KR20060088132A - 기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 - Google Patents

기지의 서열에 인접한 미지의 ｄｎａ 서열을 증폭하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭(primary amplification)하는 단계 (a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 관한 것이다: (a-1) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성(degenerate) 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열으 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1차 축퇴성 DW-ACP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하며, 제1차 어닐링 온도에서 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭(first-stage amplification)을 실시하는 단계; 그리고, (a-2) 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작동하지 못하도록 하는 제2차 어닐링 온도에서 제2단계 증폭(second-stage amplification)을 실시하는 단계.
DNA 워킹, 프라이머, ACP, 축퇴성, 증폭

Description

기지의 서열에 인접한 미지의 ＤＮＡ 서열을 증폭하는 방법{Method for Amplifying Unknown ＤＮＡ Sequence Adjacent to Known Sequence}
본 발명은 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 신규한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머를 이용한 미지 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법 및 그의 응용에 관한 것이다.
중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 가장 효과적인 방법이다. PCR 과정에서, 타깃 핵산에 인접해 있는 5’및 3’서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 “프라이머”로 이용되며, 이는 중요한 역할을 한다.
특정 DNA 부위를 분리하고 분석하기 위하여 PCR을 적용하는 경우, 목적의 부위에 인접한 DNA 서열에 대한 정보가 요구된다. 이러한 요구는 기지 DNA 서열의 부위에 대한 증폭반응만을 가능하게 한다. 필수적인 서열 정보가 없는 경우, 복합적인 DNA 파퓰레이션에 있는 타깃 DNA 단편에 대한 PCR 증폭은 비-타깃 DNA를 증폭하는 결과를 초래할 수 있다.
기지의 서열에 인접한 미지의 DNA 서열을 분리하기 위하여, 많은 PCR-기반 방법들이 개발되었다. 이 방법들은, 인버스 PCR(Triglia et al., 1988), 판핸들 PCR(Shyamala et al., 1989; Jones 및 Winistorfer, 1997), 벡터레트 PCR(Arnold et al., 1991), 앵커드 PCR(Roux et al., 1990), AP-PCR(Dominguez et al., 1994; Trueba and Johnson, 1996), 캡쳐 PCR(Lagerstrom et al., 1991) 및 어댑터- 또는 카세트-연결 PCR(Iwahana et al., 1994; Riley et al., 1990; Siebert et al., 1995; Willems, 1998; Kilstrup and Kristiansen, 2000)을 포함한다.
그러나, 상기의 방법들은 제한효소로 DNA를 절단하고, 절단된 DNA를 링커 또는 이중쇄, 부분이중쇄 또는 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 카세트와 라이게이션한 다음 시퀀싱 전에 생성물을 정제 및/또는 서브클로닝하여야 하는 필요성과 같은 제한점들을 가지고 있다. 이러한 여러 과정에 대한 필요성 때문에 상기의 방법들의 편의성 및 효율성이 감소된다. 또한, 상기의 방법들에 있어서, 벡터, 어탭터, 카세트 또는 테일 프라이머의 비-특이적 결합에 의해 초래되는 높은 백그라운드 및 비-특이적 산물의 형성과 같은 공통된 문제점이 발견된다.
따라서, 네스티드 PCR을 실시하기 전에 바이오틴화 목적의 단편을 캡처링하는 바이오틴/스트렙타비딘 시스템이 신규한 방법론으로 제시되었다(Rosenthal and Jones, 1990; Mishra et al. 2002). 이 방법은 노이즈를 감소시키고 기지의 서열에 인접한 부위를 증폭할 수 있도록 하는 데 있어서 개선점을 나타내지만, 복잡한 고정화 단계를 요구하고 큰 비용이 소요되는 문제점이 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
상술한 종래의 기술들의 단점을 극복하기 위하여, 본 발명자는 미지의 서열을 증폭하는 데 있어서 높은 백그라운드 문제점을 기본적으로 완벽하게 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 높은 신뢰성으로 보다 편이한 방식으로 미지의 서열을 증폭할 수 있는, 기지의 서열에 인접한 미지 서열의 신규한 증폭 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열의 핵산 증폭 과정을 포함하는 프로세스를 위한 상기의 방법의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭(primary amplification)하는 단계 (a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법을 제공한다: (a-1) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성(degenerate) 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열으 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1차 축퇴성(degenerate) DW-ACP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하며, 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장산물이 생성되는, 제1차 어닐링 온도에서 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭(first-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 제1차 어닐링 온도는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로 작동하도록 하며, (a-2) 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작동하지 못하도록 하는 제2차 어닐링 온도에서 제2단계 증폭(second-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 다음의 과정을 포함하는 단계: (a-2-1) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열 상의 한 위치에 실질적으로 상보적인 타깃-특이적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 상기 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 타깃-특이적 프라이머 연장산물이 생성되며, (a-2-2) 상기 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 제2차 DW-ACP를 이용하여 상기 타깃-특이적 프라이머 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 제2차 DW-ACP 연장산물이 생성되며, 그리고, (a-2-3) 상기 제2차 DW-ACP 및 상기 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 상기 제2차 DW-ACP 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열이 없는 제1차 증폭 산물(primary amplification product)이 생성된다.
본 발명은 신규한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(이하, “DW-ACP"라 한다)를 이용하여 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 기지의 서열의 일 부분에 인접한 미지의 DNA 서열을 선별적으로 증폭하는 독특한 방법에 관한 것이다.
복잡하고 많은 단계 및 PCR-기반 방법들의 내재적인 백그라운드 문제점과 같은 종래의 DNA(또는 지놈) 워킹 방법들의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자에 의해 개발된 WO 03/050305에 개시되어 있는 어닐링 조절 프라이머(annealing control primer: ACP) 시스템을 변형시켜, 기지 서열의 일 부분에 인접한 미지 서열의 선별적 증폭에 적용하였다. ACP 시스템은 증폭반응의 특이성(specificity)을 크게 개선할 수 있기 때문에, ACP를 이용하는 것은 증폭 과정에서 프라이머의 비-특이적 프라이밍을 근본적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 본 발명에서 증폭 과정을 단순화시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 다음 일반식 I로 표시된다:
5’-Xp-Yq-Zr-Qs-3’(I)
상기 일반식에서, Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜던 서열 부위를 나타내며, Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q, r 및 s는 뉴클레오타이드의 수이고; 상기 X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP는 기지 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위하여 개발된 것으로서, 본 발명자에 의해 개발된 WO 03/050305에 개시되어 있는 어닐링 조절 프라이머의 원리를 이용하고 이를 변형하며, 상기 특허 문헌의 교시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 원리는 최소 두 개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체에 의해 분리된 명백한 3’- 및 5’-말단 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 조성, 그리고 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 있어서 3’- 및 5’-말단 부위에 대한 조절자 부위의 영향에 있다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’- 및 5’-말단 부위 사이에 있는 조절자 부위의 존재는, 프라이머 어닐링 특이성의 개선을 초래하는 주 요소이다.
용어 “핵산” 또는 “뉴클레오타이드”는 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체이며, 다르게 특별하게 언급되지 않는 한 자연 뉴클레오타이드의 공지 유사체를 포함한다. 따라서, 본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP는 단일쇄 또는 이중쇄 gDNA, cDNA 또는 mRNA 주형을 이용한 핵산 증폭에 이용될 수 있다. 본 발명의 프라이머와 관련하여 사용되는 용어 “부위(portion)”는 조절자 부위와 같은 개입 부위에 의해 분리된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 용어 “3-말단 부위” 또는 “5-말단 부위”는 조절자 부위에 분리된, 본 발명 프라이머의 3’-말단 또는 5’-말단에 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머와 관련하여 사용되는 용어 “실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 소정의 어닐링 조건하에서 프라이머가 주형 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 어닐링된 프라이머는 중합효소에 의해 연장되어 뉴클레오타이드 서열의 상보체를 생성한다. 따라서, 상기 용어는 용어 “완전히 상보적인(perfectly complementary)” 또는 이와 관련된 용어와 다른 의미를 갖는다.
축퇴성 프라이머에서 불확실한 위치의 뉴클레오타이드가 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체에 의해 치환되는 것은 공지된 사실이며, 상기 유니버설 염기는 디옥시이노신(Ohtsuka et al, 1985; Sakanari et al., 1989), 1-(2‘-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤(Nichols et al., 1994) 및 5-니트로인돌 (Loakes and Brown, 1994)을 포함하며, 상기 염기들은 4종의 종래 염기들과 비특이적으로 염기쌍을 이루기 때문에 축퇴성 프라이머의 디자인과 관련된 문제점을 해결하는 데 이용된다. 그러나, 디옥시이노신, 1-(2‘-디옥시-베타D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체가, 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 프라이머, 즉 DNA 워킹 프라이머에서 어닐링 온도에 따라 프라이머내의 각각의 기능적 부위를 구별케 하는 조절자 역할을 할 수 있다는 것에 대하여는 어떠한 보고도 없다.
용어 “유니버설 염기(universal base) 또는 비-구별성 염기 유사체(non-discriminatory base analog)”는 자연의 DNA/RNA 염기들에 대하여 구별 없이 자연의 DNA/RNA 염기들의 각각과 염기쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이며, 가장 바람직하게는, 디옥시이노신이다.
프라이머 내에 디옥시이노신과 같은 유니버설 염기들을 가지는 폴리디옥시뉴클레오타이드의 존재는, 염기쌍에서의 약한 수소결합 상호작용 때문에, 낮은 어닐링 온도를 초래한다. 이러한 이론을 확장하여, 본 발명자는, 프라이머의 축퇴성 서열 부위와 3’-말단 부위 및 5’-말단 부위 사이에 유니버설 염기들을 가지는 폴리디옥시뉴클레오타이드가 존재하면 낮은 융해온도를 갖는 부분을 형성시키며, 이 부분은 축퇴성 서열 부위와 3’-말단 부위 및 5’-말단 부위 각각에 경계를 형성시키고, 이는 특정 온도에서 축퇴성 서열 부위와 3’-말단 부위가 타깃 서열에 어닐링하는 것을 촉진시킬 것이라는 사실을 추론 하였다. 이러한 이론은 본 발명의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 기초를 제공한다.
