CN112322784B - 寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用 - Google Patents

寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用。该寡聚核苷酸组包括包括四种寡核苷酸分子，分别标记为A、B、A’和B’，能够与目的基因的核酸分子进行互补配对。该试剂盒包括该寡聚核苷酸组、分子信标、PfAgo酶和DNA连接酶。本发明利用了PfAgo酶编辑DNA，LCR反应良好的特异性和区分单碱基特异性的能力以及分子信标的高灵敏度的特点，对检测的靶目标放大，其检测灵敏度可以达到1aM，并且具有好的特异性，还能实现病毒各种亚型的多通道分析，操作也简单准确。

Description

寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，尤其涉及寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用。
背景技术
SARS-CoV-2具有约30000个核苷酸长度的单链正链RNA基因组。该基因组编码27种蛋白质，包括一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)和4种结构蛋白。SARS-CoV-2的4种结构蛋白包括穗状表面糖蛋白(S)、小包膜蛋白(E)、基质蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。针对该病毒的检测，目前主要的检测方法是RT-qPCR，但该方法存在假阳性、假阴性等缺点。假阳性主要是由于PCR方法的特异性，假阴性主要是由于检测的敏感性。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种检测SARS-CoV-2病毒的试剂盒，用以解决RT-qPCR检测手段存在的诸多问题。
本发明的第一方面，提供了寡聚核苷酸组，用于对病毒目的基因进行LCR扩增，包括寡核苷酸分子，分别标记为A、B、A’和B’；
若目的基因的核酸分子为双链DNA分子，所述A分子和所述B分子可与双链DNA分子中的一条链互补配对，所述分子A’和所述B’分子可与双链DNA分子中的另一条链互补配对；
若目的基因的核酸分子为单链RNA分子，所述A分子和所述B分子可分别与单链RNA分子逆转录的双链cDNA分子中一条链互补配对以形成连接产物，所述A’分子和所述B’分子可分别与所述连接产物进行再次互补配对。
具体的，所述B分子、所述A’分子和所述B’分子均带有磷酸基团。
具体的，所述目的基因包括HPV11病毒E6基因、HPV16病毒E6基因、HPV18病毒L1基因、SARS-CoV-2病毒N基因、SARS-CoV-2病毒ORF-1a基因、SARS-CoV-2病毒S基因、SARS-CoV-2病毒突变体S基因、SARS病毒N基因和MERS病毒N基因中的至少一种。
具体的，靶向HPV11病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
11-A：CTGTGGGGGAACCT，如SEQ ID NO.1所示；
11-B：GTGCCTGATGACCT，如SEQ ID NO.2所示；
11-A’：TCATCAGGCAC，如SEQ ID NO.3所示；
11-B’：AGGTTCCCCCA，如SEQ ID NO.4所示；
靶向HPV16病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
16-A：AATGTTTCAGGACCC，如SEQ ID NO.5所示；
16-B：ACAGGAGCGACCCA，如SEQ ID NO.6所示；
16-A’：GGGTCGCTCCTGT，如SEQ ID NO.7所示；
16-B’：GGGTCCTGAAACAT，如SEQ ID NO.8所示；
靶向HPV18病毒L1基因的所述寡聚核苷酸组包括：
18-A：GGATTGCGTCGCAA，如SEQ ID NO.9所示；
18-B：GCCCACCATAGGCC，如SEQ ID NO.10所示；
18-A’：GCCTATGGTGGGC，如SEQ ID NO.11所示；
18-B’：TTGCGACGCAATC，如SEQ ID NO.12所示；
靶向SARS-CoV-2病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2N-A：TGTCAAGCAGCAGC，如SEQ ID NO.13所示；
SC2N-B：AAAGCAAGAGCAGC，如SEQ ID NO.14所示；
SC2N-A’：GCTCTTGCTTT，如SEQ ID NO.15所示；
SC2N-B’：GCTGCTGCTTG，如SEQ ID NO.16所示；
靶向SARS-CoV-2病毒ORF-1a基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2ORF-A：GAGTTGATCACAACT，如SEQ ID NO.17所示；
SC2ORF-B：ACAGCCATAACCTT，如SEQ ID NO.18所示；
SC2ORF-A’：AGGTTATGGCTGT，如SEQ ID NO.19所示；
SC2ORF-B’：AGTTGTGATCAACT，如SEQ ID NO.20所示；
靶向SARS-CoV-2病毒S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2S-A：TGTGCAGTTAACAT，如SEQ ID NO.21所示；
SC2S-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.22所示；
SC2S-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.23所示；
SC2S-B’：ATGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.24所示；
靶向SARS-CoV-2病毒突变体S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2SM-A：TGTGCAGTTAACAC，如SEQ ID NO.25所示；
SC2SM-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.26所示；
SC2SM-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.27所示；
SC2SM-B’：GTGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.28所示；
