ES2280891T3 - Metodo para obtener polinucleotidos circulares mutados y/o quimericos. - Google Patents
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Abstract
Un método para generar polinucleótidos quiméricos o mutados que consta de los siguientes pasos: a) proporcionar un polinucleótido molde circular cerrado que contenga un primer gen de interés, b) proporcionar fragmentos de un polinucleótido diana de DNA bicatenario proveniente de un segundo gen de interés capaz de hibridar con el primer gen de interés, y que dichos fragmentos tengan extremos 3''OH libres y extremos 5'' fosforilados, c) generar cadenas simples de dichos polinucleótidos molde y de los mencionados fragmentos de polinucleótido diana, d) hibridar dichos fragmentos del polinucleótido diana con los ya mencionados polinucleótidos molde, e) elongar los fragmentos hibridados del polinucleótido diana a través de una DNA polimerasa, f) ligar las mellas entre los fragmentos elongados mediante la utilización de una DNA ligasa, y de este modo crear una molécula de DNA circular de longitud completa quimérica, y g) utilizar el producto obtenido en f) y repetir los pasos del c) al f) de 1 a 100veces.
Description
Método para obtener polinucleótidos circulares
mutados y/o quiméricos.
La presente invención está relacionada con un
método in vitro rápido, sencillo y eficaz destinado a generar
polinucleótidos circulares mutados. Dicho método se basa en
proporcionar un polinucleótido molde de DNA circular cerrado que
contenga un primer gen de interés, proporcionar fragmentos de un
polinucleótido diana de DNA bicatenario que a su vez contengan un
segundo gen de interés que sea capaz de hibridar con el primer gen
de interés, donde los fragmentos tengan extremos 3'OH libres y
extremos 5' fosforilados, crear cadenas simples de dicho
polinucleótido molde y de los citados fragmentos del polinucleótido
diana, hibridar los fragmentos de polinucleótidos de DNA diana con
el polinucleótido circular, elongar los fragmentos, por ejemplo,
mediante la utilización de una DNA polimerasa y ligar los
fragmentos elongados entre ellos, por ejemplo, mediante la
utilización de una DNA ligasa. Estos pasos dan como resultado una
cadena de DNA hija circular mutada o recombinada. Para promover el
incremento de la frecuencia de mutación o recombinación, los pasos
de hibridación, elongación y ligación se repiten de 1 a 100 veces.
Mediante este método se puede obtener fácilmente una multitud de
polinucleótidos quiméricos o mutados. La invención también muestra
métodos para obtener biomoléculas recombinadas basadas en dichos
polinucleótidos mutados.
Existe un gran interés por la aplicación de
biomoléculas para usos médicos, industriales y científicos (Powell,
K.A., et al., Directed Evolution and Biocatalysis, Angew.
Chem. Int. Ed. Engl. 40 (2001) 3948-3959) (Kirk,
O., et al., Industrial enzyme applications, Curr. Opin.
Biotechnol. 13 (2002) 345-351).
Algunas aplicaciones necesitan biomoléculas que
tengan características o propiedades muy especiales que no se
encuentren en la naturaleza o que sea muy difícil obtenerlas. Una
manera de generar dichas biomoléculas imita el principio de la
evolución natural. Se generan mutantes al azar de una biomolécula y
se selecciona un mutante que tenga las propiedades deseadas
mediante un proceso de cribado apropiado. Este tipo de enfoque
recibe el nombre de "evolución dirigida" (Arnold, F.H., y
Volkov, A.A., Directed evolution of biocatalysts, Current Opinion
in Chemical Biology 3 (1999) 54-59).
Se pueden emplear varias técnicas para crear
estos mutantes (Vasserot, A.P., et al., Optimization of
protein therapeutics by directed evolution, Drug Discov Today 8
[2003] 118-126) (Graddis, T.J., et al.,
Designing proteins that work using recombinant technologies, Curr.
Pharm. Biotechnol. 3 [2002] 285-297) (Brakmann, S.,
Discovery of superior enzymes by directed molecular evolution,
Chembiochem. 2 [2001] 865-871).
Los métodos que se utilizan hoy en día para
generar biomoléculas que posean las propiedades deseadas pueden
dividirse prácticamente en técnicas que introducen mutaciones
puntuales y técnicas en las que se recombinan secuencias de
polinucleótidos similares pero no idénticos.
El primer tipo de métodos, da lugar a
polinucleótidos mutados mediante la introducción de mutaciones
puntuales al azar en la secuencia de interés, por ejemplo, mediante
una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con tendencia al
error (Cadwell, R.C., y Joyce, G.F., PCR Methods Appl. 2 (1992)
28-33), el uso de las denominadas cadenas mutadoras
(Greener, A., et al., Methods Mol. Biol. 57 (1996)
375-385), o el tratamiento del DNA con sustancias
químicas mutagénicas (Deshler, J.O., Gen. Anal. Techn. Appl. 9
(1992) 103-106).
El segundo tipo de técnica que da lugar a los
polinucleótidos quiméricos consta de la recombinación de genes o de
fragmentos de genes que provienen de distintas variantes de un
gen.
En la patente WO 01/34835, se describen las
técnicas para la recombinación de dominios funcionales.
El método de recombinación más utilizado para la
optimización de biomoléculas es el llamado "DNA shuffling" (US
5 834 252; US 5 605 793; US 5 830 721; US 5 837 458; US 5 811 238).