제1차 축퇴성 DW-ACP에서 조절자 부위는, 어닐링 온도에 따라 프라이머의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 랜덤 서열 및 3’-말단 부위)를 조절할 수 있다. 조절자 부위는 5’-말단 부위 서열이 주형에 어닐링하는 것을 억제할 뿐만 아니라, 제1차 어닐링 온도에서 프라이머의 어닐링 부위를 축퇴성 서열 부위와 3’-말단 부위로 한정하는 작용을 한다. 따라서 조절자 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위와 3’-말단 부위의 주형에 대한 어닐링을 크게 개선한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1차 DW-ACP의 조절자 부위는, 5’-말단 부위와 축퇴성 서열 부위 사이에 최소 3개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하며, 보다 바람직하게는 최소 4개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함한다. 유리하게는, 제1차 DW-ACP의 5’-말단 부위 및 축퇴성 서열 부위 사이에 있는 유니버설 염기 잔기의 길이는 최대 10잔기이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1차 DW-ACP의 조절자 부위는 2-10개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함한다. 가장 바람직하게는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위 및 축퇴성 서열 부위 사이에 있는 유니버설 염기는 약 3-5 잔기 길이를 갖는다. 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 연속적 또는 단속적(intermittent), 바람직하게는 연속적 방식으로 존재할 수 있다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위는 어닐링 특이성에 부분적으로 기여한다. 중요하게는, 5’-말단 부위는, 증폭 반응의 첫 번째 라운드 이후의 후속의 증폭 반응에서 단독 또는 다른 부위와 함께 프라이밍 위치로 작용한다. 바람직한 구현예에 따르면, 5’-말단 부위의 전-선택(pre-selected) 뉴클레오타이드 서열은 주형 핵산상의 어떠한 위치에 대하여도 실질적으로 상보적이지 않다.
일반적으로, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위는 최소 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 5’-말단 부위 서열의 길이는 최대 60 뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게는, 5’-말단 부위 서열의 길이는 6-50 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 18-25 뉴클레오타이드이다. 5’-말단 부위에서 보다 긴 서열이 이용되면, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 효율이 감소될 수 있고, 보다 짧은 서열이 이용되면, 고엄격 조건 하에서 어닐링 효율이 감소될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 5’-말단 부위의 전-선택 뉴클레오타이드 서열은 T3 프로모터 서열, T7 프로모터 서열, SP6 프로머터 서열 및 M13 전방향 또는 역방향 유니버설 서열과 같은 유니버설 프라이머 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, DW-ACP의 이점, 즉 어닐링 특이성의 개선이 손상되지 않는 범위 내에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위를 변형할 수 있다. 예를 들어, 5’-말단 부위는 제한효소(들)의 인식 서열(들)을 포함할 수 있으며, 상기 서열은 증폭 산물이 적합한 벡터 내로 클로닝하는 것을 용이하게 한다. 또한, 5’-말단 부위는 증폭 산물의 검출 또는 분리용 표지를 갖는 최소 하나의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 적합한 표지는 형광단, 발색단, 화학발광단, 자기입자, 방사능동위원소, 매스 표지, 전자밀집입자, 효소, 조인자, 효소에 대한 기질, 그리고 항체, 스트렙타비딘, 바이오틴, 디곡시게닌과 킬레이팅기와 같은 특정 결합 파트너를 갖는 햅텐을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 5’-말단 부위는 박테리오파아지 RNA 중합효소 프로모터 부분을 포함할 수 있다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 랜덤 서열 부위는 조절자 및 5’-말단 부위 사이에 위치한다. 용어 “축퇴성 랜덤 서열” 부위는 4종의 디옥시리보뉴클레오타이드, 즉 dATP, dTTP, dCTP 및 dGTP 중 어느 하나(any one)에 의해 각각의 뉴클레오타이드가 차지되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서 축퇴성 랜덤 서열 부위는 다양한 뉴클레오타이드 서열들을 가지는 프라이머의 한 풀을 제공하며, 이 중에서 적어도 하나는 주형의 미지의 타깃 서열 상에 있는 어느 한 위치에 어닐링될 것으로 기대된다. 예를 들어, 축퇴성 랜덤 서열 부위에 3종의 축퇴성 뉴클레오타이드를 포함하는 제1차 축퇴성 DW-ACP가 합성되는 경우, 64종의 올리고뉴클레오타이드들이 생성될 수 있다. 따라서, 축퇴성 랜덤 서열 부위의 이용은, 제1차 축퇴성 DW-ACP가 특정되지 않은 타깃 핵산에 혼성화될 수 있는 가능성을 더욱 증가시킨다. 축퇴성 서열 및 3’-말단 부위 서열을 포함하는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 타깃 코어 서열이 주형의 한 위치에 혼성화되는 경우, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 부위 및 3’-말단 부위 서열의 상보적 결합 위치가 주형의 미지의 타깃 서열에 몇 개 존재하게 된다. 흥미롭게는, 본 발명자는, 기지 서열의 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 가장 근접한 거리에 있는 하나의 타깃-결합 위치에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 결합하여 하나의 주 타깃 산물이 일반적으로 생성된다는 사실을 관찰하였다. 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 보다 이격된 위치에 존재하는 다른 결합 위치들에 혼성화되는 프라이머들은 산물을 잘 생성하지 않으며, 그 이유는 타깃-특이적 프라이머 서열로부터 가장 근접한 결합 위치에 혼성화된 프라이머가 연장되면 이는 다른 결합 위치들에 혼성화된 프라이머들의 연장을 방해할 수 있기 때문이다.
3’-말단 부위의 길이, 증폭 반응 수율 및 증폭될 뉴클레오타이드의 길이와 같은 다양한 고려 사항에 따라, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 랜덤 서열 부위의 길이가 결정될 수 있다. 예를 들어, 축퇴성 서열 부위의 길이가 증가하면, 본 발명에서 증폭 수율이 감소한다. 일반적으로, 축퇴성 서열 부위의 길이는 1-5, 바람직하게는 2-5, 보다 바람직하게는 2-4, 가장 바람직하게는 3이다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 미지의 뉴클레오타이드 서열 상의 한 위치에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서의 작용을 할 수 있는 범위 내에서, 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 대한 하나 또는 그 이상의 미스매치를 가질 수 있다는 것은 당연하다. 가장 바람직하게는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 미지의 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에에 완전히 상보적인, 즉 미스매치되는 서열이 없는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 미지의 서열의 한 위치에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열, 즉 “아비트러리(arbitrary)” 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 용어 “아비트러리 뉴클레오타이드 서열”은 증폭될 미지의 핵산 서열에 대한 정보 없이 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
일반적으로, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위의 길이는 최소 3 뉴클레오타이드이다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 서열 및 3’-말단 부위)의 길이가 최소 6 뉴클레오타이드라는 것은 중요한 사항이며, 이 길이는 프라이머가 특이성을 가지고 어닐링하는 데 요구되는 최소 길이 요건으로 판단된다. 실제적으로, 특이성을 가지는 프라이머 어닐링은 어닐링 부위가 최소 8 뉴클레오타이드일 경우 담보될 수 있다. 바람직하게는, 3’-말단 부위의 길이는 3-20 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 4-6 뉴클레오타이드이다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 준비된다. 상기 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열은 5’-ANNATGN-3'과 같은 해독 개시 코돈 ATG를 포함하는 mRNA의 코자크 서열을 포함할 수 있으며, 상기 N은 4종의 디옥시뉴클레오타이드 중에서 어느 하나이다(McBratney and Sarnow, 1996). 또한, 상기 특정 아비트러리 뉴클레오타이드 서열은 표준의 폴리아데닐화 시그널 서열 AATAAA을 포함할 수 있다(Juretic and Theus, 1991). 선택적으로, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위의 5’-말단에 있는 뉴클레오타이드는 4종의 디옥시뉴클레오타이드 중에서 어느 하나를 갖도록 다양화할 수 있으며, 이에 의해 3’-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열의 측면에서 4종류의 제1차 축퇴성 DW-ACP가 얻어진다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위의 길이는, 증폭될 뉴클레오타이드의 길이, 축퇴성 서열 부위의 길이 및 증폭 수율과 같은 다양한 고려 사항에 기초하여 결정될 수 있다. 예컨대, 3’-말단 부위가 4개의 아비트러리 뉴클레오타이드를 가지는 경우, 이론적으로 4-염기 서열 조합은 주형에서 256 bp 마다 한번씩 존재할 수 있다. 따라서, 증폭되는 뉴클레오타이드의 길이는 256 bp 이상이 된다.
제1차 축퇴성 DW-ACP의 전체 길이는 바람직하게는 20-80 뉴클레오타이드이고, 보다 바람직하게는 28-50 뉴클레오타이드이며, 가장 바람직하게는 30-40 뉴클레오타이드이다.
본 발명의 방법에 있어서, 주형의 기지의 뉴클레오타이드 서열 상에 있는 한 위치에 대한 실질적으로 상보적인 제1차 타깃-특이적 프라이머가 이용된다. 제1차 타깃-특이적 프라이머를 언급하면서 사용되는 용어 “실질적으로 상보적”은 제1차 축퇴성 DW-ACP에 대하여 사용되는 용어와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서, 제1차 증폭반응(primary amplification)은 DW-ACP 시스템의 장점을 최대화하기 위하여 서로 다른 어닐링 온도에서 실시되는 2-단계 증폭 과정에 따라 실시된다.
본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 핵산 분자의 증폭에도 이용될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.
mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용된다. 역전사 단계는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은, 증폭될 분자가 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않는다. 특히, 증폭될 수 있는 분자는 자연의 원핵세포 핵산, 진핵세포 (예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 저등동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스 (예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 및 비로이드 핵산을 포함한다. 또한, 상기 뉴클레오타이드 서열은 화학적으로 합성되었거나 또는 합성될 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 따라서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 자연에서 발견되거나 또는 발견되지 않는 것이다.
본 발명에서 이용되는 제1차 축퇴성 DW-ACP는 미지의 뉴클레오타이드 서열 상의 한 위치에 혼성화 또는 어닐링 되며, 결국 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 어닐링 부위(즉, 축퇴성 서열 및 3’-말단 부위)의 서열은 완전한 상보성을 나타낼 필요는 없고, 단지 안정된 이중쇄 구조를 형성할 수 있을 정도의 실질적으로 상보적인 서열을 가지면 된다. 따라서, 이중쇄 구조의 형성을 위한 혼성화를 완전히 배제하지 않는 한도 내에서 완전한 상보성 (complete complementarity)으로부터의 이탈이 허여된다. 미지 서열상의 한 위치에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 혼성화되는 것은 중합효소에 의한 주형-의존성 중합반응의 선제 조건이다. 상보적인 핵산에 제1차 축퇴성 DW-ACP가 염기쌍을 형성하는 데 영향을 미치는 인자 (Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985))는 프라이밍 효율에 영향을 미친다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 뉴클레오타이드 조성은 최적 어닐링 온도에 영향을 미치며 따라서 프라이밍 효율에도 영향을 미친다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 “클레나우” 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다.