靶向SARS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SN-A：GGTCTAGCAGCAAT，如SEQ ID NO.29所示；
SN-B：AGCGCGAGGGCAGT，如SEQ ID NO.30所示；
SN-A’：CTGCCCTCGCGCT，如SEQ ID NO.31所示；
SN-B’：ATTGCTGCTAGAC，如SEQ ID NO.32所示；
靶向MERS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
MN-A：CAGATGGACCTGGAGA，如SEQ ID NO.33所示；
MN-B：AGTGCCGCGGG，如SEQ ID NO.34所示；
MN-A’：CCCGCGGCACT，如SEQ ID NO.35所示；
MN-B’：TCTCCAGGTCCATC，如SEQ ID NO.36所示。
本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，包括靶向目的基因的所述的寡聚核苷酸组、针对所述目的基因且带有荧光标记的分子信标、PfAgo酶和DNA连接酶。
进一步的，所述目的基因、所述寡聚核苷酸组和所述分子信标均具有多种且一一对应。
所述分子信标具体包括下方中至少一项：
MB-HPV11：5’-FAM-cgcaccTGGGGGAACCAGTGCCTGATGAggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ IDNO.37所示；
MB-HPV16：5’-ROX-cgcaccATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGACCCggtgcg-BHQ2-3’，如SEQID NO.38所示；
MB-HPV18：5’-HEX-cgcaccGATTGCGTCGCATGCCCACCATAGGCggtgcg-BHQ1-3’，如SEQID NO.39所示；
MB-SARS-CoV-2-N：5’-FAM-cgcaccCAAGCAGCAGCtAAGCAAGAGCggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.40所示；
MB-SARS-CoV-2-O：5’-ROX-cgcaccAGTTGATCACAACTACAGCCATAACCTggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.41所示；
MB-SARS-CoV-2-S：5’-FAM-cgcaccTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.42所示；
MB-SARS-CoV-2tu-S：5’-ROX-cgcaccTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.43所示；
MB-SARS-N：5’-HEX-cgcaccGTCTAGCAGCAATTGCGCGAGGGCAGggtgcg-BHQ1-3’，如SEQID NO.44所示；
MB-MERS-N：5’-ROX-cgcaccGATGGACCTGGAGAAGTGCCGCGGGggtgcg-BHQ2-3’，如SEQID NO.45所示。
本发明的第三方面，提供所述寡聚核苷酸组或所述试剂盒在如下任一中的应用：
1)检测或辅助检测病毒；
2)制备检测或辅助检测病毒产品；
3)检测或辅助检测病毒核酸；
4)制备检测或辅助检测病毒核酸产品；
5)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒；
6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒产品；
7)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸；
8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸产品；
9)筛选或辅助筛选病毒防治药物。
本发明的第四方面，提供了一种利用所述寡聚核苷酸组检测或辅助检测病毒核酸的方法，包括如下步骤：
病毒核酸提取、LCR扩增和结果判定；
所述LCR扩增包括采用所述寡聚核苷酸组和DNA连接酶对病毒核酸上目的基因区域进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；
所述结果判定包括在LCR扩增得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值，得到对于的Ct值，根据Ct值判定病毒核酸检测结果；或者对扩增产物进行酶切后产生的片段进行检测，以确定病毒核酸检测结果。
本发明的第五方面，提供了一种利用所述试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，包括以下步骤：
S1、采用所述寡聚核苷酸组和DNA连接酶对所述目的基因进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；若待测病毒为RNA病毒，需要先进行逆转录；
S2、将所述分子信标与所得LCR产物混合，加入PfAgo酶，进行酶切反应；
S3、对酶切产物进行荧光检测，根据对应荧光检测值与空白对照的荧光值的比较判断待测病毒核酸检测结果。
有益效果：
本发明提供的寡聚核苷酸组和试剂盒，能够用于检测HPV11病毒、HPV16病毒、HPV18病毒、HPV病毒、SARS-CoV-2病毒、SARS病毒和MERS病毒，利用了PfAgo酶编辑DNA，LCR反应良好的特异性和区分单碱基特异性的能力以及分子信标的高灵敏度的特点，对检测的靶目标放大，实现了HPV病毒各种亚型的三通道检测，能够区分新型冠状病毒和SARS、MERS病毒，并且能够区分单碱基突变的新型冠状病毒突变体。其检测灵敏度可以达到1aM，并且具有好的特异性，还能实现病毒各种亚型的多通道分析，操作也简单准确。
附图说明
图1是本发明实施例所采用检测的SARS-CoV-2基因分布图。
图2是本发明实施例所采用检测的HPV基因分布图。
图3是本发明实施例对HPV和SARS-CoV-2检测的示意图。
图4是本发明实施例中对LCR反应的优化，4a是不同浓度鲑鱼精对LCR反应的影响，4b是四种寡核苷酸的平均Tm值对LCR反应的影响。
图5是本发明实施例中PfAgo在不同长度向导DNA(gDNA)下靶向切割DNA的能力。
图6是本发明实施例中针对SARS-CoV-2和SARS病毒N基因进行LCR反应的电泳图。
图7是本发明实施例中区分HPV11病毒(图中11泳道)，HPV16病毒(图中16泳道)，HPV18病毒(图中18泳道)、SARS-CoV-2病毒(图中C泳道)，SARS(图中S泳道)和MERS病毒(图中M泳道)的电泳图。
