클로닝하여 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명 방법에 의해 약 10,000여개의 클론을 제조하였으며, 그 중 대표적으로 10개의 클론을 무작위 선별하여 재조합 DNA 염기서열을 결정하고 실험에 이용한 상기 두 야생형 유전자와 비교한 결과, 재조합 클론 3, 4, 10의 경우 두 종류의 유전자들 사이에 각 1번의 재조합이 일어났음을 보여주고 있으며, 재조합 클론 1, 2, 7, 8에서는 각 2번의 재조합, 재조합 클론 6, 9에서는3번의 재조합, 그리고 재조합 클론 5에서는 4번의 재조합이 무작위적으로 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 재조합 결과를 통해 본 발명이 두 종류 이상의 폴리뉴클레오타이들 사이에 무작위적인 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA 라이브러리 제조방법은 앞으로 그 응용성이 무한히 많다고 볼 수 있다. 이러한 시험관내(in vitro) 돌연변이 유발 방법은 앞으로 실험실에서 생화학적 연구를 위한 도구로서 사용될 뿐만 아니라, 생명체를 유지, 조절하는 단백질의 작용 메카니즘을 분자수준에서 이해할 수 있게 하기 때문에 효소, 항체, 백신(항원), 호르몬, 결합단백질, 혈장단백질 등의 생산 및 스크리닝을 위한 도구로 사용되어 결국 원래와는 다른 기질특이성의 변화, 반응특이성의 변화, 활성의 증진, 항원성의 변화, 안정성의 증가 등을 유도함으로써 궁극적으로 의약, 식품의 품질개선 및 증진, 에너지 전환율의 향상, 축산 어업에서의 육종 또는 품질개량, 새로운 화학제품의 개발 및 생산 등의 여러 산업분야에 활발히 응용될 수 있다 (Chartrain M.et al.,Curr. Opin.in Biotech.,11: 209-214 (2000); Miyazaki K.et al.,J. Mol. Biol.,297: 1015-1026 (2000); Giver, L. and Arnold, F. H.,Curr. Opin. Chem. Biol.,2: 335-338 (1998); Kumamaru, T.et al.,Nat. Biotechnol.,16: 663-666 (1998) 및 Patten, P. A.,Curr. Opin. Biotechnol.,8: 724-733 (1997)).

이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은아니다.

실시예 1: 한쪽방향성을 갖는 단일가닥의 폴리뉴클레오티드 절편 제조

다음과 같은 여러 가지 방법을 통해, 상동성을 갖는 한 쌍의 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 다양한 길이를 갖는 한쪽방향성의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들의 풀(pool)을 제조하였다.

1-1) 역전사 반응을 이용한 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들의 제조

본 발명의 원리를 구체화하기 위하여 세라티아 마르세센스 키티나아제 유전자(m-chi)와 세라티아 리큐파션스 키티나아제 유전자(l-chi)들 사이에 무작위적인 재조합 돌연변이 유전자를 제조하기로 하였다. 이들 유전자의 염기서열을 도 2에 도시하였다.

먼저 이들 유전자를 각각 제한효소HindIII,XbaI으로 절단하여 동일한 제한효소로 절단한 pUC19 벡터에 삽입하여 플라스미드 pUC19-m-chi및 pUC19-l-chi를 제조하였다. 얻어진 플라스미드를NdeI으로 절단하여 크레나우(Klenow)로 갭 메우기(gap-filling)한 후HindIII로 절단하였다. 얻어진 약 2 kb의 DNA 절편을 pBluscript II KS 벡터(Stratagene)의HindIII,EcoRV부위에 넣어 총 5 kb인 재조합 플라스미드를 얻었다. 이렇게하여 만들어진 각각의 플라스미드 pBSK-m-chi및 pBSK-l-chi를SpeI으로 절단하여 선형화(linearized)하였다.

선형화된 각각의 플라스미드 200 ng, 전사 완충용액[40 mM Tris-HCl (pH7.9), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidine, 10 mM NaCl, 10 mM DTT], 각 0.5 mM rNTP, 40 단위의 RNasin, 17 단위의 T3 RNA 중합효소를 포함하는 총 20 ㎕의 혼합물을 37℃에서 1시간 반응시켰다.