Este método incluye la creación de fragmentos bicatenarios que
provienen de diferentes moldes de DNA bicatenario donde dichos
moldes de distinto DNA contienen áreas homólogas y heterólogas. El
reensamblaje de los fragmentos aleatorios se realiza mediante una
reacción parecida a la PCR sin cebadores adicionales. El hecho de
solapar dominios de secuencias de DNA que puedan funcionar como
cebadores/moldes los unos con los otros es esencial para un
reensamblaje satisfactorio. Debido al poco rendimiento de la
secuencia de DNA recombinado después del reensamblaje, habitualmente
tiene que amplificarse gracias a una reacción adicional de PCR y
más tarde tendrá que clonarse en un sistema de expresión apropiado.
De este modo, los productos génicos se pueden utilizar para
transformar células huésped adecuadas, ser expresados y luego
cribados para obtener una propiedad nueva o mejorada.
Alternativas metodológicas al DNA
shuffling son la recombinación aleatoria de cebadores (RPR,
en sus siglas en inglés) (Shao, Z., et al., Nucleic Acids
Res. 26 (1998) 681-683) y el proceso de extensión
escalonada (StEP, en sus siglas en inglés) (Zhao, H., et
al., Nat. Biotechnol. (1998) 16258-16261).
Pueden lograrse mutaciones dirigidas a través de
los métodos dispuestos en las patentes WO 02/16606 y WO 99/35281.
Dichos métodos utilizan DNA circular como molde y las mutaciones
dirigidas se introducen mediante el uso de cebadores diseñados
específicamente para este fin que ya contengan mutaciones
puntuales.
\newpage
La patente W0 01/29211 también describe un
método de recombinación. Según este método, el polinucleótido molde
no está integrado en un DNA circular y hace que sea necesaria la
inserción del DNA recombinado en un sistema de expresión adecuado
después de la recombinación.
También se detalla otro método para obtener
genes quiméricos en la patente WO 00/09697. El método ahí dispuesto
logra una gran diversidad de moléculas de DNA recombinado gracias a
la utilización de varios tipos de matrices de DNA ensambladas de
forma lineal.
A pesar del gran progreso alcanzado en los
distintos tipos de métodos que dan lugar a polinucleótidos mutantes
y, sobretodo, quiméricos, aún existe una necesidad inmensa de
proporcionar un método para generar polinucleótidos quiméricos que
ayudarían a evitar, por lo menos parcialmente, los famosos
inconvenientes que presentan los nuevos procedimientos en el
campo.
El objetivo de la presente invención además era
el de desarrollar un método simple y eficaz de recombinación de DNA
para obtener polinucleótidos quiméricos mediante la máxima reducción
del número de fases de desarrollo mientras se logra un alto nivel
de diversidad en los polinucleótidos quiméricos resultantes.
Se ha resuelto que los inconvenientes de los
métodos que ya se conocían en el campo pueden superarse al menos
parcialmente mediante los métodos, las células huésped y las
biomoléculas recombinantes de acuerdo con la presente invención.
La presente invención se refiere a un método
para generar un polinucleótido quimérico o mutado, y consta de los
siguientes pasos: proporcionar un polinucleótido molde de DNA
circular cerrado que contenga un primer gen de interés;
proporcionar fragmentos de un polinucleótido diana de DNA
bicatenario que contengan un segundo gen de interés capaz de
hibridar con el primer gen de interés y que además dichos fragmentos
tengan extremos 3'OH libres y extremos 5' fosforilados; generar
cadenas simples del mencionado de polinucleótido molde y los
fragmentos del polinucleótido diana; hibridar dichos fragmentos del
polinucleótido diana con el polinucleótido molde citado; elongar
los fragmentos hibridados del polinucleótido diana mediante una DNA
polimerasa; ligar las mellas existentes entre los fragmentos
elongados mediante la utilización de una DNA ligasa y de este modo
generar una molécula de DNA circular quimérica de longitud completa;
y después, utilizar dicha molécula de DNA circular quimérica de
longitud completa repetidamente como un polinucleótido molde de DNA
circular cerrado mediante la generación nuevamente de cadenas
simples, hidridarlas, elongarlas y ligarlas como se ha descrito
anteriormente. Debido a que en algunos aspectos esta tecnología se
parece a la conocida reacción en cadena de la polimerasa, se
propuso el término de quimerización en cadena de la polimerasa (PCC,
en sus siglas en inglés).
También se describe un método utilizado para
obtener una célula huésped transformada mediante la introducción de
un polinucleótido quimérico o mutado obtenido de acuerdo con un
método de la presente invención.
Además, se describe una célula que contiene un
polinucleótido quimérico o mutado producido por un método de acuerdo
con la presente invención.
Una realización adicional hace referencia a un
método para obtener una biomolécula recombinante que consta de los
siguientes pasos: obtener un polinucleótido quimérico o mutado
mediante el uso de un método de acuerdo con esta invención;
transformar dicho polinucleótido quimérico o mutado en un huésped
apropiado; expresar el gen recombinado; y realizar un proceso de
cribado para dicha biomolécula recombinante.
En una primera realización preferida, la
presente invención hace referencia a un método para generar un
polinucleótido quimérico o mutado que consta de los siguientes
pasos: proporcionar un polinucleótido molde circular cerrado que
contenga un primer gen de interés; proporcionar fragmentos de un
polinucleótido diana de DNA bicatenario proveniente de un segundo
gen de interés capaz de hibridar con el primer gen de interés y que
dichos fragmentos tengan extremos 3'OH libres y extremos 5'
fosforilados; generar cadenas simples de dicho polinucleótido molde
y de los fragmentos del polinucleótido diana; hibridar esos
fragmentos del polinucleótido diana con el mencionado
polinucleótido molde; elongar los fragmentos hibridados del
polinucleótido diana mediante una DNA polimerasa; ligar las mellas
entre los fragmentos elongados mediante la utilización de una DNA
ligasa y de ese modo generar una molécula de DNA circular quimérica
de longitud completa. Dicha molécula de DNA circular quimérica o
mutada de longitud completa luego debería utilizarse repetidamente
como un molde de polinucleótido circular cerrado en los ciclos
siguientes de quimerización mediante una nueva generación de cadenas
simples que hibriden, se elongen y se ligen como se ha descrito
anteriormente. A efectos prácticos, se hace referencia a este método
como si se tratase de un método de quimerización, aunque también se
han obtenido otros mutantes beneficiosos sin un proceso de
recombinación mediante el método inventivo.