图8是本发明实施例中区分单碱基专一性的电泳图；左方图为针对HPV18病毒L1基因的电泳图，右方图为针对SARS-CoV-2的N基因的电泳图；左右电泳图中，泳道1表示不添加模板的空白对照，泳道2表示四条寡核苷酸与靶DNA互补，泳道3-泳道8表示在连接处的点突变，其余泳道为Marker泳道。
图9是本发明实施例提供的对不同浓度的HPV11基因转录产物样品的检测结果图。
图10是本发明实施例提供的对不同浓度的SARS-CoV-2的N基因转录产物样品的检测结果图。
图11是本发明实施例针对HPV病毒不同亚型的多通道检测图。
图12是本发明实施例针对HPV病毒不同亚型的另一多通道检测图。
图13是本发明实施例区分不同冠状病毒的荧光强度图。
图14是本发明实施例区分新型冠状病毒与其突变体的在不同荧光基团下的荧光强度图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
寡聚核苷酸组及检测方法
本发明实施例提供的寡聚核苷酸组，用于对病毒目的基因进行LCR扩增，包括四种寡核苷酸分子，分别标记为A、B、A’和B’；
若目的基因的核酸分子为双链DNA分子，所述A分子和所述B分子可与双链DNA分子中的一条链互补配对，所述分子A’和所述B’分子可与双链DNA分子中的另一条链互补配对；
若目的基因的核酸分子为单链RNA分子，所述A分子和所述B分子可分别与单链RNA分子逆转录的双链cDNA分子中一条链互补配对以形成连接产物，所述A’分子和所述B’分子可分别与所述连接产物进行再次互补配对。
其中，优选的，四种寡聚核苷酸分子的长度在14nt以下。可选的，A的长度可以超过14nt。针对HPV11、HPV16的E6基因，HPV18的L1基因，针对SARS-CoV-2的N基因、ORF-1a基因和S基因，针对SARS和MERS的N基因分别设计这四种寡聚核苷酸。具体针对的SARS-CoV-2基因分布和HPV基因分布如图1和2所示。
具体的，各种寡聚核苷酸序列如下：
靶向HPV11病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
11-A：CTGTGGGGGAACCT，如SEQ ID NO.1所示；
11-B：GTGCCTGATGACCT，如SEQ ID NO.2所示；
11-A’：TCATCAGGCAC，如SEQ ID NO.3所示；
11-B’：AGGTTCCCCCA，如SEQ ID NO.4所示；
靶向HPV16病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
16-A：AATGTTTCAGGACCC，如SEQ ID NO.5所示；
16-B：ACAGGAGCGACCCA，如SEQ ID NO.6所示；
16-A’：GGGTCGCTCCTGT，如SEQ ID NO.7所示；
16-B’：GGGTCCTGAAACAT，如SEQ ID NO.8所示；；
靶向HPV18病毒L1基因的所述寡聚核苷酸组包括：
18-A：GGATTGCGTCGCAA，如SEQ ID NO.9所示；
18-B：GCCCACCATAGGCC，如SEQ ID NO.10所示；
18-A’：GCCTATGGTGGGC，如SEQ ID NO.11所示；
18-B’：TTGCGACGCAATC，如SEQ ID NO.12所示；；
靶向SARS-CoV-2病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2N-A：TGTCAAGCAGCAGC，如SEQ ID NO.13所示；
SC2N-B：AAAGCAAGAGCAGC，如SEQ ID NO.14所示；
SC2N-A’：GCTCTTGCTTT，如SEQ ID NO.15所示；
SC2N-B’：GCTGCTGCTTG，如SEQ ID NO.16所示；；
靶向SARS-CoV-2病毒ORF-1a基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2ORF-A：GAGTTGATCACAACT，如SEQ ID NO.17所示；
SC2ORF-B：ACAGCCATAACCTT，如SEQ ID NO.18所示；
SC2ORF-A’：AGGTTATGGCTGT，如SEQ ID NO.19所示；
SC2ORF-B’：AGTTGTGATCAACT，如SEQ ID NO.20所示；；
靶向SARS-CoV-2病毒S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2S-A：TGTGCAGTTAACAT，如SEQ ID NO.21所示；
SC2S-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.22所示；
SC2S-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.23所示；
SC2S-B’：ATGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.24所示；；
靶向SARS-CoV-2病毒突变体S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2SM-A：TGTGCAGTTAACAC，如SEQ ID NO.25所示；
SC2SM-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.26所示；
SC2SM-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.27所示；
SC2SM-B’：GTGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.28所示；；
靶向SARS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SN-A：GGTCTAGCAGCAAT，如SEQ ID NO.29所示；
SN-B：AGCGCGAGGGCAGT，如SEQ ID NO.30所示；
SN-A’：CTGCCCTCGCGCT，如SEQ ID NO.31所示；
SN-B’：ATTGCTGCTAGAC，如SEQ ID NO.32所示；；
靶向MERS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
MN-A：CAGATGGACCTGGAGA，如SEQ ID NO.33所示；
MN-B：AGTGCCGCGGG，如SEQ ID NO.34所示；
MN-A’：CCCGCGGCACT，如SEQ ID NO.35所示；
MN-B’：TCTCCAGGTCCATC，如SEQ ID NO.36所示。
具体的，所述B分子、所述A’分子和所述B’分子均带有磷酸基团。
更具体的，所述B分子、所述A’分子和B’分子均通过T4多核苷酸激酶处理后使其5’端带上磷酸基团。
T4多核苷酸激酶反应体系如下，以25ul/反应为例。
