ES2310597T3 - Metodo de preparacion de fragmentos de polinucleotidos para su uso en reordenamiento. - Google Patents
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Abstract
Un método para la preparación de fragmentos de polinucleótidos para su uso en el reordenamiento de polinucleótidos, que comprende: la obtención de una biblioteca de polinucleótidos homólogos a partir de un gen tipo salvaje por sucesivos pasos controlados de mutagénesis la desnaturalización e hibridación de dicho polinucleótido para la formación de los polinucleótidos heterodúplex la división de dichos polinucleótidos heterodúplex usando cualquiera de las proteínas del sistema de reparación de polinucleótidos que pueden dividir los pares de bases con error de replicación in vitro comprendiendo DAM metilasa, MutS, MutL, MutH, exonucleasa, ADN helicasa II, proteína SSB, ADN polimerasa III, ADN ligasa, o una combinación de éstas; o con un complejo de reparación por división de bases consistentes en ADN glicosilasa, endonucleasa AP, ADN polimerasa I, ADN ligasa, o una combinación de éstas; o con un complejo de reparación por división de nucleótidos consistente en Uvr-A, Uvr-B, Uvr-C, ADN polimerasa I, ADN ligasa, o una combinación de éstas la desnaturalización de dichos polinucleótidos heterodúplex divididos para la obtención de fragmentos.
Description
Método de preparación de fragmentos de
polinucleótidos para su uso en reordenamiento.
Los métodos de evolución dirigida que emplean la
reparación del ADN o polinucleótidos para mediar la creación de la
diversidad genética son conocidos en el arte. Por ejemplo tal método
es descrito en WO 99/29902. Estos tipos de métodos consisten en
exponer un polinucleótido heterodúplex en el sistema de reparación
del ADN celular para convertir completamente una cadena del
heterodúplex en el complemento perfecto de la cadena opuesta o para
convertir parcialmente una o ambas cadenas en el complemento más
perfecto de la otra, por lo tanto formar en último caso un
heterodúplex recombinante.
En muchos sentidos, sin embargo, el uso
particular de la reparación del ADN descrito anteriormente no se
presta para los métodos de evolución dirigida basados en el
reordenamiento, especialmente aquellos métodos que son mediados por
el molde. Primero, en los métodos de reordenamiento mediados por el
molde la cadena recombinante que se forma en la cadena molde no
deberá, desde luego, ser reparada en el punto donde esta se vuelve
idéntica a la cadena molde. Segundo, dependiendo de las condiciones
de la reacción y los materiales iniciales la cadena molde puede ser
inadvertidamente reparada para corresponder a la cadena
recombinante, lo cual es especialmente desventajoso si el molde
está siendo reciclado o usado nuevamente. De este modo, el uso de la
reparación de un ADN como es descrito anteriormente podría requerir
de un monitoreo más cercano de los materiales iniciales, las
condiciones de las reacciones de reparación y las cantidades de
enzimas de reparación. Tercero, el uso de la reparación del ADN
como es descrito anteriormente coloca los medios de control de los
experimentos en un punto hacia el final del proceso, esto no es,
hasta después del reordenamiento y apareamiento de la cadena
recombinante al molde. Como se explica abajo, existen ventajas al
mover los medios de control a un punto antes del reordenamiento o
creación de los fragmentos.
Además, el uso de la reparación del ADN descrito
en WO 99/29902 no sugiere un uso alternativo para la reparación del
ADN, quizás porque el uso exclusivamente alternativo tiene sentido
en el contexto de los métodos de evolución dirigida basados en el
reordenamiento. La alternativa es el uso de proteínas de reparación
del ADN no para la reparación de polinucleótidos en sí sino de los
fragmentos de polinucleótidos.
El ADN celular es constantemente expuesto a un
amplio espectro de factores exógenos (por ejemplo luz ultravioleta,
radiación por ionización, o químicos ambientales) o factores
endógenos (por ejemplo, daños oxidativos, o inestabilidad
estructural a pH fisiológico) que genera lesiones en el ADN. Para
contrarrestar estos factores, una variedad de vías de reparación
del ADN han evolucionado para proteger la célula contra los efectos
genotóxicos y letales de daño en el DNA. Las vías de reparación por
división del ADN incluyen, por ejemplo, reparación por división de
base (BER), reparación por división de nucleótido (NER), y
reparación de errores de replicación (MMR).
En E. coli, por ejemplo, diferentes
proteínas están involucradas en estas tres vías de reparación. En
la vía BER, las proteínas involucradas son ADN glicosilasa,
endonucleasa AP, ADN polimerasa I y ADN ligasa. La posición de la
base dañada es denominada sitio abásico o sitio AP. La ADN
glicosilasa reconoce el sitio AP y remueve la base dañada.
Entonces, la endonucleasa AP remueve el sitio AP y los nucleótidos
vecinos de ese modo crean una espacio inducido. Finalmente, el
espacio inducido es rellenado por la ADN polimerasa I y la ADN
ligasa. Ver la Figura 1.
En la vía NER, las proteínas involucradas en
E. coli son Uvr-A, Uvr-B,
Uvr-C, ADN polimerasa I y ADN ligasa.
