JP2022545465A - アミラーゼバリアント - Google Patents

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Abstract

アミラーゼ酵素活性を有する遺伝子操作された酵素、該酵素を含む組成物、ならびに該酵素を作製および使用する方法。遺伝子操作されたアミラーゼ酵素は、洗濯用洗剤、食器用洗剤、ならびにエタノール生産、デンプン加工、紙加工、およびパルプ、動物飼料、ベーキング、カーケア、工業、および、家庭のためのクリーニング製品などの多くの異なる用途において有用である。【選択図】なし

Description

本発明においては、新しいアミラーゼ酵素が提供される。より具体的には、遺伝子操作されたアミラーゼ酵素、該酵素を含む組成物、該酵素を使用する方法または該酵素を含む組成物が提供される。
遺伝子操作されたアミラーゼ酵素は、洗濯用洗剤、食器用洗剤、ならびにエタノール生産、デンプン加工、紙加工、およびパルプ、動物飼料、ベーキング、カーケア、工業、および、家庭のためのクリーニング製品などの多くの異なる適用において有用である。アミラーゼは、デンプン染みの除去において用いられており、クリーニング製品などの様々な組成物に添加されている。これらの適用の多くは、高温でまたは変性条件で安定であるアミラーゼの使用を必要とする。かくして、改善された特性、特に、改善された安定性および改善された性能を有する遺伝子操作されたアミラーゼ酵素が必要である。
本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインからなる。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドのAおよびBドメインは、配列番号42のアミノ酸配列を有するAおよびBドメインに対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドのCドメインは、配列番号44のアミノ酸配列を有するCドメインに対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、1個以上の位置に置換、欠失、および/または挿入を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列：TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kから選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V; および 485Qからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含み、好ましくは、本発明のアミラーゼは、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、430Mおよび/または451Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39中に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、432、455、477、479および481(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号40中に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182、182および183、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失(配列番号39の番号付けによる)を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置の置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/SおよびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、
(a)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列；
(b)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
(c)高ストリンジェンシー条件下で、
(i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37をコードする配列；または
(ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
または
(d)アミラーゼ活性を有する(a)、(b)、もしくは(c)の断片
を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、またはその任意の組合せの増加を含み、好ましくは、アミラーゼは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性が増加している。
本発明はまた、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチド、またはアミラーゼ活性を有する本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードする核酸配列；
(c)高ストリンジェンシー条件下で、
(i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37をコードする配列；または
(ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；
(d)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)、(b)、もしくは(c)の断片；または
(e)（a)～(d)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
を含む、単離された、合成、または組換え核酸に関する。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたは核酸構築物を含む発現ベクターにも関する。
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド、本明細書に記載の核酸構築物、または本明細書に記載の発現ベクターを含む宿主細胞にも関する。
本発明はまた、本明細書に記載のようなアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを含む組成物にも関する。
好ましくは、組成物は、第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、およびヌクレアーゼからなる群から選択される少なくとも1つの第2の酵素をさらに含む。
本発明はまた、本明細書に記載のアルファ-アミラーゼを有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを作製する方法であって、ポリペプチドをコードする核酸配列を用意すること、核酸配列を発現宿主中に形質転換すること、発現宿主を培養して、ポリペプチドを産生させること、および必要に応じて、ポリペプチドを精製することを含む、方法にも関する。
本発明はまた、生地または生地から調製された焼き製品を調製する方法であって、本明細書に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを生地に添加すること、およびそれを焼くことを含む、方法にも関する。
本発明はまた、デンプンを加工するため、繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、または動物に給餌するための、本明細書に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドの使用方法にも関する。
本発明はまた、ハイブリッドが、AおよびBドメインならびにCドメインを含み、AおよびBドメインのアミノ酸配列が配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、少なくとも2つの異なるアミラーゼに由来するハイブリッドを作製するステップを含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを作製する方法にも関する。
本発明はまた、第1のアミラーゼのCドメインの使用方法であって、前記Cドメインが、配列番号42のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するAおよびBドメインを有する第2のアルファアミラーゼの、安定性、pHプロファイル、発現、活性、熱安定性、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、洗濯における性能からなる群から選択される1つ以上の特性を改善するため、デンプンを加工するため、繊維製品をクリーニングするため、硬表面をクリーニングするため、食器をクリーニングするため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、および動物に給餌するために、配列番号44のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記使用が、第2のアルファ-アミラーゼのCドメインを、第1のアルファ-アミラーゼのCドメインとを置き換えることを含む、方法にも関する。
配列番号４０、４１、５４、及び９についての、負荷(チャレンジ)後の残存活性％を示す。
酵素は、アミノ酸残基の配列を含む生体分子(ポリペプチド)であり、酵素は、反応を触媒することができる。したがって、酵素は、触媒的に活性なタンパク質またはポリペプチドである。酵素の名称は、国際生化学分子生物学連合の命名法委員会(IUBMB)の推奨に基づいて決定される。酵素は、EC(Enzyme Commission)番号、推奨名、別名(もしあれば)、触媒活性、その他の因子によって規定される。本明細書における酵素は、ポリペプチド配列(本明細書ではアミノ酸配列とも呼ばれる)によって同定することができる。ポリペプチド配列は、酵素の「活性部位」を含む3次元構造を特定し、次いで、その触媒活性を決定付ける。ポリペプチド配列は、配列番号によって同定することができる。
酵素は、酵素をコードするDNAを含有する植物；動物；細菌、古細菌、真菌、酵母、環境試料を含む多くの異なる供給源から得られるか、もしくはそれに由来するか、または酵素を実験室において合成的に生成することができる。例えば、酵素の細菌供給源としては、バチルス(Bacillus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、大腸菌(E. coli )およびシュードモナス(Pseudomonas)に由来する酵素が挙げられる；酵素の真菌供給源としては、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム(Fusarium)、サーモミセス(Thermomyces) およびトリコダーマ(Trichoderma)に由来する酵素が挙げられる；酵素の酵母供給源としては、ピチア(Pichia)およびサッカロミセス(Saccharomyces)に由来する酵素が挙げられる。
世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)は、1文字目が大文字の以下の3文字記号を用いて配列表中でアミノ酸残基を表すべきであるとしている。以下の表は、標準遺伝子基準を用いた、アミノ酸識別子ならびにアミノ酸をコードする対応するDNAコドンの概観を提供する。アミノ酸残基をコードするDNAコドンは、用いられる生物に応じて異なっていてもよく、遺伝子コードの翻訳のためのわずかに異なる表を適用してもよい。そのような非標準コード翻訳表の編集はNCBIで維持されている。
「親」ポリペプチドアミノ酸配列は、親ポリペプチドアミノ酸配列の「バリアント(変異体)」をもたらす、配列への突然変異の導入(例えば、1個以上(断片)のアミノ酸置換、挿入、欠失、またはその組合せを導入することによる)のための出発配列である。親としては、(さらなる)変化の導入のための出発配列として用いられる、野生型ポリペプチドアミノ酸配列または合成的に生成されたポリペプチドアミノ酸配列が挙げられる。
「バリアントポリペプチド（変異体ポリペプチド）」とは、そのアミノ酸配列がその親とは異なる酵素を指す。親ポリペプチドと、バリアントポリペプチドとの相違は、1個の単一アミノ酸残基、または1個より多いアミノ酸残基（２以上のアミノ酸残基）であってもよい。1個より多いアミノ酸残基は、連続的アミノ酸残基または非保存的アミノ酸残基であり得る。連続的アミノ酸残基は、4個の連続的アミノ酸残基；5個の連続的アミノ酸残基；8個の連続的アミノ酸残基；9個の連続的アミノ酸残基；11個の連続的アミノ酸残基；13個の連続的アミノ酸残基；または14個の連続的アミノ酸残基であってもよい。以下の定義はアミノ酸変化の文脈でのバリアントを記載するが、核酸を、例えば、置換によって同様に改変することができる。
「成熟ポリペプチド」とは、任意の翻訳後改変、グリコシル化、リン酸化、トランケーション、N末端改変、C末端改変、シグナル配列欠失を含むその最終形態にある酵素を意味する。成熟ポリペプチドは、発現系、ベクター、プロモーター、および/または産生プロセスに応じて変化してもよい。
「合成」または「人工」化合物は、in vitroでの化学的または酵素的合成によって生産される。
用語「天然に存在しない」とは、その元の天然に存在する環境または供給源中には存在しない(ポリ)ヌクレオチド、アミノ酸、(ポリ)ペプチド、酵素、タンパク質、細胞、生物、または他の材料を指す。好ましくは、本発明のアミラーゼは、天然に存在しないアミラーゼである。
バリアントポリヌクレオチドおよびバリアントポリペプチド配列は、親配列と比較した場合のそれらの配列同一性によって定義することができる。配列同一性は通常、「配列同一性%」または「同一性%」として提供される。配列同一性の算出のために、第1のステップでは、配列アラインメントが作製される。本発明によれば、ペアワイズ全体アラインメントが作製され、これは、2つの配列がその完全長にわたって整列されることを意味し、通常は、アラインメントアルゴリズムと呼ばれる数学的手法を使用することによって作製される。
本発明によれば、アラインメントは、NeedlemanおよびWunsch (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)のアルゴリズムを使用することによって生成される。好ましくは、「NEEDLE」プログラム(The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))が、プログラムのデフォルトパラメーター（ポリヌクレオチド：ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5およびマトリックス=EDNAFULL；ポリペプチド：ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5およびマトリックス=EBLOSUM62)を使用して、本発明の目的のために使用される。
2つの配列を整列させた後、第2のステップでは、同一性の値が、作製されたアラインメントから決定される。
このために、同一性%は、同一の残基の数を、本発明の対応する配列をその完全長にわたって示しているアラインメント領域の長さで割って、100を掛けることによって算出される：同一性%=(同一の残基/本発明の対応する配列をその完全長にわたって示しているアラインメント領域の長さ)*100。
2つの核酸配列の同一性パーセントを算出するために、いくらかの仕様と共に、2つのアミノ酸配列の同一性パーセントの算出に関してと同じことが適用される。タンパク質をコードする核酸配列については、ペアワイズアラインメントを、イントロンを除く開始コドンから停止コドンまでの本発明の配列のコード領域の完全長にわたって行うべきである。本発明の配列が比較される、他の配列中に存在するイントロンを、ペアワイズアラインメントのために除去してもよい。次いで、同一性パーセントは、同一性%=(同一の残基/イントロンを除く開始コドンから停止コドンまでの本発明の配列をその完全長にわたって示しているアラインメント領域の長さ)*100によって算出される。2つの配列を整列させた後、第2のステップでは、同一性の値が、作製されたアラインメントから決定される。
さらに、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)を実装する核酸配列のための好ましいアラインメントプログラムは、プログラムのデフォルトパラメーター(ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5およびマトリックス=EDNAFULL)を用いる「NEEDLE」(The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))である。
本発明の配列と同一の、または類似する領域を有し、同一性%を決定するために本発明の配列と比較されるべき配列を、当業界における技術の範囲内にある様々な方法によって、例えば、NCBIで入手可能な、BLAST、BLAST-2などの公共的に利用可能なコンピューター方法およびプログラムを使用して容易に同定することができる。
バリアントポリペプチドを、親配列と比較した場合のそれらの配列類似性によって定義することができる。配列類似性は通常、「配列類似性%」または「類似性%」として提供される。配列類似性%は、アミノ酸の規定のセットが、例えば、そのサイズによって、その疎水性によって、その電荷によって、または他の特徴によって類似する特性を共有することを考慮に入れる。本明細書では、あるアミノ酸の、類似するアミノ酸との交換は、「保存的突然変異」と呼ぶことができる。本発明による類似アミノ酸は、以下の通り定義され、本発明による類似性%の決定にも適用されるべきであり、例えば、データベース検索および配列アラインメントのための最も用いられるアミノ酸類似性マトリックスの1つである「NEEDLE」プログラムによって用いられるBLOSUM62マトリックスに従うものでもある：
アミノ酸Aは、アミノ酸Sと類似する
アミノ酸Dは、アミノ酸E; Nと類似する
アミノ酸Eは、アミノ酸D; K; Qと類似する
アミノ酸Fは、アミノ酸W; Yと類似する
アミノ酸Hは、アミノ酸N; Yと類似する
アミノ酸Iは、アミノ酸L; M; Vと類似する
アミノ酸Kは、アミノ酸E; Q; Rと類似する
アミノ酸Lは、アミノ酸I; M; Vと類似する
アミノ酸Mは、アミノ酸I; L; Vと類似する
アミノ酸Nは、アミノ酸D; H; Sと類似する
アミノ酸Qは、アミノ酸E; K; Rと類似する
アミノ酸Rは、アミノ酸K; Qと類似する
アミノ酸Sは、アミノ酸A; N; Tと類似する
アミノ酸Tは、アミノ酸Sと類似する
アミノ酸Vは、アミノ酸I; L; Mと類似する
アミノ酸Wは、アミノ酸F; Yと類似する
アミノ酸Yは、アミノ酸F; H; Wと類似する。
保存的アミノ酸置換は、酵素などの機能的タンパク質のポリペプチド配列の配列の全長にわたって生じてもよい。一実施形態では、そのような突然変異は、酵素の機能的ドメインに関するものではない。一実施形態では、保存的突然変異は、酵素の触媒中心に関するものではない。
配列類似性の算出のために、第1のステップでは、配列アラインメントが上記のように作製される。2つの配列を整列させた後、第2のステップでは、類似性の値が、作製されたアラインメントから決定される。
このために、類似性%は、同一の残基の数+類似する残基の数を、本発明の配列をその完全長にわたって示しているアラインメント領域の長さで割って、100を掛けることによって算出される：類似性%=[(同一の残基+類似する残基)/本発明の配列をその完全長にわたって示しているアラインメント領域の長さ]*100。
本発明は、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
本発明はさらに、本発明のバリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、「核酸分子」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのポリマー性非分枝形態の、ヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはその両方の組合せを指す。「遺伝子」は、ある特定の遺伝的情報を担持するDNA断片である。
「親」ポリヌクレオチド酸配列は、前記親ポリヌクレオチド配列の「バリアント(変異体)」をもたらす、配列への突然変異の導入のための出発配列である。「バリアントポリヌクレオチド」とは、酵素をコードするポリヌクレオチドを指し、バリアントポリヌクレオチドは、その核酸配列がその親ポリヌクレオチドと異なる。
本発明のポリヌクレオチドは、一態様では、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38の全長ポリヌクレオチド配列のいずれか1つと比較した場合、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一である核酸配列を有する。
好ましくは、ポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞中での発現を改善するためのコドン最適化されたポリヌクレオチドである。
「置換」は、元のアミノ酸、次いで、アミノ酸配列内の位置の番号、次いで、置換されるアミノ酸を提供することによって記載される。特定のアミノ酸残基を、元のものとは異なる19種のアミノ酸残基のいずれかと置換してもよい。例えば、120位のヒスチジンのアラニンとの置換は、「His120Ala」または「H120A」と指定される。アミノ酸位置での代替的な置換は、以下のように「His120Ala,Leu」または「H120A,L」と示される。示される特定の置換の代わりに、保存的アミノ酸代替物を使用する代替的置換を使用することができることがここで理解される。
アミノ酸欠失は、親酵素の元のアミノ酸、次いで、アミノ酸配列内の位置の番号、次いで、*を提供することによって記載される。したがって、150位のグリシンの欠失は、「Gly150*」または「G150*」と指定される。あるいは、欠失は、例えば、「D183およびG184の欠失」によって示される。
アミノ酸挿入は、親酵素の元のアミノ酸、次いで、アミノ酸配列内の位置の番号、次いで、元のアミノ酸と追加のアミノ酸を提供することによって記載される。例えば、グリシンの次のリジンの180位での挿入は、「Gly180GlyLys」または「G180GK」と指定される。例えば、Gly180の後のLysおよびAlaなどの、1個より多いアミノ酸残基が挿入される場合、これを、Gly180GlyLysAlaまたはG195GKAと示すことができる。
置換および挿入が同じ位置に存在する場合、これをS99SD+S99Aまたは短縮してS99ADと示すことができる。
バリアントポリペプチドの1個以上のアミノ酸置換は、1個以上の保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的アミノ酸置換」または「関連アミノ酸」とは、あるアミノ酸配列中の1個のアミノ酸残基の、親アミノ酸配列と比較して同じ位置の類似する特性を有する異なるアミノ酸残基との置き換えを意味する。保存的アミノ酸置換のいくつかの例としては、限定されるものではないが、正荷電アミノ酸残基の、異なる正荷電アミノ酸残基との置き換え；極性アミノ酸残基の、異なる極性アミノ酸残基との置き換え；非極性アミノ酸残基の、異なる非極性アミノ酸残基との置き換え、塩基性アミノ酸残基の、異なる塩基性アミノ酸残基との置き換え、または芳香族アミノ酸残基の、異なる芳香族アミノ酸残基との置き換えが挙げられる。
「酵素活性」とは、酵素によって示される少なくとも1つの触媒効果を意味する。酵素活性は、酵素1ミリグラムあたりの単位(比活性)または酵素1分子あたり、1分あたりの変換される基質の分子(モル活性)として表される。酵素活性は、酵素の実際の機能、例えば、ペプチド結合の加水分解的切断を触媒することによってタンパク質分解活性を示すプロテアーゼ、エステル結合の加水分解的切断によって脂肪分解活性を示すリパーゼ、多糖中のグルコシド結合の(内部)加水分解を含むアミラーゼ活性などによって特定することができる。
酵素活性は、保存中に、または酵素の操作的使用中に変化してもよい。用語「酵素安定性」は、保存または操作中の時間の関数としての酵素活性の保持に関する。本明細書における用語「保存」とは、生成物または組成物または製剤が、製造される時点から、最終適用において使用される時点まで保存されるという事実を示すことを意味する。保存中の時間の関数としての酵素活性の保持は、本明細書では「保存安定性」と呼ぶことができる。
