KR20210117223A

KR20210117223A - 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법

Info

Publication number: KR20210117223A
Application number: KR1020210081843A
Authority: KR
Inventors: 이재훈
Original assignee: (주) 하임바이오텍
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-09-28
Also published as: WO2021261928A1; KR102475713B1; US20230250471A1; JP2023542064A; CN115735008A; EP4170046A1

Abstract

본 발명은 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법에 관한 것으로, 상기 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물은 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하여, 하나의 용기에서 순차적인 중합효소 연쇄반응을 일으킬 수 있다. 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄 반응은 종래 네스티드(nested) PCR과 달리 반응물 첨가 단계가 생략되는 바 외부로부터 오염물질의 유입이 적고, 유전자 중합효소 연쇄반응(PCR)의 수율을 높일 수 있으며, 매우 낮은 유전자가 존재하는 경우에도 재현성 높은 중합효소 연쇄반응 결과를 얻을 수 있다.

Description

순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법{COMPOSITION FOR SEQUENTIAL POLYMERASE CHAIN REACTION AND GENE AMPLIFICATION METHOD USING SAME}

본 발명은 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 하나의 용기에 준비하여, 중합효소 연쇄반응을 연속적으로 수행할 수 있는 방법으로, 온도에 따라 각각의 중합효소 연쇄반응의 조절이 가능하며, 하나의 용기에서 순차적으로 진행될 수 있는 바, 유전자 증폭 시 외부로부터 오염물질의 유입이 적고, 유전자 중합효소 연쇄반응(PCR)의 수율을 높일 수 있는 방법에 관한 것이다.

분자 진단은 유전자를 분석하여 질병을 진단하는 분야로, 현재 체외진단 분야 중 가장 높은 성장세를 보이고 있는 실정이다. 실제로, 급속한 환경 오염과 기후변화에 인한 것으로 추정되는 신종 바이러스가 크게 확산되면서, 체외진단 분야 중 가장 높은 진단의 정확도가 확보되고, 신종 바이러스가 출현하는 경우 신속하게 감염 여부를 확인할 수 있다는 이점이 있는 분자 진단에 대한 많은 연구가 계속되고 있다.

염기서열 또는 염기의 변이를 분석하기 위하여 여러 가지 방법들이 있으나 이 모든 방법들을 사용하기 이전에 기본적으로 많은 양의 유전자 시료를 수득하여야 한다. 현재 연구자들이 유전자 시료를 수득하기 위하여 가장 보편적으로 사용하는 방법은 DNA 중합효소를 이용한 중합 효소 연쇄반응(이하, "PCR"이라 함)이다. 상기 방법은 주형과 결합할 수 있는 프라이머를 설계하여 유전자의 원하는 부위만을 증폭시킬 수 있다. 유전자로부터 증폭하고자 하는 영역을 결정하고, 결정한 부위의 3' 말단의 염기서열과 상보적으로 결합할 수 있는 염기서열을 결정하여 프라이머를 설계한다.

PCR의 응용기법 중 네스티드(nested) PCR은 PCR 증폭의 특이성과 민감도를 증가시킬 수 있는 기법으로 대개 순도가 낮은 DNA나 RNA를 증폭하고자 할 때 이용한다. 이 방법은 2종류의 프라이머(primer)에 의해 연속적인 PCR로서 목적 유전자의 프라이머(primer)를 이용하여 제1 중합효소 연쇄 반응을 수행하고 첫 번째 PCR산물과 결합하는 2차 프라이머(primer)를 사용하여 제2 중합효소 연쇄 반응을 수행한다. 특히, 네스티드(nested) PCR방법은 첫 번째 증폭 프라이머(primer)로 증폭한 후 다시 2차 프라이머를 첨가하여 증폭하는 방법으로 민감도를 높이거나 특수한 목적의 증폭이 필요할 경우 많이 쓰이는 방법이다. 하지만, 네스티드(nested) PCR은 보통 두 번 다른 튜브를 써야 하기 때문에 실험자의 손이 많이 가고 불편하며, 증폭 산물을 다루는 도중 오염을 일으킬 수 있는 문제점이 있다. 기존의 PCR과 비교하여 외부로부터의 오염은 줄이되, 주형 유전자의 증폭시간을 줄이고 증폭량을 늘일 수 있고, 점 돌연변이를 검출하기 위해 이용되는 통상의 중합효소 연쇄반응에서의 수율(PCR YIELD) 문제(일반적으로, 점 돌연변이를 검출하기 위한 PCR 진행 시 프라이머의 양을 낮은 농도로 사용하고, 일반적인 어닐링 단계의 온도보다 조금 더 높은 온도로 어닐링 단계를 수행함으로써 PCR YIELD가 감소하는 문제가 있다.)를 해소할 수 있는 PCR 방법이 요구되는 실정이다.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본원 발명은 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 하나의 용기에 준비하는 단계; 제1 중합효소 연쇄반응; 및 제2 중합효소 연쇄반응을 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응의 수행 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 제1 중합효소 연쇄반응은, a) 주형 유전자의 이중 나선이 풀어지는 제1 변성 단계; b) 상기 a) 단계에 따른 주형 유전자에 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머가 결합하는 제1 어닐링 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 주형 유전자가 복제되어, 제1 산물이 합성되는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 중합효소 연쇄반응은, d) 상기 제1 산물의 이중 나선이 풀어지는 제2 변성단계; e) 상기 d)단계에 따른 제1 산물에 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머가 결합하는 제2 어닐링 단계; f) 상기 e) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 제1 산물이 복제되어 제2 산물이 합성되는 단계; 및 g) 상기 제2 산물에 제1 정방향 프라이머가 결합하여 제3 산물이 합성되고, 제3 산물에 제3 역방향 프라이머가 결합하여 최종 산물을 합성하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 제1 중합효소 연쇄반응 및 제2 중합효소 연쇄반응은, 온도에 따라 조절될 수 있으며, 상기 e) 단계의 수행 온도는 b)단계의 수행 온도보다 높을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 e) 단계는 상기 b) 단계보다 5℃ 내지 30℃ 더 높은 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따르면 상기 b) 단계가 40℃ 이상 50℃미만의 온도에서 수행되는 경우, 상기 e) 단계는 50℃ 이상 72℃ 이하의 온도에서 수행되고, 상기 b) 단계가 40℃ 이상 60℃ 미만의 온도에서 수행되는 경우, 상기 e) 단계는 60℃ 이상 72℃이하의 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 제2 역방향 프라이머는 주형 유전자와 결합하는 서열 외에 임의의 유전자(어댑터 유전자) 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 제2 역방향 프라이머는 임의의 유전자 서열을 더 포함하여, 제2 산물 또는 제3 산물에 상기 임의의 유전자 서열 또는 이의 상보적인 서열이 포함될 수 있다.