El término "gen quimérico o mutado" se
utiliza para indicar que los polinucleótidos quiméricos o mutados se
obtienen en una frecuencia elevada gracias a la utilización de un
método de acuerdo con la presente invención. Como ya se conoce en
el ámbito, las mutaciones son por ejemplo, mutaciones puntuales,
deleciones o inserciones. Un polinucleótido quimérico tomado en el
sentido de la presente invención es cualquier gen de interés que
conste de por lo menos 15 polinucleótidos consecutivos provenientes
de 2 genes de interés distintos. Entonces, aunque la ventaja
principal de la presente invención sea la elevada frecuencia de
quimerización que se obtiene, esta también posee efectos
secundarios adicionales y bienvenidos que consisten en que los
polinucleótidos mutados también se generan frecuentemente cuando se
utiliza el método de quimerización de la presente invención. El
término "o" se emplea para indicar que los polinucleótidos que
se obtienen pueden contener sólo mutaciones, mutaciones así como
secuencias quiméricas, o secuencias quiméricas en ausencia de otras
mutaciones.
El gen seleccionado mediante un método de
acuerdo con la presente invención es preferiblemente un gen
quimérico con mutaciones adicionales o sin ellas.
Un "gen de interés" hace referencia a
cualquier secuencia de polinucleótidos que manifieste una propiedad
que pueda ser seleccionada o cribada mediante cualquier
procedimiento de cribado o de selección adecuado. La presente
invención también hace uso de al menos un "primer" y un
"segundo" gen de interés.
El término "un" cuando se refiere al primer
o al segundo gen de interés no debería entenderse como que se está
refiriendo exclusivamente a un solo gen. La presente invención
también podría aplicarse de forma exitosa empleando varios moldes
diferentes así como varios genes diana diferentes. Preferiblemente,
todos estos moldes y genes diana representan variantes de un solo
gen. Sin embargo, es preferible utilizar tres, dos o un solo molde
o gen o genes diana, respectivamente.
Obviamente, la relación molar del gen molde en
comparación con los fragmentos de un gen diana influirá en el grado
de quimerización alcanzado. Se recomiendan las relaciones molares
(fragmentos/moldes) de 15 a 1000, pero aún son más preferibles las
relaciones de 10 a 500, de 20 a 400 y de 30 a 300.
El primer y el segundo gen de interés deben ser
homólogos al menos parcialmente para permitir la hibridación
necesaria para el método inventivo. Un experto en la materia no
tendrá problemas a la hora de seleccionar los pares de genes
adecuados para realizar el método de esta invención.
Para obtener una frecuencia de hibridación
apropiada, el molde y el gen diana deben tener una homología de al
menos el 40%. Es preferible que la homología entre los dos genes sea
de al menos el 50%. También es preferible que la homología sea
superior y de al menos el 60% o al menos el 70%. Es aún más
preferible que la homología sea del 80% o más, como se determina en
el método descrito debajo.
La homología entre el primer y el segundo gen de
interés se analiza preferiblemente con el programa PileUp del
paquete GCG, versión 10.2 (Genetics Computer Group, Inc.). PileUp
crea una alineación múltiple de secuencias utilizando una
simplificación del método de alineación progresivo de Feng, D.F., y
Doolittle, R.F., J. Mol. Evol. 25 (1987) 351-360, y
por consiguiente se definen las matrices de puntuación para residuos
de aminoácidos idénticos, similares o diferentes. Este proceso
comienza con el alineamiento por parejas de las dos secuencias más
parecidas y da lugar a un grupo de dos secuencias alineadas. Este
grupo entonces podría alinearse con la siguiente secuencia o grupo
de secuencias alineadas que más coincida. Dos grupos de secuencias
podrían alinearse mediante una extensión simple de la alineación
por parejas de dos secuencias individuales. Se logra la alineación
final mediante series de alineaciones por parejas progresivas que
incluyan cada vez más secuencias y grupos distintos hasta que todas
las secuencias se hayan incluido en la alineación por parejas
final.
Por cuestiones prácticas, la identidad de
secuencia también podría calcularse si se comparan el molde y el
gen diana. En dichas comparaciones los nucleótidos individuales en
sus posiciones de secuencia correspondientes se comparan unos con
otros. La identidad de secuencia es preferiblemente de al menos el
40% para una secuencia parcial de 30 nucleótidos de largo como
mínimo. Aún es más preferible que la identidad de secuencia sea de
al menos el 50% o superior o incluso más preferiblemente de al menos
el 60%.
Muchos genes relacionados entre sí que existen
en la naturaleza desempeñan la misma función en distintos
individuos, así como también en distintas especies. A modo de
ejemplo, la hemoglobina se emplea para transportar el oxígeno en la
sangre. Dentro de la especie humana, a la hemoglobina se la conoce
por presentar variaciones ligeras en su secuencia (conocidas como
alelos), mientras que la hemoglobina en otros mamíferos manifiesta
más diferencias a nivel de secuencia. Por lo tanto, estos genes
representan las variantes que se dan de forma natural en un solo
gen o en un locus génico. Es preferible que tanto el gen molde como
el gen diana representen ambos las variantes de un único gen que
existe de forma natural.
