RS61648B1 - Kompozicije i metode za antitela koja ciljaju epo - Google Patents

Description

Opis

Osnova pronalaska

[0001] Dijabetička retinopatija (DR) najčešća je komplikacija kod pacijenata sa dijabetesom. Dijabetični edem makule (DME) može se javiti u bilo kojoj fazi DR, i glavni je uzrok gubitka vida kod pacijenata sa DR. Prijavljeno je da je incidencija DME nakon 10 godina praćenja 20,1% kod dijabetesa tip 1, 25,4% kod dijabetesa tip 2 zavisnog od insulina, i 13,9% kod dijabetesa tip 2 koji nije zavisan od insulina (Klein et al. (1995) Ophthalmology 102, 7-16). Ispitivanje ETDRS ((1985) Fotokoagulacija za dijabetični edem makule - Izveštaj studije o ranom lečenju dijabetične retinopatije .1. Archives of Ophthalmology 103, 1796-1806), pionirska studija za DR, pokazala je da, iako terapija laserskom fotokoagulacijom smanjuje rizik od umerenog gubitka vida u očima sa DME za ~ 50% nakon 3 godine, samo neke oči povrate vid, a neke oči i dalje doživljavaju gubitak vida čak i nakon intenzivnog lečenja. Poslednjih godina napredak u farmakoterapiji i isporuci lekova za oči pokazao se obećavajućim za lečenje DME. Studija RESTORE, jedno od dva ključna ispitivanja faze III za DME (Mitchell et al. (2011) Ophthalmology 118, 615-625) pokazali su da je Lucentis ® superiorniji od laserske monoterapije. Prosečna promena najbolje korigovane oštrine vida (BCVA), koja je bila primarna klinička krajnja tačka, značajno je poboljšana u grupi sa lekom Lucentis ® (6,1 slovo za grupu Lucentis ® u odnosu na 0,8 slova za lasersku grupu; p <0,0001). Slični korisni efekti demonstrirani su kod VEGF Trap-Eye (Regeneron Inc., NY, SAD) i Ozurdex® (intravitrealni implantat deksametazona; Allergan Inc., CA, SAD) (Do et al. (2011) Ophthalmology 118, 1819-1826; Haller et al. (2010) Archives of Ophthalmology 128, 289-296). Međutim, 16% očiju lečenih lekom Ozurdex razvilo je povećani intraokularni pritisak, koji predstavlja rizik za glaukom.

[0002] Yanagihara et al. (J Immunoassay Immunochem 29: 181-96, 2008) opisuje proizvodnju antirekombinantnih monoklonskih antitela humanih eritropoetina (EPO) i daje pet mišjih monoklonskih antitela koja su specifično reagovala sa humanim EPO. Antitelo autora Yanagihara et al. sa najjačim afinitetom za EPO imalo je KDod 516 pM.

[0003] Uprkos ovim novim mogućnostima lečenja DME, i dalje postoji znatna nezadovoljena potreba za lečenjem. ~ 25% očiju u ključnim ispitivanjima leka Lucentis® nije dobilo nikakvu oštrinu vida nakon 12 meseci lečenja, a ~ 50% očiju je zadržalo oštrinu vida 20/40 ili goru. Studije asocijacije kompletnog genoma pokazale su da dijabetičari koji su homozigotni za polimorfizam promotera eritropoetina (Epo) (T) imaju 2,17 puta veći rizik od razvoja proliferativnog DR (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 6998-7003). Zanimljivo je da ljudi sa alelom T promotera za Epo imaju približno 7,5 puta veću koncentraciju Epo u staklastom telu u odnosu na ljude sa alelom G (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 6998-7003).

[0004] I dalje postoji potreba za razvijanjem efikasnog lečenja za dijabetičku retinopatiju, posebno DME koji bi zamenio ili dopunio postojeće tretmane.

Sažetak pronalaska

[0005] Pronalazak se odnosi na antitela ili antigen vezujuće fragmente, kako su ovde opisani, a koji vezuju Epo i/ili darbepoetin.

[0006] U skladu s tim, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, a sastoji se od sekvenci varijabilnog domena teškog i lakog lanca Fab NVS1 (SEQ ID NO: 13, odnosno 14), NVS2 (SEQ ID NO: 33, odnosno 34), NVS3 (SEQ ID NO: 53, odnosno 54) ili NVS4 (SEQ ID NOs: 73 odnosno 74).

[0007] Ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti vezuju Epo i/ili darbepoetin sa KDmanjim ili jednakim 100 pM. Na primer, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu se vezati za humani Epo i/ili darbepoetin sa KDmanjim ili jednakim 50 pM, manjim ili jednakim 40 pM, manjim ili jednakim 35 pM, manjim ili jednakim 30 pM, manjim ili jednakim 25 pM, manjim ili jednakim 20 pM, manjim ili jednakim 15 pM, manjim ili jednakim 14 pM, manjim ili jednakim 13 pM, manjim ili jednakim 12 pM, manjim ili jednakim 11 pM, manjim ili jednakim 10 pM. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju humani Epo sa KDmanjim ili jednakim 35 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 6 pM, izmereno tehnikom ravnotežne titracije rastvora (SET). Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju darbepoetin sa KDmanjim ili jednakim 24 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 4 pM, izmereno pomoću SET.

[0008] Ovde se opisano izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za Epo čoveka, cinomolgusa, miša i/ili pacova. Ovde su takođe opisana izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koji vezuju konformacioni epitop koji sadrži aminokiseline odabrane od humanog Epo spirala D i petlja AB. Ovde su takođe opisana izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koji vezuju konformacioni epitop koji sadrži aminokiseline odabrane od humanog Epo spirala D, petlja AB i spirala A. Izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu se vezati za D spiralu domena Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88). U drugim aspektima, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu da vezuju domen petlje AB (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89). U drugim aspektima, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu da vezuju domen petlje AB (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89) i spirale A (aminokiseline 4-26 humanog Epo; SEQ ID NO: 86). Ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu da vezuju domen spirale D Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88) i domen petlje A-B (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89). Ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu da vezuju domen spirale D Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88) i spirale A (aminokiseline 4-26 humanog Epo; SEQ ID NO: 86). Ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu da vezuju domen spirale D Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88), domen petlje A-B (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89) i spirale A (aminokiseline 4-26 humanog Epo; SEQ ID NO: 86).

[0009] Ovde su takođe opisana izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koji vezuju konformacioni epitop na Epo koji sadrži aminokiselinske ostatke Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 i Arg162 iz humanog Epo (SEQ ID NO.81). Dalje su opisana izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koji vezuju konformacioni epitop na Epo koji sadrži aminokiselinske ostatke Ser9, Gln13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151 , Lys154, Leu155, Gly158, Glu159 i Arg162, humanog Epo (SEQ ID NO.81). Ovde su takođe opisana izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koji vezuju konformacioni epitop na Epo koji sadrži aminokiselinske ostatke Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 i Arg162, humanog Epo (SEQ ID NO.81).

[0010] Predmetna prijava takođe opisuje izolovana antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente, koji vezuju Epo i dalje se takmiče u vezivanju za antitelo, kako je opisano u Tabeli 1. Predmetna prijava takođe opisuje izolovana antitela ili antigen vezujuće fragmente, koji vezuju isti epitop kao antitelo opisano u Tabeli 1.

[0011] Dalje opisano ovde je izolovano antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji vezuje Epo i ima izoelektričnu tačku (pI) veću od 8,2, veću od 8,3, veću od 8,4, veću od 8,5 ili veću od 9,0.

[0012] Ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju cinomolgusov Epo, Epo miša i/ili Epo pacova sa KDmanjim ili jednakim 100 pM, manjim ili jednakim 80 pM, manjim ili jednakim 70 pM, manjim ili jednakim 60 pM, manjim ili jednakim 50 pM, manjim ili jednakim 40 pM, manjim ili jednakim 35 pM, manjim ili jednakim 30 pM, manjim ili jednakim 25 pM, manjim ili jednakim 20 pM, manjim ili jednakim 15 pM, manjim ili jednakim 10 pM, manjim ili jednakim 5 pM, manjim ili jednakim 4 pM, manjim ili jednakim 3 pM, manjim ili jednakim 2 pM, manjim ili jednakim 1 pM. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju cinomolgusov Epo, Epo miša i/ili Epo pacova sa KDmanjim ili jednakim 80 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 40 pM, izmereno pomoću SET. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju cinomolgusov Epo sa KDmanjim ili jednakim 80 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 8 pM, izmereno pomoću SET. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju mišji Epo sa KDmanjim ili jednakim 45 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 37 pM, izmereno pomoću SET. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti mogu takođe da vezuju Epo pacova sa KDmanjim ili jednakim 57 pM, izmereno pomoću sistema Biacore, ili manjim ili jednakim 13 pM, izmereno pomoću SET.

[0013] Afinitet vezivanja izolovanih antitela i antigen vezujućih fragmenata koji su ovde opisani može se odrediti pomoću SET. Postupci za SET su poznati u struci, i detaljnije su opisani u nastavku. Alternativno, afinitet vezivanja ovde opisanih izolovanih antitela ili fragmenata može se odrediti Biacore testom. Postupci za kinetičke testove Biacore poznati su u struci, i detaljnije su opisani u nastavku.

[0014] Ovde opisana izolovana antitela i antigen vezujući fragmenti mogu se koristiti za inhibiranje Epo-zavisne proliferacije ćelija sa IC50manjim ili jednakim 350 pM, manjim ili jednakim 300 pM, manjim ili jednakim 250 pM, manjim ili jednakim 200 pM, manjim ili jednakim 190 pM, manjim ili jednakim 180 pM, manjim ili jednakim 175 pM, manjim ili jednakim 170 pM, manjim ili jednakim 160 pM, manjim ili jednakim 150 pM, manjim ili jednakim 125 pM, manjim ili jednakim 115 pM, manjim ili jednakim 110 pM, manjim ili jednakim 100 pM, manjim ili jednakim 90 pM, ili manjim ili jednakim 80 pM. Preciznije, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je ovde opisano, može da inhibira Epo-zavisnu proliferaciju ćelija, mereno pomoću in vitro testa proliferacije Ba/F3-EpoR ćelija sa IC50manjim ili jednakim 338 pM, manjim ili jednakim 183 pM, manjim ili jednakim 175 pM, manjim ili jednakim 174 pM, manjim ili jednakim 145 pM, manjim ili jednakim 112 pM, manjim ili jednakim 89 pM, ili manjim ili jednakim 74 pM.

[0015] Ovde opisana izolovana antitela i antigen vezujući fragmenti mogu se koristiti za inhibiranje Epo-zavisne ćelijske proliferacije u B ćelijama. Preciznije, ovde opisana izolovana antitela i antigen vezujući fragmenti mogu se koristiti za inhibiranje Epo-zavisne proliferacije ćelija u B-ćelijama miša. Na primer, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu da inhibiraju Epo-zavisnu proliferaciju ćelija mereno pomoću in vitro testa proliferacije Ba/F3-EpoR ćelija sa IC50manjim ili jednakim 350 pM, manjim ili jednakim 300 pM, manjim ili jednakim 250 pM, manjim ili jednakim 200 pM, manjim ili jednakim 175 pM, manjim ili jednakim 150 pM, manjim ili jednakim 125 pM, manjim ili jednakim 115 pM, manjim ili jednakim 110 pM, manjim ili jednakim 100 pM, manjim ili jednakim 90 pM, ili manjim ili jednakim 80 pM. Preciznije, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je ovde opisano, može da inhibira Epo-zavisnu proliferaciju ćelija, mereno pomoću in vitro testa proliferacije Ba/F3-EpoR ćelija sa IC50manjim ili jednakim 338 pM, manjim ili jednakim 174 pM, manjim ili jednakim 112 pM, ili manjim ili jednakim 74 pM.

[0016] Ovde opisana izolovana antitela i antigen vezujući fragmenti mogu se koristiti za inhibiranje Epo-zavisne proliferacije ćelija humanih B ćelija. Na primer, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može da inhibira Epo-zavisnu proliferaciju ćelija, mereno in vitro testom proliferacije ćelija F36E, sa IC50manjim ili jednakim 200 pM, manjim ili jednakim 190 pM, manjim ili jednakim 180 pM, manjim ili jednakim 170 pM, manjim ili jednakim 160 pM, manjim ili jednakim 150 pM, manjim ili jednakim 125 pM, manjim ili jednakim 100 pM, ili manjim ili jednakim 90 pM. Preciznije, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kao što je ovde opisano, može da inhibira Epo-zavisnu proliferaciju ćelija, mereno pomoću in vitro testa proliferacije ćelija F36E sa IC50manjim ili jednakim 183 pM, manjim ili jednakim 175 pM, manjim ili jednakim 145 pM, ili manjim ili jednakim 89 pM.

[0017] Izolovana antitela, ili njihovi antigen vezujući fragmenti, mogu takođe da blokiraju vezivanje Epo za Epo receptor i / ili da spreče vezivanje Epo za površinu ćelije.

[0018] Dalje opisana ovde su izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, koja se specifično vezuju za Epo čoveka, cinomolgusa, miša i/ili pacova. U daljem aspektu, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment takmiči se u vezivanju sa antitelom ili antigen vezujućim fragmentom, opisanom u Tabeli 1.

[0019] Izolovana antitela, ili njihovi antigen vezujući fragmenti, kako su ovde opisani, mogu biti monoklonska antitela, humana ili humanizovana antitela, himerna antitela, jednolančana antitela, Fab fragmenti, Fv fragmenti, F(ab')2 fragmenti ili ScFv fragmenti, i/ili izotipovi IgG.

[0020] Izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, kao što je ovde opisano, takođe mogu sadržati okvir u kojem je aminokiselina supstituisana u okvir antitela iz odgovarajućih sekvenci VH ili VL humane germinativne linije.

[0021] Izolovana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu imati kompletne sekvence teškog i lakog lanca Fab opisane u Tabeli 1. Preciznije, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati sekvence teškog i lakog lanca Fab NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4.

[0022] Dalji aspekt pronalaska uključuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, koji ima sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca Fab NVS1 (SEQ ID NO 13, odnosno 14), NVS2 (SEQ ID NO 33, odnosno 34), NVS3 (SEQ ID NO 53, odnosno 54), ili NVS4 (SEQ ID NO 73, odnosno 74).

[0023] U jednom aspektu pronalaska, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment uključuje sekvencu varijabilnog domena teškog lanca (VH) odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 33, 53 i 73. Izolovano antitelo ili antigen vezujući fragment dalje može da sadrži sekvencu promenljivog domena lakog lanca (VL), pri čemu se varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca kombinuju i formiraju mesto vezivanja antigena za Epo. Konkretno, sekvenca varijabilnog domena lakog lanca može se odabrati od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74, pri čemu se navedeno izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za Epo.

[0024] Pronalazak se takođe odnosi na izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji uključuje sekvencu varijabilnog domena lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74, pri čemu se navedeno izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment vezuje za humani Epo. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu dalje da sadrže sekvencu varijabilnog domena teškog lanca, pri čemu se varijabilni domen lakog lanca i varijabilni domen teškog lanca kombinuju i formiraju i mesto vezivanja antigena za Epo.

[0025] Konkretno, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se vezuje za Epo, mogu imati varijabilne domene teškog i lakog lanca koji sadrže sekvence SEQ ID NO: 13 i 14; 33 i 34; 53 i 54; odnosno 73 i 74.

[0026] U drugom aspektu pronalaska, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se vezuje za Epo, ima teški lanac i laki lanac koji sadrži sekvence SEQ ID NO: 15 i 16; 35 i 36; 55 i 56; odnosno 75 i 76.

[0027] Pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kako je ovde opisano. Kao i kompozicije antitela u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Konkretno, pronalazak nadalje uključuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku opisan u Tabeli 1, kao što su, na primer, antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže kombinaciju dva ili više izolovanih antitela ili njihovih antigen vezujućih fragmenata prema pronalasku opisanih u Tabeli 1.

[0028] Pronalazak se takođe odnosi na izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni teški lanac koji ima sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 13, 33, 53 i 73. Konkretno, nukleinska kiselina ima sekvencu sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, 37, 57 i 77. U daljem aspektu pronalaska, sekvenca je SEQ ID NO: 17, 37, 57, ili 77.

[0029] Pronalazak se takođe odnosi na izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira varijabilni laki lanac koji ima sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74. Konkretno, nukleinska kiselina ima sekvencu sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 38, 58 i 78. U daljem aspektu pronalaska, sekvenca je SEQ ID NO: 18, 38, 58, ili 78.

[0030] Pronalazak se takođe odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu koja kodira polipeptid koja uključuje varijabilni domen lakog lanca koja ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sekvence sa sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 18, 38, 58 i 78.

[0031] Pronalazak se takođe odnosi na vektor koji uključuje jednu ili više ovde opisanih molekula nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0032] Pronalazak se takođe odnosi na izolovanu ćeliju domaćina koja uključuje jedan ili više ovde opisanih molekula ili vektora nukleinske kiseline prema pronalasku. Pronalazak se takođe odnosi na izolovanu ćeliju domaćina koja uključuje sekvencu rekombinantne DNK koja kodira teški lanac gore opisanog antitela prema pronalasku i drugu sekvencu rekombinantne DNK koja kodira laki lanac gore opisanog antitela prema pronalasku, pri čemu su navedene sekvence DNK operativno povezane sa promoterom i sposobne su za ekspresiju u ćeliji domaćinu. Razmatra se da antitelo može biti humano monoklonsko antitelo. Takođe se razmatra da je ćelija domaćin nehumana ćelija sisara, na primer CHO ćelija.

[0033] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranja Epo-zavisne proliferacije ćelija, pri čemu postupak uključuje korak dovođenje u kontakt Epo (npr. dovođenje u kontakt Epo kod ispitanika) sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente ovde opisanog pronalaska; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. U jednom aspektu, postupak uključuje dovođenje u kontakt ćelije (npr. ćelije koja sadrži Epo) sa kompozicijom koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu za inhibiranje Epo-zavisne proliferacije ćelija kod ispitanika. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0034] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranje Epo-zavisne ćelijske signalizacije, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano, kako bi se sprečilo da Epo stupi u interakciju sa receptorom na površini ćelije. U jednom aspektu, postupak uključuje dovođenje u kontakt ćelije koja sadrži Epo sa kompozicijom koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u inhibiranju Epo-zavisne ćelijske signalizacije kod ispitanika. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0035] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranje Epo-zavisne ćelijske proliferacije ili signalizacije, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano, radi sprečavanja interakcije Epo sa

1

receptorima na površini ćelije. Smatra se da je ćelija B ćelija. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija.

[0036] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranje vezivanja Epo za Epo receptor, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt (npr. dovođenja Epo u kontakt kod ispitanika) sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u inhibiranju vezivanja Epo za Epo receptor na ćeliji ispitanika; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0037] Pronalazak se dalje odnosi na postupak za inhibiranje vezivanja Epo za ćeliju, pri čemu postupak uključuje dovođenje u kontakt Epo (npr. kod ispitanika) sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. U jednom aspektu, postupak uključuje dovođenje u kontakt ćelije (npr. ćelije koja sadrži Epo) sa kompozicijom koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano. Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u inhibiranju vezivanja Epo za ćeliju ispitanika. U jednom aspektu, smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0038] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje makularnog edema kod ispitanika, pri čemu postupak uključuje korak davanja ispitaniku efektivne količine kompozicije koja sadrži antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za lečenje makularnog edema kod ispitanika. U jednom aspektu, makularni edem je povezan sa vaskularnom bolešću mrežnjače. Razmatra se da vaskularna bolest mrežnjače povezana s edemom makule može uključivati dijabetičku retinopatiju, dijabetični makularni edem, proliferativnu dijabetičku retinopatiju, neproliferativnu dijabetičku retinopatiju, starosnu degeneraciju makule, okluziju vene mrežnjače, multifokalni horoiditis, miopičnu horoidnu neovaskularizaciju, ili retinopatiju nedonoščadi. Takođe se razmatra da je ispitanik čovek.

[0039] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje stanja ili poremećaja povezanog sa vaskularnom bolešću mrežnjače kod ispitanika, pri čemu postupak uključuje korak davanja ispitaniku efektivne količine kompozicije koja sadrži antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače kod subjekta. U jednom aspektu, smatra se da je stanje ili poremećaj povezan sa vaskularnom bolešću mrežnjače dijabetička retinopatija. U drugom aspektu, smatra se da je stanje ili poremećaj starosna degeneracija makule. Još se dalje razmatra da stanje ili poremećaj povezan sa vaskularnom bolešću mrežnjače može biti okluzija vene mrežnjače, multifokalni horoiditis, miopična horoidalna neovaskularizacija ili retinopatija nedonoščadi. Takođe se razmatra da je ispitanik čovek.

[0040] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa dijabetičkom retinopatijom kod ispitanika, pri čemu postupak uključuje korak davanja ispitaniku efektivne količine kompozicije koja sadrži antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa dijabetičkom retinopatijom kod ispitanika. Razmatra se da je ispitanik čovek.

[0041] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa edemom makule kod ispitanika, pri čemu postupak uključuje korak davanja ispitaniku efektivne količine kompozicije koja sadrži antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment, kako je ovde opisano, za lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa edemom makule kod ispitanika. Dalje se razmatra da je stanje ili poremećaj povezan sa edemom makule dijabetični makularni edem. Dalje se razmatra da je ispitanik čovek.

[0042] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje proliferativne dijabetičke retinopatije kod ispitanika, pri čemu postupak uključuje korak davanja ispitaniku efektivne količine kompozicije koja sadrži antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može sadržati antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koji sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kako je ovde opisano, za lečenje proliferativne dijabetičke retinopatije kod ispitanika. Dalje se razmatra da se kompozicija daje u oko ispitanika, pri čemu kompozicija smanjuje dilataciju vene mrežnjače, smanjuje vaskularno curenje i / ili povećava protok krvi u oku. Dalje se razmatra da je ispitanik čovek.

[0043] Bilo koje prethodno pomenuto izolovano antitelo ili njegovi antigen vezujući fragmenti može biti monoklonsko antitelo ili njegov antigen vezujući fragment.

Definicije

[0044] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje kao što obično podrazumevaju stručnjaci u struci na koju se ovaj pronalazak odnosi.

[0045] Termin „antitelo“, kako se ovde koristi, označava kompletno antitelo i bilo koji antigen vezujući fragment (tj., „antigen vezujući deo“) ili njegov jedan lanac. Kompletno antitelo je glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca . Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CL. VH i VL regioni se mogu dalje dodatno podeliti u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni za određivanje

1

komplementarnosti (CDR), prošarane regionima koji su više očuvani, nazvani regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, poređana od amino terminusa do karboksi terminusa sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćine ili faktore, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplemenata.

[0046] Pojam „antigen vezujući deo“ ili „antigen vezujući fragment“ antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na jedan ili više fragmenata netaknutog antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za dati antigen (npr., eritropoetin: Epo). Antigen vezujuće funkcije antitela mogu se izvoditi pomoću fragmenata netaknutog antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih pojmom „antigen vezujući deo“ ili „antigen vezujući fragment“ uključuju Fab fragment, jednovalentni fragment koji se sastoji od domena VL, VH, CL i CH1; F(ab)2fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu šarke; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela; fragment antitela sa jednom domenom (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341: 544-546), koja se sastoji od VH domena ili VL domena; i izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR).

[0047] Nadalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana odvojenim genima, njima se, rekombinantnim postupcima, može pridružiti veštački peptidni linker koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni uparuju i formiraju jednovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr., Ptice et al., 1988 Science 242: 423-426; i Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci.85: 5879-5883). Takva jednolančana antitela uključuju jedan ili više antigen vezujućih delova ili fragmenata antitela. Ti fragmenti antitela su pribavljeni putem uobičajenih tehnika poznatih stručnjacima za ovu oblast, i fragmenti su podvrgnuti skriningu za korisnost na isti način kao i netaknuta antitela.