経時的な、ある特定の条件下で保存または使用される酵素の触媒活性の変化を決定および定量するために、「初期酵素活性」を、時間ゼロ(100%)およびある特定の後の時点(x%)で規定の条件下で測定する。測定された値の比較によって、酵素活性の潜在的な損失の程度を決定することができる。酵素活性損失の程度は、酵素安定性または不安定性を決定付ける。
酵素の酵素活性および/または保存安定性および/または操作安定性に影響するパラメーターは、例えば、ｐH、温度、キレート剤、および酸化物質の存在である。
バリアントポリペプチドは、pH約4.0～ｐH約12.0の範囲内の任意の単一の点で、広いpHにわたって活性であってよい。バリアントポリペプチド酵素は、pH5.0～pH11.0、pH6.0～pH10.0、およびpH7.0～pH9.0の範囲にわたって活性であってもよい。別の実施形態では、バリアントポリペプチド酵素は、pH7.1～pH8.9、pH7.2～pH8.8、pH7.3～pH8.7、pH7.4～pH8.6、pH7.5～pH8.5にわたって活性であってよい。バリアントポリペプチドは、pH 4.0、pH 4.1、pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9、pH 5.0、pH 5.1、pH 5.2、pH 5.3、pH 5.4、pH 5.5、pH 5.6、pH 5.7、pH 5.8、pH 5.9、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6 pH 8.7、pH 8.8 pH 8.9、pH 9.0、pH 9.1、pH 9.2、pH 9.3、pH 9.4、pH 9.5、pH 9.6、pH 9.7、pH 9.8、pH 9.9、pH 10.0、pH 10.1、pH 10.2、pH 10.3、pH 10.4、pH 10.5、pH 10.6、pH 10.7、pH 10.8、pH 10.9、pH 11.0、pH 11.1、pH 11.2、pH 11.3、pH 11.4、pH 11.5、pH 11.6、pH 11.7、pH 11.8、pH 11.9、pH 12.0、pH 12.1、pH 12.2、pH 12.3、pH 12.4、およびpH 12.5、pH 12.6、pH 12.7、pH 12.8、pH 12.9、またはそれより高いpHで活性であってもよい。
「pH安定性」とは、特定のpH範囲で酵素活性を示す酵素の能力を指す。
バリアントポリペプチドは、温度が、約10℃～約95℃の範囲内の任意の点である、広い温度にわたって活性であってよい。バリアントポリペプチドは、10℃～55℃、10℃～50℃、10℃～45℃、10℃～40℃、10℃～35℃、10℃～30℃、または10℃～25℃の温度範囲で活性であってよい。バリアントポリペプチドは、20℃～55℃、20℃～50℃、20℃～45℃、20℃～40℃、20℃～35℃、20℃～30℃、または20℃～25℃の温度範囲で活性であってよい。バリアントポリペプチドは、少なくとも10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃の温度、またはそれより高い温度で活性である。
用語「温度安定性」および「熱安定性」とは、特定の温度範囲で触媒活性を示すタンパク質の能力を指す。酵素熱安定性は、T50値(半減期とも呼ばれる、上記を参照)として知られるものによって特徴付けることができる。T50は、熱処理を受けていない参照試料と比較した場合、ある特定の時間にわたる熱不活化後にも50%の残留酵素活性が依然として存在する温度を示す。
一実施形態では、バリアントポリペプチドは、親分子と比較した熱安定性を改善する。別の実施形態では、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較した場合、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、またはそれより高い℃数ずつ、熱安定性を改善する。別の実施形態では、熱安定性の増加は、65℃～100℃の温度で測定される。熱安定性の増加を、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、および/または100℃で測定することができる。別の実施形態では、熱安定性の増加は、70℃の温度で測定される。別の実施形態では、熱安定性の増加は、80℃の温度で測定される。別の実施形態では、熱安定性の増加は、90℃の温度で測定される。一実施形態では、熱安定性は、70℃、80℃、または90℃、好ましくは、70℃で改善される。別の実施形態では、熱安定性は、65℃～90℃、好ましくは、70℃～85℃、好ましくは、70℃～80℃の温度範囲で改善される。
一実施形態では、バリアントポリペプチドは、全長アミノ酸配列の断片であり、断片はアミラーゼ活性を有する。
本明細書で使用される場合、「断片」または「サブ配列」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部である。
用語「機能的断片」とは、それぞれ、全長アミノ酸配列の単に一部を含むが、同じか、または類似する活性および/または機能を依然として有する任意の核酸またはアミノ酸配列を指す。好ましくは、機能的断片は、全長アミノ酸配列の元の配列と少なくとも75%同一、少なくとも76%同一、少なくとも77%同一、少なくとも78%同一、少なくとも79%同一、少なくとも80%同一、少なくとも81%同一、少なくとも82%同一、少なくとも83%同一、少なくとも84%同一、少なくとも85%同一、少なくとも86%同一、少なくとも87%同一、少なくとも88%同一、少なくとも89%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%同一、少なくとも92%同一、少なくとも93%同一、少なくとも94%同一、少なくとも95%同一、少なくとも96%同一、少なくとも97%同一、少なくとも98%同一、少なくとも98.5%同一、少なくとも99%同一、または少なくとも99.5%同一である。機能的断片は、それぞれ、元の核酸または元のアミノ酸配列と比較して、連続する核酸またはアミノ酸を含む。
A-、B-およびC-ドメイン：
アルファ-アミラーゼの構造は、3つの異なるドメインA、BおよびCを含み、例えば、Machiusら、1995, J. Mol. Bio/. 246: 545-559を参照されたい。用語「ドメイン」は、それ自体、全分子の異なり、独立した下位構造を形成するポリペプチドの領域を意味する。アルファ-アミラーゼは、Aドメインと呼ばれる、活性部位残基を担持するベータ/アルファ-8バレル、Bドメインと呼ばれる、ベータシートとアルファヘリックス3との間のかなり長いループ(一緒になって、「AおよびBドメイン」)、およびCドメインおよびまた、一部の場合、さらなる炭水化物結合ドメインからなる(例えば、WO2005/001064；Machiusら、上掲)。
アルファ-アミラーゼのドメインを、結晶学的技術の使用などの構造分析によって決定することができる。アルファ-アミラーゼのドメインを決定するための代替的な方法は、アルファ-アミラーゼのアミノ酸配列と、ドメインが決定された別のアルファ-アミラーゼとの配列アラインメントによる。例えば、Cドメインが決定されたアルファ-アミラーゼ中のCドメイン配列と整列する配列を、所与のアルファ-アミラーゼのCドメインと考えることができる。
AおよびBドメイン：
本明細書で使用される用語「AおよびBドメイン」は、これらの2つのドメインが1つのユニットとして取られるが、Cドメインはアルファ-アミラーゼの別のユニットであることを意味する。かくして、「AおよびBドメイン」のアミノ酸配列は、「AおよびBドメイン」と、他のさらなるドメイン(Cドメインなど)とを含むアルファ-アミラーゼの1つの連続する配列または配列の一部分と理解される。かくして、用語「AおよびBドメインは配列番号42に対する少なくとも75%の配列同一性を有する」とは、AおよびBドメインを形成するアミノ酸配列が配列番号42に対する少なくとも75%の配列同一性を有することを意味する。本明細書で使用される場合、アルファ-アミラーゼの「AおよびBドメイン」は、配列番号39のアミノ酸1～399に対応する。
ABドメインドナー：
本明細書で使用される場合の用語「ABドメイン」は、AおよびBドメインが得られるアルファ-アミラーゼを意味する。かくして、配列番号42のアミノ酸配列を有するAおよびBドメインについて、ABドメインドナーは、配列番号39のアルファ-アミラーゼである。
Cドメイン：
本明細書で使用される場合、アルファ-アミラーゼの「Cドメイン」は、例えば、配列番号39のアミノ酸400～485に対応する。かくして、アルファアミラーゼのCドメインを、前記アルファアミラーゼと、配列番号39のアルファアミラーゼとのアラインメントによって見出すことができる。配列番号39のアミノ酸400～485と整列する前記アルファアミラーゼの部分は、本発明によれば、アルファアミラーゼの「Cドメイン」である。かくして、例えば、配列番号40のアミノ酸配列を有するアルファアミラーゼのCドメインは、配列番号44として本明細書に開示されるアミノ酸401～486から構成される。
炭水化物結合ドメインまたは炭水化物結合モジュール(CBM)：
触媒モジュール(A、BおよびCドメイン)を含むアミラーゼは、1つ以上の非触媒CBM(炭水化物結合ドメインとも呼ばれる炭水化物結合モジュールまたは具体的には、アミラーゼデンプン結合ドメイン)をさらに含んでもよい。CBMは、酵素と基質との結合を改善することができる。CBMは、Cドメインに結合される。
本発明のアルファ-アミラーゼは、3個のドメイン、A、BおよびCドメインを含む。好ましくは、本発明のアミラーゼは、炭水化物結合ドメインを含まない。好ましくは、本発明のアルファ-アミラーゼは、A、BおよびCドメインである3個のドメインのみからなる。
本発明者らは驚くべきことに、配列番号39またはそのバリアントの第1のアルファアミラーゼ(「ABドメインドナー」)に由来するAおよびBドメインと、配列番号40またはそのバリアントの第2のアルファアミラーゼ(「Cドメインドナー」)に由来するCドメインとのハイブリッドであるポリペプチドが、ABドメインドナーのアルファ-アミラーゼ(配列番号39もしくはそのバリアント)およびCドメインドナーのアルファ-アミラーゼ(配列番号40もしくはそのバリアント)、ならびに/または、さらには、安定性を改善する突然変異、すなわち、配列番号39の番号付けによる182および183位のアミノ酸に欠失を有する配列番号39のアルファ-アミラーゼである、配列番号41のアルファ-アミラーゼと比較して、改善された特性を有することを見出した。
配列番号39のアミノ酸配列を有するアルファ-アミラーゼのAおよびBドメインは、アミノ酸1～399に対応すると決定された。この配列も、本明細書に配列番号42として開示される。配列番号39のアミノ酸配列のCドメインは、アミノ酸400～485(配列番号43として本明細書に開示される)に対応すると決定された。配列番号40のアミノ酸配列を有するアルファ-アミラーゼのCドメインは、配列番号40のアミノ酸401～486に対応すると決定され、本明細書に配列番号44としても開示される。かくして、本発明の一実施形態では、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号39またはそのバリアントのアミノ酸1～399と、配列番号40またはそのバリアントのアミノ酸401～486とのハイブリッドである。
ABドメインドナー：
一実施形態では、AおよびBドメインは、配列番号39のアミノ酸配列を含むアルファ-アミラーゼから得られ、そのAおよびBドメインも配列番号42として本明細書に開示される。本発明の一実施形態では、AおよびBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号42のアミノ酸配列に対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性などの、少なくとも75%の同一性を有する。
他の好適なABドメインドナーは、配列番号39のアルファ-アミラーゼと密接に関連するアルファ-アミラーゼである。好ましくは、ABドメインドナーは、配列番号39のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。好ましくは、ABドメインドナーは、配列番号41のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。
あるいは、ABドメインドナーは、配列番号40のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。
Cドメインドナー：
最も好ましいCドメインドナーは、Cドメインが本明細書に配列番号44としても開示されるアミノ酸401～486に対応すると決定される配列番号40として開示されるアルファ-アミラーゼである。したがって、本発明は、最も好ましい実施形態では、配列番号44として開示されるCドメインまたはそれに対する少なくとも75%の配列同一性を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも80%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも85%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも90%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも95%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも97%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも98%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と少なくとも99%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。別の実施形態では、本発明は、配列番号44の配列と100%同一である配列を有するCドメインと融合した、上に開示されたAおよびBドメインを含むアルファ-アミラーゼに関する。
配列番号44のCドメインと少なくとも75%同一である好適なCドメインは、本明細書に配列番号46および配列番号48として開示される2つのCドメインである。その対応するハイブリッドアミラーゼは、配列番号49および配列番号50に示される。
好ましくは、Cドメインドナーは、配列番号40のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。
あるいは、Cドメインドナーは、配列番号39のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。
かくして、代替的な実施形態では、ABドメインドナーが配列番号40のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである場合、Cドメインドナーは、配列番号39のアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有するアルファ-アミラーゼである。
ハイブリッド：
本発明は、配列番号39に示されるアミラーゼと、配列番号40に示されるアミラーゼとのハイブリッドおよびアミラーゼ活性を有するそのバリアントと考えることができる、アミラーゼ(すなわち、アミラーゼ活性を有するポリペプチド)に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号39に示されるアミラーゼに由来するAおよびBドメインと、配列番号40に示されるアミラーゼのCドメインとを含むハイブリッドアミラーゼおよびアミラーゼ活性を有するそのバリアントに関する。
代替的な実施形態では、本発明は、配列番号40に示されるアミラーゼに由来するAおよびBドメインと、配列番号39に示されるアミラーゼのCドメインとを含むハイブリッドアミラーゼおよびアミラーゼ活性を有するそのバリアントに関する。
かくして、本発明のポリペプチドは、一方のポリペプチドの領域が他方のポリペプチドの領域のN末端またはC末端で融合されたハイブリッドまたは融合ポリペプチドと記載することができる。融合ポリペプチドを生産するための技術は当業界で公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがインフレームとなるように、そして融合ポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、ライゲーションすることを含む。融合ポリペプチドを、融合ポリペプチドが翻訳後的に作出されるインテイン技術を使用して構築することもできる (Cooperら、1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawsonら、1994, Science 266: 776-779)。あるいは、本発明によるポリペプチドを、当業者には公知の手段によって、合成遺伝子構築物によって産生させることができる。かくして、特許請求されるポリペプチドの一方でのAおよびBドメインと、他方でのCドメインとが、異なるアルファアミラーゼに由来し、一緒に融合される必要はない。それらはまた、例えば、親アミラーゼ配列中に対応するアミノ酸置換を導入することによって、ハイブリッド配列に等しいバリアントアミラーゼを作出することによって、例えば、合成的に生産することもできる。かくして、本発明のアミラーゼを、ハイブリッドが、AおよびBドメインならびにCドメインを含み、AおよびBドメインのアミノ酸配列が配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、少なくとも2つの異なるアミラーゼに由来するハイブリッドを作製するステップを含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを作製する方法によって取得することができる。あるいは、本発明のアミラーゼを、親アミラーゼ(好ましくは、配列番号39もしくは配列番号40またはそのバリアントに示される)を改変するステップおよびこの親アミラーゼ中に、ある特定の位置で、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、または123位で、好ましくは、1～123位で、好ましくは、1～29位で、より好ましくは、1～20位で、またはさらにより好ましくは、1～10位で、アミノ酸置換を導入するステップを含む方法によって取得することができる。
好ましくは、親アミラーゼは、配列番号39に示されるアミラーゼであり、配列番号39のCドメイン内で、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29位に、好ましくは、1～29位に、より好ましくは、1～10位に、1個以上のアミノ酸置換が導入されて、これらの位置でのアミノ酸配列を配列番号40に変換する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼは、配列番号39に示されるアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有し、配列番号39のCドメイン内で、配列番号39の番号付けによる400、402、408、409、410、418、419、420、422、423、429、430、437、441、444、446、449、452、454、458、459、460、466、471、473、475、482、484、および485位からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置のアミノ酸残基は、好ましくは、配列番号40に存在するアミノ酸残基に交換される。
好ましくは、アルファ-アミラーゼは、配列番号39に示されるアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有し、配列番号39のCドメイン内で、アミノ酸配列は、配列番号39の番号付けによるK400T、N402R、H408P、N409D、M410V、N418D、T419G、A420V、P422A、N423D、I429L、M430I、N437S、Y441E、R444K、K446N、Q449E、R452Y、I454M、R458Q、S459T、G460N、A466K、N471Q、S473H、N475S、W482Y、N484Q、およびN485Qからなる群から選択される1個以上の置換を含む。
あるいは、親アミラーゼは、配列番号40に示されるアミラーゼであり、配列番号40のABドメイン内で、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、または123位で、好ましくは、1～123位、より好ましくは、1～100位、さらにより好ましくは、1～50位に、1個以上のアミノ酸置換が導入されて、これらの位置でのアミノ酸配列を、配列番号39に変換する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼは、配列番号40に示されるアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有し、配列番号40のAおよびBドメイン内で、配列番号39の番号付けによる1、2、3、4、5、9、17、25、28、29、32、35、36、41、48、51、52、82、83、86、87、89、90、93、94、95、96、98、113、116、118、123、124、125、129、136、138、142、144、150、158、165、169、170、172、174、183、186、192、193、206、208、212、214、217、218、222、225、227、229、235、242、243、244、245、246、250、251、255、256、260、263、267、269、273、274、275、276、280、282、284、286、291、297、298、299、302、303、304、311、313、318、320、323、324、328、330、337、338、339、343、345、346、355、356、360、361、374、375、376、377、378、379、382、384、391、394、395、および396位からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置のアミノ酸残基は、好ましくは、配列番号39に存在するアミノ酸残基に交換される。
好ましくは、アルファ-アミラーゼは、配列番号40に示されるアルファ-アミラーゼに対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%などの、少なくとも75%の同一性を有し、配列番号40のAおよびBドメイン内で、アミノ酸配列は、配列番号39の番号付けによるA1HH、A2H、T3N、I4G、N5T、L9M、A17L、K25N、H28R、T29S、G32S、A35K、Q36D、S41A、Y48W、T51A、T52S、K82R、A83N、K86Q、S87A、I89V、E90T、H93K、K94S、Q95N、N96G、N98Q、Y113A、T116W、T118R、D123N、R124P、N125S、I129Q、E136T、N138E、G142K、N144D、D150N、K158R、T165V、E169Q、G170S、K172Q、L173LQ、I183D、A186G、S192D、S193T、L206I、F208M、D212E、A214V、M217L、K218R、T222V、A225T、E227T、N229G、L235I、D242K、H243Y、E244S、Y245F、L246T、V250L、N251T、Q255N、Q256T、E260N、T263A、Y267F、Q269K、Q273G、T274A、L275I、N276E、A280S、V282T、Y284W、Q286H、A291V、F297L、H298Y、Y299N、K302R、G303S、N304G、N311Q、L313F、M318V、N320R、A323T、L324H、L328F、E330D、G337E、Q338E、S339A、V343F、S345E、P346E、F355L、I356T、A360D、E361Q、TSGN374I、S375P、S376T、Y377H、E378G、I379V、L382M、D384S、M391E、K394Q、N395K、およびF396Y位からなる群から選択される1個以上の置換を含む。
一実施形態では、ハイブリッドアミラーゼは、配列番号39に示されるアミラーゼに対する少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアミラーゼに由来するAおよびBドメインと、配列番号40に示されるアミラーゼに対する少なくとも75%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアミラーゼに由来するCドメインとを含む。
