CN112553307A - 一种基于CasRNA酶的一锅式核酸检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法及其应用。所述一锅式核酸检测方法包括：将待测溶液、RPA扩增单元、转录单元和含有Cas RNA酶的CRISPR单元混合，在扩增的同时实时监测反应体系的荧光强度，最终通过荧光动力学曲线实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。所述一锅式核酸检测方法不但避免了扩增产物在转移过程中造成的气溶胶污染，防止出现假阳性结果，而且解决一步式“RPA扩增‑CRISPR‑Cas DNA酶”体系中，模板DNA不断被Cas DNA酶消化导致的检测时间长、检测灵敏度低等问题。

Description

一种基于CasRNA酶的一锅式核酸检测方法及应用
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体涉及一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法及应用。
背景技术
CRISPR/Cas系统由成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)和它的辅助蛋白(CRISPR-associated，Cas)构成。CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫，当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，CRISPR系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具，为实现快速便捷灵敏的特异性核酸检测提供了有利依据。将CRISPR应用于核酸快速检测领域时，常常配合Cas12a、Cas12b等DNA酶和Cas13a、Cas13b等RNA酶进行使用。但此CRISPR体系的灵敏度有限(pM～nM)，无法满足临床需求。为了解决这一问题，目前有不少研究将其与各种核酸扩增技术(如PCR、LAMP和RPA等)结合。
其中，重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)被称作是最有可能替代PCR的核酸扩增技术，仅仅需要在恒定的37～40℃内保持10-15min，即可实现核酸的快速扩增。RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。
目前，已有RPA-CRISPR联用的技术发表在国际期刊上，但是报道中需要分两步进行，即首先利用RPA进行核酸扩增，然后再将扩增产物加入CRISPR体系进行检测(详见WangB,Wang R,Wang D,et al.Cas12aVDet:A CRISPR/Cas12a-Based Platform for Rapid andVisual Nucleic Acid Detection[J].Analytical Chemistry,2019,91(19):12156-12161)。
上述方法带来的问题包括：1、在扩增产物的转移过程中有造成气溶胶污染的风险，在实际检测中很容易出现假阳性结果；2、扩增完成后，核酸样本浓度基本一致，再次进行CRISPR检测无法实现定量化等。
CN111808931A公开了一种一步式RPA-CRISPR核酸检测方法、试剂盒及应用。所述核酸检测方法将待测溶液、RPA试剂和CRISPR试剂混合并扩增，使扩增和检测同步进行，此方法将CRISPR-Cas12a DNA酶与RPA扩增技术整合至单一反应体系中，无需样品转移即可实现核酸的定量检测，具有一定的优越性。但是由于Cas12a DNA酶和扩增体系竞争目标DNA，导致检测时间较长，且低浓度下的检测稳定性较差。
因此，提供一种灵敏度和准确度较高、不易被污染、检测时间较短且稳定性较好的核酸定量化分析方法是本领域亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，该方法基于CRISPR检测技术与RPA扩增，利用Cas RNA酶和转录酶，使目标DNA在扩增过程中不受干扰。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，包括：
将待测溶液、RPA反应单元、转录单元和含有Cas RNA酶的CRISPR单元混合，在扩增的同时实时监测反应体系的荧光强度，最终通过荧光动力学曲线实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
本发明中，将基于Cas RNA酶的CRISPR检测技术与RPA扩增结合，借助转录过程实现基于CRISPR的一锅式快速高特异性核酸检测。该方法中，目标DNA通过RPA单元扩增，然后通过转录单元实现DNA到RNA的转化，转录出的RNA与crRNA及Cas RNA酶结合实现快速检测。在此方法中，Cas RNA酶体系并不会切割双链DNA，因此目标DNA的扩增过程不受干扰，这极大地缩短了检测时间，经过实验验证整个检测过程仅需30min即可完成。
作为本发明优选的技术方案，所述RPA扩增单元中包括DNA重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP、RPA正向引物和RPA反向引物。
优选地，所述RPA正向引物上包括T7转录启动子序列或T3转录启动子序列。
本发明中，所述RPA正向引物上还包含启动子，使得扩增得到的DNA产物上携带启动子，进而能够在转录酶的作用下转录成为RNA。