[0048] Antigen vezujući fragmenti se takođe mogu ugraditi u antitela sa jednim domenom, maksitela, minitela, intratela, dijatela, trijatitela, tetratela, v-NAR i bis-scFv (vidi, npr, Hollinger i Hudson, 2005., Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Antigen vezujući delovi antitela se mogu graftovati na konstrukcije na bazi polipeptida, kao što je fibronektin tip III (Fn3) (vidi US Pat. br.6,703,199, koji opisuje monotela polipeptida fibronektina).

[0049] Antigen vezujući fragmenti se mogu uklopiti u jednolančane molekule koji sadrže par tandemskih Fv segmenata (VH-CH1-VH-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipeptidima lakog lanca, čine par antigen vezujućih regiona (Zapata et al., 1995. Protein Eng. 8 (10): 1057-1062; i US Pat. br.5,641,870).

[0050] Kako se ovde koristi, termin „afinitet“ se odnosi na jačinu interakcije između antitela i antigena na jednom antigenskom mestu. U okviru svakog antigenskog mesta, varijabilni region „kraka“ antitela interaguje putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što je više interakcija, jači je afinitet. Kako se ovde koristi, izraz „veliki afinitet“ za antitelo ili njegov antigen vezujući fragment (npr. Fab fragment) obično se odnosi na antitelo ili antigen vezujući fragment, sa KD od 10<-9>M ili manje.

[0051] Izraz „aminokiselina“ odnosi se na prirodne i sintetičke aminokiseline, kao i na analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na sličan način kao prirodne aminokiseline. Prirodne aminokiseline su one kodirane genetskim kodom, kao i one aminokiseline koje se kasnije modifikuju, npr, hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat i O-fosfoserin. Analozi aminokiselina odnose se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodne aminokiseline, tj., alfa ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, npr, homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr., norleucin) ili modifikovane peptidne skelete, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodne aminokiseline. Mimetik aminokiselina odnosi se na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja se razlikuje od opšte hemijske strukture aminokiseline, ali koja funkcioniše na sličan način kao prirodne aminokiseline.

[0052] Izraz „specifičnost vezivanja“, kako se ovde koristi, odnosi se na sposobnost pojedinačnog mesta kombinovanja antitela da reaguje samo sa jednom antigenskom determinantom.

1

[0053] Izraz „specifično (ili selektivno) se vezuje“ za antitelo (npr., Epo-vezujuće antitelo) odnosi se na reakciju vezivanja koja je odlučujuća za prisustvo srodnog antigena (npr, ljudski Epo ili cinomolgusov Epo) u heterogenoj populaciji proteina i drugih bioloških sredstava. Fraze "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" ovde se koriste kao sinonimi termina "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".

[0054] Izraz „stanje ili poremećaj povezan sa vaskularnom bolešću mrežnjače“ odnosi se na stanja, poremećaje ili bolesti u kojima se mrežnjača degeneriše ili postaje nefunkcionalna. To uključuje dijabetičku retinopatiju (DR), dijabetički makularni edem (DME), proliferativnu dijabetičku retinopatiju (PDR), neproliferativnu dijabetičku retinopatiju (NPDR), starosnu degeneraciju makule (AMD), okluziju vene mrežnjače (RVO), multifokalni horoiditis, miopičnu horoidalnu neovaskularizaciju ili retinopatiju nedonoščadi. Anatomske karakteristike vaskularne bolesti mrežnjače koje se mogu lečiti Epo inhibicijom uključuju edem makule, dilataciju vena, tortuoznost krvnih sudova, vaskularno curenje mereno fluoresceinskom angiografijom, krvarenje u mrežnjači i mikrovaskularne anomalije (npr. mikroaneurizma, meki eksudati mrežnjače, IRMA), gubitak kapilara, adhezija leukocita, ishemija mrežnjače, neovaskularizacija optičkog diska, neovaskularizacija zadnjeg pola, neovaskularizacija irisa, intraretinalno krvarenje, krvarenje u staklastom telu, makularni ožiljak, subretinalna fibroza i fibroza mrežnjače.

[0055] Izraz „stanje ili poremećaj povezan sa dijabetičkom retinopatijom“ odnosi se na stanja u kojima se mrežnača degeneriše ili postaje disfunkcionalna, kao posledica efekta dijabetesa melitusa (tip 1 ili tip 2) na vaskulaciju mrežnjače, metabolizam mrežnjače, pigmentni epitel mrežnjače, krvno-retinalnu barijeru ili očni nivo naprednih krajnjih proizvoda glikacije (AGE), aktivnost aldoza reduktaze, glikozilovani hemoglobin i protein kinazu C. Gubitak vida kod pacijenata sa dijabetičkom retinopatijom može biti rezultat ishemije mrežnjače, edema makule, vaskularnog curenja, krvarenje u staklastom telu ili direktnih efekata povišenih nivoa glukoze na neurone mrežnjače. Anatomske karakteristike dijabetičke retinopatije koje se mogu lečiti Epo inhibicijom uključuju mikroaneurizmu, meke eksudate mrežnjače, dilataciju vena, edem makule, intraretinalne mikrovaskularne abnormalnosti (IRMA), intraretinalno krvarenje, vaskularnu proliferaciju, neovaskularizaciju diska, rubeozu i ishemiju mrežnjače. „Dijabetički makularni edem“ pojavljuje se kod osoba sa dijabetičkom retinopatijom, i može se javiti u bilo kojoj fazi bolesti.

1

[0056] Pojam „stanje ili poremećaj povezan sa edemom makule“ odnosi se na stanja ili poremećaje kod kojih se otok ili zadebljanje makule javlja kao rezultat propuštanja tečnosti iz krvnih sudova mrežnjače, „edem makule“. Makularni edem se javlja kod vaskularne bolesti mrežnjače, i često je njena komplikacija. Specifična stanja ili poremećaji povezani sa edemom makule uključuju dijabetičku retinopatiju, dijabetički edem makule, proliferativnu dijabetičku retinopatiju, neproliferativnu dijabetičku retinopatiju, starosnu degeneraciju makule, okluziju vene mrežnjače, multifokalni horoiditis, miopičnu horoidnu neovaskularizaciju, ili retinopatiju nedonoščadi. Lečenje edema makule inhibicijom Epo može se odrediti funduskopskim pregledom, optičkom koherentnom tomografijom i poboljšanjem oštrine vida.

[0057] Izraz „himerno antitelo“ je molekul antitela u kome (a) konstantni region ili njegov deo se menja, zamenjuje ili razmenjuje tako da je mesto vezivanja antigena (varijabilni region) povezano sa konstantnim regionom različite ili promenjene klase, efektorske funkcije i/ili vrste, ili potpuno drugačijim molekulom koji himernim antitelima daje nova svojstva, npr., enzim, toksin, hormon, faktor rasta, lek itd.; ili (b) varijabilni region ili njegov deo se menja, zamenjuje ili razmenjuje varijabilnim regionom koji ima drugačiju ili promenjenu specifičnost antigena. Na primer, mišje antitelo se može modifikovati zamenom njegovog konstantnog regiona konstantnim regionom iz humanog imunoglobulina. Zbog zamene s humanim konstantnim regionom, himerno antitelo može zadržati svoju specifičnost u prepoznavanju antigena, istovremeno imajući smanjenu antigenost kod ljudi u odnosu na originalno mišje antitelo.

[0058] Pojmovi „Epo protein“ ili „Epo antigen“ ili „EPO“ ili „Epo“ koriste se naizmenično i odnose se na protein eritropoetin u različitim vrstama. Na primer, ljudski Epo ima sekvencu kako je prikazano u Tabeli 1: SEQ ID NO: 81. Primeri Epo proteina iz drugih vrsta dati su u Tabeli 1, SEQ ID NO: 82, 83, 84 ili 85. Proteinske sekvence za ljudski, cinomolgusov, miš, pacovski i zečji Epo su javno dostupne, i opisane u Tabeli 1. Humani Epo takođe može biti hiperglikozilovan. Hiperglikozilovani Epo je u struci poznat i pod nazivom „darbepoetin“, i može se dobiti iz različitih izvora, uključujući LEK Pharmacueticals.

[0059] Izraz „konzervativno modifikovana varijanta“ odnosi se na sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina. S obzirom na određene sekvence nukleinske kiseline, konzervativno modifikovane varijante odnose se na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili

1

suštinski identične sekvence aminokiselina, ili gde nukleinska kiselina ne kodira sekvencu aminokiselina, u suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju aminokiselinu alanin. Dakle, na svakom položaju u kojem je alanin specificiran kodonom, kodon se može izmeniti u bilo koji odgovarajući opisani kodon bez menjanja kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinske kiseline su „tihe varijacije“, koje su jedna od vrsta konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline koja ovde kodira polipeptid takođe opisuje sve moguće tihe varijacije nukleinske kiseline. Stručnjak će prepoznati da se svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može modifikovati tako da daje funkcionalno identičan molekul. U skladu s tim, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je obuhvaćena svakom opisanom sekvencom.

[0060] Za polipeptidne sekvence, „konzervativno modifikovane varijante“ uključuju pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije polipeptidne sekvence koje dovode do supstitucije aminokiseline hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline dobro su poznate u struci. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak, i ne isključuju polimorfne varijante, međuvrsne homologe i alele iz ponalaska. Sledećih osam grupa sadrže aminokiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu: 1) alanin (A), glicin (G); 2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); 3) asparagin (N), glutamin (Q); 4) arginin (R), lizin (K); 5) izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); 6) fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W); 7) serin (S), treonin (T); i 8) cistein (C), metionin (M) (vidi, npr., Creighton, Proteins (1984)). U nekim otelotvorenjima, pojam „konzervativne modifikacije sekvence“ koristi se za modifikacije aminokiselina koje ne utiču značajno i ne menjaju karakteristike vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu.

[0061] Izraz „epitop“ označava proteinsku determinantu koja se može specifično vezati za antitelo. Epitopi se uobičajeno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome da se vezivanje za prve, ali ne i za druge, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača.

1

[0062] Termin „humano antitelo“, kako se ovde koristi, treba da obuhvata antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR-i dobijeni od sekvenci humanog porekla. Nadalje, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz takvih ljudskih sekvenci, npr., sekvence humane germinativne linije ili mutirane verzije sekvence humane germinativne linije. Humana antitela iz otkrića mogu da uključe ostatke aminokiselina koji nisu kodirani humanim sekvencama (npr. mutacije uvedene nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).

[0063] Termin „humano monoklonsko antitelo“ se odnosi na antitela koja pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja, koja imaju varijabilne regione u kojima su i regioni okvira i CDR dobijeni od humanih sekvenci. U jednom otelotvorenju, humana monoklonska antitela se proizvode hibridomima koji uključuju (i) B ćeliju dobijenu od transgenih nehumanih životinja, npr., transgeni miš, koji ima genom koji se sastoji od transgena teškog lanca čoveka i transgena lakog lanca (ii) fuzionisanog sa imortalizovanom ćelijom.

[0064] „Humanizovano“ antitelo je antitelo koje zadržava reaktivnost nehumanog antitela, pri čemu je manje imunogeno kod ljudi. To se može postići, na primer, zadržavanjem nehumanih CDR regiona i zamenom preostalih delova antitela njihovim humanim parnjacima (tj. konstantnog regiona, kao i delova okvira varijabilnog regiona). Vidi, npr., Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81: 6851-6855, 1984; Morrison i Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92, 1988; Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498, 1991; i Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, 1994. Drugi primeri tehnologije humanog inženjerstva uključuju, ali nisu ograničeni na tehnologiju Xoma prikazanu u US 5,766,886.

[0065] Pojmovi „identičan“ ili 100% „identičnost“, u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptidnih sekvenci, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste. Dve sekvence su „suštinski identične“ ako dve sekvence imaju određeni procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj., 60% identičnosti, opciono 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identičnosti u određenom regionu ili, ako nije navedeno, u celoj sekvenci), kada se uporede i poravnaju tako da maksimalno odgovaraju u delu koji se poredi, ili određenom regionu kao što je izmereno pomoću jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci ili ručnim poravnavanjem i vizuelnim pregledom. Po želji, identičnost postoji u regionu koji ima dužinu najmanje oko 50 nukleotida (ili 10 aminokiselina), ili još

1

poželjnije, u regionu koji ima dužinu 100 do 500 ili 1000 ili više nukleotida (ili 20, 50, 200 ili više aminokiselina).

[0066] Za poređenje sekvenci, obično jedna sekvenca deluje kao referentna sekvenca, s kojom se upoređuju ispitivane sekvence. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, ispitivane i referentne sekvence se unose u računar, po potrebi se određuju koordinate podsekvence, i određuju se parametri programa algoritma sekvence. Mogu se koristiti zadati parametri programa, ili se mogu odrediti alternativni parametri. Algoritam za poređenje sekvenci zatim izračunava procenat identičnosti sekvence za ispitivane sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu parametara programa.

[0067] „Deo za upoređivanje“, kako se ovde koristi, uključuje referencu na segment bilo kog broja susednih pozicija odabranih iz grupe koja se sastoji od 20 do 600, obično oko 50 do oko 200, češće oko 100 do oko 150, u kome se sekvenca može upoređivati sa referentnom sekvencom sa istim brojem susednih položaja nakon što se dve sekvence optimalno poravnaju. Postupci za poravnavanje sekvenci za poređenje dobro su poznati u struci. Može se izvršiti optimalno poravnanje sekvenci za poređenje, npr, pomoću algoritma lokalne homologije autora Smith i Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2: 482c, algoritma za poravnanje homologije, Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol.48: 443, 1970, postupka traženja sličnosti, Pearson i Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u softverskom paketu Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili ručnog poravnavanja i vizuelnog pregleda (vidi, npr, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).

[0068] Dva primera algoritama koji su pogodni za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence su algoritmi BLAST i BLAST 2.0, koje su opisali Altschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; odnosno Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. Softver za izvođenje BLAST analiza javno je dostupan putem Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information). Ovaj algoritam uključuje prvo identifikovanje parova sekvenci sa visokim rezultatom (high scoring sequence pairs, HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine W u ispitivanoj sekvenci, koji se podudaraju ili zadovoljavaju neki pozitivan rezultat vrednosti praga T kada se poravnaju sa rečju iste dužine u sekvenci baze podataka. T se naziva pragom rezultata susedne reči (Altschul et al,

2

supra). Ovi početni pogoci susedne reči deluju kao seme za pokretanje pretraživanja, kako bi se pronašli duži HSP koji ih sadrže. Pogoci reči se produžavaju u oba smera duž svake sekvence dokle god se može povećati kumulativni rezultat poravnanja. Kumulativni rezultati se izračunavaju koristeći, za nukleotidne sekvence, parametre M (nagradni rezultat za par odgovarajućih ostataka; uvek > 0) i N (kazneni rezultat za neusklađenost ostataka; uvek < 0). Za aminokiselinske sekvence, matrica rezultata koristi se za izračunavanje kumulativnog rezultata. Proširenje pogodaka reči u svakom smeru zaustavlja se kada: kumulativni rezultat poravnanja opadne za veličinu X sa svoje maksimalne postignute vrednosti; kumulativni rezultat padne na nulu ili ispod, zbog akumulacije jednog ili više poravnanja ostataka s negativnim rezultatom; ili je dosegnut kraj bilo koje sekvence. Parametri BLAST algoritma W, T i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. Program BLASTN (za nukleotidne sekvence) koristi prema zadatim postavkama dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) ili 10, M = 5, N = -4 i poređenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, program BLASTP kao zadate vrednosti koristi dužinu reči od 3 i očekivanje (E) od 10, i matricu rezultata BLOSUM62 (vidi Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989) poravnanja (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M = 5, N = -4 i poređenje oba lanca.

[0069] BLAST algoritam takođe vrši statističku analizu sličnosti između dve sekvence (vidi, npr., Karlin i Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787, 1993). Jedno merilo sličnosti koje obezbeđuje algoritam BLAST je najmanja verovatnoća zbira (P (N)), koja daje pokazatelj verovatnoće kojom bi slučajno došlo do podudaranja između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom referentnoj sekvenci ako je najmanja verovatnoća zbira prilikom poređenja ispitivane nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom manja od oko 0,2, poželjnije manja od oko 0,01, a najpoželjnije manja od oko 0,001.

[0070] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence takođe se može utvrditi pomoću algoritma E. Meyersa i W. Millera (Comput. Appl. Biosci. 4:11-17, 1988), koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 tabele težine ostataka, kaznene dužine praznine od 12 i kaznene praznine od 4. Uz to, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može se odrediti pomoću algoritma koji su dali Needleman i Wunsch (J. Mol, Biol. 48: 444-453, 1970) koji je ugrađen u program GAP u programskom paketu GCG (dostupan na mreži na gcg.com), koristeći matricu Blossom 62 ili matricu PAM250, i težinu praznine 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i dužinsku težinu 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.

[0071] Osim prethodno navedenog procenta identičnosti sekvence, još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinskih kiselina ili polipeptida suštinski identične je da je polipeptid kodiran prvom nukleinskom kiselinom imunološki unakrsno reaktivan sa antitelima izazvanim polipeptidom kodiranim drugom nukleinskom kiselinom, kao što je opisano u nastavku. Dakle, polipeptid je tipično suštinski identičan drugom polipeptidu, na primer, kada se dva peptida razlikuju samo po konzervativnim supstitucijama. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je da se dva molekula ili njihovi komplementi hibridizuju međusobno pod strogim uslovima, kao što je opisano u nastavku. Još jedan pokazatelj da su dve sekvence nukleinske kiseline suštinski identične je da se isti prajmeri mogu koristiti za pojačavanje sekvence.

[0072] Izraz „inhibiraju (ili inhibira) Epo-zavisnu ćelijsku proliferaciju“ odnosi se na sposobnost anti-Epo antitela da ometa ćelijsku aktivaciju (npr. ćelijska signalizacija), replikaciju i/ili proliferaciju koju stimuliše i/ili indukuje Epo. Konkretno, „inhibiranje“ se odnosi na statistički značajno smanjenje (tj. p<0,05) Epo-zavisne ćelijske proliferacije ili drugog parametra (npr. Epo-zavisna ćelijska signalizacija, angiogeneza), kod ispitanika nakon kontakta sa anti-Epo antitelom ili njegovim fragmentom, kako je ovde opisano u odnosu na kontrolu. Kako se ovde koristi, „inhibiraju (ili inhibira) Epo-zavisnu ćelijsku proliferaciju“ može se odnositi i na klinički značajno poboljšanje vizuelne funkcije ili anatomije mrežnjače nakon tretmana ovde opisanim anti-Epo antitelom kod pacijenta kojem je dijagnostikovano stanje ili poremećaj povezan sa vaskularnom bolešću mrežnjače, kako je opisano u nastavku.

[0073] Kako se ovde koristi, „inhibiraju (ili inhibira) Epo-zavisnu ćelijsku proliferaciju“ odnosi se na sposobnost ovde opisanog anti-Epo antitela da proizvede statistički značajno (tj. p<0,05) smanjenje aktivacije intraćelijskih signalnih puteva stimulisanih ili indukovanih putem Epo.

[0074] Izraz „izolovano antitelo“ odnosi se na antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za Epo suštinski je bez antitela koja se specifično vezuju za druge antigene osim Epo). Međutim, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za Epo može imati unakrsnu reaktivnost na druge antigene. Štaviše, izolovano antitelo može biti u velikoj meri slobodno od drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

[0075] Termin „izotip“ označava klasu antitela (npr. IgM, IgE, IgG, kao što je IgG1 ili IgG4) koju obezbeđuju geni konstantnog regiona teškog lanca. Izotip takođe uključuje modifikovane verzije jedne od tih klasa, gde su modifikacije načinjene da bi se izmenila Fc funkcija, na primer, da bi se pojačale ili smanjile efektorske funkcije ili vezivanje za Fc receptore. Izotip se takođe odnosi na klasu antitela (npr. kapa, lambda) koja je obezbeđena konstantnim regionima lakog lanca.

[0076] Termin „Kassoc“ ili „Ka“, kako se ovde koristi, treba da se odnosi na brzinu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok se termin „Kdis“ ili „Kd“, kako se ovde koristi, odnosi na brzinu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Izraz „KD“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kd prema Ka (tj. Kd/Ka) i izražava se kao molska koncentracija (M). KDvrednosti za antitela se mogu odrediti pomoću metoda dobro poznatih u struci. Metode za određivanje KDantitela uključuju merenje površinske plazmonske rezonance pomoću biosenzorskog sistema kao što je Biacore<®>sistem ili merenje afiniteta putem ravnotežne titracije rastvora (SET).

[0077] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskih antitela" kako se ovde koriste označavaju pripremu molekula antitela iz jedne molekulske kompozicije. Kompozicija monoklonskog antitela ispoljava pojedinačnu specifičnost vezivanja i afinitet prema konkretnom epitopu.

[0078] Termin „nukleinska kiselina“ ovde se koristi naizmenično sa terminom „polinukleotid“ i odnosi se na dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge nukleotida ili modifikovane ostatke skeleta ili veze, koji su sintetički, prirodno se javljaju i ne javljaju se u prirodi, a imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i koji se metabolizuju na sličan način kao referentni nukleotidi. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničenja, fosforotioate, fosforamidate, metil fosfonate, hiralne metil fosfonate, 2-O-metil ribonukleotide, peptid-nukleinske kiseline (PNA).

[0079] Ako nije drugačije naznačeno, konkretna sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njene konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerativnog kodona) i komplementarne sekvence, kao i eksplicitno naznačene sekvence.

2

Specifično, kako je prikazano u nastavku, supstitucije degenerativnih kodona se mogu postići generisanjem sekvenci u kojima je treći položaj jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisan ostacima mešovitih baza i/ili dezoksiinozina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.

19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; i Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

[0080] Termin „operativno povezan“ odnosi se na funkcionalni odnos između dva ili više segmenata polinukleotida (npr. DNK). Pojam se obično odnosi na funkcionalni odnos regulatorne sekvence transkripcije sa transkribovanom sekvencom. Na primer, promoterska ili pojačavačka sekvenca operativno je povezana sa kodirajućom sekvencom ako stimulira ili modulira transkripciju kodirajuće sekvence u odgovarajućoj ćeliji domaćinu ili drugom ekspresionom sistemu. Obično, promoterske regulatorne sekvence transkripcije koje su operativno povezane sa transkribovanom sekvencom su fizički susedne transkribovanoj sekvenci, tj., one su cis-delujuće. Međutim, neke regulatorne sekvence transkripcije, poput pojačivača, ne moraju biti fizički susedne ili locirane u neposrednoj blizini kodirajućih sekvenci čiju transkripciju pojačavaju.

[0081] Kako se ovde koristi, termin „optimizovana“ znači da je sekvenca nukleotida izmenjena tako da kodira sekvencu aminokiselina pomoću kodona koji su poželjni u proizvođačkoj ćeliji ili organizmu, generalno eukariotskoj ćeliji, na primer, ćelije Pichia, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili humane ćelije. Optimizovana sekvenca nukleotida je konstruisana da zadrži u potpunosti ili u najvećoj mogućoj meri sekvencu aminokiseline koja je prvobitno kodirana polaznom sekvencom nukleotida, koja je poznata i kao "matična" sekvenca. Optimizovane sekvence su ovde konstruisane da imaju kodone koji su poželjni u ćelijama sisara. Međutim, ovde je predviđena i optimizovana ekspresija ovih sekvenci u drugim eukariotskim ćelijama ili prokariotskim ćelijama. Sekvence aminokiselina kodirane optimizovanim sekvencama nukleotida takođe se nazivaju optimizovanim.