상기 체외전사(in vitrotranscription) 반응에 의해 얻어진m-chi및l-chi유전자의 RNA를 1 % 아가로우스 젤에서 전기영동으로 분석하였다. 도 3 (a)의 레인 2와 3에서 5 kb의 플라스미드 밴드와 체외전사 결과물인 RNA를 확인할 수 있었다. 이들 RNA를 RNAeasy 컬럼(Qiagen)으로 정제한 후 각각 두 종류 유전자로부터 비롯된 200 ng의 RNA를 섞은 다음, 이를 6 ㎍ 무작위 헥사머(random hexamer; Genotech, Inc.), 0.2 mM 각 dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM KCl, 0.6 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT, 40 단위의 RNasin, 50 단위의 M-MLV 역전사효소와 총 50 ㎕가 되도록 혼합하고 이 혼합물을 37℃에서 1시간동안 역전사반응시켰다. 이후 20 ng의 RNase I을 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 역전사반응에 이용된 RNA를 제거하였다.

무작위 헥사머는 주형 RNA에 무작위적인 위치에서 접합할 수 있으므로, 무작위 헥사머로부터의 뉴클레오티드 신장에 의해 다양한 길이의 한쪽방향성 단일가닥의 DNA 절편들이 제조된다.

상기 역전사 반응물을 1% 아가로우스 젤에서 전기영동하였으며(도 3의 (b)의 레인 2), 단일가닥 DNA 절편들의 밴드를 젤로부터 오려내어 GENECLEAN 키트(Bio 101)로 정제하였다.

1-2) 순차적으로 5' 말단이 절단된 한쪽방향성 단일가닥 DNA 절편의 제조

이 방법은 엑소뉴클레아제 III(Exonuclease III)의 두 가지 유용한 특성, 즉, (i) 매우 균일한 속도로 순차적으로 절단하고, (ii) 4염기의 3'-돌출 말단을 갖는 DNA는 절단하지 못하는 특성(Henikoff, S.,Gene,28, 351-359(1984))을 이용한 것이다.

m-chi유전자 또는l-chi유전자를 포함하는 pGEM-T 벡터(Promega) 약 30 ㎍씩을 제한효소SphI과NcoI으로 선형화시켰는데,SphI은 엑소뉴클레아제 III로 절단되지 않는 4염기의 3'-돌출 말단을 만들고NcoI은 4염기의 5'-돌출 말단을 만든다. 이 선형화된 각각의 DNA와 엑소뉴클레아제 III 반응 완충용액[66 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.66 mM MgCl₂]이 들어있는 총 60 ㎕의 혼합물을 제조한 다음 300 단위의 엑소뉴클레아제 III를 넣었다. 매 20초 간격으로 2.5 ㎕를 분취해서 S1 핵산 가수분해효소 (S1 nuclease) 반응 혼합물[S1 핵산 가수분해효소 반응 완충액(300 nM 아세트산 칼륨, pH 4.6, 2.5 M NaCl, 10 mM ZnSO₄, 50% 글리세롤) 및 50 단위의 S1 핵산 가수분해효소] 7.5 ㎕와 섞은 후에 실온에서 15분간 정치하였다.

S1 정지 용액[300 mM 트리스 염기, 50 mM EDTA]로 S1 핵산 가수분해효소를 불활성화시킨 후, 크레나우를 넣고 37℃에서 30분간 중합반응을 실시한 다음 이 산물을SacI으로 절단하였다. 1% 아가로우스 젤 전기영동 분석을 통해서 상기에서 생성된, 순차적으로 길이가 줄어든 이중가닥 DNA 절편들을 분석하였다. DNA 절편들을 젤로부터 추출하고, 150 단위의 엑소뉴클레아제 III를 넣고 10분 동안 반응시켜서한쪽방향으로 절단된 단일가닥 DNA 절편들을 얻었다.

1-3. 단일가닥 DNA 주형으로부터 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편들의 제조

m-chi유전자 또는l-chi유전자를 포함하는 pGEM-T 벡터(Promega) 5 ㎍씩을 제한효소SphI과NcoI으로 선형화시켰다. 선형화된 각각의 DNA와 엑소뉴클레아제 III 반응 완충용액[66 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.66 mM MgCl₂]이 들어있는 총 60 ㎕의 혼합물을 제조한 다음에 300 단위의 엑소뉴클레아제 III를 넣고 37℃에서 10분동안 반응시켰다.