본 발명의 두 단계 증폭 과정은 단지 시간적으로만 분리되어 있다. 제1단계 증폭 다음에 제2단계 증폭이 이어진다. 따라서 상기 2-단계 증폭은 모든 종류의 프라이머, 제1차 DW-ACP, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 포함하는 하나의 반응 시스템에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링 또는 혼성화는 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격 조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 본 발명에 있어서, 2 단계 증폭 과정은 서로 조건, 특히 각각 서로 다른 어닐링 온도에서 실시된다. 바람직하게는, 제1단계 증폭은 낮은 엄격 조건, 특히 낮은 어닐링 온도에서 실시된다. 보다 바람직하게는, 제1차 어닐링 온도는 약 35-50℃이고, 가장 바람직하게는 40-48℃이다. 제1차 어닐링 온도에서, 제1차 DW-ACP의 어닐링 부위는 축퇴성 서열과 3’-말단 부위로 한정되며, 이는 어닐링 특이성을 향상시킨다.
본 발명에 따르면, 저엄격 조건하에서의 제1단계 증폭 과정은, 제1단계 증폭에서의 프라이머 어닐링의 특이성을 개선하기 위하여, 어닐링, 연장 및 변성의 최소 1 사이클을 실시하며, 그런 다음 제2단계 증폭 과정이 고엄격 조건하에서 보다 효과적으로 진행된다. 가장 바람직하게는, 제1단계 증폭 과정은 1 사이클이 실시된다. 제1단계 증폭 과정의 1 사이클 실시는 중요한 사항이며, 이는 제1차 축퇴성 DW-ACP 단독으로 비-특이적 증폭 산물을 형성하는 것을 억제하기 때문이다. 제1차 증폭의 1 사이클(제1단계 증폭) 동안에, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 저엄격 조건 하에서 주형의 미지 타깃 위치들에 결합한다. 그러나, 제1차 증폭의 다른 사이클들(제2단계 증폭)에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위는 제1차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외하고, 고엄격 조건 하에서 주형에 결합하는 또는 연장된 프라이머 서열에 결합하는 프라이머로 작동하지 않는다. 결국, 제1차 축퇴성 DW-ACP 단독은 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장 산물을 제외하고는 제1차 증폭 동안에 어떠한 산물도 생성시킬 수 없다(도 2 참조).
제2단계 증폭 과정은 바람직하게는 고염격 조건, 특히 높은 어닐링 온도에서 실시한다. 유리하게는, 제2차 어닐링 온도는 약 50-72℃, 보다 바람직하게는 50-65℃, 가장 바람직하게는 52-65℃이다. 제2차 어닐링 온도와 같은 높은 어닐링 온도에서, 제1차 축퇴성 DW-ACP는 더 이상 프라이머로서 작용하지 않으며; 대신에, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머가 높은 특이성으로 프라이머 작용을 한다.
고엄격 조건 하에서의 제2단계 증폭 과정은, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머의 조합을 이용하여 최소 1 사이클, 바람직하게는 최소 5 사이클 동안 실시되며, 이에 의해 제1차 축퇴성 DW-ACP로부터 유래된 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열이 없는 미지의 타깃-특이적 산물이 생성된다. 보다 바람직하게는, 제2단계 증폭은 10-40 사이클, 보다 더 바람직하게는 10-30 사이클, 그리고 가장 바람직하게는 10-20 사이클 동안 실시된다.
고엄격 및 저엄격 조건은 당업계에 공지된 표준으로부터 용이하게 결정할 수 있다. 용어 “사이클”은 타깃 핵산의 1 카피 (copy)를 생성하는 과정을 나타낸다. 사이클은 변성, 어닐링 및 연장 과정을 포함한다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2차 축퇴성 DW-ACP는 다음 일반식 II로 표시된다:
5’-X'p-Su-Y'v-Z'w-3’(II)
상기 일반식에서, X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-말단 부위를 나타내며, Su는 단계 (a-2-1)의 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, Y'v는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하는, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내며, p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고; X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
두 개의 연관된 서열을 언급하면서 사용되는 용어 “해당하는(corresponding to)"은 하나의 뉴클레오타이드 서열이 다른 비교 대상의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화될 수 있는 뉴클레오타이드 서열과 혼성화 될 정도로 서로 완전 동일하거나 혹은 부분적으로 동일한 서열임을 표현하기 위하여 사용되는 용어이다.
일반식 II의 제2차 DW-ACP는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 서열에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일반식 II의 프라이머는 보다 높은 어닐링 특이성을 나타낸다.
제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위는 제1차 DW-ACP의 5’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있다. 즉, 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 제1차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 서열과 완전 동일하거나 혹은 일부 동일하다. 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위와 제1차 DW-ACP의 5’-말단 부위에 대해 반대 센스(opposite sense)를 가지는 뉴클레오타이드 서열 사이에 이중쇄 구조가 형성되게 하는 혼성화를 완전히 배제하지 않는 범위에서, 완전 동일성으로부터의 이탈이 허용된다.
일반식 II의 제2차 DW-ACP에서 보조 어닐링 부위(Su)는 매우 독특한 것이며, 이는 비특이적 위치에 대한 프라이머의 비특이적 결합으로부터 초래되는 높은 백그라운드 문제를 완벽하게 제거하는 데 어느 정도 기여를 하는 부위이다. 상기 보조 어닐링 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽(opposite) 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보조 어닐링 부위를 이와 같이 디자인한 전략은, DNA 중합효소(예컨대, Taq 중합효소)가 유니버설 염기를 인식하여 자연 NMPs의 삽입을 지시하는 방식을 이용한 것이다. DNA 중합효소가 유니버설 염기를 인식하는 방식은, Geoffrey C. Hoops, et al. (Nucleic Acids Research, 25(24):4866-4871(1997)이 발표를 하였으나, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 8-히드록시구아닌, 2-히드록시아데닌, 6-O-메틸구아닌 및 크산틴은 각각 (C 및 A), (T 및 A), (T 및 C) 및 (T 및 C)의 삽입을 지시한다. 또한, Geoffrey C. Hoops, et al.은, 니트로피롤 및 이노신을 포함하는 염기는, 가장 선호적으로, 각각 dAMP 및 dCMP의 삽입을 지시한다고 발표하였다.
따라서 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 최소 2개의 디옥시이노신 또는 이노신 잔기를 포함하는 경우, 디옥시사이티딘 뉴클레오타이드가 조절자 부위의 반대쪽 부위에 가장 선호적으로 Taq 중합효소에 의해 삽입되기 때문에, 상기 보조 어닐링 부위는 최소 2개의 디옥시구아노신 뉴클레오타이드를 포함하여야 한다.
제2차 DW-ACP에서, Y'v, 조절자 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 억제한다. 또한, 상기 조절자 부위는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체의 비구별성 결합을 통하여 추가적인 어닐링 부위를 제공하며, 이는 제2차 DW-ACP가, 결과 산물에 있는 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 상보적인 서열에 선별적으로 어닐링 되도록 한다.
일반식 II의 조절자 부위는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위에 반대쪽에 위치하는 부위에 혼성화된다. 조절자 부위에 적합한 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 DNA 복제에 참여시 구별성을 상실하는 어떠한 염기도 가능하다. 바람직하게는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합을 포함한다. 보다 바람직하게는, 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이며, 가장 바람직하게는, 디옥시이노신이다.
일반식 II의 조절자 부위의 길이는, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 축퇴성 서열 부위의 길이에 의해 주로 결정된다. 또한, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위의 5’-말단에 있는 뉴클레오타이드가 특정의 뉴클레오타이드를 갖도록 디자인된 경우, 조절자 부위는 1개의 뉴클레오타이드만큼 길어진다. 일반식 II의 조절자 부위에 있는 유니버설 염기는, 바람직하게는, 연속적인 방식으로 존재한다.
제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위는 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지고 있다. 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위의 서열과 완전 동일하거나 혹은 부분적으로 동일하다. 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위와 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 대해 반대 센스(opposite sense)를 가지는 뉴클레오타이드 서열 사이에 이중쇄 구조가 형성되게 하는 혼성화를 완전히 배제하지 않는 범위에서, 완전 동일성으로부터의 이탈이 허용된다. 가장 바람직하게는, 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위의 뉴클레오타이드 서열은 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위와 완전히 일치하는 것이며, 이는 주형에 프라이머의 3’-말단 부위가 완전히 일치하는 것이 성공적인 증폭을 위해 요구되기 때문이다.
제2단계 증폭에 따르면, 제1차 타깃 특이적 프라이머는, 기지의 뉴클레오타이드 서열 상에 있는 그의 상보적인 서열에 어닐링하여 타깃-특이적 프라이머 연장 산물을 생성한다. 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 경우, 타깃-특이적 프라이머 연장 산물에 있는 그의 반대쇄(opposite strand)는 상술한 바와 같이 DNA 중합효소에 의해 선호되는 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위가 최소 2개의 디옥시이노신 또는 이노신 잔기를 포함하는 경우, 타깃-특이적 프라이머 연장 산물에 있는 그의 반대쇄에는 최소 2개의 디옥시사이티딘 뉴클레오타이드가 삽입된다.
타깃-특이적 프라이머 연장 산물이 생성된 이후, 제2차 DW-ACP와 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 제1차 증폭 산물이 생성된다. 제2단계 증폭 과정 동안, 제2차 DW-ACP의 모든 부위들이 증폭 산물의 3’-말단에 위치한 제1차 DW-ACP 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에만 어닐링되며, 조절자 때문에 다른 위치에는 어닐링하지 못한다. 따라서, 제2차 DW-ACP 단독으로는 비-특이적 산물을 생성할 수 없다(도 2 참조).
제1차 DW-ACP로부터 유래된 축퇴성 랜덤 서열이 없는 최종 제1차 증폭 산물은 제2차 증폭 과정에서 주형으로 이용된다. 제1차 증폭에 이어 제2차 증폭이 실시되는 경우, 제1차 증폭 산물에는 축퇴성 랜덤 서열이 없기 때문에 제2차 증폭 과정이 보다 높은 특이성 및 신뢰성으로 실시되는 데, 이의 상세한 설명은 아래에 기재되어 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은, 상기 제1차 증폭 산물의 3’-말단에 존재하는 상기 제2차 DW-ACP 서열에 대한 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 3’-말단 부위에 포함하는 제3차 DW-ACP 및 단계 (a)의 제1차 타깃-특이적 프라이머 또는 상기 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위한 네스티드 타깃-특이적 프라이머를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하는, 제3차 어닐링 온도에서 제2차 증폭 반응(secondary amplification)을 실시하는 단계 (c)를 추가적으로 포함한다.