本発明の一実施形態では、AおよびBドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号42のアミノ酸配列に対する少なくとも78%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91 %、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性などの、少なくとも75%の同一性を有し、Cドメインを形成するアミノ酸配列は、配列番号44に対する少なくとも75%の同一性を有する。
アルファ-アミラーゼを、あるアルファ-アミラーゼのCドメインまたはその一部を、別のアルファ-アミラーゼのCドメインまたはその一部と置換することによって生産することができる。ハイブリッドアルファ-アミラーゼを生産する場合、アミノ酸をリンカー領域中で欠失させる、または挿入するべきではなく、その場合、リンカー領域は、配列番号39の番号付けによるアミノ酸380～420位と本明細書では理解される。好ましくは、アミラーゼの配列番号39の番号付けによるアミノ酸380～420位は、配列番号39および/または配列番号40のいずれかに存在するアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミラーゼの配列番号39の番号付けによるアミノ酸390～410位は、配列番号39および/または配列番号40のいずれかに存在するアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミラーゼの配列番号39の番号付けによるアミノ酸395～405位は、配列番号39および/または配列番号40のいずれかに存在するアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミラーゼは、アミノ酸380～399位(配列番号39の番号付けによる)に、配列番号39のアミノ酸残基を含む。好ましくは、アミラーゼは、アミノ酸400～420位(配列番号39の番号付けによる)に、配列番号40のアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、1個以上の位置に置換、欠失、および/または挿入を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列：TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A, V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kから選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V; および 485Qからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する。
さらなる実施形態では、本発明は、上に開示されたポリペプチドのバリアントに関する。本発明のアミラーゼは、1個以上の位置に追加の置換、欠失、および/または挿入を含んでもよい。ポリペプチドを、AおよびBドメインのみにおいて、またはCドメインのみにおいて、またはAおよびBドメインと、Cドメインとの両方において突然変異（置換、欠失、および/または挿入）させることができる。ポリペプチドを、追加の残基、例えば、炭水化物結合ドメインが存在する場合、AおよびBドメインとCドメインとの外側で突然変異(置換、欠失、および/または挿入)させることができる。アミノ酸変化は、タンパク質のフォールディングおよび/もしくは活性に大きく影響しない保存的アミノ酸置換もしくは挿入である、小さなもの；典型的には、1～30アミノ酸の小さい欠失；アミノ末端のメチオニン残基などの、小さいアミノもしくはカルボキシル末端伸長；20～25残基までの小さいリンカーペプチド；または正味の電荷もしくはポリヒスチジン配列、抗原性エピトープもしくは結合ドメインなどの別の機能を変化させることによって精製を容易にする小さい伸長であってもよい。
一実施形態では、1個以上の位置に置換を含み、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、または37のアミラーゼのバリアントは、好ましくは、1～20位、より好ましくは、1～10位に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の置換、好ましくは、保存的置換を含む。
ポリペプチド中の必須アミノ酸を、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発(CunninghamおよびWells, 1989, Science 244: 1081-1085)などの、当業界で公知の手順に従って同定することができる。後者の技術では、単一のアラニン突然変異を、分子中の全ての残基に導入し、得られた突然変異分子をアルファ-アミラーゼ活性について試験して、分子の活性にとって重要であるアミノ酸残基を同定する。Hiltonら、1996, J. Bio/. Chem. 271: 4699-4708も参照されたい。酵素の活性部位または他の生物学的相互作用を、推定接触部位アミノ酸の突然変異と共に、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、または光親和性標識などの技術によって決定されるような、構造の物理的分析によって決定することもできる。例えば、de Vosら、1992, Science 255: 306-312; Smithら、1992, J. Mol. Bio/. 224: 899-904; Wlodaverら、1992, FEBS Lett. 309: 59-64を参照されたい。必須アミノ酸の同一性を、関連ポリペプチドとのアラインメントから推測することもできる。配列番号39のアミノ酸の配列中の必須アミノ酸は、触媒残基である、D236、E266およびD333位に位置する。これらのものは、好ましくは、突然変異させるべきではない。単一または複数のアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を、突然変異誘発、組換え、および/またはシャッフリングの公知の方法、次いで、Reidhaar-OlsonおよびSauer, 1988, Science 241: 53-57; BowieおよびSauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; またはWO 95/22625によって開示されたものなどの関連スクリーニング手順を用いて作製および試験することができる。用いることができる他の方法としては、変異性PCR、ファージディスプレイ(例えば、Lowmanら、1991, Biochemistry 30: 10832-10837; 米国特許第5,223,409号; WO 92/06204)、および領域特異的突然変異誘発(Derbyshireら、1986, Gene 46: 145; Nerら、1988, DNA 7: 127)が挙げられる。
突然変異誘発/シャッフリング法を、高効率の自動化されたスクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞によって発現されるクローニングされた突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出することができる(Nessら、1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子を、宿主細胞から回収し、当業界で標準的な方法を使用して迅速に配列決定することができる。これらの方法は、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定を可能にする。
好ましい突然変異は、配列番号39のアミノ酸181+182、または182+183、または181+183または181+184などの、181、182、183および184から選択される1個以上、好ましくは、少なくとも2個のアミノ酸位置での欠失である。ここで、分子は、かなり安定化される。本発明の好ましい実施形態では、配列番号39中の182および183に対応するアミノ酸が欠失される。一実施形態では、本発明のハイブリッドアミラーゼは、配列番号39のAおよびBドメイン、または本明細書に開示されるバリアントと、配列番号40のアルファアミラーゼに由来するCドメイン、または本明細書に開示されるバリアントとを含み、配列番号39中の182および183に対応するアミノ酸の欠失をさらに含む。そのようなバリアントは、例えば、本明細書に配列番号54として開示される。
本発明の他の実施形態では、ハイブリッドアミラーゼは、立体衝突を回避するために、ドメインCと、AおよびBドメインとの境界面内にアミノ酸置換を含む。一実施形態では、好ましい置換は、ドナーアミラーゼのCドメイン(配列番号44など)内の、同等の位置での置き換えようとするCドメイン(配列番号43など)のアミノ酸中での置換である。同等の位置は、両方の配列を整列させることによって定義することができる。これらの突然変異のための好ましい位置は、構造モデルの検査によって分析される。好ましいものは、限定されるものではないが、ドナーCドメイン内の1個以上の下記アミノ酸位置：401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481(配列番号39による番号付け)での置換である。好ましくは、アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号39に存在する401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
別の実施形態では、好ましい置換は、Cドメインアクセプターアミラーゼ(配列番号42など)のAおよびBドメイン内の、同等の位置に存在するCドメインドナーアミラーゼ(配列番号51)のAおよびBドメインのアミノ酸中での置換である。同等の位置は、両方の配列を整列させることによって定義することができる。これらの突然変異のための好ましい位置は、構造モデルの検査によって分析される。好ましいものは、限定されるものではないが、CドメインアクセプターアミラーゼのAおよびBドメイン内；好ましくは、配列番号39のAおよびBドメイン内の1個以上の下記アミノ酸位置：309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39による番号付け)での置換である。好ましくは、アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号40に存在する309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
配列番号52に与えられるハイブリッドアミラーゼをもたらす、配列番号42に与えられるAおよびBドメインと、配列番号44に与えられるCドメイン以外からなるハイブリッドアミラーゼ内の境界面の適合化のための例は、配列番号53として、または配列番号54中に与えられるアミラーゼをもたらすI430MおよびM454I突然変異(配列番号39による番号付け)である。かくして、好ましくは、本発明のアミラーゼは、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含み、好ましくは、本発明のアミラーゼは、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、430Mおよび/または451Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含む。
本発明のアミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置、好ましくは、9、179、186、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置、より好ましくは、179、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによる、M9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換、好ましくは、M9L、K179L、G186E/N/Q/S、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換、より好ましくは、K179L、G186E、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換をさらに含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明は、本発明のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドにも関する。さらなる実施形態では、本発明はまた、高ストリンジェンシー条件下で、(i)本明細書に記載の成熟ポリペプチドコード配列または(ii)(i)の全長相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。本明細書で定義される用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相補的なヌクレオチド配列が互いにアニーリングするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは、全体として溶液中で起こってもよく、すなわち、両方の相補的核酸は溶液中にある状態で起こってもよい。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、磁気ビーズ、セファロースビーズまたは他の任意の樹脂などのマトリックスに固定された相補的核酸の1つと共に起こってもよい。ハイブリダイゼーションプロセスはさらに、ニトロセルロースもしくはナイロン膜などの固相支持体に固定された、または限定されるものではないが、シリカガラス支持体を含む担体に、例えば、フォトリソグラフィーによって固定された相補的核酸の1つと共に起こってもよい(後者は核酸アレイまたはマイクロアレイまたは核酸チップとして知られる)。ハイブリダイゼーションを起こさせるために、核酸分子を、一般的には、温度的もしくは化学的に変性させて、二本鎖を2つの単一鎖に融解する、および/または一本鎖核酸からヘアピンもしくは他の二次構造を除去する。
ハイブリッドのこの形成または融解は、限定されるものではないが、温度などの様々なパラメーターに依存する。温度の上昇は融解を促進するが、温度の低下はハイブリダイゼーションを促進する。しかしながら、このハイブリッド形成プロセスは、直線様式での温度の適用される変化に従っていない；ハイブリダイゼーションプロセスは、動的であり、既に形成されたヌクレオチド対は、同様に隣接するヌクレオチドの対形成を支援している。したがって、正確な近似によれば、ハイブリダイゼーションは、イエスかノーかのプロセスであり、ハイブリダイゼーションと、ハイブリダイゼーションなしとの境界を基本的に定義するのは温度である。この温度は、融点(Tm)である。Tmは、所与のヌクレオチド配列の全分子の50%が二本鎖にハイブリダイズし、50%が一本鎖として存在する、摂氏温度である。
融点(Tm)は、分析される核酸配列の物理的特性に依存し、したがって、2つの異なる配列間の関係を示すことができる。しかしながら、融点(Tm)はまた、配列とは直接関連しない様々な他のパラメーターによっても影響され、ハイブリダイゼーション実験の適用条件を考慮に入れる必要がある。例えば、塩(例えば、一価カチオン)の増加は、より高いTmをもたらす。
所与のハイブリダイゼーション条件のためのTmを、物理的ハイブリダイゼーション実験を行うことによって決定することができるが、Tmを、DNA配列の所与の対についてin silicoで見積もることもできる。この実施形態では、MeinkothおよびWahl (Anal. Biochem., 138:267-284, 1984)の式が、50個以上の塩基の長さを有するストレッチについて用いられる：Tm=81.5℃ + 16.6(logM) + 0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L。
Mは、一価カチオンのモル濃度であり、%GCはDNAストレッチ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、%formは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、Lは、塩基対中のハイブリッドの長さである。この式は、0.01～0.4Mの塩範囲および30%～75%の範囲の%GCに関するものである。
上記Tmは、完全に一致したプローブに関する温度であるが、Tmは、それぞれ1%のミスマッチにつき、約1℃ずつ低下する(Bonnerら、J. Mol. Biol. 81: 123-135, 1973)：Tm=[81.5°C + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (%ホルムアミド) - 500/L ] - %非同一性。
この式は、35個以上のヌクレオチドを有するプローブについて有用であり、科学的方法文献(例えば、「Recombinant DNA Principles and Methodologies」、James Greene, Chapter 「Biochemistry of Nucleic acids」、Paul S. Miller, page 55; 1998, CRC Press)、多くの特許出願(例えば、US 7026149)、およびまた、商業的企業のデータシート(例えば、www.genomics.agilent.comからの「Equations for Calculating Tm」)において広く参照されている。
この実施形態においてさほど好ましいわけではない、Tm算出のための他の式は、示される事例についてのみ使用できる：
DNA-RNAハイブリッドについて(Casey, J.およびDavidson, N. (1977) Nucleic Acids Res.,4:1539):
Tm = 79.8°C +18.5 (log M) + 0.58 (% GC) + 11.8 (%GC * % GC) -0.5 (% form) - 820/L。
RNA-RNAハイブリッドについて(Bodkin, D.K.およびKnudson, D.L. (1985) J. Virol. Methods, 10: 45):
Tm = 79.8°C +18.5 (log M) + 0.58 (% GC) + 11.8 (%GC * % GC)-0.35 (% form) - 820/L。
20塩基未満のオリゴヌクレオチドプローブについて(Wallace, R.B.ら(1979) Nucleic Acid Res. 6: 3535): Tm = 2 x n(A+T) + 4 x n(G+C)(式中、nはハイブリッドを形成するプローブ中のそれぞれの塩基の数である)。
20～35ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブについて、改変されたWallaceの計算法を適用することができる：Tm = 22 + 1.46 n(A+T) + 2.92 n(G+C)(式中、nはハイブリッドを形成するプローブ中のそれぞれの塩基の数である)。
他のオリゴヌクレオチドについて、融点算出のための隣接モデルを、適切な熱力学的データと一緒に使用するべきである：
[数１]
Tm = (Σ(ΔHd)+ΔHi)/(Σ(ΔSd)+ΔSi+ΔSself + R×ln(cT/b) ) + 16.6log[Na +] - 273.15
(Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L.A. 1986 Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl Acad. Sci. USA 833746-3750; Alejandro Panjkovich, Francisco Melo, 2005. Comparison of different melting temperature calculation methods for short DNA sequences. Bioinformatics, 21 (6): 711-722)
(式中、Tmは、摂氏温度での融点であり；Σ(ΔHd)およびΣ(ΔSd)は、全ての内部隣接ダブレットにわたって算出された、(それに応じて)エンタルピーおよびエントロピーの和であり；ΔSselfは、自己相補的配列に関するエントロピーペナルティであり；ΔHiおよびΔSi は、それぞれ、開始エンタルピーおよびエントロピーの和であり；Rは、気体定数(1.987cal/K・molで固定)であり；cTは、モル単位での合計鎖濃度であり；定数bは、非自己相補配列については4の値を採るか、または自己相補鎖の二本鎖について、もしくは一方の鎖が有意な過剰量である場合の二本鎖については1に等しい)。
熱力学的計算は、アニーリングが7.0に近いpHで緩衝溶液中で起こり、2状態遷移が起こると推定する。
計算のための熱力学的値を、(Alejandro Panjkovich, Francisco Melo, 2005. Comparison of different melting temperature calculation methods for short DNA sequences. Bioinformatics, 21 (6): 711-722)中の表1から、または元の研究論文(Breslauer, K.J., Frank, R., Blocker, H., Marky, L.A. 1986 Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc. Natl Acad. Sci. USA 833746-3750; SantaLucia, J., Jr, Allawi, H.T., Seneviratne, P.A. 1996 Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. Biochemistry 353555-3562; Sugimoto, N., Nakano, S., Yoneyama, M., Honda, K. 1996 Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of DNA duplexes. Nucleic Acids Res. 244501-4505)から取得することができる。
この実施形態によるTmのin silicoでの見積もりのために、最初に、2つの配列間のバイオインフォマティクス配列アラインメントのセットを生成する。そのようなアラインメントを、部分アラインメントを作製する、「Blast」(NCBI)、「Water」(EMBOSS)または「Matcher」(EMBOSS)、または全体アラインメントを作製する、「Needle」（EMBOSS)プログラムのような、当業者には公知の様々なツールによって生成することができる。これらのツールを、そのデフォルトパラメーター設定だけでなく、いくつかのパラメーターの変更と共に適用するべきである。例えば、「MATCHER」プログラムを、ギャップオープン/ギャップ伸長に関する様々なパラメーター(14/4; 14/2; 14/5; 14/8; 14/10; 20/2; 20/5; 20/8; 20/10; 30/2; 30/5; 30/8; 30/10; 40/2; 40/5; 40/8; 40/10; 10/2; 10/5; 10/8; 10/10; 8/2; 8/5; 8/8; 8/10; 6/2; 6/5; 6/8; 6/10のような)と共に適用し、「WATER」プログラムを、ギャップオープン/ギャップ伸長に関する様々なパラメーター(10/0,5; 10/1; 10/2; 10/3; 10/4; 10/6; 15/1; 15/2; 15/3; 15/4; 15/6; 20/1; 20/2; 20/3; 20/4; 20/6; 30/1; 30/2; 30/3; 30/4; 30/6; 45/1; 45/2; 45/3; 45/4; 45/6; 60/1; 60/2; 60/3; 60/4; 60/6のような)と共に適用することができ、またこれらのプログラムを、両方のヌクレオチド配列を与えられる通りに使用するだけでなく、その逆相補形態にある配列の1つも使用することによって適用すべきである。例えば、BlastN(NCBI)を、増大したe値カットオフ(例えば、e+1またはさらにはe+10)と共に適用して、特に、小さいサイズのデータベースにおいて、非常に短いアラインメントを同定することもできる。