각 유전자의 선형화된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로하여 10 단위의 크레나우 효소, 6 ㎍의 무작위 헥사머, 0.1 mM 각 dNTP를 첨가하고 반응완충용액(10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl₂, 7.5 mM DTT)에서 37℃로 중합반응시켜 단일가닥 DNA 절편을 제조하였다.

생성된 한쪽방향성의 단일가닥 DNA 절편을 1% 아가로우스 젤에서 전기영동으로 분석한 후 GENECLEAN 키트(Bio 101)로 정제하였다.

실시예 2: 한쪽방향성의 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들을 주형으로 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 폴리뉴클레오티드의 재조립

상기 실시예 1에서 얻은 단일가닥 DNA 절편들을 중합효소 연쇄 반응의 주형으로 사용하였다. 반응 혼합물은 단일가닥 DNA 절편 20 ng, 0.2 mM 각 dNTP, 2 mMMgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Triton X-100, 2 단위 Vent DNA 중합효소(New England BioLabs) 및 25 pmole의 시발물질을 총 50 ㎕의 부피로 포함하였으며, 여기에서 시발물질로는m-chi및l-chi유전자의 5' 말단과 공통 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 24)를 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 94℃, 3분; 30 주기의 (94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 30초); 및 72℃, 5분의 조건으로 PTC-101 Thermal cycler(MJ Research)를 이용하여 수행하였다. 상기 반응이 끝난 후 반응물에 다시 25 pmole의 3'-특이적 올리고뉴클레오티드(서열번호: 25)를 시발물질로서 첨가하여, 94℃, 3분; 30 주기의 (94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 30 초); 및 72℃, 5분의 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 완전한 크기의 DNA를 증폭하였다. 상기 PCR에 의해 제조된 반응물을 1% 아가로우스 젤 전기영동한 결과 약 1.7 kb의 DNA 밴드를 도 3의 (c)의 레인 2에서 확인할 수 있었다.

실시예 3: 재조합 돌연변이 염기서열 분석 및 스크리닝

실시예 2의 PCR 산물을 GENECLEAN 키트(Bio 101)에 의해 젤에서 분리한 후,HindIII,XbaI으로 자른 다음 동일한 제한효소로 절단한 pBluescriptII KS 벡터에 삽입하였다. 상기 재조합 플라스미드를 대장균 JM83 균주에 형질전환(transformation)시켜서 앰피실린이 100 ㎍/ml의 농도로 들어있는 LB-한천 배지에 도말하였다. 여기서 자란 콜로니중에서 무작위로 선별한 14개의 콜로니로부터 Qiaprep Spin Miniprep 방법(Qiagen)을 통해 플라스미드 DNA를 추출하고 각 플라스미드 DNA를 세 가지 제한효소NotI,PstI,HincII를 처리하여 절단하였다.

도 4는 상기의 제한효소에 의해 절단되어 나온 DNA 절편들의 크기를 1% 아가로우스 젤 전기영동을 통해 분석한 결과이다. 레인 5는l-chi유전자를 함유하는 플라스미드를 제한효소NotI,PstI,HincII로 절단했을 때 나타나는 전형적인 DNA 절편형태를 보이고 있으며 레인 8, 13은m-chi유전자를 함유하는 플라스미드를 제한효소NotI,PstI,HincII로 절단했을 때 나타나는 전형적인 DNA 절편형태를 보이고 있다. 나머지 레인들은 두 야생형 유전자를 함유하는 플라스미드를 절단했을 때와는 다른 DNA 절편 형태들을 보이고 있다. 이 결과는 무작위로 선발한 14개의 클론중에서 최소한 11개의 클론이 두 야생형 유전자가 재조합된 유전자들을 보유하고 있음을 의미한다.