본 발명의 상기 제2 역방향 프라이머에 포함되는 임의의 유전자 서열은, 특별히 제한되는 바는 없으나, 제1 산물의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열을 포함하지 않아 제1 산물과는 결합하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 상기 제3 산물에 결합하는 프로브를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 프로브가 결합하는 제3 산물의 유전자 서열은, 제2 역방향 프라이머에 포함된 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열 또는 이의 일부 서열일 수 있다. 본 발명에서 상기 프로브는, 상기 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열에 결합함으로써, 제2 산물의 존재 여부, 즉, 제2 중합효소 연쇄반응의 진행 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄 반응용 키트 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법은 종래 네스티드(nested) PCR과 달리 반응물 첨가 단계가 생략되는 바 외부로부터 오염물질의 유입이 적고, 증폭 시간을 단축시킬 수 있다.

본 발명의 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은, 낮은 농도의 타겟 유전자(해당 PCR에서 복제 대상이 되는 유전자)가 존재하는 경우에도 높은 재현성을 갖는 특징이 있다.

예를들어 일반적인 10³ copy RT-PCR의 경우 10² copy의 타겟 유전자(target template)가 존재할 때 비로소 재현성 있는 PCR 결과를 나타낸다. 반면 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응은, 제2 중합효소 연쇄반응, 제2 역반응 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 이용하여 타겟 유전자의 농도가 낮은 경우에도 높은 재현성을 갖게된다.

본 발명의 순차적 중합효소 연쇄반응 방법에 따르면, 제2 역방향 프라이머의 농도는 낮추되, 제3 역방향 프라이머의 농도는 높여 빠른 시간에 더 많은 양의 산물을 합성할 수 있는 바, 점 돌연변이를 검출하기 위해 이용되는 통상의 중합효소 연쇄반응에서의 수율(PCR YIELD) 문제의 해소할 수 있는 이점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 중합효소 연쇄반응용 키트는 적은 양(낮은 농도)의 유전자(template)을 용이하게 증폭시켜 민감도가 높은 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 제1 중합효소 연쇄반응의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응의 순서도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응의 순서도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응의 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따라 통상적인 중합효소 연쇄반응을 이용하여 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 다른 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응 단계의 모식도이다.
도 8은 다른 실시예에 따라 통상적인 중합효소 연쇄반응을 이용하여 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응 단계의 모식도이다.
도 10은 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 통상적인 중합효소 연쇄반응을 이용하여 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응 산물의 전기영동 이미지이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서, 'PCR(polymerase chain reaction)'은 검출을 원하는 특정 주형 유전자를 증폭하는 방법으로 중합효소 연쇄반응의 변형 방법으로 RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 complementary DNA를 합성하고, 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하는 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)과 형광물질을 사용하여 DNA를 증폭시키면서 증폭산물을 동시에 검출하는 실시간 중합효소 연쇄반응 등을 포함한다.

본 명세서에서 특별한 언급이 없는 이상, 본 발명의 순차적 중합효소 연쇄반응은 당업계에서 통상적으로 이용되는 방법으로 진행되는 과정을 포함한다.

예를들어, 본 발명의 순차적 중합효소 연쇄반응에 이용되는 효소에는 핵산외부가수분해효소(exonuclease) 활성을 갖는 DNA Taq-polymerase가 포함될 수 있으며, 이는 제1 중합효소 연쇄반응과 제2 중합효소 연쇄반응에서 동일하게 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, '프라이머'는 복제하려는 짧은 자유 3'말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기 쌍을 형성할 수 있고 주형 유전자 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에서,'주형 유전자'는 이중가닥인 DNA, 단일 가닥인 RNA, cDNA, miRNA를 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 주형 유전자는 DNA 형태이다.

본 명세서에서 '산물' 이란 중합효소 연쇄반응에 따라 합성된 유전자를 의미한다.

본 명세서에서 프로브 또는 프라이머의'분해'란, 프로브 또는 프라이머의 구조가 물리적 또는 화학적으로 변형 또는 파괴되는 것을 의미할 수 있다.

보편적으로 알려진 중합효소 연쇄반응(PCR) 기술과 마찬가지로, 하나의 PCR 단계는 3 단계로 이루어진다. 열을 이용하여 유전자를 분리하는 열 변성 과정(denaturation 변성 단계)을 거친 후, 온도를 낮추어 프라이머(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing, 어닐링 단계)하게 하고, 다시 열을 약간 올려서 유전자를 합성하는 중합 반응(polymerization or extension, 유전자 합성 단계)이 진행된다. 상기 열 변성 단계, 어닐링 단계 및 유전자 합성 단계는 순차적으로 진행되며, 각 단계가 한 번씩 진행된 것을 하나의 cycle이 진행되었다고 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제1 중합효소 연쇄 반응의 경우 95℃에서 15초 동안 변성 단계, 65℃에서 30초 동안 어닐링 단계, 72℃에서 30초 동안 유전자 합성 단계를 거친 경우 이때 제1 중합효소 연쇄 반응이 1cycle(회) 진행되었다고 할 수 있는 것이다.

