ES2223613T3 - Metodo para la produccion de biopolimeros con propiedades modificadas. - Google Patents

Metodo para la produccion de biopolimeros con propiedades modificadas.

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ES2223613T3 ES00977514T ES00977514T ES2223613T3 ES 2223613 T3 ES2223613 T3 ES 2223613T3 ES 00977514 T ES00977514 T ES 00977514T ES 00977514 T ES00977514 T ES 00977514T ES 2223613 T3 ES2223613 T3 ES 2223613T3
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Manfred Eigen
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Abstract

Un método para la producción de moléculas polinucleotídicas con propiedades modificadas, en el que se completa al menos un ciclo que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias, en la que los polinucleótidos individuales de dicha población tienen segmentos de la secuencia homólogos y heterólogos, y en la que la población también contiene cadenas que son completa o parcialmente complementarias con estas cadenas monocatenarias; (b) la formación de moléculas polinucleotídicas bicatenarias de la población de las moléculas polinucleotídicas monocatenarias proporcionada según la etapa (a), que comprenden cadenas bicatenarias con diferentes segmentos de la secuencias heterólogos; (c) la degradación monocatenaria exonucleolítica parcial de las moléculas polinucleotídicas bicatenarias producidas según la etapa (b); y (d) la extensión dirigida por moldes de los extremos degradados de la cadena bicatenaria parcialmente degradada producida según la etapa (c), en el que las etapas (c) y (d) pueden realizarse posterior o contemporáneamente.

Description

Método para la producción de biopolímeros con propiedades modificadas.
La presente invención se refiere a un método para la producción de moléculas polinucleotídicas con propiedades modificadas.
Las biomoléculas (y, en particular, los biopolímeros como polinucleótidos, polipéptidos, polisacáridos, etc.) no sólo son la base de la vida biológica conocida, sino que también se utilizan cada vez más en los más variados campos técnicos de aplicación. La búsqueda de nuevas biomoléculas funcionales, su aislamiento o producción, así como su aplicación técnica es la materia de la biotecnología moderna. Además del descubrimiento fortuito de biomoléculas no conocidas hasta la fecha en la naturaleza que muestran propiedades deseadas (cfr. selección de sustancias naturales), en fechas recientes has surgido métodos que imitan los principios de la evolución natural en el laboratorio y, por tanto, generan biomoléculas completamente nuevas con propiedades específicas (documento WO 92/18645; Eigen y Rigler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994), 5740; Koltermann y Kettling, Biophys. Chem., 66 (1997), 159; Kettling et al., Current Topics in Microbiol. & Immunol., 243 (1999), 173). Esta denominada biotecnología evolutiva o evolución molecular dirigida toma los descubrimientos de las investigaciones evolutivas teóricas y prácticas realizadas a lo largo de muchos años y los aplica a la evolución dirigida de biomoléculas.
En términos muy sencillos, la evolución dirigida de las funciones moleculares se realiza mediante la interacción eficaz de los procesos de variación y selección que actúan sobre poblaciones de moléculas. Mientras que la variación surge del contenido en información de una biomolécula, la selección tiene lugar por medio del fenotipo molecular. La información de una molécula polinucleotídica (genotipo) indica el orden secuencial de los diversos monómeros en una molécula polinucleotídica. El fenotipo de una molécula polinucleotídica indica la suma de las funciones y propiedades de una molécula polinucleotídica y de los productos de la transcripción o traducción codificados por un polinucleótido. La unión de la información de la secuencia y del fenotipo seleccionable puede lograrse mediante selección unida a amplificación (Kettling, tesis doctoral, Göttingen/TU Braunschweig (1999)), mediante compartimentalización y análisis funcional, denominado selección (documento WO 92/18645; documento WO 99/34195), o mediante enlace físico del genotipo y fenotipo, así como su selección (documento DE 19646372; documento US 5.849.545; documento DE-A1 4305651).
El tipo de interacción entre los procesos de variación y selección es crucial para el éxito de las estrategias de evolución dirigida. En la naturaleza, al igual que en el laboratorio, el principio de cuasiespecie ha demostrado ser la estrategia con mayor éxito (medida mediante el tiempo que se necesita para lograr una generación evolutiva y la optimización de las funciones moleculares). Una cuasiespecie indica una población dinámica de variantes de moléculas relacionadas (mutantes) que surgen de la replicación errónea. Puede demostrarse que (correspondiente al principio de cuasiespecie) no es el tipo salvaje (centro de la cuasiespecie) sino la distribución completa lo que es objeto de la selección. Bajo condiciones de selección modificadas, los variantes ventajosos ya están presentes en esta distribución de mutantes, correspondientes a su valor de adaptación, y no tienen que formarse por posteriores mutaciones aleatorias. Si los parámetros de selección se cambian, la generación evolutiva parece una deriva dirigida de modo implícito de la cuasiespecie a lo largo de los bordes del paisaje de adaptación. La producción de la cuasiespecie y la aplicación de este principio en la biotecnología evolutiva se describe en el documento WO 92/18645.
La base para la producción de una cuasiespecie es una replicación errónea de los variantes de moléculas. Cuando se utilizan polinucleótidos, la replicación se realiza preferiblemente mediante enzimas de replicación, es decir, polimerasas que hacen posible la síntesis dirigida por moldes de una molécula polinucleotídica. La introducción de errores, es decir, la variación en la información de la molécula, puede lograrse mediante el proceso de copiado por sí solo, inherentemente erróneo, pero también mediante el aumento intencionado de la incorrección de la polimerasa (por ejemplo, la adición definida de monómeros no equilibrada, la adición de análogos de bases, PCR errónea, polimerasas con una proporción de error muy alta), mediante la modificación química de los polinucleótidos después de la síntesis, mediante la síntesis completa de polinucleótidos bajo una aplicación al menos parcial de mezclas de monómeros y/o de análogos de nucleótidos, así como mediante una combinación de estos
métodos.
Aparte de estos métodos para crear mutaciones puntuales (en forma de intercambios, deleciones e inserciones de bases), la recombinación de partes de la secuencia en la naturaleza es una estrategia muy exitosa para combinar mutaciones puntuales, pero también para combinar dominios dentro de un polímero, para combinar subunidades de un heteromultímero, o para combinar variantes de genes dentro de una agrupación génica o un genoma. La recombinación homóloga, en particular, es decir, la combinación de las correspondientes partes de la secuencia de diferentes variantes pero manteniendo la orientación y los marcos de lectura, desempeña un papel importante, puesto que puede evitarse el ruido de fondo de secuencias no relacionadas que acompañan a una recombinación inespecífica. Según el principio de cuasiespecie, la recombinación homóloga es un medio intencionado para expandir la distribución de la secuencia. Diversas subdistribuciones relacionadas de una cuasiespecie, que se originan a partir del paisaje de adaptación subyaciente, pero que tienen un grado relativo tan bajo de relación que su convergencia a lo largo de los bordes del paisaje de adaptación es muy improbable sin recombinación, pueden expandirse enormemente mediante recombinación homóloga. Con ello, surge un método evolutivo que, por contraste con las introducción de mutaciones en serie, conduce a la multiplicación de la velocidad experimental. Además, una aplicación controlada tecnológicamente de la recombinación homóloga, en principio, también permite la fusión de las distribuciones de las cuasiespecies que se generaron bajo diferentes presiones de selección y, por tanto, la fusión de funciones moleculares seleccionadas por separado.
En los experimentos, la recombinación puede llevarse a cabo de diferentes modos: por un lado, in vitro utilizando funciones enzimáticas individuales o mezclas o secuencias definidas de las etapas del procesamiento enzimático, y por otro lado, in vivo utilizando la recombinación celular y/o procesos de reparación.
Para los métodos in vitro se han utilizando principalmente en la técnica, hasta la fecha, los métodos basados en PCR. En primer lugar se puede mencionar la barajadura de DNA, también denominada PCR sexual (documento WO 95/22625; Stemmer, Nature, 370 (1994), 389). En este método se proporciona cualquier fragmento de genes solapantes y posteriormente se juntan para formar productos de la longitud original mediante una PCR sin la adición de un cebador. Por tanto, el cebado mutuo de los fragmentos en cada ciclo de PCR permite que los fragmentos de origen diferente se unan incidentemente para formar una molécula producto de una forma homóloga. Ajustando la longitud del fragmento, la barajadura de DNA hace posible, al menos en principio, limitar la frecuencia de los acontecimientos de recombinación. Otro método basado en la PCR es el método de la PCR que utiliza cebadores aleatorios (documento WO 98/42728; Shao et al., Nucl. Acids Res., 26 (1998), 681). En este método, se utilizan cebadores con secuencias aleatorizadas que permiten un inicio de la polimerización en posiciones aleatorias dentro de un polinucleótido. Por tanto, de modo similar a la barajadura de DNA, se forman fragmentos polinucleotídicos cortos que pueden recombinarse entre sí mediante cebado mutuo. Con este método apenas es posible controlar la frecuencia de recombinación. Además, los cebadores inespecíficos conducen a una proporción de error inherente comparativamente elevada, que puede constituir un problema con partes de la secuencia sensibles y/o genes largos. Como alternativa a estos métodos, el proceso de extensión escalonado (documento WO 98/42728; Zhao et al., Nat. Biotechnol., 16 (1998), 258) utiliza un protocolo de PCR modificado para provocar que se produzca un intercambio de cadenas durante la amplificación de la PCR. Utilizando fases muy cortas en la temperatura de polimerización entre la fase de disolución y reasociación, se permite que los productos formados de modo incompleto se hibriden con nuevos moldes y puedan prolongarse más. El ajuste de la frecuencia de recombinación puede tener lugar ajustando el tiempo de polimerización y el número de ciclos. Sin embargo, un límite técnico es el ajuste exacto de fases muy cortas a cierta temperatura. Como alternativa a este método basado en PCR, se ha descrito un método que produce heterodúplex a partir de una población de secuencias polinucleotídicas con mutaciones, que entonces se someten a una reparación estadística in vivo mediante la introducción en células, o in vitro mediante la incubación con un extracto celular, conduciendo, hasta cierto grado, a la formación de variaciones de moléculas recombinantes dependiendo de la frecuencia relativa de los variantes en la población inicial (WO 99/29902). Una característica de este método es el uso de sistemas de reparación celulares que reconocen, de forma específica, las bases desapareadas y reparan, de modo estadístico, una de las dos cadenas de la doble cadena. Este método está restringido, por una parte, por la limitada eficacia para introducir polinucleótidos en las células y, por otra parte, por la falta de control del proceso de reparación.