Uvr-A, Uvr-B, y
Uvr-C están involucradas en la eliminación de los
nucleótidos dañados (por ejemplo, dímeros inducidos por luz
ultravioleta) para crear un espacio inducido. El espacio inducido es
rellenado por la ADN polimerasa I y la ADN ligasa. Ver la Figura 2.
En levadura, proteínas similares a aquellas de E. coli están
involucradas. Por ejemplo, en levaduras, las proteínas RADxx (por
ejemplo, RAD3 y RAD10) son similares a las Uvr en E.
coli.
En la vía MMR, las proteínas involucradas en
E. coli son DAM metilasa, MutS, Mult., Ruth, exonucleasa,
ADN helicasa II, proteína SSB, ADN polimerasa III y ADN ligasa. Para
la eliminación de las bases con errores de replicación, la vía
involucra la determinación de cual base es la correcta. En E.
coli, esta determinación es lograda por una metilasa especial
denominada Dam metilasa, que puede metilar todas las adeninas que
tienen lugar dentro de las secuencias (5')GATC. Inmediatamente
después de la replicación del ADN, la cadena molde ha sido
metilada, pero la cadena nuevamente sintetizada no ha sido metilada
aún. De este modo, la cadena molde y la nueva cadena pueden ser
distinguidas. La reparación de errores de replicación en eucariotas
puede ser similar a la de E. coli. Homólogos de MutS y MutL
han sido identificados en levadura, mamíferos y otras eucariotas.
MSH1 y MSH5 son homólogos a MutS. MLH1, PMS1 y PMS2 son homólogos a
Mult. En eucariotas, el mecanismo para distinguir la cadena molde
de la cadena nueva no está claro todavía.
La vía MMR continúa con la MutS enlazada a los
pares de bases con errores de replicación. Ver la Figura 3. MutL es
entonces reclutada al complejo y activa a MutH que se enlaza a las
secuencias GATC. La activación de MutH divide la cadena no metilada
en el sitio GATC. Posteriormente, el segmento desde el sitio
dividido hasta el error de replicación es eliminado por
exonucleasa. Este paso simultáneamente involucra helicasa II y
proteínas enlazadas al ADN de simple cadena. Estas proteínas
enlazadas al ADN de simple cadena son denominadas proteínas SSB. Si
la división tiene lugar en el extremo 3' del error de replicación,
el paso es llevado a cabo por la exonucleasa I (que degrada una
simple cadena exclusivamente en la dirección 3'a 5'). Si la división
tiene lugar en el extremo 5' del error de replicación, exonucleasa
VII o RecJ es usada para degradar el ADN de simple cadena. El
espacio es rellenado por la ADN polimerasa III y ADN ligasa. La
distancia entre el sitio GATC y el error de replicación puede ser
tan larga como 1000 pares de bases. Por lo tanto, la reparación del
error de replicación es muy cara e ineficiente.
La recombinación de ácidos nucleicos in
vitro e in vivo son aplicaciones útiles (por ejemplo, la
creación de nuevas secuencias que codifiquen para proteínas que
tienen propiedades deseadas o mejoradas). Una variedad de métodos
han sido descritos en el arte para posibilitar esta recombinación
(por ejemplo, diseño racional para la evolución dirigida). Estos
métodos incluyen aquellos descritos en las Patentes U.S Nos.
5,605,763 y 5,965,408. Generalmente, los métodos de recombinación
dependen de los fragmentos producidos y de los fragmentos
recombinantes. Con relación a los fragmentos recombinantes, diversos
métodos han sido descritos en el arte. Por ejemplo, las Patentes
U.S. Nos. 5,605,763 y 5,965,408 recitan fragmentos recombinantes
basados en el termociclado de fragmentos similar a la reacción en
cadena de la polimerasa en presencia de la ADN polimerasa. La
Patente Internacional No. WO 00/09679 describe la unión
termocíclica para recombinar fragmentos de tamaño génico más
específico e incrementado. Estos métodos se basan en un proceso de
múltiples pasos involucrando un paso de fragmentación para generar
fragmentos de genes parentales que son adicionalmente ensamblados
para crear polinucleótidos recombinantes. La fragmentación es
obtenida por tratamientos aleatorios (por ejemplo ADNasa I,
sonicación, ruptura mecánica), o por tratamientos controlados (por
ejemplo endonucleasas de restricción). Estos procesos de
fragmentación no toman en cuenta el nivel de homología de los genes
parentales.
Información general adicional con relación al
uso de los sistemas in vitro de reparación del ADN aparece
en Dianov y otros, Curr. Biol. 1994
(1069-1078), y en WO 97/21837.
La US 5830721 revela la preparación de
fragmentos de polinucleótidos para su uso en el método de
reordenamiento, que puede ser producido por diferentes métodos.
Métodos aleatorios son revelados para la fragmentación del ácido
nucleico que puede ser digerido usando una nucleasa, como ADNasa I o
ARNasa, o fragmentado por el método de sonicación o por pasaje a
través de un tubo que tiene un orificio pequeño.
Es también descrito que el ácido nucleico puede
también ser parcialmente digerido con una o más enzimas de
restricción. En este caso, la fragmentación es controlada por la
localización de los sitios de corte. Sin embargo, las posiciones de
corte están impuestas por los sitios de restricción.
