CN103103283A - 一种检测单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，涉及单核苷酸多态性的分析检测，具体涉及一种普适的利用缺口-连接酶链式反应扩增目标DNA，将DNAzyme序列引入连接产物中，然后利用Lambda外切酶降解没有参与连接反应的磷酸化探针，及外切酶III释放DNAzyme的检测方法。本发明将DNAzyme探针与Gap-LCR探针相结合，通过在LCR体系中的待连接的一个磷酸化探针中加入一段DNAzyme序列，Gap-LCR扩增反应结束以后，向体系中加入Anti-G序列（与探针中的DNAzyme序列部分互补配对），利用Lambda外切酶降解5端磷酸化的DNA探针，然后利用外切酶III释放连接产物中的DNAzyme，通过DNAzyme的特性来进行SNP的定性和定量检测。本发明具有简单、方便、实用、经济，广泛适用于各种单核苷酸多态性检测。

Description

一种检测单核苷酸多态性的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及单核苷酸多态性的分析检测，具体涉及一种普适的利用缺口-连接酶链式反应扩增目标DNA，将DNAzyme序列引入连接产物中，然后利用Lambda外切酶降解没有参与连接反应的磷酸化探针，及外切酶III释放DNAzyme的检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是基因组DNA中某一特定核苷酸位置上发生转换、颠换、插入或缺失等变化，而且任何一种等位基因在群体中的频率不小于1%。它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上，与许多疾病直接相关，如血友病和苯酮尿病等，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。核酸探针技术就是利用核苷酸碱基互补配对的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。目前核酸探针技术在临床微生物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域得到越来越广泛的应用，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具。

DNAzyme是通过体外指数富集的配基系统进化(SELEX)技术发现的具有催化活性的单链DNA分子，由于其性质稳定、易于储存及化学合成经济方便等优点赢得众多科学家的广泛关注。1996年，Dipankar Sen发现了能够折叠成G-四链体的富含鸟嘌呤的单链DNAzyme。2004年Itamar Willner研发出了室温下能形成发夹结构的催化信标，通过释放这种能形成G-四链体的DNAzyme来检测核酸和端粒酶的活性。这种DNAzyme与卟啉铁（hemin）或者卟啉铁类似物结合后，具有类似于过氧化物酶的活性，能催化H₂O₂将显色底物（ABTS，DAB等）氧化成有色物质，因此可以直接在室温下通过颜色变化来检测核酸。

连接酶依赖的DNA扩增技术是在20世纪80年代晚期和90年代初期研究DNA连接酶在缺口连接时的保真性的过程中取得突破性进展的，多用于单核苷酸多态性的检测。连接酶检测反应(Ligase detection reaction,LDR)是通过一对与目标核酸互补配对的探针的反复连接实现目标核酸的线性扩增。连接酶扩增反应(Ligase amplification reaction,LAR)或连接酶链式反应(Ligase chain reaction,LCR)是在连接酶检测反应(Ligase detection reaction,LDR)的基础上发明的一种依赖连接酶的DNA指数扩增技术。它们在LDR的基础上引入另外一组与目标基因对应链互补配对的探针，通过反复的热变性、退火和连接进而实现目标基因的指数扩增。该技术首次实现体外酶促连接特异DNA片段，能迅速扩增放大目的核酸，使后续的检测更灵敏；LCR既可扩增，又可测定DNA异常，其特点是特异性强，灵敏度高。Gap-LCR是一种修饰过的LCR技术，是在LCR体系中的分别互补配对的两组探针的连接处设计一个碱基的缺口，该缺口处的碱基必须通过DNA聚合酶进行延伸后，才能在连接酶的作用下进行连接反应，最终实现Gap-LCR的指数扩增。Gap-LCR技术能够避免探针自身引起的平末端的连接反应，从而降低背景，增加灵敏度。目前的LCR扩增技术多与同位素标记或者荧光修饰相结合运用于单核苷酸多态性的检测，这些方法都在一定程度上存在同位素污染、试剂或者检测仪器成本过高等问题。