优选地，所述转录单元包括转录聚合酶和NTP。
优选地，所述含有Cas RNA酶CRISPR单元包括Cas RNA酶、crRNA和探针RNA。
优选地，所述Cas RNA酶包括Cas 13a和/或Cas13b。
优选地，所述转录聚合酶包括T7转录聚合酶或T3转录聚合酶。
作为本发明优选的技术方案，所述RPA正向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，例如可以是0.32μM、0.35μM、0.36μM、0.38μM、0.4μM、0.42μM、0.45μM、0.48μM、0.5μM、0.54μM或0.55μM等，优选为0.42μM。
优选地，所述RPA反向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，例如可以是0.32μM、0.35μM、0.36μM、0.38μM、0.4μM、0.42μM、0.45μM、0.48μM、0.5μM、0.54μM或0.55μM等，优选为0.42μM。
优选地，所述转录酶的工作浓度为0.4～0.6U/μL，例如可以是0.42U/μL、0.44U/μL、0.45U/μL、0.46U/μL、0.48U/μL、0.5U/μL、0.52U/μL、0.55U/μL或0.58U/μL等，优选为0.5U/μL。
作为本发明优选的技术方案，所述Cas RNA酶的工作浓度为0.01～0.05μM，例如可以是0.012μM、0.015μM、0.02μM、0.024μM、0.026μM、0.03μM、0.032μM、0.038μM、0.04μM、0.042μM或0.046μM等，优选为0.025μM。
优选地，所述crRNA的工作浓度为0.01～0.1μM，例如可以是0.012μM、0.02μM、0.03μM、0.035μM、0.04μM、0.045μM、0.05μM、0.055μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM或0.09μM等，优选为0.05μM。
优选地，所述探针RNA的工作浓度为0.1～0.2μM，例如可以是0.12μM、0.14μM、0.15μM、0.16μM、0.17μM、0.18μM或0.19μM等，优选为0.1μM。
本发明中无论是转录单元还是CRISPR单元用量改变，均会影响信号上升速率，若试剂浓度增加过多，虽然有助于信号快速读出，但是进行荧光定量的难度会增加，因为所得标准曲线可能会较为接近；同时，RPA扩增体系在本发明所述范围内最佳，若不在此范围内，可能会影响扩增效率。
作为本发明优选的技术方案，所述探针RNA的两端修饰有荧光基团和荧光猝灭基团。
优选地，所述荧光基团包括HEX、JOE、TET、ROX、TAM或FAM中的任意一种。
优选地，所述荧光猝灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGB中的任意一种。
对于探针RNA而言，理论上其碱基个数越少，猝灭效果越好，荧光背景越低；其荧光基团与淬灭基团的选择没有限制，能够实现探针DNA的功能即可。
作为本发明优选的技术方案，所述扩增的温度为26～42℃，例如可以是26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃或42℃等，优选为37～42℃，进一步优选为40℃。
优选地，所述扩增的时间为20～40min，例如可以是22min、24min、25min、26min、28min、30min、32min、34min、36min或38min等，优选为30min。
作为本发明优选的技术方案，所述一锅式核酸检测方法包括如下步骤：
(1)配制反应体系：将DNA重组酶、DNA聚合酶、T7转录聚合酶、dNTP、NTP、RPA正向引物、RPA反向引物、Cas13a、crRNA和探针RNA混合，再与待测溶液混合得到所述反应体系；
其中，所述RPA正向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，且所述RPA正向引物上包含T7启动子序列；
所述RPA反向引物的工作浓度为0.3～0.6μM；
所述T7转录聚合酶的工作浓度为0.4～0.6U/μL；
所述Cas13a的工作浓度为0.01～0.05μM，所述crRNA的工作浓度为0.01～0.1μM，所述探针RNA的工作浓度为0.1～0.2μM；
(2)扩增并检测：所述反应体系在37～42℃扩增20～40min，并通过荧光实时定量检测仪检测荧光强度，实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
第二方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的一锅式核酸检测方法进行核酸扩增和检测的试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括RPA扩增单元、转录单元、含有Cas RNA酶的CRISPR单元和阳性标准品。
第三方面，本发明还提供一种如第一方面所述的一锅式核酸检测方法或如第二方面所述的试剂盒在传染病监测、检验检疫、食品安全或毒品检验中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明中提供了一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，通过将基于Cas RNA酶的CRISPR单元、转录单元和RPA扩增单元混合，实现核酸扩增-检测同步进行，此方法不仅可以避免分步检测所带来的气溶胶污染，提高检测准确度，同时实现目标DNA的定量化检测；