"In vitro", como es usado aquí, se
refiere a cualquier localización fuera del ser vivo.
"Reparación del ADN" o "reparación de
polinucleótido" se refiere a cualquier proceso que, en células,
protege contra los efectos genotóxicos del daño del ADN. Aún, en la
presente invención la reparación preferiblemente tiene lugar in
vitro.
"ds" significa ADN de doble cadena.
"ss" significa ADN de simple cadena.
"Polinucleótido" y "secuencia de
polinucleótido" se refiere a cualquier secuencia de ácido
nucleico o ribonucleico, incluyendo ARNm. Un polinucleótido puede
ser un gen o una porción de un gen. "Gen" se refiere a un
polinucleótido o porción de este asociado con una función o
actividad biológica conocida o desconocida. De este modo los genes
incluyen secuencias codificadoras, secuencias reguladoras y
secuencias de reconocimiento. Un gen puede ser obtenido por
diferentes vías, incluyendo la extracción desde una fuente de ácido
nucleico, síntesis química y síntesis por polimerización.
"Polinucleótidos homólogos" difieren uno de
otro al menos en una posición residual correspondiente. De este
modo, como usado aquí, "homólogos" abarca lo que es algunas
veces referido como "parcialmente heterólogos". La homología,
por ejemplo, entre los polinucleótidos parentales, puede comprender
desde 20 hasta el 99.99%, preferiblemente de 30 a 90, más
preferiblemente de 40 a 80%. En algunas realizaciones el término
homólogos puede describir secuencias que son, por ejemplo,
exclusivamente alrededor de 20-45% idénticas a las
posiciones residuales correspondientes. Las secuencias homólogas
pueden o no compartir con uno u otro origen común ascendente o
evolutivo.
"Polinucleótidos heterodúplex" son
polinucleótidos de doble cadena en los que las dos cadenas no son
totalmente complementaria una a otra.
La frase al menos dos polinucleótidos
heterodúplex homólogos se refiere a una pluralidad de
polinucleótidos de doble cadena, donde una cadena de cada
polinucleótido de doble cadena no es exclusivamente complementaria
de forma imperfecta a su cadena opuesta sino que también difiere de
la cadena correspondiente de uno de los otros polinucleótidos de
doble cadena al menos en una posición del residuo correspondiente.
En otras palabras, los polinucleótidos heterodúplex son homólogos
unos de otros.
El polinucleótido parental y progenitor son
sinónimos intercambiables que se refieren a los polinucleótidos que
son fragmentados para crear fragmentos donadores. En la presente
invención, los polinucleótidos parentales son generalmente
polinucleótidos heterodúplex homólogos. Los polinucleótidos
parentales son frecuentemente derivados de los genes.
Polinucleótido recombinante, polinucleótido mutante, polinucleótido
quimérico y quimera generalmente se refieren a los polinucleótidos
que son generados por el método. Sin embargo, estos términos pueden
referirse a otros polinucleótidos quiméricos, como polinucleótidos
quiméricos en una biblioteca inicial. Secuencia de referencia se
refiere a un polinucleótido, frecuentemente de un gen, que tiene
propiedades deseadas o propiedades cercanas a las deseadas, y que
es usado como blanco o punto de referencia para crear o evaluar
otros polinucleótidos.
Biblioteca de polinucleótido y biblioteca de ADN
se refieren a un grupo, fusión o banco de polinucleótidos o
fragmentos de estos. La biblioteca inicial puede comprender ADN
geonómico o complejo e incluye los intrones. Puede también
comprender secuencias generadas por series previas de
reordenamiento. Igualmente, una biblioteca de consulta u otra
biblioteca limitada de polinucleótidos recombinantes o fragmentos
que pueden servir y ser referenciada como una biblioteca inicial.
La biblioteca de consulta se refiere a una biblioteca de
polinucleótidos que contiene quimeras generadas por el proceso
inventivo u otro proceso recombinante.
Residuo se refiere a una base individual, de
nucleótido o ribonucleótido, más bien que múltiples bases, de
nucleótidos o ribonucleótidos. Residuo puede referirse a un residuo
libre que no es parte de un polinucleótido o fragmento, o a un
residuo particular que forma parte de un polinucleótido o
fragmento.
Fragmentos donadores y fragmentos generalmente
se refieren a las porciones fragmentadas de polinucleótidos
parentales. Los fragmentos pueden también referirse a fragmentos
sustituidos o suplementarios que son adicionados a la mezcla de
reacción y/o que se derivan de una fuente diferente de la
fragmentación de los polinucleótidos parentales. La mayoría o todos
los fragmentos deben ser más cortos que los polinucleótidos
parentales. La mayoría o todos los fragmentos son más cortos que
los moldes del ensamble. Como es usado aquí, los fragmentos
donadores preferiblemente no inician la extensión por polimerasa,
esto significa, que ellos no son cebadores.