Por tanto, el problema técnico subyaciente a la presente invención es proporcionar un método para la producción de polinucleótidos con propiedades modificadas que evite las desventajas, mencionadas anteriormente, de los métodos conocidos, y que haga posible una nueva combinación eficaz de genotipos de una cuasiespecie de moléculas polinucleotídicas, que entonces conduce a la formación de fenotipos modificados. En especial, el problema técnico es proporcionar un método de recombinación homóloga in vitro que combine un control preciso del número de acontecimientos de recombinación, con la posibilidad de una recombinación regioselectiva.
Este problema técnico se ha resuelto proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Por tanto, la presente invención se refiere a un método para la producción de moléculas polinucleotídicas con propiedades modificadas, en el que se completa al menos un ciclo que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias, en la que las moléculas polinucleotídicas individuales de dicha población tienen al menos un segmento de la secuencia homólogo y al menos dos segmentos de la secuencia heterólogos, y en la que la población también contiene cadenas que son completa o parcialmente complementarias con estas cadenas monocatenarias;
(b) la formación de moléculas polinucleotídicas bicatenarias de la población de las moléculas polinucleotídicas monocatenarias proporcionada según la etapa (a), que comprenden cadenas bicatenarias con diferentes segmentos de la secuencias heterólogos (heterodúplex);
(c) la degradación monocatenaria exonucleolítica parcial de las moléculas polinucleotídicas bicatenarias producidas según la etapa (b); y
(d) la extensión dirigida por moldes de los extremos degradados de la cadena bicatenaria parcialmente degradada producida según la etapa (c),
en el que las etapas (c) y (d) pueden realizarse posterior o contemporáneamente.
La figura 1 muestra, de forma esquemática, una de las posibles variaciones del método que se describirá a continuación.
Dependiendo de los requerimientos, el método de la invención permite una nueva combinación fortuita y controlada de segmentos de la secuencia heterólogos. El principio de una degradación de polinucleótidos monocatenarios secuencial parcial definida de polinucleótidos heterodúplex bicatenarios y la posterior polimerización semiconservativa de los polinucleótidos monocatenarios permite (además de una recombinación completa) también una recombinación regioselectiva de los segmentos de la secuencia heterólogos. Además, la frecuencia de la recombinación es alta y puede ajustarse de modo preciso mediante el número de ciclos. Este control de la frecuencia de la recombinación puede lograrse también, en parte, mediante los métodos descritos anteriormente de barajadura de DNA y proceso de extensión escalonado. El cebado aleatorio no ofrece esta posibilidad, el sistema de reparación apenas la ofrece. Al igual que el cebado aleatorio, el proceso de extensión escalonada tiene la desventaja de tener un fondo de polinucleótidos de partida no recombinados, puesto que ambos métodos están basados en la amplificación de estos polinucleótidos de partida. Aunque la barajadura de DNA tiene un fondo reducido de polinucleótidos de partida, esto se logra mediante la fragmentación de las secuencias de partida, y este proceso requiere experimentos muy sofisticados. Además, como cebado aleatorio y sistema de reparación, no ofrece ninguna posibilidad de una recombinación regioselectiva. Por tanto, el método de la invención se caracteriza por una combinación de ventajas que no pueden lograrse con ninguno de los métodos descritos hasta ahora (cfr. tabla 1). Otras ventajas del método son el hecho de que supone experimentos menos sofisticados y menos tiempo, y ofrece la posibilidad de ser automático.
TABLA 1 Comparación de diversos métodos de recombinación in vitro
2
Las realizaciones A y B se definen a continuación.
Los productos resultantes de cada ciclo individual según el método de la invención son polinucleótidos monocatenarios semiconservativos, puesto que (dependiendo de la realización) se mantuvo un segmento de la secuencia más corto o más largo en el extremo 3' ó 5', mientras que el resto de la secuencia se sintetizó de nuevo en el extremo 3' ó 5'.
En una realización preferida, se completa más de un ciclo que comprende las etapas (a) a (d) mencionadas anteriormente, es decir, al menos dos, preferiblemente al menos cinco, más preferiblemente al menos diez, y lo más preferible al menos veinte.
La aplicación cíclica del método de la invención hace posible generar polinucleótidos con múltiples segmentos de la secuencia recién combinados, a partir de una agrupación de partida de secuencias polinucleotídicas relacionadas. En particular, la aplicación cíclica hace posible combinar varios segmentos de la secuencia heterólogos entre sí. Además, es posible controlar con exactitud la frecuencia de recombinación para cada cadena polinucleotídica mediante el número de ciclos. Con la aplicación cíclica, también puede controlarse la distancia media entre las nuevas combinaciones de un ciclo al siguiente.
En una realización preferida, la longitud de la degradación de la degradación exonucleolítica según la etapa (c) del método de la invención se hace más corta cuando aumenta el número de ciclos. Esto permite una nueva combinación de la región entera de la secuencia de los polinucleótidos proporcionados según la etapa (a).
En una realización particularmente preferida del método de la invención, la regioselectividad de la combinación de cadenas recién sintetizadas y parcialmente degradadas se regula mediante el control de la degradación monocatenaria exonucleolítica parcial, según la etapa (c) del método.
En otra realización preferida, se realiza una etapa de selección después de uno, varios o todos los ciclos del método de la invención. Esta etapa de selección puede relacionarse con el genotipo o con el fenotipo o con ambos genotipo y fenotipo del polinucleótido.
En este caso, el genotipo de un polinucleótido es el orden secuencial de los diferentes monómeros en el polinucleótido. El fenotipo es la suma de funciones y propiedades de una molécula polinucleotídica y de los productos de la transcripción o traducción codificados por un polinucleótido.
La etapa de selección puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante selección acoplada a amplificación (natural), selección mediante separación física o selección mediante selección (Koltermann y Kettling, Biophys. Chem., 66 (1997), 159; Kettling et al., Current Topics in Microbiol. and Immunol., 243 (1999), 173).
La población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias proporcionada según la etapa (a) del método de la invención puede ser cualquier población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias que comprende al menos dos tipos de moléculas polinucleotídicas, en el que éstas comprenden al menos un segmento de la secuencia homólogo y al menos dos segmentos de la secuencia heterólogos. La expresión "población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias" significa un intervalo de moléculas polinucleotídicas, en el que se evitan o no existen las interacciones intermoleculares en forma de apareamiento de bases específicas entre las moléculas. El término "polinucleótido" (ácidos nucleicos, oligonucleótidos) incluye DNA y RNA. Los polinucleótidos son heteropolímeros lineales orientados (dirección 5'-3') que pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En la cadena bicatenaria, dos cadenas monocatenarias están unidas mediante interacciones en forma de apareamiento de bases específicas. En principio, los polinucleótidos también pueden ser DNA o RNA con monómeros modificados. En general, el método también puede utilizarse para polímeros artificiales construidos de forma similar.
La expresión "segmentos homólogos" indica segmentos que son idénticos o complementarios en una o más moléculas polinucleotídicas, es decir, que tienen la misma información en la posición correspondiente.
La expresión "segmentos heterólogos" significa segmentos que no son idénticos o complementarios en dos o más moléculas polinucleotídicas, es decir, que tienen diferente información en la posición correspondiente. La información de una molécula polinucleotídica (genotipo) es el orden secuencial de los diversos monómeros en una molécula polinucleotídica. Un segmento de la secuencia heterólogo tiene una longitud de al menos un nucleótido, aunque sin embargo puede ser mucho más largo. En particular, un segmento de la secuencia heterólogo puede tener una longitud de dos nucleótidos o tres nucleótidos, por ejemplo, un codón, y preferiblemente de más de 5 nucleótidos, más preferiblemente de más de 10 nucleótidos. En principio, no existe un límite superior con relación a la longitud del segmento heterólogo. No obstante, la longitud del segmento heterólogo no debe ser mayor que 10.000 nucleótidos, preferiblemente no debe ser más largo de 5.000 nucleótidos, más preferiblemente no mayor de 2.000 nucleótidos, y lo más preferible no más largo de 1.000 nucleótidos. Estos segmentos de la secuencia más largos pueden, por ejemplo, ser las regiones hipervariables de una secuencia que codifica un anticuerpo, los dominios de una proteína, los genes en una agrupación de genes, regiones de un genoma, etc. Preferiblemente, los segmentos heterólogos son segmentos de la secuencia en los que las moléculas polinucleotídicas se diferencian en bases individuales. Sin embargo, los segmentos heterólogos también pueden basarse en el hecho de que una deleción, duplicación, inserción, inversión, adición o similares están presentes o se han producido en una molécula polinucleotídica.
Según la invención, las moléculas polinucleotídicas proporcionadas según la etapa (a) del método de la invención tienen al menos un segmento de la secuencia homólogo y al menos dos segmentos de la secuencia heterólogos. Sin embargo, preferiblemente tienen una pluralidad de segmentos homólogos y heterólogos. En principio, no existe un límite superior para el número de segmentos homólogos y heterólogos.
Los segmentos heterólogos en las moléculas polinucleotídicas monocatenarias están cada uno interrumpidos por segmentos homólogos. Los segmentos homólogos preferiblemente tienen una longitud de al menos 5, más preferiblemente al menos 10 y lo más preferible al menos 20 nucleótidos. Al igual que los segmentos heterólogos, los segmentos homólogos, también, pueden ser mucho más largos y, en principio, no existe un límite superior a su longitud. Preferiblemente, su longitud no debe exceder de 50.000 nucleótidos, más preferiblemente no deben ser más largos de 20.000 nucleótidos, incluso más preferiblemente no ser más largos de 10.000 nucleótidos, y lo más preferible no más largos de 1.000 nucleótidos.
La población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias también contiene cadenas que son total o parcialmente complementarias con las cadenas monocatenarias. El término "complementario" indica segmentos en dos o más moléculas polinucleotídicas que, debido a su información, pueden conducir a la formación de cadenas bicatenarias restringidas a estos segmentos mediante una interacción en forma de apareamientos de bases específicas.