[0082] Termini „polipeptid“ i „protein“ ovde se koriste naizmenično da bi se označio polimer aminokiselinskih ostataka. Termini se primenjuju na polimere aminokiselina u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštačka hemijska imitacija odgovarajuće aminokiseline koja se javlja u prirodi, kao i na polimere aminokiselina koji se javljaju u prirodi i polimer aminokiselina koji se ne javlja u prirodi. Ako nije drugačije naznačeno, konkretna polipeptidna sekvenca takođe implicitno obuhvata njegove konzervativno modifikovane varijante.

[0083] Termin „rekombinantno humano antitelo“, kako se ovde koristi, obuhvata sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju rekombinantnim metodama, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomska za humane imunoglobulinske gene ili iz njih pripremljen hibridom, antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira humano antitelo, npr. transfektoma, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela i antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, nastaju ili izoluju bilo kojim drugim putem koji uključuje splajsovanje celog ili dela sekvenci humanog imunoglobulinskog gena u druge sekvence DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR dobijeni od imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije. Međutim, u nekim otelotvorenjima, takva rekombinantna humana antitela mogu biti podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi sekvenca životinje koja je transgena za humani IgG, in vivo somatskoj mutagenezi) i tako su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako su dobijene od sekvenci VH i VL humane germinativne linije i srodne su njima, ne moraju prirodno postojati u repertoaru germinativne linije humanog antitela in vivo.

[0084] Termin „rekombinantna ćelija domaćin“ (ili jednostavno „ćelija domaćin“) odnosi se na ćeliju u koju je uveden vektor za rekombinantnu ekspresiju. Jasno je da takvi termini nisu predviđeni da se odnose samo na određenu predmetnu ćeliju već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu javiti u narednim generacijama bilo zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo u stvari ne mora biti identično matičnoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u opseg termina „ćelija domaćin“ kako se ovde koristi.

[0085] Termin „ispitanik“ uključuje ljudske i neljudske životinje. Neljudske životinje uključuju sve kičmenjake (npr. sisare i kičmenjake koji nisu sisari), kao što su nehumani primati (npr. cinomolgus majmun), ovce, psi, krave, pilići, vodozemci i reptili. Osim kada je naznačeno, termini „pacijent“ ili „ispitanik“ ovde se koriste naizmenično. Kako se ovde koriste, termini „cyno“ ili „cinomolgus“ odnose se na cinomolgus majmuna (Macaca fascicularis).

2

[0086] Kako se ovde koristi, termin „lečiti“ ili „lečenje“ bilo koje bolesti ili poremećaja (npr. vaskularna bolest mrežnjače, dijabetička retinopatija, edem makule) odnosi se u jednom otelotvorenju na ublažavanje bolesti ili poremećaja (tj. usporavanje ili zaustavljanje ili smanjivanje napredovanja bolesti ili najmanje jednog njenog kliničkog simptoma). U drugom otelotvorenju, "lečiti" ili "lečenje" se odnosi na olakšavanje ili ublažavanje najmanje jednog fizičkog parametra, uključujući one koje pacijent možda ne primećuje. U još jednom otelotvorenju, „lečiti“ ili „lečenje“ se odnosi na modulaciju bolesti ili poremećaja, bilo fizički (npr. stabilizacija uočljivog simptoma), fiziološki (npr. stabilizacija fizičkog parametra), ili oba istovremeno. U još jednom otelotvorenju, „lečiti“ ili „lečenje“ odnosi se na sprečavanje ili prolongiranje ispoljavanja ili razvoja, ili napredovanja bolesti ili poremećaja. „Prevencija“ kako se koristi za ovde opisane indikacije, uključujući, stanja ili poremećaje povezane sa vaskularnom bolešću mrežnjače, stanja ili poremećaje povezane sa dijabetičkom retinopatijom i/ili stanja ili poremećaje povezane sa edemom makule, označava bilo koje delovanje koje sprečava ili usporava pogoršanje funkcije vida, anatomije mrežnjače, parametra vaskularne bolesti mrežnjače, parametra bolesti dijabetičke retinopatije i/ili parametra bolesti edema makule, kako je opisano u nastavku, kod pacijenta koji je pod rizikom navedenog pogoršanja. Preciznije, „lečenje“ stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače, stanja ili poremećaja povezanih as dijabetičkom retinopatijom i/ili stanja ili poremećaja povezanih sa edemom makule znači bilo koju radnju koja dovodi do, ili se smatra da dovodi do, poboljšanja ili očuvanja funkcije vida i/ili anatomije mrežnjače. Postupci za procenu lečenja i/ili prevencije bolesti su poznati u struci i ovde su opisani u nastavku.

[0087] Termin „vektor“ se odnosi na molekul polinukleotida sposoban da transportuje drugi polinukleotid za koji je vezan. Jedna vrsta vektora je „plazmidni“, koji se odnosi na kružnu dvolančanu petlju DNK u koju se mogu ligirati dodatni segmenti DNK. Druga vrsta vektora je virusni vektor, kao što je vektor adeno asociranog virusa (AAV ili AAV2), pri čemu se dodatni segmenti DNK mogu ligirati u virusni genom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju su uvedeni (npr. bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomski vektori sisara). Ostali vektori (npr. neepizomski vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, te se tako repliciraju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde nazivaju „rekombinantni ekspresioni vektori“ (ili jednostavno, „ekspresioni

2

vektori“). Generalno, ekspresioni vektori koji su korisni u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, „plazmid“ i „vektor“ mogu da se koriste naizmenično, jer je plazmid najčešće korišćeni oblik vektora. Međutim, pronalazak treba da obuhvata i druge takve oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusi sa oštećenjem replikacije, adenovirusi i adeno asocirani virusi), koji imaju ekvivalentnu funkciju.

Kratki opis slika

[0088]

Slika 1. Pokazuje da EPO izaziva širenje krvnih sudova u centralnoj mrežnjači.

Slika 2. Pokazuje da anti-EPO Fab neutrališe EPO u očima zečeva.

Slika 3. Pokazuje da anti-EPO Fab neutrališe EPO u očima zečeva.

Detaljan opis

[0089] Predmetni pronalazak se delimično zasniva na otkriću molekula antitela koji se specifično vezuju za Epo. Pronalazak se odnosi na antitela punog IgG formata, kao i na njihove antigen vezujuće fragmente, poput Fab fragmenata (npr. vidite antitela NVS1, NVS2, NVS3 i NVS4).

[0090] Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo (npr. Epo čoveka, Epo cinomolgusa, Epo pacova i Epo miša), farmaceutske kompozicije, postupke proizvodnje i postupke upotrebe takvih antitela i kompozicija.

Epo antitela i antigen vezujući fragmenti

[0091] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo. U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša, kao i humani hiperglikozilovani Epo (darbepoetin).

2

Antitela iz pronalaska uključuju, ali nisu ograničena na, humana monoklonska antitela i Fab, izolovana kako je opisano u primerima.

[0092] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša), pri čemu antitela sadrže VH domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13, 33, 53 ili 73. Predmetna prijava takođe opisuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein, pri čemu antitela sadrže VH CDR koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VH CDR navedenih u Tabeli 1, ispod. Konkretno, predmetna prijava opisuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša), pri čemu antitela sadrže (ili se alternativno sastoje od) jedan, dva, tri ili više VH CDR koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VH CDR navedenih u Tabeli 1, ispod.

[0093] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein, a navedena antitela sadrže VL domen koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, 34, 54 ili 74. Predmetna prijava takođe opisuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša), a navedena antitela sadrže VL CDR koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VL CDR navedenih u Tabeli 1, ispod. Konkretno, predmetna prijava opisuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša), pri čemu navedena antitela sadrže (ili se alternativno sastoje od) jedan, dva, tri ili više VL CDR koji imaju aminokiselinsku sekvencu bilo kog od VL CDR navedenih u Tabeli 1, ispod.

[0094] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju VH, VL, teški lanac kompletne dužine i laki lanac kompletne dužine antitela koja se specifično vezuju za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša). Takve sekvence nukleinskih kiselina mogu da se optimizuju za ekspresiju u ćelijama sisara (na primer, Tabela 1 prikazuje optimizovane sekvence nukleinskih kiselina za teški lanac i laki lanac antitela iz pronalaska).

Tabela 1 Primeri Epo antitela, Fab i Epo proteina

2

2

1

2

4

[0095] Pošto svako od ovih antitela može da se vezuje za Epo, sekvence VH, VL, lakog lanca kompletne dužine i teškog lanca kompletne dužine (aminokiselinske sekvence i sekvence nukleotida koji kodiraju aminokiselinske sekvence) mogu da se „pomešaju i upare“ kako bi nastala Epo vezujuća antitela iz pronalaska. Takva „pomešana i uparena“ Epo vezujuća antitela mogu da se testiraju koristeći testove vezivanja poznate u struci (npr. ELISA i druge testove opisane u odeljku Primeri). Kada su ovi lanci pomešani i upareni, sekvencu VH iz konkretnog VH/VL para treba zameniti strukturno sličnom sekvencom VH. Slično tome, sekvencu teškog lanca kompletne dužine iz konkretnog para teškog lanca kompletne dužine / lakog lanca kompletne dužine treba zameniti strukturno sličnom sekvencom teškog lanca kompletne dužine. Slično tome, sekvencu VL iz konkretnog VH/VL para treba zameniti strukturno sličnom sekvencom VL. Slično tome, sekvencu lakog lanca kompletne dužine iz konkretnog para teškog lanca kompletne dužine / lakog lanca kompletne dužine treba zameniti strukturno sličnom sekvencom lakog lanca kompletne dužine. Shodno tome, takođe je opisano i izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa: varijabilnim domenom teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 33, 53 i 73, i varijabilnim domenom lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74, pri čemu se antitelo specifično vezuje za Epo (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša).

[0096] U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim domenom lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 13, odnosno 14. U drugim specifičnim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim domenom lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 33, odnosno 34. U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim domenom lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 53, odnosno 54. U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa varijabilnim domenom teškog lanca i varijabilnim domenom lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 73, odnosno 74.

[0097] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje (i) izolovano antitelo koje ima: teški lanac kompletne dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je optimizovana za ekspresiju u ćeliji sisara izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 35, 55 i 75, i laki lanac kompletne dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je optimizovana za ekspresiju u ćeliji sisara izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 36, 56 i 76; ili (ii) funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen vezujući deo. Preciznije, u određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa teškim lancem i lakim lancem koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 15, odnosno 16. U drugim specifičnim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa teškim lancem i lakim lancem koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 35, odnosno 36. U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa teškim lancem i lakim lancem koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 55, odnosno 56. U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući region sa teškim lancem i lakim lancem koji sadrže aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 75, odnosno 76.

[0098] Termini „region koji određuje komplementarnost“ i „CDR“, kako se ovde koriste, označavaju sekvence aminokiselina u varijabilnim regionima antitela koji dodeljuju antigensku specifičnost i afinitet vezivanja. Generalno, postoje tri CDR-a u svakom varijabilnom regionu teškog lanca (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri CDR-a u svakom varijabilnom regionu lakog lanca (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

[0099] Precizne granice sekvence aminokiselina datog CDR mogu se lako utvrditi korišćenjem bilo koje dobro poznate šeme, uključujući one koje opisuju Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD („Kabatova“ šema numeracije), Al-Lazikani et al. (1997) JMB 273,927-948 („Čotijina“ šema numeracije).

4

[0100] Na primer, po Kabatu, aminokiselinski ostaci CDR u varijabilnom domenu teškog lanca (VH) numerisani su 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3), a aminokiselinski ostaci CDR u varijabilnom domenu lakog lanca (VL) numerisani su 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3). Po Čotijinoj definiciji, CDR aminokiseline u VH su numerisane 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3); a aminokiselinski ostaci u VL su numerisani 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) i 91-96 (LCDR3). Kombinovanjem Kabatove i Čotijine definicije CDR, CDR-i se sastoje od aminokiselinskih ostataka 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) i 95-102 (HCDR3) u humanom VH i aminokiselinskih ostataka 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) i 89-97 (LCDR3) u humanom VL.

[0101] Predmetna prijava opisuje Epo vezujuća antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i lakog lanca kako je opisano u Tabeli 1, ili njihove kombinacije. Aminokiselinske sekvence VH CDR1 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 1, 21, 41 ili 61. Aminokiselinske sekvence VH CDR2 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 2, 22, 42 ili 62. Aminokiselinske sekvence VH CDR3 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 3, 23, 43, ili 63. Aminokiselinske sekvence VL CDR1 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 4, 24, 44, ili 64. Aminokiselinske sekvence VL CDR2 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 5, 25, 45, ili 65. Aminokiselinske sekvence VL CDR3 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 6, 26, 46, ili 66. Ovi CDR regioni su razgraničeni koristeći Kabatov sistem.

[0102] Alternativno, kako je definisano koristeći Čotijin sistem (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948), aminokiselinske sekvence VH CDR1 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 7, 27, 47, ili 67. Aminokiselinske sekvence VH CDR2 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 8, 28, 48, ili 68. Aminokiselinske sekvence VH CDR3 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 9, 29, 49, ili 69. Aminokiselinske sekvence VL CDR1 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 10, 30, 50, ili 70. Aminokiselinske sekvence VL CDR2 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 11, 31, 51, ili 71. Aminokiselinske sekvence VL CDR3 antitela su prikazane u SEQ ID NO: 12, 32, 52, ili 72.

[0103] S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za Epo i da antigen vezujuću specifičnost obezbeđuju prvenstveno regioni CDR1, 2 i 3, sekvence CDR1, 2 i 3 VH i sekvence CDR1, 2 i 3 VL se mogu „mešati i uparivati“ (tj. CDR-i različitih antitela se mogu mešati i uparivati, mada svako antitelo poželjno sadrži komplet CDR1, 2 i 3 VH i komplet CDR1, 2 i 3 VL) dajući druge Epo vezujuće molekule iz pronalaska. Takva „pomešana i uparena“ Epo vezujuća antitela mogu da se testiraju koristeći testove vezivanja poznate u struci i one koji su opisani u Primerima (npr. ELISA, SET, Biacore). Kada se CDR sekvence VH pomešaju i upare, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz konkretne sekvence VH treba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Slično tome, kada su CDR sekvence VL pomešane i uparene, sekvence CDR1, CDR2 i/ili CDR3 iz konkretne sekvence VL treba da se zamene strukturno sličnim sekvencama CDR. Osobi sa uobičajenim znanjem u oblasti biće jasno da nove VH i VL sekvence mogu biti kreirane supstitucijom jedne ili više sekvenci CDR regiona VH i/ili VL sa strukturno sličnim sekvencama iz sekvenci CDR ovde prikazanih za monoklonska antitela predmetnog pronalaska. Pored prethodno navedenog, u jednom otelotvorenju, antigen vezujući fragmenti ovde opisanih antitela mogu da sadrže CDR1, 2 i 3 VH ili CDR1, 2 i 3 VL, pri čemu se fragment vezuje za Epo kao jedan varijabilni domen.

[0104] U određenim otelotvorenjima pronalaska, antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti mogu imati kompletne sekvence teškog i lakog lanca Fab opisane u Tabeli 1. Preciznije, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment mogu imati tešku i laku sekvencu Fab NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4.

[0105] Antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za Epo sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca kako ih je definisao Kabat, i kako su opisani u Tabeli 1. U daljim otelotvorenjima pronalaska, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za Epo sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca kako ih je definisao Čotija, i kako su opisani u Tabeli 1.

[0106] Predmetna prijava takođe opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO:1, CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 2; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 3; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 4; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 5; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 6. Takođe su opisana antitela koja se specifično vezuju za Epo koja sadrže CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 21; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 22; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 23; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 24; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 25; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 26. Dalje je opisano antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 41; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 42; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 43; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 44; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 45; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 46. Predmetna prijava takođe opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 61; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 62; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 63; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 64; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 65; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 66.

[0107] U drugom specifičnom otelotvorenju, predmetna prijava takođe opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 7; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 8; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 9; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 10; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 11; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 12. Predmetna prijava takođe opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 27; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 28; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 29; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 30; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 31; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 32. Predmetna prijava dalje opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 47; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 48; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 49; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 50; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 51; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 52. Predmetna prijava takođe opisuje antitelo koje se specifično vezuje za Epo koje sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 67; CDR2

4

varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 68; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca iz SEQ ID NO: 69; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 70; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 71; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca iz SEQ ID NO: 72.

[0108] U određenim otelotvorenjima, pronalazak obuhvata antitela ili antigen vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za Epo kako je opisano u SEQ ID NO 13 do 16; 33 do 36; 53 do 56 i 73 do 76 iz Tabele 1. U poželjnom otelotvorenju, antitelo ili antigen vezujući fragment koji vezuje Epo je Fab NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4.

[0109] Kako se ovde koristi, humano antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca ili teške ili lake lance kompletne dužine koji su „proizvod“ ili „dobijeni od“ konkretne sekvence germinativne linije ako su varijabilni regioni ili lanci kompletne dužine antitela pribavljeni iz sistema koji koristi gene imunoglobulina humane germinativne linije. Takvi sistemi obuhvataju imunizaciju transgenih miševa koji nose gene humanog imunoglobulina gde je željeni antigen ili biblioteka za skrining gena humanog imunoglobulina prikazana na fagu sa željenim antigenom. Humano antitelo koje je „proizvod“ ili „dobijeno od“ sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može se identifikovati kao takvo poređenjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humanih germinativnih linija i biranjem sekvence imunoglobulina humane germinativne linije koja je po sekvenci najbliža (tj. najveći % identičnosti) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je „proizvod“ ili „dobijeno od“ konkretne sekvence imunoglobulina humane germinativne linije može da sadrži razlike u aminokiselinama u poređenju sa sekvencom germinativne linije, usled, na primer, somatskih mutacija koje se javljaju u prirodi ili namernog uvođenja mutacija usmerenih na mesto. Međutim, u VH ili VL regionima okvira, izabrano humano antitelo je tipično najmanje 90% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina humane germinativne linije, i sadrži ostatke aminokiselina koji identifikuju humano antitelo kao humano u poređenju sa sekvencama aminokiselina imunoglobulina germinativne linije drugih vrsta (npr. mišje sekvence germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije. Tipično, rekombinantno humano antitelo neće pokazivati više od 10 razlika u aminokiselinama u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije u VH ili VL regionima okvira. U određenim slučajevima, humano antitelo neće pokazivati više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2 ili 1 razlike u aminokiselinama u odnosu na aminokiselinsku sekvencu koju kodira gen imunoglobulina germinativne linije. Primeri gena imunoglobulina humane germinativne linije uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente varijabilnog domena germinativne linije opisane u nastavku, kao i DP47 i DPK9.

Homologa antitela

[0110] U još jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov antigen vezujući fragment iz predmetnog pronalaska mogu da sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologe sa sekvencama opisanim u Tabeli 1 i antitelo se vezuje za Epo protein (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša) i zadržava željena funkcionalna svojstva tih antitela koja su opisana u Tabeli 1.

[0111] Predmetna prijava opisuje izolovano antitelo ili njegov funkcionalni antigen vezujući fragment koji sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca, pri čemu varijabilni domen teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 33, 53 i 73; varijabilni domen lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74; i antitelo se specifično vezuje za Epo (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša). U određenim aspektima, sekvence teškog i lakog lanca dalje sadrže sekvence HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kako ih definiše Kabat, na primer SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, odnosno 6; SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, odnosno 26; SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45, odnosno 46; ili SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65, odnosno 66. U određenim drugim aspektima, sekvence teškog i lakog lanca dalje sadrže sekvence HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 kako ih definiše Čotija, na primer SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, odnosno 12; SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, odnosno 32; SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, odnosno 52; ili SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71, odnosno 72.

4

[0112] U drugim otelotvorenima, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu biti 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa sekvencama prikazanim u Tabeli 1. U drugim otelotvorenjima, aminokiselinske sekvence VH i/ili VL mogu biti identične osim aminokiselinske supstitucije na najviše 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih pozicija. Antitelo koje ima regione VH i VL koji imaju veliku (tj. 80% ili veću) identičnost sa regionima VH i VL koji su opisani u Tabeli 1 može se dobiti mutagenezom (npr. mutageneza usmerena na mesto ili PCR posredovana mutageneza) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju SEQ ID NO: 13, 33, 53 ili 73 i SEQ ID NO: 14, 34, 54, odnosno 74, nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela na zadržavanje funkcije koristeći ovde opisane funkcionalne testove.

[0113] U drugim otelotvorenjima, antitela iz pronalaska mogu imati aminokiselinske sekvence teškog lanca kompletne dužine i/ili lakog lanca kompletne dužine koje su 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa sekvencama prikazanim u Tabeli 1. Antitelo koje ima teški lanac kompletne dužine i laki lanac kompletne dužine sa velikom (tj.

80% ili većom) identičnošću sa teškim lancima kompletne dužine iz bilo kog od SEQ ID NO: 15, 35, 55 ili 75 i lakim lancima kompletne dužine iz bilo kog od SEQ ID NO: 16, 36, 56 ili 76, može se dobiti mutagenezom (npr, mutageneza usmerena na mesto ili PCR posredovana mutageneza) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju takve polipeptide, nakon čega sledi testiranje kodiranog izmenjenog antitela na zadržavanje funkcije koristeći ovde opisane funkcionalne testove.

[0114] U drugim otelotvorenjima, nukleotidne sekvence teškog lanca kompletne dužine i/ili lakog lanca kompletne dužine mogu biti 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa sekvencama prikazanim u Tabeli 1.

[0115] U drugim otelotvorenjima, nukleotidne sekvence varijabilnih regiona teškog lanca i/ili varijabilnih regiona lakog lanca mogu biti 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identične sa sekvencama prikazanim u Tabeli 1.

[0116] Kako se ovde koristi, procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija zajedničkih za sekvence (tj. % identičnosti je jednak broju identičnih pozicija/ukupan broj pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina i dužinu svake praznine, koje se moraju uvesti zarad optimalnog poravnanja dve sekvence. Poređenje sekvenci i

4

utvrđivanje procenta identičnosti između dve sekvence se može ostvariti pomoću matematičkog algoritma, kako je opisano u neograničavajućim primerima u nastavku.

[0117] Dodatno ili alternativno, proteinske sekvence iz predmetnog pronalaska mogu dalje da se koriste kao „upitna sekvenca“ za obavljanje pretrage u javnim bazama podataka, na primer, radi identifikovanja srodnih sekvenci. Na primer, takve pretrage mogu da se obavljaju koristeći program BLAST (verzija 2.0) čiji su autori Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol.

215:403-10.

Antitela sa konzervativnim modifikacijama

[0118] U drugim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska je optimizovano za ekspresiju u ćeliji sisara i ima sekvencu teškog lanca kompletne dužine i sekvencu lakog lanca kompletne dužine, pri čemu jedna ili više od ovih sekvenci ima naznačene aminokiselinske sekvence na osnovu ovde opisanih antitela ili njihove konzervativne mutacije, i pri čemu antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva Epo vezujućih antitela iz pronalaska. Shodno tome, opisano je izolovano antitelo koje je optimizovano za ekspresiju u ćeliji sisara koje se sastoji od teškog lanca kompletne dužine i lakog lanca kompletne dužine, pri čemu teški lanac kompletne dužine ima aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe od SEQ ID NO: 15, 35, 55 i 75, i njihove konzervativne modifikacije; i laki lanac kompletne dužine ima aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe od SEQ ID NO: 16, 36, 56 i 76 i njihove konzervativne modifikacije; i antitelo se specifično vezuje za Epo (npr. Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša).