No aleatorios y controlados, como usados aquí,
se refieren en términos generales al control o pronóstico, por
ejemplo, sobre la velocidad o localización de la recombinación,
lograda por medio del molde y/o orientación a la unión de la
invención. No aleatorios y controlados se pueden también referir más
específicamente a las técnicas de fragmentación de polinucleótidos
que posibilitan algún control o pronóstico sobre el tamaño o
secuencia de los fragmentos resultantes. Por ejemplo, usando enzimas
de restricción para cortar los polinucleótidos se proporciona algún
control sobre las características de los fragmentos. Note que la
invención puede todavía ser considerada no aleatoria cuando esta
emplea la fragmentación aleatoria (típicamente por digestión con
ADNasa I). En tales casos, el molde ensamblado, mecanismos de
reparación y otras características de la invención todavía
proporcionan un grado de control. En realizaciones preferidas, sin
embargo, la fragmentación es no aleatoria o controlada.
Molde de ensamble y molde se refieren a un
polinucleótido usado como andamio o matriz sobre la cual los
fragmentos se pueden aparear o hibridar para formar parcialmente o
totalmente un polinucleótido de doble cadena. Los moldes de
ensamble de la invención son distinguidos de las diversas secuencias
en el arte que han sido referidas como molde. Por ejemplo, los
moldes de la presente invención no incluyen fragmentos donadores
superpuestos que facilitan la extensión de los fragmentos donadores
complementarios por consiguiente hibridados. Como tal, el molde de
ensamble es diferente de los fragmentos donadores en algún punto del
proceso. Los moldes de ensamble de la presente invención tampoco
incluyen aquellas secuencias usadas en el proceso que descansan con
fuerza en la extensión de la polimerasa para generar toda o la
mayoría de la cadena opuesta. En otras palabras, la realización del
reordenamiento en la invención descansa en la hibridación de los
fragmentos donadores para formar el peso de la cadena recombinante.
Preferiblemente, la cadena molde del polinucleótido recombinante
formada por el proceso, aunque puede ser en sí recombinante, no
sufre recombinación durante el proceso. En otras palabras,
preferiblemente los fragmentos no donadores son incorporados en la
cadena molde durante un ciclo del proceso. El molde puede ser
sintético, resultado del reordenamiento u otros procesos
artificiales, o este puede existir en la naturaleza. El molde
transitorio se refiere a un molde que no es propiamente incorporado
dentro de los polinucleótidos recombinantes finales. Este
transitoriedad es causada por la separación o desintegración de la
cadena molde del polinucleótido recombinante no final generado
durante el método. El molde se puede derivar de una secuencia de
referencia, la biblioteca inicial, la biblioteca de consulta o en
otra parte. Aunque el molde puede comprender o derivarse de un
polinucleótido parental de la biblioteca inicial, en una
realización preferida del molde es concebida, y un polinucleótido no
clasifica para un molde concebido si este entra en el proceso de
reordenamiento accidentalmente, por ejemplo, por el corrimiento de
algún modo dentro del paso de hibridación sin ser fragmentado. En
otras palabras, el molde concebido no es completamente aleatorio o
accidental. Más bien, al menos hasta cierto punto un molde concebido
es directamente o indirectamente obtenido para usar como un molde
por un ser humano, o una computadora operada de ese modo, por medio
de una planificación, concepción, formulación, creación, derivación
y/o selección determinada de cualquier una secuencia(s) de
polinucleótido específica deseada o una secuencia(s) de una
fuente(s) que es probable contenga una secuencia(s)
deseada.
Molde parental se refiere a la cadena de un
polinucleótido parental o heterodúplex que generalmente no es
afectado por el sistema de reparación del polinucleótido, por
ejemplo, porque este es metilado. Como tal, el molde parental
refleja la utilización popular del término molde, a diferencia de
muchos significados especializados de molde de ensamblaje como
descrito anteriormente.
Cadena solitaria o no-idéntica
es usado para describir una población de secuencias de simple cadena
que no se complementan una a otra porque ellas son todas de la
misma cadena, tanto sentido como antisentido, de un polinucleótido
o polinucleótidos múltiples homólogos. En otras palabras, las
secuencias de cadenas complementarias opuestas están ausentes, pero
la población no contiene secuencias que son complementarias una de
otra. Por ejemplo, la población de fragmentos
no-idénticos puede consistir en fragmentos de
cadenas superiores de los polinucleótidos parentales, mientras la
población de moldes no-idénticos puede consistir en
cadenas inferiores de uno o más de los polinucleótidos
parentales.
Unión se refiere a la creación de un enlace
fosfodiéster entre dos residuos.
Hendidura se refiere a la ausencia de enlace
fosfodiéster entre dos residuos que son hibridados en la misma
cadena de un polinucleótido. La hendidura incluye la ausencia de
enlaces fosfodiéster causado por ADNasas u otras enzimas, así como
las ausencias de enlaces entre fragmentos adyacentes hibridados que
simplemente no han sido unidos. Como usado aquí, hendidura no
abarca los espacios residuales.
Espacio y espacio residual, es como usado aquí,
se refieren a la ausencia de uno o más residuos en una cadena de un
polinucleótido parcialmente de doble cadena. En algunas
realizaciones de la invención, espacios cortos (menos que
aproximadamente 15-50 residuos) son rellenados por
polimerasas y/o bordes solapados. Espacios grandes son
convencionalmente rellenados por polimerasas.
Hibridación tiene su significado común excepto
que puede abarcar algunos ciclos de desnaturalización y
re-hibridación necesarios.