表1寡聚核苷酸磷酸化修饰反应体系配置
Figure BDA0002753761720000101
T4多核苷酸激酶磷酸化反应程序：37℃1h；65℃20min。
采用上述四种寡聚核苷酸对每种病毒的目的基因进行多重LCR扩增，扩增反应体系如下：
表2 LCR反应体系配置(以10ul/反应为例)
Figure BDA0002753761720000102
Figure BDA0002753761720000111
LCR扩增程序为：80℃1min变性；40℃2min连接；35个循环。对于新型冠状病毒目的基因的扩增，只需要向步骤3最终反应体系中加入除模板和寡核苷酸A以外的组分。上述LCR反应条件为经过优化后的结果，优化过程如图4所示。
进一步的实施例中，本发明还提供一种利用上述寡聚核苷酸组检测或辅助检测病毒核酸的方法，包括如下步骤：病毒核酸提取、LCR扩增和结果判定。
其中，LCR扩增包括采用所述寡聚核苷酸组和DNA连接酶对病毒核酸上目的基因区域进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；
其中，结果判定包括在LCR扩增得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值，得到对于的Ct值，根据Ct值判定病毒核酸检测结果。
一些实施方式中，对于结果判定，还可以通过Lambda外切酶降解剩余的磷酸化寡聚核苷酸，有利于降低对照反应的信号，增加灵敏度，具体如在得到扩增产物后，向体系中加入阻断序列和氯化钠溶液。然后利用外切酶III降解双链DNA中3端为平末端或者凹陷末端的DNA序列，从而将扩增产物酶切为片段，通过对这些片段进行电泳检测，荧光检测或其他化学发光检测，或者进行毛细管电泳检测等手段进行检测，以完成对病毒核酸的结果判定。
试剂盒及检测方法
本发明的另一些实施方式中，还提供一种试剂盒，包括靶向目的基因的上述实施例提供的寡聚核苷酸组、针对该目的基因且带有荧光标记的分子信标、PfAgo酶和DNA连接酶。
目的基因包括HPV11、HPV16的E6基因，HPV18的L1基因，针对SARS-CoV-2的N基因、ORF-1a基因和S基因，针对SARS和MERS的N基因。寡聚核苷酸组和分子信标均具有多种且与目的基因一一对应。
本发明实施例提供的用于HPV和SARS-CoV-2病毒检测的试剂盒，具体包括上述LCR扩增所需的溶液，包括对应于HPV11、16、18，新型冠状病毒N、ORF-1、S基因，新型冠状病毒突变体S基因，MERS和SARS病毒上下游引物的四条寡聚核苷酸，DNA连接酶，10×DNAligasebuffer和鲑鱼精；上述分子信标；PfAgo DNA编辑酶。其中，四条寡聚核苷酸的长度优选为14nt以下，这是由于PfAgo DNA编辑酶能够在向导DNA(gDNA)下靶向切割DNA，而本发明提供的寡核苷酸分子能够作为这种向导DNA，引导PfAgo对LCR扩增产物进行靶向切割，从而得到所需的目的基因片段。由图5的结果可知，在gDNA长度为14nt以下时，PfAgo DNA编辑酶的切割效果更佳。
其中，分子信标具体为：
针对HPV11的分子信标：
MB-HPV11-E6基因：5’-FAM-cgcaccTGGGGGAACCAGTGCCTGATGAggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.37所示。
针对HPV16-E6基因的分子信标：
MB-HPV16：5’-ROX-cgcaccATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCGACCCggtgcg-BHQ2-3’，如SEQID NO.38所示。
针对HPV18-L1基因的分子信标：
MB-HPV18：5’-HEX-cgcaccGATTGCGTCGCATGCCCACCATAGGCggtgcg-BHQ1-3’，如SEQID NO.39所示。
针对SARS-CoV-2-N基因的分子信标：
MB-SARS-CoV-2-N：5’-FAM-cgcaccCAAGCAGCAGCtAAGCAAGAGCggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.40所示。
针对SARS-CoV-2-ORF-1a基因的分子信标：
MB-SARS-CoV-2-O：5’-ROX-cgcaccAGTTGATCACAACTACAGCCATAACCTggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.41所示。
针对SARS-CoV-2-S基因的分子信标：
MB-SARS-CoV-2-S：5’-FAM-cgcaccTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.42所示。
针对SARS-CoV-2突变体-S基因的分子信标：
MB-SARS-CoV-2tu-S：5’-ROX-cgcaccTGTTCTTTATCAGGGTGTTAACTGCACAggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.43所示。
针对SARS病毒N基因的分子信标：
MB-SARS-N：5’-HEX-cgcaccGTCTAGCAGCAATTGCGCGAGGGCAGggtgcg-BHQ1-3’，如SEQID NO.44所示。
针对MERS病毒N基因的分子信标：
MB-MERS-N：5’-ROX-cgcaccGATGGACCTGGAGAAGTGCCGCGGGggtgcg-BHQ2-3’，如SEQID NO.45所示。
其中，不同荧光基团在特定激发波长和发射波长如表3所示。
表3荧光基团的激发波长和发射波长
Figure BDA0002753761720000131
Figure BDA0002753761720000141
如图3所示，本发明实施例还提供利用该试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的方法，包括以下步骤：
S1、采用上述实施例提供寡聚核苷酸组和DNA连接酶对所述目的基因进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；若待测病毒为RNA病毒，需要先进行逆转录；
S2、将靶向对应目的基因的分子信标与所得LCR产物混合，加入PfAgo酶，进行酶切反应；
S3、对酶切产物进行荧光检测，根据对应荧光检测值与空白对照的荧光值的比较判断待测病毒核酸检测结果。
其中，若待测病毒为RNA病毒，逆转录过程如下：以SARS病毒为例
表4逆转录体系配置(以20ul/反应为例)
Figure BDA0002753761720000142
逆转录反应程序为：42℃，10min。
LCR扩增程序如表2所示。
PfAgo介导靶向切割分子信标，LCR扩增得到的产物与分子信标混合，并加入DNA编辑酶PfAgo进行酶切反应，反应体系如表5所示。