因此，如何设计一种廉价、有效、经济、普适的检测方法来检测基因组DNA中单核苷酸多态性是近年来许多学者们正在研究的问题。

发明内容

本发明提供一种SNP的检测方法，该方法在缺口-连接酶链式扩增技术的探针上引入DNAzyme序列，该方法是一种不需要特殊修饰的探针和昂贵的检测仪器，就能够迅速、简便、并且高灵敏专一地对血液样品中单核苷酸多态性进行定性和定量的检测方法。

实现以上目的的技术方案如下：

一种DNA的缺口-连接酶链式扩增方法，包括以下步骤：

a)根据目标DNA的突变位点设计探针用于缺口-连接酶链式扩增，在其中一条磷酸化的DNA探针序列的3端引入DNAzyme序列；

b)对待测样品中的目标核酸序列进行Gap-LCR扩增时，在Gap-LCR体系中除了加入待检测的目标核酸序列，还需要加入两组探针，这两组探针分别与待检测目标核酸序列中突变位点附近的碱基互补配对。

c)本发明所涉及的探针分别为长度为20-25个核苷酸的与目标核酸序列互补的片段，DNAzyme序列包含在其中一个磷酸化的探针中；该DNAzyme序列可以被其互补探针或者扩增反应结束后加入阻断序列，即Anti-G形成互补配对，使得该DNAzyme或部分DNAzyme序列处于封闭状态，该状态有利于Lambda外切酶消化未参与连接反应的磷酸化探针，尤其是含有DNAzyme序列的探针；然后利用Lambda外切酶将未参与扩增反应的磷酸化探针进行降解，然后利用外切酶III的3’-5’的外切酶活性将连接产物中的DNAzyme序列释放出来，产生能检测的信号。

d)本发明所涉及的探针中的DNAzyme标记是一种能够产生信号的、具有催化功能的DNA序列，该DNAzyme是能与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme。

e)本发明所涉及的探针中的DNAzyme标记是与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme时，可在DNAzyme释放后，通过加入hemin、显色底物ABTS或者荧光物质盐酸酪胺、H₂O₂进行信号的检测。当显色底物为ABTS时，在室温下显色后，可以直接用肉眼观察颜色变化或用分光光度计测得一定波长下的吸光值来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在突变位点，存在突变位点的目标核酸序列的样品显绿色，不存在目标核酸序列的样品都为无色。当产生信号的物质为盐酸酪胺时，在室温下被氧化后，可以直接通过多功能读数仪测得一定波长下的吸光值来检测信号，从而判断目标核酸序列是否存在，存在突变位点的目标核酸序列的样品时有荧光信号，不存在突变位点的目标核酸序列的样品时没有荧光信号产生。

f)在本发明用与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme标记的寡核苷酸探针对核酸的单核苷酸多态性进行检测时，Gap-LCR结束后向体系中加入一定浓度的钠离子，此步骤有利于阻断序列Anti-G更好的封闭DNAzyme序列，形成互补配对的双链结构，以便Lambda外切酶更加完全地消化未被连接的含DNAzyme序列的探针，使阴性对照的信号更低，从而使检测结果更加灵敏。

在本发明的Gap-LCR反应体系中，寡核苷酸探针大约在0.6μM-1.2μM、探针的量没有特别限制，等量即可，以保证连接反应的产率，同时控制背景。

在本发明对核酸进行检测的过程中，阻断序列Anti-G可以设计在其中一条探针中，也可以单独存在。当被设计在其中一条探针中时，在一开始就加入Gap-LCR体系中，此时只需要考虑各个探针的Tm值不要差别太大。当Anti-G单独存在时，既可以在一开始就加入Gap-LCR体系中，也可以在Gap-LCR扩增结束后再加入。较佳体系为Anti-G阻断序列单独设计，在Gap-LCR体系结束后再加入，此时更容易设计满足Tm值差别小的探针，同时减少Gap-LCR扩增过程中的非特异性延伸或者连接反应引起的背景。