此外，本发明所述的方法还能够将RPA扩增技术的高灵敏度与CRISPR检测技术的高特异性相结合，检测体系和扩增体系相互协作，没有竞争关系，反应体系中的模板DNA不会被消耗，大大缩短了检测时间，经实验验证该反应仅需15～30min即可完成目标DNA的检测；因此，本发明所述的一锅式核酸检测方法具有检测灵敏度较高、特异性好且所需时间较短等优点，在核酸的定量化分析领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的一锅式核酸检测方法的原理示意图；
其中，1-目标DNA，2-目标RNA，3-crRNA，4-Cas RNA酶，5-探针DNA。
图2为实施例2中不同浓度的目标DNA经检测后得到的荧光动力学曲线图。
图3为对比例1中不同浓度的目标DNA经检测后得到的荧光动力学曲线图。
图4为对比例2中不同浓度的目标DNA经检测后得到的荧光动力学曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
通过图1简单描述本发明提供的一锅式核酸检测方法的原理：
首先，将待测样品与反应试剂配制成核酸检测的反应体系置于反应容器(例如EP管)中，若待测样品中含有目标DNA 1，则目标DNA1在RPA扩增反应体系的扩增下，得到大量的DNA扩增产物，由于引物中含有T7启动子序列，因此所述DNA扩增产物上也将携带T7启动子序列；
而后，扩增产物在T7转录酶的作用下进行转录，得到目标RNA2；
在转录进行的同时，已经产生的目标RNA2被CRISPR体系检测到，具体原理如下：
crRNA3与目标RNA 2的序列配对后，与Cas RNA酶4形成复合结构从而激活Cas RNA酶4的反式切割活性，切断探针RNA 5，使荧光基团远离猝灭剂发出荧光，通过荧光检测设备在扩增的同时对反应体系中的荧光强度进行实时监测；最终荧光动力学曲线的信号上升速率与待测样品中的目标DNA 1浓度呈现线性关系。
同时，所述方法还能够根据溶液荧光强度变化曲线对溶液中初始目标DNA进行定量；对于定量而言，经过多次重复以得到定量曲线，即根据荧光动力学曲线中信号上升的速率来判断，简单来说就是某一时刻的荧光强度值除以所需时间，随着待测样品中目标DNA的浓度提高，信号上升速率也会逐渐加快；本方法的检测速度快、检测时间短，所以每个浓度梯度之间的差异较小，定性检测优势明显，定量检测有所不足。
以下实施例中，若无特殊说明，所用试剂及耗材均可购自本领域常规试剂厂商，所用试验方法均为本领域技术人员知晓的常规方法。
实施例1
本实施例提供一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，具体步骤如下：
(1)配制反应体系
将DNA重组酶、DNA聚合酶、T7转录酶、dNTP、NTP、RPA正向引物、RPA反向引物、Cas13a、crRNA、探针RNA和缓冲液混合，再与待测溶液混合得到所述反应体系；
其中，以50μL的反应体系为准，各组分及其浓度和使用量如下表1所示：
表1
Figure BDA0002876563320000081
Figure BDA0002876563320000091
其中，冻干的反应微球为商用的RPA基础反应单元，包括DNA重组酶、DNA聚合酶、T7转录酶和dNTP；待测溶液的使用量可根据实际情况进行调整，最终用水补足至50μL。
(2)将上述配制得到的溶液置于37℃条件下进行反应，同时通过荧光实时定量检测仪检测反应溶液的荧光强度，持续30min，得到溶液荧光强度变化曲线，若待测溶液中含有目标DNA，则溶液中荧光强度会随着时间的延长而增加，若待测溶液中不含目标DNA，则溶液中荧光强度基本为0且不会发生变化；
同时，本实施例中所述的方法建议经过多次重复制定标准曲线，进而根据溶液荧光强度变化曲线对溶液中初始目标DNA进行定量。
实施例2
本实施例中利用实施例1提供的一锅式核酸检测方法检测目标DNA。
其中，待测溶液中的目标DNA即模板链Template-sense(SEQ ID NO.1)为：
5′-AGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGA-3′；
其互补序列即模板-反义链Template-antisense(SEQ ID NO.2)为：
5′-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAGCTGCAGCACCAGCTGTCCAACCTGAAGAAGAATCACCAGGAGTCAAATAACTTCTATGTAAAGCAAGTAAAGTTTGAAACCT-3′；
反应体系中所用的正向引物Forward Primer(SEQ ID NO.3)为：
5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGA-3′；其中，下划线所示序列为T7启动子，T7启动子前的GAAAT可以是任意序列，是为了增加T7转录的效率；
反应体系中所用的反向引物Reverse Primer(SEQ ID NO.4)为：
5′-TCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAG-3′；
反应体系中所用的crRNA(SEQ ID NO.5)为：
5′-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGCAGCACCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG-3′；
反应体系中所用的探针RNA(SEQ ID NO.6)为：