바람직하게는, 제2차 증폭반응은 당업계에 공지된 네스티드(nested) 증폭 과정을 따르며, 이는 제1차 증폭 산물로부터 미지 타깃 산물을 선별적으로 증폭하기 위한 것이다. 바람직하게는, 제2차 증폭반응은 고염격 조건, 특히 높은 어닐링 온도에서 실시된다. 유리하게는, 상기 높은 어닐링 온도는 약 50-72℃, 보다 바람직하게는 50-70℃, 가장 바람직하게는 55-68℃이다. 높은 어닐링 온도에서, 제3차 DW-ACP의 일부 부위가 아닌 전 부위들이 어닐링에 참여한다. 따라서, 제3차 DW-ACP는, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에만 선별적으로 어닐링될 수 있다. 고염격 조건 하에서의 제2차 증폭반응은 최소 1 사이클, 바람직하게는 최소 5 사이클 동안 실시되며, 이에 의해 제1차 증폭산물이 증폭된다. 보다 바람직한 구현예에서, 제2차 증폭반응은 10-40 사이클 동안 실시된다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 제2차 증폭반응은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제3차 DW-ACP는 다음 일반식 III으로 표시된다:
5’-X”p-Y”q-Cc-3’(III)
상기 일반식에서, X”p는 상기 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 전체 또는 일부에 해당되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내고, Y”q는 일반식 II의 제2차 DW-ACP의 보조 어닐링 부위, 5’-말단 부위의 일부분, 보조 어닐링 부위의 일부분과 5’-말단 부위의 일부분, 또는 보조 어닐링 부위의 일부분과 조절자 부위의 일부분에 해당하며, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 제1차 증폭 산물의 비-타깃 서열에 X”p 부위가 어닐링하는 것을 방해하는 작용을 하며, Cc는 상기 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위와 조절자 부위 서열의 전부 또는 일부분에 대하여 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q 및 c는 뉴클레오타이드의 수이고, X”, Y”및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
제3차 DW-ACP에서, X”p는 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 전부에 해당되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
Y”q는 일반식 II의 제2차 DW-ACP에 반대되는 센스의 뉴클레오타이드 서열에 대한 결합 부위뿐만 아니라, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 제1차 증폭 산물의 비-타깃 서열에 X”p 부위가 어닐링하는 것을 억제하는 조절자 부위도 제공한다. 뿐만 아니라, 놀랍게도, 두 어닐링 부위, X”p 및 Cc 사이에 위치한 조절자 부위는 두 부위에 높은 어닐링 특이성을 제공할 수 있다.
3’-말단 부위, Cc는 제2차 DW-ACP의 조절자 부위 서열에 대해 반대되는 센스의 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 따라서, 제2차 DW-ACP의 조절자 부위가 최소 2개의 디옥시이노신 또는 이노신 잔기를 포함하는 경우, 상술한 바와 같이 디옥시사이티딘 뉴클레오타이드가 조절자 부위의 반대 부위에 가장 선호적으로 삽입되기 때문에, 상기 3’-말단 부위는 최소 2개의 디옥시구아노신 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직하다.
제2차 DW-ACP에 대한 설명은 일반식 III의 제3차 DW-ACP에 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)를 실시하기 전에, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 제거하기 위한, 단계 (a)의 반응 결과물을 정제하는 단계 (b)를 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 증폭 산물의 정제는 젤 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 가장 바람직하게는, 정제는 실리카-젤 막이 있는 스핀 컬럼을 이용하여 실시된다. 이 방법에 따르면, 증폭 산물은 고염의 존재하에서 실리카-젤 막에 흡착되며, 프라이머와 같은 불순물들은 컬럼을 통과하게 된다. 따라서 증폭산물은 증폭 반응물로부터 신속하게 정제되어 수득될 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 2-단계 증폭 과정을 포함하는 제1차 증폭 반응 단계 (a) 및 제2차 증폭 반응 단계 (c)를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 방법은 2-단계 증폭 과정을 포함하는 제1차 증폭 반응 단계 (a), 정제 단계 (b) 및 제2차 증폭 반응 단계 (c)를 포함한다.
비-특이적 증폭 반응을 완전히 극복한 소망하는 결과가 달성되지 않거나 혹은 의심스러운 경우, 또는 단계 (c)의 증폭 산물이 아가로스 젤에서 보이지 않는 경우, 제2차 증폭 산물의 안쪽 부위를 증폭하도록 디자인된 또 다른 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 추가적인 네스티드 증폭 반응을 최소 1 사이클 동안 실시할 수 있다.
본 발명의 방법은 특정 목적을 위한 공지의 다른 과정과 결합될 수 있다. 예를 들어, 증폭 산물의 분리 (또는 정제)는 제1차 증폭 또는 제2차 증폭 반응에 후속될 수 있다. 상기 과정은 젤 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 또는 혼성화에 의해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 클로닝용 담체에 삽입될 수 있다. 또한, 본 발명의 증폭 산물은 발현 벡터를 가지는 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 증폭 산물을 발현하기 위하여, 프로모터의 조절하 또는 프로모터에 작동적으로 연결된 증폭 산물을 운반하는 발현 벡터를 제조한다. 다양한 숙주-발현 시스템에서 단백질 또는 펩타이드 발현을 하기 위하여, 증폭산물 및 전사/번역/조절 서열을 포함하는 발현 벡터를 제작하는 많은 표준 기술들이 알려져 있다. 원핵세포 숙주용 프로모터는 pL λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터 및 T7 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 진핵세포 숙주용 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 그리고 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 또는 사이토메갈로 바이러스로부터 유래된 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵세포 숙주의 예는 E. coli, 바실러스 서브틸리스, 그리고, 살로넬라 티피무리움, 세라티아 마르세센스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내세균을 포함한다. 미생물뿐만 아니라, 다세포 유기체로부터 유래된 세포 배양물도 숙주로서 이용할 수 있다. 척추동물 또는 무척추동물로부터 유래된 세포배양물이 이용될 수 있다. 포유동물 세포뿐만 아니라, 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대, 콜리플라우어 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 하나 또는 그 이상의 암호화 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예컨대, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물도 이용될 수 있다. 증폭산물로부터 발현된 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 방법에 따라 정제될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머를 제공한다:
5’-Xp-Yq-Zr-Qs-3’(I)
상기 일반식에서, Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜던 서열 부위를 나타내며, Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q, r 및 s는 뉴클레오타이드의 수이고; 상기 X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머를 제공한다:
5’-X'p-Su-Y'v-Z'w-3’(II)
상기 일반식에서, X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-말단 부위를 나타내며, Su는 단계 (a-2-1)의 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, Y'v는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하는, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내며, p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고; X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 III로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머를 제공한다:
5’-X”p-Y”q-Cc-3’(III)
상기 일반식에서, X”p는 상기 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 전체 또는 일부에 해당되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내고, Y”q는 일반식 II의 제2차 DW-ACP의 보조 어닐링 부위, 5’-말단 부위의 일부분, 보조 어닐링 부위의 일부분과 5’-말단 부위의 일부분, 또는 보조 어닐링 부위의 일부분과 조절자 부위의 일부분에 해당하며, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 제1차 증폭 산물의 비-타깃 서열에 X”p 부위가 어닐링하는 것을 방해하는 작용을 하며, Cc는 상기 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위와 조절자 부위 서열의 전부 또는 일부분에 대하여 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q 및 c는 뉴클레오타이드의 수이고, X”, Y”및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
본 발명의 DW-ACP는 상술한 본 발명의 증폭 과정에 이용되는 것이기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 과도한 반복 기재를 초래하는 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 제1차 축퇴성 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머, 제2차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머, 제3차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 또는 이의 조합을 포함하는 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 타깃-특이적 프라이머를 추가적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 PCR 반응에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 디옥시리보뉴클레오타이드-5’-트리포스페이트를 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 키트는 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 완충액 및 시약, DNA 중합효소의 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적양은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 구획에 상술한 성분들을 포함한다.
본 발명은 핵산 증폭반응, 바람직하게는 PCR을 실시하여 핵산 또는 핵산들(DNA 또는 mRNA)의 혼합물로부터 미지의 뉴클레오타이드 서열을 선별적으로 증폭하는 개선된 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열의 핵산 증폭 과정을 포함하는 프로세스를 위한 상술한 본 발명 방법의 용도를 제공한다.
본 발명은 다양한 핵산 증폭-기반 기술에 적용될 수 있다. 대표적인 예는 다음과 같다:
(i) 기지의 뉴클레오타이드 서열의 크로모좀 부위의 어느 한쪽에 있는 미지의 연속의 DNA 부위들을 수득하는 지놈 워킹. 예로서 지놈 시퀀싱 프로젝트, 프로모터 부위의 클로닝, 엑손/인트론 연결부위오 같은 유전자 구조의 동정, 갭 필링 및 트랜스유전자의 위치 또는 방향성을 포함한다;
(ⅱ) 전장 cDNA의 클로닝 또는 시퀀싱, 또는 스플라이싱 분석을 위한 cDNA의 5’- 및 3’-말단의 신속한 증폭(RACE);
(ⅲ) 결실, 삽입 및 좌위을 포함하는 부위의 맵핑; 그리고
(ⅳ) 전체 지놈 시퀀싱을 위하여 샷건 클로닝 없이 BAC 말단의 신속한 증폭.
하기의 특정 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 첨부된 청구항에 의하여 판단되는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
도 1A는 제1차 축퇴성 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP), 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하는 제1차 증폭 과정의 구체적인 일 구현예를 보여주는 도면이다.
도 1B는 제3차 DW-ACP 및 제2차 타깃-특이적 프라이머를 이용하는 제2차 증 폭 과정의 구체적인 일 구현예를 보여주는 도면이다.
도 2는 DNA 워킹 증폭에 의해 생성된 증폭 산물을 보여준다. 종래의 DNA 워킹 프라이머 단독은 증폭산물을 생성시켰다(레인 1 및 2). 반대로, DW-ACP 단독은 어떠한 가시적 산물도 형성시키지 않았으나(레인 4), 테일 프라이머가 이용된 경우, 테일 프라이머의 주형에 대한 비특이적 결합 때문에 비특이적 산물을 형성시켰다(레인 3).