本发明中所涉及的DNA聚合酶是一种既不具有5’-3’外切酶活性，也不具有3’-5’的外切酶活性的耐热性聚合酶，用于延伸连接反应前探针缺口处的碱基。

在本发明中，对待测核酸样品的长度没有限制，可以检测合成的短片段DNA，也可以检测质粒DNA或者基因组DNA。

如本文所用，下列词语/术语具有下列含义，除非另外说明。

“DNA”：脱氧核糖核酸。是一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核糖核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成，是遗传信息的载体。

“LCR”：连接酶链式反应。是体外连接酶促扩增特异DNA片段的一种方法,由高温变性、适温退火、延伸及连接等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，而含有突变位点的DNA则不能扩增，该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

“DNAzyme”：脱氧核酶（deoxyribozyme，Catalytic DNA）是人工合成的、利用体外分子进化技术筛选的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，能与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性。

“探针”：一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始填补缺口，为连接反应创造条件。

“SELEX”：systematic evolution of ligands by exponential enrichment，指数级富集的配体系统进化技术，从大量的随机序列的寡核苷酸库中鉴定出一种数量很少的具有独特性质的核酸序列的方法。SELEX方法是由Tuerk和Ellington等在1990年建立的，它是一种通过体外反复选择和放大从巨大的核苷酸组合库中筛选特定核苷酸序列的方法。SELEX过程中，首先是用组合化学合成DNA的方法合成随机序列的核酸库然后，在一定的温度下将寡核苷酸随机序列库与靶分子共同孵育于特定的缓冲液中，组合库中的极少数分子将与靶分子结合，然后用物理的方法将结合的分子与未结合的分子分离开来。

“Hemin”：血红素，即卟啉铁。

Lambda外切酶：一种具有高持续能力的5’-3’外切脱氧核糖核酸酶，选择性切割双链DNA中的5端磷酸化的DNA序列，该酶对单链DNA和未磷酸化DNA的活性较低、对含有切口的DNA无活性、对缺口的DNA活性有限。

外切酶III：该酶具有3’-5’的外切酶脱氧核糖核酸酶活性，降解双链DNA的平末端，5’突出末端或切口，从DNA链的3’端释放5’单磷酸核苷酸，产生单链DNA片段。该酶对具有3’突出末端（至少有4个碱基，且3’末端不是C残基）的DNA、单链DNA、硫代磷酸酯连接的核苷酸无活性。

本发明所公开的方法关键在于将DNAzyme序列设计在用于LCR扩增的寡核苷酸探针中，经过扩增后，先用Lambda外切酶降解没有被连接的磷酸化探针，然后用外切酶III将连接产物中的DNAzyme序列释放出来，在LCR结束后通过检测DNAzyme的量来直接或间接对目标核酸序列进行定性或定量，该方法灵敏、准确、快速且廉价，可应用于各种单核苷酸多态性检测体系，特别是对于某些疾病早期检测和遗传分析等均有很高的实用价值。本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

1.新颖性。本发明成功将DNAzyme探针与普通的LCR探针相结合，提供一种普适的利用Lambda外切酶降解未被连接的磷酸化探针，然后利用外切酶III释放连接产物中的DNAzyme来进行单核苷酸多态性，在国内尚为首创。

2.通用性。本发明所涉及的Gap-LCR检测方法，针对不同样品中的待检测核酸，只需改变寡核苷酸探针中的与目标核酸序列互补的特异性序列，创造性的建立了一种LCR通用型核酸检测体系。

3.实用性。现有的实时荧光LCR技术通常对检测设备具有较高的要求，从而使检测具有一定的局限性，而本发明检测方法仅需要普通PCR仪，因此，核酸多态性检测变得更加广泛、实用、方便。

4.经济性。现有的荧光、同位素标记的LCR技术，探针的合成和试剂及检测仪器的费用都较高，而本发明中所涉及的探针序列和标记物都由普通的核苷酸组成，不用特殊修饰，合成方便，试剂较为廉价，因此，大大降低了检测成本。