5′-FAM-dTUUUUUC-BHQ1-3′；
(2)根据上述反应体系，设置不同的DNA浓度梯度，目标DNA浓度为100～106aM，具体设置为1aM、10aM、100aM、103aM、104aM、105aM和106aM，并在37℃下进行反应，同时检测反应溶液的荧光强度；
所得结果如图2所示，由图可知，当溶液中目标DNA的浓度为101～106aM时，在扩增过程中，荧光信号的上升速率与目标DNA的浓度呈现明显的线性关系。
因此，在该体系中，扩增、T7转录及Cas13a检测互不干扰，且能有效的协同作用，极大地缩短了检测时间，其检测时间可缩短为15～30min。
实施例3
本实施例中利用实施例1提供的一锅式核酸检测方法检测铜绿假单胞菌中目标DNA。
其中，铜绿假单胞菌中的目标DNA即模板链Template-sense(SEQ ID NO.7)为：
5′-GAGAATGACAAAGTGGAACTGGTGATCCGCCTGGGCGAGAACAACATCGCCCAACTGGTCTACAACGTCTCCTACCTGATTCCCGGCGAGGGACTGTCGCGGCCGCATTTCGTCATCGACGCCAAGACCGGCGAAGTGCTCGATCAGTGGGAAGGCCTGGC-3′；
其互补序列即模板-反义链Template-antisense(SEQ ID NO.8)为：
5′-GCCAGGCCTTCCCACTGATCGAGCACTTCGCCGGTCTTGGCGTCGATGACGAAATGCGGCCGCGACAGTCCCTCGCCGGGAATCAGGTAGGAGACGTTGTAGACCAGTTGGGCGATGTTGTTCTCGCCCAGGCGGATCACCAGTTCCACTTTGTCATTCTC-3′；
反应体系中所用的正向引物Forward Primer(SEQ ID NO.9)为：
5′-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGACAAAGTGGAACTGGTGATCCGCCTG-3′；其中，下划线所示序列为T7启动子，T7启动子前的GAAAT可以是任意序列，是为了增加T7转录的效率；
反应体系中所用的反向引物Reverse Primer(SEQ ID NO.10)为：
5′-GCCAGGCCTTCCCACTGATCGAGCACTTCGCCG-3′；
反应体系中所用的crRNA(SEQ ID NO.11)为：
5′-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUGUAGACCAGUUGGGCGAUGUUGUU-3′；
反应体系中所用的探针RNA(SEQ ID NO.12)为：
5′-FAM-dTUUUUUC-BHQ1-3′；
对比例1
与实施例2的区别在于，本对比例中将所用的LwaCas13a RNA酶体系替换为LbCas12a DNA酶体系。
相应的，其反应体系中无需添加T7转录酶和NTP混合液，RPA正向引物也无需添加T7启动子，其余步骤均与实施例1保持一致。
LbCas12a体系中crRNA(SEQ ID NO.13)为：
5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUACUCCUGGUGAUUCUUCUUC-3′
所得结果如图3所示，由图可知，本对比例中提供的方法所需时间较长，其原因为Cas12a DNA酶和扩增体系竞争目标DNA，导致检测时间较长，且低浓度下的检测稳定性较差。
对比例2
与实施例2的区别在于，本对比例中将扩增与检测步骤分步进行，具体步骤为：
将待测溶液与RPA试剂混合，所用RPA扩增试剂盒为
Figure BDA0002876563320000121
Basic试剂盒，在37℃下扩增20min后，加入CRISPR试剂进行荧光强度检测。
所得到的荧光强度如图4所示，由于RPA核酸扩增速度较快，因此检测结果无明显的CT值；
当目标DNA浓度为10-1～106aM时，扩增20min后均产生大量的扩增产物，其浓度远高于CRISPR-Cas13a检测的线性范围，因此无法通过CRISPR方法进行定量分析，即由于扩增完成后DNA产物浓度接近，所以无法获得定量曲线。因此，在产生差异较小的非特异性扩增时(如SNP分型检测)可能会出现判断错误；同时，两步法扩增还有一个较为明显的缺点，即若实验室环境中存在气溶胶污染，那么，由于实验步骤中产物的转移，导致待测的核酸受到气溶胶污染，检测结果准确度较低。
综上所述，本发明提供的一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，不但克服了扩增产物的转移过程中受到气溶胶污染的缺陷，而且解决一步式“RPA扩增-CRISPR-CasDNA酶”体系中模板DNA不断被Cas DNA酶消化导致的检测时间长及灵敏度低的问题。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方科技大学
<120> 一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法及应用
<130> 20201210
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工合成
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<212> DNA
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<400> 9