Como observará un experto en la materia,
cualquier combinación de un gen molde o un gen diana será apropiada
siempre y cuando los fragmentos del gen diana hibriden con el gen
molde. Las condiciones de hibridación se pueden variar, por
ejemplo, mediante cambios en las condiciones del tampón. Según la
presente invención, la hibridación se realiza preferentemente en un
tampón que contenga Tris-HCl 0,2 M; MgSO_{4} 0,02
M; KCl 0,1 M; (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,1 M; Triton
X-100 al 1%, y 1 mg de albúmina sérica bovina
(BSA)/ml a pH 8,8. Cualquier pareja de gen molde y gen diana que
produzca un número suficiente de casos de hibridación en la primera
ronda de quimerización en dicho tampón, es apropiada para realizar
el método de quimerización según esta invención.
\newpage
El primer gen de interés se proporciona como una
parte integral de un polinucleótido circular cerrado. Debido a
cuestiones prácticas, al primer gen de interés que contiene un
polinucleótido circular cerrado también se le denominará gen
"molde".
Cualquier tipo de polinucleótido circular (RNA o
DNA) o incluso seudopolinucleótidos circulares que contengan
análogos de nucleótidos como por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos
(PNA) puede utilizarse como un primer polinucleótido. En una
realización beneficiosa y preferible, el primer polinucleótido que
contenga el gen molde es un ácido desoxirribonucleico (DNA). El
polinucleótido circular cerrado es preferiblemente un DNA
bicatenario.
Existen numerosos métodos para clonar un cierto
gen e insertarlo en un sistema de expresión adecuado que no es
necesario citar aquí. Por conveniencia, cabe mencionar que el
experto está bastante familiarizado con estos métodos que se
resumen por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology
Volumen 1-4, editado por Ausubel, F.M., et
al., Massachusetts General Hospital y Harward Medical School por
John Wiley & Sons, Inc.
El gen molde se puede ensanchar fácilmente y al
mismo tiempo desnaturalizar gracias a la transformación de una cepa
huésped adecuada con el plásmido, la inoculación de la cepa
portadora del plásmido durante un periodo de tiempo apropiado y el
aislamiento del plásmido del cultivo celular. El uso de un
polinucleótido circular metilado proporciona una ventaja adicional.
Después de completarse la quimerización mediante un método según la
presente invención, el DNA metilado (o sea, el material inicial)
puede eliminarse fácilmente utilizando enzimas de restricción
específicas que solamente eliminen el DNA metilado. Ya que el molde
inicial es DNA metilado y sólo se producen moléculas de DNA
quimérico o mutado circular sin metilar, el molde inicial se puede
eliminar mediante la utilización de una enzima como la DpnI que sólo
escinde DNA metilado. Por lo tanto, el camino más apropiado para
realizar el método inventivo consiste en la utilización de un DNA
circular cerrado metilado como si fuese el polinucleótido que
contiene el primer gen de interés.
Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos
del primer gen de interés es el polinucleótido completo para este
gen. Sin embargo, como podrá apreciar el experto, este gen se podrá
acortar para representar sólo secuencias parciales de un gen. La
longitud mínima requerida es la de un polinucleótido que manifieste
una actividad o función biológica que se pueda identificar mediante
cualquier método de cribado o selección apropiado.
Por cuestiones prácticas, también utilizamos el
término gen "diana" para referirnos al segundo gen de interés.
El gen diana debe estar disponible en forma bicatenaria y
preferiblemente como DNA bicatenario. Sólo se logra una
amplificación exponencial durante las distintas series de
quimerización si los fragmentos provenientes del gen diana
contienen fragmentos en ambas direcciones de la cadena, tanto en la
hebra codificante como en la hebra antisentido.
El gen o polinucleótido diana no se proporciona
como una molécula continua de longitud completa sino más bien como
una forma fragmentada. Como podrá observar un experto en la materia,
los fragmentos apropiados de un polinucleótido de DNA bicatenario
podrían crearse de varias maneras. Los métodos para proporcionar
fragmentos de un polinucleótido diana bicatenario no son cruciales
siempre y cuando se tenga cuidado de que al menos alguno de los
fragmentos generados entonces sean capaces de hibridar con el primer
gen de interés con el requisito adicional de que los fragmentos
proporcionados deben tener un OH en el extremo 3' y un residuo de
fosfato en el extremo 5', respectivamente. Son más preferibles los
métodos que provocan la fragmentación aleatoria del gen diana.
Los fragmentos aleatorios pueden obtenerse
mediante numerosos métodos que el experto ya conoce. Una posibilidad
podría ser la de amplificar la secuencia de interés de DNA a través
de una PCR y cortar aleatorialmente el producto de la PCR mediante
una endonucleasa dando lugar a fragmentos con los extremos 3'OH y 5'
fosfato requeridos. Por ejemplo, la digestión puede llevarse a cabo
en muy poco tiempo con desoxirribonucleasa I y el grado de
digestión puede monitorizarse sobre gel de agarosa. Una vez que ya
se ha alcanzado el grado de fragmentación deseado, se puede parar
la reacción, por ejemplo, al calentar la muestra a 95ºC durante 5
minutos y así se destruye la nucleasa. La desoxirribonucleasa I
también puede separarse de los fragmentos mediante varios métodos,
es decir, utilizando los equipos de purificación de la reacción en
cadena para la polimerasa (PCR) que están disponibles
comercialmente. Otra posibilidad sería la de utilizar cebadores muy
cortos para una hibridación al azar en una reacción PCR con la
segunda secuencia de interés de DNA como un molde, dando lugar a
productos de PCR de diversas longitudes, y los extremos 5' de los
fragmentos obtenidos así pueden fosforilarse posteriormente con una
quinasa apropiada. Habitualmente deberían emplearse fragmentos con
una longitud de entre 8 y 1000 pares de bases (pb). En una
realización preferida la mayoría (más del 50%) de los fragmentos
utilizados estarán entre las 10 y 300 pb.