본 발명의 '순차적 중합효소 연쇄반응'은, 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 하나의 용기에 준비하는 단계; 제1 중합효소 연쇄반응 단계; 및 제2 중합효소 연쇄반응 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 제1 중합효소 연쇄반응 단계는, a) 주형 유전자의 이중 나선이 풀어지는 제1 변성 단계; b) 상기 a) 단계에 따른 주형 유전자에 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머가 결합하는 제1 어닐링 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 주형 유전자가 복제되어, 제1 산물이 합성되는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 중합효소 연쇄반응 단계는, d) 상기 제1 산물의 이중 나선이 풀어지는 제2 변성단계; e) 상기 d)단계에 따른 제1 산물에 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머가 결합하는 제2 어닐링 단계; f) 상기 e) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 제1 산물이 복제되어 제2 산물이 합성되는 단계; 및 g) 상기 제2 산물에 제1 정방향 프라이머가 결합하여 제3 산물이 합성되고, 제3 산물에 제3 역방향 프라이머가 결합하여 최종 산물을 합성하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 '용기'란, 중합효소 연쇄 반응을 일으킬 수 있는 모든 형태의 실험 도구를 포함한다. 본 발명은 하나의 용기 내에서 서로 다른 중합효소 연쇄반응이 연속적, 독립적으로 진행되는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서 '순차적 중합효소 연쇄반응 (이하'스위칭(switching) PCR')'이란, 주형 유전자를 증폭하는 제1 중합효소 연쇄반응 및 제1 중합효소 연쇄반응의 산물을 증폭하는 제2 중합효소 연쇄반응이 연속적, 순차적으로 일어나는 반응을 의미하며, 각각의 중합효소 연쇄 반응의 개시여부는 온도로 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄 반응은 제3, 제4 의 중합효소 연쇄반응 또는 그 이후의 단계까지 추가적으로 진행될 수 있다.

본 발명의 순차적 중합효소 연쇄 반응은 제1 중합효소 연쇄반응과 제2 중합효소 연쇄반응 사이에 별도의 반응물 첨가 단계가 제외되며 하나의 용기에서 제1 중합효소 연쇄반응과 제2 중합효소 연쇄반응이 연속적, 독립적으로 진행될 수 있다. 종래의 네스티드(nested PCR)반응과 달리, 본 발명에 따른 '순차적 중합효소 연쇄반응'은 반응물을 첨가하는 중간 단계가 생략되는 바 유전자 증폭 시간을 단축할 수 있고, 외부물질로부터 오염을 방지할 수 있다.

상기 제1 중합효소 연쇄 반응 또는 제2 중합효소 연쇄 반응은 여러 cycle이 진행될 수 있으며, 본 발명의 순차적 중합효소 연쇄 반응은 일부로써 네스티드(nested) PCR 기술이 이용될 수 있다. 본 발명은 다수의 PCR 단계를 거침으로써, 주형 유전자(template)가 낮은 농도로 존재하여도 빠른 시간 안에 유전자를 증폭할 수 있다.

통상적인 중합효소 연쇄반응(PCR)과 같이, 본 발명은 주형 유전자의 양을 증폭시키는 것을 주 목적으로 하며, 본 발명에 따른 '순차적 중합효소 연쇄 반응'의 제1 중합효소 연쇄 반응과 제2 중합효소 연쇄 반응은 수회 진행되어 다량의 최종 유전자(최종 산물)를 합성할 수 있다. 상술한 바와 같이 본 발명의 각 단계에서 합성된 유전자는 이후 반응에 이용되거나 잔존하게 된다.

본 발명에서 프라이머의 합성 개시 방향을 나타내는 '정방향' 또는 '역방향'은, 각 프라이머 간의 합성 방향이 상이함 또는 동일함을 의미하는 것이지, 복제 대상 유전자(예를들면 주형 유전자)에 따른 5'->3' 또는 3'->5'의 유전자 합성 방향을 특정하는 것은 아니다. 즉, 복제 대상 유전자에 따른 프라이머의 유전자 합성 방향은 달라질 수 있지만, 역방향 프라이머 간의 합성 방향은 동일하며, 정방향 프라이머와는 반대된다.

예를 들어, 주형 유전자가 이중가닥인 경우, 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머는 각각 상보적인 주형 유전자 가닥을 복제할 수 있다 (제1 중합효소 연쇄반응). 이후, 제1 정방향 프라이머는 제1 역방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에 결합하고, 제2 역방향 프라이머는 제1 정방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에 결합하여 유전자 가닥을 복제할 수 있다(제2 중합효소 연쇄반응). 상기 제1 정방향 프라이머는 제2 역방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에 결합하여, 제3 산물의 합성을 개시할 수 있으며, 이때 제2 역방향 프라이머에 임의의 유전자 서열이 추가로 포함된 경우, 제3 산물에는 임의의 유전자 서열에 상보적인 유전자 서열이 추가로 합성될 수 있다. 제3 역방향 프라이머는 제1 정방향 프라이머에 의해 합성된 제3 산물에 결합하여, 최종 산물의 합성을 개시할 수 있다. 이때, 제3 산물에 포함된 '임의의 유전자 서열과 상보적인 서열'에 프로브 및 제3 역방향 프라이머가 결합한다면, 제3 역방향 프라이머의 유전자 합성 개시에 따라 상기 프로브는 제3 산물에서 떨어지며 발광하게 된다. 이 경우 제3 산물이 합성되어야만 프로브에 의한 발광이 확인되므로, 제2 중합효소 연쇄반응이 진행되었음을 알 수 있는 것이다.