gaaattaata cgactcacta tagggagaat gacaaagtgg aactggtgat ccgcctg 57
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
gccaggcctt cccactgatc gagcacttcg ccg 33
<210> 11
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 11
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacuugu agaccaguug ggcgauguug 60
uu 62
<210> 12
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
tuuuuuc 7
<210> 13
<211> 41
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 13
uaauuucuac uaaguguaga uacuccuggu gauucuucuu c 41

Claims (10)

1.一种基于Cas RNA酶的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述一锅式核酸检测方法包括：
将待测溶液、RPA扩增单元、转录单元和含有Cas RNA酶的CRISPR单元混合，在扩增的同时实时监测反应体系的荧光强度，最终通过荧光动力学曲线实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
2.根据权利要求1所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述RPA扩增单元中包括DNA重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、dNTP、RPA正向引物和RPA反向引物；
优选地，所述RPA正向引物上包括T7转录启动子序列或T3转录启动子序列；
优选地，所述转录单元包括转录聚合酶和NTP；
优选地，所述含有Cas RNA酶CRISPR单元包括Cas RNA酶、crRNA和探针RNA；
优选地，所述Cas RNA酶包括Cas 13a和/或Cas13b；
优选地，所述转录聚合酶包括T7转录聚合酶或T3转录聚合酶。
3.根据权利要求2所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述RPA正向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，优选为0.42μM；
优选地，所述RPA反向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，优选为0.42μM；
优选地，所述转录聚合酶的工作浓度为0.4～0.6U/μL，优选为0.5U/μL。
4.根据权利要求2或3所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述Cas RNA酶的工作浓度为0.01～0.05μM，优选为0.025μM；
优选地，所述crRNA的工作浓度为0.01～0.1μM，优选为0.05μM；
优选地，所述探针RNA的工作浓度为0.1～0.2μM，优选为0.1μM。
5.根据权利要求2～4任一项所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述探针RNA的两端修饰有荧光基团和荧光猝灭基团；
优选地，所述荧光基团包括HEX、JOE、TET、ROX、TAM或FAM中的任意一种；
优选地，所述荧光猝灭基团包括BHQ1、BHQ2或MGB中的任意一种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述扩增的温度为26～42℃，优选为37～42℃；
优选地，所述扩增的时间为20～40min，优选为30min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一锅式核酸检测方法，其特征在于，所述一锅式核酸检测方法包括如下步骤：
(1)配制反应体系：将DNA重组酶、DNA聚合酶、T7转录聚合酶、dNTP、NTP、RPA正向引物、RPA反向引物、Cas13a、crRNA和探针RNA混合，再与待测溶液混合得到所述反应体系；
其中，所述RPA正向引物的工作浓度为0.3～0.6μM，且所述RPA正向引物上包含T7启动子序列；
所述RPA反向引物的工作浓度为0.3～0.6μM；
所述T7转录聚合酶的工作浓度为0.4～0.6U/μL；
所述Cas13a的工作浓度为0.01～0.05μM，所述crRNA的工作浓度为0.01～0.1μM，所述探针RNA的工作浓度为0.1～0.2μM；
(2)扩增并检测：所述反应体系在37～42℃扩增20～40min，并通过荧光实时定量检测仪检测荧光强度，实现对所述待测溶液中目标DNA的定量分析。
8.一种利用如权利要求1～7任一项所述的一锅式核酸检测方法进行核酸扩增和检测的试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RPA扩增单元、转录单元、含有Cas RNA酶的CRISPR单元和阳性标准品。
10.如权利要求1～7任一项所述的一锅式核酸检测方法或如权利要求8或9所述的试剂盒在传染病监测、检验检疫、食品安全或毒品检验中的应用。
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