Los términos hibridación, elongación y ligación
como se utilizan en la presente invención tienen el significado que
el experto les otorga.
Según la presente invención, el método debe
repetirse de 1 a 100 veces. Mientras que en la primera serie de
quimerización solamente está presente el polinucleótido molde
circular cerrado que contiene el primer gen de interés, en cada uno
de los ciclos siguientes se observará un continuo crecimiento del
número de los polinucleótidos de DNA circulares cerrados quiméricos
o mutados que, según la presente invención, una vez más actuarán
como molde para el siguiente ciclo. Además, el empleo de
polinucleótidos que ya son polinucleótidos quiméricos o mutados
como moldes en las series consecutivas de quimerización, aumentará
el número total de moléculas quiméricas o mutadas diferentes.
\newpage
El método de acuerdo con la presente invención
se ilustra en la Figura 1. En el primer paso, las moléculas de
cadena simple se generan tanto para el polinucleótido molde como
para el polinucleótido diana. En el segundo paso, los fragmentos de
DNA de cadena simple de un gen diana o de una secuencia de interés
se hibridan con un polinucleótido molde que se incorpora en una
molécula de un polinucleótido de cadena simple circular cerrado.
Los fragmentos hibridados se elongan mediante una DNA polimerasa
hasta que la enzima encuentra un fragmento ya unido. La DNA
polimerasa abandona la cadena de DNA dejando una mella entre el
extremo 3'OH elongado de un fragmento y el extremo 5' fosfato de
otro fragmento. La mella o gap cierra mediante la DNA ligasa que
liga la extensión 3'OH con el extremo 5' fosforilado del siguiente
fragmento unido. Como resultado final de dicho ciclo de
quimerización se obtiene un DNA bicatenario que consta de dos
moléculas de DNA circulares cerradas. Es algo obvio para el experto
que el número de fragmentos hibridados determina el grado de
quimerización de las secuencias de interés de DNA. El método según
la presente invención proporciona la ventaja principal de que el
polinucleótido circular cerrado bicatenario obtenido en la primera
serie de quimerización, o más a menudo en una serie previa, puede
utilizarse directamente en una serie de quimerización posterior.
Para realizar una serie de quimerización posterior, la doble cadena
obtenida en la primera serie se desnaturaliza y ambas moléculas de
cadena simple circulares funcionan ahora como un polinucleótido
molde en el siguiente ciclo de quimerización. Se realizan
preferiblemente de dos a cincuenta ciclos de quimerización como los
descritos anteriormente. Esto da lugar a un continuo aumento del
número de recombinaciones que, a su vez, tiene como resultado una
gran diversidad de polinucleótidos quiméricos o mutados. Es más
preferible que se realicen de 15 a 35 ciclos de quimerización.
El método eficaz y práctico de quimerización de
acuerdo con la presente invención puede realizarse fácilmente con
una única mezcla de reactivos que contenga todos los reactantes
necesarios. Los detalles de los reactivos más preferidos se
facilitan más abajo y en la sección de ejemplos. Si es necesario, el
método inventivo también podría realizarse en fases, por ejemplo,
se podrían añadir fragmentos de un polinucleótido diana al comienzo
y, nuevamente, después de un número adecuado de ciclos de
quimerización. Por supuesto sería posible realizar dichas
modificaciones y otras similares dentro del ámbito de la presente
invención.
La quimerización se puede lograr llevando a cabo
una reacción parecida a la PCR que utilice un polinucleótido
circular cerrado que contenga el gen molde y fragmentos del gen
diana en ambas orientaciones como cebadores. Preferiblemente, la
reacción se lleva a cabo a temperaturas muy elevadas. También es
preferible el empleo de una DNA polimerasa termoestable y de una
DNA ligasa también termoestable, como las DNA polimerasas y ligasas
obtenidas a partir de organismos como Pyrococcus furiosus,
Thermus aquaticus, etc. También es preferible y aconsejable
utilizar una DNA polimerasa con actividad reparadora para asegurarse
de que se evitan los errores de polimerización no deseados fuera de
la secuencia de interés del DNA. Esto es también muy beneficioso
para conservar intacto un sistema de expresión.
Como se ha descrito anteriormente, el producto
del ciclo de quimerización funciona como molde para los fragmentos
restantes de la mezcla de reacción y de este modo, el ciclo de
quimerización puede repetirse. Esto significa que en una PCR
normal, se consigue una amplificación exponencial de las secuencias
de DNA quimérico o mutado y además que el número de polinucleótidos
se amplía exponencialmente. La proporción de moldes iniciales
respecto al nuevo DNA generado aumenta a favor de la molécula
quimérica en cada ciclo. Esto también reduce considerablemente el
riesgo o la probabilidad de obtener clones relacionados después de
la transformación de una célula huésped adecuada con los
polinucleótidos quiméricos o mutados.
Un ciclo estándar de quimerización por PCR de
acuerdo con la presente invención emplea, por ejemplo, los
siguientes reactivos: un sistema tamponador en el que actúen tanto
la polimerasa y la ligasa seleccionadas, los dNTP, la polimerasa,
la ligasa, el ATP (u otro cofactor para la ligasa), el molde y los
fragmentos del polinucleótido diana; y consta de los siguientes
pasos: incubación a 72ºC para ligar las mellas no deseadas del molde
circular, 30 segundos a 95ºC para desnaturalizar el DNA bicatenario
en un DNA monocatenario, 1 minuto a 50ºC para hibridar los
fragmentos con el molde, 8 minutos a 72ºC para elongar los
fragmentos mediante una DNA polimerasa, 30 segundos a 95ºC para
eliminar la DNA polimerasa unida del molde, y 8 minutos a 72ºC para
ligar los fragmentos entre sí y eliminar cualquier mella existente.