ハイブリダイゼーションは必ずしも2つの配列の完全長にわたって起こらなくてもよいが、異なる領域では最良であってよいため、部分的アラインメントを考慮し、次いで、実際の融点を決定することが重要である。したがって、全ての作出されたアラインメントから、アラインメントの長さ、アラインメントのGC含量(%)(より正確な様式では、アラインメント内で一致している塩基のGC含量(%))、およびアラインメントの同一性を決定する必要がある。次いで、それぞれのアラインメントに関する予測される融点(Tm)を算出する必要がある。最も高いTm計算値を用いて、実際の融点を予測する。
本明細書で定義される用語「本発明の完全配列にわたるハイブリダイゼーション」とは、本発明の配列が約300～500塩基長の小片に断片化された場合、300塩基よりも長い配列に関して、全ての断片がハイブリダイズしなければならないことを意味する。例えば、1つまたは組合せの制限酵素を用いることによって、DNAを小片に断片化することができる。次いで、Tmのバイオインフォマティクスin silico計算を、全ての断片について行ったのと全く同じ上記手順によって実施する。個々の断片の物理的ハイブリダイゼーションを、標準的なサザン分析、または当業者には公知である同等の方法によって分析することができる。
本明細書で定義される用語「ストリンジェンシー」は、2つのヌクレオチド配列間のハイブリッド形成が起こり得る容易性を記載する。「より高いストリンジェンシー」の条件は、一方の配列のより多くの塩基が他方の配列と対形成することを必要とし(融点Tmは、「より高いストリンジェンシー」の条件において低下する)、「より低いストリンジェンシー」の条件は、いくらかより多くの塩基が対形成しなくてもよい。したがって、2つの配列間の関係の程度を、それらが依然としてハイブリッドを形成することができる実際のストリンジェンシー条件によって見積もることができる。ストリンジェンシーの増大を、実験的ハイブリダイゼーション温度を一定に保持し、塩濃度を低下させることによって、または塩を一定に保持し、実験的ハイブリダイゼーション温度を増大させることによって、またはこれらのパラメーターの組合せによって達成することができる。また、ホルムアミドの増加は、ストリンジェンシーを増大させるであろう。当業者であれば、ハイブリダイゼーション中に変更してもよく、ストリンジェンシー条件を維持するか、または変化させるであろうさらなるパラメーターを知っている(Sambrookら(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989および毎年のアップデート))。
典型的なハイブリダイゼーション実験は、最初のハイブリダイゼーションステップ、次いで、1回～数回の洗浄ステップによって行われる。これらのステップのために使用される溶液は、当業者には公知である、EDTA、SDS、断片化精子DNAまたは同様の試薬のような、分析される配列の分解を防止する、および/またはプローブの非特異的バックグラウンド結合を防止する追加成分を含有してもよい(Sambrookら(2001) Molecular Cloning: a laboratory manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New York or to Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989および毎年のアップデート))。
ハイブリダイゼーション実験のための典型的なプローブは、FeinbergおよびVogelstein (Anal. Biochem., 132 (1), 6-13 (1983); Anal. Biochem., 137 (1), 266-7 (1984))によって最初に開発された、全ての可能なヘキサヌクレオチドの混合物の、標識しようとするDNAとのハイブリダイゼーションに基づくものである、ランダムプライム標識法によって生成される。標識されたプローブ生成物は、実際には、可変的な長さの、典型的には、100～1000ヌクレオチド長のサイズの断片の集合であってよく、最も高い断片濃度は、典型的には、約200～400bpである。ハイブリダイゼーション実験のためのプローブとして最終的に使用される、プローブ断片の実際のサイズ範囲は、用いられる標識法のパラメーター、生成されたプローブのその後の精製(例えば、アガロースゲル)、標識化のために用いられる鋳型DNAのサイズ(大きい鋳型は、例えば、標識化の前に、4bpカッター、例えば、HaeIIIを使用して制限消化することができる)によっても影響され得る。
本発明について、本明細書に記載の配列は、プローブが他の配列から生成されるハイブリダイゼーション実験によって分析され、このプローブは、標準的なランダムプライム標識法によって生成される。本発明について、プローブは、約200～400ヌクレオチドのサイズを有する標識されたオリゴヌクレオチドのセットからなる。本発明の配列と、他の配列とのハイブリダイゼーションは、プローブのハイブリダイゼーションが、上で定義されたように、本発明の完全配列にわたって起こることを意味する。ハイブリダイゼーション実験は、最後の洗浄ステップのストリンジェンシーによって最高のストリンジェンシーを達成することによって行われる。最後の洗浄ステップは、少なくとも洗浄条件1：50℃で1.06 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件2：55℃で1.06 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件3：60℃で1.06 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件4：65℃で1.06 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件5：65℃で0.52 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件6：65℃で0.25 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件7：65℃で0.12 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミド、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件8：65℃で0.07 x SSC、0.1 % SDS、0 %ホルムアミドのストリンジェンシー条件と同等のストリンジェンシー条件を有する。
「低ストリンジェント洗浄」は、少なくとも洗浄条件1であるが、洗浄条件3よりもストリンジェントではないストリンジェンシー条件と同等のストリンジェンシー条件を有し、ここで、洗浄条件は、上記の通りである。
「高ストリンジェント洗浄」は、少なくとも洗浄条件4、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件5、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件6、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件7、別の実施形態では、少なくとも洗浄条件8のストリンジェンシー条件と同等のストリンジェンシー条件を有し、ここで、洗浄条件は、上記の通りである。
本発明のアミラーゼは、改善された特性を示す。好ましくは、改善された特性は、配列番号39および/または配列番号40に示されるアミラーゼの特性に関するものである。洗浄性能は、15℃で改善されることが好ましい。一実施形態では、改善される特性は、洗剤安定性である。別の実施形態では、改善される特性は、比活性である。別の実施形態では、改善される特性は、温度安定性である。別の実施形態では、改善される特性は、pH依存的安定性である。別の実施形態では、改善される特性は、酸化的安定性である。別の実施形態では、改善される特性は、Ca2+依存性の低下である。さらに別の実施形態では、改善される特性は、低温での洗浄性能である。本発明の一実施形態では、ポリペプチドは、40℃もしくは40℃未満、または30℃もしくは30℃未満、または25℃もしくは25℃未満、または20℃もしくは20℃未満、または15℃もしくは15℃未満、または10℃もしくは10℃未満などの低温での改善された洗浄性能を有する。好ましい実施形態では、改善される特性は、温度安定性である。
アミラーゼ活性を有する好ましいポリペプチド(アミラーゼ)：
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインからなる。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I;および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V; および485Qからなる群から選択される、また好ましくは、配列番号39の番号付けによる435R、437A、441D、および485Kからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V; および485Qからなる群から選択される、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、または全部のアミノ酸残基を有する、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含む、好ましくは、アミラーゼが、アミノ酸残基430Mおよび/または430Iを含む、好ましくは、置換が、I430MおよびM454I、好ましくはI430MおよびM454Iからなる群から選択される、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置の置換を含み、好ましくは、アミラーゼが、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換、好ましくはI430MおよびM454Iを含み、アルファ-アミラーゼを有するポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる、181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失を含む(配列番号39の番号付けによる)、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置の置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換、好ましくは、I430MおよびM454Iを含み、アルファ-アミラーゼを有するポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失を含み(配列番号39の番号付けによる)、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドが、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含み、好ましくは、ポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V; および485Qからなる群から選択される1個以上のアミノ酸残基を有する、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含む、好ましくは、アミラーゼが、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換、好ましくはI430MおよびM454Iを含み、アルファ-アミラーゼを有するポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる、181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失を含む(配列番号39の番号付けによる)、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、配列番号52のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含む、好ましくは、アミラーゼが、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、430Mおよび454Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換、好ましくは、I430MおよびM454Iを含み、アルファ-アミラーゼを有するポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる、181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失を含む(配列番号39の番号付けによる)、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、配列番号53のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、アルファ-アミラーゼを有するポリペプチドが、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失を含む(配列番号39の番号付けによる)、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択されるアミノ酸位置の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基にアミノ酸残基を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号40に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号40に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択されるアミノ酸位置の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基にアミノ酸残基を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失、好ましくは182および183位に対応するアミノ酸の欠失を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置、好ましくは、9、179、186、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置、より好ましくは、179、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによる、M9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換、好ましくは、M9L、K179L、G186E/N/Q/S、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換、より好ましくは、K179L、G186E、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
また、配列番号39または配列番号40のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であるアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される、1個以上の位置、好ましくは、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドも本明細書に開示される。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸置換を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、またはそれらの任意の組合せにおける増加を含み、好ましくは、アミラーゼが、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性が増大している、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性の増加を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
一実施形態では、本発明は、
(a)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37、好ましくは、配列番号54、配列番号5、配列番号11、配列番号17、もしくは配列番号27に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列；
(b)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38、好ましくは、配列番号55、配列番号6、配列番号12、配列番号18、もしくは配列番号29との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
(c)高ストリンジェンシー条件下で、
(i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37、好ましくは、配列番号54、配列番号5、配列番号11、配列番号17、もしくは配列番号27をコードする配列；または
(ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38、好ましくは、配列番号55、配列番号6、配列番号12、配列番号18、もしくは配列番号29に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
または
(d)アミラーゼ活性を有する(a)、(b)、もしくは(c)の断片
を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってもよい)を含み、好ましくは、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V;および485Qからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む。
好ましくは、本発明のアミラーゼは、本明細書に記載の少なくとも1個のアミノ酸置換を含み、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37、好ましくは、配列番号54、配列番号5、配列番号11、配列番号17、または配列番号27のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、本発明のアミラーゼは、本明細書に記載の少なくとも1個のアミノ酸置換を含み、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である、好ましくは、配列番号54のアミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一である、アミノ酸配列を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、435R、437A、441D、および485Kからなる群から選択される1個以上のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V;および485Qからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V;および485Qからなる群から選択される、好ましくは、435R、437S,A、441E,D、および485Q,Kからなる群から選択される、1個以上のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V;および485Qからなる群から選択される、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個または全部のアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、アミノ酸残基402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,K、好ましくは、配列番号39の番号付けによる402R; 419D; 420V; 422A; 423D; 428A,T; 435R; 437S; 441E; 444K; 450V; 452Y; 466K; 469W; 473R; 475S; 476G; 479V; 483V;および485Qからなる群から選択されるアミノ酸残基を有する。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置での置換を含み、好ましくは、アミラーゼは、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、430Mおよび/または454Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される1個以上の位置での置換を含み、好ましくは、アミラーゼは、アミノ酸残基430Mおよび/または430I、好ましくは、430Mおよび/または454Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、430および454位での置換、好ましくは、430Mおよび/または454Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、430および454位での置換、好ましくは、430Mおよび/または454Iをもたらす置換、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される置換を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位(配列番号39の番号付けによる)に対応するアミノ酸の欠失を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択されるアミノ酸位置の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39に存在するような、401、403、405、411、413、415、424、426、428、430、432、454、455、477、479および481（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択されるアミノ酸位置の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、もしくは少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号40に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392、および396（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号40に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392、および396（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号40に存在するような、309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396（配列番号39の番号付けによる）からなる群から選択されるアミノ酸位置の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基にアミノ酸残基を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位(配列番号39の番号付けによる)に対応するアミノ酸の欠失を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、182および183位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは182および183位に対応する両方のアミノ酸の欠失（配列番号39の番号付けによる）を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182位、182および183位、または183および184位(配列番号39の番号付けによる)に対応するアミノ酸の欠失を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、182および183位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、182および183位に対応する両方のアミノ酸の欠失（配列番号39の番号付けによる）を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、182および183位に対応する両方のアミノ酸の欠失（配列番号39の番号付けによる）を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置、好ましくは、9、179、186、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置、より好ましくは、179、195、および206からなる群から選択される1個以上の位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによる、M9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換、好ましくは、M9L、K179L、G186E/N/Q/S、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換、より好ましくは、K179L、G186E、N195F、およびI206Lからなる群から選択される1個以上の置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または全部のアミノ酸残基位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、または全部のアミノ酸置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39の番号付けによる、9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、または全部のアミノ酸残基位置での置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/S、およびE190Pからなる群から選択される少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、または全部のアミノ酸置換を含む。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、またはそれらの任意の組合せにおける増加を含み、好ましくは、アミラーゼは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性が増大している。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、またはそれらの任意の組合せにおける増加を含み、好ましくは、アミラーゼは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性が増大している。