Antitela koja se vezuju za isti epitop

[0119] Predmetna prijava takođe opisuje antitela koja se vezuju za isti epitop, kao i Epo vezujuća antitela opisana u Tabeli 1. Dodatna antitela se stoga mogu identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da se takmiče (npr. da konkurentski inhibiraju vezivanje, na statistički značajan način) sa drugim antitelima iz pronalaska u testovima vezivanja Epo (kao što su oni opisani u Primerima). Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje antitela iz predmetnog pronalaska za Epo protein pokazuje da test antitelo može da se takmiči sa tim antitelom u vezivanju za Epo; takvo antitelo može, prema neograničavajućoj teoriji, da se vezuje za isti ili

4

srodni (npr. strukturno sličan ili prostorno blizak) epitop na Epo proteinu kao antitelo sa kojim se takmiči. U određenom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za isti epitop na Epo kao antitela iz predmetnog pronalaska je humano monoklonsko antitelo. Takva humana monoklonska antitela mogu da se pripreme i izoluju kao što je ovde opisano. Kako se ovde koristi, antitelo se „takmiči“ za vezivanje kada konkurentsko antitelo inhibira Epo vezivanje antitela ili antigen vezujućeg fragmenta iz pronalaska za više od 50% u prisustvu ekvimolarne koncentracije konkurentskog antitela.

[0120] U drugim otelotvorenjima, antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju domen D spirale Epo (aminokiseline 138-162 Epo proteina; SEQ ID NO: 88). U drugim otelotvorenjima, antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju A spiralu (aminokiseline 4-26 Epo proteina; SEQ ID NO: 86) i A-B petlju Epo (aminokiseline 27-55 Epo proteina; SEQ ID NO: 89).

[0121] U drugim otelotvorenjima, antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska se vezuju za domen D spirale Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88). U drugim otelotvorenjima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti vezuju domen A-B petlje (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89). U drugim otelotvorenjima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti vezuju domen petlje A-B (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89) i spirale A (aminokiseline 4-26 humanog Epo; SEQ ID NO: 86). U još jednom otelotvorenju, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti vezuju domen D spirale Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88) i domen petlje A-B (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89). U drugim otelotvorenjima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti vezuju domen D spirale Epo (aminokiseline 138-162 humanog Epo; SEQ ID NO: 88), domen petlje A-B (aminokiseline 27-55 humanog Epo; SEQ ID NO: 89) i spirale A (aminokiseline 4-26 humanog Epo; SEQ ID NO: 86).

[0122] U drugim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline na pozicijama 44-50, 52, 53, 147, 150, 151, 154, 155, 159 i 162 humanog Epo (SEQ ID NO.81). U drugim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline na pozicijama 9, 13, 44-53, 147, 150, 151, 154, 155, 158, 159 i 162 humanog Epo (SEQ ID NO.81). U drugim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline na pozicijama 23, 43-50, 52, 53, 131, 143, 147,

4

150, 151, 154, 155, 159 i 162 humanog Epo (SEQ ID NO.81). U određenim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (na pozicijama 44-50), Lys-Arg (na pozicijama 52-53), Asn (na poziciji 147), Arg-Gly (na pozicijama 150-151), Lys-Leu (na pozicijama 154-155), Glu (na poziciji 159) i Arg (na poziciji 162) humanog Epo (SEQ ID NO.81). U određenim drugim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline Ser (na poziciji 9), Glu (na poziciji 13), Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (na pozicijama 44-50), Lys-Arg (na pozicijama 52-53), Asn (na poziciji 147), Arg-Gly (na pozicijama 150-151), Lys-Leu (na pozicijama 154-155), Gly (na poziciji 158), Glu (na poziciji 159) i Arg (na poziciji 162) humanog Epo (SEQ ID NO.81). U daljim aspektima, izolovana antitela ili antigen vezujući fragmenti iz pronalaska vezuju epitop koji obuhvata aminokiseline Glu (na pozicijama 23), Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (na pozicijama 43-50), Lys-Arg (na pozicijama 52-53), Arg (na poziciji 131), Arg (na poziciji 143), Asn (na poziciji 147), Arg-Gly (na pozicijama 150-151), Lys-Leu (na pozicijama 154-155), Glu (na poziciji 159) i Arg (na poziciji 162) humanog Epo (SEQ ID NO.81).

[0123] Ovde je takođe opisan konformacioni epitop na humanom Epo, pri čemu epitop obuhvata aminokiselinske ostatke Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 i Arg162, pri čemu će vezivanje antitela za epitop inhibirati vezivanje Epo za Epo receptor. Takođe se pretpostavlja da će antitelo koje se vezuje za epitop iz pronalaska dalje inhibirati Epo-zavisnu proliferaciju ćelija.

[0124] Ovde je takođe opisan konformacioni epitop na humanom Epo, pri čemu epitop obuhvata aminokiselinske ostatke Ser9, Glu13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159 i Arg162, pri čemu će vezivanje antitela za epitop inhibirati vezivanje Epo za Epo receptor. Takođe se pretpostavlja da će antitelo koje se vezuje za epitop iz pronalaska dalje inhibirati Epo-zavisnu proliferaciju ćelija.

[0125] Ovde je takođe opisan konformacioni epitop na humanom Epo, pri čemu epitop obuhvata aminokiselinske ostatke Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 i Arg162, pri čemu će vezivanje antitela za epitop inhibirati vezivanje Epo za Epo receptor.

4

Takođe se pretpostavlja da će antitelo koje se vezuje za epitop iz pronalaska dalje inhibirati Epo-zavisnu proliferaciju ćelija.

Konstruisana i modifikovana antitela

[0126] Antitelo iz pronalaska dalje može da se pripremi koristeći antitelo koje ima jednu ili više ovde prikazanih sekvenci VH i/ili VL kao polaznu supstancu za konstruisanje modifikovanog antitela, gde modifikovano antitelo može imati izmenjena svojstva u odnosu na početno antitelo. Antitelo se može konstruisati modifikacijom jednog ili više ostataka u jednom ili oba varijabilna regiona (tj. VH i/ili VL), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili u jednom ili više regiona okvira. Dodatno ili alternativno, antitelo se može konstruisati modifikacijom ostataka u konstantnom regionu (konstantnim regionima), na primer radi izmene efektorske funkcije (efektorskih funkcija) antitela.

[0127] Jedan tip konstruisanja varijabilnog regiona koji se može obaviti je CDR graftovanje. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima pretežno putem aminokiselinskih ostataka koji se nalaze u šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR) teškog i lakog lanca. Usled toga, sekvence aminokiselina u CDR su raznovrsnije između pojedinačnih antitela nego sekvence izvan CDR-a. Pošto su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija antigenantigen, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja podražavaju svojstva specifičnih antitela koja se javljaju u prirodi putem konstruisanja ekspresionih vektora koji obuhvataju CDR sekvence specifičnih prirodnih antitela graftovane na sekvence okvira različitog antitela sa različitim svojstvima (vidite, npr., Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A.

86:10029-10033; U.S. Patent br. 5,225,539, Winter, i U.S. Patente br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.)

[0128] Takve sekvence okvira se mogu pribaviti iz javnih baza podataka DNK ili objavljenih referenci koje uključuju sekvence gena antitela germinativne linije. Na primer, sekvence DNK germinativne linije za gene varijabilnih regiona humanih teških i lakih lanaca se mogu pronaći u "VBase" bazi podataka sekvenci humane germinativne linije (dostupno na internetu na mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication br.91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol.227:776-798; i Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836.

[0129] Primer sekvenci okvira za upotrebu u antitelima iz pronalaska su one koje su stukturno slične sekvencama okvira koje koriste odabrana antitela iz pronalaska, npr. sekvence konsenzusa i/ili sekvence okvira koje koriste monoklonska antitela iz pronalaska. Sekvence CDR1, 2 i 3 VH i sekvence CDR1, 2 i 3 VL se mogu graftovati na regione okvira koji imaju sekvencu identičnu onoj koja se može naći u genu imunoglobulina germinativne linije iz kojeg se dobijaju sekvence okvira, ili se sekvence CDR mogu graftovati na regione okvira koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama germinativne linije. Na primer, otkriveno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati ostatke u regionima okvira radi održavanja ili unapređenja sposobnosti antitela da vezuje antigen (vidite, npr. U.S. Patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.). Okviri koji mogu da se koriste kao konstrukcije na kojima se grade ovde opisana antitela i antigen vezujući fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2 i Vk2. Dodatni okviri su poznati u struci i mogu se naći, na primer, u bazi podataka vBase na internetu na vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1.

[0130] Shodno tome, predmetna prijava takođe opisuje izolovana Epo vezujuća antitela ili njihove antigen vezujuće fragmente sa varijabilnim regionom teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 33, 53 i 73, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u regionu okvira takvih sekvenci, i dalje sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 34, 54 i 74, ili aminokiselinsku sekvencu koja ima jednu, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u regionu okvira takvih sekvenci.

[0131] Druga vrsta mutacije varijabilnog regiona je mutacija ostataka aminokiselina u CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regionima VH i/ili VL kako bi se time poboljšalo jedno ili više svojstava vezivanja (npr. afinitet) željenog antitela, što je poznato kao „afinitetno sazrevanje“. Mutageneza usmerena na mesto ili PCR-posredovana mutageneza se može izvršiti radi uvođenja mutacije (mutacija), i efekat na vezivanje antitela, ili druga željena funkcionalna svojstva, mogu se proceniti u in vitro ili in vivo testovima kao što je ovde opisano i dato u Primerima. Mogu se uvesti konzervativne modifikacije (kao što je prethodno razmatrano).

1

Mutacije mogu biti supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja aminokiselina. Štaviše, tipično nije izmenjeno više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka u CDR regionu.

Graftovanje antigen vezujućih domena u alternativne okvire ili konstrukcije

[0132] Širok dijapazon okvira ili konstrukcija antitela/imunoglobulina može da se koristi sve dok dobijeni polipeptid uključuje najmanje jedan vezujući region koji se specifično vezuje za Epo. Takvi okviri ili konstrukcije uključuju 5 glavnih idiotipova humanih imunoglobulina ili njihove fragmente, i uključuju imunoglobuline drugih životinjskih vrsta, poželjno je sa humanizovanim aspektima. Antitela sa jednim teškim lancem poput onih koja su identifikovana kod kamelida su od posebnog interesa u tom pogledu. Stručnjaci za ovu oblast nastavljaju da razvijaju i otkrivaju nove okvire, konstrukcije i fragmente.

[0133] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na generisanje antitela koja nisu zasnovana na imunoglobulinu pomoću neimunoglobulinskih konstrukcija na koje se CDR-i iz otkrića mogu graftovati. Poznati ili budući neimunoglobulinski okviri i konstrukcije mogu se koristiti sve dok sadrže region za vezivanje specifičan za ciljni Epo protein. Poznati neimunoglobulinski okviri ili konstrukcije uključuju, bez ograničenja, fibronektin (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), ankirin (Molecular Partners AG, Zurich, Švajcarska), antitela domena (Domantis, Ltd., Cambridge, MA, i Ablynx nv, Zwijnaarde, Belgija), lipokalin (Pieris Proteolab AG, Freising, Nemačka), male modularne imunske lekove (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maksitela (Avidia, Inc., Mountain View, CA), protein A (Affibody AG, Švedska) i afilin (gama-kristalin ili ubikvitin) (Scil Proteins GmbH, Halle, Nemačka).

[0134] Fibronektinske konstrukcije se zasnivaju na domenu fibronektina tipa III (npr. deseti modul fibronektina tipa III (domen 10 Fn3)). Domen fibronektina tipa III ima 7 ili 8 beta lanaca koji su raspodeljeni između dve beta ravni, koje su upakovane jedna naspram druge kako bi formirale jezgro proteina, i dalje sadrže petlje (analogno CDR-ima) koje povezuju beta lance i izložene su rastvaraču. Postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta ravni, pri čemu je ivica granica proteina normalna na smer beta lanaca (vidite US 6,818,418). Ove konstrukcije bazirane na fibronektinu nisu imunoglobulin, mada je ukupno savijanje blisko povezano sa savijanjem najmanjeg funkcionalnog fragmenta antitela,

2

varijabilnim regionom teškog lanca, koji sadrži celokupnu jedinicu za prepoznavanje antigena u IgG kamile ili lame. Zbog te strukture, neimunoglobulinsko antitelo podražava antigen-vezujuća svojstva koja su po prirodi i afinitetu slična kao kod antitela. Te konstrukcije se mogu koristiti u strategiji randomizacije i mešanja petlji in vitro koja je slična postupku afinitetnog sazrevanja antitela in vivo. Ovi molekuli na bazi fibronektina mogu se koristiti kao konstrukcije gde regioni petlje molekula mogu biti zamenjeni CDR-ima iz pronalaska koristeći standardne tehnike kloniranja.

[0135] Tehnologija ankirina se zasniva na korišćenju proteina sa ponavljajućim modulima izvedenim iz ankirina kao konstrukcija za nošenje varijabilnih regiona koji mogu da se koriste za vezivanje za različite ciljeve. Ponavljajući modul ankirina je polipeptid od 33 aminokiseline koji sadrži dva antiparalelna α-heliksa i β-zaokret. Vezivanje varijabilnih regiona je pretežno optimizovano upotrebom displeja ribozoma.

[0136] Avimeri se dobijaju iz prirodnog proteina koji sadrži A-domen kao što je LRP-1. Ti domeni se koriste u prirodi za protein-protein interakcije, i kod ljudi je preko 250 proteina strukturno zasnovano na A-domenima. Avimeri se sastoje od brojnih monomera "A-domena" (2-10) povezanih pomoću aminokiselinskih linkera. Mogu se kreirati avimeri koji mogu da se vežu za ciljani antigen korišćenjem metodologije opisane, na primer, u U.S. Patentnim publikacijama br.20040175756, 20050053973, 20050048512 i 20060008844.

[0137] Afinitetni ligandi afitela su mali jednostavni proteini koji se sastoje od snopa od tri spirale na bazi konstrukcije jednog ili više IgG-vezujućih domena proteina A. Protein A je površinski protein iz bakterije Staphylococcus aureus. Domen konstrukcije se sastoji od 58 aminokiselina, od kojih je 13 randomizovano da generišu biblioteke afitela sa velikim brojem varijanti liganada (vidite, npr. US 5,831,012). Molekuli afitela imitiraju antitela; oni imaju molekulsku masu od 6 kDa, u poređenju sa molekulskom masom antitela, koja je 150 kDa. Uprkos njihovoj maloj veličini, mesto vezivanja molekula afitela je slično kao za antitela.

[0138] Antikalini su proizvodi koje je razvila kompanija Pieris ProteoLab AG. Dobijeni su od lipokalina, rasprostranjene grupe malih i robusnih proteina koji su obično uključeni u fiziološki transport ili skladištenje hemijski osetljivih ili nerastvornih supstanci. Nekoliko prirodnih lipokalina se javlja u tkivu ili telesnim tečnostima čoveka. Arhitektura proteina podseća na imunoglobuline, sa hipervarijabilnim petljama iznad čvrstog okvira. Međutim, za razliku od antitela ili njihovih rekombinantnih fragmenata, lipokalini su sastavljeni od pojedinačnog lanca polipeptida sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, te su neznatno veći od pojedinačnog imunoglobulinskog domena. Skup od četiri petlje, koji čini džep za vezivanje, ispoljava izraženu strukturnu plastičnost i toleriše širok raspon bočnih lanaca. Mesto vezivanja se tako može preoblikovati u vlasničkom postupku kako bi prepoznavalo propisane ciljane molekule ili različite oblike sa velikim afinitetom i specifičnošću. Jedan protein iz familije lipokalina, bilin-vezujući protein (BBP) dobijen od Pieris brassicae, korišćen je za razvoj antikalina putem mutageneze seta od četiri petlje. Jedan primer patentne prijave koja opisuje antikaline je PCT Publikacija br. WO 1999/16873.

[0139] Molekuli afilina su mali neimunoglobulinski proteini koji su projektovani za specifične afinitete prema proteinima i malim molekulima. Novi molekuli afilina se mogu veoma brzo izabrati iz dve biblioteke, od kojih se svaka zasniva na različitim proteinima konstrukcije koji su izvedeni od ljudi. Molekuli afilina ne pokazuju bilo kakvu strukturnu homologost sa imunoglobulinskim proteinima. Trenutno se koriste dve afilinske konstrukcije, od koji je jedna gama kristalin, humani strukturni protein očnog sočiva, a druga je „ubikvitinska“ superfamilija proteina. Obe humane konstrukcije su veoma male, pokazuju veliku temperaturnu stabilnost i skoro da su otporne na pH promene i denaturišuće agense. Velika stabilnost je pre svega posledica proširene strukture beta ravni proteina. Primeri proteina izvedenih iz gama kristalina su opisani u WO 2001/04144, a primeri proteina „sličnih ubikvitinu“ su opisani u WO 2004/106368.

[0140] Mimetici proteinskog epitopa (PEM) su ciklični molekuli srednje veličine slični peptidu (Mm 1-2 kDa) koji oponašaju sekundarnu strukturu beta ukosnice proteina, koja je glavna sekundarna struktura uključena u interakciju protein-protein.

[0141] Predmetni pronalazak obezbeđuje potpuno humana antitela koja se specifično vezuju za Epo protein. U poređenju sa himernim ili humanizovanim antitelima, humana Epo vezujuća antitela iz pronalaska imaju dodatno smanjenu antigenost kada se primenjuju na ljudskim ispitanicima.

Kamelidna antitela

4

[0142] Proteini antitela dobijeni od članova familije kamila i jednogrbih kamila (Camelus bactrianus i Camelus dromedarius), uključujući vrste iz novog sveta, kao što su lame (Lama paccos, Lama glama i Lama vicugna), okarakterisani su uzimajući u obzir veličinu, strukturnu složenost i antigenost za humane ispitanike. Određenim antitelima iz ove familije sisara u prirodnom obliku nedostaju laki lanci, te su tako strukturno različita od tipičnih četvorolančanih kvaternernih struktura koje imaju dva teška i dva laka lanca, za antitela drugih životinja. Vidite PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 objavljen 3. marta 1994.).

[0143] Region antitela kamelida koji je mali pojedinačni varijabilni domen identifikovan kao VHH može se dobiti genetskim inženjerstvom dajući mali protein koji ima veliki afinitet prema cilju, što dovodi do proteina izvedenog iz antitela male molekulske mase poznatog kao „kamelidno nanotelo“. Vidite U.S. patent broj 5,759,808 izdat 2. juna 1998; vidite takođe Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; i Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Konstruisane biblioteke kamelidnih antitela i fragmenata antitela su komercijalno dostupne, na primer, od kompanije Ablynx, Ghent, Belgija. Kao i kod drugih antitela nehumanog porekla, aminokiselinska sekvenca kamelidnog antitela se može izmeniti rekombinantnim putem da bi se dobila sekvenca koja više podseća na humanu sekvencu, tj. nanotelo može biti „humanizovano“. Tako, prirodno niska antigenost kamelidnih antitela za ljude može dalje da se smanji.

[0144] Kamelidno nanotelo ima molekulsku masu oko jedne desetine molekulske mase humanog IgG, i protein ima fizički prečnik od svega nekoliko nanometara. Jedna posledica male veličine je sposobnost kamelidnih nanotela da se vezuju za antigenska mesta koja su funkcionalno nevidljiva većim proteinima antitela, tj. kamelidna nanotela su korisna kao reagensi koji detektuju antigene koji su inače skriveni kada se koriste klasične imunološke tehnike, i kao mogući terapeutski agensi. Još jedna posledica male veličine je da kamelidno nanotelo može da inhibira kao rezultat vezivanja za specifično mesto na žljebu ili uskoj pukotini ciljnog proteina, i tako može da posluži u svojstvu koje više podseća na funkciju klasičnog leka male molekulske mase nego na funkciju klasičnog antitela.

[0145] Mala molekulska masa i kompaktna veličina dovode do toga da su kamelidna nanotela izuzetno termostabilna, stabilna na ekstremnim pH vrednostima i stabilna na proteolitičku digestiju, i slabo antigena. Druga posledica je da kamelidna nanotela sa lakoćom prelaze iz sistema krvotoka u tkiva, pa čak prelaze krvno-moždanu barijeru i mogu da leče poremećaje koji utiču na nervno tkivo. Nanotela mogu dalje olakšati transport leka kroz krvno-moždanu barijeru. Vidite U.S. patentnu prijavu 20040161738 objavljenu 19. avgusta 2004. Ove osobine u kombinaciji sa malom antigenošću za ljude nagoveštavaju veliki terapeutski potencijal. Nadalje, ovi molekuli mogu biti u potpunosti eksprimirani u prokaritskim ćelijama kao što je E. coli i eksprimiraju se kao fuzioni proteini sa bakteriofagom i funkcionalni su.

[0146] Shodno tome, karakteristika predmetnog pronalaska je kamelidno antitelo ili nanotelo koje ima veliki afinitet prema Epo. U određenim ovde datim otelotvorenjima, kamelidno antitelo ili nanotelo je prirodno proizvedeno u kamelidnoj životinji, tj. proizvodi ga kamelid nakon imunizacije sa Epo ili njegovim peptidnim fragmentom, koristeći tehnike koje su ovde opisane za druga antitela. Alternativno, Epo vezujuće kamelidno nanotelo je konstruisano, tj. proizvedeno selekcijom, na primer, iz biblioteke faga koja prikazuje odgovarajuće mutagenizovane proteine kamelidnog nanotela koristeći postupke panovanja sa Epo kao ciljem, kako je opisano u ovde datim primerima. Konstruisana nanotela se mogu dalje prilagođavati pomoću genetskog inženjerstva kako bi imala poluživot u primaocu od 45 minuta do dve nedelje. U specifičnom otelotvorenju, kamelidno antitelo ili nanotelo se dobija graftovanjem CDR sekvenci teškog ili lakog lanca humanih antitela iz pronalaska u nanotelo ili sekvence okvira antitela sa jednim domenom, kao što je, na primer, opisano u WO 1994/004678.

Bispecifični molekuli i multivalentna antitela

[0147] U drugom aspektu, predmetni pronalazak prikazuje bispecifične ili multispecifične molekule koji sadrže Epo-vezujuće antitelo ili njegov fragment iz pronalaska. Antitelo iz pronalaska ili njegovi antigen vezujući regioni mogu da se derivatizuju ili povežu sa drugim funkcionalnim molekulom, npr. drugim peptidom ili proteinom (npr. drugo antitelo ili ligand za receptor) radi generisanja bispecifičnog molekula koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljana molekula. Antitelo iz pronalaska može zapravo biti derivatizovano ili povezano sa više od jednog drugog funkcionalnog molekula kako bi nastali multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli takođe treba da budu obuhvaćeni terminom „bispecifični molekul“ kako se ovde koristi. Kako bi se kreirao bispecifični molekul iz pronalaska, antitelo iz pronalaska može biti funkcionalno vezano (npr. hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnim vezivanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.

[0148] Shodno tome, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje prvu vezujuću specifičnost za Epo i drugu vezujuću specifičnost za drugi ciljni epitop. Na primer, drugi ciljni epitop je drugi epitop Epo različit od prvog ciljnog epitopa.

[0149] Dodatno, za pronalazak u kome je bispecifični molekul multispecifičan, molekul može dalje da uključi treću specifičnost vezivanja, uz prvi i drugi ciljni epitop.

[0150] U jednom otelotvorenju, bispecifični molekuli iz otkrića sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo ili njegov fragment antitela, uključujući, npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv ili jednolančani Fv. Antitelo takođe može da bude dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili njegov minimalni fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što opisuju Ladner et al. U.S. Patent br.4,946,778.

[0151] Dijatela su dvovalentni, bispecifični molekuli u kojima su domeni VH i VL eksprimirani na jednom lancu polipeptida, povezani linkerom koji je prekratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu. Domeni VH i VL se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca, čime nastaju dva antigen vezujuća mesta (vidite, npr. Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Dijatela mogu da se proizvedu ekspresijom dva polipeptidna lanca sa strukturom VHA-VLB i VHB-VLA (VH-VL konfiguracija) ili VLA-VHB i VLB-VHA (VL-VH konfiguracija) u istoj ćeliji. Većinom mogu da se eksprimiraju u rastvorljivom obliku u bakterijama. Jednolančana dijatela (scDb) proizvode se povezivanjem dva polipeptidna lanca koji formiraju dijatelo sa linkerom od približno 15 aminokiselinskih ostataka (vidite Holliger i Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb može da se eksprimira u bakterijama u rastvorljivom, aktivnom monomernom obliku (vidite Holliger i Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun i Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Dijatelo se može fuzionisati sa Fc da bi se stvorilo „di-dijatelo“ (vidite Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).