La formación de moléculas polinucleotídicas monocatenarias según la etapa (a) del método de la invención puede realizarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, métodos físicos, químicos, bioquímicos y biológicos. Los ejemplos de éstos incluyen la disolución de cadenas bicatenarias polinucleotídicas mediante calentamiento a unas temperaturas mayores que la temperatura de reasociación (Newton, en: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994); Lazurkin, Biopolymers, 9 (1970), 1253-1306); la desnaturalización de cadenas bicatenarias polinucleotídicas mediante la adición de agentes de desnaturalización (urea, detergentes, etc.); la adición de enzimas que convierten los polinucleótidos bicatenarios en polinucleótidos monocatenarios, por ejemplo, mediante la degradación exonucleolítica de DNA bicatenario para producir DNA monocatenario, o mediante la síntesis de RNA monocatenario utilizando una RNA-polimerasa dependiente de DNA con o sin transcriptasa inversa; la PCR asimétrica (Newton, en: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994)), en la que preferiblemente una de las dos cadenas producto se forma utilizando un exceso de uno de los dos cebadores; la adición de proteínas o enzimas que desenrollan las moléculas de DNA bicatenario (girasas, etc.) y otras proteínas u otros agentes que estabilizan las moléculas de DNA monocatenario en desarrollo (proteína de unión monocatenaria, dendrímeros, etc.) y la inserción de la secuencia en el genoma de virus monocatenarios (M13, fd, etc.) y la posterior purificación del genoma polinucleotídico monocatenario (Trower, Methods in Mol. Biol., 58 (1996), 363-366; Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987); Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Los expertos en la técnica estarán familiarizados con otros métodos, como la síntesis química de moléculas polinucleotídicas monocatenarias.
En una realización particularmente preferida del método de la invención se utilizan secuencias polinucleotídicas relacionadas de la distribución de mutantes de una cuasiespecie para proporcionar una población de polinucleótidos monocatenarios con segmentos homólogos y heterólogos (etapa (a), figura 1). En este contexto, el término "relacionado" significa polinucleótidos que tienen segmentos homólogos y heterólogos entre ellos.
Una cuasiespecie es una población dinámica de variantes de moléculas relacionadas (mutantes) que se forma mediante una replicación defectuosa. Puede demostrarse que, correspondiente al principio de cuasiespecie, no es el tipo salvaje (centro de la cuasiespecie), sino la distribución completa lo que es objeto de la selección. Bajo condiciones de selección modificadas, los variantes ventajosos en esta distribución de mutantes ya están contenidos, según su valor de adaptación, y no deben ser formados por posteriores mutaciones aleatorias. Si los parámetros de selección se cambian sucesivamente, la generación evolutiva parece una deriva dirigida de modo implícito de la cuasiespecie a lo largo de los bordes del paisaje de adaptación. La producción de la cuasiespecie y la aplicación de este principio en la biotecnología evolutiva se describe en el documento WO 92/18645.
La base para la producción de una cuasiespecie es una replicación errónea de los variantes de moléculas. Cuando se utilizan polinucleótidos, la replicación se realiza preferiblemente mediante enzimas de replicación, es decir, polimerasas que hacen posible la síntesis dirigida por moldes de una molécula polinucleotídica. La introducción de errores, es decir, la variación en la información de la molécula, puede lograrse mediante el proceso de copiado por sí solo, inherentemente erróneo, pero también mediante el aumento intencionado de la incorrección de la polimerasa (por ejemplo, la adición definida de monómeros no equilibrada, la adición de análogos de bases, PCR errónea, polimerasas con una proporción de error muy alta), mediante la modificación química de los polinucleótidos después de la síntesis, mediante la síntesis completa de polinucleótidos bajo una aplicación al menos parcial de mezclas de monómeros y/o de análogos de nucleótidos, así como mediante una combinación de estos métodos.
Preferiblemente, se utilizan distribuciones de mutantes de una cuasiespecie, estando los mutantes individuales de la cuasiespecie ya mejorados en sus propiedades fenotípicas de una función molecular deseada, en comparación con el tipo salvaje. La expresión "fenotipo de una molécula polinucleotídica" indica la suma de funciones y propiedades de una molécula polinucleotídica y de los productos de la transcripción o traducción codificados por un polinucleótido.
Además, pueden utilizarse secuencias de origen diverso, entre otras, secuencias polinucleotídicas de una familia génica de una especie diferente, secuencias polinucleotídicas que se han replicado in vivo (por ejemplo, mediante virus, mediante bacterias mutágenas, mediante bacterias bajo irradiación de UV, etc.) o in vitro (por ejemplo, mediante una reacción de Q\beta-replicasa, PCR defectuosa, etc.) con una proporción particularmente elevada de error, secuencias polinucleotídicas en las que, después de la síntesis, se han insertado mutaciones mediante agentes químicos o que se han sintetizado de modo químico de tal manera que muestran segmentos homólogos y heterólogos, o secuencias polinucleotídicas que se han producido combinando las técnicas mencionadas.
En principio, los polinucleótidos utilizados en el método de la invención pueden ser cualquier polinucleótido, en particular moléculas de DNA o RNA. En especial, en la etapa (b) del método, también pueden producirse cadenas bicatenarias que consisten en cadenas de DNA y RNA (híbridos de DNA/RNA).
La producción de polinucleótidos heterodúplex bicatenarios (heterodúplex) según la etapa (b) del método de la invención se logra preferiblemente mediante la hibridación de los segmentos homólogos de los polinucleótidos monocatenarios complementarios (Newton, en: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994).
El término "heterodúplex" significa polinucleótidos bicatenarios con al menos un segmento homólogo y al menos un segmento heterólogo. Utilizando una población de secuencias polinucleotídicas con segmentos heterólogos se forman heterodúplex con una probabilidad estadística que se corresponde con la frecuencia relativa de los variantes de secuencia. Comenzando a partir de, por ejemplo, una población idealmente mixta en la que dos segmentos heterólogos están presentes en dos variantes diferentes, cada uno en proporción igual, se producirá un heterodúplex de modo estadístico cada segundo polinucleótido bicatenario. Si el número de variantes es mucho mayor que la frecuencia relativa de variantes individuales, se forman heterodúplex casi exclusivamente.
La hibridación de los polinucleótidos monocatenarios complementarios para formar polinucleótidos bicatenarios se realiza según métodos conocidos por los expertos en la técnica. En particular, puede lograrse combinando cadenas monocatenarias y ajustando las condiciones de la reacción que estimulan la reasociación de los polinucleótidos complementarios, por ejemplo, disminuyendo la temperatura, ajustando a un valor de pH neutro y baja concentración salina, etc.
Mediante la degradación exonucleolítica de las cadenas monocatenarias de los polinucleótidos heterodúplex según la etapa (c) del método de la invención, las moléculas polinucleotídicas individuales que ahora forman parte de una cadena bicatenaria se degradan en parte de modo exonucleolítico. Resulta esencial que sólo se produzca una degradación exonucleolítica parcial. La degradación exonucleolítica de la molécula polinucleotídica bicatenaria puede tener lugar en la dirección 3'-5' o en la dirección 5'-3' o en ambas direcciones 3'-5' y 5'-3'. Además, la degradación de secciones monocatenarias desapareadas más largas de segmentos heterólogos de las moléculas polinucleotídicas puede tener lugar de modo exonucleolítico añadiendo exonucleasas específicas monocatenarias en la dirección 5'-3' y 3'-5'. De esta manera se forman polinucleótidos bicatenarios con secciones monocatenarias. La longitud media y la distribución acompañante de la degradación monocatenaria en la dirección 3'-5' o la dirección 5'-3' también puede controlarse mediante las condiciones de reacción y el tiempo de reacción de la degradación exonucleolítica. En el caso de la recombinación regioselectiva, se pretende que las reacciones de degradación comiencen y terminen lo más simultáneamente posible, mientras que en el caso de la recombinación completa, el comienzo y el final de la reacción de degradación también puede realizarse de modo consecutivo. Además, también puede lograrse una degradación monocatenaria estadística, insertando un tioéster en lugar de un fosfodiéster en la síntesis de polinucleótidos monocatenarios, terminando la degradación exonucleolítica de la cadena monocatenaria en el primer tioéster cada una.
Existe una pluralidad de exonucleasas conocidas que permiten una degradación 3'- ó 5'-exonucleolítica. A principios de los setenta ya se habían aislado y descrito diversas exonucleasas (Lehmann, en: The Enzymes, Boyer (ed.), Academic Press (1971), 251-270). En la actualidad, se han descrito un vasto número de diferentes exonucleasas de los más variados organismos y con funciones muy diferentes (Koonin, Curr. Biol., 7 (1997), R 604-6). En general, las exonucleasas están implicadas en una multitud de diferentes procesos celulares. Se han descrito las más variadas actividades exonucleolíticas en la bibliografía técnica, por ejemplo, la degradación nucleolítica de RNA o DNA monocatenario, tanto desde el extremo 3' al 5' de un polinucleótido como viceversa. Las cadenas monocatenarias en un DNA bicatenario también pueden ser degradadas por exonucleasas, tanto desde el extremo 3' al 5' de un polinucleótido como viceversa. Incluso se ha descrito la degradación exonucleolítica de un DNA bicatenario, es decir, la degradación simultánea de los extremos 5' y 3' en un extremo bicatenario.