앞선 내용에서 알 수 있듯이, 본 발명의 제1 산물 또는 제2 산물은 이중가닥으로 구성될 수 있으며, 본 발명의 각 프라이머는 각각의 유전자와 상보적인 유전자 서열에 결합하여, 이후의 반응을 진행한다.

본 명세서에서 '제1 정방향 프라이머' 및 '제1 역방향 프라이머'는 주형 유전자에 결합하여 주형 유전자의 복제를 개시하는 프라이머를 의미한다. 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머의 주형 유전자 복제 개시에 따라 제1 산물이 합성된다. 본 발명에서'제1 역방향 프라이머'는 주형 유전자에만 결합하도록 설계하나, '제1 정방향 프라이머'는 주형 유전자뿐만 아니라, 제1 산물, 제2 산물 또는 제3 산물에도 결합하여 복제를 개시할 수 있다.

본 명세서에서'제2 역방향 프라이머'는 상기 제1 산물에 결합하는 프라이머를 의미하며, 제2 역방향 프라이머는 주형 가닥에도 결합할 수 있으나, 활성 온도 및 제1 어닐링 단계의 온도를 조절하여 제1 중합효소 연쇄반응에는 관여하지 않도록 설계한다. 주형 유전자가 DNA인 경우, 제1 산물 역시 이중 가닥인 바, 제1 정방향 프라이머는 제2 역방향 프라이머가 결합하는 제1 산물 유전자 가닥의 상보적 가닥에 결합하여 제1 산물 유전자의 복제를 개시한다. 이때, 제2 역방향 프라이머는 제1 산물 또는 주형 유전자에 포함되지 않는 임의의 유전자(어댑터 유전자) 서열을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 임의의 유전자는 제2 역방향 프라이머의 5'말단에 위치할 수 있다. 따라서, 제2 역방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에는 주형 유전자에 포함되지 않은 상기 임의의 유전자 서열이 포함될 수 있다.

상기 제2 역방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에는 제1 정방향 프라이머가 결합하여 제3 산물의 합성을 개시할 수 있다.

본 명세서에서 '제3 역방향 프라이머'는 상기 제3 산물에 결합하는 프라이머를 의미한다. 상기 제3 역방향 프라이머는 '제3 산물'에 존재하는 '상기 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열'에 결합할 수 있다. 본 발명에 따르면, 제3 역방향 프라이머는 상기 '임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열'에 결합하는 것인 바, 제1 중합효소 연쇄반응에 관여하지 않는다.

중합효소 연쇄반응(PCR) 시, 주형 유전자의 점 돌연변이(point mutation)를 검출하기 위하여, 이용되는 프라이머의 농도를 감소시키는 것이 일반적이나, 이 경우 최종 생성되는 산물의 양(수율)이 감소하는 문제가 있다. 이와 같은 문제를 해소하기 위해, 본 발명은 임의의 유전자를 포함하는 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 이용한다. 본 발명에서 제2 역방향 프라이머는 (바람직하게는 5'말단에) 임의의 유전자(어댑터 유전자)를 포함할 수 있으며, 제1 산물을 주형으로 하여 제2 중합효소 연쇄반응을 개시한다. 본 발명에 따르면, 상기 제2 역방향 프라이머에 의해 합성된 제2 산물에는 제1 정방향 프라이머가 결합할 수 있고, 이에 의해 상기 '임의의 유전자(어댑터 유전자)와 상보적인 유전자'를 포함하는 제3 산물이 합성된다. 제3 역방향 프라이머는 상기 제3 산물에 포함된 '임의의 유전자(어댑터 유전자)와 상보적인 유전자'에 결합하여 최종 산물의 합성을 개시하는 바, 제3 역방향 프라이머의 농도는 점 돌연변이와 상관없이 높은 농도로 이용할 수 있으므로, 더 많은 산물을 생성할 수 있는 것이다. 즉, 점 돌연변이를 검출하기 위해 이용되는 통상의 중합효소 연쇄반응에서의 수율(PCR YIELD) 문제(일반적으로, 점 돌연변이를 검출하기 위한 PCR 진행 시 프라이머의 양을 낮은 농도로 사용하고, 일반적인 어닐링 단계의 온도보다 조금 더 높은 온도로 어닐링 단계를 수행함으로써 PCR YIELD가 감소하는 문제가 있다.)를 해소하기 위해, 이용되는 제2 역방향 프라이머의 농도는 낮추되, 제3 역방향 프라이머의 농도는 높일 수 있으므로 빠른 시간에 더 많은 양의 산물을 합성할 수 있는 것이다.

본 명세서에서 프라이머의 '설계'란, 프라이머가 특정 조건(예를들면, 온도)에서 활성화되거나 블로킹(blocking)될 수 있도록 프라이머를 제조하는 것을 의미하며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 프라이머 설계 방법이 이용될 수 있다. 상기 설계 방법에는 프라이머의 길이(mer) 또는 서열을 조절하는 방법이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, '블로킹(blocking)'이란, 타겟 유전자(해당 PCR에서 복제 대상이 되는 유전자(template))에 프라이머가 어닐링되지 않는 것을 의미할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR) 의 모식도이다. 도 1을 참조하면, 제1 프라이머는 주형 유전자에, 유도 프라이머는 제1 산물에 결합하여 제2 산물을 합성할 수 있다. 도 1은 제1 중합효소 연쇄 반응과 제2 중합효소 연쇄 반응 단계를 하나의 모식도로 표현한 것일 뿐, 제1 중합효소 연쇄 반응과 제2 중합효소 연쇄 반응이 동시에 진행되는 것은 아니다.

