JPH05502788A

JPH05502788A - 特定部位の突然変異誘発を誘導するための方法

Info

Publication number: JPH05502788A
Application number: JP2514208A
Authority: JP
Inventors: スリレティ，スティーブ　エヌ．; シェン，シー―シャン; レベル，スザンヌ
Original assignee: カナダ国
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-26
Publication date: 1993-05-20
Also published as: EP0497798A1; ATE125297T1; US5071743A; CA2071892A1; EP0497798B1; DE69021073D1; WO1991006643A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、線状化された二本鎖ＤＮＡのために十分な長さの相補的鎖合成を指図することかできる閉環性オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖ＤＮＡに対して直接的に特定部位の突然変異誘発を誘導するための方法に関する。

発明の背景その広い用途のために、オリゴヌクレオチド指図の特定部位突然変異誘発は、近代の分子生物学研究の基本的な手段を具体化する。コード又は非コードＤＮＡ中への挿入、欠失及び置換の導入のためへのその利用性は、ＤＮＡ５ＲＮＡ及びタンパク質のレベルで構造−機能関係の分析を包含する広範囲の種類の研究の実施を可能にする。酵素触媒の分野において、特定部位突然変異誘発によるアミノ酸置換に由来する構造的及び機械的情報は、生化学及び生物物理研究から得られる多くの知識に有意に追加し続ける。

φＸ１７ａＤＮＡ内に表現型的に選択できる特定部位突然変異誘発を誘発するために合成オリゴヌクレオチドの使用を示す初期報告に従って、特定部位突然変異誘発のため一般的な方法が示された。約１０年前でのこれらの進歩以来、所望する特定部位突然変異誘発を誘導するために必要な時間及び努力を減じるように企画された多くの異なったアプローチか説明されて来た。一般的に、これらの方法は２種のカテゴリーに分かれる二親の形の大きなバックグラウンドに対する変異分子の同定のために必要な労力のかかる特別なハイブリダイゼーション操作を排除するように企画された方法及び−重鎖ＤＮＡ鋳型の生成のために特異化されたベクター中への標的ＤＮＡのクローニングのための必要条件の回避に向けられる方法。

一般的な適用性及び高い効能を維持し、そしていづれか存在するプラスミド上での特定部位突然変異誘発の直接的な実施を可能にするアプローチが所望される。

発明の要約本発明は、閉環するオリゴヌクレオチドを用いて、−末鎖の線状ＤＮＡ鋳型に前もって切断され、そして変性されている二本鎖ＤＮＡに対して直接的に特定部位突然変異誘発を誘導するための新規アプローチを提供する。

この方法は、初めに、−末鎖の線状ＤＮＡ鋳型に変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることを含んで成る。その閉環性オリゴヌクレオチドは、線状ＤＮＡ鋳型の十分な長さの相補的鎖の合成及び環状化を指図するために前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端の少なくとも１つの端に相補的なそのヌクレオチド配列の少なくとも一部を育することによって特徴づけられる。

ハイブリダイゼーションか完結した後すぐに、変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドか、線状ＤＮＡ鋳型に相補的なり　Ｎ　Ａ　鎖中に及び結局、共有的に閉環されたＤＮＡ環中に、ポリマラーゼ及びリガーゼ酵素の作用にハイブリダイズされた線状ＤＮＡ鋳型を付与することによって導入され、ヘテロ二重鎖の二本鎖ＤＮＡ分子が生成される。

最後に、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの合成された相補的鎖の選択的複製か行なわれる追加の段階を含んで成る。適切な選択システムとしてＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のｄｕｔ−ｕｎｇ−株における標的ＤＮＡ配列の増殖を通して得られるウラシル置換されたＤＮＡ鋳型を使用することか好ましい。

場合によっては、本発明の方法は、それ自体、二本鎖ＤＮＡか線状一本ＭＤＮＡ鋳型に切断され、そして変性される初期段階を含んで成る。

好ましくは、上記で言及される閉環性オリゴヌクレオチドは、その両自由端にアニールするために線状ＤＮＡ鋳型の個々の自由端に相補的なそのヌクレオチド配列の少なくとも２種の異なった部分を存し、それによってＤＮＡ鋳型の環状化を引き起こすであろう。他方、その閉環性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型の３ ′末端にのみ相補的な配列を有することかできる。

本発明の方法は、原核性又は真核性独立プラスミド又はレプリコンに対する遺伝的に変性された相補的鎖か必要とされる他のタイプの研究に拡張され得る。

また、−重鎖の線状ＤＮＡ鋳型に前もって切断され、そして変性されている二本鎖ＤＮＡの特定部位突然変異誘発を誘導するためのキットも、本発明の範囲内にある。その鋳型は、鋳型に相補的なりＮＡ＠中に導入される変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。そのキットは、−重鎖の線状ＤＮＡ鋳型の自由端の少なくとも１つの端に相補的なそれらのヌクレオチド配列の少なくとも一部を存する１又は複数の閉環性オリゴヌクレオチド、及び相補的ＤＮＡ鎖の選択的複製のための手段を含んで成る。好ましくは、上記に言及されるようなＥ、コリのｄｕｔ−ｕｎｇ−株か選択手段として使用されるであろう。本発明のキットはまた、適切な対照ＤＮＡ及び場合によっては、適切な試薬及び緩衝液も含むことかできる。