Fragmentos adyacentes se refieren a los
fragmentos hibridados cuyos extremos son alineados uno contra el
otro y separados exclusivamente por hendiduras, no por
espacios.
Unión solamente se refiere a las realizaciones
de la invención que no utilizan o requieren ningún espacio
rellenado, extensión de polimerasa o borde solapado. En las
realizaciones de unión solamente, todos los fragmentos hibridan
adyacentemente. Note que las realizaciones que no son realizaciones
exclusivas a la unión todavía usan unión.
Como usado aquí, orientado a la unión, unión
orientada y compatible a la unión generalmente representa o se
refiere a los procesos mediados por el molde que posibilitan la
unión de los fragmentos o residuos en un conjunto relativo o un
orden relativamente predecible. En realizaciones de unión solamente,
el método no emplea técnicas de rellenado de espacios y en su lugar
se basa en uniones de fragmentos adyacentes, frecuentemente logrados
después de múltiples eventos de hibridación.
Como usado aquí, mediado por exonucleasa
generalmente se refiere a un proceso mediado por el molde que emplea
borde solapado que posibilita la unión de los fragmentos o residuos
en un conjunto relativo o un orden relativamente predecible.
Se hace referencia para los dibujos adjuntos en
los que:
La Fig. 1 representa la reparación del ADN por
división de base.
La Fig. 2 representa la reparación del ADN por
división de nucleótido.
La Fig. 3 representa la reparación del ADN por
reconocimiento de error en la replicación.
La Fig. 4 representa la preparación del ADNss y
un molde parental.
La Fig. 5 representa la preparación del ADNss
usando la digestión con una exonucleasa lamda específica.
La Fig. 6 representa los resultados de las
condiciones de digestión específica.
La Fig. 7 representa los sitios dam
metilasa.
La Fig. 8 representa la amplificación por
PCR.
La Fig. 9 representa la construcción del
heterodúplex.
Esta invención se refiere al proceso de
fragmentación entre dos cadenas de polinucleótidos parentales en
dependencia de los errores de replicación. La invención comprende
un método para preparar los fragmentos de polinucleótidos de ADN
que consiste en la formación de moléculas de heterodúplex por
hibridación de los polinucleótidos. Estos polinucleótidos pueden
ser de simple cadena o de doble cadena.
La presente invención proporciona un método y un
proceso de formación de fragmentos que pueden ser usados en
cualquier proceso de reordenamiento o combinación de procesos de
reordenamiento. Una biblioteca de mutantes a partir de un gen
original o familia de genes es usado como un sustrato o sustratos
para los pasos comprendiendo desnaturalización e hibridación. El
gen original puede ser obtenido por PCR mutagénico, PCR propenso a
error, mutagénesis química, mutagénesis física y una combinación de
estos. En otra realización preferida, el paso que comprende la
hibridación adicionalmente comprende la creación de los
heterodúplex. Los heterodúplex pueden entonces ser usados después
del reconocimiento de los errores de replicación como sustrato o
sustratos para la preparación de fragmentos.
La presente invención proporciona un método para
la preparación de fragmentos de ADN para su uso en el reordenamiento
de polinucleótidos, incluyendo la exposición de al menos dos
polinucleótidos heterodúplex homólogos a un sistema de reparación
de polinucleótidos hasta que los heterodúplex comprendan al menos un
fragmento apareado, y la desnaturalización de dichos heterodúplex
para obtener los fragmentos. Preferiblemente, antes o después de la
desnaturalización o exposición, fragmentar al menos una cadena de
cada uno de dichos heterodúplex por exposición adicional de dichos
heterodúplex para una ADNasa o enzima de restricción.
El tema de la presente invención es definido en
las reivindicaciones. Este se refiere a un método para la
preparación de fragmentos de polinucleótidos para su uso en el
reordenamiento de polinucleótidos, comprendiendo:
la obtención de una biblioteca de
polinucleótidos homólogos a partir de un gen tipo salvaje por
sucesivos pasos controlados de mutagénesis
la desnaturalización e hibridación de dicho
polinucleótido para la formación de los polinucleótidos
heterodúplex
la división de dichos polinucleótidos
heterodúplex usando cualquiera de las proteínas del sistema de
reparación de polinucleótidos que pueden dividir in vitro
los pares de bases con error de replicación comprendiendo a DAM
metilasa, MutS, MutL, MutH, exonucleasa, ADN helicasa II, proteína
SSB, ADN polimerasa III, ADN ligasa, o una combinación de éstas; o
con un complejo de reparación por división de base consistentes en
ADN glicosilasa, endonucleasa AP, ADN polimerasa I, ADN ligasa, o
una combinación de éstas; o con un complejo de reparación por
división de nucleótidos consistente en Uvr-A,
Uvr-B, Uvr-C, ADN polimerasa I, ADN
ligasa, o una combinación de éstas
la desnaturalización de dichos polinucleótidos
heterodúplex divididos para la obtención de fragmentos.
En una realización preferida, la biblioteca
inicial es en sí producida por la presente invención. En una
realización preferida adicional, la biblioteca inicial puede ser
producida por cualquier proceso de reordenamiento o una combinación
de procesos de reordenamiento. Cualquier consulta in vivo o
in vitro puede ser usada para formar esta biblioteca por
repetición del proceso de la invención. Las secuencias recombinantes
seleccionadas después de una primera corrida del proceso puede ser
opcionalmente mezcladas con otras secuencias.