El ciclo de quimerización se repite preferiblemente de 20 a 25
veces. Finalmente, la mezcla de reacción se enfría a 4ºC.
Ya que el método descrito se basa en el uso de
polinucleótidos circulares cerrados y da como resultado moléculas
molde de DNA quimérico circular cerrado, es evidente que es
conveniente utilizar plásmidos como moléculas molde de DNA circular
cerrado. Dicho plásmido contiene preferiblemente un sistema de
expresión adecuado para una secuencia de DNA o para un gen de
interés. El polinucleótido molde es preferiblemente un plásmido
circular cerrado bicatenario que contenga un origen de replicación,
un promotor para la expresión del gen, un gen de selección y una
primer gen de interés. Como podrá apreciar fácilmente un experto en
la materia, es preferible que solamente se recombine aquella parte
de la secuencia de polinucleótido que contiene el gen de interés y
el resto de la secuencia de DNA, es decir, el sistema de expresión o
la parte del plásmido de la secuencia se deja intacta. En un método
de acuerdo con esta invención también pueden utilizarse dos o más
plásmidos diferentes que contengan una secuencia de interés
de DNA.
de DNA.
Los pasos que habitualmente necesitan otros
métodos ya conocidos en el campo, como por ejemplo, la inserción de
moléculas de DNA quiméricas o mutadas obtenidas recientemente en un
sistema de expresión adecuado, no son necesarios en el caso de que
los polinucleótidos de DNA quiméricos o mutados producidos mediante
un método de acuerdo con esta invención ya estén incorporados en un
sistema de expresión. De este modo se evitan pasos adicionales como
la preparación de vectores, la inserción utilizando enzimas de
restricción y la ligación. Esto hace que el método inventivo sea
mucho más simple y práctico a la hora de utilizarlo.
El resultado de la quimerización PCR, es decir
la PCC, se puede controlar mediante electroforesis en gel de
agarosa. Debería verse un polinucleótido del tamaño deseado
(idéntico al molde) en el gel de agarosa.
Preferiblemente, la presente invención también
hace referencia a un método para obtener una célula huésped
transformada mediante la introducción de un polinucleótido quimérico
o mutado obtenido según un método de acuerdo con la presente
invención en dicho huésped. Se prefieren bacterias como las cepas de
E. coli o Bacillus como cepas huésped. Dichas
transformaciones han resultado ser bastante exitosas y producen
transformantes con un rendimiento elevado.
El DNA circular quimérico o mutado obtenido de
acuerdo con la presente invención puede utilizarse para transformar
posteriormente una célula huésped adecuada sin ningún otro
procedimiento. Como se ha descrito anteriormente, este proceso de
transformación puede incorporar opcionalmente un paso más para
eliminar un polinucleótido molde metilado. Sin embargo, este paso
tampoco necesitará otra purificación. Por tanto, es preferible
utilizar directamente los polinucleótidos quiméricos o mutados
obtenidos en un método de acuerdo con esta invención sin una
purificación previa para transformar una célula huésped.
Naturalmente una célula huésped obtenida
mediante la transformación con un polinucleótido quimérico o mutado
obtenido mediante el método de la presente invención, representa una
realización aún más preferida de la presente invención.
La presente invención también está relacionada
con un método para obtener una biomolécula recombinante, y consta
de los siguientes pasos: obtener un polinucleótido quimérico o
mutado a través de la utilización de un método de acuerdo con la
presente invención; transformar un huésped adecuado con dicho
polinucleótido quimérico o mutado; expresar el gen recombinado; y
realizar un proceso de cribado para dicha biomolécula
recombinante.
Después del aislamiento de los clones
individuales (inoculación y expresión de los productos génicos
quiméricos o mutados) se puede realizar el proceso de cribado con
las nuevas biomoléculas para identificar los clones que contienen
un gen recombinante con la propiedad deseada.
El proceso de cribado podría realizarse para
seleccionar cualquier propiedad. Es preferible que la biomolécula
sea un vector de expresión, y así se seleccionen los vectores de
expresión que den lugar a un rendimiento proteínico superior. Es
más preferible que la biomolécula sea un polipéptido y de este modo
el proceso de selección se basará simplemente en, por ejemplo,
escoger una propiedad deseada de dicho polipéptido. Es más
preferible que dicho polipéptido recombinante sea una enzima. Como
podrá observar un experto en la materia, las diferentes propiedades
enzimáticas se pueden seleccionar fácilmente una vez que el nuevo
polinucleótido (mutado o quimérico) esté disponible y se exprese
como se ha descrito anteriormente.
Como podrá apreciar fácilmente un experto, los
métodos aquí dispuestos son bastante beneficiosos por varias
razones porque, por ejemplo, evitan la necesidad de una reacción de
amplificación por PCR que aún es necesaria en los métodos novedosos
del ámbito, sobretodo para generar moléculas de DNA quiméricas o
mutadas a una frecuencia razonable y sin necesidad de una fase
previa de purificación antes de la transformación. También es
bastante obvio que omitiendo la fase de amplificación por PCR no se
produce la preselección de un polinucleótido quimérico o mutado.
Esto da como resultado una gran diversidad de polinucleótidos
quiméricos o mutados que van a utilizarse para la transformación, y
estos a su vez también dan como resultado una gran diversidad de
variantes genéticas para realizar procesos de cribado y de
selección.
A continuación se proporcionan ejemplos,
referencias, listado de secuencias y figuras que ayudan a comprender
la presente invención, es decir, el verdadero objetivo de lo que se
expone en las reivindicaciones que se adjuntan. Se entiende que se
pueden realizar modificaciones en los procedimientos expuestos sin
desviarse de la esencia de la invención.