最後に、本発明は、−重鎖の線状ＤＮＡ鋳型の自由端にアニールする閉環性オリゴヌクレオチドに関し、それによって、−重鎖の線状ＤＮＡ鋳型の環化が得られ、その閉環性オリゴヌクレオチドは、長さ１０〜５０個のヌクレオチドを有し、そして線状ＤＮＡ鋳型の自由端に少なくとも相補的なヌクレオチド配列を有することによって特徴づけられる。

好ましくは、閉環性オリゴヌクレオチドは、次のもの：（へａｔエエｌ　５’ＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧ（：ＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣ。

嶋ｆ１エエＩｌ　５’ＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣ７（へｓｅ工）　５’ＣＴＴＣＣＣＧＧＣ八八ＣＡＡＴＴ八八ＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧ。

（Ｈａｔ工）　５′丁ＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧｊ（Ｎｄｅ工１　５’ＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣ（、ＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡ。

（Ｐｓｔエン　５′八へＣＡＣＧＡ丁ＧＣＣＴＧＣＡＧＣ八八ＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧ　ｇ（ＳｓｐＨ５’八Ａ−ＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡ八八ＡＡＧＧＡＡＧＡ。

（Ｘｍｎ工）へへ　５’ＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧｉ５　’ＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴ。

及びそれらの相補的配列から成る群から選択される。

本発明は、次の記載により一層容易に示されるであろう。

ｍ≦１且ニー第１図は、本発明の特定部位突然変異誘発反応を行なう場合に得られる段階の順序及び予定される構造の好ましし１態様を示す。

第２図は、本発明の標準の相補的鎖合成／特定部位突然変異誘発反応の効率に対する上昇するオリゴヌクレオチド濃度の効果を示す。

主玉虫止祉呈Ｒ監本発明は、二本鎖ＤＮＡの特定部位突然変異誘発への新規アプローチに関する。

このアプローチは、ＤＮ’Ａの十分な長さの相補的鎖合成を指図することができる構造体の生成を包含する。その構造体は、“°閉鎖性”オリゴヌクレオチドとして本開示に言及されるであろうものの存在下で、線状ＤＮＡ鋳型の熱変性及び冷却に従って形成される。この閉環性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型の自由端の少なくとも１つの端に相補的なその配列の少なくとも一部を有するヌクレオチド配列である。閉環性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖の環状化及びポリマラーゼ依存性の十分な長さの相補的鎖合成及び共有的に閉環されたヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子中への連結のために適切なプライマー−環状鋳型構造体の生成のための物質として機能する。

この新規方法を開発するためには、線状二本鎖分子の均質集団の変性に続いて利用できる一本ｍＤＮＡの時間依存性濃度は、ポリマラーゼ依存性ＤＮＡ合成反応において鋳型として使用するために十分であることが仮定された。さらに、ＤＮＡ合成の間、ポリマラーゼ（Ｅ、コリのポリマラーゼＩ）のヘリカーゼ活性は、部分的に再アニールされた分子に鎖置換をもたらすことによって相補的鎖合成のレベルを増強する実際の特定部位突然変異誘発実験への前記条件の適用は、２種の追加の要素を必要とする：　（ｉ）線状ＤＮＡ鋳型の十分な長さの相補的鎖合成及び環化を指図するための、突然変異誘発性オリゴヌクレオチド以外の閉環性オリゴヌクレオチド、及び（ｉｉ）高い効率の突然変異誘発を得るために新規に合成された鎖の選択的複製のための機構。

閉環性オリゴヌクレオチド “閉環性”オリゴヌクレオチドとして言及されて来たちのの使用は、線状ＤＮＡ鋳型の十分な長さのコピーの製造の問題及びＤＮＡリガーゼの作用により、共有的に閉環された環状物に転換されるべきその得られる二本鎖分子を供給する問題を取り扱うために常に必要なプライマーのための必要条件を満たす。

概念的に、２種の形の閉環性オリゴヌクレオチドか可能である：鋳型鎖の自由端にアニールすることによって線状化の部位を補足する“オーバーラッピング形（それによってＤＮＡ鎖の環化を引き起こす）：又は他方、標的の鋳型鎖の３′末端に直接的にハイブリッドすることによって、プラント末端化された分子を生成する“フラッシュ”形。両者の場合、閉環性オリゴヌクレオチドは１０〜５０個のヌクレオチドを含むことができる。