Algunas de estas enzimas ya están disponibles en el mercado. En sustitución de una pluralidad de exonucleasas, la exonucleasa III (ExoIII) (E.C.3.1.11.2) se cita en la presente como ejemplo de la clase de enzimas exonucleolíticas. La ExoIII se vende, por ejemplo, en USB, Roche Molecular Biochemicals, Stratagen, y New England Biolabs. La ExoIII de E. coli tiene diversas actividades. La enzima es no procesadora y tiene una actividad 3'-5' exonucleolítica específica en DNA bicatenarios, una actividad DNA-3'-fosfatasa y una actividad endonucleolítica en sitios apurínicos en el DNA. La ExoIII degrada preferiblemente los extremos 3' en DNA bicatenarios, mientras que los extremos 3 colgantes no se degradan. Roger y Weiss (Gene, 11 (1980), 187-195), Rogers y Weiss (Methods Enzymol., 65 (1980), 201-211), Sambrook (ibid.), Henikoff (Gene, 28 (1984), 351-359), Ljunquist et al. (J. Bacteriol., 126 (1976), 646-653), Vandeyar et al. (Gene, 65 (1988), 129-133), y Guo y Wu (Nucl. Acids Res., 10 (1982), 2065-2084) ofrecen una visión general del aislamiento y caracterización de la ExoIII. Los expertos en la técnica también conocen las más variadas aplicaciones técnicas de ExoIII, por ejemplo, en la formación de moldes monocatenarios para procesos de marcaje (James y Leffak (Anal. Biochem., 141 (1984), 33-37)) y diversas técnicas de secuenciación (Smith (Nucl. Acids Res., 6 (1979), 831-848), Guo y Wu (Methods Enzymol., 100 (1983), 60-95), y Hoheisl y Pohl (J. Mol. Biol., 193 (1987), 447-464)) y en la producción de fragmentos de DNA por medio de nucleótidos \alpha-tiofosfato insertados en el DNA y su degradación terminada por ExoIII para reacciones de secuenciación (Putney et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78 (1981), 7350-7354) y Labeit et al. (DNA, 5 (1986), 173-177)). La introducción de segmentos monocatenarios en DNA bicatenario y su tratamiento con mutágenos (Shortle y Nahtans (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978), 2170-2174)) o la hibridación con oligonucleótidos defectuosos (Nakamaye y Eckstein (Nucl. Acids Res., 14 (1986), 9679-9698)) conduce a segmentos mutagenizados en regiones específicas. Muchas otras aplicaciones técnicas de ExoIII para la modificación del DNA se han descrito en la bibliografía técnica (Masamune et al. (J. Biol. Chem., 246 (1971), 2680-2691), Luckow et al. (Nucl. Acids Res., 15 (1987), 417-429), Roberts et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76 (1979), 760-764), Sakonju et al. (Cell, 19 (1980), 13-25), Peters y Baumeister (J. Bacteriol., 167 (1986), 1048-1054), Garon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 (1975), 3039-3043), Riley y Weintraub (Cell, 13 (1978), 281-293), Wu (Nature, 371 (1985), 84-87), Henikoff (ibid.), Hoheisl y Pohl (Nucl. Acids. Res., 14 (1986), 3605), y Henikoff (Nucl. Acids Res., 18 (1990), 2961-2966)). Otras exonucleasas disponibles en el mercado son la subunidad épsilon de la DNA-polimerasa III de E. coli con actividad 3'-5' exonucleolítica (Krutyakov (Mol. Biol., 32 (1998), 197-199)), la exonucleasa lambda de New England Biolabs del fago lambda coli con actividad lambda-5'-3'-exonucleolítica en DNA 5'-fosforilado bicatenario, en la que los extremos 5' no fosforilados en el DNA monocatenario y las cadenas bicatenarias se degradan también, pero con una actividad muy reducida. La lambda-exonucleasa no muestra ninguna actividad en mellas o segmentos monocatenarios en DNA bicatenario (Little (Gene Amplification & Analysis, 2 (1981), 135-145)). La Bal31-nucleasa de USB, New England Biolabs, y Quantum Biotechnologies, se produce a partir del medio de cultivo de Alteromonas espejiana Bal31. La Bal31 degrada el DNA bicatenario desde ambos extremos 5' y 3' y tiene, además, una actividad endonucleolítica en DNA monocatenario (Gray et al. (Nucl. Acids Res., 2 (1975), 1459-1492), Legerski et al. (Nucl. Acids Res., 5 (1978), 1445-1464), Wei et al. (J. Biol. Chem., 258 (1983), 13506-13512), Sambrook (ibid.), Bencen et al. (J. Biol. Chem., 259 (1984), 13584-13589), Hauser y Gray (Genetic Analysis, Techniques & Applications, 8 (1991), 139-147), y Zhen et al. (Biochemistry, 25 (1986), 6598-6603)). La exonucleasa I (ExoI) se vende en USB y deriva de E. coli. La ExoI degrada, de modo específico, DNA monocatenario procesadoramente en la dirección 3'-5' (Brody et al. (J. Biol. Chem., 261 (1986), 7136-7143), Brody y Doherty (Biochemistry, 24 (1985), 2072-2076), Philips y Kushner (J. Biol. Chem., 262 (1987), 455-459), Prasher et al. (J. Biol. Chem., 258 (1983), 6340-6343), Prasher et al. (J. Bacteriol, 153 (1983), 903-908), y Ray et al. (J. Biol. Chem., 249 (1974), 5379-5381)). Otras exonucleasas que pueden adquirirse en el mercado incluyen la exonucleasa V (EC 1.3.1.11.5) de USB, derivada de Micrococcus luteus (ATCC 4698), la exonucleasa VII de USB, derivada de E. coli, la T7-5'-exonucleasa Gene 6 de USB, derivada del bacteriófago T7, y la T5-5'-exonucleasa derivada del bacteriófago T5 (Sayers y Eckstein (J. Biol. Chem., 265 (1990), 18311-18317), Garforth et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96 (1999), 38-49), y Moyer y Rothe (J. Virol., 24 (1977), 177-193)).
También se ha descrito en la bibliografía técnica un gran número de exonucleasas que no están disponibles en el mercado pero que son accesibles para los expertos en la técnica por medio de métodos convencionales de bioquímica y biología molecular, por ejemplo, la 3'-5'-exonucleasa YNT20 de Saccharomyces cerevisiae (Hanekamp y Thorsness (Current Genetics, 34 (1999), 438-448)), WNR humana (Kamath-Loeb et al. (J. Biol. Chem., 273 (1998), 34145-34150), Huang et al. (Nat. Genet., 20 (1998), 114-116)), p53 de diversos organismos (Mummenbrauer et al. (Cell, 85 (1996), 1089-1099), Janus et al. (Mol. Cell. Biol., 19 (1999), 2155-2168)), 3'-5'-exonucleasa de linfocitos B (Kenter y Tredup (Mol. Cell. Biol., 11 (1991), 4398-4404)), TREX1 y TREX2 de mamíferos (Mazur y Perrino (J. Biol. Chem., 274 (1999), 19655-19660)), Mre 11 humana (Paull et al. (Molecular Cell, 1 (1998), 969-979)), 3'-5'-exonucleasa de mieloblastos humanos (Perrino et al. (J. Biol. Chem., 269 (1994), 16357-16363)), 3'-5'-exonucleasa del citosol de células H9 de leucemia linfoblástica aguda human (Skalski et al. (Biochemical Pharmacology, 50 (1995), 815-821)), y VDJP humana (Zhu y Halligan (Biochem. Biophys. Res. Commun., 259 (1999), 262-270)). También se ha descrito un vasto número de 5'-3'-exonucleasas en la bibliografía técnica, y son accesibles para los expertos en la técnica por medio de métodos convencionales de bioquímica y biología molecular, por ejemplo, la DNasa VII de núcleos de placenta humana (Pedrini y Grossman (J. Biol. Chem., 258 (1983), 1536-1543)), la 5'-3'-exonucleasa del bacteriófago N4 (Guinta et al. (J. Biol. Chem., 261 (1986), 10736-10743)), la exonucleasa V de núcleos de Saccharomyces cerevisiae (Burgers et al. (J. Biol. Chem., 263 (1988), 8099-8105)), la exonucleasa de timo de ternera (Siegal et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992), 9377-9381), Murante et al. (J. Biol. Chem., 269 (1994), 1191-1196)), la 5'-3'-exonucleasa de extractos nucleares (ExoI) de Saccharomyces cerevisiae (Huang y Symington (Mol. Cell. Biol. (1993), 3125-3134; Fiorentini et al. (Mol. Cell. Biol., 17 (1997), 2764-2773)), RAD2 y RTH1 de Saccharomyces cerevisiae, así como el homólogo XPG humano (Habroken et al. (J. Biol. Chem., 269 (1994), 31342-31345), Sommers et al. (J. Biol. Chem., 270 (1995), 4193-4196)), exonucleasas asociadas a polimerasas víricas (Sayers (Methods Enzymol., 275 (1996), 227-238)), T4-RNasa H del bacteriófago T4 (Mueser et al. (Cell, 85 (1996), 1101-1112)), así como la helicasa del síndrome de Werner humana (Suzuki et al. (Nucl. Acids Res., 27 (1999), 2361-2368)). Además, pueden utilizarse las actividades exonucleolíticas de las polimerasas descritas a continuación.
En una realización preferida del método de la invención, la degradación monocatenaria exonucleolítica de los polinucleótidos bicatenarios según la etapa (c) del método de la invención se realiza en la dirección 3'-5'.
En una realización particularmente preferida (realización A; cfr. figura 2, primer ciclo), una cadena de la cadena bicatenaria está protegida de la degradación exonucleolítica, de modo que en esta realización sólo una de las dos cadenas polinucleotídicas se somete a la digestión exonucleolítica, mientras que la cadena complementaria sirve como molde en la síntesis monocatenaria dirigida por moldes según la etapa (c).
En otra realización preferida, ambas cadenas polinucleotídicas se someten a la digestión exonucleolítica (realización B, figura 3, primer ciclo), de forma que ambas cadenas se utilizan, con una parte de su secuencia como molde, mientras que la otra parte de la secuencia se somete a la síntesis monocatenaria semiconservativa.
La degradación exonucleolítica de los polinucleótidos monocatenarios en los polinucleótidos heterodúplex producidos según la etapa (c) puede realizarse según métodos conocidos por un experto en la técnica, y se han descrito, por ejemplo, en Ross (Methods, 17 (1999), 52-59; Hoheisel (Anal. Biochem., 209 (1993), 238-246), y Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987)). En particular, se utilizan métodos químicos o bioquímicos. Se prefiere realizar la degradación exonucleolítica de una manera bioquímica mediante enzimas que tienen una correspondiente actividad específica, por ejemplo, una degradación 3'-exonucleolítica utilizando la exonucleasa III de E. coli. Se puede influir en la longitud de la degradación y, por tanto, la regioselectividad de la nueva combinación hasta un grado crucial mediante las condiciones de reacción y el tiempo de reacción de la degradación parcial. La reacción puede comenzarse, por ejemplo, cambiando las condiciones del tampón o la temperatura, añadiendo un cofactor, aunque preferiblemente añadiendo una exonucleasa, y puede terminarse, por ejemplo, cambiando las condiciones del tampón, añadiendo un inhibidor o una proteasa, disminuyendo la temperatura, aunque preferiblemente aumentando la temperatura (por ejemplo, la desnaturalización de exonucleasa III a 62ºC). La velocidad de degradación de la exonucleasa depende principalmente de las condiciones de reacción y también puede ajustarse en un amplio intervalo. Si la velocidad de la degradación de exonucleasa III, por ejemplo, es de 400 nucleótidos, o preferiblemente 25 nucleótidos por minuto bajo ciertas condiciones de reacción, el intervalo puede ajustarse seleccionando el tiempo de incubación, por ejemplo, con una precisión que varía desde 20-30 nucleótidos. Un experto en la técnica sabe ajustar las diferentes condiciones para controlar la degradación exonucleolítica, como se muestra, por ejemplo, en el ejemplo 2 y la figura 8.