도 3은 TNF-α 유전자의 프로모터 서열의 증폭을 위한 DW-ACP-증폭에 의해 생성된 증폭 산물을 보여 준다. 다른 크기의 주 산물은 각각의 다른 제1차 DW-ACPs, DW-ACP1-A(레인 1), DW-ACP1-T(레인 2), DW-ACP1-G(레인 3) 및 DW-ACP1-C(레인 4)로부터 생성된 것이다. 이들 산물들은, 서열 분석을 통해 TNF-α 유전자의 프로모터 서열로 규명되었다.
도 4는 PBP cDNA의 5’-말단 부위 서열의 증폭을 위한 DW-ACP-증폭에 의해 생성된 증폭 산물을 보여 준다. 다른 크기의 주 산물은 각각의 다른 제1차 DW-ACPs, DW-ACP1-A(레인 1), DW-ACP1-T(레인 2), DW-ACP1-G(레인 3) 및 DW-ACP1-C(레인 4)로부터 생성된 것이다.
실시예
하기의 실시예에서, 다음의 약어들이 이용된다: M(molar), mM millimolar), μM (micromolar), g (gram), ㎍ (micrograms), ng (nanograms), ℓ(liters), ml (milliliters), ㎕ (microliters), ℃(degree Centigrade); Roche (Roche Diagnostics, Mannheim, 독일); Promega (Promega Co., Madison, 미국); QIAGEN (QIAGEN GmbH, Hilden, 독일); 및 Applied Biosystems (Foster City, CA, 미국).
실시예에서 이용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 서열목록에 기재되어 있다.
실시예 1: DNA 워킹 ACP - PCR 방법에서 ACP 시스템의 평가
DNA 워킹 ACP-PCR에서 ACP 시스템의 효과를 평가하기 위하여, ACP 시스템을 종래의 장 프라이머(longer primer) 시스템과 비교 실험 하였다. 주형으로서 식물 지놈 DNA를 이용하였다.
A. 프라이머 디자인
유기체의 DNA 또는 핵산 혼합물로부터 기지의 서열의 부위에 인접한 미지 서열을 증폭하기 위하여, DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACPs)를 디자인 하였다. 제1차 DW-ACP는, 3’-말단 타깃 결합 서열과 5’-말단 비-타깃 테일 사이에 폴리디옥시이노신[폴리(dI)] 링커를 가지는 삼분할 구조를 갖도록 하였고, 상기 3’-말단 타깃 결합 서열은 3’-말단에 전결정 아비트러리 서열 그리고 5’-말단에 축퇴성 랜덤 서열을 포함하며, 3’-말단 타깃 결합 서열의 3’-말단과 5’-말단 사이에는 A, C, T 및 G 중 어느 하나가 포함되도록 하였다. 따라서, DW-ACP의 3’-말단 타깃 결합 서열의 3’-말단에 있는 아비트러리 서열에 따라, 최소 4종의 DW-ACP 프라이머가 생성된다.
4종의 제1차 축퇴성 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(제1차 DW-ACPs)는 다음과 같이 디자인되었고, 어닐링 조절 프라이머(ACP)는 본 발명자에 의해 개발되었고 WO 03/050305에 개시되어 있다:
DW-ACP1-A: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNAGGTC-3' (SEQ ID NO:1);
DW-ACP1-C: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNCGGTC-3' (SEQ ID NO:2);
DW-ACP1-T: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNTGGTC-3'(SEQ ID NO:3); 및
DW-ACP1-G: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIINNNGGGTC-3' (SEQ ID NO:4).
제2차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(제2차 DW-ACPs)는 다음과 같이 디자인되었다:
DW-ACP2-N: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIIIGGTC-3' (SEQ ID NO:5);
DW-ACP2-NA: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIIAGGTC-3' (SEQ ID NO:6);
DW-ACP2-NC: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIICGGTC-3' (SEQ ID NO:7);
DW-ACP2-NT: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIITGGTC-3'(SEQ ID NO:8); 및
DW-ACP2-NG: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGGGIIIGGGTC-3' (SEQ ID NO:9).
제3차 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(제3차 DW-ACPs)는 다음과 같이 디자인되었다:
DW-ACP3-N1: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAIIIIGGGGGGTC-3' (SEQ ID NO:10);
DW-ACP3-N2: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGIIIIGGGGGTC-3' (SEQ ID NO:11); 및
DW-ACP3-N3 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGAGGIIIIGGGGTC-3' (SEQ ID NO:12).
또 다른 제3차 DW-ACP는, 네스티드 DW-ACP에 이용될 네스티드 프라이머 용도로 디자인 되었고 그 서열은 다음과 같다:
Nested DW-P3-N: 5'-CCAAGCGAGGGGGGGGGGTC-3' (SEQ ID NO:13).
ACP의 폴리디옥시이노신[폴리(dI)] 링커는 주형의 비-타깃 위치에 5’-말단 테일 서열이 어닐링 하는 것을 억제하며, 특정 온도에서 타깃 서열에 3’-말단에서 프라이머 혼성화가 발생되는 것을 촉진하는 작용을 하며, 결국 어닐링 특이성을 크게 증가시킨다(Hwang et al., 2003).
대조군으로서, 폴리디옥시이노신[폴리(dI)] 링커 없이 테일을 서열을 가지는 종래의 DNA 워킹 장 프라이머(DW-Ps)를 이용하였고, 그의 서열은 다음과 같다:
DW-P1-A: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGANNNAGGTC-3' (SEQ ID NO:14);
DW-P1-C: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGANNNCGGTC-3' (SEQ ID NO:15);
DW-P1-T: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGANNNTGGTC-3' (SEQ ID NO:16);
DW-P1-G: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGANNNGGGTC-3' (SEQ ID NO:17); 및
DW-P1: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGANNNNGGTC-3' (SEQ ID NO:18).
DW-ACPs 및 DW-Ps의 5’-말단 부위 서열에 해당하는 테일 프라이머, JYC3 및 JYC3-ACP는 다음과 같다:
JYC3: 5'-TCACAGAAGTATGCCAAGCGA3' (SEQ ID NO:19).
본 실시예에서의 프라이머는 DNA 합성기(Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI))를 이용하여 표준 프로토콜에 따라 합성되었다. 프라이머 내의 디옥시이노신은 디옥시이노신 CE 포스포라미다이트(ABI)를 이용하여 삽입하였다. OPC 카트리지(ABI)를 이용하여 프라이머를 정제하였고, UV 스펙트로포토미터로 260 nm에서 프라이머의 농도를 결정하였다. 프라이머에서, “I"는 디옥시이노신, 그리고 "N"은 4종의 디옥시리보뉴클레오타이드, 즉, dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP 중에서 어느 하나의 뉴클레오타이드에 의해 차지된 축퇴성 뉴클레오타이드를 의미한다.
B. 지놈 DNA 분리
대두 슈트를 지놈 DNA 분리에 이용하였다. 시료를 액체 질소에 급속하게 냉동시킨 다음 그라인딩을 하였다. 그라인딩된 시료 200 ㎍을, 분해 완충액(100 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 25 mM EDTA pH 8.0, 및 0.5% SDS) 1.2 ml 및 20 mg/ml의 프로테아제 K 6 ㎕를 포함하는 15 ml 튜브에 첨가하였다. 튜브를 50℃에서 12시간 동안 가열하였다. 지놈 DNA를 동일 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1)로 2회 추출한 다음, 클로로포름/이소아밀 알코올(24:1)로 1회 추출하였다. 이렇게 분리된 지놈 DNA를 DNA 워킹 ACP-PCR 방법에서 ACP 시스템의 효과를 평가하는 데 주형으로 이용하였다.
C. 제1차 DNA 워킹 PCR
종래의 지놈 워킹 방법들은, PCR 동안에 DNA 워킹(DW) 프라이머가 주형에 비특이적으로 프라이밍 하기 때문에 높은 백그라운드 문제점을 가지고 있다. 따라서 종래의 DW-P 단독 또는 DW-ACP 단독을 이용하여 DNA 워킹 PCR을 실시하여, DW 프라이머 단독이 비특이적 산물을 생성하는 지 여부를 확인하였다.
DW-P에 대한 종래의 PCR을 타깃-특이적 프라이머 없이 실시하였고, 대두 지놈 DNA 100 ng, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, DW-P1(10 μM) 5 ㎕ 또는 DW-P1-C(10 μM) 5 ㎕, 및 Taq 중합효소 (5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정치시킨 다음; 다음의 PCR 반응을 실시하였다. 94℃에서 5분 변성 반응, 이어, 94℃ 40초, 47℃ 40초 및 72℃ 60초의 30 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응.
제1차 DW-ACP에 대한 ACP-PCR을 2-단계 PCR 증폭으로 실시하여 ACP 시스템의 이점을 최대화 하였다.
2-단계 PCR 증폭을 타깃-특이적 프라이머 없이 서로 다른 2 어닐링 온도에서 실시하였고, 대두 지놈 DNA 100 ng, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, DW-ACP1-C(10 μM) 1 ㎕, 및 Taq 중합효소(5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼 합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정치시킨 다음; 94℃ 5분, 45℃ 3분 및 72℃ 1분의 1 사이클로 이루어진 제1단계 PCR을 실시하고, 이어, 94℃ 40초, 60℃ 40초 및 72℃ 60초의 30 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응하여 제2단계 PCR을 실시하였다.
D. 제1차 DNA 워킹 산물의 정제
제1차 DNA 워킹 PCR에서 이용된 DW-Ps 또는 제1차 DW-ACPs와 같은 프라이머를 제거하기 위하여, 제1차 증폭 반응 산물을 스핀 컬럼(PCR purification Kit, QIAGEN)을 이용하여 정제하였다.
E. 제1차 DNA 워킹 PCR 산물의 제2차 증폭
축퇴성 DNA 워킹 산물을 증폭하기 위하여, 축퇴성 제1차 DW-ACP의 전체 풀(pool)에 대하여 완벽하게 상보적인 서열에만 선별적으로 어닐링 하는, DW-P, 제1차 DW-ACP 또는 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위 서열에 해당하는 테일 프라이머(JYC3)를 이용하여 PCR을 실시하였다.
PCR 반응은 타깃-특이적 프라이머 없이 실시하였고, DNA 워킹 PCR에 의해 생성된 PCR 산물 2 ㎕, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, 테일 프라이머 JYC3(10 μM) 1 ㎕ 또는 DW-ACP2-N(10 μM) 1 ㎕, 및 Taq 중합효소 (5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정 치시킨 다음; 다음의 PCR 반응을 실시하였다. 94℃에서 5분 변성 반응, 이어, 94℃ 40초, 60℃ 40초 및 72℃ 60초의 30 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응.
F. 전기영동
증폭 산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동 한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다.