閉環性オリゴヌクレオチドの使用及びユニークな制限酵素部位の利用性に対するこの新規アプローチの依存性は、はとんどのＤＮＡ配列に共通する配列、たとえばプラスミドｐＢＲ３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子及びＣｏ１Ｅ１複製起点複製−づれかの制限酵素部位でハイブリダイズするように閉環性オリゴヌクレオチドを企画することによって、一般的にある程度、満たされ得る。たとえば閉環性オリゴヌクレオチドは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるＰｓｔｌ、ＰｖｕＩ又は５ｃａＩ部位又は複製の起点近くでのＡｆ　ＩＩＩＩ又はＮｄｅＩ部位を補足するために構成され得る。結局、これらの部位のいづれかか、対象の特定のＤＮＡ配列において１回以上発生し、すなわち切断されていない、間違って切断された及び広範に切断された分子は本発明の条件下で形質転換能力をほとんど又はまったく有さないので、線状化は、反応に悪影響を及ぼす危険性を伴わないで部分的消化により実施され得る。

従って、上記に言及されるオリゴヌクレオチド企画のタイプは、多くの種類の突然変異誘発実験のだめの通常の試薬としての単一の閉環性オリゴヌクレオチドの調製物の使用を再選択システムに関しては、ウラシル置換された親ＤＮＡの使用は、新しく合成された相補的ＤＮＡ鎖の選択的な生存のための単純且つ便利な生物学的アプローチ及び従って高い効率の突然変異誘発を提供する。

ウラシル置換されたＤＮＡは、Ｅ、コリｄｕｔ−ｕｎｇ−株中で所望するＤＮＡ鋳型を増殖することによって調製される。ｄａｔ’−ｕｎｇ株は、ｄＵＴＰアーゼ、すなわちＤＮＡ中への導入のためにＴＴＰと競争するｄＵＴＰの高められた細胞内プールをもたらすｄａｔ遺伝子の生成物に不足している。また、ＤＮＡ鎖中に導入されるウラシルは、ウラシルグリコシラーゼ、すなわちウランルヌクレオチドの切断を担当し、そしてｕｎｇ遺伝子によりコードされる酵素の産生におけるｄａｔ”　ｕｎｇ−株の欠乏のために除去されない。

従って、ウラシル置換されたＤＮＡは、ウラシルを除去することかできないｕｎｇ−株において生物学的に活性である。

しかしながら、ウラシル置換されたＤＮＡ鋳型の生物学的活性は、ウラシルグリコシラーゼの作用を通して鋳型を不活性化するであろうこのＤＮＡがｕｎｇ＋宿主に導入される場合、実質的に減じられる。

Ｋｕｎｋｅ　ｌによりＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．４８８〜４９２（１９８５）にこれまで示されたように、Ｅ、コリのｄａｔ”’ｕｎｇ−株における一本鎖標的ＤＮＡの増殖は、ウラシル含有鋳型を生成し、ｄａｔ”　ｕｎｇ“株を形質転換することにおけるその効率は、通常のＤＮＡの効率よりも３〜４倍低い。しかしながら、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを通してのウラシル置換された鋳型に相補的な突然変異誘発実験のインビトロ合成は、ウラシルを含まない相補的鎖を導ひくであろう。このウラシルを含まない相補的鎖は、トランスフェクションの前、ウラシルグリコシラーゼにより処理された後でさえ、Ｅ。

コリのｄｕｔ”　ｕｎｇ＋株においてまだ生物学的に活性であり、そしてウラシル含有鋳型は、そのような処理により不活性化されるであろう。本発明にこの方法を使用すれば、形質転換効率の有意なレベルが得られ、そして４０〜６０％の形質転換体が変異表現型を有する。

実際、線状化され、そして変性されたＤＮＡから生成された一本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズする。閉環性オリゴヌクレオチド及びＥ、コリのｄｕｔ−ｕｎｇ −株の組合された使用は、約５０％、すなわちＤＮＡ配列決定による急速なスクリーニングを受けるレベルの変異形成効率で、二本ｌＤＮＡに対する特定部位突然変異誘発の直接的な実施を可能にする方法を提供する。

しかしながら、当業者は、他の選択システム、たとえばＴａｙｌｏｒなど、、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．８７４９〜８７８５（１９８５）により記載されるチオヌクレオチドの導入又は示差メチル化が、本発明に実質的に使用され得ることを容易に認めるであろう。

選択システムとしてＥ、コリのｄｕｔ−ｕｎｇ−株による、本発明の方法を用いての特定部位突然変異誘発標的ＤＮＡ鎖に対して所望する突然変異反応を行なうために、問題の鎖をまず、Ｅ、コリのａｕｔ−ｕｎｇ−株中で増殖し、そして当業者に知られているいづれかの適切な技法を用いて単離する。所望するＤＮＡ配列が単離され、そして精製された後すぐに、それを、それが環状形で存在する場合、適切な制限酵素との反応により線状化し、そして続いて、熱変性により一本鎖形にする。