Como alternativa, la actividad 3'-5'-exonucleolítica también puede proporcionarse por la polimerasa utilizada en la etapa (d), con la condición de que esta polimerasa pueda realizar la correspondiente función exonucleasa.
Con respecto a la realización A que aparece en la figura 2, en la que una cadena está protegida de la degradación 3'-exonucleolítica, existen diversas formas de proteger los extremos 3' de la degradación exonucleolítica, por ejemplo, insertando un tioéster en lugar de un fosfodiéster en el extremo 3' del esqueleto de fosforribosa. En el caso de una modificación de tioéster de dos lados, mediante la inserción anterior de un sitio de restricción singular en la secuencia y la posterior ruptura con la enzima de restricción, una de las dos cadenas puede protegerse de forma selectiva (realización A-1). Además, una cadena puede protegerse proporcionando, en primer lugar, una de las dos cadenas como una cadena monocatenaria circular (por ejemplo, utilizando un genoma monocatenario vírico, realización A-2), o produciendo un extremo colgante 3' monocatenario de más de 4 bases (es decir, probablemente si se utiliza exonucleasa III, realización A-3). Además, mediante una ligasa, ambos extremos en un lado de la cadena bicatenaria pueden unirse de modo covalente mediante la unión de una cadena monocatenaria circular (realización A-4).
En otra realización preferida del método según la invención, se degradan segmentos desapareados de los heterodúplex de modo exonucleolítico en la etapa (c) mediante una exonucleasa específica monocatenaria, por ejemplo, en la dirección 3'-5' por la exonucleasa I de E. coli.
En otra variante del método de la invención, la degradación monocatenaria exonucleolítica de las moléculas polinucleotídicas bicatenarias según la etapa (c) se realiza en la dirección 5'-3'. Preferiblemente, se utiliza la T7-exonucleasa Gene 6 del bacteriófago T7.
Además, en una realización preferida, segmentos desapareados de los heterodúplex se degradan de modo exonucleolítico en la dirección 5'-3', por ejemplo, mediante la exonucleasa VII de E. coli. Además, se prefiere modificar un extremo 5' del polinucleótido bicatenario, de tal forma que se protege de la degradación monocatenaria 5'-exonucleolítica.
En otra realización preferida del método de la invención, se insertan mellas monocatenarias en las moléculas polinucleotídicas bicatenarias antes de que se realice la degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) del método de la invención (realización C, figura 4, primer ciclo). De media, existe una o menos de una mella monocatenaria por molécula polinucleotídica bicatenaria.
Las mellas monocatenarias pueden insertarse, por ejemplo, mediante enzimas de mella específicas de secuencia. Los ejemplos de estas enzimas de mella son las enzimas de mella V.Bchl de Bacillus chitinosporus, N.BstNBI de Bacillus stearothermophilus, N.BstSEI de Bacillus stearothermophilus, N.CviPII de la cepa NC64A de Chlorella, N.CviQXI de la cepa NC64A de Chlorella, V.EcoDcm de E. coli, V.HpaII de Haemophilus parainfluenzae, V.NeaI de Nocardia aerocolonigenes, y V.XorII de Xanthomonas oryzae.
Como alternativa, las mellas monocatenarias también pueden introducirse en los polinucleótidos bicatenarios mediante enzimas de mella inespecíficas de secuencia. En este caso, es posible utilizar la DNasa I del páncreas de ternero con Mg^{2+} como cofactor (Kunitz, J. Genetic Physiology, 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology, 33 (1950), 363, y Melgac y Goldthwaite, J. Biolog. Chem., 243 (1968), 4409).
En otra realización preferida, en el caso de insertar mellas monocatenarias, posteriormente se produce una degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) en la dirección 5'-3' del método, comenzando en las mellas monocatenarias. En este caso, de nuevo, por ejemplo, puede utilizarse la T7-exonucleasa Gene 6 del bacteriófago T7.
Además, se prefieren los segmentos desapareados de los heterodúplex para ser degradados de modo exonucleolítico por la exonucleasa VII de E. coli.
En otra realización preferida del método de la invención, en el caso de insertar mellas monocatenarias, se produce posteriormente una degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) del método en la dirección 3'-5', comenzando en las mellas monocatenarias. En este caso, se prefiere utilizar la exonucleasa III de E. coli.
Preferiblemente, además, se prefieren los segmentos desapareados de los heterodúplex para ser degradados de modo exonucleolítico en la dirección 3'-5', por ejemplo, por la exonucleasa I de E. coli.
En otra realización preferida del método de la invención, en el caso de insertar mellas monocatenarias, se produce posteriormente una degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) en la dirección 5'-3' y en la dirección 3'-5', comenzando en las mellas monocatenarias. En este caso, pueden utilizarse las enzimas mencionadas anteriormente. Preferiblemente, se utiliza la Bal31-nucleasa derivada del medio de cultivo de Alteromonas espejiana Bal31. Además, preferiblemente los segmentos desapareados de los heterodúplex se degradan de modo exonucleolítico por la exonucleasa VII de E. coli.
En otra realización preferida del método de la invención, se utiliza una polimerasa con actividad 5'-exonucleolítica para la degradación 5'-exonucleolítica según la etapa (c) del método de la invención, en particular después de la inserción de mellas monocatenarias.
Por último, la síntesis semiconservativa de los polinucleótidos según la etapa (d) del método de la invención se realiza extendiendo de nuevo el extremo 3' ó 5' de la cadena monocatenaria parcialmente degradada mediante una polimerasa, y el correspondiente segmento 5' ó 3' de la cadena complementaria del heterodúplex como molde. La expresión "síntesis monocatenaria semiconservativa" significa la síntesis de un polinucleótido por medio de la extensión de una cadena monocatenaria existente mediante la información de una correspondiente hebra molde.
Dependiendo de la realización, sólo una de las dos cadenas (por ejemplo, la cadena codogénica o no codogénica) se extiende (realización A), o ambas cadenas se utilizan como molde con el extremo 5' ó 3'. Al mismo tiempo, se sintetizan de nuevo en el extremo 3' ó 5' (realización B). En la realización B, la síntesis semiconservativa de los polinucleótidos puede verse seguida de una única síntesis de los polinucleótidos complementarios. Por tanto, se logra una nueva combinación eficaz del segmento de la secuencia conservativa que no se ha degradado (cfr. figura 4). Los expertos en la técnica están familiarizados con la realización de la polimerización dirigida por moldes, que se describe, por ejemplo, en Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) o en Ausubel (ibid.).
Para la reacción de polimerasa, puede utilizarse cualquier enzima con actividad de polimerización de polinucleótidos dirigida por moldes, que sea capaz de polimerizar cadenas polinucleotídicas comenzando desde el extremo 3' ó 5'. En la actualidad se han aislado y descrito un vasto número de polimerasas de los más diversos organismos y con diferentes funciones. Con respecto al tipo de molde y el polinucleótido sintetizado, se realiza una diferenciación entre las DNA-polimerasas dependientes de DNA, las DNA-polimerasas dependientes de RNA (transcriptasas inversas), las RNA-polimerasas dependientes de DNA, y las RNA-polimerasas dependientes de RNA (replicasas). Con respecto a la estabilidad frente a la temperatura, se diferencia entre polimerasas no termoestables (37ºC) y termoestables (75-95ºC). Además, las polimerasas se diferencian con respecto a la presencia de actividad 5'-3'- y 3'-5'-exonucleolítica. Las DNA-polimerasas dependientes de DNA son las polimerasas más importantes.
En particular, pueden emplearse DNA-polimerasas con un óptimo de temperatura de exacta o aproximadamente 37ºC. Éstas incluyen, por ejemplo, la DNA-polimerasa I de E. coli, la DNA-polimerasa T7 del bacteriófago T7, y la DNA-polimerasa T4 del bacteriófago T4, que están fabricadas por un gran número de fabricantes, por ejemplo, USB, Roche Molecular Biochemicals, Stratagene, NEB o Quantum Biotechnologies. La DNA-polimerasa I de E. coli (holoenzima) tiene actividad polimerasa 5'-3', una actividad exonucleasa 3'-5' de prueba de lectura, y una actividad exonucleasa 5'-3'. La enzima se utiliza para el marcaje in vitro de DNA mediante el método de traducción de mella (Rigby et al. (J. Mol. Biol., 113 (1977), 237-251)). Por contraste con la holoenzima, el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli tampoco tiene una actividad 5'-exonucleasa, igual que la DNA-polimerasa T7 y la DNA-polimerasa T4. Por tanto, estas enzimas se utilizan para las llamadas reacciones de relleno, o para la síntesis de cadenas largas (Young et al. (Biochemistry, 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol., 29 (1974), 46-53)). Después de todo, el variante 3'-5'-exo(-) del fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli tampoco tiene actividad 3'-exonucleasa. Esta enzima se utiliza a menudo para la secuenciación de DNA según Sanger (Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977), 5463-5467)). Aparte de estas enzimas, hay una pluralidad de otras DNA-polimerasas de 37ºC con diferentes propiedades, que pueden emplearse en el método de la invención.