이중 10개의 플라스미드의HindIII와XbaI 제한효소 부위 사이에 들어있는 삽입 DNA 절편의 염기서열을 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(PE Biosystems)를 사용하여 분석하였다. 도 5a 내지 5e는 10개의 클론에서 얻은 재조합 DNA 염기서열을 야생형m-chi및l-chi유전자와 함께 배열하여 비교한 결과이다. 도 6은 도 5에서 보여지는 각 클론들의 재조합 DNA 염기서열을 실험에 이용한 두 야생형 유전자와 비교하였을 때 재조합 돌연변이 유전자 상에서 각 야생형에서 유래된 유전자 부위들의 위치를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 재조합 DNA 클론 3, 4, 10의 경우 두 종류의 유전자들 사이에 각 1번의 재조합이 일어났으며, 재조합 DNA 클론 1, 2, 7, 8에서는 각 2번의 재조합, 재조합 DNA 클론 6, 9에서는 3번의 재조합, 그리고 재조합DNA 5에서는 4번의 재조합이 무작위적으로 일어났음을 알 수 있다. 이러한 결과를 통해 본 발명이 두 종류 이상의 출발 폴리뉴클레오티드들 사이에 무작위적인 재조합 DNA 라이브러리를 제조하는데 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

두 야생형 유전자가 재조합된 라이브러리에서 야생형보다 비활성이 더 높은 키티나아제를 생성하는 재조합체를 스크리닝하기 위하여, 콜로니를 다시 앰피실린 100 ㎍/ml 및 팽윤된 키틴(swollen chitin) 0.5%를 함유하는 LB-한천 배지에 레플리카 플레이팅(replica plating)에 의해 옮기고 투명한 플라크가 생길 때까지 37℃에서 밤새 배양하였다. 약 800 여개의 콜로니를 투명환(clear zone)의 정도에 따라 스크리닝하였다. 도 7은 재조합 키티나아제를 발현하는 콜로니가 각기 다른 키틴 분해능을 보이는 것을 투명환(clear zone) 크기에 따라 보여주고 있다. 야생형보다 더 큰 투명환을 보이는 한 콜로니로부터 생산된 키티나아제를 R-24 키티나아제라 명명하고, 이 클론으로부터 Qiaprep Spin Miniprep 방법(Qiagen)을 통해 플라스미드 DNA를 추출한 다음 R-24 키티나아제 유전자 부위의 염기서열을 분석하였다. 도 8a 및 8b는 R-24 키티나아제 유전자의 염기서열(서열번호: 13)을 두 야생형 유전자, 즉,l-chi유전자(서열번호: 1) 및m-chi유전자(서열번호: 2)의 염기서열과 비교한 것이다. 도 9는 R-24 키티나아제 유전자를 두 야생형 키티나아제 유전자와 비교하여 간략하게 도식화한 것이다. 도 9로부터, R-24 키티나아제의 유전자는 두 야생형 유전자 사이에 4번의 재조합을 통해 만들어 졌음을 알 수 있다. 표 1은 R-24 키티나아제의 비활성(specific activity)을 두 야생형 키티나아제의 비활성과 비교하여 나타낸 것이다.

야생형 키티나아제 및 재조합 R-24 키티나아제의 비활성

키티나아제	비활성 (U/mg)
세라티아 마르세센스 키티나아제	150.6
세라티아 리큐파션스 키티나아제	201.3
R-24 키티나아제	227.2

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, R-24 키티나아제는 비활성이 세라티아 마르세센스 키티나아제보다 약 1.5배, 세라티아 리큐파션스 키티나아제보다 약 1.1배 증가하였다.

실시예 4: 키토산아제 열안정성의 증진

4-1) 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 이용한 키토산아제 변이체의 제조

pBR322 벡터를EcoRV와SalI으로 절단하여 얻은 약 0.5kb의 DNA 절편을 pBluescriptII SK 벡터의EcoRV/SalI 절단부위에 삽입하였다. 이 플라스미드를XbaI과EcoRI으로 절단한 후 이 부위에Bacillussp. KCTC 0377BP에서 유래된 키토산아제 유전자를XbaI과EcoRI으로 절단하여 얻은 약 1.4 kb의 유전자 절편을 삽입하고 최종 플라스미드를 pBSK-csn-322로 명명하였다.

pBSK-csn-322 플라스미드를 주형으로 하여 에러 유발성 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 프라이머로서 csn-XbaI(서열번호: 26) 및 csn-c1(서열번호: 27)을 사용하였다. 중합효소 연쇄반응은 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 0.15 mM MnCl₂, 50 pmol의 각 프라이머, 10 ng 주형 DNA, 5 U Taq 폴리머라제를 혼합한 100㎕의 반응액 및 MJ Research thermal cycler(PTC-200)를 이용하여 94℃, 3분; 30 주기의 (94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 30 초); 및 72℃, 5분의 조건에서 수행하였다.