[0152] Druga antitela koja mogu da se koriste u bispecifičnim molekulima iz pronalaska su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela.

[0153] Bispecifični molekuli mogu da se pripreme pomoću konjugacije specifičnosti vezivanja konstituenata, korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može da se generiše zasebno, i da se zatim konjuguje jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste raznovrsni agensi za kuplovanje ili unakrsno vezivanje. Primeri agenasa za unakrsno vezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (sulfo-SMCC) (vidite, npr. Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med.

160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Druge metode uključuju one koje opisuje Paulus 1985, Behring Ins. Mitt. br. 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), i Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agensi za konjugaciju su SATA i sulfo-SMCC, i oba su dostupna od kompanije Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[0154] Kada su specifičnosti vezivanja antitela, ona se mogu konjugovati putem sulfhidrilnog vezivanja regiona šarke C-terminusa dva teška lanca. U konkretnom otelotvorenju, region šarke je modifikovan da sadrži neparan broj sulfhidril ostataka, na primer, pre konjugacije.

[0155] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu da se kodiraju u istom vektoru i eksprimiraju i sastave u istoj ćeliji domaćinu. Ova metoda je posebno korisna kada je bispecifični molekul fuzioni protein mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ili ligand x Fab. Bispecifični molekul iz pronalaska može biti jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Metode za pripremu bispecifičnih molekula su opisane, na primer, u U.S. Patentu broj 5,260,203; U.S. Patentu broj 5,455,030; U.S. Patentu broj 4,881,175; U.S. Patentu broj 5,132,405; U.S. Patentu broj 5,091,513; U.S. Patentu broj 5,476,786; U.S. Patentu broj 5,013,653; U.S. Patentu broj 5,258,498; i U.S. Patentu broj 5,482,858.

[0156] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može da se potvrdi, na primer, pomoću testa sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), radioimunotestom (REA), FACS analizom, biološkim testom (npr. inhibicija rasta) ili vestern blot testom. Svaki od ovih testova generalno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo koji su od posebnog interesa putem korišćenja označenog reagensa (npr. antitela) specifičnog za željeni kompleks.

[0157] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje multivalentna jedinjenja koja sadrže najmanje dva identična ili različita antigen vezujuća dela antitela iz pronalaska koja se vezuju za Epo. Antigen vezujući delovi mogu da se povežu putem proteinske fuzije ili kovalentne ili nekovalentne veze. Alternativno, metode vezivanja su opisane za bispecifične molekule. Četvorovalentna jedinjenja mogu da se dobiju, na primer, unakrsnim vezivanjem antitela iz pronalaska sa antitelom koje se vezuje za konstantne regione antitela iz pronalaska, na primer, Fc ili region šarke.

[0158] Trimerizujući domen je opisan, na primer, u Boreanovom patentu EP 1012 280B1. Pentamerizujući moduli su opisani, na primer, u WO 1998/018943.

Antitela sa produženim poluživotom

[0159] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za Epo protein koja imaju produženi poluživot in vivo.

[0160] Mnogi faktori mogu da utiču na poluživot proteina in vivo, na primer, filtracija u bubrezima, metabolizam u jetri, razgradnja putem proteolitičkih enzima (proteaza) i imunogeni odgovori (npr. neutralizacija proteina putem antitela i preuzimanje u makrofage i dendritske ćelije). Razne strategije mogu da se koriste za produžavanje poluživota antitela iz predmetnog pronalaska. Na primer, putem hemijskog vezivanja sa polietilenglikolom (PEG), reCODE PEG, konstrukcijom antitela, polisijalinskom kiselinom (PSA), hidroksietil skrobom (HES), albumin vezujućim ligandima i ugljovodoničnim štitovima; genetskim fuzionisanjem sa proteinima koji se vezuju za serumske proteine, kao što su albumin, IgG, FcRn, i transferom; kuplovanjem (genetičkim ili hemijskim) sa drugim vezujućim ostacima koji se vezuju za serumske proteine, kao što su nanotela, Fab, DARPini, avimeri, afitela i antikalini; genetskim fuzionisanjem sa rPEG, albuminom, domenom albumina, albumin vezujućim proteinima i Fc; ili inkorporacijom u nano nosače, formulacije sa sporim otpuštanjem ili medicinska sredstva.

[0161] Da bi se produžila cirkulacija antitela u serumu in vivo, inertni polimerni molekuli kao što je polietilen glikol (PEG) velike molekulske mase mogu da se vežu za antitela ili njihov fragment sa multifunkcionalnim linkerom ili bez njega, putem konjugacije specifične za mesto PEG sa N- ili C-terminusom antitela ili putem epsilon-amino grupa prisutnih na ostacima lizina. Da bi se antitelo pegilovalo, antitelo, ili njegov fragment, tipično se podvrgava reakciji sa PEG, kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG, u uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa vezuje za antitelo ili fragment antitela. Pegilovanje se može izvršiti reakcijom acilovanja ili reakcijom alkilovanja sa reaktivnim molekulom PEG (ili analognim reaktivnim polimerom rastvornim u vodi). Kako se ovde koriste, termini „polietilen glikol“ i „PEG“ treba da obuhvate svaki od oblika PEG koji je korišćen za derivatizaciju drugih proteina, kao što je mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi polietilen glikol ili polietilen glikol maleimid. U određenim otelotvorenjima, antitelo koje će biti pegilovano je aglikozilovano antitelo. Koristiće se derivatizacija linearnog ili razgranatog polimera koja dovodi do minimalnog gubitka biološke aktivnosti. Stepen konjugacije može da se prati pomoću SDS-PAGE i masene spektrometrije kako bi se osigurala ispravna konjugacija molekula PEG sa antitelima. Neizreagovali PEG može da se odvoji od konjugata antitelo-PEG putem hromatografije na molekulskim sitima ili jonoizmenjivačke hromatografije. PEG-derivatizovana antitela mogu da se testiraju na vezujuću aktivnost, kao i na in vivo efikasnost, korišćenjem postupaka koji su dobro poznati stručnjacima, na primer, ovde opisanim imunološkim testovima. Postupci za pegilovanje proteina poznati su u struci, i mogu se primeniti na antitela prema pronalasku. Vidite, na primer, EP 0 154 316 čiji su autori Nishimura et al. i EP 0401 384 čiji su autori Ishikawa et al.

[0162] Ostale modifikovane tehnologije pegilovanja uključuju rekonstituišuću hemijski ortogonalno usmerenu tehnologiju konstruisanja (ReCODE PEG), koja ugrađuje hemijski naznačene bočne lance u biosintetičke proteine putem rekonstituisanog sistema koji uključuju tRNK sintetazu i tRNK. Ova tehnologija omogućava inkorporaciju više od 30 novih aminokiselina u biosintetičke proteine u ćelijama E. coli, kvasca i sisara. tRNK inkorporira nenativnu aminokiselinu na bilo koje mesto gde se nalazi ćilibarni kodon, i pretvara ćilibarni iz zaustavnog kodona u kodon koji daje signal za ugrađivanje hemijski naznačene aminokiseline.

[0163] Tehnologija rekombinantne pegilacije (rPEG) takođe može da se koristi za produženje poluživota u serumu. Ova tehnologija uključuje genetsko spajanje nestrukturiranog proteinskog repa od 300-600 aminokiselina sa postojećim farmaceutskim proteinom. Budući da je prividna molekulska masa takvog nestrukturiranog lanca proteina oko 15 puta veća od stvarne molekulske mase, poluživot proteina u serumu se znatno produžava. Za razliku od tradicionalne PEGilacije, koja zahteva hemijsku konjugaciju i prečišćavanje, postupak proizvodnje je znatno pojednostavljen, a proizvod je homogen.

[0164] Polisijalizacija je druga tehnologija koja koristi prirodnu polimernu polisijalinsku kiselinu (PSA) za produženje aktivnog života i unapređenje stabilnosti terapijskih peptida i proteina. PSA je polimer sijalinske kiseline (šećer). Kada se koristi za isporuku proteina i terapeutskog peptidnog leka, polisijalinska kiselina obezbeđuje zaštitno mikrookruženje na konjugaciji. To produžava aktivni život terapeutskog proteina u krvotoku, i sprečava da ga imunološki sistem prepozna. PSA polimer se prirodno nalazi u ljudskom telu. Usvojile su ga određene bakterije koje su evoluirale tokom miliona godina da bi njime obložile svoje zidove. Te prirodno polisijalizovane bakterije bile su sposobne da, pomoću molekulske mimikrije, zavaraju odbrambeni sistem tela. PSA, koji je vrhunska prirodna tehnologija za prikrivanje, lako može da se proizvede iz takvih bakterija u velikim količinama i sa prethodno utvrđenim fizičkim karakteristikama. Bakterijski PSA je u potpunosti neimunogen, čak i kada se kupluje sa proteinima, jer je hemijski identičan sa PSA u ljudskom telu.

[0165] Druga tehnologija uključuje upotrebu derivata hidroksietil skroba („HES“) povezanih sa antitelima. HES je modifikovani prirodni polimer dobijen iz voštanog kukuruznog skroba, i može da se metabolizuje enzimima tela. Rastvori HES se obično primenjuju da se zameni nedovoljna zapremina krvi i da se poboljšaju reološka svojstva krvi. Hesilacija antitela omogućava produženje poluživota u krvotoku povećanjem stabilnosti molekula, kao i smanjenjem bubrežnog klirensa, što dovodi do povećane biološke aktivnosti. Promenom različitih parametara, kao što je molekulska masa HES, može se prilagoditi širok raspon konjugata HES antitela.

1

[0166] Antitela sa produženim poluživotom in vivo takođe mogu da se stvore uvođenjem jedne ili više aminokiselinskih modifikacija (tj. supstitucija, insercija ili delecija) u konstantni domen IgG ili njegov FcRn vezujući fragment (poželjno Fc ili fragment Fc domena šarke). Vidite, npr. International Publication br. WO 98/23289; International Publication br. WO 97/34631; i U.S. Patent br.6,277,375.

[0167] Nadalje, antitela mogu da se konjuguju sa albuminom (npr. albumin humanog seruma, HSA) kako bi se napravilo antitelo ili fragment antitela stabilniji in vivo ili sa dužim poluživotom in vivo. Te tehnike su dobro poznate u struci, vidite, npr. International Publication br. WO 93/15199, WO 93/15200, i WO 01/77137; i Evropski patent br. EP0 413622. Pored toga, u kontekstu bispecifičnog antitela kako je gore opisano, specifičnosti antitela mogu da se konstruišu tako da se jedan vezujući domen antitela vezuje za Epo, dok se drugi vezujući domen antitela vezuje za serumski albumin, poželjno HSA.

[0168] Strategije za produženje poluživota su posebno korisne kod nano tela, vezivača na bazi fibronektina, i drugih antitela ili proteina kod kojih je poželjan produženi poluživot in vivo.

Konjugati antitela

[0169] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela ili njihove fragmente koji se specifično vezuju za Epo protein rekombinantno fuzionisan ili hemijski konjugovan (uključujući i kovalentne i nekovalentne konjugacije) sa heterologim proteinom ili polipeptidom (ili njegovim fragmentom, poželjno sa polipeptidom od najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 aminokiselina) da bi se stvorili fuzioni proteini. Konkretno, pronalazak obezbeđuje fuzione proteine koji sadrže antigen vezujući fragment antitela koji je ovde opisan (npr. Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, F(ab)2 fragment, VH domen, VH CDR, VL domen ili VL CDR) i heterologi protein, polipeptid ili peptid. Postupci za fuzionisanje ili konjugaciju proteina, polipeptida ili peptida sa antitelom ili fragmentom antitela poznati su u struci. Vidite, npr. U.S. Patente br. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 i 5,112,946; Evropske patente br. EP 0307434 i EP 0367166; International Publication br. WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-

2

10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; i Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341.

[0170] Dodatni fuzioni proteini mogu da se stvore pomoću tehnike mešanja gena, mešanja motiva, mešanja egzona i/ili mešanja kodona (jednim imenom se naziva „mešanje DNK“). Mešanje DNK može da se koristi za izmenu aktivnosti antitela iz pronalaska ili njihovih fragmenata (npr. antitela ili njihovi fragmenti sa većim afinitetima i manjim brzinama disocijacije). Vidite, uopšteno, U.S. Patente br. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 i 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol.287:265-76; i Lorenzo i Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Antitela ili njihovi fragmenti, ili kodirana antitela ili njihovi fragmenti, mogu da se izmene podvrgavanjem nasumičnoj mutagenezi putem PCR sklonog greškama, nasumičnom insercijom nukleotida ili drugim postupcima pre rekombinacije. Polinukleotid koji kodira antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za Epo protein može se rekombinovati sa jednom ili više komponenata, motiva, sekcija, delova, domena, fragmenata itd., jednog ili više heterologih molekula.

[0171] Štaviše, antitela ili njihovi fragmenti se mogu spojiti sa sekvencama markera, kao što je peptid, radi lakšeg prečišćavanja. U poželjnim otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca markera je heksahistidinski peptid, kao što je oznaka data u pQE vektoru (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), između ostalog, od kojih su mnoge komercijalno dostupne. Kao što je opisano u Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, na primer, heksahistidin omogućava jednostavno prečišćavanje fuzionog proteina. Ostale peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničene na, hemaglutininsku („HA“) oznaku, koja odgovara epitopu dobijenom od proteina hemaglutinina gripa (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), i oznaku „flag“.

[0172] U drugim otelotvorenjima, antitela iz predmetnog pronalaska ili njihovi fragmenti konjugovani sa dijagnostičkim agensom ili agensom koji može da se detektuje. Takva antitela mogu biti korisna za praćenje ili prognoziranje nastanka, razvoja, progresije i/ili težine bolesti ili poremećaja u okviru procedure kliničkog testiranja, kao što je utvrđivanje efikasnosti određene terapije. Takva dijagnoza i detekcija mogu da se ostvare kuplovanjem antitela sa supstancama koje mogu da se detektuju, uključujući, bez ograničenja, različite enzime, kao što su, bez ograničenja, peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što su, bez ograničenja, streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentne supstance, kao što su, bez ograničenja, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlortriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentne supstance, kao što je, bez ograničenja, luminol; bioluminescentne supstance, kao što su, bez ograničenja, luciferaza, luciferin i ekvorin; radioaktivne supstance, kao što su, bez ograničenja, jod (131I, 125I, 123I i 121I,), ugljenik (14C), sumpor (35S), tricijum (3H), indijum (115In, 113In, 112In i 111In,), tehnecijum (99Tc), talijum (201Ti), galijum (68Ga, 67Ga), paladijum (103Pd), molibden (99Mo), ksenon (133Xe), fluor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re,142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn i 117Tin; i pozitron emitujući metali koristeći različite pozitronske emisione tomografije, i neradioaktivni paramagnentni joni metala.

[0173] Predmetni pronalazak dalje obuhvata upotrebu antitela ili njihovih fragmenata konjugovanih sa terapeutskim ostatkom. Antitelo ili njegov fragment mogu biti konjugovani sa terapeutskim ostatkom kao što je citotoksin, npr. citostatički ili citocidalni agens, terapeutski agens ili jon radioaktivnog metala, npr. alfa emiteri. Citotoksin ili citotoksični agens uključuju bilo koji agens koji je štetan po ćelije.

[0174] Dalje, antitelo ili njegov fragment mogu biti konjugovani sa terapeutskim ostatkom ili ostatkom leka koji modifikuje dati biološki odgovor. Terapeutske ostatke ili ostatke leka ne treba smatrati ograničenim na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, ostatak leka može biti protein, peptid ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, toksin kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, toksin kolere ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora, α-interferon, βinterferon, nervni faktor rasta, faktor rasta dobijen od trombocita, tkivni aktivator plazminogena, apoptotski agens, antiangiogeni agens; ili modifikator biološkog odgovora kao što je, na primer, limfokin.

[0175] Štaviše, antitelo može da se konjuguje sa terapeutskim ostacima kao što je jon radioaktivnog metala, kao što su alfa-emiteri poput 213Bi ili makrociklični helatori korisni za konjugaciju radiometalnih jona, uključujući, bez ograničenja, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, sa polipeptidima. U određenim otelotvorenjima, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N'',N'''-tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može vezati za

4

antitelo putem molekula linkera. Takvi molekuli linkera su poznati u struci i opisali su ih Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; i Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26(8):943-50.

[0176] Tehnike za konjugaciju terapeutskih ostataka sa antitelom su dobro poznate, vidite, npr. Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (izdav.), str.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2. izd.), Robinson et al. (izdav.), str. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (izdav.), str.

475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (izdav.), str. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev.62:119-58.

[0177] Antitela se takođe mogu vezati za čvrste podloge, što je posebno korisno za imunološke testove ili prečišćavanje ciljnog antigena. Takve čvrste podloge uključuju, ali nisu ograničene na, staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.

Postupci za proizvodnju antitela iz pronalaska

Nukleinske kiseline koje kodiraju antitela

[0178] Pronalazak obezbeđuje u velikoj meri prečišćene molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji sadrže segmente ili domene Epo vezujućih lanaca antitela iz pronalaska koji su prethodno opisani. Neke nukleinske kiseline iz pronalaska sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca prikazan u SEQ ID NO: 13, 33, 53 ili 73, i/ili nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca prikazan u SEQ ID NO: 14, 34, 54, ili 74. U specifičnom otelotvorenju, molekuli nukleinskih kiselina su oni identifikovani u Tabeli 1. Neki drugi molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska sadrže nukleotidne sekvence koje su u velikoj meri identične (npr. najmanje 95% ili 99%) sa nukleotidnim sekvencama molekula nukleinskih kiselina identifikovanih u Tabeli 1. Kada se eksprimiraju iz odgovarajućih ekspresionih vektora, polipeptidi kodirani ovim polinukleotidima mogu da ispolje Epo antigen vezujuću sposobnost.

[0179] Ovde su opisani polinukleotidi koji kodiraju najmanje jedan CDR region, a obično sva tri CDR regiona teškog ili lakog lanca Epo vezujućeg antitela koje je prethodno prikazano. Neki drugi polinukleotidi kodiraju sve ili suštinski sve sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i/ili lakog lanca Epo vezujućeg antitela koje je prethodno prikazano. Zbog degeneracije koda, brojne sekvence nukleinskih kiselina će kodirati svaku od sekvenci aminokiselina imonoglobulina.

[0180] Molekuli nukleinske kiseline iz pronalaska mogu da kodiraju i varijabilni region i konstantni region antitela. Neke sekvence nukleinske kiseline iz pronalaska sadrže nukleotide koji kodiraju sekvencu zrelog teškog lanca koja je u velikoj meri identična (npr. najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) sa sekvencom zrelog teškog lanca datom u SEQ ID NO: 15, 35, 55, ili 75. Neke druge sekvence nukleinske kiseline sadrže nukleotid koji kodira sekvencu zrelog lakog lanca koja je u velikoj meri identična (npr. najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) sa sekvencom zrelog lakog lanca datom u SEQ ID NO: 16, 36, 56, ili 76.

[0181] Polinukleotidne sekvence mogu da se proizvedu de novo sintezom DNK u čvrstoj fazi ili PCR mutagenezom postojeće sekvence (npr, sekvence kao što je opisana u Primerima u nastavku) koja kodira Epo vezujuće antitelo ili njegov vezujući fragment. Direktna hemijska sinteza nukleinskih kiselina može da se postigne postupcima poznatim u struci, kao što je fosfotriestarski postupak čiji su autori Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; fosfodiestarski postupak čiji su autori Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; dietilfosforamiditni postupak čiji su autori Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; i postupak na čvrstoj podlozi iz U.S. Patenta br. 4,458,066. Uvođenje mutacija u polinukleotidnu sekvencu putem PCR može da se obavi kako je opisano, npr. u PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (izdav.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; i Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.

[0182] U pronalasku su takođe obezbeđeni ekspresioni vektori i ćelije domaćini za proizvodnju Epo vezujućih antitela iz pronalaska koja su prethodno opisana. Različiti ekspresioni vektori mogu da se koriste za ekspresiju polinukleotida koji kodiraju lance Epo vezujućeg antitela ili vezujuće fragmente. I ekspresioni vektori na bazi virusa i nevirusni ekspresioni vektori mogu da se koriste za proizvodnju antitela u sisarskoj ćeliji domaćini. Nevirusni vektori i sistemi uključuju plazmide, epizomske vektore, obično sa ekspresionom kasetom za ekspresiju proteina ili RNK i humane veštačke hromozome (vidite, npr. Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Na primer, nevirusni vektori korisni za ekspresiju Epo vezujućih polinukleotida i polipeptida u ćeliji sisara (npr. čoveka) uključuju pThioHis A, B i C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B i C, (Invitrogen, San Diego, CA), MPSV vektore, i brojne druge vektore poznate u struci za ekspresiju drugih proteina. Korisni virusni vektori uključuju vektore na bazi retrovirusa, adenovirusa, adeno asociranih virusa, virusa herpesa, vektore na bazi SV40, papiloma virusa, HBP Epštajn-Barovog virusa, vektora virusa vakcinija i virusa Semliki šume (SFV). Vidite Brent et al., prethodno; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; i Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[0183] Izbor ekspresionog vektora zavisi od predviđenih ćelija domaćina u kojima vektor treba da se eksprimira. Obično, ekspresioni vektori sadrže promoter i druge regulatorne sekvence (npr. pojačivače) koje su operabilno povezane sa polinukleotidima koji kodiraju lanac ili fragment Epo vezujućeg antitela. U nekim otelotvorenjima, inducibilni promoter se koristi za sprečavanje ekspresije umetnutih sekvenci, osim u indukujućim uslovima. Inducibilni promoteri uključuju, npr., arabinozu, lacZ, metalotioneinski promoter ili promoter toplotnog šoka. Kulture transformisanih organizama mogu da se prošire u neindukujućim uslovima bez uticaja na populaciju za kodirajuće sekvence čije ekspresione proizvode ćelije domaćini bolje podnose. Pored promotora, mogu biti potrebni ili poželjni i drugi regulatorni elementi za efikasnu ekspresiju lanca ili fragmenta Epo vezujućeg antitela. Ti elementi obično uključuju ATG početni kodon i susedno mesto vezivanja ribozoma ili druge sekvence. Pored toga, efikasnost ekspresije može da se poveća uključivanjem pojačivača koji odgovaraju ćelijskom sistemu koji se koristi (vidite, npr. Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; i Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Na primer, pojačivač SV40 ili pojačivač CMV mogu da se koriste za povećanje ekspresije u sisarskim ćelijama domaćinima.

[0184] Ekspresioni vektori takođe mogu da obezbede poziciju signalne sekvence za sekreciju radi formiranja fuzionog proteina sa polipeptidima koje kodiraju umetnute sekvence Epo vezujućeg antitela. Češće su umetnute sekvence Epo vezujućeg antitela povezane sa signalnim sekvencama pre uključivanja u vektor. Vektori koji će se koristiti za primanje sekvenci koje kodiraju varijabilne domene lakog i teškog lanca Epo vezujućeg antitela ponekad takođe kodiraju konstantne regione ili njihove delove. Takvi vektori omogućavaju ekspresiju varijabilnih regiona kao fuzionih proteina gde konstantni regioni tako dovode do proizvodnje netaknutih antitela ili njihovih fragmenata. Takvi konstantni regioni su obično humani.