好ましくは、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドは、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性の増加を含む。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
好ましくは、本発明は、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドであって、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドに関する。
本発明はまた、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチド、またはアミラーゼ活性を有する本明細書に記載の任意のポリペプチド、好ましくは、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
(c)高ストリンジェンシー条件下で、
(i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37をコードする配列；または
(ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に示されるポリヌクレオチド
の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；
(d)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)、(b)、もしくは(c)の断片；または
(e)（a)～(d)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
を含む、単離された、合成、または組換え核酸に関する。
好ましくは、単離された、合成、または組換え核酸は、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
(c)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)、もしくは(b)の断片；または
(d)（a)～(c)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
を含む。
本明細書でさらに好ましいのは、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドがアミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
(c)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)もしくは(b)の断片；または
(d)（a)～(c)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
を含む、単離された、合成、または組換え核酸である。
本明細書でさらに好ましいのは、
(a)核酸がアミラーゼ活性位を有するポリペプチドをコードする、配列番号55に対する少なくとも90%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドがアミラーゼ活性を有する、配列番号54に対する少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列；
(c)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)もしくは(b)の断片；または
(d)（a)～(c)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
を含む、単離された、合成、または組換え核酸である。
好ましくは、単離された、合成、または組換え核酸は、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
を含む。
好ましくは、単離された、合成、または組換え核酸は、
(a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
(b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
を含む。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼ活性を有するポリペプチド(すなわち、アミラーゼ)である。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも99%または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号52、配列番号53、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37のアミノ酸配列に対する1個以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその任意の組合せを含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、好ましくは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25位、好ましくは、1～25位、より好ましくは、1～10位に、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37のアミノ酸配列に対する1個以上のアミノ酸残基の置換を含むアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、アミノ酸配列が、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38の全長ポリヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、アミノ酸配列が、配列番号55の全長ポリヌクレオチド配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一である核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、およびその任意の組合せが増大している、アミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、熱安定性が増大している、アミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、熱安定性が増大しているアミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、熱安定性の増大が、70℃～100℃の温度での熱負荷後のものであり、好ましくは、熱安定性の増大が、70℃～90℃、より好ましくは、75℃～85℃、最も好ましくは、80℃の温度での熱負荷後のものである、アミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、熱安定性の増大が、70℃～100℃の温度での熱負荷後のものであり、好ましくは、熱安定性の増大が、70℃～90℃、より好ましくは、75℃～85℃、最も好ましくは、80℃の温度での熱負荷後のものである、アミラーゼである。
本明細書でさらに好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼであって、80℃での熱負荷後に熱安定性の増大を示すアミラーゼである。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物に関する。組成物は、前記ポリペプチドと、別の酵素との組合せを含んでもよい。酵素の組合せは、同じクラスのもの、例えば、第1のアミラーゼと第2のアミラーゼとを含む組成物であってもよい。酵素の組合せは、異なるクラスの酵素に由来してもよく、例えば、リパーゼとアミラーゼとを含む組成物であってもよい。酵素の組合せは、少なくとも1つの本発明のアミラーゼと、1つ以上の第2の酵素とを含む組成物であってもよい。一実施形態では、組成物は、1つの第2の酵素、2つの第2の酵素、3つの第2の酵素、4つの第2の酵素、または4つより多い第2の酵素を含む。ある実施形態では、第2の酵素は、第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、およびヌクレアーゼ、またはその任意の組合せからなる群から選択される。
組成物は、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを含む。別の実施形態では、組成物は、第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、ヌクレアーゼ、およびその任意の組合せからなる群から選択される第2の酵素をさらに含む。好ましい実施形態では、組成物は、第2の酵素をさらに含み、第2の酵素は、異なるアミラーゼである。別の好ましい実施形態では、組成物は、第2の酵素をさらに含み、第2の酵素は、プロテアーゼである。
好ましくは、組成物は、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを含む。別の実施形態では、組成物は、第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、ヌクレアーゼ、およびその任意の組合せからなる群から選択される第2の酵素をさらに含む。好ましい実施形態では、組成物は、第2の酵素をさらに含み、第2の酵素は、異なるアミラーゼである。別の好ましい実施形態では、組成物は、第2の酵素をさらに含み、第2の酵素は、プロテアーゼである。
ハイブリッドまたは本発明の組成物にとって好適なさらなる酵素は、以下にさらに記載される。一実施形態では、好適な酵素は、以下に開示される親酵素の全長ポリペプチド配列と比較した場合、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である酵素活性を有する酵素バリアントを含む。
アミラーゼ
アルファ-アミラーゼ(E.C.3.2.1.1)酵素は、3個以上の(1->4)-アルファ結合D-グルコースユニットを含有する多糖中の(1->4)-アルファ-D-グルコシド結合の内部加水分解を実行することができる。アミラーゼ酵素は、無作為の様式でデンプン、グリコーゲンおよび関連多糖およびオリゴ糖に対して作用する；還元基は、アルファ構成で遊離される。アミラーゼ酵素の他の例としては、ベータ-アミラーゼ (E.C. 3.2.1.2)、グルカン1,4-アルファ-マルトテトラヒドロラーゼ(E.C. 3.2.1.60)、イソアミラーゼ (E.C. 3.2.1.68)、グルカン1,4-アルファ-マルトヘキサオシダーゼ (E.C. 3.2.1.98)、およびグルカン1,4-アルファ-マルトヒドロラーゼ (E.C. 3.2.1.133)が挙げられる。
以下に記載されるアミラーゼを、親アミラーゼとして使用して、本明細書に記載の1個以上のアミノ酸置換および/または欠失を導入することによってバリアントアミラーゼを作出することができる。
多くのアミラーゼ酵素が、限定されるものではないが、WO 2002/068589、WO 2002/068597、WO 2003/083054、WO 2004/091544、およびWO 2008/080093を含む特許および公開特許出願に記載されている。
アミラーゼは、WO95/10603に記載された配列番号2を有するバチルス・ニケニフォルミス(Bacillus licheniformis)に由来することが知られる。好適なバリアントは、WO95/10603に記載された配列番号2と少なくとも90%同一であるもの、および/またはデンプン分解活性を有する、以下の位置：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408、および444に1個以上の置換を含むものである。そのようなバリアントは、WO 94/02597、WO 94/018314、WO 97/043424およびWO 99/019467の配列番号4に記載されている。
アミラーゼは、WO 02/10355に記載された配列番号6を有するバチルス・ステアロサーモフィルス(B. stearothermophilus)に由来することが知られるか、または必要に応じて、野生型配列にわたってC末端トランケーションを有すると共にデンプン分解活性を有する、それと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。配列番号6の好適なバリアントとしては、それと少なくとも90%同一であるもの、ならびに/または181および/もしくは182位における欠失および/または193位における置換をさらに含むものが挙げられる。
アミラーゼは、WO 99/19467に開示された配列番号6を有するバチルス種(Bacillus sp.)707に由来することが知られるか、またはデンプン分解活性を有するそれと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、SP-722としても記載される、WO 96/23872に記載された配列番号2もしくは配列番号7を有するバチルス・ハルマパルス(Bacillus halmapalus)から知られるか、またはデンプン分解活性を有する配列の1つと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、WO 00/22103に開示された配列番号4を有するバチルス種DSM12649に由来することが知られるか、またはデンプン分解活性を有するそれと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、WO 2009/061380に開示された配列番号2を有するバチルス株TS-23から知られるか、またはデンプン分解活性を有するそれと少なくとも90 %同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、WO 2013/184577に開示された配列番号1を有するサイトファガ種(Cytophaga sp.)から知られるか、またはデンプン分解活性を有するそれと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、WO 2010/104675に開示された配列番号1を有するバチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)DSM90から知られるか、またはデンプン分解活性を有するそれと少なくとも90%同一であるアミラーゼである。
アミラーゼは、WO 00/60060に記載された配列番号2のアミノ酸1～485を有することが知られるか、またはデンプン分解活性を有する配列番号2のアミノ酸1～485と少なくとも96%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼである。
アミラーゼはまた、WO 2006/002643に記載の配列番号12を有することも知られるか、またはそれに対する少なくとも80%の同一性を有し、デンプン分解活性を有するアミラーゼである。好適なアミラーゼとしては、配列番号12と比較して少なくとも80%の同一性を有する、ならびに/またはY295FおよびM202LITV位に置換を含むものが挙げられ、デンプン分解活性を有する。
アミラーゼはまた、WO 2011/098531に記載の配列番号6を有することも知られるか、またはそれに対する少なくとも80%の同一性を有し、デンプン分解活性を有するアミラーゼである。好適なアミラーゼとしては、配列番号6と比較して少なくとも80%の同一性を有する、ならびに/または193 [G,A,S,TもしくはM]、195 [F,W,Y,L,IもしくはV]、197 [F,W,Y,L,IもしくはV]、198 [QもしくはN]、200 [F,W,Y,L,IもしくはV]、203 [F,W,Y,L,IもしくはV]、206 [F,W,Y,N,L,I,V,H,Q,DもしくはE]、210 [F,W,Y,L,IもしくはV]、212 [F,W,Y,L,IもしくはV]、213 [G,A,S,TもしくはM]および243 [F,W,Y,L,IもしくはV]からなる群から選択される1個以上の位置に置換を含むものが挙げられ、デンプン分解活性を有する。
アミラーゼはまた、WO 2013/001078に記載の配列番号1を有することが知られるか、またはそれに対する少なくとも85%の同一性を有し、デンプン分解活性を有するアミラーゼである。好適なアミラーゼとしては、配列番号1と比較して少なくとも85%の同一性を有する、ならびに/またはG304、W140、W189、D134、E260、F262、W284、W347、W439、W469、G476、およびG477位に対応する2個以上(数個)の位置に変更を含み、デンプン分解活性を有するものが挙げられる。
アミラーゼは、WO 2013/001087に記載の配列番号2を有することが知られるか、またはそれに対する少なくとも85%の同一性を有し、デンプン分解活性を有するアミラーゼである。好適なアミラーゼとしては、デンプン分解活性を有する、WO 2013/001087に記載の配列番号2と比較して少なくとも85%の同一性を有する、ならびに/または配列番号の番号付けによる181+182位、もしくは182+183位、もしくは183+184位の欠失を含むものが挙げられる。好適なアミラーゼとしては、W140、W159、W167、Q169、W189、E194、N260、F262、W284、F289、G304、G305、R320、W347、W439、W469、G476およびG477に対応するいずれかの位置に1個または2個以上の改変を含み、デンプン分解活性を有する、WO 2013/001087に記載の配列番号2と比較して少なくとも85%の同一性を有する、ならびに/または配列番号2の番号付けによる181+182位、もしくは182+183位、もしくは183+184位の欠失を含むものが挙げられる。
アミラーゼはまた、例えば、WO 2006/066594に記載された上記のアミラーゼに由来するハイブリッドα-アミラーゼも含む。
商業的に入手可能なアミラーゼ酵素としては、Duramyl(商標)、Termamyl(商標)、Termamyl SC(商標)、Termamyl Ultra(商標)、Fungamyl(商標)、Stainzyme(商標)、Stainzyme Plus(商標)、Natalase(商標)、Liquozyme X、Supramyl(商標) Amplify(商標)、Amplify Prime(商標)およびBAN(商標) (Novozymes A/Sから)、およびRapidase(商標)、Purastar(商標)、Purastar OxAm(商標) Powerase(商標)、Effectenz(商標) (M100、DuPontから)、Preferenz(商標) (S1000、S110およびF1000; DuPontから)、PrimaGreen(商標) (ALL; DuPont)、Optisize(商標) (DuPont)およびKam(商標) (Kao)およびKemzyme(商標) (Biozym)が挙げられる。
リパーゼ
「リパーゼ」、「脂肪分解酵素」、「脂質エステラーゼ」は全て、ECクラス3.1.1の酵素(「カルボン酸エステルヒドロラーゼ」)を指す。リパーゼ(E.C. 3.1.1.3、トリアシルグリセロールリパーゼ)は、トリグリセリドを、より多くの親水性モノおよびジグリセリド、遊離脂肪酸、ならびにグリセロールに加水分解することができる。リパーゼ酵素は通常、ホスホリパーゼA(E.C. 3.1.1.4)、ガラクトリパーゼ(E.C. 3.1.1.26)、クチナーゼ (EC 3.1.1.74)、ならびにステロールエステラーゼ活性(EC 3.1.1.13)および/またはワックスエステルヒドロラーゼ活性(EC 3.1.1.50)を有する酵素などの、トリグリセリドとは異なる基質に対して活性であるか、または特定の脂肪酸を切断する酵素も含む。
多くのリパーゼ酵素が、限定されるものではないが、WO2000032758、WO2003/089620、WO2005/032496、WO2005/086900、WO200600976、WO2006/031699、WO2008/036863、WO2011/046812、およびWO2014059360を含む特許および公開特許出願に記載されている。
リパーゼは、グリース、脂肪、油、および乳製品の染みを除去するために洗剤および洗浄製品中で使用される。商業的に入手可能なリパーゼとしては、限定されるものではないが、Lipolase(商標)、Lipex(商標)、Lipolex(商標)およびLipoclean(商標) (Novozymes A/S)、Lumafast (元々はGenencorから)およびLipomax (Gist-Brocades/現在はDSM)が挙げられる。
脂肪分解活性を決定するための方法は、文献中で周知である(例えば、Guptaら(2003), Biotechnol. Appl. Biochem. 37, p. 63-71を参照されたい)。例えば、リパーゼ活性を、パラ-ニトロフェニルパルミチン酸基質(pNP-Palmitate、C:16)中のエステル結合を加水分解し、黄色であるpNPを遊離させ、405nmで検出することによって測定することができる。
プロテアーゼ
タンパク質分解活性を有する酵素は、「プロテアーゼ」または「ペプチダーゼ」と呼ばれる。プロテアーゼは、「プロテアーゼ活性」または「タンパク質分解活性」を示す活性タンパク質である。