본 발명에서, 제1 중합효소 연쇄 반응과 제2 중합효소 연쇄 반응의 각 어닐링 단계는 온도를 달리 할 수 있으며, 바람직하게는 제2 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계 온도가 제1 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 온도보다 높다. 예를 들어, 상기 제2 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계는 상기 제1 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계보다 5℃ 내지 30℃ 더 높은 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따르면, 각 프라이머가 활성화되는 온도는 서로 다를 수 있다. 이때, 제1 정방향 프라이머의 활성화 온도는 가장 넓은 범위로 설계되는 것이 바람직하며, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머의 활성화 온도는 제1 역방향 프라이머의 활성화 온도보다 높게 설계되는 것이 바람직하다. 예를들어, 제2 역방향 프라이머 또는 제3 역방향 프라이머의 활성화 온도는 제1 역방향 프라이머의 활성화 온도보다 5℃ 내지 30℃ 더 높게 설계될 수 있다.

본 발명에 따른 제1 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계는 제2 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계보다 5℃ 내지 30℃ 더 낮은 온도에서 진행될 수 있으며, 제1 역방향 프라이머의 유전자 합성 개시에 의해 핵산외부가수분해효소가 활성화된다. 즉, 제1 중합효소 연쇄 반응에서는 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머에 의한 제1 산물만 합성할 수 있다. 제2 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계는 제1 중합효소 연쇄 반응의 어닐링 단계보다 5℃ 내지 30℃ 더 높은 온도에서 진행될 수 있으며, 상대적으로 높은 온도에 의해, 제1 역방향 프라이머에 의한 반응은 진행되지 않는 반면, 제2 역방향 프라이머는 제1 산물에 결합할 수 있어, 제2 중합효소 연쇄 반응만이 진행된다.

구체적으로, 도 3 및 도 4는 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄 반응의 모식도를 나타낸다.

도 3에 따르면, 제1 중합효소 연쇄반응에서는 주형 유전자 가닥(10)에 제1 정방향 프라이머(20) 및 제1 역방향 프라이머(30)가 결합하여 유전자 합성을 개시한다. 제1 중합효소 연쇄반응에 따라 제1 산물(21)이 합성되며, 제1 산물에 다시 제1 정방향 프라이머(20) 및 제2 역방향 프라이머(40)가 결합하여 제2 중합효소 연쇄반응이 진행된다. 도 3을 참조하면, 제1 역방향 프라이머(30)는, 제1 중합효소 연쇄반응에서 활성화되지만, 제2 중합효소 연쇄반응에서는 활성화되지 않는다.

도 4를 참조하면, 제2 중합효소 연쇄 반응에 따른 제1 산물에 제1 정방향 프라이머(20) 및 제2 역방향 프라이머(40)가 결합하여 유전자를 합성할 수 있다. 이때, 제2 역방향 프라이머(40)는 제1 산물에 결합하는 유전자 서열(또는 주형 유전자에 결합하는 유전자 서열) 외에 임의의 유전자 서열을 더 포함할 수 있다. 제2 역방향 프라이머에 의해 합성되는 제2 산물은 주형 유전자 외에 임의의 유전자 서열을 더 포함하게 된다. 본 발명의 프로브는 제2 산물에 합성된 임의의 유전자에 결합할 수 있다. 제3 역방향 프라이머(50)가 제2 산물에 결합하여 유전자의 합성을 개시하는 경우, 상기 프로브는 제2 산물에서 떨어져 특정 시그널을 나타낼 수 있고, 해당 시그널을 파악하여 제2 중합효소 연쇄반응이 진행되었음을 알 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머, 제3 역방향 프라이머 및 프로브는 하기 표 1과 같은 서열로 구성될 수 있다.

	서열정보 (5'→3')
제1 정방향 프라이머	GGGAGCCAATATTGTCTTTGTGTTC
제1 역방향 프라이머	GTGCCGCCTGCTG
제2 역방향 프라이머 (예시 1)	CTCCACCGTGCAGCTCATCA
제2 역방향 프라이머 (예시 2)	TAGGCGGAATCGGTAGTAATCAA CAT CAGTCTGATAAGCTATCGG TAC CTCCACCGTGCAGCTCATCAC
제3 역방향 프라이머	TAGGCGGAATCGGTAGTAATCAA
프로브	/56-FAM/ CAG TCT GAT /ZEN/ AAG CTA TCG G /3IABkFQ/

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

<1-1> 기준 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

PCR 튜브에 qPCR Master mix 10 μl를 넣는다. 이후, Template DNA(T790M) 1 μl를 넣고, 10 uM 농도의 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 각각 1 μl씩, 10 uM 농도의 제2 역방향 프라이머 1 ul, 제3 역방향 프라이머 1 ul, 프로브 0.5ul를 넣는다. 상기 튜브에 증류수 7μl를 더 넣은 후 파이펫팅(pipetting) 한다(이때 제조된 키트를 실험군 1이라 한다). 이후, PCR machine(Bio-Rad CFX96^TM)의 well에 튜브를 넣고 하기 표 2와 같이 온도를 조절하여 제1 중합효소 연쇄 반응을 20회, 제2 중합효소 연쇄 반응을 40회 진행하였다.

온도 조건	시간	Cycle 횟수
95℃	15분
95℃	15초	제1 중합효소 연쇄 반응 20 회
65℃	30초
72℃	30초
95℃	15초	제2 중합효소 연쇄 반응 40 회
71℃	30초
72℃	30초

<1-2> 희석된 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

Template DNA(T790M)를 1/2μl (실험군 2), 1/4μl (실험군 3), 1/6μl (실험군 4), 1/8μl (실험군 5), 1/10μl (실험군 6) 농도로 하여 실험군을 제조하였으며, 나머지 조건은 실험예 1-1과 동일하게 실험하였다.