このようにして得られた鋳型ＤＮＡを、所望する閉環性及び突然変異誘発性オリゴヌクレオチドと共に混合する。適切なアニーリング緩衝液を添加し、そして反応混合物を７０〜１００°Ｃの範囲の温度で０．５〜５分間インキュベートし、次に場合によっては、０〜４２°Ｃの範囲の温度で１〜１５分間冷却する。

冷却後、適切なりＮＡ合成緩衝液、ＤＮＡリガーゼ及びポリマラーゼを添加し、そしてその混合物を０〜４２°Ｃの温度で１〜５時間インキュベートする。

次にそれらの相補的ウラシル置換のＤＮＡ鋳型にハイブリダイズされる完全な突然変異誘発性ＤＮＡ鎖を含む混合物を、細胞を形質転換するために直接使用する。コンピテント細胞の調製及び形質転換反応を、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１６６、５５７〜５８０（１９８３）に記載されるＨａｎａｈａｍの方法か好ましいが、当業者に良く知られている方法に従って行なう。形質転換の後、突然変異誘発性ＤＮＡ鎖を有する細胞を選択する。

本発明は、次の例により一層容易に例示されるであろう。

例１ β−ガラクトシダーゼのα−相補的に基づく色指示薬システムに対する突然変異誘発。

本発明のアプローチを試験し、そして相補的鎖合成及び付随する特定部位突然変異誘発のためのその可能性を定量評価するために、β−ガラクトシダーゼ（１ａｃＺａ）のα−相補活性に基づく２種の色指示薬システムを開発した。

Ｂ２Ｗ（青〜白）として言及されるシステムは、１　ａｃＺα翻訳の開始から下流のＴＡＡ停止コドンの２ａ個のアミノ酸を生成するために２個の塩基を変えることによって、Ｇｅｎｅ３３．１０３〜１１９（１９８５）　ｉ：記載される青色原体プラスミドｐＵＣ１９を無色のプラスミドに転換するために突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いる。同時に、Ｄｒａ１部位を、意図された変化の存在の確証のために創造する。

Ｗ２Ｂ（白〜青）として言及される第２システムにおいては、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドか、プラスミドｐｓＮ３２８２、すなわちプラスミドｐＵｃ１９の無色の誘導体中に２個の塩基を挿入する。プラスミドｐＳＮＳ２８２を、ＨｉｎｄＩＩＩによるｐＵｃｌ、９ＤＮＡの切断、続く、付着端をフィルインするためにクレノウボリマラーゼによる及び分子を再環化するためにＴ４ＤＮＡリガーゼによる処理により構成した。Ｇｅｎｅ３３．１０３〜１１９（１９８５）に記載されるようなＪＭ１１０中への形質転換の後、３０μＭのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び３０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａ１）を含むプレート上での無色のコロニーを、新しく創造されたＮｈｅｌ認識配列（そのサブセットは、整合するアンバートリプレット（・・・Ａ　ＡＧＣＴＡＧ　ＣＴＴ・・・）である）の存在について分析した。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドにより創造されるｐＳＮ３２８２中への２個の塩基の挿入は、アンバーコドンを排除し、そして青色のコロニーの生成をもたらす読み取り枠に導びく。制限酵素部位、Ｘｈｏｌの同時生成はまた、このシステム企画に包含された。

線状ＤＮＡ鋳型の生成両プラスミドをまず、Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ　８２゜４８８〜４９２（１９８５）に記載されるｄｕ　ｔ−ｕｎｇ−ＲＺｌ　０３２株（ＡＴＣＣ＃３９７３７）中で増殖し、ウラシル置換されたプラスミドＤＮＡを生成した。ｐＵｃｌ９又は１）　５ＮＳ２８２のいづれかを含む培養物を、１．６％のバクトドリブトン、１％酵母抽出物、０．５％のＮａＣ１及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む培地中で一晩増殖せしめた。次に、得られるウラシル置換のプラスミドを、Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１１７．８３５〜８４２（１９８３）に記載されるようにしてＣｓＣ，１−臭化エチジウム段階−グラジェントにおける平衡遠心分離により精製した。線状化されたウラシル置換の鋳型を、Ｓｃａ　ｌによるＤＮＡの切断、続くフェノールによる抽出、エタノールによる沈殿及びＩｍＭのトリス−ＨＣｌ、吐８．０、及び０．１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ中への５０ｎｇ／ｍｌでの再懸濁により調製した。