プロテアーゼは、クラスEC3.4のメンバーである。プロテアーゼとしては、アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11)、ジペプチダーゼ(EC 3.4.13)、ジペプチジル-ペプチダーゼおよびトリペプチジル-ペプチダーゼ(EC 3.4.14)、ペプチジル-ジペプチダーゼ(EC 3.4.15)、セリン型カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.16)、メタロカルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.17)、システイン型カルボキシペプチダーゼ(EC 3.4.18)、オメガペプチダーゼ(EC 3.4.19)、セリンエンドペプチダーゼ(EC 3.4.21)、システインエンドペプチダーゼ(EC 3.4.22)、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ(EC 3.4.23)、メタロ-エンドペプチダーゼ(EC 3.4.24)、トレオニンエンドペプチダーゼ (EC 3.4.25)、未知の触媒機構のエンドペプチダーゼ(EC 3.4.99)が挙げられる。
商業的に入手可能なプロテアーゼ酵素としては、限定されるものではないが、Lavergy(商標) Pro (BASF); Alcalase(登録商標)、Blaze(登録商標)、Duralase(商標)、Durazym(商標)、Relase(登録商標)、Relase(登録商標) Ultra、Savinase(登録商標)、Savinase(登録商標) Ultra、Primase(登録商標)、Polarzyme(登録商標)、Kannase(登録商標)、Liquanase(登録商標)、Liquanase(登録商標) Ultra、Ovozyme(登録商標)、Coronase(登録商標)、Coronase(登録商標) Ultra、Neutrase(登録商標)、Everlase(登録商標)およびEsperase(登録商標) (Novozymes A/S)、商標名Maxatase(登録商標)、Maxacal(登録商標)、Maxapem(登録商標)、Purafect(登録商標)、Purafect(登録商標) Prime、Purafect MA(登録商標)、Purafect Ox(登録商標)、Purafect OxP(登録商標)、Puramax(登録商標)、Properase(登録商標)、FN2(登録商標)、FN3(登録商標)、FN4(登録商標)、Excellase(登録商標)、Eraser(登録商標)、Ultimase(登録商標)、Opticlean(登録商標)、Effectenz(登録商標)、Preferenz(登録商標)およびOptimase(登録商標) (Danisco/DuPont)の下で販売されているもの、Axapem(商標) (Gist-Brocases N.V.)、バチルス・レンタス(Bacillus lentus)のアルカリプロテアーゼ、ならびにKaoからのKAP (バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)のスブチリシン)が挙げられる。
少なくとも1種のプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ(EC 3.4.21)から選択することができる。セリンプロテアーゼまたはセリンペプチダーゼ(EC 3.4.21)は、触媒活性部位にセリンを有し、触媒反応中に基質との共有結合付加体を形成することを特徴とする。セリンプロテアーゼを、キモトリプシン(例えば、EC 3.4.21.1)、エラスターゼ(例えば、EC 3.4.21.36)、エラスターゼ(例えば、EC 3.4.21.37またはEC 3.4.21.71)、グランザイム(例えば、EC 3.4.21.78またはEC 3.4.21.79)、カリクレイン(例えば、EC 3.4.21.34、EC 3.4.21.35、EC 3.4.21.118、またはEC 3.4.21.119)、プラスミン(例えば、EC 3.4.21.7)、トリプシン(例えば、EC 3.4.21.4)、トロンビン(例えば、EC 3.4.21.5)およびスブチリシン(スブチロペプチダーゼとしても知られる、例えば、EC 3.4.21.62)からなる群から選択することができ、後者は以後、「スブチリシン」とも呼ばれる。
セルラーゼ
「セルラーゼ」、「セルラーゼ酵素」または「セルロース分解酵素」は、セルロースの加水分解に関与する酵素である。3種の主要な型のセルラーゼ、すなわち、エンド-ss-1,4-グルカナーゼ(エンド-1,4-P-D-グルカン4-グルカノヒドロラーゼ、E.C. 3.2.1.4；セルロース中のβ-1,4-グルコシド結合を加水分解する)、セロビオヒドロラーゼ(1,4-P-D-グルカンセロビオヒドロラーゼ、EC 3.2.1.91)、およびss-グルコシダーゼ(EC 3.2.1.21)が公知である。
セルラーゼ酵素は、限定されるものではないが、WO1997/025417、WO1998/024799、WO2003/068910、WO2005/003319、およびWO2009020459などの特許および公開特許出願に記載されている。
商業的に入手可能なセルラーゼ酵素としては、Celluzyme(商標)、Endolase(商標)、Carezyme(商標)、Cellusoft(商標)、Renozyme(商標)、Celluclean(商標) (Novozymes A/Sから)、Ecostone(商標)、Biotouch(商標)、Econase(商標)、Ecopulp(商標) (AB Enzymes Finlandから)、Clazinase(商標)、およびPuradax HA(商標)、Genencor detergent cellulase L、IndiAge(商標) Neutra (Genencor International Inc./DuPontから)、Revitalenz(商標) (2000、DuPontから)、Primafast(商標) (DuPont)およびKAC-500(商標) (Kao Corporationから)が挙げられる。
本発明によるセルラーゼは、「セルロース分解活性」または「セルラーゼ活性」を有する。セルロース分解活性の測定のためのアッセイは、当業者には公知である。例えば、カルボキシメチルセルロースを還元炭水化物にセルラーゼ加水分解し、その還元能力を、Hoffman, W. S., J. Biol. Chem. 120, 51 (1937)による、フェリシアン化物反応によって比色的に決定することによって、セルロース分解活性を決定することができる。
マンナーゼ
マンナーゼ(E.C. 3.2.1.78)酵素は、マンナン、ガラクトマンナンおよびグルコマンナン中の内部β-1,4ベータ-D-マンノシド結合を加水分解する。「マンナーゼ」は、ファミリー5または26のアルカリマンナーゼであってもよい。マンナーゼはヘミセルロース含有染料の一部を除去するため、マンナーゼは洗浄および/またはクリーニング製剤の有用な成分である。これらの型の染料の不十分な除去は、例えば、繊維の灰色化をもたらし得る。ヘミセルロースの主な構成要素は、ヘテロ-1,4-D-キシランおよびヘテロ-1,4-ベータ-マンナンである。マンナンは、ガラクトースまたはアセチル置換を含有してもよい、β-1,4-結合D-マンノピラノシル残基の骨格を有する多糖であり、骨格中にグルコース残基を有してもよい。マンナーゼ酵素は、バチルスまたはフミコラ(Humicola)に由来する野生型、特に、バチルス・アガラドヘレンス(B. agaradhaerens)、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ハロデュランス(B. halodurans)、バチルス・クラウシ(B. clausii)、またはフミコラ・インソレンス(H. insolens)に由来することが知られている。好適なマンナーゼは、WO 99/064619に記載されている。
商業的に入手可能なマンナーゼ酵素としては、Mannaway(登録商標) (Novozymes AIS)が挙げられる。
ペクチン酸リアーゼ
ペクチン酸リアーゼ(E.C. 4.2.2.2)酵素は、(1->4)-アルファ-D-ガラクツロナンを除去的に切断して、その非還元末端に4-デオキシ-アルファ-D-ガラクト-4-エヌロノシル基を有するオリゴ糖を与える。
ペクチン酸リアーゼ酵素は、限定されるものではないが、WO2004/090099などの特許および公開特許出願に記載されている。ペクチン酸リアーゼは、バチルス、特に、バチルス・リケニフォルミスもしくはバチルス・アガラドへレンスに由来するか、または例えば、米国特許第6,124,127号、WO 99/027083、WO 99/027084、WO 2002/006442、WO 2002/092741、WO 2003/095638に記載された、これらのいずれかに由来するバリアントであることが知られている。
商業的に入手可能なペクチン酸リアーゼ酵素としては、 Xpect(商標)、Pectawash(商標)およびPectaway(商標) (Novozymes A/S); PrimaGreen(商標)、EcoScour (DuPont)が挙げられる。
ヌクレアーゼ
デオキシリボヌクレアーゼI、またはDNaseとしても知られるヌクレアーゼ(EC 3.1.21.1)は、5’-ホスホジヌクレオチドおよび5’-ホスホオリゴヌクレオチド最終産物へのエンドヌクレアーゼ的切断を実行する。
ヌクレアーゼ酵素は、限定されるものではないが、US3451935、GB1300596、DE10304331、WO2015155350、WO2015155351、WO2015166075、WO2015181287、およびWO2015181286などの特許および公開特許出願に記載されている。
本発明の一態様では、少なくとも1つの本発明のアミラーゼバリアントが、少なくとも1つのプロテアーゼと共に提供される。一実施形態では、本発明のアミラーゼバリアントは、少なくとも1つのプロテアーゼの存在下で安定である。一実施形態では、本発明のアミラーゼバリアントは、対応する親アミラーゼと比較した場合、プロテアーゼ安定性が増大している。一実施形態では、少なくとも1つのプロテアーゼは、WO 89/06279の表I中に配列a)として開示されたスブチリシン309、またはそれと少なくとも80%同一であり、タンパク質分解活性を有するそのバリアントから選択される。一実施形態では、本発明のアミラーゼバリアントは、配列番号1によるアミラーゼと比較した場合に、前記スブチリシン309またはそれと少なくとも80%同一であるそのバリアントの存在下でプロテアーゼ安定性が増大している。
プロテアーゼは、それ自身、プロテアーゼ安定剤によって安定化するか、またはプロテアーゼを非安定化することができる。一実施形態では、本発明のアミラーゼバリアントは、配列番号1によるアミラーゼと比較した場合に、非安定化されたスブチリシン309またはそれと少なくとも80%同一であるその非安定化されたバリアントの存在下でプロテアーゼ安定性が増大している。
作製方法：
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のバリアントポリペプチドを作製する方法であって、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を用意すること、核酸配列を宿主細胞中に形質転換すること、宿主細胞を培養して、バリアントポリペプチドを産生させること、および必要に応じて、宿主細胞からバリアントポリペプチドを精製することを含む、方法に関する。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを「発現」させることができる。用語「発現」または「遺伝子発現」とは、特定の遺伝子または複数の特定の遺伝子または特定の核酸構築物の転写を意味する。用語「発現」または「遺伝子発現」とは、遺伝子または複数の遺伝子または遺伝子構築物の構造RNA(例えば、rRNA、tRNA)またはmRNAへの転写、次いで、後者のタンパク質への翻訳または翻訳なし、を意味する。このプロセスは、DNAの転写および得られるmRNA産物のプロセッシングを含む。
酵素の工業生産は通常、発現系を使用することによって行われる。「発現系」は、宿主微生物、発現宿主、宿主細胞、産生生物、または産生株を意味し、これらの用語のそれぞれを互換的に使用することができる。一実施形態では、発現宿主は、細菌発現系、酵母発現系、真菌発現系、および合成発現系からなる群から選択される。発現宿主は、野生型細胞または組換え細胞であってもよい。本明細書における「野生型細胞」とは、ある特定の改変の前の細胞を意味する。用語「組換え細胞」(本明細書では「遺伝子改変細胞」とも呼ばれる)とは、それが誘導された野生型細胞と比較して、変更された、改変された、または異なる遺伝子型を示すように遺伝的に変更、改変または操作された細胞を指す。「組換え細胞」は、ある特定のタンパク質または酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを含んでもよく、したがって、前記タンパク質または酵素を発現してもよい。
かくして、一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物に向けられる。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターに向けられる。
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞に向けられる。
さらに別の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドを発現させる方法であって、
(a)本明細書に記載のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物を宿主細胞中に導入することによって、本明細書に記載のアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む異種核酸構築物を含む宿主細胞を提供するステップ；
(b)ポリヌクレオチドの発現を伝導する条件下でステップ(a)の組換え宿主細胞を培養するステップ；および
(c)必要に応じて、ポリヌクレオチドによってコードされる目的のタンパク質を回収するステップ
を含む、方法に向けられる。
発現系の例としては、限定されるものではないが、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、サーモミセス・ラヌギノサス(Thermomyces lanuginosus)、フサリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フサリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、大腸菌(Escherichia coli)、バチルス(Bacillus)、好ましくは、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)、またはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、シュードモナス(Pseudomonas)、好ましくは、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris) (コマガタエラ・ファフィ(Komagataella phaffii)としても知られる)、ミセリオプトラ・サーモフィル(Myceliopthora thermophile) (C1)、サーモテロミセス・サーモフィラ(Themothelomyces thermophila)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、トリコダーマ(Trichoderma)、好ましくは、トリコダーマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)およびサッカロミセス(Saccharomyces)、好ましくは、サッカロミセス・セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。バリアントポリペプチドを、上に列挙された発現系を使用して生産することができる。
一実施形態では、細菌発現系は、大腸菌、バチルス、シュードモナス、およびストレプトミセスから選択される。一実施形態では、酵母発現系は、カンジダ(Candida)、ピチア、サッカロミセス、および/またはシゾサッカロミセスから選択される。一実施形態では、真菌発現系は、ペニシリウム(Penicillium)、アスペルギルス、フサリウム、ミセリオプトラ(Myceliopthora)、リゾムコル(Rhizomucor)、リゾプス(Rhizopus)、サーモミセス(Thermomyces)、およびトリコダーマから選択される。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの文脈における用語「異種」(または外因性または外来または組換え)は、
(a)宿主細胞にとって天然ではない；
(b)宿主細胞にとって天然であるが、構造的改変、例えば、欠失、置換、および/もしくは挿入が、天然配列を変更するための組換えDNA技術によって宿主細胞のDNAの操作の結果として含まれる；または
(c)宿主細胞にとって天然であるが、発現が量的に変更されるか、もしくは発現が、組換えDNA技術による宿主細胞のDNAの操作の結果として、天然宿主細胞とは異なるゲノム位置、例えば、より強力なプロモーターから指令される、
と本明細書で定義される。
2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のアミノ酸配列に関して、用語「異種」は、2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のアミノ酸配列が、互いに特異的な組合せで天然に存在しないことを特徴付けるために使用される。
本明細書で使用される「遺伝子構築物」または「遺伝子カセット」は、本明細書に記載の1つ以上の制御配列(少なくともプロモーター)に機能し得る形で連結された、発現させようとする目的の少なくとも1つの配列から構成されるDNA分子である。典型的には、発現カセットは、3つのエレメント：プロモーター配列、オープンリーディングフレーム、および真核生物においては、通常、ポリアデニル化部位を含有する、3’非翻訳領域を含む。追加の調節エレメントとしては、転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーが挙げられる。イントロン配列を、5’非翻訳領域(UTR)に、またはコード配列中に付加して、細胞質ゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させることもできる。発現カセットは、ベクターの一部であってよいか、または宿主細胞のゲノム中に組み込み、その宿主細胞のゲノムと一緒に複製させることができる。発現カセットは通常、発現を増加させるか、または減少させることができる。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、別の細胞への移入のための、または所与の細胞内での安定な、もしくは一過的な発現のための、外来ポリヌクレオチド配列を運搬するのに好適な任意の種類の構築物を含む。本明細書で使用される用語「ベクター」は、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター(例えば、ファージ)、バクテリオファージ、バキュロウイルス、コスミド、フォスミド、人工染色体、または目的の特定の宿主に特異的な任意の他のベクターなどの、任意の種類のクローニング媒体を包含する。低コピー数または高コピー数ベクターも含まれる。外来ポリヌクレオチド配列は通常、本明細書では「目的の遺伝子」と呼ぶことができるコード配列を含む。目的の遺伝子は、宿主細胞の起源または目標の種類に応じて、イントロンおよびエクソンを含んでもよい。
本明細書で使用されるベクターは、宿主細胞または宿主細胞オルガネラへの形質転換時に外来ポリヌクレオチドの転写および翻訳のためのセグメントを提供してもよい。そのような追加のセグメントは、調節ヌクレオチド配列、特定の細胞型におけるその維持および/または複製にとって必要とされる1つ以上の複製起点、1つ以上の選択マーカー、ポリアデニル化シグナル、マルチクローニング部位などの外来コード配列の挿入のための好適な部位などを含んでもよい。一例は、ベクターが、エピソーム遺伝子エレメント(例えば、プラスミドまたはコスミド分子)として細菌細胞中で維持される必要がある場合である。好適な複製起点の非限定例としては、f1-oriおよびcolE1が挙げられる。
ベクターは、例えば、細菌宿主細胞中のプラスミドとして、宿主細胞のゲノム中に組み込むことなく複製することができるか、またはそれはそのDNAの一部もしくは全部を、宿主細胞のゲノム中に組み込み、かくして、そのDNAの複製および発現をもたらすことができる。
外来核酸を、クローニングによってベクター中に導入することができる。クローニングは、好適な手段および方法(例えば、制限酵素)によるベクター(例えば、マルチクローニング部位内での)および外来ポリヌクレオチドの切断によって、前記外来核酸とベクターとの制御された融合を可能にする、個々の核酸内の適合構造を作出することができることを意味してもよい。
ベクター中に導入されたら、コード配列を含む外来核酸は、宿主細胞または宿主細胞オルガネラへの導入(形質転換、形質導入、トランスフェクションなど)に適するようになってよい。宿主細胞または宿主細胞オルガネラ中での外来ポリヌクレオチド配列の発現にとって好適なクローニングベクターを選択することができる。
本明細書で言及される用語「導入」または「形質転換」は、移入のために用いられる方法によらず、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの移入を包含する。すなわち、本明細書で使用される用語「形質転換」は、ベクター、シャトルシステム、または宿主細胞とは独立であり、それは、当業界で公知の形質転換のポリヌクレオチド移入方法に関するだけでなく(例えば、Sambrook, J.ら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)、限定されるものではないが、形質導入またはトランスフェクションなどの任意のさらなる種類のポリヌクレオチド移入方法も包含する。器官形成または胚形成によるにしろ、その後のクローン増殖を可能にする植物組織を、遺伝子構築物と共に形質転換し、それから全植物を再生させることができる。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって利用可能な、かつそれに最も適したクローン増殖系に応じて変化するであろう。
本発明の一実施形態では、ベクターは、宿主細胞の形質転換のために使用される。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞中に一過的または安定的に導入し、例えば、プラスミドとして非組込みを維持することができる。「安定な形質転換」は、形質転換された細胞または細胞オルガネラが、次世代の細胞または細胞オルガネラに外来コード配列を含む核酸を渡すことを意味してもよい。通常、安定な形質転換は、外来コード配列を含む核酸の、染色体への、またはエピソーム(核DNAの別々の小片)としての組込みに起因する。
「一過的な形質転換」は、細胞または細胞オルガネラが、形質転換されたら、ある特定の時間にわたって、多くは、一世代以内で外来核酸配列を発現することを意味してもよい。通常、一過的な形質転換は、染色体中に、またはエピソームとして組み込まれない外来核酸配列を含む核酸に起因する。
あるいは、それは、宿主ゲノム中に組み込まれてもよい。次いで、得られる形質転換された植物細胞を使用して、当業者には公知の様式で形質転換された植物を再生することができる。
組換え細胞は、対応する野生型細胞と比較した場合、「増加した」または「減少した」発現を示してもよい。
本明細書で使用される用語「増加した発現」、「増強された発現」または「過剰発現」とは、元の野生型発現レベル(同様に発現の非存在または測定不能な発現であってもよい)に対して追加的である任意の形態の発現を意味する。本明細書における「増加した発現」、「増強された発現」または「過剰発現」に対する参照は、対照生物と比較した、遺伝子発現の増加ならびに/またはポリペプチドに関する限り、増加したポリペプチドレベルおよび/もしくは増加したポリペプチド活性を意味すると取られる。発現の増加は、優先順位の低い順に、対照生物のものと比較して少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、もしくは100%またはそれより多いものであってよい。
遺伝子または遺伝子産物の発現を増加させるための方法は、当業界で十分に立証されており、例えば、適切なプロモーターにより駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用を含む。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして働く単離された核酸を、非異種形態のポリヌクレオチドの適切な位置(典型的には、上流)に導入して、目的のポリペプチドをコードする核酸の発現を増加させることができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、および/もしくは置換によってin vivoで変更することができるか(Kmiecらの米国特許第5,565,350号; ZarlingらのWO 93/22443を参照されたい)、または単離されたプロモーターを、適切な向きおよび本発明の遺伝子からの適切な距離で生物中に導入して、遺伝子の発現を制御することができる。