여기서 얻은 약 1.4kb의 DNA 절편을XbaI과EcoRI으로 절단한 다음 pBSK-csn-322을XbaI과EcoR1으로 절단하여 1.4kb의 DNA 절편을 제거한 부위에 삽입하였다. 이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 대장균 JM83 균주에 형질전환시켜서 앰피실린이 100 ㎍/ml의 농도로 들어있는 LB-한천 배지에 도말한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 여기서 자란 콜로니를 다시 앰피실린이 100 ㎍/ml의 농도로 들어있는 LB-한천 배지에 옮겨 찍은 후 37℃에서 20시간 동안 정치배양하였다. 이 LB-한천 플레이트를 70℃의 수조에 15분 동안 올려 놓아 열처리한 후 50 mM의 Na-아세테이트 완충용액에 0.1%의 키토산과 1%의 아가로우스를 녹인 용액을 LB-한천 배지위에 부가하였다. 이 LB-한천 배지를 37℃에서 24시간동안 정치배양한 후 0.2% 콩고 레드(Congo Red) 염색시약을 이용해 키토산이 분해되어 투명환을 생성하는 콜로니들을 선발하였다. 위와 같은 과정을 통해 12,000여개의 콜로니들중에서 야생형보다 열안정성이 증진된 9개의 클론을 선발하였다. 이들 클론으로부터 Qiaprep Spin Miniprep 방법(Qiagen)을 통해 플라스미드 DNA를 추출하고 각 플라스미드 DNA에서 키토산아제 유전자 부위의 염기서열을 분석하였다. 표 2는 에러유발성 PCR을 통해 만들어진 열안정성이 증가한 키토산아제 변이체의 아미노산 치환부위를 야생형과 비교하여 나타낸 것이다.

에러유발성 PCR을 통해 제조된 열안정성이 증가한 키토산아제 변이체의 아미노산 치환부위

키토산아제 변이체	아미노산 치환부위
d10-68	D305G
e3-97	E308G
e4-12	I389M
e15-20	T131I, N368D
e18-5	S24P, T277A, N368D
e22-23	K172E, S376P
e26-27	Q159R
e26-98	E107D, Q442R
e30-97	S376P, Y451C

4-2) 1차 재조합 라이브러리의 생성 및 스크리닝

4-1)에서 얻어진 9개의 키토산아제 유전자들을 출발 폴리뉴클레오티드로 이용하여 본 발명의 DNA 재조합 방법을 수행하였다.

위의 9개의 클론에서 얻은 각각의 플라스미드 500 ng씩을 섞은 후XhoI으로 절단하여 약 4.9 kb의 선형화된 DNA 절편을 얻었다. 선형화된 플라스미드 200 ng에 40 mM Tris-HCl (pH 7.8), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidine, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 각 0.5 mM 각 rNTP, 40 단위의 RNasin, 17 단위의 T3 RNA 중합효소가 총 20 ㎕에 들어있는 혼합물을 37℃에서 1시간 반응시켰다. 얻어진 변이 키토산아제 유전자들의 RNA 전사물을 RNAeasy 컬럼(Qiagen)으로 정제하였다.

200 ng의 RNA에 6 ㎍ 랜덤 헥사머, 0.2 mM 각 dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM KCl, 0.6 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT, 40 단위의 RNasin, 50 단위의 M-MLV역전사효소를 총 50 ㎕가 되도록 섞고 이 혼합물을 37℃에서 1시간동안 역전사반응시켰다. 이후 20 ng의 RNase I을 넣고 37℃에서 1시간 반응시켜 주형 RNA를 제거하였다. 상기의 역전사반응을 통해 주형 RNA에 접합한 무작위 헥사머로부터 다양한 크기의 한쪽방향성 단일가닥 DNA가 합성되었다. 상기 역전사 반응물을 1% 아가로우스 젤 전기영동으로 분석한 후 단일가닥 DNA 절편들을 GENECLEAN 키트(Bio 101)로 추출하였다.