[0185] Ćelije domaćini za gajenje i ekspresiju lanaca Epo vezujućih antitela mogu biti prokariotske ili eukariotske. E. coli je jedan prokariotski domaćin koristan za kloniranje i ekspresiju polinukleotida iz predmetnog pronalaska. Ostali mikrobni domaćini pogodni za upotrebu uključuju bacile, kao što je Bacillus subtilis, i druge enterobakterije, kao što su Salmonella, Serratia i različite vrste Pseudomonas. U ovim prokariotskim domaćinima, takođe mogu da se naprave i ekspresioni vektori koji obično sadrže kontrolne sekvence ekspresije kompatibilne sa ćelijom domaćinom (npr. poreklo replikacije). Pored toga, biće prisutan bilo koji broj poznatih promotera, kao što je sistem promotera laktoze, sistem triptofanskog (trp) promotera, sistem promotera beta-laktamaze ili promoterski sistem iz faga lambda. Promoteri obično kontrolišu ekspresiju, opciono sa sekvencom operatora, i imaju sekvence mesta vezivanja ribozoma i slično, za započinjanje i kompletiranje transkripcije i translacije. Drugi mikrobi, poput kvasca, takođe mogu da se koriste za ekspresiju Epo vezujućih polipeptida iz pronalaska. Takođe se mogu koristiti ćelije insekata u kombinaciji sa bakulovirusnim vektorima.

[0186] U nekim poželjnim otelotvorenjima, sisarske ćelije domaćini se koriste za ekspresiju i proizvodnju Epo vezujućih polipeptida iz predmetnog pronalaska. Na primer, one mogu biti ili ćelijska linija hibridoma koja eksprimira gene imunoglobulina (npr. 1D6.C9 mijelom klon hibridoma, kako je opisano u Primerima) ili ćelijska linija sisara koja nosi egzogeni ekspresioni vektor (npr. SP2/0 ćelije mijeloma prikazane u nastavku). To uključuje bilo koji normalnu smrtnu ili normalnu ili abnormalnu besmrtnu životinjsku ili humanu ćeliju. Na primer, razvijen je niz pogodnih ćelijskih linija domaćina sposobnih za lučenje netaknutih imunoglobulina, uključujući CHO ćelijske linije, razne Cos ćelijske linije, HeLa ćelije, ćelijske linije mijeloma, transformisane B-ćelije i hibridome. Upotreba ćelijske kulture tkiva sisara za ekspresiju polipeptida je uopšteno razmotrena, npr. u Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Ekspresioni vektori za sisarske ćelije domaćine mogu da uključuju kontrolne sekvence ekspresije, kao što je poreklo replikacije, promoter i pojačivač (vidite, npr. Queen, et al., Immunol. Rev.89:49-68, 1986), i neophodna mesta za obradu informacija, kao što su mesta vezivanja ribozoma, mesta splajsovanja RNK, mesta poliadenilacije i sekvence terminatora transkripcije. Ovi ekspresioni vektori obično sadrže promotere dobijene od gena sisara ili virusa sisara. Pogodni promotori mogu biti konstitutivni, specifični za vrstu ćelije, specifični za određenu fazu i/ili prilagodljivi ili podesivi. Korisni promotori uključuju, ali nisu ograničeni na, promoter metalotioneina, konstitutivni glavni kasni promoter adenovirusa, MMTV promoter koji može da se indukuje deksametazonom, SV40 promoter, MRP polIII promoter, konstitutivni MPSV promoter, CMV promoter koji može da se indukuje tetraciklinom (kao što je humani trenutni-rani CMV promoter), konstitutivni CMV promoter i kombinacije promoter-pojačivač poznate u struci.

[0187] Postupci za uvođenje ekspresionih vektora koji sadrže željene sekvence polinukleotida razlikuju se u zavisnosti od vrste ćelijskog domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hloridom se obično koristi za prokariotske ćelije, dok se tretman kalcijum fosfatom ili elektroporacija mogu koristiti za druge ćelijske domaćine. (Generalno, vidite Sambrook, et al., gore). Ostali postupci uključuju, npr. elektroporaciju, tretman kalcijum fosfatom, transformaciju posredovanu lipozomom, injektovanje i mikroinjektovanje, balističke postupke, virozome, imunolipozome, konjugate polikatjon:nukleinska kiselina, golu DNK, veštačke virione, fuziju sa strukturnim proteinom herpes virusa VP22 (Elliot i O'Hare, Cell 88:223, 1997), preuzimanje DNK pojačano agensom i ex vivo transdukciju. Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina sa visokim prinosom često će biti poželjna stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju lance ili vezujuće fragmente Epo vezujućeg antitela mogu da se pripreme koristeći ekspresione vektore iz pronalaska koji sadrže virusno poreklo replikacije ili endogene ekspresione elemente i selektabilni marker gen. Nakon uvođenja vektora, ćelije mogu da se ostave da rastu tokom 1-2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivni medijum. Svrha selektabilnog markera je da prenese otpornost na selekciju, i njegovo prisustvo omogućava rast ćelija koje uspešno eksprimiraju uvedene sekvence u selektivnom medijumu. Otporne, stabilno transficirane ćelije mogu da se razmnožavaju koristeći tehnike uzgajanja tkiva odgovarajuće za vrstu ćelije.

Stvaranje monoklonskih antitela iz pronalaska

[0188] Monoklonska antitela (mAb) mogu da se proizvedu raznovrsnim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatske ćelije koju su dali Kohler i Milstein, 1975 Nature 256: 495. Mogu da se koriste brojne tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela, npr. virusna ili onkogena transformacija B limfocita.

[0189] Životinjski sistemi za pripremu hibridoma uključuju mišje, pacovske i zečje sisteme. Proizvodnja hibridoma u mišu je dobro utvrđena procedura. Imunizacioni protokoli i tehnike za izolovanje imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u struci. Takođe su poznati i fuzioni partneri (npr. ćelije mišjeg mijeloma) i fuzione procedure.

[0190] Himerna ili humanizovana antitela iz predmetnog pronalaska se mogu pripremiti na osnovu sekvence mišjeg monoklonskog antitela pripremljenog kako je prethodno opisano. DNK koja kodira imunoglobuline teškog i lakog lanca može da se dobije od željenog mišjeg hibridoma, i da se konstruiše da sadrži nemišje (npr. humane) sekvence imunoglobulina, korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima korišćenjem postupaka poznatih u struci (vidite, npr. U.S. Patent br. 4,816,567, Cabilly et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu da se ubace u humani okvir korišćenjem postupaka poznatih u struci. Vidite, npr. U.S. Patent br.5,225,539, Winter, i U.S. Patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.

[0191] U određenom otelotvorenju, antitela iz pronalaska su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena na Epo mogu da se generišu korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema umesto mišjeg sistema. Ti transgeni i transhomozomski miševi uključuju miševe koji se ovde nazivaju HuMAb miševi, odnosno KM miševi, a kolektivno se ovde nazivaju "humanim Ig miševima".

[0192] HuMAb mouse<®>(Medarex, Inc.) sadrži minilokuse gena humanog imunoglobulina koji kodiraju nepreuređene sekvence humanog teškog (µ i γ) i κ lakog lanca imunoglobulina, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse µ i κ lanca (vidite, npr. Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Shodno tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca su podvrgnuti zameni klase i somatskoj mutaciji radi generisanja monoklonskog humanog IgGκ velikog afiniteta (Lonberg, N. et al., 1994 gore; pregled dat u Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. i Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, i Harding, F. i Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci.764:536-546). Priprema i korišćenje HuMAb miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, dalje su opisani u Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol.

152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; i Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. Vidite dalje, U.S. Patente br. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; sve autora Lonberg i Kay; U.S. Patent br. 5,545,807, Surani et al.; PCT Publikacije br. WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 i WO 99/45962, sve autora Lonberg i Kay; i PCT Publikaciju br. WO 01/14424, Korman et al.

[0193] U drugom otelotvorenju, humana antitela iz pronalaska mogu da se uzgajaju pomoću miša koji nosi sekvence humanog imunoglobulina na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi transgen humanog teškog lanca i transhromozom humanog lakog lanca. Takvi miševi, koji se ovde nazivaju „KM miševi“, opisani su detaljno u PCT Publikaciji WO 02/43478, Ishida et al.

[0194] Još dalje, alternativni sistemi transgenih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu se koristiti za dobijanje Epo vezujućih antitela iz pronalaska. Na primer, može se koristiti alternativni transgeni sistem koji se naziva Xenomouse (Abgenix, Inc.). Takvi miševi su opisani, npr. u U.S. Patentima br. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963, Kucherlapati et al.

[0195] Štaviše, alternativni sistemi transhromozomskih životinja koji eksprimiraju gene humanog imunoglobulina su dostupni u struci, i mogu se koristiti za dobijanje Epo vezujućih antitela iz pronalaska. Na primer, mogu da se koriste miševi koji istovremeno nose

1

transhromozome humanog teškog lanca i transhromozome humanog lakog lanca, koji se nazivaju „TC miševi“. Takve miševe opisuju Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Dalje, krave koje nose transhromozome humanog teškog i lakog lanca su opisane u struci (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu da se koriste za dobijanje Epo vezujućih antitela iz pronalaska.

[0196] Humana monoklonska antitela iz pronalaska takođe se mogu pripremiti koristeći postupke displeja faga za skrining biblioteka gena humanog imunoglobulina. Takvi postupci displeja faga za izolovanje humanih antitela su utvrđeni u struci i opisani u primerima u nastavku. Vidi na primer: U.S. Patente br. 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698, Ladner et al.; U.S. Patente br.5,427,908 i 5,580,717, Dower et al.; U.S. Patente br.5,969,108 i 6,172,197, McCafferty et al.; i U.S. Patente br.5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081, Griffiths et al.

[0197] Humana monoklonska antitela prema pronalasku takođe mogu da se pripreme korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imunske ćelije tako da može da se generiše odgovor humanog antitela nakon imunizacije. Takvi miševi su opisani, na primer, u U.S. Patentima br.5,476,996 i 5,698,767, Wilson et al.

Okvir ili Fc inženjerstvo

[0198] Konstruisana antitela uključuju ona u kojima su načinjene modifikacije ostataka okvira u VH i/ili VL, npr. radi poboljšanja svojstava antitela. Takve modifikacije okvira su tipično načinjene da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratno mutiranje" jednog ili više ostataka okvira u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Specifičnije, antitelo koje je prošlo somatsku mutaciju može sadržati ostatke okvira koji se razlikuju od sekvence germinativne linije od koje je antitelo dobijeno. Takvi ostaci mogu da se identifikuju poređenjem sekvenci okvira antitela sa sekvencama germinativne linije od kojih je antitelo dobijeno. Da bi se sekvence regiona okvira vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu biti „povratno mutirane“ u sekvencu germinativne linije, na primer, putem mutageneze usmerene na mesto. Takva „povratno mutirana“ antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.

2

[0199] Drugi tip modifikacija okvira uključuje mutaciju jednog ili više ostataka u regionu okvira, ili čak u jednom ili više CDR regiona, kako bi se uklonili epitopi T ćelija, čime se smanjuje potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se takođe naziva „deimunizacija“, i detaljnije je opisan u U.S. Patentnoj publikaciji br.20030153043 čiji su autori Carr et al.

[0200] Pored modifikacija načinjenih u regionima okvira ili CDR, ili kao njihova alternativa, antitela iz pronalaska se mogu konstruisati da uključe modifikacije u Fc regionu, tipično da bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao što je poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje Fc receptora i/ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela. Nadalje, antitelo iz pronalaska može biti hemijski modifikovano (npr. jedan ili više hemijskih funkcionalnih ostataka se može vezati za antitelo) ili modifikovano da se izmeni njegova glikozilacija, ponovo radi izmene jednog ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svako od ovih otelotvorenja je detaljnije opisano u nastavku. Numerisanje ostataka u Fc regionu je prema Kabatovom EU indeksu.

[0201] U jednom otelotvorenju, region šarke CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u regionu šarke izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br. 5,677,425 čiji su autori Bodmer et al. Broj cisteinskih ostataka u regionu šarke CH1 je izmenjen, na primer, radi olakšavanja sklapanja lakih i teških lanaca ili radi povećanja ili smanjenja stabilnosti antitela.

[0202] U drugom otelotvorenju, Fc region šarke antitela je mutiran da smanji biološki poluživot antitela. Specifičnije, uvedena je jedna ili više mutacija aminokiselina u CH2-CH3 region interfejsa domena fragmenta Fc šarke tako da antitelo ima umanjeno vezivanje stafilokoknog proteina A (SpA) u odnosu na SpA vezivanje nativnog domena Fc šarke. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br.6,165,745 čiji su autori Ward et al.

[0203] U drugom otelotvorenju, antitelo je modifikovano da bi se produžio njegov biološki poluživot. Mogući su raznovrsni pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više od sledećih mutacija: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u U.S. Patentu br. 6,277,375, Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo se može izmeniti u CH1 ili CL regionu kako bi sadržalo epitop za vezivanje receptora spasa (eng. salvage receptor) uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što opisuju U.S. patenti br. 5,869,046 i 6,121,022 autora Presta et al.

[0204] U još jednom otelotvorenju, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog ostatka aminokiseline različitim ostatkom aminokiseline da bi se izmenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina se može zameniti različitim aminokiselinskim ostacima tako da antitelo ima izmenjen afinitet prema efektorskom ligandu ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost matičnog antitela. Efektorski ligand prema kome je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br.5,624,821 i 5,648,260 čiji su autori Winter et al.

[0205] U drugom otelotvorenju, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka se može zameniti različitim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje C1q i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentu br.6,194,551 čiji su autori Idusogie et al.

[0206] U drugom otelotvorenju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka je izmenjen kako bi se time izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljnije opisan u PCT Publikaciji WO 94/29351 čiji su autori Bodmer et al.

[0207] U još jednom otelotvorenju, Fc region je modifikovan da poveća sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da poveća afinitet antitela prema Fcγ receptoru putem modifikovanja jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je dalje opisan u PCT Publikaciji WO 00/42072 čiji je autor Presta. Štaviše, mesta vezivanja na humanom IgG1 za FcγRI, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana, i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (vidite Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem.276:6591-6604).

[0208] U još jednom otelotvorenju, glikozilacija antitela je izmenjena. Na primer, može se napraviti aglikozilovano antitelo (tj. antitelo nema glikozilaciju). Glikozilacija može biti izmenjena da bi se, na primer, povećao afinitet antitela prema „antigenu“. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije u

4

sekvenci antitela. Na primer, može se načiniti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje dovode do eliminacije jednog ili više mesta glikozilacije varijabilnog regiona okvira, čime se eliminiše glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može povećati afinitet antitela prema antigenu. Takav pristup je detaljnije opisan u U.S. Patentima br.5,714,350 i 6,350,861 čiji su autori Co et al.

[0209] Dodatno ili alternativno, može se napraviti antitelo koje ima izmenjenu vrstu glikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećane bisektujuće strukture GlcNac. Pokazalo se da takvi izmenjeni šabloni glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata se mogu postići, na primer, ekspresijom antitela u ćeliji domaćinu sa izmenjenim mehanizmom glikozilacije. Ćelije sa izmenjenim mehanizmom glikozilacije su opisane u struci, i mogu se koristiti kao ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela iz pronalaska, čime se proizvodi antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 čiji su autori Hang et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno ometanim FUT8 genom, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. PCT Publikacija WO 03/035835 čiji je autor Presta opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću povezivanja fukoze sa Asn(297)-povezanim ugljenim hidratima, što takođe dovodi do hipofukozilacije antitela eksprimiranih u toj ćeliji domaćinu (vidite takođe Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem.

277:26733-26740). PCT Publikacija WO 99/54342 čiji su autori Umana et al. opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikozil transferaze koje modifikuju glikoprotein (npr. beta(1,4)-N acetilglukozaminil transferaza III (GnTIII)), tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama pokazuju porast bisektujućih GlcNac struktura, što dovodi do povećane ADCC aktivnosti antitela (vidite takođe Umana et al., 1999 Nat. Biotech.

17:176-180).

Postupci konstruisanja izmenjenih antitela

[0210] Kao što je gore razmotreno, Epo vezujuća antitela sa VH i VL sekvencama ili sekvencama teškog i lakog lanca kompletne dužine koje su prikazana ovde mogu da se koriste za kreiranje novih Epo vezujućih antitela putem modifikovanja sekvenci teškog lanca i/ili lakog lanca kompletne dužine, VH i/ili VL sekvenci, ili na njih vezanih konstantnih regiona. Dakle, strukturne karakteristike Epo vezujućeg antitela iz pronalaska mogu da se koriste za kreiranje strukturno povezanih Epo vezujućih antitela koja zadržavaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela iz pronalaska, kao što je vezivanje za humani Epo, i takođe inhibiraju jedno ili više funkcionalnih svojstava Epo (npr. inhibicija vezivanja Epo za Epo receptor, inhibicija ćelijske proliferacije zavisne od Epo).

[0211] Na primer, jedan ili više CDR regiona antitela iz predmetnog pronalaska, ili njihove mutacije, mogu se rekombinantno kombinovati sa poznatim regionima okvira i/ili drugim CDR-ima radi kreiranja dodatnih rekombinantno konstruisanih Epo vezujućih antitela iz otkrića, kao što je prethodno razmotreno. Drugi tipovi modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Polazna supstanca za postupak konstruisanja je jedna ili više sekvenci VH i/ili VL koje su ovde obezbeđene, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se kreiralo konstruisano antitelo, nije neophodno zapravo pripremiti (tj. eksprimirati kao protein) antitelo koje ima jednu ili više VH i/ili VL sekvenci koje su ovde date ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Prevashodno, informacije koje se nalaze u sekvencama se koriste kao polazni materijal za kreiranje "druge generacije" sekvenci dobijenih od originalnih sekvenci, a zatim se sekvence "druge generacije" pripremaju i eksprimiraju kao protein.

[0212] Shodno tome, ovde je opisan i postupak za pripremu modifikovanog Epo vezujućeg antitela koji obuhvata korake: a) proizvodnje Epo vezujućeg antitela koje sadrži sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca antitela sa CDR1 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1, 21, 41 i 61, CDR2 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 22, 42 i 62, i/ili CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 23, 43 i 63; i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela sa CDR1 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 24, 44 i 64, CDR2 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 25, 45 i 65, i/ili CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 26, 46 i 66; b) izmene najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca antitela radi kreiranja najmanje jedne izmenjene sekvence antitela; i c) ekspresije izmenjene sekvence antitela kao proteina.

[0213] Shodno tome, ovde je opisan i postupak za pripremu Epo vezujućeg antitela koji se sastoji od sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela sa CDR1 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 27, 47 i 67, CDR2 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 28, 48 i 68, i/ili CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 29, 49 i 69; i sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca antitela sa CDR1 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 30, 50 i 70, CDR2 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 31, 51 i 71, i/ili CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 32, 52 i 72; izmene najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca antitela radi kreiranja najmanje jedne izmenjene sekvence antitela; i ekspresije izmenjene sekvence antitela kao proteina.

[0214] Shodno tome, u drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu Epo vezujućeg antitela optimizovanog za ekspresiju u ćeliji sisara koji se sastoji od: sekvence teškog lanca kompletne dužine antitela sa sekvencom izabranom iz grupe od SEQ ID NO: 15, 35, 55 i 75; i sekvence lakog lanca kompletne dužine antitela sa sekvencom izabranom iz grupe od SEQ ID NO: 16, 36, 56 i 76; izmene najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci teškog lanca kompletne dužine antitela i/ili sekvenci lakog lanca kompletne dužine antitela radi kreiranja najmanje jedne izmenjene sekvence antitela; i ekspresije izmenjene sekvence antitela kao proteina. U jednom otelotvorenju, izmena teškog ili lakog lanca je u regionu okvira teškog ili lakog lanca.

[0215] Izmenjena sekvenca antitela takođe može da se pripremi skriningom biblioteka antitela koje imaju fiksne sekvence CDR3 ili minimalne suštinske determinante vezivanja, kako je opisano u US20050255552, i raznovrsne CDR1 i CDR2 sekvence. Skrining takođe može da se obavi u skladu sa bilo kojom tehnologijom za skrining koja je prikladna za skrining antitela iz biblioteka antitela, kao što je tehnologija displeja faga.

[0216] Standardne tehnike molekulske biologije mogu da se koriste za pripremu i ekspresiju izmenjene sekvence antitela. Antitelo koje je kodirano izmenjenim sekvencama antitela je ono koje zadržava jedno, neka ili sva funkcionalna svojstva Epo vezujućih antitela koja su ovde opisana, čija funkcionalna svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, specifično vezivanje za Epo čoveka, cinomolgusa, pacova i/ili miša; i antitelo inhibira Epo zavisnu ćelijsku proliferaciju u F36E i/ili Ba/F3-EpoR testu ćelijske proliferacije.

[0217] U određenim otelotvorenjima postupaka konstruisanja antitela iz otkrića, mutacije mogu da se uvedu nasumično ili selektivno u celoj sekvenci za kodiranje Epo vezujućeg antitela ili u njenom delu, i dobijena modifikovana Epo vezujuća antitela mogu da se podvrgnu skriningu na aktivnost vezivanja i/ili druga funkcionalna svojstva, kao što je ovde opisano. Mutacioni postupci su opisani u struci. Na primer, PCT Publikacija WO 02/092780, čiji je autor Short, opisuje postupke za stvaranje i proveru mutacija antitela pomoću saturacione mutageneze, sintetičkog ligacionog sklapanja, ili njihove kombinacije. Alternativno, PCT Publikacija WO 03/074679, čiji su autori Lazar et al. opisuje postupke korišćenja postupaka računarskog skrininga za optimizaciju fizičko-hemijskih svojstava antitela.

[0218] U određenim otelotvorenjima pronalaska, antitela su konstruisana da se ukloni mesto deamidacije. Poznato je da deamidacija uzrokuje strukturne i funkcionalne promene u peptidu ili proteinu. Deamidacija može dovesti do smanjene bioaktivnosti, kao i do izmena u farmakokinetici i antigenosti proteinskog leka. (Anal Chem. 2005 Mar 1;77(5):1432-9).

[0219] U određenim otelotvorenjima pronalaska, antitela su konstruisana radi povećanja pI i poboljšavanja njihovih lekovitih svojstava. pI proteina je ključna determinanta ukupnih biofizičkih svojstava molekula. Poznato je da su antitela koja imaju nizak pI manje rastvorljiva, manje stabilna i sklona agregaciji. Dalje, prečišćavanje antitela sa niskim pI predstavlja izazov i može biti problematično, posebno tokom povećanja obima za kliničku upotrebu. Povećanjem pI anti-Epo antitela ili Fab iz pronalaska poboljšava se njihova rastvorljivost, što omogućava da se antitela formulišu pri većim koncentracijama (>100 mg/ml). Formulacija antitela u visokim koncentracijama (npr. >100 mg/ml) pruža prednost mogućnosti primene većih doza antitela u oči pacijenata putem intravitrealnih injekcija, što zauzvrat može da omogući smanjenu učestalost doziranja, što je značajna prednost u lečenju hroničnih bolesti, uključujući vaskularnu bolest mrežnjače. Viši pI mogu takođe da povećaju FcRn posredovano recikliranje IgG verzije antitela, što omogućava da lek opstane u telu u dužem vremenskom periodu, uz manji broj injekcija. Konačno, ukupna stabilnost antitela je značajno poboljšana usled većeg pI, što dovodi do dužeg trajanja i bioaktivnosti in vivo. Poželjno, pI je veći ili jednak 8,2.

[0220] Funkcionalna svojstva izmenjenih antitela mogu da se procene koristeći standardne testove dostupne u struci i/ili ovde opisane, kao što su oni dati u Primerima (npr. ELISA).