イントロン配列を、5’非翻訳領域(UTR)または部分コード配列のコード配列に付加して、細胞質ゾル中に蓄積する成熟メッセージの量を増加させることもできる。発現構築物中の転写ユニットへのスプライス可能なイントロンの含有は、mRNAとタンパク質レベルとの両方において遺伝子発現を最大で1000倍増加させることが示された(BuchmanおよびBerg (1988) Mol. Cell biol. 8: 4395-4405; Callisら(1987) Genes Dev 1:1183-1200)。遺伝子発現のそのようなイントロン増強は、典型的には、転写ユニットの5’末端近くに配置した場合に最大となる。
ポリペプチドの増加した発現または過剰発現を得るために、最も一般的には、このポリペプチドをコードする核酸を、ポリアデニル化シグナルと共にセンス方向に過剰発現させる。イントロンまたは他の増強エレメントを、意図される発現パターンを有する発現を駆動するのに好適なプロモーターに加えて使用することができる。
酵素は、一般的には、所望の酵素の発現にとって好適な条件下での組換え細胞の培養によって所望の酵素を発現するそれを使用することによって商業生産される。
培養は通常、組換え細胞を増殖させ(このプロセスは発酵と呼ぶことができる)、所望のタンパク質を発現させる好適な栄養培地中で行われる。発酵の終わりに、発酵ブロスを収集し、発酵ブロスが液体画分と固体画分とを含む場合、さらにプロセッシングしてもよい。
目的の酵素を、発酵ブロスからさらに精製することができる。用語「精製」または「精製すること」とは、少なくとも１つの成分、例えば、目的のタンパク質を、少なくとも別の成分、例えば、発酵ブロスの粒子状物質から分離し、物理的障壁によって必ずしも分離する必要がない異なる区画または相に移すプロセスを指す。そのような異なる区画の例は、濾過膜または布によって隔てられた2つの区画、すなわち、濾液と保持液である；そのような異なる相の例は、それぞれ、沈殿物と上清またはケーキと濾液である。発酵ブロスから目的の酵素を精製した後に得られる溶液は、本明細書では「精製された酵素溶液」と呼ばれる。
所望の酵素を分泌させて(発酵ブロスの液体画分中に)もよく、または宿主細胞から分泌させなくてもよい(したがって、発酵ブロスの細胞中に含まれる)。これに応じて、所望の酵素を、発酵ブロスの液体画分から、または細胞溶解物から回収することができる。所望の酵素の回収は、当業者には公知の方法を使用する。発酵ブロスからのタンパク質または酵素の回収のための好適な方法としては、限定されるものではないが、収集、遠心分離、濾過、抽出、および沈降が挙げられる。目的の酵素が発酵ブロス中で沈降もしくは結晶化するか、または発酵ブロスの粒子状物質に少なくとも部分的に結合する場合、バイオマスから酵素を放出させるか、または酵素の結晶および沈降物を可溶化する追加の処理ステップが必要になることがある。US6316240B1は、発酵ブロスから、発酵中に沈降する、および/または結晶化する酵素を回収するための方法を記載する。所望の酵素が発酵ブロスの細胞中に含まれる場合、細胞からの酵素の放出が必要となることがある。細胞からの放出を、例えば、限定されるものではないが、当業者には周知の技術を用いた細胞溶解によって達成することができる。
精製された酵素溶液を、「酵素製剤」を形成させるためにさらにプロセッシングしてもよい。「酵素製剤」は、成分が、酵素製剤中に含まれる酵素を安定化する目的および/または酵素製剤自体の安定化に役立つ、少数の成分を含む任意の非複合製剤を意味する。用語「酵素安定性」は、保存または操作中の時間の関数としての酵素活性の保持に関する。用語「酵素製剤安定性」は、保存もしくは操作中の酵素製剤の物理的外見の維持ならびに保存もしくは操作中の微生物夾雑の回避に関する。
「酵素製剤」は、それ自身、最終使用について決定することができる複合製剤に製剤化されることを意図する組成物である。本発明による「酵素製剤」は、複数の成分が最終適用において特定の作用をそれぞれ個別に発揮するように複合製剤中に製剤化される、いくつかの成分を含む複合製剤ではない。複合製剤は、限定されるものではないが、個々の洗剤成分が、洗剤製剤の洗浄性能において有効な量で製剤化される、洗剤製剤であってもよい。
本発明の一態様では、少なくとも1つの本発明のアミラーゼバリアントは、酵素製剤中に含まれる。
酵素製剤は、固体または液体であってもよい。酵素製剤を、当業界で公知の技術を使用することによって得ることができる。例えば、限定されるものではないが、固体酵素製剤を、押出しまたは顆粒化によって得ることができる。好適な押出しおよび顆粒化技術は、当業界で公知であり、例えば、WO9419444A1およびWO9743482A1に記載されている。
酵素製剤の文脈における「液体」は、20℃および101.3kPaでの物理的外見に関する。
液体酵素製剤は、全て酵素製剤の総重量に対して、0.1～40重量%、または0.5～30重量%、または1～25重量%、または3～10重量%の範囲の酵素量を含んでもよい。
液体酵素製剤は、1より多い型の酵素を含んでもよい。一実施形態では、酵素製剤は、1種以上の本発明によるアミラーゼを含む。一実施形態では、酵素製剤は、1種以上の本発明によるアミラーゼと、第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ、ヌクレアーゼ、およびその任意の組合せからなる群から選択される少なくとも1種のさらなる酵素とを含む。
本発明の水性酵素製剤は、全て酵素製剤の総重量に対して、約50重量%より多い、約60重量%より多い、約70重量%より多い、または約80重量%より多い量の水を含んでもよい。
本発明の液体酵素製剤は、発酵培地から生じる塩、生産宿主細胞から生じる細胞破片、発酵中に生産宿主細胞によって産生される代謝物などの残留成分を含んでもよい。
一実施形態では、残留成分は、全て水性酵素製剤の総重量に対して、30重量%未満、20重量%未満、10重量%未満、または5重量%未満の量で液体酵素製剤中に含まれていてもよい。一実施形態では、酵素製剤、特に、液体酵素製剤は、1種以上の酵素に加えて、溶媒、塩、pH調節剤、保存剤、安定剤、キレート剤、および増粘剤からなる群から選択される1種以上の追加成分を含む。液体酵素製剤中の保存剤は、ソルビトール、安息香酸塩、プロキセル、またはそれらの任意の組合せであってもよい。液体酵素製剤中の安定剤は、MPG、グリセロール、酢酸塩、またはその任意の組合せであってもよい。液体酵素製剤中のキレート剤は、クエン酸塩であってもよい。
一実施形態では、酵素製剤は、少なくとも1種の本発明のポリペプチドバリアントと、少なくとも1種の保存剤とを含む。好適な保存剤の非限定例としては、(第4級)アンモニウム化合物、イソチアゾリノン、有機酸、およびホルムアルデヒド放出剤が挙げられる。好適な(第4級)アンモニウム化合物の非限定例としては、塩化ベンザルコニウム、ポリヘキサメチレンビグアニド(PHMB)、塩化ジデシルジメチルアンモニウム(DDAC)、およびN-(3-アミノプロピル)-N-ドデシルプロパン-1,3-ジアミン(ジアミン)が挙げられる。好適なイソチアゾリノンの非限定例としては、1,2-ベンゾイソチアゾリン-3-オン(BIT)、2-メチル-2H-イソチアゾール-3-オン(MIT)、5-クロロ-2-メチル-2H-イソチアゾール-3-オン(CIT)、2-オクチル-2H-イソチアゾール-3-オン(OIT)、および2-ブチル-ベンゾ[d]イソチアゾール-3-オン(BBIT)が挙げられる。好適な有機酸の非限定例としては、安息香酸、ソルビン酸、L-(+)-乳酸、ギ酸、およびサリチル酸が挙げられる。好適なホルムアルデヒド放出剤の非限定例としては、N,N’-メチレンビスモルホリン(MBM)、2,2',2''-(ヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン-1,3,5-トリイル)トリエタノール(HHT)、(エチレンジオキシ)ジメタノール、α,α',α''-トリメチル-1,3,5-トリアジン-1,3,5(2H,4H,6H)-トリエタノール(HPT)、3,3'-メチレンビス[5-メチルオキサゾリジン](MBO)、およびcis-1-(3-クロロアリル)-3,5,7-トリアザ-1-アゾニアダマンタンクロリド(CTAC)が挙げられる。
さらに有用な保存剤としては、ヨードプロピニルブチルカルバメート(IPBC)、ジクロロ-ジメチル-ヒダントイン(DCDMH)、ブロモ-クロロ-ジメチル-ヒダントイン(BCDMH）、およびジブロモ-ジメチル-ヒダントイン(DBDMH)などのハロゲン放出化合物；ブロノポール(2-ブロモ-2-ニトロプロパン-1,3-ジオール)、2,2-ジブロモ-2-シアノアセトアミド(DBNPA)などのブロモ-ニトロ化合物；グルタルアルデヒドなどのアルデヒド；フェノキシエタノール；ビフェニル-2-オール；ならびに亜鉛またはナトリウムピリチオンが挙げられる。
一実施形態では、酵素製剤は、少なくとも1種の本発明のポリペプチドバリアントと、少なくとも1種の酵素安定剤とを含む。酵素安定剤は、液体酵素製剤中に含まれる少なくとも1種の酵素の保存中の酵素活性の喪失を減少させることができる物質から選択される。本発明における酵素活性の喪失の減少は、酵素活性の喪失が、保存前の初期酵素活性と比較した場合に少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%減少することを意味してもよい。好ましい安定剤は、塩(例えば、CaCl2)、プロパンジオール、ポリエチレングリコール、MPG、グリセロール、酢酸塩、またはその任意の組合せからなる群から選択される。
酵素の用途
別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドバリアントを、食品において使用することができ、例えば、酵素は、パン焼きのための添加物であってもよい。酵素を、飼料において使用することができ、例えば、酵素は、動物飼料添加物である。酵素を、デンプン加工産業において使用することができ、例えば、アミラーゼは、デンプンのエタノールまたは糖(高フルクトースコーンシロップ)および油、ドライディスティラーグレインなどへの変換において使用される。ポリペプチドバリアントは、パルプおよび紙加工において使用され、例えば、酵素を、紙の強度を改善するために使用することができる。酵素を、採掘および油井サービスのために使用することができ、例えば、セルラーゼを、油井破砕中にグアーを破壊するために使用することができる。一実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドバリアントは、洗剤製剤またはクリーニング製剤において使用される。
一実施形態では、本発明は、生地または生地から調製される焼き製品を調製する方法であって、本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの1つを生地に添加し、それを焼くことを含む、方法に関する。一実施形態では、本発明は、デンプンを加工するための本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの使用方法に関する。一実施形態では、本発明は、繊維製品、硬表面、または食器をクリーニングまたは洗浄するための本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの使用方法に関する。一実施形態では、本発明は、エタノールを作製するための本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの使用方法に関する。一実施形態では、本発明は、パルプまたは紙を加工するための本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの使用方法に関する。一実施形態では、本発明は、動物に給餌するための本明細書に記載のアミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドの使用方法に関する。
一実施形態では、本発明のアミラーゼは、洗剤製剤またはクリーニング製剤において使用される。
「洗剤製剤」または「クリーニング製剤」は、汚れた材料をクリーニングするために指定される組成物を意味する。クリーニングは、洗濯および硬表面クリーニングを含む。本発明による汚れた材料は、繊維製品および/または硬表面を含む。
用語「洗濯」は、家庭での洗濯と工業用洗濯との両方に関し、繊維製品を、本発明の洗剤組成物を含有する溶液で処理するプロセスを意味する。洗濯プロセスを、家庭用または工業用洗濯機などの技術的デバイスを使用することによって実行することができる。あるいは、洗濯プロセスを、手で行ってもよい。
用語「繊維製品」とは、糸(編物もしくは織物のために使用される天然もしくは合成の繊維から作られる糸)、糸中間体、繊維、不織布材料、天然材料、合成材料、ならびに衣服(布地から作られる任意の衣類)、布および他の品物などの、これらの材料から作られる布地(繊維を織る、編む、もしくはフェルト状にすることによって作られる繊維製品)を含む任意の繊維製品材料を意味する。
用語「布地」は、天然繊維、合成繊維、およびその混合物を含む。天然繊維の例は、植物(亜麻、黄麻および綿など)またはコラーゲン、ケラチンおよびフィブロインのようなタンパク質を含む、動物(例えば、シルク、羊毛、アンゴラ、モヘア、カシミア)起源のものである。合成起源の繊維の例は、Spandex(登録商標)もしくはLycra(登録商標)などのポリウレタン繊維、ポリエステル繊維、エラストフィンなどのポリオレフィン、またはナイロンなどのポリアミド繊維である。繊維は、単一の繊維またはニットウェア、織物、または不織布などの繊維製品の一部であってもよい。
用語「硬表面クリーニング」は、硬表面が、床、家具、壁、衛生陶器、ガラス、刃物類または食器を含む金属表面などの、家庭における任意の硬表面を含んでもよい、硬表面のクリーニングと本明細書で定義される。
用語「食器洗浄」とは、例えば、手または自動食器洗い機による、全ての形態の食器洗浄を指す。食器洗浄は、限定されるものではないが、プレート、カップ、ガラス、ボウルなどの全ての形態の瀬戸物、スプーン、ナイフ、フォークおよび給仕用品などの全ての形態の刃物類ならびにセラミック、メラミンなどのプラスチック、金属、磁器、ガラスおよびアクリル樹脂のクリーニングを含む。
本発明の洗剤製剤は、1種以上の洗剤成分を含む。選択される成分は、所望のクリーニング適用および/または洗剤組成物の物理的形態に依存する。
用語「洗剤成分」は、界面活性剤、増量剤（building agent）、ポリマー、漂泊系などの、洗剤成分にとって好適である任意の型の成分を意味すると本明細書で定義される。その公知の特性を認める当業界で公知の任意の成分が、本発明による好適な洗剤成分である。一実施形態では、洗剤成分は、有効量で存在する場合に、洗浄もしくはクリーニング性能を提供するか、または加工を効率的に補助する(加工、保存および使用中に物理的特性を維持する；例えば、流動性改変剤、ハイドロトロープ、乾燥剤)成分を意味する。
通常、洗剤組成物は、３以上の洗剤成分の複合製剤である。
洗剤成分は、洗剤製剤の最終適用において2以上の機能を有してもよく、したがって、本明細書における特定の機能の文脈において記載される任意の洗剤成分は、洗剤製剤の最終適用において別の機能を有してもよい。洗剤製剤の最終適用における特定の洗剤成分の機能は、洗剤製剤中のその量、すなわち、洗剤成分の有効量に依存する。
用語「有効量」は、有効な染み除去および有効なクリーニング条件(例えば、pH、発泡の量)を提供するある特定の成分の量、視覚的利益(例えば、蛍光増白、染料移動阻害)を効率的に提供するある特定の成分の量、ならびに加工を効率的に補助するある特定の成分(加工、保存および使用中の物理的特性を維持する；例えば、流動性改変剤、ハイドロトロープ、乾燥剤)の量を含む。
一実施形態では、洗剤製剤は、少なくとも1種の成分が染み除去において有効であり、少なくとも1種の成分が視覚的クリーニング条件を提供するのに有効であり、少なくとも1種の成分が、洗剤の物理的特性を維持するのに有効である、2種より多い洗剤成分の製剤である。
クリーニング性能は、関連するクリーニング条件下で上昇する。本明細書における用語「関連するクリーニング条件」とは、洗濯機、自動食器洗い機または手によるクリーニングプロセスにおいて実際に用いられる、条件、特に、クリーニング温度、時間、クリーニング機構、石けん水濃度、洗剤の種類および水の硬度を指す。
個々の洗剤成分および洗剤組成物中での使用は、当業者には公知である。好適な洗剤成分は、特に、界面活性剤、増量剤、ポリマー、アルカリ、漂泊系、蛍光増白剤、石けん水抑制剤および安定化剤、ハイドロトロープ、ならびに防腐剤を含む。さらなる例は、例えば、「complete Technology Book on Detergents with Formulations (Detergent Cake, Dishwashing Detergents, Liquid & Paste Detergents, Enzyme Detergents, Cleaning Powder & Spray Dried Washing Powder)」、Engineers India Research Institute (EIRI)、第6版 (2015)に記載されている。当業者のための別の参考書は、「Detergent Formulations Encyclopedia」、Solverchem Publications、2016であってもよい。
洗剤成分は、白色繊維製品、着色繊維製品、およびウールの洗濯などの、所望の適用に応じて、洗剤製剤中での型および/または量が変化する。選択される成分は、洗剤製剤の物理的形態(パウチまたは錠剤として提供される、液体、固体、ゲルなど)にさらに依存する。例えば、洗濯製剤のために選択される成分はさらに、用いられる洗浄温度、洗濯機の機構(垂直軸と水平軸の機械)、洗浄サイクルあたりの水の消費量などのような側面とそれ自体関連する地域的な慣習および水の平均硬度のような地理的特性に依存する。
例えば、低い洗剤濃度系は、約800ppm未満の洗剤成分が洗浄水中に存在する洗濯製剤を含む。中程度の洗剤濃度は、約800ppm～約2,000ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗濯製剤を含む。高い洗剤濃度は、約2,000ppmの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗濯製剤を含む。
個々の洗剤成分について記載される数値範囲は、洗剤組成物中に含まれる量を提供する。そのような範囲は、範囲を規定する数字を含むことが理解されなければならず、規定の範囲内のそれぞれの整数を含む。
別途記載されない場合、「重量%」または「%w/w」は、総洗剤組成物に対するものであることを意味する。この場合、「重量%」または「%w/w」は、以下のように算出される：物質の重量としてのその物質の濃度を組成物の総重量で割って、100を掛ける。
本発明の洗剤製剤は、1種以上の界面活性剤を含んでもよい。「界面活性剤」(「表面活性剤」と本明細書では同義的に用いられる)は、液体に添加した場合、界面でのその液体の性質を変化させる有機化学物質を意味する。そのイオン電荷に従って、界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、または両性と呼ばれる。
界面活性剤の非限定例は、McCutcheon's 2016 Detergents and Emulsifiers、およびMcCutcheon's 2016 Functional Materials、両方ともNorth American and International Edition, MC Publishing Co, 2016年版に開示されている。さらに有用な例は、当業者には公知である同刊行物の以前の版に開示されている。
非イオン性界面活性剤は、正荷電でも負荷電(すなわち、イオン性)でもない官能基を含有する界面活性剤を意味する。アニオン性およびカチオン性界面活性剤とは対照的に、非イオン性界面活性剤は、溶液中でイオン化しない。
好ましい方法および使用：
本明細書で好ましいのは、AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアミラーゼを作製する方法であって、前記アミラーゼをコードする核酸配列を用意すること；核酸配列を発現宿主中に形質転換すること、発現宿主を培養して、アミラーゼを産生させること、および必要に応じて、アミラーゼを精製することを含む、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを作製する方法であって、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、または配列番号38を含む核酸配列を用意すること；核酸配列を発現宿主中に形質転換すること、発現宿主を培養して、アミラーゼを産生させること、および必要に応じて、アミラーゼを精製することを含む、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを作製する方法であって、配列番号55を含む核酸配列を用意すること；核酸配列を発現宿主中に形質転換すること、発現宿主を培養して、アミラーゼを産生させること、および必要に応じて、アミラーゼを精製することを含む、方法である。
発現宿主が、細菌発現系、酵母発現系、真菌発現系、および合成発現系からなる群から選択される、アミラーゼを作製する方法。
細菌発現系が、大腸菌、バチルス、シュードモナス、およびストレプトミセスから選択され、酵母発現系が、カンジダ、ピチア、サッカロミセス、シゾサッカロミセスから選択されるか、または真菌発現系が、ペニシリウム、アスペルギルス、フサリウム、ミセリオプトラ、サーモテロミセス、リゾムコル、リゾプス、サーモミセス、およびトリコダーマから選択され、好ましくは、バチルスである、アミラーゼを作製する方法。
本明細書で好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを作製する方法であって、発現宿主が、好ましくは、バチルス・プミルス、バチルス・スブチリス、およびバチルス・リケニフォルミスから選択され、最も好ましくは、バチルス・リケニフォルミスである、バチルス宿主細胞である、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを作製する方法であって、発現宿主が、好ましくは、バチルス・プミルス、バチルス・スブチリス、およびバチルス・リケニフォルミスから選択され、最も好ましくは、バチルス・リケニフォルミスである、バチルス宿主細胞である、方法である。
本明細書で好ましいのは、第1のアミラーゼのCドメインの使用方法であって、前記Cドメインが、配列番号42のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するAおよびBドメインを有する第2のアルファアミラーゼの、安定性、pHプロファイル、発現、活性、熱安定性、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、洗濯における性能からなる群から選択される1つ以上の特性を改善するため、デンプンを加工するため、繊維製品をクリーニングするため、硬表面をクリーニングするため、食器をクリーニングするため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、および動物に給餌するために、配列番号44のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記使用が、第2のアルファ-アミラーゼのCドメインを、第1のアルファ-アミラーゼのCドメインとを置き換えることを含む、方法である。
本明細書で好ましいのは、生地または生地から調製された焼き製品を調製する方法であって、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを、生地に添加すること、およびそれを焼くことを含む、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼを、生地に添加すること、およびそれを焼くことを含む、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、デンプンを加工するため、繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、または動物に給餌するため、好ましくは、繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、デンプンを加工するため、繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、または動物に給餌するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品、硬表面、または食器をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品、硬表面、または食器をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品、硬表面、または食器をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、または配列番号37の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