La DNA-polimerasa termoestable más ampliamente utilizada, que tiene una temperatura óptima de 75ºC y aún es suficientemente estable a 95ºC, es la DNA-polimerasa Taq de Thermus aquaticus, que está disponible en el mercado. La DNA-polimerasa Taq es una DNA-polimerasa 5'-3' muy procesadora sin actividad 3'-5'-exonucleasa. A menudo se utiliza para PCR convencionales, para reacciones de secuenciación y para PCR mutagénicas (Cadwell y Joyce (PCR Methods Appl., 3 (1994), 136-140, Arigoni y Kaminski (Methods Mol. Biol., 23 (1993), 109-114)). La DNA-polimerasa Tth de Thermus thermophilus HB8 y la DNA-polimerasa Tfl de Thermus flavus tienen propiedades similares. La DNA-polimerasa Tth, además, tiene una actividad transcriptasa inversa ("reverse transcriptase", RT) intrínseca en presencia de iones manganeso (Cusi et al. (Biotechniques, 17 (1994), 1034-1036)). Entre las DNA-polimerasas termoestables sin actividad 5'-exonucleasa pero con actividad 3'-exonucleasa, muchas de ellas están disponibles en el mercado: DNA-polimerasa Pwo de Pyrococcus woesei, DNA-polimerasa Tli, Vent o DeepVent de Thermococcus litoralis, DNA-polimerasa Pfx o Pfu de Pyrococcus furiosus, DNA-polimerasa Tub de Thermus ubiquitous, DNA-polimerasa Tma o UITma de Thermotoga maritima (Newton y Graham, en: PCR, Spektrum Akad., Verlag Heidelberg (1994), 1)). Las polimerasas sin actividad 3'-exonucleasa de prueba de lectura se utilizan para amplificar productos de PCR que están lo más exentos posible de defectos. Después de todo, con el fragmento de Stoffel de la DNA-polimerasa Taq, con la DNA-polimerasa Vent-(exo-) y la DNA polimerasa Tsp, se encuentran disponibles DNA-polimerasas estables sin actividad 5'- y 3'-exonucleolítica.
Entre las DNA-polimerasas dependientes de RNA (transcriptasas inversas), la transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar, la transcriptasa inversa M-MuLV del virus de la leucemia murina de Moloney, y la transcriptasa inversa HIV del virus de la inmunodeficiencia humana son las enzimas más habituales, y también pueden adquirirse en diversos fabricantes, como NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies. Al igual que la transcriptasa inversa HIV, la transcriptasa inversa AMV tiene una actividad RNasa-H asociada. Esta actividad se encuentra significativamente reducida en la transcriptasa inversa M-MuLV. Las transcriptasas inversas M-MuLV y AMV no tienen actividad 3'-5'-exonucleasa.
Las enzimas más comunes entre las RNA-polimerasas dependientes de DNA incluyen la RNA-polimerasa de E. coli, la RNA-polimerasa SP6 de Salmonella typhimurium LT2 infectada con el bacteriófago SP6, la RNA-polimerasa T3 del bacteriófago T3, y la RNA-polimerasa T7 del bacteriófago T7.
En una realización preferida del método de la invención, las cadenas molde en la etapa (d) del método son moléculas de DNA, y se utiliza una DNA-polimerasa dependiente de DNA para la extensión dirigida por moldes.
En una realización particularmente preferida, se utiliza una DNA-polimerasa no termoestable, y se prefiere particularmente una polimerasa con actividad 5'- y 3'-exonucleolítica, como la polimerasa I de E. coli.
Como alternativa, también puede utilizarse una DNA-polimerasa no termoestable que no tiene actividad 5'-exonucleolítica sino una actividad 3'-exonucleolítica, por ejemplo, el fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli, la DNA-polimrasa T7 del bacteriófago T7, o la DNA-polimerasa T4 del bacteriófago T4.
Además, puede utilizarse una DNA-polimerasa no termoestable que no tenga actividad 5'- ni 3'-exonucleolítica, por ejemplo, el variante 3'-5'-exo(-) del fragmento de Klenow de la DNA-polimerasa I de E. coli.
En otra realización particularmente preferida, se utiliza una polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq-Pol, Pwo-Pol, etc.). Esta polimerasa de nuevo puede tener actividad 5'- y 3'-exonucleolítica, o actividad 5'-exonucleolítica pero no 3'-exonucleolítica, como por ejemplo la DNA-polimerasa Taq de Thermus aquaticus, la DNA-polimerasa Tth de Thermus thermophilis HB8, o la DNA-polimerasa Tfl de Thermus flavus.
Como alternativa, la DNA-polimerasa termoestable puede no tener actividad 5'-exonucleolítica pero sí actividad 3'-exonucleolítica, como la DNA-polimerasa Pwo de Pyrococcus woesei, la DNA-polimerasa VentR, la DNA-polimerasa DeepVentR, o la DNA-polimerasa Tli de Thermococcus litoralis, la DNA-polimerasa Pfu o la DNA-polimerasa Pfx de Pyrococcus furiosus, o la DNA-polimerasa Tma o la DNA-polimerasa UITma de Thermotoga maritima.
Además, puede utilizarse una polimerasa termoestable que no tenga actividad 3'- ni 5'-exonucleolítica, como el fragmento de Stoffel de la DNA-polimerasa Taq de Thermus aquaticus, la DNA-polimerasa Tsp, o el variante exo(-) de la DNA-polimerasa VentR o la DNA-polimerasa DeepVentR de Thermococcus litoralis.
Si se utiliza una polimerasa termoestable, se prefiere que la reacción de polimerasa se produzca directamente después de detener la degradación exonucleolítica, por ejemplo, aumentando la temperatura. No existe ninguna purificación entre medias ni un posterior tratamiento de las muestras. Además, en el caso de varios ciclos, se evita preferiblemente la adición de nuevo de polimerasa después de cada ronda de purificación. Si se utiliza una exonucleasa que se desnaturaliza cuando se calienta a una temperatura de \leq 72ºC pero que, sin embargo, se renaturaliza después de la disolución térmica de las cadenas a aproximadamente 90ºC y un enfriamiento por debajo de la temperatura de reasociación, es posible una realización que trabaje como una reacción en una sola etapa a lo largo de varios ciclos, sin la adición de sustancias o la manipulación de muestras entre medias. En otra realización preferida, se añade exonucleasa en exceso con relación a la polimerasa, en la que el procesamiento de la polimerasa (Pol I, etc.) es significativamente mayor que el de la degradación exonucleolítica.
En otra realización preferida, los extremos 3' de los segmentos recién sintetizados se acoplan de modo covalente, si se han insertado mellas monocatenarias antes de la degradación exonucleolítica y la posterior síntesis monocatenaria dirigida por moldes. Preferiblemente, dicho acoplamiento se realiza mediante una ligasa, y se prefiere particularmente la DNA-ligasa T4 del bacteriófago T4.
En otra realización preferida del método de la invención, las cadenas molde en la etapa (d) del método de la invención en las que se produce la síntesis monocatenaria dirigida por moldes son moléculas de RNA. En este caso, se utiliza una DNA-polimerasa dependiente de RNA, preferiblemente la transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar, la transcriptasa inversa HIV del virus de la inmunodeficiencia humana, o la transcriptasa inversa M-MuLV del virus de la leucemia murina de Moloney, para la síntesis monocatenaria dirigida por moldes. Además, se prefiere utilizar una transcriptasa inversa termoestable, y se prefiere particularmente la DNA-polimerasa Tth de Thermus s thermophilus con actividad transcriptasa inversa intrínseca.
En otra realización preferida, la cadena polinucleotídica que, según la etapa (c), se somete a la degradación monocatenaria exonucleolítica y, según la etapa (d), a la síntesis monocatenaria, consiste en RNA.
Por tanto, los polinucleótidos monocatenarios semiconservativos recién sintetizados comprenden la información original desde el extremo 5' al 3', o según el caso, desde el extremo 3' al 5' de la degradación exonucleolítica, así como la información de la cadena contraria desde el extremo 5' al extremo 3', o desde el extremo 3' al extremo 5' de la nueva síntesis. Las figuras 2 y 3 muestran un ejemplo de las posibles realizaciones A y B en la aplicación cíclica (variante con la degradación 3'-exonucleolítica). Controlando la longitud de la degradación monocatenaria exonucleolítica (por ejemplo, la reacción controlada por el tiempo de la actividad exonucleolítica), en cada ciclo pueden producirse nuevas combinaciones de una manera regioselectiva, es decir, preferiblemente en secciones particulares de las secuencias polinucleotídicas. Mediante la aplicación cíclica de dicho método, comenzando con otra producción de DNA heterodúplex de las moléculas monocatenarias semiconservativas generadas según un primer ciclo, pueden producirse nuevas combinaciones de forma repetida. En este caso, la aplicación cíclica de la realización A (cfr. figura 2) ofrece combinaciones regioselectivas y ubicuas de diferentes segmentos de la secuencia heterólogos con una frecuencia de recombinación definida de los polinucleótidos. La aplicación cíclica de la realización B (cfr. figura 3) ofrece la posibilidad de una combinación completamente nueva de los segmentos de la secuencia heterólogos de una cuasiespecie, incluso hasta después de unos pocos ciclos. En este caso, debe enfatizarse que la población inicial de las cadenas polinucleotídicas no sirve como molde de polinucleótidos recién sintetizados, sino que se combinan nuevamente entre sí según un mecanismo semiconservativo.
Por tanto, la aplicación del método según la invención hace posible que dos o más segmentos de la secuencia heterólogos diferentes, localizados en dos polinucleótidos monocatenarios diferentes, se unan con polinucleótidos monocatenarios semiconservativos nuevos. Utilizando dicho método pueden producirse polinucleótidos monocatenarios semiconservativos con proporciones idénticas y diferentes de segmentos de la secuencia nuevos y conservativos, dependiendo de la ejecución controlada de la degradación exonucleolítica.
Además se describe un kit que contiene instrucciones para realizar el método de la invención. El kit puede contener al menos uno de los siguientes componentes:
(i) un tampón para la producción de polinucleótidos bicatenarios;
(ii) un agente que permite una degradación exonucleolítica parcial de las moléculas polinucleotídicas bicatenarias;
(iii) un tampón para realizar la degradación exonucleolítica parcial;
(iv) un agente que permite la polimerización dirigida por moldes de una cadena polinucleotídica comenzando a partir del extremo degradado; y
(v) un tampón para realizar la reacción de polimerización de (v).
Se describen estas y otras realizaciones, que son obvias para un experto en la técnica y que están incluidas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Otra bibliografía con respecto a uno de los métodos, medios y aplicaciones mencionados anteriormente, que puede utilizarse dentro del significado de la presente invención, puede obtenerse de la técnica actual, por ejemplo en bibliotecas públicas, por ejemplo mediante el uso de medios electrónicos. Para este objetivo pueden servir, entre otros, las bases de datos públicas, como la "medline", a la que puede accederse mediante Internet, por ejemplo en la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov./PubMed/medline.html. Otras bases de datos y direcciones son conocidas por los expertos en la técnica, y pueden obtenerse en Internet, por ejemplo en la dirección http://www.lycos.com. Una visión de conjunto de las fuentes e información con respecto a patentes y solicitudes de patentes en biotecnología se encuentra en Berks, TIBTECH, 12 (1994), 352-364.