Profilaktička i terapeutska primena

[0221] Antitela koja vezuju Epo kako je ovde opisano mogu da se koriste u terapeutski korisnoj koncentraciji za lečenje bolesti ili poremećaja povezane sa povišenim nivoima i/ili aktivnošću Epo putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela ili antigen vezujućih fragmenata iz pronalaska. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja stanja ili poremećaja povezanih sa dijabetičkom retinopatijom (DR) putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja stanja ili poremećaja povezanih sa edemom makule putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje postupak lečenja dijabetičkog edema makule (DME) primenom na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak lečenja proliferativne dijabetičke retinopatije (PDR) putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Još dalje, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke lečenja starosnog edema makule (AMD), okluzije vene mrežnjače (RVO), angioedema, multifokalnog horoiditisa, miopične horoidne neovaskularizacije i/ili retinopatije nedonoščadi putem primene na ispitaniku kome je to potrebno delotvorne količine antitela iz pronalaska. Pronalazak takođe obezbeđuje postupke lečenja beta talasemije i/ili kancera.

[0222] Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaja povezanih sa povišenim nivoima i/ili aktivnošću Epo. Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače. Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju stanja ili poremećaja povezanih sa dijabetičkom retinopatijom (DR). Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju stanja ili poremećaja povezanih sa edemom makule, dijabetičkim edemom makule (DME) i/ili proliferativnom dijabetičkom retinopatijom (PDR). Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu kod starosnog edema makule (AMD), okluzije vene mrežnjače (RVO), angioedema, multifokalnog horoiditisa, miopične horoidne neovaskularizacije i/ili retinopatije nedonoščadi. Pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju beta talasemije i/ili kancera. Preciznije, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment iz pronalaska, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju bolesti ili poremećaju povezanih sa povišenim nivoima i/ili aktivnošću Epo, može biti bilo koje od ovde opisanih antitela ili antigen vezujućih fragmenata, pored onih opisanih u Tabeli 1. Dalje, izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment iz pronalaska, kao što je ovde opisano, za upotrebu u lečenju stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače može biti bilo koje od ovde opisanih antitela ili antigen vezujućih fragmenata, pored onih opisanih u Tabeli 1. Antitela iz pronalaska mogu da se koriste, između ostalog, za sprečavanje progresije stanja ili bolesti povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače (na primer, DR, DME, NPDR, PDR, starosna degeneracija makule (AMD), okluzija vene mrežnjače (RVO), angioedem, multifokalni horoiditis, miopična horoidna neovaskularizacija i/ili retinopatija nedonoščadi), za lečenje ili prevenciju edema makule povezanog sa vaskularnom bolešću mrežnjače, za smanjenje učestalosti injekcije Lucentis® (RTM) i za poboljšanje gubitka vida usled progresije vaskularne bolesti mrežnjače. Antitela iz pronalaska takođe mogu da se koriste u kombinaciji sa anti-VEGF terapijama za lečenje pacijenata sa vaskularnom bolešću mrežnjače.

[0223] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za inhibiciju Epo-zavisne proliferacije ćelija, pri čemu postupak uključuje korak dovođenje u kontakt Epo (npr. dovođenje u kontakt Epo kod ispitanika) sa delotvornom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente iz ovde opisanog pronalaska; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. U jednom aspektu, postupak uključuje dovođenje u kontakt ćelije (npr. ćelije koja sadrži Epo) sa kompozicijom koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu za inhibiranje Epo-zavisne proliferacije ćelija kod ispitanika. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Ćelija može biti B ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0224] Proliferacija ćelija može da se izmeri, na primer, biomikroskopijom špalt lampom, optičkom koherentnom tomografijom, fotografisanjem očnog dna u boji i fluoresceinskom angiografijom (Heng et al. Diabet. Med. 2013 Jun;30(6):640-50). Pored toga, sposobnost ovde opisanog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta da inhibiraju Epo zavisnu proliferaciju ćelije može da se izmeri koristeći testove kao što je F36E ili Ba/F3-EpoR test proliferacije ćelija opisan u nastavku.

[0225] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranje Epo-zavisne ćelijske signalizacije, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano, kako bi se sprečilo da Epo stupi u interakciju sa receptorom na površini ćelije. U jednom aspektu, postupak uključuje dovođenje u kontakt ćelije koja sadrži Epo sa kompozicijom koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u inhibiranju Epo-zavisne ćelijske signalizacije kod ispitanika. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek.

[0226] Vezivanje Epo za EpoR indukuje signalizaciju putem JAK2 kinaza koja dovodi do aktivacije nishodnih puteva signalizacije koji uključuju fosfatidil-inozitol 3-kinazu (PI-3K)/Akt, MAP kinazu, STAT5 i protein kinazu C (Jelkmann, 2007; Jelkmann, 2004). Objavljeno je da se Epo ili Epo receptor (EpoR) proizvode endogeno od strane različitih vrsta ćelija, kao što su endotelne ćelije, ćelije glatkog mišića i ćelije CNS (Ogunshola i Bogdanova, 2013). Aktivacija EpoR nakon vezivanja Epo može da pokrene nishodne puteve signalizacije koji dovode do različitih aktivnosti kao što je transport kalcijuma (Korbel et al., 2004), preživljavanje ćelije (Velly et al., 2010), neuroprotekcija (Grimm et al., 2002) i angiogeneza (Ribatti, 2010; Ribatti et al., 2003). Shodno tome, inhibicija Epo zavisne signalizacije ćelija može da se utvrdi merenjem aktivnosti jednog ili više ovih puteva signalizacije. Na primer, inhibicija Epo zavisne signalizacije ćelija može da se utvrdi

1

merenjem JAK2 kinaze, PI-3K/Akt, MAP kinaze, STAT5 ili protein kinaze C. Postupci za merenje tih puteva signalizacije su poznati u struci, i kompleti za merenje aktivnosti takvog puta su komercijalno dostupni. Uz to, inhibicija Epo zavisne ćelijske signalizacije može da se utvrdi merenjem proliferacije ćelija, kako je prethodno opisano. Proliferacija ćelija može biti u ispitaniku (npr. angiogeneza), ili može da se izmeri koristeći test kao što je F36E ili Ba/F3-EpoR test ćelijske proliferacije opisan u nastavku. U jednom aspektu, Epo zavisna ćelijska signalizacija se statistički značajno smanjuje (p <0,05) u prisustvu ovde opisanog antitela, u odnosu na kontrolu.

[0227] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiciju Epo zavisne ćelijske proliferacije ili signalizacije, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano, kako bi se sprečilo da Epo stupi u interakciju sa receptorom na površini ćelije. Smatra se da je ćelija B ćelija. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija.

[0228] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za inhibiranje vezivanja Epo za Epo receptor, pri čemu postupak uključuje korak dovođenja Epo u kontakt (npr. dovođenja Epo u kontakt kod ispitanika) sa efektivnom količinom kompozicije koja sadrži izolovano antitelo ili njegove antigen vezujuće fragmente prema pronalasku, kao što je ovde opisano; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku, kao što je ovde opisano, za upotrebu u inhibiranju vezivanja Epo za Epo receptor na ćeliji ispitanika; naročito, kompozicija može da sadrži antitelo NVS1, NVS2, NVS3 ili NVS4. Smatra se da je ćelija ljudska ćelija. Dalje se smatra da je ćelija u ispitaniku. Takođe se smatra da je ćelija u oku ispitanika. Dalje se smatra da je ispitanik čovek. Inhibicija Epo vezivanja za Epo receptor može da se izmeri kako opisuju Khankin et al. PLoS ONE, 20105:e9246

[0229] Lečenje i/ili prevenciju vaskularne bolesti mrežnjače i edema makule povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače može da odredi oftalmolog ili zdravstveni stručnjak koristeći klinički relevantna merenja funkcije vida i/ili anatomije mrežnjače. Lečenje stanja ili poremećaja povezanih sa vaskularnom bolešću mrežnjače označava bilo koju aktivnost (npr. primena ovde opisanog anti-Epo antitela) koja dovodi, ili se smatra da dovodi do poboljšanja

2

ili očuvanja funkcije vida i/ili anatomije mrežnjače. Uz to, prevencija, kada se odnosi na stanja ili poremećaje povezane sa vaskularnom bolešću mrežnjače, označava bilo koju aktivnost (npr. primena ovde opisanog anti-Epo antitela) koja sprečava ili usporava pogoršanje funkcije vida, anatomije mrežnjače i/ili parametra vaskularne bolesti mrežnjače, kako je ovde definisano, kod pacijenta koji je pod rizikom od takvog pogoršanja.

[0230] Funkcija vida može da obuhvata, na primer, oštrinu vida, oštrinu vida pri slabom osvetljenju, vidno polje, centralno vidno polje, periferni vid, osetljivost na kontrast, adaptaciju na mrak, oporavak od foto stresa, razlikovanje boja, brzinu čitanja, zavisnost od pomoćnih sredstava (npr. veliki font, uveličavajuća sredstva, teleskopi), prepoznavanje lica, veštinu u upravljanju motornim vozilom, sposobnost da se obavi jedna ili više svakodnevnih aktivnosti i/ili zadovoljstvo koje pacijent prijavljuje u pogledu funkcije vida.

[0231] Primeri mera funkcije vida uključuju Snelenovu oštrinu vida, ETDRS oštrinu vida, oštrinu vida sa niskom luminescencijom, Amslerovu mrežu, Goldmanovo vidno polje, Hamfrijevo vidno polje, mikroperimetriju, Peli-Robsonovu tabelu, SKILL karticu, Išiharine obojene ploče, Farnsvortov D15 ili D100 test boja, standardnu elektroretinografiju, multifokalnu elektroretinografiju, validirane testove brzine čitanja, prepoznavanje lica, simulacije vožnje i zadovoljstvo koje pacijent prijavljuje. Tako, može se reći da se lečenje vaskularne bolesti i/ili edema makule ostvaruje po dobijanju, ili izostanku gubitka, 2 ili više linija (ili 10 slova) vida na ETDRS skali. Pored toga, može se reći da do lečenja vaskularne bolesti i/ili edema makule dolazi kada ispitanik ispoljava najmanje 10% povećanja, ili izostanak 10% smanjenja brzine čitanja (reči u minutu). Pored toga, može se reći da do lečenja vaskularne bolesti i/ili edema makule dolazi kada ispitanik ispoljava najmanje 20% povećanja, ili izostanak 20% smanjenja udela ispravno identifikovanih ploča na Išiharinom testu ili ispravno sekvencioniranih diskova na Farnsvortovom testu. Dalje, može se reći da do lečenja vaskularne bolesti i/ili edema makule dolazi ako ispitanik ima, na primer, najmanje 10% smanjenja, ili izostanak 10% ili više povećanja vremena do prethodno utvrđenog stepena prilagođavanja na mrak. Pored toga, može se reći da do lečenja vaskularne bolesti i/ili edema makule dolazi kada ispitanik ispoljava, na primer, najmanje 10% smanjenja, ili izostanak 10% ili više povećanja ukupne oblasti vidnog skotoma izraženog kao ugao vida koji utvrđuje kvalifikovani zdravstveni stručnjak (tj. oftalmolog).

[0232] Nepoželjni aspekti anatomije mrežnjače koji mogu da se tretiraju ili spreče uključuju, na primer, mikroaneurizmu, edem makule, meke eksudate mrežnjače, intraretinalnu mikrovaskularnu abnormalnost (IRMA), gubitak kapilara, adheziju leukocita, ishemiju mrežnjače, neovaskularizaciju optičkog diska, neovaskularizaciju zadnjeg pola, neovaskularizaciju irisa, intraretinalno krvarenje, krvarenje u staklastom telu, makularni ožiljak, subretinalnu fibrozu i fibrozu mrežnjače, dilataciju vena, tortuoznost krvnih sudova, vaskularno curenje. Tako, lečenje, na primer, edema makule može da se utvrdi putem smanjenja od 20% ili većeg smanjenja debljine centralnog subpolja mrežnjače, izmereno optičkom koherentnom tomografijom.

[0233] Primeri sredstava za ispitivanje anatomije rožnjače uključuju funduskopiju, fotografisanje očnog dna, fluoresceinsku angiografiju, indocijanin zelenu angiografiju, optičku koherentnu tomografiju (OCT), optičku koherentnu tomografiju spektralnog domena, oftalmoskopiju skenirajućim laserom, konfokalnu mikroskopiju, adaptivnu optiku, autofluorescenciju očnog dna, biopsiju, nekropsiju i imunohistohemiju. Tako, može se reći da se vaskularna bolest i/ili edem makule leče kod ispitanika nakon 10% smanjenja u oblasti curenja, utvrđeno pomoću fluoresceinske angiografije.

[0234] Na ispitanicima koji će se lečiti terapeutskim agensima iz predmetnog pronalaska takođe mogu da se primene drugi terapeutski agensi poznatim postupcima za lečenje stanja povezanih sa dijabetesom melitusom, kao što su svi oblici insulina i antihipertenzivni lekovi.

[0235] Lečenje i/ili prevenciju očne bolesti, kao što je starosna degeneracija makule (AMD), okluzija vene mrežnjače (RVO), angioedem, multifokalni horoiditis, miopična horoidna neovaskularizacija i/ili retinopatija nedonoščadi, može da odredi oftalmolog ili zdravstveni stručnjak koristeći klinički relevantna merenja funkcije vida i/ili anatomije mrežnjače pomoću bilo kojeg od prethodno opisanih merenja. Iako se ovde opisana merenja ne primenjuju na svaku ovde datu bolest oka, stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati klinički relevantno merenje funkcije vida i/ili anatomije mrežnjače koje može da se koristi za datu bolest oka.

[0236] Kada se terapeutski agensi iz predmetnog pronalaska primenjuju zajedno sa drugim agensom, oni mogu da se primenjuju redom po bilo kom redosledu ili istovremeno. U nekim

4

aspektima, antitelo iz predmetnog pronalaska se primenjuje na ispitaniku koji takođe dobija terapiju drugim agensom (npr. Lucentis®). U drugim aspektima, vezujući molekul se primenjuje zajedno sa hirurškim tretmanima.

[0237] Odgovarajući agensi za kombinovano lečenje sa Epo vezujućim antitelima uključuju agense poznate u struci koji mogu da modulišu aktivnost VEGF, VEGF receptore, druge receptore inhibitora tirozin kinaze, ili druge entitete koji modulišu HIF-1 posredovane puteve. Drugi agensi za koje je objavljeno da inhibiraju te puteve uključuju ranibizumab, bevicizumab, pegaptanib, aflibercept, pazopanib, sorafinib, sunitinib i rapamicin. Kombinovana lečenja antiinflamatornim agensima kao što su kortikosteroidi, NSAIL i inhibitori TNF-α takođe mogu biti korisna u lečenju vaskularne bolesti mrežnjače i edema makule, na primer, dijabetičke retinopatije i DME.

[0238] Režim kombinovane terapije može biti aditivan, ili može da proizvodi sinergijske rezultate (npr. smanjenje težine retinopatije veće od očekivanog za kombinovanu upotrebu dva agensa). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje kombinovanu terapiju za prevenciju i/ili lečenje vaskularne bolesti mrežnjače i edema makule, specifično, dijabetičke retinopatije, uključujući DME i/ili PDR kako je prethodno opisano sa Epo vezujućim antitelom iz pronalaska i antiangiogenim agensom, kao što je anti-VEGF agens.

Farmaceutske kompozicije

[0239] Pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže Epo vezujuća antitela (netaknuta ili vezujući fragmenti) iz pronalaska formulisana zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Kompozicije mogu dodatno da sadrže jedan ili više terapeutskih agenasa koji su pogodni za lečenje ili prevenciju, na primer, dijabetičke retinopatije. Farmaceutski prihvatljivi nosači pojačavaju ili stabilizuju kompoziciju, ili mogu da se koriste za olakšavanje pripreme kompozicije. Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, koji su fiziološki kompatibilni.

[0240] Farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može se primeniti brojnim različitim postupcima poznatim u struci. Put i/ili način primene variraju u zavisnosti od željenih rezultata. Poželjno je da primena bude intravitrealna, intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili supkutana, ili primena blizu mesta cilja. Farmaceutski prihvatljivi nosači treba da budu pogodni za intravitrealnu, intravensku, intramuskularnu, supkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. putem injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, bispecifični i multispecifični molekul, može biti obloženo materijalom radi zaštite jedinjenja od dejstva kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da dovedu do inaktivacije jedinjenja.

[0241] Kompozicija treba da bude sterilna i tečna. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, putem premaza poput lecitina, putem održavanja potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i putem korišćenja surfaktanata. U mnogim slučajevima, poželjno je da se u kompoziciju uključe izotonični agensi, na primer, šećeri, polialkoholi poput manitola ili sorbitola, i natrijum hlorid. Dugoročna apsorpcija injektabilnih kompozicija se može ostvariti putem uključivanja u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata ili želatina.

[0242] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu da se pripreme u skladu sa postupcima koji su dobro poznati i rutinski se koriste u struci. Vidite, npr, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20. izd. 2000; and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, izd., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Farmaceutske kompozicije se poželjno proizvode u uslovima prema DPP. Uobičajeno, terapeutski delotvorna ili efikasna doza Epo vezujućeg antitela koristi se u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska. Epo vezujuća antitela su formulisana u farmaceutski prihvatljivim doznim oblicima putem konvencionalnih postupaka koji su poznati stručnjacima za datu oblast. Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, može biti primenjen pojedinačni bolus, nekoliko podeljenih doza može biti primenjeno u određenom vremenskom periodu ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno potrebama terapeutske situacije. Posebno je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u pojedinačnom doznom obliku radi lakše primene i uniformnosti doze. Pojedinačni dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice prilagođene kao jedinične doze za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem.

[0243] Stvarni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama iz predmetnog pronalaska mogu da variraju kako bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je delotvorna za postizanje željenog terapeutskog odgovora za konkretnog pacijenta, kompoziciju i način primene, pri čemu nije toksična za pacijenta. Izabrani dozni nivo zavisi od niza farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretnih kompozicija iz predmetnog pronalaska koje se koriste ili njihovih estara, soli ili amida, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja konkretnog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne zdravstvene istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora.

[0244] Lekar ili veterinar može započeti sa dozama antitela iz pronalaska koje se koristi u farmaceutskoj kompoziciji pri nivoima koji su niži od potrebnih za postizanje željenog terapeutskog dejstva, i postepeno povećavati dozu do postizanja željenog dejstva. Uopšteno, delotvorne doze kompozicije predmetnog pronalaska za lečenje ovde opisane vaskularne bolesti mrežnjače variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge lekove koji se primenjuju, i da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Doze za lečenje treba titrisati kako bi se optimizovala bezbednost i efikasnost. Za sistemsku primenu sa antitelom, doza je u opsegu od oko 0,0001 do 100 mg/kg, a češće 0,01 do 15 mg/kg telesne težine domaćina. Za intravitrealnu primenu sa antitelom, doza može biti u opsegu od 0,1 mg/oku do 10 mg/oku. Preciznije, doza može biti u opsegu od 1 mg/oku do 9 mg/oku, 2 mg/oku do 8 mg/oku, 3 mg/oku do 7 mg/oku, 4 mg/oku do 6 mg/oku ili 4,5 mg/oku do 5,5 mg/oku. U određenim slučajevima, doza može biti 0,1 mg/oku, 0,2 mg/oku, 0,3 mg/oku, 0,4 mg/oku, 0,5 mg/oku, 0,6 mg/oku, 0,7 mg/oku, 0,8 mg/oku, 0,9 mg/oku, 1 mg/oku, 2 mg/oku, 3 mg/oku, 4 mg/oku, 5 mg/oku, 6 mg/oku, 7 mg/oku, 8 mg/oku, 9 mg/oku ili 10 mg/oku. Primer režima lečenja obuhvata sistemsku primenu jednom na svake dve nedelje, ili jednom mesečno, ili jednom na svakih 3 do 6 meseci. Primer režima lečenja obuhvata sistemsku primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na svakih 3 do 6 meseci, ili po potrebi (PRN).

[0245] Antitela se obično primenjuju u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti nedeljni, mesečni ili godišnji. Intervali takođe mogu biti neredovni, kako je indikovano merenjem nivoa Epo vezujućeg antitela u krvi pacijenta. Pored toga, lekar može da odredi alternativne intervale doziranja i da ih primenjuje mesečno ili po potrebi kako bi bili efikasni. Delotvornost se zasniva na rastu lezija, brzini ublažavanja lekom Lucentis®, debljini mrežnjače određene putem optičke koherentne tomografije (OCT), i oštrine vida. U nekim postupcima sistemske primene, doza je prilagođena radi postizanja koncentracije antitela u plazmi od 1-1000 µg/ml, a u nekim postupcima 25-500 µg/ml. Alternativno, antitelo se može primenjivati kao formulacija sa produženim otpuštanjem, i u tom slučaju je potrebna ređa primena. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Generalno, humanizovana antitela pokazuju duži poluživot nego himerna antitela i nehumana antitela. Doza i učestalost primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. Kod profilaktičkih primena, relativno mala doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dužeg vremenskog perioda. Neki pacijenti nastave sa primanjem lečenja do kraja života. Kod terapeutskih primena, relativno velika doza u relativno kratkim intervalima je ponekad potrebna dok se progresija bolesti ne umanji ili ne završi, i poželjno dok pacijent ne ispolji delimično ili kompletno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu može biti davan profilaktički režim.

Primeri

[0246] Sledeći primeri su dati radi daljeg ilustrovanja pronalaska, ali oni ne ograničavaju njegov opseg.

Primer 1: Stvaranje afinitetno sazrelih Epo antitela

[0247] Potpuno humana biblioteka displeja faga je korišćena za stvaranje ovde opisanih Epo vezujućih antitela.

[0248] Biotinilovani i nebiotinilovani Epo čoveka i cinomolgusa korišćeni su u panovanju rastvora i čvrste faze. Obavljena su standardna panovanja kao i RapMAT pristupi (Prassler et al., (2009) Immunotherapy 1(4):571-583). Nakon sekundarnog skrininga i RapMAT panovanja, izabrani su klonovi za anlizu sekvence, i skup od 8 antitela je odabran za konverziju u format FabCys, germinizaciju, optimizaciju pI i uklanjanje mesta deamidacije. Stvaranje FabCys je ostvareno pomoću sopstvenog postupka RapCLONE®. RapCLONE<®>je obavljen kao postupak u dva koraka za laku i efikasnu konverziju velike količine Fab klonova u format IgG i FabCys. U prvom koraku kloniranja, eukariotska ekspresiona kaseta je uvedena u ekspresione vektore pMORPH<®>x11 (za HuCAL PLATINUM<®>) putem BsiWI/MfeI (za objedinjeni κ) ili HpaI/MfeI (za objedinjeni λ) digestije i zatim ligacije. To je praćeno drugim korakom kloniranja u kome su Fab grupe koje sadrže ekspresione kasete digestovane koristeći EcoRV/BlpI (objedinjeni κ i λ) i zatim klonirane u pMorph<®>4_IgG1f ili pMorph<®>4_h_FabCys akceptorski vektor za ekspresiju u ćelijama sisara. Za ovaj projekat, RapCLONE® je primenjen samo na jedinstvenom, sekvenciranom i okarakterisanom Fab. Stoga su svi klonovi izolovani nakon RapCLONE®.

[0249] Nizak pI (<8,2) se uopšteno povezuje sa lošim biofizičkim svojstvima, uključujući stabilnost i agregaciju. Izabrano je 8 finalnih kandidata (HCDR3 jedinstveni klonovi) za germinizaciju, optimizaciju pI i uklanjanje mesta deamidacije, što dovodi do ukupno 12 germinizovanih varijanti. Sintetisano je 12 VL-gena (dva za 11317, 11324, 11331 i 11345) i jedan VH (11324). Moguće zbog ranog uklanjanja kandidata sa PTM, samo 11317 (VL), 11332 (VL) i 11380 (VH) sadržali su mesta deamidacije koja su uklonjenja germinizacijom. Germinizacija se obično vrši na najbližoj germinativnoj liniji. Da bi se povećao pI, lambda germinativna linija 3h je izabrana za 6 kandidata umesto najbliže germinativne linije 3r, ili pored nje. Pored toga, konstruisane su varijante lambda 3j za tri kandidata kako bi se minimizovao rizik (11317, 11331 i 11345).