表5 PfAgo酶切体系(以15ul/体系为例)
Figure BDA0002753761720000151
PfAgo酶切反应程序为：95℃，30min。
可以采用荧光光度计或者荧光定量PCR仪进行荧光测定。
荧光检测过程中，用荧光光度计测得荧光值然后减去空白对照的荧光值得到去除背景的相对荧光值；检测不同激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照(不加靶DNA)的荧光值后得到待测样品的相对荧光值的结果；
结合本发明的灵敏度分析，本试剂盒的结果判读方法如下：
(1)判断HPV病毒DNA或SARS-CoV-2病毒RNA的有无：若荧光值大于空白对照(无所述HPV DNA或SARS-CoV-2RNA)，则证明有所述HPV DNA或SARS-CoV-2RNA，若小于等于空白对照，则证明无所述HPV DNA或SARS-CoV-2RNA；
(2)判断HPV病毒DNA的种类：通过荧光基团在相应光谱下得发光情况判断待检测样品中HPV核酸的种类：
若在激发光谱为538nm，发射光谱为555nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有HPV18；
若在激发光谱为588nm，发射光谱为607nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有HPV16；
若在激发光谱为496nm，发射光谱为518nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有HPV11；
(3)判断冠状病毒的种类(针对N基因)：通过荧光基团在相应光谱下得发光情况判断待检测样品中冠状病毒核酸的种类：
若在激发光谱为538nm，发射光谱为555nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有SARS；
若在激发光谱为588nm，发射光谱为607nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有MERS；
若在激发光谱为496nm，发射光谱为518nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有SARS-CoV-2；
(4)判断是新型冠状病毒的野生型还是突变型(针对S基因)：通过荧光基团在相应光谱下得发光情况判断待检测样品中新型冠状病毒核酸的种类：
若在激发光谱为496nm，发射光谱为518nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有SARS-CoV-2野生型；
若在激发光谱为588nm，发射光谱为607nm时有光谱(测得的荧光值大于空白对照的荧光值)，则表明含有SARS-CoV-2突变型。
实施例1阳性标准品的检测
1、阳性标准品的获得
取确定含有HPV11，HPV16，HPV18中的至少一种的阳性样品作为阳性标准品，采用安必平的人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒对样品进行检测，阳性样品(包括高危型人乳头瘤病毒样品和低危型人乳头瘤病毒样品)作为本发明的HPV病毒阳性标准品。
取确定含有SARS-CoV-2、MERS、SARS的N基因，新型冠状病毒的ORF-1a基因，新型冠状病毒野生型和突变型的S基因中的至少一种的阳性样品作为阳性标准品，采用现有的新型冠状病毒检测试剂盒对样品进行检测，阳性样品(包含相关基因的cDNA)作为本发明的冠状病毒阳性标准品。
2、LCR扩增得到LCR扩增产物：对上述阳性标准品采用实施例1的方法进行LCR扩增后得到得扩增产物，图6是对SARS和SARS-CoV-2的N基因进行LCR扩增后得到的扩增产物进行20％聚丙烯酰胺凝胶电泳实验的结果图，可见均实现了成功扩增。
3、酶切反应：LCR扩增得到的产物与上述分子信标混合，并加入PfAgo蛋白酶进行酶切反应。酶切反应体系如表5所示。
4、PfAgo酶切后用荧光光度计检测不同激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照(不加靶DNA)的荧光值后得到阳性标准品的相对荧光值的结果如图11-14所示。
采用本发明的方法对待测样品进行检测时，将待测样品的LCR产物与本发明的分子信标混合，加入DNA编辑酶PfAgo，进行酶切反应并用荧光光度计测得荧光值然后减去空白对照的荧光值得到去除背景的相对荧光值(background-substracted fluorescence(AU))。若荧光值大于空白对照，则证明有所述HPV DNA或者冠状病毒RNA，若小于等于空白对照，则证明无所述HPV DNA或者冠状病毒RNA，同时根据不同HPV亚型DNA和不同冠状病毒的不同基因设计得到的不同荧光基团标记得到的分子信标，从而通过荧光基团在相应光谱下得发光情况判断待检测样品中HPV核酸的种类和冠状病毒核酸的种类。
实施例2灵敏度、特异性以及单碱基专一性分析
以HPV11相关质粒和新型冠状病毒N基因相关cDNA作为模板，以HPV11和N基因相关四条寡聚核苷酸以及分子探针检测灵敏度为例。
1、不同梯度阳性标准品的获得
取20μL HPV11和N基因阳性标准品加入180μL DEPC处理的水，依次进行梯度稀释，获得不同梯度的阳性标准品。分别为100pM，10pM，1pM，100fM，10fM，1fM，100aM，10aM，1aM。
2、对上述不同浓度的阳性标准品采用实施例1的方法进行LCR扩增后得到得扩增产物。
3、LCR扩增得到的产物与上述分子信标混合，并加入Pfago蛋白酶进行酶切反应。酶切反应体系如表5所示。
4、PfAgo酶切后用荧光光度计检测不同激发光谱和发射光谱下荧光的情况，通过减去空白对照(不加靶DNA)的荧光值。
由图9-10可知，本发明的检测方法最低可以检测到1aM的HPV11和N基因，且呈现较好的正相关。
特异性分析：
如图7所示，将特异性靶向SARS-CoV-2的N基因和HPV11的四种寡聚核苷酸加入进行LCR反应，发现只有当SARS-CoV-2和HPV11出现时，才能出现明显的LCR扩增产物，表明本发明的用于检测HPV病毒和冠状病毒的试剂盒具有特异性强的优点。
单碱基专一性分析：
如图8所示，只有连接位点的碱基与模板配对时，LCR反应才能进行，表明本发明的用于检测HPV病毒和冠状病毒的试剂盒具有单碱基专一性的优点。
实施例3临床样本分析
采用实施例1中的LCR扩增得到LCR扩增产物；LCR扩增得到的产物与实施例1中的分子信标混合，并加入PfAgo蛋白酶进行酶切反应，反应体系如表5所示。
荧光检测结果如图11-14所示，并采用市场上其他试剂盒，如安必平的HPV核酸检测试剂盒和明德生物的新型冠状病毒检测试剂盒，检测结果如表6和表7。结果表明，本发明提供的试剂盒与市场上的阳性率和阴性率相当，并且不存在假阳性和假阴性的情况。