Figura
1
En la Figura 1 se muestra que en el método
inventivo se utiliza un polinucleótido circular cerrado bicatenario
que contiene un primer gen de interés (flecha rayada) y fragmentos
derivados de un DNA diana bicatenario (flecha negra). Dichos
polinucleótidos se mezclan con todos los reactivos necesarios y
después se llevan a cabo los pasos de desnaturalización,
hibridación, polimerización y ligación.
\newpage
Figura
2
para hAP y ciAP En la fila superior se muestra
la secuencia de aminoácidos de la fosfatasa alcalina de intestino de
ternera y en la fila inferior la secuencia correspondiente de la
fosfatasa alcalina de placenta humana.
Figura
3
Los resultados de la fragmentación del DNA diana
con desoxirribonucleasa I según el Ejemplo 1, se muestran en la
Figura 3.
Figura
4
Se aplicaron 5 \mul de muestra, obtenida como
se ha descrito en el Ejemplo 1, en un gel de agarosa al 1%. Después
de la electroforesis, las bandas de DNA se tiñeron con bromuro de
etidio. Se muestran las bandas teñidas.
Los genes de la ciAP y la hpAP manifiestan una
homología aproximadamente del 80% (véase Id. de Sec. núm.: 1 y 3
respectivamente). Se muestran ambas secuencias de aminoácidos en la
Figura 2 y en la Id. de Sec. núm.: 2 y 4 respectivamente. La
distribución de las áreas homólogas y heterólogas es casi al azar
sobre el gen completo, y de esta forma hace que sea más fácil
controlar el grado de quimerización de ambos genes.
Se clonaron los dos genes en el plásmido pkk 177
con un gen de resistencia a la ampicilina bajo el control de un
promotor pmgI (véase la solicitud de patente WO 88/09373) y se
utilizaron para transformar la cepa E. coli
XL-blue-MRF'.
Para el experimento que viene a continuación se
utilizó hpAP como primer gen de interés.
Los fragmentos al azar del gen diana se
generaron a partir de un gen de la ciAP.
La cepa E. coli que transporta el
plásmido con el gen hpAP se inoculó durante la noche a 37ºC. El
plásmido se aisló mediante un equipo Roche High Pure Plasmid
Isolation Kit Id. 1754777 y la concentración se determinó con luz
ultravioleta a 260 nm. Se preparó una solución de 5 ng de DNA/\mul
de agua.
Se preparó una solución acuosa que contenía el
plásmido que transporta el gen de la ciAP, utilizando el mismo
método que se aplicó para el gen molde. Se amplificó el gen de la
ciAP a través de una PCR empleando cebadores adecuados (véase Id.
de Sec. núm.: 5 y 6 respectivamente).
El producto de la PCR resultante se purificó con
la utilización de un equipo de purificación de PCR de Roche (Roche
PCR purification Kit) y se determinó la concentración de DNA.
El gen de la ciAP se sometió a una digestión con
desoxirribonucleasa I. Se realizó la siguiente manera
preparación:
30 \mul de ciAP (100 ng de DNA/\mul de
agua)
1,5 \mul de desoxirribonucleasa I (0,1
U/\mul; Roche Cat. núm. 776785 diluido con 1 x Puffer Cat. núm.
1417991)
8 \mul de tampón (10 x Puffer Cat. núm.
1417991)
40,5 \mul de agua.
\newpage
Después de 10 minutos de incubación a
temperatura ambiente, la preparación se congeló rápidamente sobre
hielo seco para parar la digestión con desoxirribonucleasa I. Se
analizaron 5 \mul de muestra sobre un gel de agarosa al 1% para
controlar la digestión (véase la Figura 3). La nube de fragmentos
demostró que la mayoría de ellos tenían un tamaño de unas 50 pb. La
desoxirribonucleasa I se inactivó mediante el calentamiento de la
preparación restante a 95ºC durante 10 minutos. El DNA se purificó
gracias al equipo de purificación para PCR de Roche (Roche PCR
purification Kit) y la concentración de DNA se determinó a 260
nm.
2,5 U/\mul de polimerasa Pfu de Stratagene
Cat. núm. 600252
10 x de tampón de polimerasa Pfu de Stratagene
Cat. núm. 600252
4 U/\mul de ligasa Pfu de Stratagene Cat. núm.
600191
dNTP 40 mM = dATP 10 mM, dCTP 10 mM, dTTP 10 mM,
dGTP 10 mM
5 \muM/\mul de ATP de Roche Cat. núm.
1140965
Programa de temperatura:
- a)
- 10 minutos a 72ºC
- b)
- 30 segundos a 95ºC
- c)
- 1 minuto a 55ºC
- d)
- 8 minutos a 72ºC
- e)
- 30 segundos a 95ºC
- f)
- 8 minutos a 72ºC
- g)
- repetir unas 20 veces los pasos del a) al f)
- h)
- 4ºC.
\newpage
Después del termociclado se aplicaron 5 \mul
de los productos de la PCR-PCC en un gel de agarosa
al 1% (véase la Figura 4).
Resultados: La muestra de PCC presenta una banda
que contiene el tamaño deseado, mientras que el control negativo no
muestra ninguna.
La transformación se realizó mediante una
electroporación de ambas muestras de PCC y de control negativo
respectivamente en la cepa E. coli XL-MRF'
(Stratagene Cat. núm. 200158). Más tarde se depositaron 100 \mul
de la preparación de la PCC y 1 ml del control negativo sobre una
placa de agar LB que contenía 100 \mul/ml de ampicilina. Las
células se incubaron durante la noche a 37ºC.