附图说明

图1是具体实施例1检测镰刀形贫血基因的流程示意图。

图2是具体实施例1检测镰刀形贫血基因的灵敏度结果图。

图3是具体实施例2检测新生儿耳聋基因突变位点235delC的结果图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实例进一步说明本发明。本领域的技术人员应理解，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1、用A组（Probe L,ProbeL*,Probe R,Probe R*）寡核苷酸探针检测镰刀形贫血基因DNAT-1(突变DNAT-1为突变DNA，正常DNAT-1为正常DNA)。

检测镰刀形贫血基因的反应步骤参见图1。A组（Probe L,ProbeL*,Probe R,Probe R*）寡核苷酸探针设计来检测镰刀形贫血基因，其中寡核苷酸探针Probe R的3’端标记了一种能与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme序列，用于信号的检测；5’端的序列为能与待检测目标基因突变位点附近的序列形成互补的序列，用于Gap-LCR扩增。

将A组寡核苷酸探针Probe L,ProbeL*,Probe R,Probe R*加入Gap-LCR体系后，变性条件下，待测DNA T-1的双链以及探针（Probe L，ProbeL*,Probe R,Probe R*）的双链结构都打开；在复性的条件下，探针（Probe L,ProbeL*）和探针（Probe R,Probe R*）分别与突变DNAT-1双链中的一条链杂交；在KlenTaq DNA聚合酶的作用下，将探针连接处的缺口碱基进行填补；然后在连接酶的作用下，将缺口填补后的探针连起来，从而得到大量的待检测的目标基因，并且在扩增的目标基因中含有DNAzyme序列。得到扩增产物后，向体系中加入阻断序列Anti-G和一定浓度的NaCl，使探针中的DNAzyme序列能够形成双链结构，以便Lambda外切酶能够很好地降解剩余的磷酸化的探针，有利于降低对照反应的信号，增加灵敏度。然后利用外切酶III可以降解双链DNA中3端为平末端或者凹陷末端的DNA序列，从而可以将连接产物中的DNAzyme序列释放出来能形成G-四链体，加入hemin，具有过氧化物酶活性，能催化H₂O₂将ABTS氧化成绿色自由基。从理论上说，每扩增一条DNA链，就有一个G-四链体分子形成，可以实现信号的累积与Gap-LCR产物的扩增量成正相关。然而若复性时，探针（ProbeL,ProbeL*）和探针（Probe R,Probe R*）分别与正常DNAT-1双链中的一条链杂交，由于探针与正常DNA不能完全互补配对，在延伸及连接缺口处存在碱基的错配，导致延伸和连接反应均不能正常进行，因而不能得到大量的扩增产物，向体系中加入阻断序列Anti-G和一定浓度的NaCl，使探针中的DNAzyme序列能够形成双链结构，以便Lambda外切酶能够很好地降解体系中的磷酸化的探针，体系中的DNAzyme被完全消化，加入外切酶III、hemin、ABTS、H₂O₂亦不会出现检测信号，从而可以区别突变DNA与正常DNA。

(1)A组（A1-A4）寡核苷酸探针检测镰刀形贫血基因DNAT-1。

寡核苷酸探针A1：5’-ACCATG GTG CAC CTGACT CCT GTG-3’

寡核苷酸探针A2：5’-phosphate-AGG AGT CAG GTG CAC CAT GGT-3’

寡核苷酸探针A3:5’-GGC AGT AAC GGC AGA CTT CTC CA-3’

寡核苷酸探针A4：5’-phosphate-AG AAG TCT GCC GTT ACT GCCAAA GGG TAGGGC GGG TTG GGAA-3’

正常DNA T-1：5’-CAG GGC AGT AAC GGC AGA CTT CTC CTC AGG AGT CAG GTG CAC CAT GGT GTC-3’

突变DNA T-1:5’-CAG GGC AGT AAC GGC AGA CTT CTC CAC AGG AGT CAG GTG CAC CAT GGT GTC-3’

(2)反应体系及Gap-LCR条件

超纯水将体系补足到50μL。

LCR条件是：95℃预热3min；95℃变性30s，65℃复性、延伸及连接4min，28个循环。

1个阴性对照为：含正常DNA T-1 10³-10⁸copies.