La biblioteca inicial puede también ser
producida por cualquier método conocido por un experto en el arte,
por ejemplo, a partir de un gen tipo salvaje, por sucesivos pasos
controlados de mutagénesis, por PCR "propenso a error", por
mutagénesis química aleatoria, por mutagénesis aleatoria in
vivo. Preferiblemente, la biblioteca inicial resulta de
reacciones de polimerización en cadena bajo condiciones que crean
mutaciones localizadas, aleatorias. La invención puede también
comprender secuencias sintéticas.
Para promover la formación de heterodúplexes,
realizaciones de la invención pueden incluir: incremento del número
de polinucleótidos parentales; corrida de polinucleótidos parentales
a través de uno o más ciclos de desnaturalización e hibridación,
usando secuencias de ADNss para formar polinucleótidos heterodúplex
parentales; o introducir un exceso relativo de uno o más
polinucleótidos en la biblioteca inicial para predisponer a la
formación del
heterodúplex.
heterodúplex.
En una realización, los polinucleótidos
parentales (que pueden contener homodúplex así como heterodúplex)
son incubados con una proteína de unión con error de replicación
como el complejo de reparación de error de replicación
MutS/MutL/MutH, que reconoce, une y corta cualquier sitio con error
de replicación. Este reconocimiento ocurre cuando la cadena molde
opuesta (no el molde ensamblado) es metilada. La fragmentación es
entonces amplificada con exonucleasas. Si la división ocurre en el
extremo 3' del error de replicación, este paso es llevado a cabo
por la exonucleasa I, que degrada la cadena simple exclusivamente en
la dirección 3'a 5'. Si la división ocurre en el extremo 5' del
error de replicación, la exonucleasa VII o RecJ es usada para
degradar el ADN de cadena simple y producir los fragmentos.
En otra realización, al menos un error de
replicación es introducido por el polinucleótido parental inicial.
En otras realizaciones, al menos una de los moldes parentales
iniciales ss o ds (no es lo mismo que molde ensamblado) es
metilado. En otros métodos, los heterodúplex pueden ser usados como
sustratos para cualquiera de las proteínas que pueden dividir los
pares de bases con error de replicación in vitro, por
ejemplo, el complejo MutS/MutL/MutH, endonucleasa VII del fago T4 o
endonucleasa I del fago T7. Aún en otra realización, errores de
replicación artificiales son introducidos, por ejemplo, por
introducción de nucleótidos modificados (dTTP o ADN conteniendo
uracilo por ejemplo) o por creación de los heterodúplex entre el ADN
y el ARN. Todavía en otra realización, la digestión parcial de los
errores de replicación es lograda para que todos los errores de
replicación no sean divididos.
Aún en otra realización, al menos una base
dañada es introducida por la secuencia parental inicial según los
métodos estándares conocidos, por ejemplo PCR mutagénico (por
ejemplo, la incorporación de análogos de base) o mutagénesis
química (utilización de: análogos de base como
5-bromouracilo o 2-aminopurina;
proflavina; agentes de alquilación como mostaza de azufre o mostaza
de nitrógeno y sulfonato de etilmetano, agentes de desaminación
como ácido de nitroso; e hidroxilamino o radicales libres). Después
de la desnaturalización e hibridación, estas moléculas pueden
formar los heterodúplex con bases dañadas/con errores de replicación
que pueden servir como sustratos para cualquiera de las proteínas
del sistema BER in vitro. Las ADN glicosilasas pueden
entonces reconocer y eliminar las bases alteradas por división
hidrolítica del enlace base-azúcar, generando un
sitio AP. Las endonucleasas AP (por ejemplo, endonucleasas como
HAP1, FEN1) entonces remueven el sitio AP y los nucleótidos vecinos
para generar los fragmentos.
Todavía en otra realización, al menos un
nucleótido dañado es introducido por la secuencia parental inicial
según los métodos estándares conocidos, por ejemplo, la formación de
dímeros de pirimida inducidos por luz UV. Después de la
desnaturalización e hibridación, estas moléculas pueden formar los
heterodúplex con los nucleótidos dañados, los que pueden ser usados
como sustratos por cualquiera de las proteínas del sistema NER
in vitro. Las secuencias parentales son incubadas con una
proteína del sistema NER como el complejo
Uvr-A/Uvr-B, y Uvr-C
o RAD, que reconoce, une y corta cualquiera de los sitios
nucleotídicos dañados resultantes para generar los fragmentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
I
Este ejemplo describe la preparación del ADNss y
un patrón parental.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los cebadores de oligonucleótidos
sintéticos para PCR fueron de Biotech. El cebador sentido pET5
5'AGATC
TCGATCCCGCGAAATTAATACG'3 y el cebador antisentido pET3 5'CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG'3 (con o sin la terminación fosforotioato (PTO)) fueron usadas para amplificar el gen GFP (GENBANK : AEVGFP) pET26b+clonada (Figura 4) y producir una cadena sentido y/o antisentido de fosforotioato.