Los resultados de este experimento de
transformación según el número de clones aparecidos se proporcionan
en la siguiente tabla:
Se cogieron 20 clones escogidos al azar de la
placa de la muestra de la PCC y se inocularon de forma individual
en un medio LB/Amp durante toda la noche a una temperatura de 37ºC.
Los plásmidos de las 20 muestras se aislaron utilizando un equipo
Roche High Pure Plasmid Isolation Kit Id. 1754777 y se secuenciaron
mediante un equipo ABI Prism Dye Terminador Sequencing Kit y
secuenciadores ABI 3/73 y ABI 3/77 (Amersham Pharmacia Biotech).
Los cebadores de secuencias que se han utilizado estaban todos
basados en el gen de la ciAP (véanse las Id. de Sec. núm.: 5, 7, 8 y
9 respectivamente).
La actividad de la AP se determinó de la
siguiente manera: Se mezclaron 90 \mul de suspensión de célula
del cultivo de la noche con 10 \mul de B-PER
(Bacterial Protein Extraction Reagent, Pierce Cat. núm. 78248) para
trastornar las células. Además se añadieron 50 \mul de esta mezcla
a 90 \mul de reactivo (Roche Cat. núm. 2173107). La AP activa
libera p-nitrofenol que puede controlarse a través
de un fotómetro a 405 nm. Se empleó como control negativo una
suspensión de células en una cepa de E. coli
XL-MRF' sin el plásmido de la ciAP o la hpAP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
En la siguiente tabla se muestran los resultados
de actividad de la AP y el análisis de los clones correspondientes
mediante secuenciación:
Cabe destacar que la hpAP es el molde inicial.
Los números hacen referencia a las posiciones de los aminoácidos en
la enzima AP. Expresiones como, por ejemplo, V69A significan que un
aminoácido cambia en la posición 69 de valina (V) a alanina (A). La
alineación de las secuencias sobre en función de los aminoácidos
puede observarse en la Figura 2.
Los datos que se observan más arriba, muestran
que la quimerización se da en casi cualquier nivel deseado. El
espectro de mutantes oscila desde no tener ningún tipo de mezcla
génica (hpAP) hasta un reensamblaje completo del gen la de ciAP
fragmentado.
De los 20 clones aislados, el 50% presentaron
actividad fosfatasa alcalina, también incluyendo mutantes con
mezcla de DNA. De hecho, el clon con mayor actividad (núm. 12) es
una quimera. Además de la quimerización, se observaron mutaciones
puntuales, inserciones y deleciones de modo que se amplía el grupo
de nuevos polinucleótidos sobre los que se puede realizar la
selección de nuevas propiedades o de propiedades mejoradas.
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\vskip0.400000\baselineskip
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polinucleótidos quiméricos o mutados circulares
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22312 EP1
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP03027838.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2004-12-04
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión de la patente 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1533)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codificación de la secuencia de DNA
para la fosfatasa alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1527
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1527)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codificación de la secuencia de DNA
para la fosfatasa alcalina de placenta humana (hpAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 507
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de la fosfatasa
alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcggcgtt cagtaacacg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos Taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de la fosfatasa
alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctagatt atcagtcggg gatg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos Taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de la fosfatasa
alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtcacgtct gtgatcaacc g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Bos Taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de la fosfatasa
alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggttgatca cagacgtgac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Bos Taurus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de la fosfatasa
alcalina de intestino de ternera (ciAP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctttcgagg tgaatttcga cc
\hfill22
Claims (7)
1. Un método para generar polinucleótidos
quiméricos o mutados que consta de los siguientes pasos:
a) proporcionar un polinucleótido molde circular
cerrado que contenga un primer gen de interés,
b) proporcionar fragmentos de un polinucleótido
diana de DNA bicatenario proveniente de un segundo gen de interés
capaz de hibridar con el primer gen de interés, y que dichos
fragmentos tengan extremos 3'OH libres y extremos 5'
fosforilados,
c) generar cadenas simples de dichos
polinucleótidos molde y de los mencionados fragmentos de
polinucleótido diana,
d) hibridar dichos fragmentos del polinucleótido
diana con los ya mencionados polinucleótidos molde,
e) elongar los fragmentos hibridados del
polinucleótido diana a través de una DNA polimerasa,
f) ligar las mellas entre los fragmentos
elongados mediante la utilización de una DNA ligasa, y de este modo
crear una molécula de DNA circular de longitud completa quimérica,
y
g) utilizar el producto obtenido en f) y repetir
los pasos del c) al f) de 1 a 100 veces.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
donde se emplean una DNA polimerasa termoestable y una DNA ligasa
termoestable.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, donde el gen de interés contenido en dicho polinucleótido
molde y el gen de interés contenido en dicho polinucleótido diana
son variantes de un solo gen.
4. El método de acuerdo con las reivindicaciones
de la 1 a la 3, donde un polinucleótido molde o un polinucleótido
diana contienen dos o más variantes de un gen de interés.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 4, donde dicho polinucleótido molde
es un plásmido circular cerrado bicatenario que contiene un origen
de replicación, un promotor para la expresión génica, un gen de
selección y un primer gen de interés.
6. Un método para obtener una biomolécula
recombinante que consta de los siguientes pasos:
a) obtener un polinucleótido quimérico o mutado
mediante el empleo de un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 5,
b) utilizar dicho polinucleótido quimérico o
mutado para transformar un huésped apropiado,
c) expresar el gen recombinado, y
d) realizar un proceso de cribado para dicha
molécula recombinante.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 6,
donde dicha biomolécula es una enzima.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| EP03027838 | 2003-12-04 | ||
| EP03027838 | 2003-12-04 |
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| ES04028520T Active ES2280891T3 (es) | 2003-12-04 | 2004-12-02 | Metodo para obtener polinucleotidos circulares mutados y/o quimericos. |
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