도 2는 종래의 DW 프라이머 또는 DW-ACP 단독을 이용하여 실시된 DNA 워킹 PCR의 증폭 산물을 보여준다. 종래의 DW 프라이머, DW-P1(레인 1) 또는 DW-P1-C(레인 2)와 JYC3의 조합은, 타깃-특이적 프라이머를 사용하지 않았음에도 불구하고, 많은 PCR 산물을 생성시켰으며, 이러한 결과는, 종래의 DW 프라이머 및 테일 프라이머는 비-특이적 산물을 생성시킨다는 것을 보여준다. DW-ACP1-C 및 JYC3 조합은, 타깃-특이적 프라이머를 사용하지 않았음에도 불구하고, PCR 산물을 생성시켰으나(레인 3), DW-ACP1-C 및 DW-ACP2-N 조합은 어떠한 가시성 산물을 형성시키지 않았다(레인 4). 이러한 실험 결과는, 제1차 DW-ACP는 제1차 DNA 워킹 ACP-PCR에서 이용될 수 있지만, 만일 테일 프라이머 JYC3가 제2차 PCR 반응에서 이용되면 이는 주형의 비특이적 위치에 결합하여 결국 비특이적 산물을 증폭(레인 3)하게 됨을 보여주는 것이다. 반대로, DW-ACP2-N이 제2차 PCR 반응에서 이용되면, 이 프라이머는 ACP 시스템의 특징 때문에 주형의 비특이적 위치에 결합하지 않으며, 결국 산물을 생성하지 않는다(레인 4).
상기 실험 결과로부터 3가지 중요한 결론을 도출할 수 있다: 1) 종래의 DW 프라이머는 주형에 비특이적으로 프라이밍하기 때문에 제1차 증폭에서 많은 비특이적 산물을 생성하며, 생성된 산물은 제2차 증폭 과정에서 테일 프라이머에 의해 증폭된다; 2) 반대로, 제1차 DW-ACP는 저엄격 조건 하의 제1차 증폭의 1 사이클(제1단계 PCR)에서 주형의 특이적 위치에만 결합하며, 이 프라이머는 어닐링 부위(즉, 축퇴성 서열 및 3’-말단 부위)가 주형 또는 제1차 DW-ACP 프라이머 연장산물에 결합할 수 없는 고염격 조건 하에서의 제1차 증폭의 다음 사이클(제2단계 PCR) 동안에, 더 이상 프라이머로서 작용하지 않으며, 따라서 제2차 DW-ACP 단독은 제2차 PCR 반응에서 어떠한 산물도 형성시키지 않는다; 그리고 3) 테일 프라이머가 제2차 PCR에 이용되는 경우, 테일 프라이머는 주형의 비특이적 위치에 결합하여 비특이적 산물을 생성시킨다.
도 2의 결과는, DNA 워킹 ACP-PCR 시스템이 백그라운드 문제를 근본적으로 해결함을 나타내는 것이며, 상기 문제는 프라이머로서 테일링 서열, 어탭터 서열 또는 카세트 서열을 종래의 기술의 중용한 문제점이다.
실시예 2: DNA 워킹 ACP PCR 방법을 이용한 마우스 지놈으로부터 TNF -α 유전자의 프로모터 서열의 증폭
본 발명의 DNA 워킹 ACP-PCR 방법의 응용을 입증하기 위하여, 마우스 TNF-α 유전자의 프로모터 서열을, TNF-α 서열 정보를 이용하여 마우스 지놈으로부터 증 폭하였다.
A. 프라이머 디자인
실시예 1과 동일한 방식으로 디자인된 DW-ACPs를, DNA 워킹 ACP-PCR 증폭에 이용하였다. TNF-α 유전자의 타깃-특이적 프라이머는 다음과 같이 디자인 되었다:
mTNFα-C1: 5'- CACCTTGCCCTGCCCATTAG-3' (SEQ ID NO:20);
mTNFα-C2: 5'- CCCTCACACTGTCCTTCTTGCC-3' (SEQ ID NO:21);
mTNFα-C3: 5'- GAATAAGGGTTGCCCAGACACTC-3' (SEQ ID NO:22); 및
mTNFα-C4: 5'- GGAGTGCCTCTTCTGCCAGTTC-3' (SEQ ID NO:23).
상기 프라이머들를 실시예 1과 같이 DNA 합성기를 이용하여 합성하였다.
B. 지놈 DNA 분리
상기 실시예 1과 같이, 마우스 태반 조직으로부터 지놈 DNA를 분리하였다.
C. 제1차 DNA 워킹 ACP PCR
제1차 DNA 워킹 ACP PCR을 4개의 각각의 튜브에서 실시하였고, 각각의 튜브는 각각의 제1차 DW-ACP를 포함하며, PCR은 ACP 시스템의 이점을 최대화 하기 위하 여 2-단계 PCR 증폭으로 실시하였고, ACP 시스템은 본 발명자에 의해 개발되었으며 WO 03/050305에 개시되어 있다.
2-단계 PCR 증폭을 서로 다른 2 어닐링 온도에서 실시하였고, 마우스 지놈 DNA 100 ng, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, 제1차 DW-ACPs(10 μM) 중 어느 하나 1 ㎕, 제2차 DW-ACP, DW-ACP2-N(10 μM) 1 ㎕, 제1차 타깃-특이적 프라이머 mTNFα-C1(10 μM) 1 ㎕, 및 Taq 중합효소(5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정치시킨 다음; 94℃ 5분, 40-45℃ 1분 및 72℃ 2분의 1 사이클로 이루어진 제1단계 PCR을 실시하고, 이어, 94℃ 40초, 55-60℃ 40초 및 72℃ 60초의 10-30 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응하여 제2단계 PCR을 실시하였다.
D. 제1차 DNA 워킹 ACP PCR 산물의 정제
제1차 DNA 워킹 ACP PCR에서 이용된 DW-ACPs 및 제1차 타깃-특이적 프라이머와 같은 프라이머를 제거하기 위하여, 제1차 증폭 반응 산물을 스핀 컬럼(PCR purification Kit, QIAGEN)을 이용하여 정제하였다.
E.제2차 DNA 워킹 ACP PCR
유전자-특이적 프라이머 mTNFα-C1의 주형에 대한 비특이적 주형으로부터 초 래되는 비특이적 산물을 가질 수 있는 제1차 DNA 워킹 ACP-PCR 산물로부터 미지의 타깃-특이적 산물만을 증폭시키기 위하여, 제2차 DW-ACP PCR을 제3차 DW-ACP 및 테스티드 TNFα 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 실시하였고, 상기 프라이머는 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된 것이다. 제2차 PCR 증폭은 제1차 PCR 증폭 산물 1-5 ㎕, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, 제3차 DW-ACP DW-ACP3-N(10 μM) 1 ㎕, 네스티드 유전자-특이적 프라이머 mTNFα-C2(10 μM) 1 ㎕, 및 Taq 중합효소 (5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정치시킨 다음; 다음의 PCR 반응을 실시하였다. 94℃에서 5분 변성 반응, 이어, 94℃ 40초, 55-60℃ 40초 및 72℃ 60초의 20-35 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응.
제2차 증폭 산물이 아가로스 젤에서 보이지 않으면, 제2차 증폭 산물의 내부 부위르 증폭하도록 디자인된 또 다른 네스티드 타깃-특이적 프라이머를 이용하여, 제3차 증폭을 추가적으로 실시하였다. 제3차 증폭은 제2차 PCR 증폭 산물 1-2 ㎕, 10 x PCR 완충액(Roche) 5 ㎕, 25 mM MgCl2 5 ㎕, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 각각 2.5 mM) 4 ㎕, 제3차 DW-ACP DW-ACP3-N1(10 μM) 1 ㎕, 네스티드 유전자-특이적 프라이머 mTNFα-C3(10 μM) 1 ㎕, 및 Taq 중합효소 (5 units/㎕, Roche) 0.5 ㎕을 포함하는 반응액 50 ㎕를 이용하였으며; 상기 반응 혼합물을 포함하는 튜브를 전가열(94℃)된 온도 순환기에 정치시킨 다음; 다음의 PCR 반응을 실시하였다. 94℃에서 5분 변성 반응, 이어, 94℃ 40초, 60-65℃ 40초 및 72℃ 60초의 30-35 사이클을 실시한 다음, 72℃에서 최종 5분 동안 연장반응.
F. 젤 추출
증폭 산물을 2% 아가로스 젤에서 전기영동 한 다음, 에티듐 브로마이드로 염색하여 검출하였다. 또한 PCR 산물은, 변성 폴리아크릴아미드 젤에서 오토래디오그래피 또는 비-방사능 검출 방법에 의해 검출될 수 있다. EtBr로 염색된 아가로스 젤에서 전기영동한 다음, 각각의 PCR 산물을 GENECLEAN II 키트(Q-BIOgene, USA)를 이용하여 추출하였다.
G. 클로닝 또는 시퀀싱
추출된 단편을 pGEM-T Easy 벡터(Promega, USA)에 제조사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다. 플라스미드를 XL1-블루 컴피던트 세포에 형질전환하였다. 형질전환된 세포를 LB/암피실린 아가 플레이트에 플레이팅 하였다. 단독의 백색의 콜로니로부터 플라스미드를 분리하였다. 삽입 서열을 EcoRI 제한효소 처리로 확인하였다. 삽입 서열을 가지는 플라스미드를 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 시퀀싱하였다. 선택적으로, 추출 단편을 직접 시퀀싱의 주형으로 이용하여, BigDye Terminator cycle 시퀀싱 키트(Perkin Elmer)를 이용하는 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(Perkin Elmer)로 시퀀싱 하였 다. 컴퓨터-보조 서열 분석을 GeneRunner 프로그램(Hastings, Inc.)을 이용하여 실시하였다.
도 3은 TNF-α 유전자의 프로모터 서열의 증폭을 위한 DNA 워킹 ACP PCR에 의해 생성된 증폭 산물을 보여 준다. 다른 크기의 주 산물은 각각의 다른 제1차 DW-ACPs, DW-ACP1-A(레인 1), DW-ACP1-T(레인 2), DW-ACP1-G(레인 3) 및 DW-ACP1-C(레인 4)로부터 생성된 것이다. 이들 산물들은, 서열 분석을 통해 TNF-α 유전자의 프로모터 서열로 규명되었다. 이러한 실험 결과는, 지놈의 기지의 서열에 인접한 미지 지놈 서열을 증폭하는 데, 본 발명의 DNA 워킹 ACP PCR 방법이 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3: DNA 워킹 PBP cDNA의 5’-말단 부위 서열의 증폭
마우스 프리세니린-결합 단백질(PBP)의 전장 cDNA 서열은 이미 알려져 있지만, 그의 3’-말단 부위 서열 정보만을 이용하여 PBP cDNA의 5’-말단 부위 서열을 증폭하는 데 본 발명의 DNA 워킹 기술을 적용하였다.