閉環性及び突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの調製２種の閉環性オリゴヌクレオチド、５’　−ＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴ−ＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴ　（オーバラップする）及び５’　ＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴ− ＣＴＧＡＧ、（フラッシュ）；及び２種の突然変異誘発性オリゴヌクレオチド、５’　−ＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＡＡ　Ａ、　ＡΔＡΔＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ　（Ｂ２Ｗ、下線部はミスマツチされた塩基、太い文字はＤｒａ１部位）及び５′−ＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＣＧＡＧ−ＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡ　（Ｗ２Ｂ、下線部は挿入塩基、太い文字はＸｈｏ１部位）を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０Ｂ　ＤＮＡ合成機を用いて、ホスホラミジット方法により合成した。オリゴヌクレオチドの精製を、２．５Ｍの酢酸アンモニウム−８３％のエタノールからの沈殿、続く室温で９５％エタノールによる洗浄により行なった。精製されたオリゴヌクレオチドを、Ｍａｎｉａｌｉｓなど、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｔ＋ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｆｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋに記載されるようにしてリン酸化した。Ｂ２Ｗ及びＷ２Ｂの両システムは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるユニークＳｅａ　１部位での相互作用のために企画された同じ閉環性オリゴヌクレオチドを用いる。

上記閉環性及び突然変異誘発性オリゴヌクレオチドはこの例において使用される態様を示すが、当業者は、本発明がそれらのオリゴヌクレオチド配列及びその相補的配列の使用に限定されないことを容易に理解するであろう。次の閉環性オリゴヌクレオチド及びその相補的配列はまた、本発明の範囲内に存在する：（ＡａｔｌＩｌ　５’ＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＨ（Ａｆｌｒｒ工１　５’ＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣ。

（へｓｅ工ｌ　５’ＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣ八八ＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧｉ（Ｈｓｔ工１　５’ＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧ＋１Ｎｄｅ工）　５’ＧＴＡＴＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＡＴにＧＴＣＣＡＣＴＣＴＣＡＢ（Ｐｓｔｌｌ　５’ＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡ（ｊＪＩＰｖｕ工）　５’ＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧ八八ＧＧＡ。

（ＳｃａＩｌ　５’八ＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴ八ＣＴ’ＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧｉ（Ｓｓｐ工１　５’ＡＡＡＴＧＣττＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＴしかしながら、閉環性オリゴヌクレオチドのこれらの典型的な例は、本発明の範囲を制限するよりもむしろ例示するために導入されることが理解されるべきである。実際に、通常の制限部位で前もって消化された線状ＤＮＡ鎖又は環状ＤＮＡ鎖のいづれかの自由端の少なくとも１つにハイブリダイズする能力を有するいづれかのオリゴヌクレオチドが、本発明に使用され得る。

、ｔの　、・・人　。亡六然、悸特にことわらない限り、反応は次の通りにして行なった。

鋳型ＤＮＡ０．１．ｐモルを、閉環性オリゴヌクレオチド２ｐモル及び突然変異誘発性オリゴヌクレオチド１０ｐモルと共に混合し、そして最終体積を水により２２ｍ１に調節した。この混合物に、アニーリング緩衝液（２００［［ＩＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，２０ｍＭのμｇＣＩ□、及び５００ｍＭのＮａＣ１）３μＩを添加し、そしてその混合物を煮沸水槽中て３分間インキュベートし、次に氷に移した。氷上で２〜８分間のインキュベーションの後、ＤＮＡ合成緩衝液（３００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，８，８０ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２，１００＋ｎＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ、５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、及び５００８μｌｍｌのＢＳＡ）３μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１μ／ｕ）１μｍ及びフレノウポリマラーゼ（７μｌμｍ）１μｍを添加し、そして氷上でのインキュベーションをさらに３０分間、続けた。次に、反応混合物を、室温に３０分間及び３７°Ｃで６０分間、連続して移した。この点で、反応混合物を、４°Ｃで貯蔵するか又はそれらの最終体積の半分を、コンビラントＨ３２１５１Ｅ、コリ細胞２００μＩを形質転換するために直接使用した。コンピテント細胞の調製及び形質転換反応を、上記に言及されるＨａｎａｈａｍの方法に従って行なった。種々のコンピテント細胞バッチの密度を、２００μｍのコンピテント細胞がｐＵＣ１９ＤＮＡ１μｇ当たり約ｌＸｌ０”個の形質転換体の効率を付与するように予備調整した。最終形質転換体積（１００μｍ）のｌ／１０を、１００　ｕ　ｇ／ｍｌのアンピシリン、３０ｐＭの±ＰＴＧ及び３０ｐｇ／ｍｌのＸ−Ｇａ１を含む富化プレート上に広げた。青色及び白色のコロニーの数を計数し、そして変異体の相対的割合を合計の％として表わした。

標準の特定部位突然変異誘発反応のための段階の順序及び予測される構造体の表示が第１図に示され、ここで突然変異誘発のための標的遺伝子は、濃い線により示される。ウラシル置換のＤＮＡ鎖を、時折り“Ｕ”を含む線により示す。オリゴヌクレオチドはまた、３′末端での矢印を含む濃い線としても示される。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドは、ミスマツチを示す屈曲を含む。括弧においては、“フラッシュ”閉環性オリゴヌクレオチドのための予測される構造体が示され：より効果的な“オーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチドは、図の主要部分に示される（構造体ＩＶ）。