Las figuras muestran:
La figura 1 es una ilustración esquemática del método de la invención.
La figura 2 ilustra el principio del método cíclico de la realización A del método según la invención, con los polinucleótidos molde protegidos de la degradación exonucleolítica. La notación de las etapas es como se define en el texto. Para que sea más claro, sólo se muestran tres ciclos.
La figura 3 ilustra el principio del método cíclico de la realización B del método según la invención, en el que cada cadena de un polinucleótido bicatenario sirve como molde y se degrada. La notación de las etapas es como se define en el texto. Para que sea más claro, sólo se muestran dos ciclos.
La figura 4 ilustra el principio del método cíclico de la realización C del método según la invención, en el que se insertan mellas monocatenarias antes de la degradación exonucleolítica. La notación de las etapas es como se define en el texto. Para que sea más claro, sólo se muestran tres ciclos. La degradación exonucleolítica se produce desde 5' a 3'.
La figura 5 ilustra esquemáticamente el procedimiento según el ejemplo 1. Sin embargo, para demostrar la controlabilidad del número de acontecimientos de recombinación en el ejemplo 1, el ciclo se realiza sólo una vez (n=0). Para una explicación, véase el texto; "rec" significa recombinantes.
La figura 6 muestra los mutantes empleados y los recombinantes resultantes con las mutaciones utilizadas como marcadores según el ejemplo 1.
La figura 7 muestra la distribución de los marcadores a lo largo de la secuencia para cada mutante (MUT), así como para cada recombinante (TMA) según el ejemplo 1. El sitio KpnI está a aproximadamente -450 pb, el sitio HindII a 0 pb, y el sitio PstI a aproximadamente 900 pb.
La figura 8 muestra la imagen en gel de agarosa del DNA digerido de modo exonucleolítico para diferentes tiempos de incubación (0 = 0 minutos, 1 = 1 minuto, 3 = 3 minutos, 4 = 4 minutos, 5 = 5 minutos) según el ejemplo 2.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención.
En los ejemplos experimentales descritos a continuación, se utilizan técnicas convencionales de la tecnología de la recombinación de DNA que se describen en diversas publicaciones, por ejemplo, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, o Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1988, Wiley Interscience. A menos que se indique lo contrario, las enzimas de restricción, las polimerasas y otras enzimas se utilizaron según las especificaciones del fabricante. Los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador de DNA Perkin Elmer Expedite.
Ejemplo 1 Recombinación in vitro de variantes de subtilisina E de B. subtilis
Este ejemplo demuestra la controlabilidad del número de acontecimientos de recombinación por gen mediante la recombinación de variantes de subtilisina E de B. subtilis en un único ciclo del método según la realización B de la presente invención.
A. Construcción del vector
El vector p3 es un plásmido lanzadera de 6,8 kb de E. coli-B. subtilis que se derivó de pMK3 (ATCC 37314) mediante la sustitución del sitio HindIII en el sitio de clonación múltiple de pMK3 por un sitio NheI exclusivo, seguido de la sustitución de la secuencia de 908 pb entre los dos sitios EcoRI por un inserto de 472 pb que contiene el promotor p43 de Bacillus subtilis y un sitio KpnI exclusivo. La orientación en p3 es tal que el sitio de clonación múltiple modificado (EcoRI SmaI BamHI SalI PstI NheI) está localizado cadena abajo del promotor. Una secuencia de DNA de 1,7 kb que contiene el gen apre (subtilisina E), junto con una secuencia de terminación, se amplificó mediante PCR a partir del genoma de Bacillus subtilis utilizando los oligonucleótidos P01 y P02 como cebadores:
P01 (longitud: 67 nucleótidos, contiene un sitio KpnI (subrayado)):
5'-AGCGCGCGATTATGTAAAATATAAAGTGATAGCGGTACCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGG
G-3' (SEQ ID NO:1)
P02 (longitud: 54 nucleótidos, contiene un sitio PstI (subrayado)):
5'-GGTCTGCTTCTTCCAGCCCTCCTGGTACTGCAGCCATCCGTCGATCATGGAACG-3' (SEQ ID NO:2)
El producto de la PCR resultante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de una digestión con PstI y KpnI y una purificación en gel de agarosa, el producto de la PCR se acopló al vector p3, que se digirió con PstI y KpnI, se purificó en gel y se desfosforiló, dando como resultado el plásmido p3-ApreT (cfr. figura 5). La transformación de una cepa de B. subtilis que carece del gen apre produjo la expresión constitutiva de la subtilisina E. La actividad se confirmó cultivando en placa a los transformantes en agar LB que contiene leche desnatada al 1%, produciéndose unos halos aclarados alrededor de cada colonia.
B. Generación de mutantes
Una secuencia de DNA de 0,86 kb que contiene la secuencia apre, desde el sitio HindIII interno hasta el extremo C-terminal del gen, se amplificó a partir de p3-ApreT mediante PCR mutagénica utilizando los oligonucleótidos P03 y P04 como cebadores:
P03 (longitud: 23 nucleótidos):
5'-GACTTAAACGTCAGAGGCGGAGC-3' (SEQ ID NO: 3)
P04 (longitud: 23 nucleótidos):
5'-GACCATGATTACGCCAAGCTAGC-3' (SEQ ID NO: 4)
La PCR mutagénica se realizó utilizando 30 pmol de cada cebador, 20 nmol de dGTP y dATP, 100 nmol de dCTP y dTTP, 20 fmol de molde, y 5 U de DNA-polimerasa Taq en Tris HCl 10 mM, pH 7,6, KCl 50 mM, MgCl_{2} 7 mM, MnCl_{2} 0,5 mM, gelatina al 0,01% durante 20 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC, y 1 minuto a 72ºC. El banco resultante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de digerir los productos de la PCR con HindIII y PstI y una purificación en gel de agarosa, se acoplaron en p3-ApreT, que también se digirió con HindIII y PstI, se purificaron en gel a partir del inserto apre original, y se desfosforilaron. Los clones resultantes se analizaron para determinar la actividad subtilisina E mediante el cultivo en placa de los transformantes de B. subtilis en agar LB que contiene leche desnatada al 1%. Los plásmidos de siete clones que no mostraron actividad (p3-ApreT-MUT02, 04, 10, 18, 24, 25, 26) se aislaron y secuenciaron. Las desviaciones de la secuencia del tipo salvaje de estos mutantes inactivos para la subtilisina E se muestran en la figura 6. Cada uno de estos clones mutantes porta al menos una mutación, y ninguna mutación se formó dos veces. En conjunto, los siete clones portaban 26 mutaciones que pueden servir como marcadores que se distribuyen aleatoriamente a lo largo de la secuencia entre el sitio HindIII y PstI (cfr. figura 7).
C. Recombinación in vitro
Las secuencias de DNA de 1,4 kb que incluyen los sitios de clonación KpnI y PstI y el gen apre completo se amplificaron mediante PCR de cada uno de los clones p3-ApreT-MUT utilizando polimerasa Pfu de Stratagene siguiendo las instrucciones del fabricante y utilizando los oligonucleótidos P05 y P06 como cebadores:
P05 (longitud: 20 nucleótidos):
5'-AATGGGCGTGAAAAAAAGCG-3' (SEQ ID NO: 5)
P06 (longitud: 23 nucleótidos):
5'-CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT-3' (SEQ ID NO: 6)
Los productos de la PCR se purificaron utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick siguiendo las instrucciones del fabricante, se comprobaron para determinar el tamaño correcto mediante una electroforesis en gel de agarosa, y se mezclaron entre sí en cantidades equimolares. Se calentaron 80 \mug de esta mezcla de PCR en Tris HCl 150 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 6,6 mM, durante 5 minutos a 94ºC, y posteriormente se enfriaron hasta 37ºC a 0,05ºC/seg para que las cadenas se reacoplaran y producir, con ello, heterodúplex de una manera estocástica. Después se añadieron 2,5 U de exonucleasa III por \mug de DNA y se incubó durante 20, 40 ó 60 minutos a 37ºC para digerir diferentes longitudes de ambos extremos 3' de los heterodúplex. Los productos de la PCR parcialmente digeridos se rellenaron con 0,6 U de polimerasa Pfu por \mug de DNA (polimerización semiconservativa) mediante una incubación durante 15 minutos a 72ºC en dNTP 0,17 mM y tampón de polimerasa Pfu según las instrucciones del fabricante. Se realizó un único ciclo de PCR utilizando los cebadores P05 y P06, y el DNA resultante se purificó utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick siguiendo las instrucciones del fabricante, se digirió con KpnI y PstI, se acopló a p3 linealizado con KpnI y PstI, y se transformó en E. coli XL1-blue. Los transformantes se comprobaron para determinar si contenían un inserto mediante minipreparación de plásmidos y electroforesis en gel. De los clones que mostraban el tamaño correcto, se eligieron 25 clones aleatoriamente, se aislaron y se analizaron mediante secuenciación.
D. Resultados
De los 25 clones elegidos aleatoriamente, 12 eran recombinantes y 13 eran idénticos a los mutantes empleados, cuya distribución era bastante estocástica. Dos mutantes se encontraron cuatro veces (MUT04, MUT26), un mutante dos veces (MUT10), tres mutantes una vez (MUT18, MUT24, MUT25), y un mutante no se encontró (MUT02). Cada uno de los 12 recombinantes se encontró sólo una vez, lo cual es el resultado claramente de un único acontecimiento de recombinación (cfr. la tabla a continuación). Sin la separación de las muestras de diferentes tiempos de incubación de la exonucleasa III (20, 40 y 60 minutos), pudieron encontrarse sitios de recombinación distribuidos a lo largo de la secuencia completa, según se demuestra en la figura 7. En total, se encontraron 48% de recombinantes. Sin embargo, este número representa sólo el límite inferior para la fracción de recombinantes. Se descubrió que algunos o todos los mutantes que aparentemente no se habían recombinado pudieron haberse originado a partir de un acontecimiento de recombinación que no cambió la secuencia, principalmente debido al hecho de que los marcadores sólo se introdujeron en la mitad C-terminal del gen (cfr. figura 5).