TCGATCCCGCGAAATTAATACG'3 y el cebador antisentido pET3 5'CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAG'3 (con o sin la terminación fosforotioato (PTO)) fueron usadas para amplificar el gen GFP (GENBANK : AEVGFP) pET26b+clonada (Figura 4) y producir una cadena sentido y/o antisentido de fosforotioato.
\vskip1.000000\baselineskip
Enzimas de restricción, ADN ligasa, ADN
polimerasas, exonucleasa lambda fueron adquiridas de NEB, y usadas
como recomendado por los fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la preparación del molde de ADNss o
polinucleótidos, diversas amplificaciones por PCR fueron hechas
usando las siguientes condiciones:
- (1)
- dos cebadores fosfatados: pET5 P y pET3 P;
- (2)
- dos cebadores PTO: pET5 PTO y pET3 PTO;
- (3)
- un cebador pET3 P y un cebador pET5 PTO para obtener el molde de ADN ss después del tratamiento con exonucleasa; y
- (4)
- un cebador pET3 P y un cebador pET5 PTO para obtener los polinucleótidos de ADN ss después del tratamiento con exonucleasa.
\vskip1.000000\baselineskip
El siguiente programa de PCR fue usado:
- 94ºC 5 minutos
- (91ºC 30 segundos, 55ºC 30 segundos, 72ºC 1.30 minutos)x 30,
- 72ºC 6 minutos, 4ºC \infty
Estas PCR fueron entonces incubadas con o sin
exonucleasa lambda para una digestión selectiva de cadenas 5 P,
como se muestra en la Figura 5. La condición (1) resultó en una
digestión total por exonucleasa lambda de la amplificación de pET5
P/pET3 P (ver carril B, Figura 5) comparado con las condiciones
experimentales del mismo producto de PCR no digerido (ver carril A,
Figura 5). La condición (2) resultó en la no digestión de la
amplificación de pET5 PTO/pET3 PTO (ver carril C, Figura 5). La
condición (3) resultó en una digestión selectiva de la cadena
anti-sentido resultante en un molde de ADN de simple
cadena (ver carril D, Figura 5). La condición (4) resultó en una
digestión selectiva de la cadena sentido resultante en
polinucleótidos de ADN de simple cadena como mostrado en blanco
(Figura 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
II
Este ejemplo representa la preparación del
fragmento usando la reparación MMR del ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células MC1061DE3 fueron usadas para
propagar la expresión del plásmido pET26b+ (Novagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los cebadores de oligonucleótidos
sintéticos para PCR fueron sintetizados por MWG Biotech.
\vskip1.000000\baselineskip
Enzimas de restricción, ADN polimerasas,
exonucleasa lambda, ADN ligasa y exonucleasa I fueron adquiridos de
NEB, y usadas como recomendado por los fabricantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ensayos de fragmentación fueron llevados a
cabo en 20 l conteniendo 0.02 M de Tris-HCl (pH
7.6); 5 mM de MgCl_{2}; 40 g de albúmina de suero bovino; 1 mM de
ATP; una apropiada concentración de cada una de las proteínas MMR
purificadas y 100 fmol de los heterodúplex. La incubación fue
lograda a 37ºC durante 1 hora y 30 l de 25 mM de EDTA (pH 8.0)
fueron entonces adicionados. El ADN fue purificado por extracción
con fenol y precipitación con etanol. El ADN resuspendido fue
entonces analizado sobre un gel desnaturalizante de agarosa al
1%.
\vskip1.000000\baselineskip
La amplificación por PCR del gen GFP fue lograda
a partir de pET26GFP (comparar con la Figura 4) y usando 5 PGFP/3
GFPPTO. 1 g del producto resultante del PCR a partir de la
amplificación del gen GFP usando pET26GFP como molde fue entonces
tratado con 8 U de dam metilasa para metilar dos sitios GATC
específicos a la dam metilasa como es mostrado en la Figura 7.
A partir de pET26GFP y usando 5 PTOGFP/P1 y GFP
P2/3, nosotros preparamos dos amplicones en los que un polienlace
de ADN pequeño conteniendo la inserción (Figura 8, mostrado en
negro) fue introducido. Después de la digestión con DpnI, para
remover el molde plasmídico, el gen GFP integro fue amplificado
usando GFP 5 PTOGFP/3 por PCR de superposición usando los dos
amplicones anteriores como muestra la Figura 8.
El producto del PCR fue entonces digerido por
NdeI/EcoRI y subclonado en pET26b+. El pET26b había sido
anteriormente linearizado por las mismas enzimas de restricción
resultando en pETinactGFP que codifica para una proteína GFP
inactiva.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN ss fue obtenido por la digestión con una
exonucleasa lambda específica (como descrito en el Ejemplo I) de
los dos amplicones siguientes (Figura 7 y 8):
- (1)
- amplicón usando cebadores específicos 5 PGFP/3 GFPPTO para obtener el molde de ADN ss antisentido metilado (como se muestra en la Figura 9); y
- (2)
- amplicón usando cebadores específicos 5 PTOGFP/3 GFP para obtener el ADN ss con la inserción (como se muestra en negro, Figura 9).
Los heterodúplex fueron preparados por
apareamiento de una preparación equimolar de ADN ss a partir del gen
GFP metilado e inactivo (con la inserción).