A. 프라이머 디자인
실시예 1과 동일한 방식으로 디자인된 DW-ACPs를, DNA 워킹 ACP-PCR 증폭에 이용하였다. 마우스 PBP 유전자의 타깃-특이적 프라이머를 그의 3’-말단 부위 서열 정보에 기초하여 다음과 같이 디자인 하였다:
mPBP-C1: 5'-TCCACACCTTGAAGTCAAAGTC-3' (SEQ ID NO:24);
mPBP-C2: 5'-CAGAGGACAGGTACTGGACAGTAG-3' (SEQ ID NO:25); 및
mPBP-C3: 5'-CAGTCTCATCACCATCCAGTCTC-3' (SEQ ID NO:26).
B. 제1차 cDNA쇄 합성
마우스 스트레인 ICR의 뇌 조직으로부터 총 RNAs를 분리하고, 종래의 방법(Hwang et al., 2000)에 따라 역전사 효소를 이용하여 제1차 cDNA쇄를 합성하였다. 역전사 반응은 총 RNAs를 이용하여 42℃에서 1.5시간 동안 다음의 성분을 포함하는 20㎕ 반응액에서 실시하였다: 총 RNA 3 ㎍, 5x 반응완충액(Promega, USA) 4 ㎕, dNTPs(각각 2 mM) 5 ㎕, 10 μM cDNA 합성 프라이머(dT20 또는 랜덤 헥사머) 2 ㎕, RNase 억제제(40 units/㎕, Promega) 0.5 ㎕, 및 역전사 효소(200 units/㎕; Promega) 1 ㎕. 제1차 cDNAs에 초정제된 H2O 80 ㎕를 첨가하여 희석하였다.
상기 cDNA 합성 프라이머의 서열은 다음과 같다:
dT20: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'(SEQ ID NO:27); 및
N6: 5'-NNNNNN-3' (SEQ ID NO:28);
C. 제1차 DNA 워킹 ACP PCR
제1차 DNA 워킹 ACP PCR을, 각각의 제1차 DW-ACP를 포함하는 4개의 각각의 튜브에서 상기 실시예 2와 같이 실시하되, 제1차 타깃-특이적 프라이머 mPBP-C1을 이용하였다.
D. 제1차 DNA 워킹 ACP PCR 산물의 정제
상기 DNA 워킹 ACP PCR에서 이용된 제1차 DW-ACPs 및 제1차 타깃-특이적 프라이머와 같은 프라이머를 제거하기 위하여, 제1차 PCR 산물을 스핀 컬럼(PCR purification Kit, QIAGEN)을 이용하여 정제하였다. 정제된 제1차 증폭 산물은 후속의 제2차 증폭에서 주형으로 이용되기 위하여, 제1차 증폭의 결과에 따라 1-10배 희석될 수 있다.
E.제2차 DNA 워킹 ACP PCR
유전자-특이적 프라이머 mPBP-C1의 주형에 대한 비특이적 주형으로부터 초래된 비특이적 산물을 가질 수 있는 제1차 DNA 워킹 ACP-PCR 산물로부터 미지의 타깃-특이적 산물만을 증폭시키기 위하여, 제2차 DW-ACP PCR을 제3차 DW-ACP 및 테스티드 PBP 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 실시하였고, 상기 프라이머는 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위하여 디자인된 것이다. 제2차 PCR 반응 조건은 실시예 2의 프로세스 E와 동일하되, 네스티드 타깃-특이적 프라이머로서 mPBP-C2를 이용하였다.
제2차 증폭 산물이 아가로스 젤에서 보이지 않으면, 제2차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하도록 디자인된 또 다른 네스티드 타깃-특이적 프라이머를 이용하여, 제3차 증폭을 추가적으로 실시하였다. 제2차 증폭 산물은 후속의 제3차 증폭에서 주형으로 이용되기 위하여, 제1차 증폭의 결과에 따라 1-1,000배 희석될 수 있다. 제3차 PCR 반응 조건은 상기 제2차 ACP PCR과 동일하되, 네스티드 타깃-특이적 프라이머로서 mPBP-C3를 이용하였다.
F. 젤 추출
증폭 산물을 실시예 2의 젤 추출(프로세스 F)에 기재된 것과 동일하게 분석하였다.
G. 클로닝 또는 시퀀싱
증폭 산물을 실시예 2의 클로닝 또는 시퀀싱(프로세스 G)에 기재된 것과 동일하게 클로닝 또는 직접적으로 시퀀싱 하였다.
도 4는 PBP cDNA의 5’-말단 부위 서열의 증폭을 위한 DNA 워킹 ACP PCR에 의해 생성된 증폭 산물을 보여 준다. 다른 크기의 주 산물은 각각의 다른 제1차 DW-ACPs, DW-ACP1-A(레인 1), DW-ACP1-T(레인 2), DW-ACP1-G(레인 3) 및 DW-ACP1-C(레인 4)로부터 생성된 것이다. 이들 산물들은, 서열 분석을 통해 PBP cDNA의 5’-말단 부위 서열로 규명되었다. 이러한 실험 결과는, 기지의 일부 cDNA 서열에 대해 다운스트림 또는 업스트림에 있는 미지 서열을 증폭하는 데, 본 발명의 DNA 워킹 ACP PCR 방법이 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참조문헌
Arnold, C., Hodgson, I.J. (1991) Vectorette PCR: a novel approach to genomic walking. PCR Methods Appl. 1:39-42.
Chun, J.Y. (2001) Annealing control primers and its uses. PCT/KR02/01781.
Dominguez, O., Lopez-larrea, C. (1994) Gene walking by unpredictably primed PCR. Nucleic Acids Res.22:3247-3248.
Hwang, I.T., Kim, Y.H., Kim, S.H., Kwak, C.I,. Gu, Y.Y., Chun, J.Y. (2003) Annealing control primer system for improving specificity of PCR amplification. BioTechniques (in press).
Hwang, I.T., Lee, Y.H., Moon, B.C., Ahn, K.Y., Lee, S.W., Chun, J.Y. (2000) Identification and characterization of a new member of the placental prolactin-like protein-C (PLP-C) subfamily, PLP-C. Endocrinology 141:3343-3352.
Iwahana, H., Tsujisawa, T., Katashima, R., Yoshimoto, K., Itakura, M. (1994) PCR with end trimming and cassette ligation: a rapid method to clone exon-intron boundaries and a 5'-upstream sequences of genomic DNA based on a cDNA sequence. PCR Methods Appl. 4:19-25.
Jones, D.H., Winistorfer, S.C. (1997) Amplification of 4-9 kb human genomic DNA flanking a known site using a panhandle PCR variant. BioTechniques 23:132-138.
Juretic, N, Theus, M. (1991) Analysis of the polyadenylation consensus sequence context in the genes of nuclear encoded mitochodrial proteins. FEBS Lett. 290:4-8.
Kilstrup, M., Kristinansen, K.N. (2000) Rapid genome walking: a simplified oligo-cassette mediated polymerase chain reaction using a single genome-specific primer. Nucleic Acids Res. 28:e55.
Lagerstrom, M., Parik, J., Malmgren, H., Stewart, J., Pettersson, U., Landegren, U. (1991) Capture PCR: efficient amplification of DNA fragments adjacent to a known sequence in human and YAC DNA. PCR Methods Appl. 1:111-119.
McBratney, S., Sarnow, P. (1996) Evidence for involvement of trans-acting factors in selection of the AUG start codon during eukaryotic translation initiation. Mol Cell Biol. 16:3523-3534.
Riley, J., Butler, R., Ogilvie, D., Finnear, R., Jenner, D., Powell, S., Anand, R., Smith, J.C., Markham, A.F. (1990) A novel, rapid method for the isolation of terminal sequences from yeast artificial chromosome (YAC) clones. Nucleic Acids Res. 18:2887-2890.
Rosenthal, A., Jones, D.S.C. (1990) Genomic walking and sequencing by oligo-cassette mediated polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 18:3095-3096.
Roux, K.H., Dhanarajan, P. (1990) A strategy for single site PCR amplification of dsDNA: priming digested cloned or genomic DNA from an anchor-modified restriction and a short internal sequence. BioTechniques 8:48-57.
Shyamala, V., Ames, G.F.L. (1989) Genome walking by single-specific primer polymerase chain reaction: SSP-PCR. Gene 84:1-8.
Siebert, P.D., Chenchik., A., Kellogg., D.E., Lukyanov, K.A., Lukyanov, S.A. (1995) An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res. 23:1087-1088.
Triglia, T., Peterson, M.G., Kemp, D.J. (1988) A procedure for in vitro amplification of DNA segements that lie outside the boundaries of known sequences. Nucleic Acids Res. 16: 8186.
Trueba, G.A., Johnson, R.C. (1996) Random primed genome walking PCR: a simple procedure to retrieve nucleotide fragments adjacent to known DNA sequences. BioTechniques 21:20.
Willems, H. (1998) Adaptor PCR for the specific amplification of unknown DNA fragments. BioTechniques 24:26-28.