실시예 1-1, 1-2에 따른 결과값은 하기 표 3과 같다. 도 5는 본 발명의 실시예 1-1, 1-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1%M (3COPY)	19.69	19.69	0.38
		20.23
		19.12
		19.73
	1/2% M	21.22	21.43	0.64
		21.05
		20.47
		21.47
		21.51
		21.78
		21.13
		20.92
		20.21
		21.06
		21.99
		20.45
		22.59
		21.60
		22.17
		21.75
		21.87
		22.15
		21.79
	1/4% M	23.42	23.15	1.07
		22.16
		22.26
		23.01
		21.07
		23.51
		22.88
		23.68
		21.97
		23.68
		21.97
		23.27
		24.07
		23.05
		23.31
		25.39
		23.10
		22.09
		23.41
		24.34
		25.18

<1-3> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

PCR 튜브에 qPCR Master mix 10 μl를 넣는다. 이후, Template DNA(T790M) 1 μl를 넣고, 10 uM 농도의 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 각각 0.5 μl씩 넣는다. 상기 튜브에 증류수 7μl를 더 넣은 후 파이펫팅(pipetting) 한다(이때 제조된 키트를 대조군 1이라 한다). 이후, PCR machine(Bio-Rad CFX96^TM)의 well에 튜브를 넣고 하기 표 4와 같이 온도를 조절하여 PCR을 60회 진행하였다.

온도 조건	시간	Cycle 횟수
95℃	15분
95℃	15초	PCR 60 회
71℃	30초
72℃	30초

<1-4> 희석된 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

Template DNA(T790M)를 1/2μl (실험군 2), 1/4μl (실험군 3), 1/6μl (실험군 4), 1/8μl (실험군 5), 1/10μl (실험군 6) 농도로 하여 실험군을 제조하였으며, 나머지 조건은 실험예 2-1과 동일하게 실험하였다.

실시예 1-3, 1-4에 따른 결과값은 하기 표 5와 같다. 도 6는 본 발명의 실시예 1-3, 1-4에 따른 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1%M (3COPY)	46.36	46.13	0.54
		45.60
		45.75
		46.79
	1/2% M	51.06	49.58	1.87
		48.25
		50.83
		49.34
		49.53
		49.94
		46.98
		49.78
		49.96
		48.02
		46.97
		50.99
		50.57
		51.28
		46.23
		53.65
		48.14
		51.00
	1/4% M	52.59	51.51	1.32
		51.53
		51.16
		51.66
		51.22
		51.81
		51.35
		52.10
		48.10
		50.26
		50.99
		50.31
		50.58
		53.42
		50.96
		52.23
		53.52
		53.35

도 5를 참조하면 실시예 1-1, 1-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 18 내지 24 cycle의 Cq 또는 Ct 값을 나타내며, 도 6를 참조하면 실시예 1-3, 1-4에 따른 표준 PCR 방법에 따라 T790M 유전자를 증폭시켰을 때, 48 내지 50 cycle에서 증폭된다. 이는 표 3 및 5의 내용과 같다. 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은 제2 중합효소 연쇄 반응에서 증폭이 되는 것을 감안하면, 실시예 1-1, 1-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 38 내지 44 cycle(제1 중합효소 연쇄 반응이 20cycle 일어남)에서 Cq 또는 Ct값을 갖음을 알 수 있다. 실시예 1-1 내지 1-4 모두, template인 T790M 유전자 농도가 낮을수록 Cq 또는 Ct 값이 증가하였으며, 농도와 상관없이 실시예 1-1 및 1-2의 증폭 cycle 값이 실시예 1-3 및 1-4의 값보다 낮았다. 따라서, 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR) 방법은 하나의 실험 기구에서 제1 중합효소 연쇄 반응과 제2 중합효소 연쇄 반응을 독립적으로 진행할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2]

<2-1> 기준 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

실시예 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

<2-2> 희석된 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

실시예 2-1, 2-2에 따른 결과값은 하기 표 6과 같다. 도 7는 본 발명의 실시예 2-1, 2-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1/4% M	17.59	19.99	1.67
		19.95
		21.56
		20.85
	1/6% M	19.10	20.66	1.40
		20.02
		19.34
		19.52
		19.93
		21.31
		23.11
		19.53
		19.66
		21.86
		22.47
		23.18
		20.26
		19.74
		18.55
		22.15
		19.88
		21.97
		21.42
		20.17
	1/8% M	23.17	22.97	0.69
		22.22
		21.52
		22.69
		23.26
		23.34
		23.30
		23.48
		23.89
		23.48
		23.97
		22.46
		22.37
		23.91
		23.87
		23.13
		23.45
		22.49
		23.51
		24.14

<2-3> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

실시예 1-3과 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

<2-4> 희석된 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

실시예 1-4와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

실시예 2-3, 2-4에 따른 결과값은 하기 표 7과 같다. 도 8은 본 발명의 실시예 2-3, 2-4에 따른 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1/4%M	51.16	51.04	1.31
		52.26
		49.19
		51.53
	1/6% M	54.55	50.22	2.08
		52.15
		55.60
		48.52
		48.80
		50.73
		49.31
		50.34
		48.27
		49.07
		49.55
		50.57
		50.70
		48.60
		48.13
		47.81
		51.44
		51.51
		48.52
		50.30
	1/8% M	55.68	53.09	3.05
		50.66
		53.22
		49.04
		54.04
		50.89
		50.25
		49.38
		50.72
		49.55
		52.74
		51.72
		54.54
		58.93
		53.63
		56.08
		58.00
		56.60