상기 과정을 통해 얻은 단일가닥 DNA 절편들을 중합효소 연쇄반응의 주형으로 사용하였다. 반응 혼합물은 단일가닥 DNA 절편 10 ng, 0.2 mM 각 dNTP, 2 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 0.1% Triton X-100, 2 단위 Vent DNA 중합효소(New England BioLabs Inc.), 25 pmole의 csn-XbaI 프라이머(서열번호: 26)를 총 50 ㎕ 양으로 포함하였다. PCR은 94℃, 3분; 30 주기의 (94℃, 30초; 55℃, 30초; 72℃, 30초); 및 72℃, 5분의 조건으로 PTC-100 Thermal cycler(MJ Research)를 이용하여 수행하였다. 이렇게 하여 얻어진 약 1.4 kb의 전장 DNA를 csn-c1 프라이머(서열번호: 27) 25 pmole을 사용하여 상기와 같은 조건으로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 증폭하였다. 여기서 얻은 약 1.4kb의 DNA를XbaI과EcoRI으로 절단한 다음 pBSK-csn-322을XbaI과EcoR1으로 절단하여 1.4kb의 DNA 절편을 제거한 부위에 삽입하였다. 제조된 플라스미드를 대장균 JM83 균주에 형질전환시켜서 앰피실린이 100 ㎍/ml의 농도로 들어있는 LB-한천 배지에 도말한 후 37℃에서 20시간 동안 배양하였다. 여기서 자란 콜로니를 다시 앰피실린이 100 ㎍/ml의 농도로 들어있는 LB-한천 배지에 레플리카 플레이팅 방법에 의해 옮긴 후 37℃에서 20시간 동안 정치배양하였다. 이 LB-한천 플레이트를 75℃의 수조에 20분 동안 올려 놓아 열처리한 후 50 mM의 Na-아세테이트 완충용액에 0.1%의 키토산과 1%의 아가로우스를 녹인 용액을 LB-한천 배지위에 부가하였다. 이 LB-한천 배지를 37℃에서 밤새 정치배양한 후, 0.2% 콩고 레드 염색시약을 이용해 열처리에도 불구하고 키토산아제 활성을 유지하여 주변에 투명환을 형성한 콜로니들을 선발하였다.

위와 같은 과정을 통해 12,000여개의 콜로니들 중에서 에러유발성 중합효소 연쇄반응을 이용한 돌연변이 방법에서 얻어진 8개의 변이체들보다 열안정성이 증진된 23개의 클론을 선발하였다.

4-3) 2차 재조합 DNA 라이브러리의 생성 및 스크리닝

1차 재조합 DNA 라이브러리의 스크리닝에서 얻어진 23개의 돌연변이 키토산아제 유전자들로부터 4-2)의 방법과 동일한 과정을 거쳐 2차 재조합 라이브러리를 만들었다. 16,000 여개의 콜로니들을 80℃의 수조에서 30분 동안 열처리한 후 출발물질인 23개의 키토산아제 변이체보다 열안정성이 더욱 증진된 돌연변이 키토산아제들을 스크리닝하였다. 최종 2개의 클론을 선발하였고 여기서 얻어진 변이 단백질들을 각각 M-13, M-20이라고 명명하였다.

4-4) M-13, M-20 키토산아제 변이체의 아미노산 치환부위의 결정 및 열안정성 분석

M-13과 M-20 키토산아제 변이체를 발현하는 각 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 추출한 다음 키토산아제 유전자의 염기서열을 분석하였다. 도 10은 야생형 키토산아제 유전자의 염기서열과 M-13, M-20 변이체의 염기서열을 비교한 것이다.

또한, 야생형 키토산아제와 열안정성이 증진된 키토산아제 변이체 M-13 및 M-20의 아미노산 서열을 분석하여 야생형 키토산아제와 다른 아미노산을 갖는 변이체 키토산아제의 아미노산 치환 부위를 표 3에 나타내었다.