（3）检测方法

向25μL Gap-LCR产物中加100mM NaCl和1.2μM的Anti-G，94℃加热1min，冷却到室温放5min，然后加入1μL（10units）Lambda外切酶，于37℃孵育3小时，然后80℃加热15min使Lambda外切酶失活，然后加入0.5μL（100units）外切酶III，于37℃孵育40min，接着70℃加热10min使外切酶III失活。然后向该体系中依次加入(NH₄)₂SO₄(90mM),Hemin(0.2μM),Tyramine·HCl(1.6μM),and H₂O₂(1.2mM)，然后于30℃在多功能读数仪中监测荧光信号，大约每隔5min检测一个数据，共10个数据即可达到基本稳定。监测时的激发波长320nm，吸收波长是410nm。

（4）检测结果

如附图2所示，mutDNA T-1浓度为10⁸copies时，用多功能读数仪在320nm的激发波长和410nm的吸收波长下检测到的荧光信号为对照（加wtDNA T-1）的5倍以上；突变DNA T-1浓度在10³-10⁸copies范围内时，荧光信号随突变DNA T-1的浓度呈线性变化。

实施例2、用B组（B1-B4）寡核苷酸探针检测初生儿耳聋基因中的突变位点235delC。

初生儿耳聋基因中的突变位点235delC的检测结果参见图3。B组（B1-B4）寡核苷酸探针设计来检测初生儿耳聋基因中的突变位点235delC，其中寡核苷酸探针B4的3’端标记了一种能与卟啉铁等结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme序列，用于信号的检测；5’端的序列为能与待检测目标基因突变位点附近的序列形成互补的序列，用于Gap-LCR扩增。

将B组寡核苷酸探针（B1-B4）加入Gap-LCR体系后，变性条件下，待测DNA T-1的双链以及探针1的双链结构都打开；在复性的条件下，探针（A1、A3）和探针（A2、A4）分别与DNAT-1双链中的一条链杂交；在KlenTaq DNA聚合酶的作用下，将探针连接处的缺口碱基进行填补；然后在连接酶的作用下，将探针连起来，从而得到大量的待检测的目标基因，并且在扩增的目标基因中含有DNAzyme序列。得到扩增产物后，向体系中加入阻断序列Anti-G和一定浓度的NaCl，使探针中的DNAzyme序列能够被阻断，以便Lambda外切酶能够很好地降解剩余的磷酸化的探针，有利于降低对照反应的信号，增加灵敏度。此外利用外切酶III可以降解双链DNA中3端为平末端或者凹陷末端的DNA序列，从而可以将连接产物中的DNAzyme序列释放出来能形成G-四链体，加入hemin，具有过氧化物酶活性，能催化H202将ABTS氧化成绿色自由基。从理论上说，每扩增一条DNA链，就有一个G-四链体分子形成，可以实现信号的累积与Gap-LCR产物的量成正相关。

(1)B组（B1-B4）寡核苷酸探针检测镰刀形贫血基因的部分序列DNA T-2。

寡核苷酸探针B1：5’-CCA TCT CCC ACA TCC GGC TAT GGGCCT-3’

寡核苷酸探针B2：5’-phosphate-C AGC TGA TCT TCG TGT CCA C-3’

寡核苷酸探针B3:5’-GTG GAC ACG AAG ATC AGC TGC AGG C-3’

寡核苷酸探针B4：5’-phosphate-AT AGC CGG ATG TGG GAG ATG G AAA GGG TAGGGC GGG TTG GGAA-3’

镰刀形贫血基因的部分序列正常DNA T-T：

5’-aagaacgtgtgctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggc[c]cctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtg-3’

镰刀形贫血基因的部分序列突变DNAT-M:

5’-aagaacgtgtgctacgatcactacttccccatctcccacatccggctatgggcctgcagctgatcttcgtgtccacgccagcgctcctagtggccatgcacgtg-3’

(2)反应体系及Gap-LCR条件

超纯水将体系补足到50μL。

LCR条件是：95℃预热3min；95℃变性30s，58℃复性及连接4min，42个循环。

1个阴性对照为：含正常DNAT-T（10⁵copies）的体系.