도 7을 참조하면 실시예 2-1, 2-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 18 내지 24 cycle의 Cq 또는 Ct값을 나타내며, 도 8을 참조하면 실시예 2-3, 2-4에 따른 표준 PCR 방법에 따라 T790M 유전자를 증폭시켰을 때, 48 내지 60 cycle에서 Cq 또는 Ct값을 나타낸다. 이는 표 6 및 7의 내용과 같다. 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은 제2 중합효소 연쇄 반응에서 증폭이 되는 것을 감안하면, 실시예 2-1, 2-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 38 내지 44 cycle(제1 중합효소 연쇄 반응이 20cycle 일어남)에서 Cq 또는 Ct값을 나타냄을 알 수 있다. 실시예 2-1 내지 2-4 모두, template인 T790M 유전자 농도가 낮을수록 Cq 또는 Ct값이 증가하였으며, 농도와 상관없이 실시예 2-1 및 2-2의 Cq 또는 Ct값이 실시예 2-3 및 2-4의 값보다 낮았다. 따라서, 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR) 방법은 유전자 중합효소 연쇄반응(PCR)의 수율을 높일 수 있고, 매우 낮은 유전자가 존재하는 경우에도 재현성 높은 중합효소 연쇄반응 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3]

<3-1> 기준 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

실시예 1-1과 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

<3-2> 희석된 농도의 template를 이용한 switching PCR 반응

실시예 1-2와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

실시예 3-1, 3-2에 따른 결과값은 하기 표 8과 같다. 도 9는 본 발명의 실시예 3-1, 3-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1/2% M	17.87	17.93	0.08
		17.99
	1/4% M	18.12	18.76	0.90
		19.39
	1/6% M	22.22	21.69	0.75
		21.16
	1/8% M	23.73	25.11	2.01
		28.07
		24.01
		24.65
	1/10% M	26.65	25.89	1.31
		23.84
		27.14
		25.49
		23.44
		26.05
		27.03
		26.11
		25.94
		27.18

<3-3> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

실시예 1-3과 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

<3-4> 희석된 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

실시예 1-4와 동일한 조건으로 PCR을 진행하였다.

실시예 3-3, 3-4 따른 결과값은 하기 표 9과 같다. 도 10는 본 발명의 실시예 3-3, 3-4에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 T790M 유전자의 증폭 결과를 나타낸 그래프이다.

유전자 종류	농도	Cq (Cycle 횟수)	Cq 평균	Cq 표준편차
PC (T790M Mutant standard)	1/2% M	55.95	54.20	2.48
		52.44
	1/4% M	52.11	52.26	0.20
		52.40
	1/6% M	54.60	54.09	0.71
		53.59
	1/8% M	-	56.84	1.72
		58.19
		54.90
		57.43
	1/10% M	53.89	56.35	1.72
		56.70
		57.61
		-
		54.18
		55.64
		56.17
		58.49
		-
		58.11

도 9을 참조하면 실시예 3-1,3-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 18 내지 24 cycle에서 Cq 또는 Ct값을 나타내며, 도 10을 참조하면 실시예 3-3, 3-4에 따른 표준 PCR 방법에 따라 T790M 유전자를 증폭시켰을 때, 48 내지 60 cycle에서 Cq 또는 Ct값을 갖는다. 이는 표 8 및 9의 내용과 같다. 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은 제2 중합효소 연쇄 반응에서도 증폭이 되는 것을 감안하면, 실시예 3-1, 3-2에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)의 결과 T790M 유전자는 38 내지 44 cycle(제1 중합효소 연쇄 반응이 20cycle 일어남)에서 Cq 또는 Ct값을 나타냄을 알 수 있다. 실시예 3-1 내지 3-4 모두, template인 T790M 유전자 농도가 낮을수록 Cq 또는 Ct값이 증가하였으며, 농도와 상관없이 실시예 3-1 및 3-2의 Cq 또는 Ct값은 실시예 3-3 및 3-4의 값보다 낮았다. 따라서, 본 발명에 따른 스위칭 PCR 방법은 유전자 증폭 시간을 단축시킬 수 있고, 유전자 중합효소 연쇄반응(PCR)의 수율을 높일 수 있으며, 매우 낮은 유전자가 존재하는 경우에도 재현성 높은 중합효소 연쇄반응 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예 3-2에서 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은 1/8%(실험군 5), 1/10%(실험군 6) 두 농도에서 모두 100% detection rate을 보여주었고, 실시예 3-4의 표준 PCR의 경우 1/8%의 농도에서는 75%의 detection rate를, 1/10%의 농도에서는 80%의 detection rate를 나타내 두 농도에서 모두 95% 미만의 detection rate가 나타남을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 순차적 중합효소 연쇄반응 (Switching PCR)은, 주형 유전자(template)의 농도가 낮은 경우에도 증폭이 용이하게 일어나는 바, 본 발명에 따른 키트를 이용한 순차적 중합효소 연쇄반응(스위칭 PCR)은 민감도가 더 높음을 알 수 있다.

[실시예 4]

<4-1> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

PCR 튜브에 qPCR Master mix 10 μl를 넣는다. 이후, Template DNA(T790M) 1 00fg/μl를 넣고, 10 uM 농도의 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머를 각각 0.5 μl씩, 10 uM 농도의 제2 역방향 프라이머 1 ul, 10 uM 농도의 제3 역방향 프라이머 1 ul 및 프로브 0.5ul를 넣는다. 상기 튜브에 증류수 7μl를 더 넣은 후 파이펫팅(pipetting) 한다. 이후, PCR machine(Bio-Rad CFX96^TM)의 well에 튜브를 넣고 하기 표 10과 같이 온도를 조절하여 PCR을 40 cycle 진행하였다.

온도 조건	시간	Cycle 횟수
95℃	15분
95℃	15초	PCR 40 회(cycle)
63℃	30초
72℃	30초

<4-2> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

온도를 하기 표 11과 같이하고, 다른 실험 조건은 실시예 4-1과 같은 조건으로 PCR을 진행하였다.

온도 조건	시간	Cycle 횟수
95℃	15분
95℃	15초	PCR 40 회(cycle)
71℃	30초
72℃	30초

<4-3> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

온도를 하기 표 12와 같이하여 제1 중합효소 연쇄 반응 및 제2 중합효소 연쇄 반응을 진행하였으며, 다른 실험 조건은 실시예 4-1과 같은 조건으로 PCR을 진행하였다.