본 발명에 의해 제조된 열안정성 키토산아제 변이체의 아미노산 치환부위

변이 키토산아제	아미노산 치환부위
M-13 키토산아제	N60Y, E107D, Q159R, N228T, D305G, E308G, N368D,S376P, F384L, I389M, D435G
M-20 키토산아제	S24P, E107D, Q159R, N286D, D305G, E308G, N357D,N368D, N371D

표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, M-13 키토산아제는 표 2의 에러유발성 중합효소 연쇄반응에서 만들어진 돌연변이체의 치환부분과 비교하여 7개의 돌연변이체에 존재하는 치환부위(E107D, Q159R, D305G, E308G, N368D, S376P,I389M)가 재조합을 통해 축적이 되었고, M-20 키토산아제는 6개의 돌연변이체에 존재하는 치환부위(S24P, E107D, Q159R, D305G, E308G, N368D)가 재조합을 통해 축적이 되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명 방법이 효율적으로 재조합 폴리뉴클레오티드를 제조하는데 이용될 수 있음을 보여주고 있다. 한편, M-13, M-20 키토산아제 변이체에서는 출발 돌연변이체 사이의 재조합에서 비롯된 변이 부위 이외에 본 발명 방법의 과정동안 각각 4개와 3개씩의 새로운 변이 부위가 도입되었음을 알 수 있다.

키토산아제 변이체들의 열 안정성을 확인하기 위해, 야생형 키토산아제, M-13 변이체 및 M-20 변이체를 60℃에서 열처리한 후 시간에 따른 잔존활성을 측정하였다. 도 11은 야생형 키토산아제와 M-13, M-20 변이체의 열안정성 차이를 보여주는 그래프로서, 효소의 활성이 최초 활성의 50%로 감소하는 기간을 의미하는 반감기(T_1/2)는 야생형이 5.1분, M-13 돌연변이체가 6.9 시간, M-20 돌연변이체가 11.6 시간이다. 이 결과는 M-13과 M-20 돌연변이체의 60℃에서의 열안정성이 야생형 키토산아제에 비해 각각 약 81배와 136배 증가했음을 보여준다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법은 두 종류 이상의 상동성있는 폴리뉴클레오티드간에 무작위적인 재조합이 가능하여, 유전자 수준에서 활성이 증가 또는 변형되거나 새로운 기능을 갖는 다양한 돌연변이 단백질을 암호화할 수 있는 돌연변이 재조합 DNA를 시험관 내에서 제조할 수 있기 때문에 신규한 유전자의 생성 및 분리에 소요되는 상당한 시간과 비용을 절약할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Claims

다음과 같은 단계를 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 제조 방법:

(a) 재조합시키고자 하는 한 종류 이상의 상동성있는 출발 폴리뉴클레오티드로부터 다양한 길이를 갖는 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들의 풀(pool)을 제조하는 단계;

(b) 복수의 주기적인 연장 반응을 포함하는 중합과정을 수행하는 단계로서,

단계 (a)에서 제조된 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편들이 순차적으로 주형으로 작용하고, 여기에 특정 올리고뉴클레오티드가 시발물질로서 첨가되며, 이 프라이머들이 주형교환(template switching)을 통해 연장되어 적어도 한 종류 이상의 재조합 폴리뉴클레오티드를 생산하고, 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드는 출발 폴리뉴클레오티드와 염기서열이 상이한 것을 특징으로 하는 단계; 및

(c) 한 종류 이상의 특정 시발물질을 사용하여 상기 (b) 단계에서 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 연쇄중합반응을 수행하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는

(i) 한 종류 이상의 출발 폴리뉴클레오티드로부터 RNA를 제조하기 위해 전사 과정을 수행하는 단계; 및

(ii) 무작위 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 하고 상기 (i)단계에서 얻어진 RNA 전사물을 주형으로 하여 역전사반응(reverse transcription)을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 폴리뉴클레오티드의 두 말단중 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계;

(ii) 상기 (i)단계의 반응 혼합물에 엑소뉴클레아제-Ⅲ를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제 Ⅲ의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조의 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계;