本発明の方法の特徴化をまず、種々の相補的鎖合成成分による処理を伴って又は伴わないで、標準のウラシル置換された線状鋳型（第１図、構造体■）の形質転換効率を評価することによって行なった。

すべての緩衝液及び操作を包含するが、しかし示されたＤＮＡ合成成分のみを含む反応を、上記のようにして行なった。

反応当たりの濃度は、必要により、０．１ｐモルの標準鋳型（線状化されたウラシル置換のｐＵＣｌ　９又はｐＳＮＳ２８２ＤＮＡ）、２ｐモルのオリゴヌクレオチド及び７単位のフレノウ酵素及び１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼであった。

結果は下記第１表に要約され、ここで与えられる値は、７回の実験の平均である。

第　１　表線状化されたウラシル置換ＤＮＡの形質転換効率におけるＤＮＡ合成依存性の上昇により示されるような相補的鎖形成鋳　型　３鋳型十オーバーラツピング閉環性オリゴ　５鋳型＋フラツシユ閉環性オリゴ　０鋳型＋ポリマラーゼ及びリガーゼ　４鋳型十オーバーラツピング閉環性オリゴ＋ポリマラーゼ及びリガーゼ　８８率をもたらすことが前記表から見出され得る。ＤＮＡ合成の不在下で、観察される形質転換体の数はゼロに近づき、これは、反応の他の成分と組合してさえ、鋳型自体は、バックグラウンドに最少に寄与することを示す。

第１表はまた、オーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチドが形質転換コンピテント分子の生成においてフラッシュ閉環性オリゴヌクレオチド（第１図、構造体ＩＶ）よりも４倍近くより効果的であることを示す。この理由は、高められた連結効率及びオーバーラッピング構造による鋳型績の自由端の良好な保護に関係される。その高い効率のために、オーバーラッピングが閉環性オリゴヌクレオチドを、すべての続く実験に使用するために選択した。

十分な長さの相補的鎖合成の出来事及び特定部位突然変異誘発への適用のための本発明の手段の評価を、Ｂ２Ｗ及びＷ２Ｂ試験システムを用いて完全な反応（第１図）を行なうことによって得た。それらの実験を、０．１ｐモルの鋳型、２ｐモルのオーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチド及び１０９モルの突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いて上記のようにして行なった。その結果は第２表に示され、ここで与えられる値は、それぞれＢ２Ｗ及びＷ２Ｂシステムについて１６及び６回の独立した実験の平均である。

第２表システム　コロニー／プレート　％変異体Ｂ２Ｗ　６２　４９Ｗ２Ｂ　５７　３１第２表におけるデータは、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの包含が高い頻度で新しく合成された鎖の表現型を適切に変えることを示す。Ｗ２Ｂシステムにおける２個の塩基挿入突然変異誘発について観察される低い変異体形成効率はたぶん、弱い突然変異誘発性オリゴヌクレオチド−鋳型複合体の結果である。なぜならば、そのような低い効率は、第２図に示されるようにオリゴヌクレオチド濃度の上昇により改良されるからであり、ここでパネルＡは、オーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチドの上昇する濃度の関数として得られるコロニーの数を示す。標準反応を、０．１ｐモルの線状化されたｐＵｃ１９又はｐＳＮＳ２８２ウラシル置換された鋳型（但し、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを含まない）を用いて上記のようにして行なった。パネルＢは、特定部位突然変異誘発の効率に対するＢ２Ｗ（三角）又はＷ２Ｂ（円）突然変異誘発性オリゴヌクレオチドの上昇する濃度の効果を示す。Ｂ２Ｗ又はＷ２Ｂシステムの成分を用いての反応を、０．１ｐモルの鋳型ＤＮＡ及び２ｐモルのオーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチドを用いて上記のようにして行なった。

指図された変更の存在を確証するために、ランダムに選択された変異体コロニー及びＢ２Ｗ及びＷ２Ｂシステムを用いての種々の特定部位突然変異誘発反応からプラスミドＤＮＡを、それぞれ制限酵素ＤｒａＩ及びＸｈｏＩにより切断した。

試験されたすべての変異体コロニーは、適切な同じに創造された制限酵素部位を含むプラスミドを生成した。さらに、プラスミドの再配置又は制限部位の複数導入か、これらの及び他の制限酵素分析により示されるように行なわれた。