表6
Figure BDA0002753761720000191
表7
Figure BDA0002753761720000192
Figure BDA0002753761720000201
应用
另外，本发明实施例还提供了上述实施例提供的寡聚核苷酸组或试剂盒在如下任一中的应用：
1)检测或辅助检测病毒；
2)制备检测或辅助检测病毒产品；
3)检测或辅助检测病毒核酸；
4)制备检测或辅助检测病毒核酸产品；
5)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒；
6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒产品；
7)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸；
8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸产品；
9)筛选或辅助筛选病毒防治药物。
这些应用中，其是新型冠状病毒，其包括病毒基因测序，病毒致毒机制的研究，其各种抗体和疫苗的开发均需要均需要对病毒检测，从这些角度而言，本发明提供的寡聚核苷酸组或试剂盒均具有广泛的应用意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 寡聚核苷酸组、试剂盒及其应用
<141> 2020-10-29
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctgtggggga acct 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtgcctgatg acct 14
<210> 3
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcatcaggca c 11
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aggttccccc a 11
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aatgtttcag gaccc 15
<210> 6
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acaggagcga ccca 14
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gggtcgctcc tgt 13
<210> 8
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gggtcctgaa acat 14
<210> 9
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ggattgcgtc gcaa 14
<210> 10
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gcccaccata ggcc 14
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gcctatggtg ggc 13
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ttgcgacgca atc 13
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgtcaagcag cagc 14
<210> 14
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aaagcaagag cagc 14
<210> 15
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gctcttgctt t 11
<210> 16
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gctgctgctt g 11
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gagttgatca caact 15
<210> 18
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
acagccataa cctt 14
<210> 19
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
aggttatggc tgt 13
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
agttgtgatc aact 14
<210> 21
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
tgtgcagtta acat 14
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cctgataaag aaca 14
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ttgctgttct ttatcagg 18
<210> 24
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
atgttaactg caca 14
<210> 25
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgtgcagtta acac 14
<210> 26
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cctgataaag aaca 14
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ttgctgttct ttatcagg 18
<210> 28
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gtgttaactg caca 14
<210> 29
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ggtctagcag caat 14
<210> 30
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
agcgcgaggg cagt 14
<210> 31
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