本明細書で好ましいのは、配列番号54の全長アミノ酸配列と少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも98.5%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、または100%同一であるアミノ酸配列を含むアミラーゼの使用方法であって、繊維製品をクリーニングまたは洗浄するための、方法である。
（実施例）
アミラーゼ発現構築物の生成
アミノ酸配列をコードする遺伝子を、コドン最適化して、バチルス・スブチリスの天然コドン存在量と一致させ、外部の商業的DNA提供業者によって物理的に合成した。受領後、これらの遺伝子を、制限-ライゲーションに基づく標準的なプロトコールによって、バチルス科の生物中での発現を提供することが知られるプロモーター、分泌シグナルペプチド、およびリボソーム結合部位(例えば、バチルス・スブチリスのamyE遺伝子の発現を駆動するプロモーター、バチルス・スブチリスのYdjM酵素のシグナルペプチド、およびコンセンサスShine-Dalgarno配列)をコードする領域を特徴とするグラム陽性発現ベクター中にクローニングした。このベクターはさらに、抗生物質に基づく選択マーカーおよび複製起点を含有していた。
反応後、プラスミドアセンブリ混合物を、Spizizenの方法(Anagnostopoulos,C. およびSpizizen,J. (1961). J. Bacteriol. 81, 741-746)に従って、WO2019016051にバチルス・スブチリスBs#053について記載されたDNA-メチルトランスフェラーゼ遺伝子が組み込まれたバチルス・スブチリスPY79 KO-7S (Bacillus Genetic Stock Center, BGSCID:1S145; Zeigler D.R)誘導体名Bs#056中に形質転換した。20μg/mlの硫酸カナマイシンを添加したLB寒天プレート上に播種し、37℃で一晩インキュベートすることによって、成功した形質転換体を選択した。一晩の選択後、個々のコロニーを取得した後、20μg/mlの硫酸カナマイシンを含むリッチ培地(例えば、LBブロス)中、37℃で一晩、250rpmで振とうしながら増殖させた。次の朝、細胞を遠心分離によって沈降させ、Macherey-Nagel NucleoSpinキットを用いるアルカリ溶解法によってプラスミドDNAを単離した。次いで、単離されたDNAを、エレクトロコンピテントなバチルス・リケニフォルミス細胞中に形質転換することができた。
エレクトロコンピテントなバチルス・リケニフォルミス細胞の調製およびDNAの形質転換を、以下の改変：DNAの形質転換時に、細胞を、選択的LB寒天プレート(20μl/mlの硫酸カナマイシン)上に播種し、37℃で一晩インキュベートした後、1mlのLBSPG緩衝剤中に回収し、37℃で60minインキュベートする(Vehmaanpera J., 1989, FEMS Microbio. Lett., 61: 165-170)を用いて、本質的にはBrigidiら(Brigidi,P., Mateuzzi,D. (1991). Biotechnol. Techniques 5, 5)によって記載されたように実施した。
アミラーゼ発現およびタンパク質定量化
発現株の単一コロニーを、96ウェルプレート(GE Life Sciences part 28403943)中、20μg/mLの硫酸カナマイシンを添加した60μLのリッチ培地(例えば、LBブロス)に播種した。培養物を、37℃で16時間増殖させた後、15μLの培養物を用いて、96ウェルプレート中、600μLの規定グルコース-ミネラル培地および20μg/mLの硫酸カナマイシンに接種した。培養物を37℃で48時間増殖させた後、遠心分離を用いて細胞を沈降させ、残留培養液体を除去することによって、上清を収獲した。アルファ-アミラーゼ活性を有するバリアントポリペプチドハイブリッドの発現レベル(mg/mLでの濃度)を、LabChip(LC)分析によって同定し、対応する発現プラスミドを、検証のために配列決定した。
レッドスターチおよび残存活性アッセイ
アルファ-アミラーゼを含有するバリアントポリペプチドに関するデンプン加水分解の量を、以下の改変を用いた、Megazyme、「Assay of Alpha-Amylase using Red-Starch」によって記載されたレッドスターチ法を使用して測定した。50mM HEPES、pH8.0緩衝剤中で調製された1.33%のレッドスターチ10μLを、50mM HEPES、pH8.0緩衝剤中に希釈した10μLの酵素と25℃で反応させた。50μLの200プルーフエタノールの添加によって、10分後に反応を終結させた。激しく混合した後、反応液を室温で10分間平衡化させた後、1,200xgで10分間、遠心分離した。40μLの反応液を移し、溶液の吸光度を、BioTekプレートリーダー中、510nmで読み取った。残存活性を、熱負荷の前後にレッドスターチアッセイを用いて測定したそれぞれの酵素の活性を比較することによって算出した。最初に試料を80℃に15分間加熱し、4℃で10分間冷やした後、24℃で5分間保持した後、25℃でレッドスターチアッセイを用いて試験することによって、50mM HEPES、pH8.0緩衝剤中に希釈した酵素に対して熱負荷を行った。
それぞれの酵素/温度の対を、技術的2回反復で行い(25℃で3回反復で行った、またはn=5)、2つの独立実験を異なる日に行った。残存活性プロットについて、「100%活性」に対する参照は、全温度にわたる最高活性測定値であった。80℃の熱負荷に関する結果を、図1に示す。配列番号54を有するアミラーゼ(430および454位に追加の突然変異を有する)をもたらす配列番号41のCドメインの、配列番号40のCドメインとの置き換えは、熱安定性を大きく増大させることが明確に視認できる。密接に関連するCドメイン(配列番号40のCドメインと密接に関連するような)の使用は、配列番号9について得られた結果によって強調される、配列番号41よりも安定であるハイブリッドを生じる。
洗濯適用(染み除去)における酵素性能
Swissatest Testmaterilien AGおよびCFT (Center for Testmaterials B.V.)から購入したデンプン(染みのタイプEMPA161およびCS28)で汚した綿に対する洗浄性能を、ハイブリッドアミラーゼについて測定した。配列番号39によるアミラーゼを、ハイブリッド分子である他のアミラーゼに関する参照として用いる。配列番号54は、例えば、183および184位に二重欠失を含有し、430および454位にさらに突然変異を含有する、配列番号42と配列番号44とのハイブリッドである。また、選択される他のアミラーゼ(配列番号5、配列番号11、配列番号17および配列番号27)は、配列番号54に対してCドメインが有意に変化したハイブリッドである。
8.0～8.5のpHをもたらす、2.5mMの硬水(14°dH、deutsche Harte) + 3.3g/Lの洗剤ES1(Maranil DBS/LC LAS 5.5% w/w、Edenorヤシ脂肪酸C12-C18ヤシ脂肪酸 2.4% w/w、Lutensol AO7 AEO 5.4% w/w、Texapon N70 FAEO 5.4% w/w、1,2プロピレングリコール6.0% w/w、エタノール2.0% w/w、KOH 2.2% w/w) + 3%クエン酸ナトリウム中、0.05、0.1、0.2、または0.4ppｍでアミラーゼを投与した。40℃で30分間にわたって Launder-O-meter (SDS Atlas)を用いて洗浄を行った。洗浄液を除去した後、布地を水で3回リンスした。試料を、室温で一晩乾燥した。洗浄性能を、分光光度計(ELREPHPO、Datacolor)を用いる洗浄した染みのデジタル画像分析を使用して測定し、平均L*AB強度を、アミラーゼを含まない洗剤基剤に対して正規化した後、4つのデータポイント(0.05、0.1、0.2、または0.4ppm)の平均を提供する。
試験染みCS28およびEMPA161に対する洗浄性能を、ddEとして示して、アミラーゼ特異的効果(dE amy - dE洗剤基剤)を示す。
Figure 2022545465000001
 上の表に提供された結果は、ハイブリッドアミラーゼ酵素が、親酵素である配列番号39と比較した場合、改善された性能(染み除去)を有することを示す。
熱負荷（熱チャレンジ）による安定性試験
本発明のハイブリッド酵素を、アミノ酸配列におけるさらなる変化によって安定化することができる。高温でバリアントを保存し、ある特定の時間後の残存活性を測定することによって、これを試験した。
したがって、酵素を、0.1M Hepes pH8.0中で約20μg/mLに希釈し、PCR装置を用いて、92℃で10min負荷した後、4℃で冷やした。負荷しなかった対照を、4℃で保持した。残存活性を測定するために、負荷した酵素および対照を、製造業者の指示書(Megazyme)に従って0.1M Hepes pH8.0および0.05%Tween20中で調製した1%レッドスターチ中で10倍希釈し、室温で10minインキュベートした。反応を2倍容量の氷冷エタノールでクエンチし、10minインキュベートした後、スピンダウンした。上清を新しいプレートに移し、510nmで吸光度を読み取った。改善係数(IF)を、特定のバリアントと、親である配列番号54との比として算出した。
配列番号39による番号付けを使用して、配列番号54中に突然変異を導入する。
Figure 2022545465000002
液体洗濯洗剤中でのハイブリッドバリアントの保存
アミノ酸配列のさらなる変化による本発明のハイブリッド酵素の安定化を、液体洗剤中でバリアントを保存し、ある特定の時間後に残存活性を測定することによってさらに試験した。
R101E突然変異を有する1%のバチルス・レンタスアルカリプロテアーゼ(BLAP)を含む、ES1-C洗剤溶液(Maranil DBS/LC LAS 5.5% w/w, Edenor C12-C18ヤシ脂肪酸2.4% w/w、Lutensol AO7 AEO 5.5% w/w、Texapon N70 FAEO 5.5% w/w、1,2プロピレングリコール6.0% w/w、エタノール2.0% w/w、KOH 2.2% w/wおよびクエン酸Na 3%、pH 8)中でアミラーゼをインキュベートすることによって液体洗濯洗剤中での保存を行い、37℃で7日間保存した。試料を、0および7日目に採取し、50mM MOPS、pH7中に希釈した後、室温でInfinityアミラーゼ試薬を用いて分析した。活性は、5分間にわたって5点MaxVとして算出される405nmでの勾配である。参照ハイブリッドアミラーゼである配列番号54に対する改善係数(IF)を、それぞれのバリアントの保存後の残存活性パーセントを取得し、それを、配列番号54の保存後の残存活性パーセントで割ることによって算出する。配列番号39による番号付けを使用して、配列番号54中に突然変異を導入する。
Figure 2022545465000003
ハイブリッドバリアントに関するマイクロスケールでの洗浄試験
本発明のハイブリッドを、アミノ酸配列における小さい変化によってクリーニング性能においてより効率的にすることができる。これを、マイクロスケールでの洗浄試験によって試験した。
バリアントを用いて、室温で洗浄液に0.02、0.05および0.1ppmのアミラーゼを60分にわたって添加した2.78mMの硬水(15.5°dH、deutsche Harte) を含む3.3g/LのES1 C(Lutensit A-LBS LAS 5.5% w/w、Edenorヤシ脂肪酸C12-C18ヤシ脂肪酸2.4% w/w、Lutensol AO7 AEO 5.5% w/w、Texapon N70 FAEO 5.5% w/w、1,2プロピレングリコール6.0% w/w、エタノール2.0% w/w、KOH 2.2% w/wおよびクエン酸Na 3%、pH 8)中で古いトウモロコシデンプン染み(CS-126)を洗浄した後、流水下で5minにわたってリンスし、乾燥し、RGB値の平均として反射光の強度について測定した。特定のバリアントの性能の、配列番号54のものに対する比を作製したところ、1より大きい数字は、より高い性能を示す。
配列番号39による番号付けを使用して、配列番号54中に突然変異を導入する。
Figure 2022545465000004

Claims (25)

  1. AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインを含むアルファ-アミラーゼ活性を有する単離された、合成の、または組換え、ポリペプチド。
  2. AおよびBドメインのアミノ酸配列が、配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が、配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、AおよびBドメインならびにCドメインからなる、アルファ-アミラーゼ活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. AおよびBドメインが、配列番号42のアミノ酸配列を有するAおよびBドメインに対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する、請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. Cドメインが、配列番号44のアミノ酸配列を有するCドメインに対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. 1個以上の位置に置換、欠失、および/または挿入を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  6. 配列TQXDYLDHPDVIGWTREGDXXHXXSGLAXLMSDGPXGXKWMXVGKNNAGEXWXDITGNQTNTVTINXDGXGQFXVXXGSXSIYXQX(式中、Xは任意のアミノ酸であってよい)を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. 配列番号39の番号付けによる、402R,H; 419S,G,D; 420V,I; 422,A,V; 423N,D,G,K; 428T,A; 435G,R,E; 437S,A; 441N,E,D; 444K,E; 450V,I; 452Y,H,R; 466K,R; 469W,S; 473H,Q,R; 475S,N; 476G,E; 479V,A; 483V,I; および485R,Q,Kからなる群から選択される1個以上のアミノ酸残基を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  8. 配列番号39の番号付けによる、430および454からなる群から選択される、好ましくは、I430MおよびM454Iからなる群から選択される1個以上の位置での置換を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 配列番号39に存在する401、403、405、411、413、415、424、426、428、432、455、477、479および481(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 配列番号40に存在する309、313、347、348、350、351、354、355、358、359、388、389、392および396(配列番号39の番号付けによる)からなる群から選択される1個以上のアミノ酸位置にアミノ酸残基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 配列番号39の番号付けによる181、182、183および184位に対応する1個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181、182、183および184位に対応する2個以上のアミノ酸の欠失、好ましくは、181および182、182および183、または183および184位に対応するアミノ酸の欠失(配列番号39の番号付けによる)を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 配列番号39の番号付けによる9、130、195、206、244、202、179、181、186、および190からなる群から選択される1個以上の位置の置換、好ましくは、配列番号39の番号付けによるM9L、E130V、N195F、I206L、S244Q、M202L、K179L、R181E、G186E/N/Q/SおよびE190Pからなる群から選択される1個以上の置換を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 以下：
    (a)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列；
    (b)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38との少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
    (c)高ストリンジェンシー条件下で、
    (i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37をコードする配列；または
    (ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に示されるポリヌクレオチド
    の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列；
    または
    (d)アミラーゼ活性を有する(a)、(b)、もしくは(c)の断片
    を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. アミラーゼが、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して、発現、活性、熱安定性、安定性、洗濯における性能、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、またはその任意の組合せが増加している、好ましくは、アミラーゼが、配列番号39または配列番号40に示されるアミラーゼと比較して熱安定性が増加している、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 単離された、合成、または組換え核酸であって、
    (a)核酸がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有する核酸配列；
    (b)ポリペプチドが、アミラーゼ活性を有する、配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%もしくは100%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする、または請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列；
    (c)高ストリンジェンシー条件下で、
    (i)配列番号54、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、もしくは配列番号37をコードする配列；または
    (ii)配列番号55、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、もしくは配列番号38に示されるポリヌクレオチド
    の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチド；
    (d)断片がアミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、(a)、(b)、もしくは(c)の断片；または
    (e)（a)～(d)のいずれかと完全に相補的な核酸配列
    を含む、単離された、合成、または組換え核酸。
  16. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸構築物。
  17. 請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６に記載の核酸構築物を含む、発現ベクター。
  18. 請求項１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載の核酸構築物、または請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  19. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを含む、組成物。
  20. 第2のアミラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ラッカーゼ、マンナーゼ、ペクチナーゼ、キシラナーゼ、およびヌクレアーゼからなる群から選択される少なくとも1つの第2の酵素をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 請求項１～１４のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを作製する方法であって、ポリペプチドをコードする核酸を用意すること、核酸配列を発現宿主中に形質転換すること、発現宿主を培養して、ポリペプチドを産生させること、および必要に応じて、ポリペプチドを精製することを含む、方法。
  22. 生地または生地から調製される焼き製品を調製する方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを、生地に添加すること、およびそれを焼くことを含む、方法。
  23. 繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するため、デンプンを加工するため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、または動物に給餌するため、好ましくは、繊維製品、硬表面、もしくは食器をクリーニングもしくは洗浄するための、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドの使用方法。
  24. ハイブリッドが、AおよびBドメインならびにCドメインを含み、AおよびBドメインのアミノ酸配列が配列番号42のアミノ酸配列と少なくとも75%同一であり、Cドメインのアミノ酸配列が配列番号44のアミノ酸配列と少なくとも75%同一である、少なくとも2つの異なるアミラーゼに由来するハイブリッドを作製するステップを含む、アルファ-アミラーゼ活性を有する、単離された、合成の、または組換えの、ポリペプチドを作製する方法。
  25. 第1のアミラーゼのCドメインの使用方法であって、前記Cドメインが、配列番号42のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するAおよびBドメインを有する第2のアルファアミラーゼの、安定性、pHプロファイル、発現、活性、熱安定性、比活性、基質特異性、pH依存的活性、pH依存的安定性、酸化的安定性、Ca2+依存性、洗濯における性能からなる群から選択される1つ以上の特性を改善するため、デンプンを加工するため、繊維製品をクリーニングするため、硬表面をクリーニングするため、食器をクリーニングするため、エタノールを作製するため、パルプもしくは紙を加工するため、および動物に給餌するために、配列番号44のアミノ酸配列に対する少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記使用が、第2のアルファ-アミラーゼのCドメインを、第1のアルファ-アミラーゼのCドメインとを置き換えることを含む、方法。
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