特定部位突然変異誘発反応の特徴化及び必要条件第３表は、個々の成分又は標準の反応手段の処理段階に対する特定部位突然変異誘発の依存性が研究される実験の結果を示す。

反応は、上記のようにして行なった。但し、示される成分又は段階か排除された。与えられる値は、３回の個々の実験の平均である。

第３表特定部位突然変異誘発反応の特徴化及び必要条件鋳型なし　０　−　Ｑ　− 閉環性オリゴなし　５　−　４　− 突然変異誘発性オＩＪコなし　５１　−　４７　−アニーリング緩衝液なし　０ −　０　−変性段階なし　７　−　１　− 氷インキュベーション　段階１　なし　４４　５６　５３　３７ＲＴインキユベーシヨン　段階ゝ　なし　３０　４０　１４　１５ＴＰ、ポリマラーゼ及びリガーゼの添加の後、それはｂ：氷上での３０分間のインキュベーションの最後で、この反応は３７℃に直接移行された。

Ｃ：この反応のためには、３７℃で少なくとも６０分か、室温で６０分間に置換された。

反応成分又は鋳型変性段階のいづれか１つの排除は、変異体形成活性の完全な損失をもたらすことか明らかである。他方、氷上及び／又は３７°Ｃてのインキュベーション段階の排除は、変異体分子の頻度をわずかに改良するように思える。

フレノウ酵素以外のいくつかのＤＮＡポリマラーゼの活性をまた、標準条件下で評価した。形質転換体の数及び得られる変異体コロニーの相対的割合により評価される場合、Ｅ。

コリのポリマラーゼ■は、フレノウフラグメントとほぼ同じように機能するか、但しＴ４及びＴ７ボリマラーゼはほとんど効果的ではなかった。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素及びＴａｑポリマラーゼは、上記の実験条件下でほとんど又はまったく活性を付与しなかった。しかしなから、■又は複数の実験パラメーターの変化は、酵素活性が弱いか又は存在しないこれらの場合において実質的な上昇を導ひくことができることが当業者によって理解されるべきである。

本発明の特定部位突然変異誘発条件下で支持体として使用するための共存的に閉環された環状ＤＮＡの可能性がまた試験された。それを行なうために、ウラシル含有超らせんＤＮＡを、線状鋳型ＤＮＡと置換し、そして標準の反応条件又は熱変性の代わりにアルカリ変性が行なわれる標準条件を用いて、特定部位突然変異誘発（閉環性オリゴヌクレオチドを含まないＢ２Ｗシステム）にゆだねた。いくつかの独立する実験の結果は、たった５〜１０％の形質転換体が変異表現型を有することを示した。突然変異誘発のこの減じられた頻度のための理由は、バックグラウンドのレベルの実質的な上昇及びたぶん不十分な及び／又は不完全な相補的鎖合成による。

ウラシル置換された超らせん鋳型、及びＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８２，４８８〜４９２（１９８５）に示されるようにバックグラウンドを減じるためにウラシルグリコシラーゼ及びアルカリによるヘテロ二重鎖の処理による又は有用な環状鋳型を生成するために、５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．１３９６〜１４００（１９８０）に記載されるようにＤＮＡに一重鎖ニツクを導入することによる相補的鎖合成のための本発明の条件を用いて、突然変異誘発の効率を改良することか可能である。

本発明の方法は、Ｂ２Ｗ及びＷ２Ｂ試験システム以外のプラスミドシステムに都合良く適用され、そして第４表に示されるように一般的な適応性のものであるように思える。

突然変異誘発反応は、オーバーランピング閉環性オリゴヌクレオチドを用いて上記のようにして行なった。

Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒｅ、　Ｊ、　、及びＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　（１９８５）Ｇｅｎｅ３３、１０３〜１１９．　Ｌｉｎ、　Ｌ−Ｌ、　、及びＬｉｔｔｌｅ、　Ｊ、Ｗ、　（１９８８）Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１７０、２１６３〜２１７３及びＭａｃＭａｎｕｓ、　Ｊ、　Ｐ、　、　Ｈｕｔｎｉｋ、　Ｃ，Ｍ、　Ｌ、　、　５ｙｋｅｓ。

Ｂ、　Ｄ、　５ｚａｂｏ、　Ａ、　Ｇ、　、　Ｗｉ　ｌｌｉａｍｓ、　Ｔ、　Ｃ，、及びＢａｎｖｉｌｌｅ、　Ｄ、　（１９８９）Ｊ、　Ｂｉｏ　１．　Ｃｈｅｍ、　２６４．３４７０〜３４７７にそれぞれ記載されるプラスミドｐＵｃ１９．　ｐＪＷＬ１８４及びｐＧＥＮ−ＴＡＣ−ＯＮＯか他の研究において構成され；　ｐＳＮ３２８２か上記のようにして構成された。

ＲＥは、スクリーニングか新しく創造された制限酵素部位を調へることによって行なわれたことを示す。

与えられる値は、変異体の％であり、続いてスクリーンされた合計から得られた変異体の数が括弧に示される。

１　制限酵素により切断することによる線状化１ｄｕｔ′ｕｎｇ°株１７）形’ Ｒ転ｔｅｌ鋳型に対するオリゴヌクレオチドのモル比補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成４年４月２＋日