ctgccctcgc gct 13
<210> 32
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
attgctgcta gac 13
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
cagatggacc tggaga 16
<210> 34
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
agtgccgcgg g 11
<210> 35
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
cccgcggcac t 11
<210> 36
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
tctccaggtc catc 14
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
cgcacctggg ggaaccagtg cctgatgagg tgcg 34
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
cgcaccatgt ttcaggaccc tcaggagcga cccggtgcg 39
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
cgcaccgatt gcgtcgcatg cccaccatag gcggtgcg 38
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
cgcacccaag cagcagctaa gcaagagcgg tgcg 34
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
cgcaccagtt gatcacaact acagccataa cctggtgcg 39
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
cgcacctgtt ctttatcagg atgttaactg cacaggtgcg 40
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
cgcacctgtt ctttatcagg gtgttaactg cacaggtgcg 40
<210> 44
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
cgcaccgtct agcagcaatt gcgcgagggc agggtgcg 38
<210> 45
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
cgcaccgatg gacctggaga agtgccgcgg gggtgcg 37

Claims (9)

1.寡聚核苷酸组，用于对病毒目的基因进行LCR扩增，其特征在于，包括四种寡聚核苷酸分子，分别标记为A、B、A’和B’；
若目的基因的核酸分子为双链DNA分子，所述A分子和所述B分子可与双链DNA分子中的一条链互补配对，所述分子A’和所述B’分子可与双链DNA分子中的另一条链互补配对；
若目的基因的核酸分子为单链RNA分子，所述A分子和所述B分子可分别与单链RNA分子逆转录的双链cDNA分子中一条链互补配对以形成连接产物，所述A’分子和所述B’分子可分别与所述连接产物进行再次互补配对；所述B分子、所述A’分子和所述B’分子均带有磷酸基团，四种所述寡聚核苷酸的长度均为14nt以下。
2.根据权利要求1所述的寡聚核苷酸组，其特征在于，所述目的基因包括HPV11病毒E6基因、HPV16病毒E6基因、HPV18病毒L1基因、SARS-CoV-2病毒N基因、SARS-CoV-2病毒ORF-1a基因、SARS-CoV-2病毒S基因、SARS-CoV-2病毒突变体S基因、SARS病毒N基因和MERS病毒N基因中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的寡聚核苷酸组，其特征在于，具体为：
靶向HPV11病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
11-A：CTGTGGGGGAACCT，如SEQ ID NO.1所示；
11-B：GTGCCTGATGACCT，如SEQ ID NO.2所示；
11-A’：TCATCAGGCAC，如SEQ ID NO.3所示；
11-B’：AGGTTCCCCCA，如SEQ ID NO.4所示；
靶向HPV16病毒E6基因的所述寡聚核苷酸组包括：
16-A：AATGTTTCAGGACCC，如SEQ ID NO.5所示；
16-B：ACAGGAGCGACCCA，如SEQ ID NO.6所示；
16-A’：GGGTCGCTCCTGT，如SEQ ID NO.7所示；
16-B’：GGGTCCTGAAACAT，如SEQ ID NO.8所示；
靶向HPV18病毒L1基因的所述寡聚核苷酸组包括：
18-A：GGATTGCGTCGCAA，如SEQ ID NO.9所示；
18-B：GCCCACCATAGGCC，如SEQ ID NO.10所示；
18-A’：GCCTATGGTGGGC，如SEQ ID NO.11所示；
18-B’：TTGCGACGCAATC，如SEQ ID NO.12所示；
靶向SARS-CoV-2病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2N-A：TGTCAAGCAGCAGC，如SEQ ID NO.13所示；
SC2N-B：AAAGCAAGAGCAGC，如SEQ ID NO.14所示；
SC2N-A’：GCTCTTGCTTT，如SEQ ID NO.15所示；
SC2N-B’：GCTGCTGCTTG，如SEQ ID NO.16所示；
靶向SARS-CoV-2病毒ORF-1a基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2ORF-A：GAGTTGATCACAACT，如SEQ ID NO.17所示；
SC2ORF-B：ACAGCCATAACCTT，如SEQ ID NO.18所示；
SC2ORF-A’：AGGTTATGGCTGT，如SEQ ID NO.19所示；
SC2ORF-B’：AGTTGTGATCAACT，如SEQ ID NO.20所示；
靶向SARS-CoV-2病毒S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2S-A：TGTGCAGTTAACAT，如SEQ ID NO.21所示；