온도 조건	시간	Cycle 횟수
95℃	15분
95℃	15초	제1 중합효소 연쇄 반응 10 회
65℃	30초
72℃	30초
95℃	15초	제2 중합효소 연쇄 반응 30 회
71℃	30초
72℃	30초

<4-4> 기준 농도의 template를 이용한 표준 PCR 반응

Template DNA(T790M)의 농도를 0으로 하고, 다른 실험 조건은 실시예 4-1과 같은 조건으로 PCR을 진행하였다.

도 11은, 본 발명의 일 실시예에 따른 PCR 산물의 전기영동 이미지이다. 도 11의 ①은 실시예 4-1에 따른 결과이며, ②는 실시예 4-2에 따른 결과를, ③은 실시예 4-3에 따른 결과를, ④는 실시예 4-4에 따른 결과를 나타낸다. 도 11을 참조하면, ①에서는 110bp에서 형광을 나타냈으며 ②에서는 131bp 부근에서 band를 나타냈고, ④ 에서는 band가 나타나지 않았다. 이를 기초로 ③을 판단해보면, 110bp에서 약하게, 131bp부근에서 강하게 band가 나타나 110bp, 131bp 크기의 산물을 모두 생성하였음을 알 수 있다. 즉, ① 및 ②에서는 각각 하나의 산물만 합성할 수 있음이, ③에서는 ①, ②의 산물 모두가 합성됨을 알 수 있다.

도 11의 상기 ①에서는 제1 중합효소 연쇄반응에서 제2 역방향 프라이머가 활성화되지 않아, 제1 산물 (110 bp)만이 형성되는 것이며, ②에서는 제1 역방향 프라이머가 높은 온도 때문에 비활성화되어 제2 산물(131 bp)만이 합성된다. 반면 도 11의 ③에서는 제1 중합효소 연쇄반응이 10 cycle, 제2 중합효소 연쇄반응이 30 cycle 동안 수행되었는 바, 수행된 cycle에 비례한 유전자의 band가 공존하는 것을 확인할 수 있다 (110 bp, 131 bp). 본 발명의 실시예인 4-3에 의하면, 각 중합효소 연쇄반응의 어닐링 온도에서 활성화될 수 있는 프라이머를 설계하여, 제1 중합효소 연쇄반응에서는 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머가, 제2 중합효소 연쇄반응에서는 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머가 활성화되었고, 이에 따라 제1 산물 및 제2 산물 모두가 형성되었음을 알 수 있다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

10: 주형 유전자
20: 제1 정방향 프라이머
21: 제1 산물
30: 제1 역방향 프라이머
40: 제2 역방향 프라이머
50: 제3 역방향 프라이머
60: 프로브

Claims

주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 하나의 용기에 준비하는 단계; 제1 중합효소 연쇄반응 단계; 및 제2 중합효소 연쇄반응 단계를 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응에 있어서,
상기 제1 중합효소 연쇄반응 단계는,
a) 주형 유전자의 이중 나선이 풀어지는 제1 변성 단계;
b) 상기 a) 단계에 따른 주형 유전자에 제1 정방향 프라이머 및 제1 역방향 프라이머가 결합하는 제1 어닐링 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 주형 유전자가 복제되어, 제1 산물이 합성되는 단계를 포함하고,
상기 제2 중합효소 연쇄반응 단계는,
d) 상기 제1 산물의 이중 나선이 풀어지는 제2 변성단계;
e) 상기 d)단계에 따른 제1 산물에 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머가 결합하는 제2 어닐링 단계;
f) 상기 e) 단계에서 결합된 제1 정방향 프라이머 및 제2 역방향 프라이머에 의해 제1 산물이 복제되어 제2 산물이 합성되는 단계; 및
g) 상기 제2 산물에 제1 정방향 프라이머가 결합하여 제3 산물이 합성되고, 제3 산물에 제3 역방향 프라이머가 결합하여 최종 산물을 합성하는 단계를 포함하는, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항에 있어서,
상기 e) 단계는 상기 b) 단계보다 높은 온도에서 수행되며,
상기 제2 역방향 프라이머는 상기 제1 역방향 프라이머 보다 높은 온도에서 활성화되도록 설계된 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항에 있어서,
상기 e) 단계는 상기 b) 단계보다 5℃ 내지 30℃ 더 높은 온도에서 수행되는 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항에 있어서,
상기 제1 중합효소 연쇄반응 및 제2 중합효소 연쇄반응은, 온도에 따라 조절되는 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항에 있어서,
상기 제2 역방향 프라이머는 주형 유전자와 상보적인 서열 외에 임의의 유전자 서열을 더 포함하는 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제5 항에 있어서,
상기 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열은 제2 산물에 포함되고,
상기 제3 역방향 프라이머는 상기 제2 산물에 포함된 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열에 결합하여 최종 산물을 힙성하는 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항에 있어서,
상기 조성물은 상기 제3 산물에 결합하는 프로브를 더 포함하고,
상기 프로브가 결합하는 제3 산물의 유전자 서열은, 제2 역방향 프라이머에 포함된 임의의 유전자 서열과 상보적인 유전자 서열인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제7 항에 있어서,
상기 프로브는 제3 역방향 프라이머에 의한 유전자 합성에 따라 분해되어 발광하는 것인, 순차적 중합효소 연쇄반응을 수행하는 방법.
제1 항의 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응용 조성물.
제1 항의 주형 유전자, DNA 중합효소, dNTP, 제1 정방향 프라이머, 제1 역방향 프라이머, 제2 역방향 프라이머 및 제3 역방향 프라이머를 포함하는 순차적 중합효소 연쇄반응용 키트.