（3）检测方法

将LCR产物加100mM NaCl,0.6μM Anti-G，94℃加热1min，冷却到室温放5min，然后加入1μL Lambda外切酶，于37℃孵育3小时，然后80℃加热15min使Lambda外切酶失活，然后加入0.5μL外切酶III，于37℃孵育40min，接着70℃加热10min使外切酶III失活。然后向该体系中依次加入(NH₄)₂SO₄(90mM),Hemin(0.2μM),Tyramine·HCl(1.6μM),and H₂O₂(1.2mM)，然后于30℃在多功能读数仪中监测荧光信号，大约每隔5min检测一个数据，共10个数据即可达到基本稳定。监测时的激发波长320nm，吸收波长是410nm。

（4）检测结果

如附图3所示，突变DNA T-2的浓度均为10⁵copies时，用多功能读数仪在320nm的激发波长和410nm的吸收波长下检测到的荧光信号为对照（加正常DNAT-2）的5倍以上。

Claims (7)

1.一种检测单核苷酸多态性的方法，其特征是：在连接酶链式反应Ligase Chain Reaction或者缺口-连接酶链式反应Gap-LCR体系中加入两组探针，其中一个5端磷酸化探针的3端用DNAzyme标记，在进行目标核酸的链式连接酶扩增反应过程中，依次在DNA聚合酶和DNA连接酶的作用下将DNAzyme引入到扩增产物中，LCR扩增以后，向扩增的产物中引入能与DNAzyme的序列部分互补的阻断序列Anti-G，同时加入终浓度为100mM的NaCl以促进Anti-G和DNAzyme更好的形成双链结构，然后利用Lambda外切酶选择性切割双链DNA中的5端磷酸化的DNA探针，而对连接产物不起作用，此时体系中主要存在着没有磷酸化的探针和连接产物，接着利用外切酶III降解双链DNA的3端为平末端或者凹陷末端的序列，从DNA链的3’端释放单磷酸核苷酸，产生单链DNA片段，将连接产物中的DNAzyme标记释放，通过检测LCR消化产物中释放出的DNAzyme标记物来进行单核苷酸多态性的定性或定量分析；寡核苷酸探针中一般含有一段15个碱基以上的序列能与目标核酸序列互补，阻断序列Anti-G与DNAzyme序列大约有12个碱基的序列完全互补配对，使DNAzyme序列处于封闭状态，以保证Lambda外切酶能够彻底消化LCR扩增反应以后体系中剩余的含DNAzyme序列的磷酸化探针，从而降低检测背景。

2.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述寡核苷酸探针中的DNAzyme标记是一种能够产生信号的、具有过氧化物酶催化功能的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述核酸聚合酶是一种不具有5’-3’和3’-5’外切酶活性的耐热性核酸聚合酶。

4.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述核酸连接酶是一种具有耐热性的核酸连接酶。

5.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述的Lambda外切酶是一种5’-3’外切脱氧核糖核酸酶，能选择性切割双链DNA中的5端磷酸化的DNA序列，对单链DNA和未磷酸化DNA的活性较低、对含有切口的DNA无活性、对缺口的DNA活性有限。

6.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述的外切酶III是一种具有3’-5’的脱氧核糖核酸酶活性的外切酶，降解双链DNA的平末端，5’突出末端或切口，从DNA链的3’端释放5’单磷酸核苷酸，产生单链DNA片段；该酶对具有至少有4个碱基且末端不是C残基的3’突出末端的DNA、单链DNA、硫代磷酸酯连接的核苷酸无活性。

7.根据权利要求1所述的单核苷酸多态性的检测方法，其特征是：所述寡核苷酸探针一般有20个核苷酸与目标核酸序列互补配对，DNAzyme序列不包含在此片段中。

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