SC2S-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.22所示；
SC2S-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.23所示；
SC2S-B’：ATGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.24所示；
靶向SARS-CoV-2病毒突变体S基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SC2SM-A：TGTGCAGTTAACAC，如SEQ ID NO.25所示；
SC2SM-B：CCTGATAAAGAACA，如SEQ ID NO.26所示；
SC2SM-A’：TTGCTGTTCTTTATCAGG，如SEQ ID NO.27所示；
SC2SM-B’：GTGTTAACTGCACA，如SEQ ID NO.28所示；
靶向SARS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
SN-A：GGTCTAGCAGCAAT，如SEQ ID NO.29所示；
SN-B：AGCGCGAGGGCAGT，如SEQ ID NO.30所示；
SN-A’：CTGCCCTCGCGCT，如SEQ ID NO.31所示；
SN-B’：ATTGCTGCTAGAC，如SEQ ID NO.32所示；
靶向MERS病毒N基因的所述寡聚核苷酸组包括：
MN-A：CAGATGGACCTGGAGA，如SEQ ID NO.33所示；
MN-B：AGTGCCGCGGG，如SEQ ID NO.34所示；
MN-A’：CCCGCGGCACT，如SEQ ID NO.35所示；
MN-B’：TCTCCAGGTCCATC，如SEQ ID NO.36所示。
4.一种试剂盒，其特征在于，包括靶向目的基因的权利要求1-3任一项所述的寡聚核苷酸组、针对所述目的基因且带有荧光标记的分子信标、PfAgo酶和DNA连接酶。
5.权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述目的基因、所述寡聚核苷酸组和所述分子信标均具有多种且一一对应。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述分子信标具体包括下方中至少一项：
MB-HPV11：5’-FAM-cgcaccTGGGGGAACCAGTGCCTGATGAgg
tgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.37所示；
MB-HPV16：5’-ROX-cgcaccATGTTTCAGGACCCTCAGGAGCG
ACCCggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.38所示；
MB-HPV18：5’-HEX-cgcaccGATTGCGTCGCATGCCCACCATAGGC
ggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.39所示；
MB-SARS-CoV-2-N：5’-FAM-cgcaccCAAGCAGCAGCtAAGCAAGA
GCggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.40所示；
MB-SARS-CoV-2-O：5’-ROX-cgcaccAGTTGATCACAACTACAGCC
ATAACCTggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.41所示；
MB-SARS-CoV-2-S：5’-FAM-cgcaccTGTTCTTTATCAGGATGTTAAC
TGCACAggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.42所示；
MB-SARS-CoV-2tu-S：5’-ROX-cgcaccTGTTCTTTATCAGGGTGTTA
ACTGCACAggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.43所示；
MB-SARS-N：5’-HEX-cgcaccGTCTAGCAGCAATTGCGCGAGGGCA
Gggtgcg-BHQ1-3’，如SEQ ID NO.44所示；
MB-MERS-N：5’-ROX-cgcaccGATGGACCTGGAGAAGTGCCGCGG
Gggtgcg-BHQ2-3’，如SEQ ID NO.45所示。
7.权利要求1-3任一项所述的寡聚核苷酸组或权利要求4-6任一项所述试剂盒在如下任一中的非疾病诊断应用：
1)检测或辅助检测病毒；
2)制备检测或辅助检测病毒产品；
3)检测或辅助检测病毒核酸；
4)制备检测或辅助检测病毒核酸产品；
5)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒；
6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒产品；
7)检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸；
8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有病毒核酸产品；
9)筛选或辅助筛选病毒防治药物。
8.一种利用权利要求1-3任一项所述寡聚核苷酸组检测或辅助检测病毒核酸的非疾病诊断方法，其特征在于，包括如下步骤：
病毒核酸提取、LCR扩增和结果判定；
所述LCR扩增包括采用所述寡聚核苷酸组和DNA连接酶对病毒核酸上目的基因区域进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；
所述结果判定包括在LCR扩增得到的扩增曲线上的指数扩增阶段设定阈值，得到对于的Ct值，根据Ct值判定病毒核酸检测结果；或者对扩增产物进行酶切后产生的片段进行检测，以确定病毒核酸检测结果。
9.一种利用权利要求4-6任一项所述的试剂盒检测或辅助检测病毒核酸的非疾病诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用所述寡聚核苷酸组和DNA连接酶对所述目的基因进行多重LCR扩增，得到与所述A分子、所述B分子、所述A’分子和所述B’分子分别对应的与所述目的基因相关的片段，即LCR产物；若待测病毒为RNA病毒，需要先进行逆转录；
S2、将所述分子信标与所得LCR产物混合，加入PfAgo酶，进行酶切反应；
S3、对酶切产物进行荧光检测，根据对应荧光检测值与空白对照的荧光值的比较判断待测病毒核酸检测结果。
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