TABLA
40
4
Ejemplo 2 Digestión con exonucleasa III
La digestión de DNA con exonucleasa III según la reivindicación 9 se conoce en la bibliografía. Sin embargo, la precisión de la relación entre el tiempo de incubación y la longitud de la cadena de DNA digerida se ha analizado principalmente en moléculas de DNA bastante laras, es decir, plásmidos linealizados. Para demostrar que pueden digerirse moléculas de DNA más cortas hasta una cierta longitud, se digirió con exonucleasa III un producto de la PCR de 0,8 kb que representa un marco de lectura abierto típicamente corto. Las moléculas de DNA resultantes eran parcialmente bicatenarias y parcialmente monocatenarias. Sin embargo, para analizar los tamaños en un gel de agarosa las moléculas deben ser totalmente bicatenarias. Por tanto, la porción monocatenaria se digirió sólo con nucleasa S1 para fines analíticos, y la distribución resultante de las moléculas de DNA bicatenarias no digeridas se analizó mediante electroforesis en gel. Si la digestión se realiza desde ambos extremos 3' simultáneamente, esto conduce a dos distribuciones de longitud superpuestas.
A. Método
Se incubaron 0,75 \mug de un producto de PCR de 790 pb con 200 unidades de exonucleasa III en 20 \mul de tampón que contiene Tris-HCl 66 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 0,66 mM, NaCl 75 mM a 25ºC. Después de 0, 1, 2, 3, 4 y 5 minutos se retiraron muestras de 2 \mul de la mezcla, se mezclaron inmediatamente con 7,5 \mul de mezcla de digestión de nucleasa S1 (acetato de Na 40,5 mM, pH 4,6, NaCl 338 mM, ZnSO_{2} 1,4 mM, glicerol al 6,8%, 1,88 U de nucleasa S1), y se colocaron en hielo. Después de tomar todas las muestras, los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La nucleasa S1 se inactivó añadiendo 1 \mul de disolución de interrupción (Tris 300 mM, EDTA 50 mM, pH 8,0) y se incubaron las muestras durante 10 minutos a 70ºC. Las muestras se ensayaron en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio y se analizaron bajo luz UV.
B. Resultados
Los resultados de la digestión aparecen en la figura 8. Los números se corresponden con el tiempo de incubación en minutos. Bajo estas condiciones de reacción, la digestión se realiza casi linealmente, con una velocidad de aproximadamente 25 nucleótidos por minuto. Las longitudes que se corresponden con un tiempo de incubación concreto no se definen de modo preciso, sino que muestran una distribución de tipo gaussiano, con una desviación estándar de aproximadamente 50 nucleótidos, permitiendo, por una parte, fijar el sitio de recombinación en una región concreta en las secuencias que se van a recombinar y, por otra parte, por ejemplo, mezclando muestras de diferentes tiempos de incubación, conseguir la recombinación regioinespecífica a lo largo de la secuencia completa.
<110> Max-Planck-Gesellshaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
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<120> Método para la producción de biopolímeros con propiedades modificadas
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<130> D 2565 PCT
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<140> documento DE 19953854.9
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<141> 9 de noviembre, 1999
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<160> 6
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<170> PatentIn versión 2.1
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<210> 1
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<211> 67
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
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<400> 1
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agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacct actctgaatt tttttaaaag 
\hfill
60 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gagaggg 
\hfill
67 
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<212> DNA
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
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<400> 2
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ggtctgcttc ttccagccct cctggtactg cagccatccg tcgatcatgg aacg 
\hfill
54 
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<210> 3
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<211> 23
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<212> DNA
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
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gacttaaacg tcagaggcgg agc 
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gaccatgatt acgccaagct agc 
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23 
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aatgggcgtg aaaaaaagcg 
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cctgtgtgaa attgttatcc gct 
\hfill
23 
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Claims (31)

1. Un método para la producción de moléculas polinucleotídicas con propiedades modificadas, en el que se completa al menos un ciclo que comprende las siguientes etapas:
(a) proporcionar una población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias, en la que los polinucleótidos individuales de dicha población tienen segmentos de la secuencia homólogos y heterólogos, y en la que la población también contiene cadenas que son completa o parcialmente complementarias con estas cadenas monocatenarias;
(b) la formación de moléculas polinucleotídicas bicatenarias de la población de las moléculas polinucleotídicas monocatenarias proporcionada según la etapa (a), que comprenden cadenas bicatenarias con diferentes segmentos de la secuencias heterólogos;
(c) la degradación monocatenaria exonucleolítica parcial de las moléculas polinucleotídicas bicatenarias producidas según la etapa (b); y
(d) la extensión dirigida por moldes de los extremos degradados de la cadena bicatenaria parcialmente degradada producida según la etapa (c),
en el que las etapas (c) y (d) pueden realizarse posterior o contemporáneamente.
2. El método según la reivindicación 1, en el que se completa más de un ciclo que comprende las etapas (a) a (d).
3. El método según la reivindicación 2, en el que la longitud de degradación de la degradación exonucleolítica, según la etapa (c) del método de la invención, se reduce de forma constante con un número creciente de ciclos.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la regioselectividad de la combinación de cadenas parcialmente degradadas y recién sintetizadas se regula mediante el control de la degradación monocatenaria exonucleolítica parcial según la etapa (c).
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que después de uno, varios o todos los ciclos se realiza una etapa de selección, y dicha etapa de selección se refiere al genotipo o al fenotipo o a ambos genotipo y fenotipo del polinucleótido.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la población de moléculas polinucleotídicas monocatenarias proporcionada según la etapa (a) son moléculas polinucleotídicas de la distribución mutante de una cuasiespecie.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cadena polinucleotídica sometida a una degradación monocatenaria exonucleolítica y una extensión dirigida por moldes consiste en DNA.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la degradación monocatenaria exonucleolítica de los polinucleótidos bicatenarios según la etapa (c) tiene lugar en la dirección 3'-5'.
9. El método según la reivindicación 8, en el que en la etapa (c) se utiliza la exonucleasa III de E. coli para la degradación monocatenaria 3'-exonucleolítica.
10. El método según la reivindicación 8 ó 9, en el que en la etapa (c) se utiliza la exonucleasa I de E. coli para la degradación monocatenaria 3'-exonucleolítica de segmentos desapareados de los heterodúplex.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la degradación monocatenaria exonucleolítica de los polinucleótidos bicatenarios según la etapa (c) tiene lugar en la dirección 5'-3'.
12. El método según la reivindicación 11, en el que en la etapa (c) se utiliza la exonucleasa T7 Gene 6 del bacteriófago T7 para la degradación monocatenaria 5'-exonucleolítica de los polinucleótidos bicatenarios.
13. El método según la reivindicación 11 ó 12, en el que en la etapa (c) se utiliza la exonucleasa VII de E. coli para la degradación monocatenaria 5'-exonucleolítica de los segmentos desapareados de los heterodúplex.
14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que uno de los dos extremos del polinucleótido bicatenario se modifica de tal manera que se protege de la degradación monocatenaria 3'- ó 5'-exonucleolítica según la etapa (c).
15. El método según la reivindicación 14, en el que la modificación tiene lugar mediante la inserción selectiva de tioésteres, o mediante la ruptura con una enzima de restricción que conduce a un extremo colgante 3', o proporcionando, en primer lugar, una de las dos cadenas como una cadena monocatenaria circular, o mediante el acoplamiento covalente con una molécula polinucleotídica circular compatible.
16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que antes de la degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c), se introducen mellas monocatenarias en las moléculas polinucleotídicas bicatenarias.
17. El método según la reivindicación 16, en el que, como media, se introduce una o menos de una mella monocatenaria por molécula polinucleotídica bicatenaria.
18. El método según la reivindicación 16 ó 17, en el que las mellas monocatenarias se introducen en las moléculas polinucleotídicas bicatenarias por medio de enzimas de mella específicas de secuencia.
19. El método según la reivindicación 16 ó 17, en el que las mellas monocatenarias se introducen en las moléculas polinucleotídicas bicatenarias por medio de enzimas de mella inespecíficas de secuencia.
20. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) tiene lugar en la dirección 5'-3' y en la dirección 3'-5'.
21. El método según la reivindicación 20, en el que se utiliza la Bal31-nucleasa del medio de cultivo de Alteromonas espejiana Bal31 para la degradación monocatenaria 5'- y 3'-exonucleolítica contemporánea de la etapa (c).
22. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la degradación monocatenaria exonucleolítica según la etapa (c) tiene lugar por medio de una polimerasa con actividad 5'-exonucleolítica.
23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 22, en el que las cadenas molde en la etapa (d) son moléculas de DNA, y se utilizan una o más DNA-polimerasas dependientes de DNA para la extensión dirigida por moldes.
24. El método según la reivindicación 23, en el que se utiliza la polimerasa I de E. coli.
25. El método según la reivindicación 23, en el que se utilizan una o varias DNA-polimerasas termoestables.
26. El método según la reivindicación 25, en el que se utiliza la DNA-polimerasa Taq de Thermus aquaticus, la DNA-polimerasa Tth de Thermus thermophilus HB8, o la DNA-polimerasa Tfl de Thermus flavus.
27. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, en el que los extremos 3' de los segmentos recién sintetizados se acoplan de modo covalente con los extremos 5' de los segmentos parcialmente degradados de una manera exonucleolítica.
28. El método según la reivindicación 27, en el que el acoplamiento covalente tiene lugar mediante la DNA-ligasa T4 del bacteriófago T4.
29. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 22, en el que las cadenas molde en la etapa (d) son moléculas de RNA, y se utilizan una o más DNA-polimerasas dependientes de RNA para la extensión dirigida por moldes.
30. El método según la reivindicación 29, en el que se utiliza la transcriptasa inversa AMV del virus de la mieloblastosis aviar, la transcriptasa inversa HIV del virus de la inmunodeficiencia humana, la transcriptasa inversa M-MuLV del virus de la leucemia murina de Moloney, o la DNA-polimerasa Tth de Thermus thermophilus con actividad transcriptasa inversa intrínseca.
31. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la cadena polinucleotídica sometida a una degradación monocatenaria exonucleolítica y una extensión dirigida por moldes consiste en RNA.
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