Claims

【特許請求の範囲】

１．一本鎖の線状ＤＮＡ鋳型に前もって切断され、そして変性された二本鎖ＤＮＡに対して特定部位突然変異誘発を誘導するための方法であって、（ａ）線状の一本鎖のＤＮＡ鋳型に突然変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、ここで前記閉環性オリゴヌクレオチドは、前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端の少なくとも１つに相補的なそのヌクレオチド配列の少なくとも一部を有することによって特徴づけられ、（ｂ）ヘテロ二重鎖の二本鎖ＤＮＡ分子を生成するために、前記ハイブリダイズされた線状ＤＮＡ鋳型をポリマラーゼ及びリガーゼ酵素の作用にゆだねることによって、前記線状ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ鎖中に前記突然変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドを導入し、そして（ｃ）前記ヘテロ二重鎖の二本鎖ＤＮＡの前記棺桶的ＤＮＡ鎖を選択的に複製することを含んで成る方法。
２．前記二本領ＤＮＡが、一本鎖の線状ＤＮＡ鋳型を生成するために切断され、そして変性される初期段階をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記二本鎖ＤＮＡがプラスミド又はいづれかの自立レプリコンである請求の範囲第１項記載の方法。
４．前記閉環性オリゴヌクレオチドが、前記線状ＤＮＡ鋳型の環化を引き起こすハイブリダイゼーションに基づいて前記線状ＤＮＡ鋳型の両自由端にアニールする前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端に少なくとも相補的なヌクレオ配列を有する請求の範囲第１項記載の方法。
５．前記閉環性オリゴヌクレオチドが、前記線状ＤＮＡ鋳型の３′末端に相補的な配列を有し、それによって、前記線状ＤＮＡ鋳型へのハイブリダイゼーションに基づいてプラント末端化された分子を創造する請求の範囲第１項記載の方法。
６．前記相補的ＤＮＡ鎖が、ウラシル置換されたＤＮＡ鋳型を得るために、まずｄｕｔ−ｕｎｇ−細菌株中において前記二本鎖ＤＮＡを増殖し、そして次に、所望する変異分子を得るために、ｄｕｔ＋ｕｎｇ＋細菌株中に前記ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子を形質転換することによって選択的に複製される請求の範囲第１項記載の方法。
７．前記閉環性オリゴヌクレオチドが、次のもの：【配列があります】及びそれらの相補的配列から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。
８．一本鎖の線状ＤＮＡ鋳型に前もって切断され、そして変性された二本鎖ＤＮＡに対して特定部位突然変異誘発を誘導するためのキットであって、前記鋳型が、前記鋳型に相補的なＤＮＡ鎖中に導入される突然変異誘発性及び閉環性オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ：（ａ）前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端の少なくとも１つの端に相補的なそれらのヌクレオチド配列の少なくとも一部を有する１又は複数の閉環性オリゴヌクレオチド、及び（ｂ）前記相補的ＤＮＡ鎖の選択的複製のための手段を含んで成るキット。
９．前記閉環性オリゴヌクレオチドが、次のもの：（ＡａｔＩＩ）【配列があります】；（ＡｆｌＩＩＩ）【配列があります】；（ＡｓｅＩ）【配列があります】；（ＭｓｔＩ）【配列があります】；（ＮｄｅＩ）【配列があります】；（ＰｓｔＩ）【配列があります】；（ＰｖｕＩ）【配列があります】；（ＳｃａＩ）【配列があります】；（ＳｓｐＩ）【配列があります】；（ＸｍｎＩ）【配列があります】；【配列があります】；及びそれらの相補的配列から成る群から選択される請求の範囲第８項記載のキット。
１０．前記閉環性オリゴヌクレオチドが、前記線状ＤＮＡ鋳型の環化を引き起こすハイブリダイゼーションに基づいて前記線状ＤＮＡ鋳型の両自由端にアニールする前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端に少なくとも相補的なヌクレオ配列を有する請求の範囲第８項記載のキット。
１１．前記変異体プラスミドの選択的複製のための手段が、ｄｕｔ−ｕｎｇ−細菌株における前記二本鎖ＤＮＡの増殖、前記相補的ＤＮＡ領中へのチオヌクレオチドの導入又は示差メチル化から選択される請求の範囲第８項記載のキット。
１２．一本鎖の線状ＤＮＡ鋳型の自由端にアニールする閉環性オリゴヌクレオチドであって、それによって前記一本鎖の線状ＤＮＡ鋳型の環化が得られ、長さ１０〜５０個のヌクレオチドを有し、そして前記線状ＤＮＡ鋳型の自由端に少なくとも相補的なヌクレオチド配列を有することを特徴とする閉環性オリゴヌクレオチド。