\vskip1.000000\baselineskip
Los heterodúplex fueron entonces tratados con
una mezcla del complejo MutS, MutL y MutH recombinante purificado.
Los fragmentos de la cadena no metilada fueron entonces obtenidos
usando uvrD, exonucleasa I o VII y actividades SSB, como es
descrito en materiales y métodos. Después de la extracción con fenol
y la precipitación con etanol, el ADN resuspendido fue examinado
sobre gel desnaturalizante de agarosa al 1%. La no fragmentación fue
detectada cuando no fueron adicionadas las proteínas MMR. Este fue
a diferencia de las dos condiciones experimentales (usando (1)
exonucleasa I, o (2) exonucleasa VII) donde fueron observados los
diferentes fragmentos siguientes:
- (1)
- 726,560 y 96 pb (usando exonucleasa I); y
- (2)
- 726,166 y 120 pb (usando exonucleasa VII).
Estos resultados fueron también reproducidos
para obtener diferentes fragmentos para los experimentos de
reordenamiento.
<110> PROTEUS S.A.
\hskip1cmDUPRET, Daniel
\hskip1cmLEFEVRE, Fabrice
\hskip1cmFOURAGE, Laurent
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO DE PREPARACIÓN DE FRAGMENTOS
DE POLINUCLEÓTIDOS PARA EL USO EN REORDENAMIENTO Y REORDENAMIENTO DE
LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 26883PCT-PP15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/USxxxxxx
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-05-16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/291,184 (solicitud
provisional)
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-05-17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(27)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido pET5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido pET3'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (13)
1. Un método para la preparación de fragmentos
de polinucleótidos para su uso en el reordenamiento de
polinucleótidos, que comprende:
la obtención de una biblioteca de
polinucleótidos homólogos a partir de un gen tipo salvaje por
sucesivos pasos controlados de mutagénesis
la desnaturalización e hibridación de dicho
polinucleótido para la formación de los polinucleótidos
heterodúplex
la división de dichos polinucleótidos
heterodúplex usando cualquiera de las proteínas del sistema de
reparación de polinucleótidos que pueden dividir los pares de bases
con error de replicación in vitro comprendiendo DAM
metilasa, MutS, MutL, MutH, exonucleasa, ADN helicasa II, proteína
SSB, ADN polimerasa III, ADN ligasa, o una combinación de éstas; o
con un complejo de reparación por división de bases consistentes en
ADN glicosilasa, endonucleasa AP, ADN polimerasa I, ADN ligasa, o
una combinación de éstas; o con un complejo de reparación por
división de nucleótidos consistente en Uvr-A,
Uvr-B, Uvr-C, ADN polimerasa I, ADN
ligasa, o una combinación de éstas
la desnaturalización de dichos polinucleótidos
heterodúplex divididos para la obtención de fragmentos.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex es generado a partir de un gen nativo
por mutagénesis dirigida sucesiva, por PCR propenso a error,
mutagénesis química aleatoria o por mutagénesis aleatoria in
vivo resultando de ese modo en una diversidad de secuencias en
dicha biblioteca de polinucleótido.
3. El método de la reivindicación 1, donde
dichos fragmentos no son idénticos.
4. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una biblioteca
inicial de polinucleótidos parentales, y que adicionalmente
comprende, antes de la exposición de dicho polinucleótido
heterodúplex a un sistema de reparación de polinucleótido, promover
la formación de dicho polinucleótido heterodúplex por incremento
del número de un polinucleótido parental en dicha biblioteca con
relación a los otros polinucleótidos parentales en dicha
biblioteca.
5. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una biblioteca
inicial de polinucleótidos parentales, y que adicionalmente
comprende, antes de la exposición de dicho polinucleótido
heterodúplex a un sistema de reparación de polinucleótido, promover
la formación de dicho polinucleótido heterodúplex por
desnaturalización e rehibridación de los polinucleótidos
parentales.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicho
sistema de reparación de polinucleótidos adicionalmente comprende
la endonucleasa VII del fago T4, la endonucleasa I del fago T7, o
una combinación de éstos.
7. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una biblioteca
inicial de polinucleótidos parentales, y que adicionalmente
comprende, antes de la exposición de dicho polinucleótido
heterodúplex a un sistema de reparación de polinucleótido,
introducir al menos un error de replicación por polinucleótido
parental.
8. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una biblioteca
inicial de polinucleótidos parentales, y al menos una cadena de los
polinucleótidos parentales es metilada.
9. El método de la reivindicación 1, donde dicho
polinucleótido heterodúplex comprende un ADN conteniendo dITP o
uracilo.
10. El método de la reivindicación 1, donde
dicho polinucleótido heterodúplex comprende un heterodúplex entre
el ADN y el ARN.
11. El método de la reivindicación 1, donde
dicho sistema de reparación de polinucleótido carece de polimerasa,
ligasa o ambas.
12. El método de la reivindicación 1, donde
dicho polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una
biblioteca inicial de polinucleótidos parentales, y donde al menos
una base dañada es introducida por el polinucleótido parental
inicial.
13. El método de la reivindicación 1, donde
dicho polinucleótido heterodúplex es obtenido a partir de una
biblioteca inicial de polinucleótidos parentales, y donde al menos
un nucleótido dañado es introducido por el polinucleótido parental
inicial.
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