(iii) 돌출된 5' 말단 구조를 갖는 상기 (ii)단계에서 생성된 이중가닥 폴리뉴클레오티드에 S1 뉴클리아제와 DNA 중합효소를 처리하여 평활(blunt) 말단을 갖도록 전환시키는 단계;

(iv) (i)단계에서 돌출된 3' 말단 구조를 가졌던 이중가닥 폴리뉴클레오티드의 동일한 말단을 새로운 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계; 및

(v) 상기 (iv)단계의 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계;

(ii) 상기 (i)단계에서 생성된 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여단일가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및

(iii) 무작위 프라이머를 사용하여 상기 (ii)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 제한효소로 처리하여 한쪽 말단을 돌출된 3' 말단 구조로 만드는 단계;

(ii) 상기 (i)단계에서 생성된 폴리뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 Ⅲ를 처리하여 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및

(iii) (ii)단계에서 얻어진 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 단일가닥 특이적 5'→3' 엑소뉴클레아제를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조를 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 정방향(forward) 혹은 역방향(reverse) 중 한 종류의 올리고뉴클레오티드 시발물질만을 사용하여 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계;

(ii) 생성된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 분리하는 단계; 및

(iii) 무작위 시발물질을 사용하여 상기 (ii)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 정방향(forward) 혹은 역방향(reverse) 중 한 종류의 올리고뉴클레오티드 시발물질만을 사용하여 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계;

(ii) 생성된 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 출발 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 분리하는 단계; 및

(iii) (ii)단계에서 얻어진 단일가닥 폴리뉴클레오티드에 단일가닥 특이적 5'→3' 엑소뉴클레아제를 처리하고 일정한 시간 간격으로 반응물을 취한 후 엑소뉴클레아제의 반응을 중지시킴으로써 한쪽 방향으로 순차적으로 절단된 구조를 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드의 풀을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계는

(i) 적어도 한 종류 이상의 출발 폴리뉴클레오티드가 삽입된 바이러스 벡터나 플라스미드 벡터로부터 단일가닥의 폴리뉴클레오티드를 추출하는 단계; 및

(ii) 무작위 올리고뉴클레오티드를 시발물질로 하여 상기 (i)단계의 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 주형으로 중합반응을 일으키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계는

(i) 적어도 한 주기의 중합반응에서 시발물질이 주형으로 이용된 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편의 말단까지 중합반응을 통해 길이가 신장되는 단계;

(ii) 다음에 계속되는 적어도 한 주기의 연쇄중합반응에서 (i)단계에서 신장된 각 폴리뉴클레오티드가 주형교환을 통해 (i)단계에서 사용된 주형 폴리뉴클레오티드 절편과는 다른 한쪽방향성 단일가닥 폴리뉴클레오티드 절편의 말단까지 길이가 더 신장되는 단계; 및

(iii) 목적하는 길이의 재조합 폴리뉴클레오티드가 얻어질 때까지 상기 (ii)단계를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 특정 올리고뉴클레오티드 시발물질은 적어도 한 종류의 출발 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화할 수 있는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 출발 폴리뉴클레오티드는 효소, 항체, 항원, 결합단백질, 호르몬, 성장인자 및 혈장단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 어느 하나의 단백질을 암호화하는 유전자 또는 그 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 효소는 가수분해효소(hydrolase), 분해효소(lyase), 전달효소(transferase), 산화환원효소(oxidoreductase), 연결효소(ligase) 및 이성화효소(isomerase)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 출발 폴리뉴클레오티드는 야생형 또는 이로부터 비롯된 돌연변이 폴리뉴클레오티드인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 재조합 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하고, 이 재조합 벡터를 발현세포에 도입하여 복수의 돌연변이 클론을 제조하는 단계를 포함하는 재조합 DNA 라이브러리의 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 벡터는 파아지, 플라스미드, 파아지미드, 바이러스 벡터 및 인공염색체 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제14항에 있어서, 상기 발현세포가 세균, 곰팡이, 식물세포, 동물세포 및 곤충세포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
제14항의 방법에 의해 제조된 재조합 DNA 라이브러리로부터 원하는 기능적 특성을 지닌 재조합 폴리뉴클레오티드를 선발하는 과정을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 원하는 성질을 갖도록 진화시키는 방법.