<110> SeeGene, Inc. <120> METHOD FOR AMPLIFYING UNKNOWN DNA SEQUENCE ADJACENT TO KNOWN SEQUENCE <130> SeeGene-4 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-A <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnnag gtc 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-C <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n stands for deoxyinosie <400> 2 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnncg gtc 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-T <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n stands for deoxyinosine <400> 3 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnntg gtc 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP1-G <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n stands for deoxyinosine <400> 4 tcacagaagt atgccaagcg annnnnnngg gtc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-N <220> <221> modified_base <222> (26)..(29) <223> n stands for deoxyinosine <400> 5 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnnng gtc 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-NA <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n stands for deoxyinosine <400> 6 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnnag gtc 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-NC <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n stands for deoxyinosine <400> 7 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnncg gtc 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-NT <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n stands for deoxyinosine <400> 8 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnntg gtc 33 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP2-NG <220> <221> modified_base <222> (26)..(28) <223> n stands for deoxyinosine <400> 9 tcacagaagt atgccaagcg aggggnnngg gtc 33 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP3-N1 <220> <221> modified_base <222> (22)..(25) <223> n stands for deoxyinosine <400> 10 tcacagaagt atgccaagcg annnnggggg gtc 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP3-N2 <220> <221> modified_base <222> (23)..(26) <223> n stands for deoxyinosine <400> 11 tcacagaagt atgccaagcg agnnnngggg gtc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-ACP3-N3 <220> <221> modified_base <222> (24)..(27) <223> n stands for deoxyinosine <400> 12 tcacagaagt atgccaagcg aggnnnnggg gtc 33 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nested DW-P3-N <400> 13 ccaagcgagg ggggggggtc 20 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-P1-A <400> 14 tcacagaagt atgccaagcg annnaggtc 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-P1-C <400> 15 tcacagaagt atgccaagcg annncggtc 29 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-P1-T <400> 16 tcacagaagt atgccaagcg annntggtc 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-P1-G <400> 17 tcacagaagt atgccaagcg annngggtc 29 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DW-P1 <400> 18 tcacagaagt atgccaagcg annnnggtc 29 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> JYC3 <400> 19 tcacagaagt atgccaagcg a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNFa-C1 <400> 20 caccttgccc tgcccattag 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNFa-C2 <400> 21 ccctcacact gtccttcttg cc 22 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNFa-C3 <400> 22 gaataagggt tgcccagaca ctc 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTNFa-C4 <400> 23 ggagtgcctc ttctgccagt tc 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPBP-C1 <400> 24 tccacacctt gaagtcaaag tc 22 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPBP-C2 <400> 25 cagaggacag gtactggaca gtag 24 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPBP-C3 <400> 26 cagtctcatc accatccagt ctc 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dT20 <400> 27 tttttttttt tttttttttt 20 <210> 28 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N6 <400> 28 nnnnnn 6

Claims (30)

  1. DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머(DW-ACP) 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 미지의 뉴클레오타이드 서열을 제1차 증폭(primary amplification)하는 단계 (a)를 포함하며, 상기 단계 (a)는 다음의 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 기지(旣知, known)의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법:
    (a-1) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 축퇴성(degenerate) 랜덤 뉴클레오타이드 서열 및 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열으 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1차 축퇴성(degenerate) DW-ACP를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하며, 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장산물이 생성되는, 제1차 어닐링 온도에서 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열의 제1단계 증폭(first-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 상기 제1차 어닐링 온도는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로 작동하도록 하며,
    (a-2) 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP가 프라이머로서 작동하지 못하도록 하는 제2차 어닐링 온도에서 제2단계 증폭(second-stage amplification)을 실시하는 단계로서, 다음의 과정을 포함하는 단계:
    (a-2-1) 상기 미지의 뉴클레오타이드 서열 상의 한 위치에 실질적으로 상보적인 타깃-특이적 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 되는 상기 제1차 타깃-특이적 프 라이머를 이용하여 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 타깃-특이적 프라이머 연장산물이 생성되며,
    (a-2-2) 상기 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열에 혼성화되는 제2차 DW-ACP를 이용하여 상기 타깃-특이적 프라이머 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 제2차 DW-ACP 연장산물이 생성되며, 그리고,
    (a-2-3) 상기 제2차 DW-ACP 및 상기 제1차 타깃-특이적 프라이머를 이용하여 상기 제2차 DW-ACP 연장산물을 증폭하는 단계로서, 이 단계에 의해 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열이 없는 제1차 증폭 산물(primary amplification product)이 생성된다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단계 증폭은 한 사이클 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제2단계 증폭은 최소 5 사이클 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제1차 어닐링 온도는 약 35℃ 내지 50℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 제2차 어닐링 온도는 약 50℃ 내지 72℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP는 다음 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-Qs-3’(I)
    상기 일반식에서, Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜던 서열 부위를 나타내며, Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q, r 및 s는 뉴클레오타이드의 수이고; 상기 X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 상기 조절자 부위는 제1차 어닐링 온도에서 어닐링 부위를 상기 프라이머의 3’-말단 부위로 한정하는 작용을 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 제2차 축퇴성 DW-ACP는 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-X'p-Su-Y'v-Z'w-3’(II)
    상기 일반식에서, X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-말단 부위를 나타내며, Su는 단계 (a-2-1)의 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, Y'v는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하는, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’ -말단 부위를 나타내며, p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고; X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제1차 증폭 산물의 3’-말단에 존재하는 상기 제2차 DW-ACP 서열에 대한 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 3’-말단 부위에 포함하는 제3차 DW-ACP 및 단계 (a)의 제1차 타깃-특이적 프라이머 또는 상기 제1차 증폭 산물의 내부 부위를 증폭하기 위한 네스티드 타깃-특이적 프라이머를 이용한 프라이머 어닐링, 프라이머 연장 및 변성의 최소 한 사이클을 포함하는, 제3차 어닐링 온도에서 제2차 증폭 반응(secondary amplification)을 실시하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 제3차 어닐링 온도는 약 50℃ 내지 72℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c)를 실시하기 전에, 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP, 제2차 DW-ACP 및 제1차 타깃-특이적 프라이머를 제거하기 위한, 단계 (a)의 반응 결과물을 정제하는 단계 (b)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 상기 제3차 DW-ACP는 다음 일반식 III으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-X”p-Y”q-Cc-3’(III)
    상기 일반식에서, X”p는 상기 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 전체 또는 일부에 해당되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내고, Y”q는 일반식 II의 제2차 DW-ACP의 보조 어닐링 부위, 5’-말단 부위의 일부분, 보조 어닐링 부위의 일부분과 5’-말단 부위의 일부분, 또는 보조 어닐링 부위의 일부분과 조절자 부위의 일부분에 해당하며, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 제1차 증폭 산물의 비-타깃 서열에 X”p 부위가 어닐링하는 것을 방해하는 작용을 하며, Cc는 상기 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위와 조절자 부위 서열의 전부 또는 일부분에 대하여 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q 및 c는 뉴클레오타이드의 수이고, X”, Y”및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오 타이드이다.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 증폭되는 뉴클레오타이드 서열은 gDNA 또는 cDNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 6 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2‘-디옥시이노신, 2-아자-2’-디옥시이노신, 2‘-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에 틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2’-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체는 디옥시이노신인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 6 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절자 부위는 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 갖는 뉴클레오타이드의 연속 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 6 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 p는 10 내지 60의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 6 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 q 또는 u는 최소 3인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 6 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 q 또는 u는 2 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 r 또는 v는 2 내지 5의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 6 항 또는 제 8 항에 있어서, 상기 s 또는 w는 3 내지 10의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 12 항에 있어서, 상기 c는 5 내지 15의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 8 항에 있어서, 상기 S는 최소 2개의 연속의 디옥시구아노신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 12 항에 있어서, 상기 C는 상기 제2차 DW-ACP의 조절자 부위 서열에 대해 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화하는 위치에서 최소 2개의 연속의 디옥시구아노신 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머:
    5’-Xp-Yq-Zr-Qs-3’(I)
    상기 일반식에서, Xp는 전-선택 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내며, 상기 Yq는 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 상기 Zr는 축퇴성 랜덤 뉴클레오타이드 서열을 갖는 축퇴성 랜던 서열 부위를 나타내며, Qs는 상기 미지 뉴클레오타이드 서열의 한 위치에 실질적으로 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q, r 및 s는 뉴클레오타이드의 수이고; 상기 X, Y, Z 및 Q는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  27. 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 II로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머:
    5’-X'p-Su-Y'v-Z'w-3’(II)
    상기 일반식에서, X'p는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 5’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 5’-말단 부위를 나타내며, Su는 단계 (a-2-1)의 타깃-특이적 프라이머 연장산물의 제1차 축퇴성 DW-ACP의 조절자 부위에 대해 반대쪽 부위에 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 보조 어닐링 부위를 나타내고, Y'v는 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 비-타깃 서열에 X'p 및 Su 부위가 어닐링되는 것을 방해하는, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, Z'w은 상기 제1차 축퇴성 DW-ACP의 3’-말단 부위에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 3’ -말단 부위를 나타내며, p, u, v 및 w는 뉴클레오타이드의 수이고; X', S, Y', 및 Z'는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  28. 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머로서, 상기 프라이머는 다음 일반식 III로 표시되는 것을 특징으로 하는 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머:
    5’-X”p-Y”q-Cc-3’(III)
    상기 일반식에서, X”p는 상기 제2차 DW-ACP의 5’-말단 부위의 전체 또는 일부에 해당되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 5’-말단 부위를 나타내고, Y”q는 일반식 II의 제2차 DW-ACP의 보조 어닐링 부위, 5’-말단 부위의 일부분, 보조 어닐링 부위의 일부분과 5’-말단 부위의 일부분, 또는 보조 어닐링 부위의 일부분과 조절자 부위의 일부분에 해당하며, 최소 두개의 유니버설 염기 또는 비-구별성 염기 유사체를 포함하는 조절자 부위를 나타내고, 제2차 DW-ACP에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 제외한 제1차 증폭 산물의 비-타깃 서열에 X”p 부위가 어닐링하는 것을 방해하는 작용을 하며, Cc는 상기 제2차 DW-ACP의 3’-말단 부위와 조절자 부위 서열의 전부 또는 일부분에 대하여 반대-센스 뉴클레오타이드 서열과 혼성화되는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 3’-말단 부위를 나타내고, p, q 및 c는 뉴클레 오타이드의 수이고, X”, Y”및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이다.
  29. 상기 제 26 항의 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머, 상기 제 27 항의 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머, 상기 제 28 항의 DNA 워킹 어닐링 조절 프라이머 또는 이의 조합을 포함하는 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열을 증폭하기 위한 키트.
  30. 기지의 뉴클레오타이드 서열에 인접한 미지의 뉴클레오타이드 서열의 핵산 증폭 과정을 포함하는 프로세스를 위한 상기 제 1 항의 방법의 용도.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210117223A (ko) * 2020-06-23 2021-09-28 (주) 하임바이오텍 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
WO1993005175A1 (en) * 1991-09-11 1993-03-18 Medical Research Council Improvements in oligonucleotide primers and probes
US6077668A (en) * 1993-04-15 2000-06-20 University Of Rochester Highly sensitive multimeric nucleic acid probes
US20020042048A1 (en) * 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
AU7733200A (en) * 1999-09-30 2001-04-30 Qiagen Genomics, Inc. Compositions and methods for reducing oligonucleotide hybridization and priming specificity

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210117223A (ko) * 2020-06-23 2021-09-28 (주) 하임바이오텍 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법
WO2021261928A1 (ko) * 2020-06-23 2021-12-30 (주)하임바이오텍 순차적 중합효소 연쇄 반응용 조성물 및 이를 이용한 유전자 증폭 방법

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