NA, nije primenljivo

* Sve PTM modifikacije su se javile u VL, **pI modifikacije su se javile u VH

[0250] Kao što je prethodno navedeno, pI proteina je ključna determinanta ukupnih biofizičkih svojstava molekula. Anti-Epo Fab identifikovani iz biblioteke displeja faga imali su pI vrednosti niže od 8,2. Da bi se poboljšala proizvodna svojstva, antitela su posebno konstruisana radi povećanja njihovog pI i poboljšanja njihovih lekovitih svojstava. Povećanjem pI anti-Epo Fab poboljšava se njihova rastvorljivost, što omogućava da se Fab formulišu u većim koncentracijama (>100 mg/ml). Formulacija Fab u visokim koncentracijama (npr. >100 mg/ml) pruža prednost mogućnosti primene većih doza Fab u oči pacijenata putem intravitrealnih injekcija, što zauzvrat može da omogući smanjenu učestalost doziranja, što je značajna prednost u lečenju hroničnih bolesti oka, uključujući, bez ograničenja, vlažnu AMD i dijabetičku retinopatiju.

[0251] Dobijeni Fab su prikazani u Tabeli 1 (NVS1, NVS2, NVS3 i NVS4).

Primer 2: Karakterizacija optimizovanih antitela

[0252] Sledeći primer opisuje postupke koji mogu da se koriste za merenje afiniteta antitela. Ovi i drugi postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u struci.

Utvrđivanje afiniteta

[0253] Afinitet antitela prema Epo meren je površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) upotrebom Biacore® T200 (Biacore) i ravnotežnom titracijom rastvora (SET). Objašnjenja svake tehnologije i odgovarajući srednji rezultati za vezivanje Epo opisani su u nastavku. Pretpostavke za model uzimaju u obzir koncentracije Epo u sistemu, kinetiku biosinteze i poluživot Epo, kao i željeni raspored doziranja, i ukazuju na to da je Fab sa afinitetom manjim od 50 pM prema Epo dovoljan za smanjenje nivoa slobodnog Epo.

Određivanje pomoću softvera Biacore

[0254] Kinetika interakcije, tj. brzine formiranja kompleksa (ka) i disocijacije (kd), može se utvrditi na osnovu podataka u senzorgramu. Ako dolazi do vezivanja kada uzorak prelazi preko pripremljene površine senzora, odgovor u senzorgramu se povećava. Ako je postignuta ravnoteža, videće se konstantni signal. Zamena uzorka puferom dovodi do disocijacije vezanih molekula, i odgovor se smanjuje. Softver za procenu Biacore generiše vrednosti kai kdubacivanjem podataka u modele interakcije.

[0255] Tri protočne ćelije su korišćene za postupak. Protočna ćelija 1 (fc1) poslužila je kao referenca, gde nije zarobljen nijedan Epo Fab, za procenu nespecifičnog vezivanja Epo za površinu čipa obloženu antitelima. Koraci hvatanja i vezivanja su obavljeni na protočnim ćelijama 2-4.

[0256] Korak hvatanja: Da bi se postigao Rmax od 20, nivo hvatanja anti-hu Fab na fc2-4 bio je približno 50 RL. Anti-hu Fab u koncentraciji od 1 ug/ul, tekao je preko Fc2-4 protokom od 10 µl/min.

[0257] Kalkulacija relativnog Rmax je sledeća:

Fab: Rmax= RL*(Mmanalit/ Mmligand)*stehiometrija 20=RL*(21,4/50)*1 = 50 RL

[0258] Analit je počeo u koncentracijama od 20 nM i uključivao je 8 razblaženja 1:2 sa duplikatom na 2,5 nM za dugačku i kratku disocijaciju. Analit je pušten sa protokom od 60 µl/min tokom 240 sekundi. Vreme disocijacije je postavljeno na 4000 sekundi i 600 sekundi. Vreme disocijacije je podešeno na 4000 sekundi za koncentracije analita od 10 nM, 2,5 nM i 0,3125 nM, za NVS2 i NVS4. Nakon ubrizgavanja uzorka, usledio je korak ispiranja puferom za regeneraciju.

[0259] Regeneracija je izvedena na kraju svakog ciklusa na svim protočnim ćelijama. Uslov regeneracije za ovaj postupak je bio 1% fosforna kiselina sa 10% natrijum hidroksida na 60 ml/min tokom 100 sekundi.

[0260] Svi ostali uslovi rada sprovedeni su na 25°C u 1x HBS-EP+ puferu (Biacore kat. br. BR-1006-69). Dobijeni signali su prilagođeni dvostrukim referenciranjem, čime se oduzimaju vrednosti indeksa prelamanja od referentne protočne ćelije i koraka vezivanja bez analita. Podaci su prikupljeni na 10 Hz i analizirani koristeći Biacore® T100 softver za procenu Verzija 1.1 (GE Healthcare). Ovaj program koristi postupak globalne analize uklapanja uz utvrđivanje brzine i konstanti afiniteta za svaku interakciju.

1

[0261] Rezultati utvrđivanja kinetike vezivanja putem Biacore prikazani su u Tabeli 2. Kao što je prikazano, ovde opisana antitela pokazuju vezivanje sa velikim afinitetom za humani Epo, uz vrednosti KDobično manje ili jednake 40 pM.

Tabela 2: Afinitetno vezivanje Epo antitela (Biacore)

ND: nije određeno

*Podaci prikazani za NVS1 su jedan set podataka

SET utvrđivanje

[0262] Za razliku od kinetičkih testova koji koriste površine senzora, poput SPR, SET je postupak koji utvrđuje afinitete u rastvoru. To je ravnotežno merenje koje ne daje kinetičke podatke.

[0263] U SET, konstantna količina antitela se inkubira sa različitim koncentracijama antigena dok se ne postigne ravnoteža. Koncentracija slobodnog antitela u uravnoteženom rastvoru utvrđuje se nanošenjem rastvora na antigenom premazanu MSD™ ploču (Meso Scale Discovery™), nakon čega sledi inkubacija sa ECL-obeleženim sekundarnim antitelom i merenje jačine signala. Pri niskim koncentracijama antigena postiže se jak signal (velika koncentracija slobodnog antitela koje se vezuje za antigen na ploči), dok je pri velikim koncentracijama antigena antitelo u potpunosti uhvaćeno antigenom, što dovodi do niskog signala. Ako je dostupan dovoljan broj koncentracija antigena u odgovarajućem opsegu, kriva titracije omogućava razumno utvrđivanje afiniteta, koristeći odgovarajući model uklapanja.

2

Za potpunu titraciju, moraju da se primene koncentracije antigena najmanje 10 puta veće od predviđenih KD. Konstantna koncentracija antitela koja se primenjuje u testu treba da bude u opsegu KD(Tabela 3), ili manja.

[0264] Za utvrđivanje KDpomoću SET, korišćene su monomerne frakcije proteina antitela (sadržaj monomera najmanje 90%, analizirano pomoću analitičke SEC; Superdex75 (Amersham Pharmacia) za Fab, odnosno Tosoh G3000SWXL (TOSOH BIOSCIENCE) za IgG).

[0265] Određivanje afiniteta u rastvoru je suštinski obavljano kao što je opisano u literaturi (Friguet et al. 305-19). Kako bi se poboljšala osetljivost i preciznost postupka SET, prebačen je sa klasičnog ELISA testa na tehnologiju zasnovanu na ECL (Haenel et al., 2005).

[0266] Epo antitela su razblažena do fiksne koncentracije u inkubacionom puferu (PBS sa 2% BSA (Sigma kat. br. A4503) i 1% Tween20 i 1% Triton-X (Sigma kat. br. 234729)), i dodata serijskom razblaženju (1:5) Epo u inkubacionom puferu.

Finalna najviša koncentracija Epo:

[0267]

Čovek, Hu-darbapoetin, cinomolgus, miš, pacov = 10 nM

Zec = 100 nM

Finalne koncentracije Fab:

[0268]

NVS2: 2 pM, osim zečje = 30 pM

NVS3: 2 pM, osim zečje = 5 pM

NVS4: 2 pM, osim zečje = 10 nM

NVS1: 2pM

[0269] Uzorci su ostavljeni da dostignu ravnotežu inkubacijom na RT preko noći.

[0270] Standardne MSD ploče premazane streptavidinom (Meso-Scale Discovery, 384 bunarčića: MSD kat. br. L11SA) blokirane su sa 25 µl inkubacionog pufera na RT tokom 1 h. Ploče su isprane 3x u TBST puferu (25 mM TBS sa 0,05% Tween20), i 0,1 µg/ml biotinilovanog Epo je dodato u 25 µl inkubacionog pufera i inkubirano na RT tokom 1 h. Ploče su isprane 3x u TBST puferu. Uzorci koji sadrže Fab i titraciju Epo dodati su ploči (25 µl) i inkubirani na RT tokom 15 minuta. Ploče su isprane 3x u TBST puferu. Dodato je 25 μl antitela za detekciju (antihumano (kozje) Sulfo-TAG, 1:1000 u inkubacionom puferu, MSD kat. br. R32AJ-1), i inkubirano na RT tokom 60 minuta. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje i dodato je 50 µl 1x MSD pufera za očitavanje T (sa surfaktantom, MSD kat. br. R92TC-1). Ploče su očitane na MSD Spector Imager 6000.

[0271] Tri eksperimenta su izvedena u odvojenim danima, svaka tačka u triplikatu.

[0272] Podaci su analizirani koristeći softver GraphPad Prism v4, sa pozadinom (prosek bunarčića koji ne sadrže Fab) oduzetom od svake vrednosti. Vrednosti X ose (koncentracija Epo u rastvoru) transformisane su u log10x.

[0273] KD vrednosti (KD) prilagođene su iz sledećeg modela:

Y=(Vrh-((Vrh/(2×Fab))×((((10^x)+Fab)+KD)-((((((10^x)+Fab)+KD)×(((10^x)+Fab)+KD)) -((4×(10^x))×Fab))^0,5))))

Vrh = signal pri koncentraciji antigena = 0

x = koncentracija Epo u rastvoru

Fab = ograničenje za koncentraciju Fab postavljeno je na 1 pM

4

[0274] Afiniteti Epo Fab određeni su pomoću SET testa, i dobijene vrednosti KD([pM] koncentracije) sažete su u Tabeli 3. NVS2 vezuje humani, humani-darbepoetin i cinomolgusov Epo sa KDmanjim od 10 pM. NVS2 takođe vezuje Epo miša sa KDmanjim od 50 pM i Epo pacova sa KDmanjim od 20 pM. NVS3 vezuje humani, humani-darbepoetin, cinomolgusov, mišji i pacovski Epo sa KDmanjim od 5 pM. NVS4 vezuje humani, humanidarbepoetin, cinomolgusov, mišji i pacovski Epo sa KDmanjim od 10 pM.

Tabela 3: Afinitetno vezivanje Epo antitela (SET)

ND: nije određeno

*Podaci prikazani za NVS1 su jedan set podataka

Primer 3: Inhibicija Epo indukovane proliferacije ćelija

[0275] Ćelije koje zavise od eritropoetina za rast i preživljavanje mogu da se koriste za merenje potentnosti anti-Epo terapeutskih agenasa pomoću Epo zavisne inhibicije proliferacije (Chiba et al., 1991).

Primer 3a: Test proliferacije Ba/F3-EpoR ćelija

[0276] Ovaj test pokazuje sposobnost Epo antitela da inhibiraju Epo indukovanu proliferaciju ćelija u mišjim Ba/F3 ćelijama koje eksprimiraju Epo receptor (Ba/F3-EpoR ćelije). Ba/F3 ćelije zavise od IL-3 za rast i preživljavanje, i pokazalo se da rastu na način nezavisan od IL-3 nakon transformacije sa različitim onkogenim tirozin kinazama. Nakon stabilne transfekcije sa EpoR, Ba/F3-EpoR ćelije su postale nezavisne od IL-3. Ekspresioni plazmid sisara pcDNA3.1 koji nosi humani EpoR transficiran je u Ba/F3 ćelije koristeći Amaxa sistem nukleofekcije (kataloški broj VCA-1003, Amaxa GmbH) prema uputstvu proizvođača koristeći uređaj Nucleofector (Amaxa, Nucleofactor™ II).

Materijali

[0277]

Materijali Opis Izvor Kataloški br.

Ploča sa 384 Matrix mikroploča sa 384 ThermoScientific 50823639

bunarčića bunarčića

Ploča sa 384 Crna uClear ploča, 384 Greiner Bio-One 7881091

bunarčića bunarčića TC sa

poklopcem

RPMI 1640 Invitrogen 11875

FBS Hyclone SH30071.03

Pen/Strep Invitrogen 15140

Higromicin B Invitrogen 10687010

Epo Genway 10-663-45072

Darbepoetin Sandoz CAS br:

209810-58-2

Ba/F3-EpoR Opisano ovde

ćelije

Cell Titer Blue Promega G8081

Održavanje ćelija

[0278] Medijum za rast: RPMI 1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100 µg/ml higromicina B/1U/ml Epo

Test medijum: RPMI 1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100 µg/ml higromicina B

[0279] Ba/F3-EpoR ćelije su održavane u medijumu za rast (RPMI 1640/10%FBS/1%Pen-Strep/100 µg/ml higromicina B/1U/ml Epo). Ćelije su podeljene na ~1e6 ćelija/ml (na svaka 3-4 dana) sve do 0,4-0,6e5 ćelija/ml.

Test Epo indukovane proliferacije ćelija

[0280]

1. Dan pre eksperimenta, Ba/F3-EpoR ćelije su pripremljene centrifugiranjem radi uklanjanja medijuma za rast, nakon čega su ćelije ponovo suspendovane u test medijumu (RPMI 1640/10% FBS/1% Pen-Strep/100 µg/ml higromicina B) koji ne sadrži Epo.

2. Na dan eksperimenta, ćelije su 2-3 puta isprane u test medijumu (centrifuga 1000 o/min, 5 min) i ponovo suspendovane u test medijumu na 1,25x 10<5>ćelija/ml.

3. 2500 ćelija je dodato u svaki test bunarčić na crnoj ploči sa 384 bunarčića (providno dno, TC tretirana).

4. Epo je serijski razblažen test medijumom na mikroploči sa 384 bunarčića, tako da je finalna koncentracija Epo bila dvostruko veća od željene finalne koncentracije.

5. 20 μl serijski razblaženog Epo (u triplikatu) dodato je u triplikatu bunarčićima sa uzorkom crne ploče sa 384 bunarčića koji sadrže Ba/F3-EpoR ćelije.

6. Ploča je okretana u centrifugi na 1000 o/min tokom 30-60 sekundi i inkubirana tokom 48 h na 37°C, 5% CO2.

7. Četiri sata pre kraja, u sve bunarčiće je dodato 8 µl Cell Titer Blue, i ponovo inkubirano na 37°C, 5% CO2.

8. Četiri sata kasnije, ploča je očitana na Beckman Coulter Paradigm sa Paradigm Multimode SW ili sličnim skenerom.

9. Epo je stimulisao proliferaciju Ba/F3-EpoR ćelija 4 puta više od početne vrednosti. Epo je stimulisao Ba/F3-EpoR sa prosečnim EC50od 11,2 pM i rasponom od 10 pM i 26 pM.

10. Anti-Epo antitela su serijski razblažena u triplikatu na mikroploči sa 384 bunarčića sa 4 ng/ml Epo u test medijumu, i inkubirana tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.

11. 20 μl/bunarčiću prethodne smeše Epo/anti-Epo antitelo dodato je ploči sa crnim zidovima sa 384 bunarčića koja je prethodno zasejana sa 2500 BaF3/EpoR ćelija po bunarčiću.

12. Nakon inkubacije, ploče su obrađene kako je prethodno prikazano u koracima 7-9

Rezultati

[0281] Epo antitela su inhibirala proliferaciju Ba/F3-EpoR ćelija u prisustvu 1 ng/ml Epo nakon 48 h. Antitela su inhibirala proliferaciju Ba/F3-EpoR ćelija sa IC50manjim ili jednakim 350 pM.

Tabela 4:

Primer 3b: Test proliferacije F36E ćelija

[0282] F36E ćelije su u velikoj meri zavisne od Epo za proliferaciju. Stimulisanje sa Epo koristeći prethodno opisane postupke obično dovodi do više od 6 puta većeg signala od početnog. EC50 ove krive je 7 pM.

Protokol za neutralizaciju testa Epo indukovane proliferacije F36E ćelija

[0283] Test proliferacije pomoću F36E ćelijske linije, Epo zavisne limfocitu slične imortalizovane ćelijske linije dobijene od matične ćelijske linije koštane srži korišćen je za skrining anti-Epo terapeutskih antitela i odabir kandidata za razvoj.

Materijali

[0284]

Održavanje ćelija

[0285] Darbepoetin, rekombinantni hiperglikozilovani humani Epo, korišćen je za testove ćelijskog održavanja i proliferacije koji su ovde opisani. Darbepoetin stimuliše proliferaciju u F36E ćelijama sa uporedivim EC50 sa rekombinantnim humanim Epo (63,2 pg/ml darbepoetina i 81,25 pg/ml eritropoetina; vidite LU-15432, str.44). F36E ćelije su održavane u medijumu za rast (RPMI 1640/5% FBS/1% Pen-Strep/5,2U/ml dEpo) sa minimalnom gustinom od 0,25e6 ćelija po ml do maksimalne gustine od 1,0e6 ćelija po ml do 10 presejavanja.

Protokol testa Epo indukovane proliferacije

[0286]

1. Epo je razblažen u test medijumu (RPMI 1640/5% FBS/1% Pen-Strep) do 4 ng/ml, 4-struke željene finalne koncentracije.

2. Anti-Epo antitelo je razblaženo u test medijumu do 200 nM, 4x finalna koncentracija, i ta koncentracija je serijski razblažena u test medijumu za šest tačaka. Razblaženje je ponovljeno za pozitivno referentno antitelo (npr: Epo26) i negativno referentno antitelo (npr: monoklonsko antitelo protiv kokošjeg lizozima).

3. Serijska razblaženja 7,5 ul razblaženog dEpo i 7,5 ul anti-Epo antitela su pomešana na polipropilenskoj ploči sa 384 bunarčića, u triplikatu, i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta.

4. F36E ćelije (2e6 po ploči sa 384 bunarčića) su peletirane, medijum za rast je aspiriran, i ćelije su jednom isprane u test medijumu (centrifuga 1200 o/min, 5 min), zatim ponovo suspendovane u test medijumu do 3,33e5 ćelija/ml.

5. U sve bunarčiće polistirenske ploče za uzgajanje ćelija sa 384 bunarčića dodato je 15 µl ćelija/bunarčiću (5000 ćelija/bunarčiću).

6. 15 ul smeše antitelo-Epo je dodato ćelijama.

1

7. Inkubirano 68 h na 37°C, 5% CO2.

8. Dodato je 8 µl Cell Titer Blue po bunarčiću i inkubirano na 37°C, 5% CO2 tokom 4 sata.

9. Fluorescencija je izmerena na 560(20)Ex/590(10)Em na Fluoroskan Ascent fluorometru mikroploča ili sličnom skeneru.

10. Prikazana je prosečna RFU /- standardna devijacija u odnosu na nM antitelo, i IC50 je utvrđen pomoću nelinearne regresione krive unete u Graph Pad Prizm softver.

Rezultati

[0287] Anti-Epo antitela su inhibirala proliferaciju F36E ćelija sa IC50manjim ili jednakim 200 pM.

Tabela 5:

Primer 4: Vezivanje epitopa

Studije sintetičkog peptida i peptidnog skraćivanja

[0288] Sintetički peptidi koji odgovaraju strukturnim domenima humanog Epo (hEpo), skraćivanjima domena hEpo ili himernim molekulima koji sadrže delove hEpo i humani trombopoetin (TPO) sintetisani su ili rekombinantno eksprimirani. Pozitivno vezivanje za sintetičke peptide pokazuje da su ostaci sadržani u tom domenu Epo uključeni u vezivanje za anti-Epo antitelo. Kod skraćenih proteina, gubitak vezivanja ukazuje na učešće skraćenog

1 1

dela u vezivanju za anti-Epo antitelo. Međutim, gubitak vezivanja ne isključuje mogućnost da je skraćivanje izmenilo strukturu preostalog proteina dovoljno značajno da utiče na vezivanje za anti-Epo antitela. Humane Epo-humane TPO himere omogućavaju održanje strukture, pri čemu i dalje omogućavaju mapiranje epitopa. Gubitak vezivanja za varijantu koja sadrži deo hTPO ukazuje da je homologi region hEpo značajan za vezivanje za anti-Epo antitelo.

Mapiranje epitopa peptida antieritropoetinskih antitela

[0289] Sintetisano je sledećih šest peptida (Tabela 6), koji odgovaraju spiralama eritropoetina.

Tabela 6:

1 2

Postavka testa

[0290]

1. 25 ul peptida u PBS-u (5 ug/ml) naneto je na MSD standardnu ploču sa 384 bunarčića (Mesoscale Discovery, kat. br. L21XA-4) preko noći.

2. Ploča je blokirana sa 90 ul PBS+5%BSA/0,1%Tween-20/0,1% TritonX-100 tokom 4 sata.

3. 500 nM Morphosys Epo Fab u razblaženjima PBS+2%BSA/0,1%Tween-20/0,1% TritonX-100 dodato je na ploču i inkubirano tokom 1 sata.

4. Ploča je isprana i inkubirana sa Sulfo-tag antihumanim IgG (Meso Scale Discovery, kat. br. R32AJ-1) radi Epo Fab ili vrsta odgovarajućih za referentne proteine/antitela (1 h)

5. Ploča je isprana i MSD rastvor za čitanje (Meso Scale Discovery, kat. R92TC-1) je dodat.

6. Očitavanje ploče

Mapiranje epitopa antieritropoetinskih antitela sa skraćenim varijantama eritropoetina

[0291]

Epo varijanta 1: Spirala A

Epo varijanta 2: Spirala A, petlja A-B

Epo varijanta 3: Spirala A, petlja A-B, spirala B

Epo varijanta 4: Spirala A, petlja A-B, spirala B, petlja B-C, spirala C

1

Epo varijanta 5: Eritropoetin kompletne dužine

Postavka testa

[0292]

1. Ploča je premazana biotinilovanim HEK293 eksprimiranim varijantama Epo na standardnoj streptavidinskoj ploči sa 384 bunarčića (Mesoscale Discovery, kat. br. L21SA-1) preko noći na 4°C.

2. Ploča je blokirana sa 90 ul PBS+5%BSA/0,1%Tween-20/0,1% TritonX-100 tokom 4 sata.

3. Mesto je isprano i 500 nM Morphosys Epo Fab je dodato ploči i inkubirano tokom 1 sata

4. Ploča je isprana i inkubirana sa Sulfo-tag antihumanim IgG (Meso Scale Discovery, kat. br. R32AJ-1) radi Epo Fab ili vrsta odgovarajućih za referentne proteine/antitela (1 h)

5. Ploča je isprana i MSD rastvor za čitanje (Meso Scale Discovery, kat. R92TC-1) je dodat.

6. Očitavanje ploče

Mapiranje epitopa antieritropoetinskih antitela sa Epo/trombopoetinskim (Tpo) i zečjim/humanim Epo himerama

Epo/Tpo himere

[0293]

Epo/Tpo varijanta 1: Humani Epo sa Tpo spiralom A

Epo/Tpo varijanta 2: Humani Epo sa Tpo petljom A-B

Epo/Tpo varijanta 3: Humani Epo sa Tpo spiralom B

1 4

Epo/Tpo varijanta 4: Humani Epo sa Tpo spiralom C

Epo/Tpo varijanta 5: Humani Epo sa Tpo spiralom D

Zečje/humane Epo himere

[0294]

Rb/Hu Epo varijanta 1: Zečji Epo sa humanom spiralom A

Rb/Hu Epo varijanta 2: Zečji Epo sa humanom petljom A-B

Rb/Hu Epo varijanta 3: Zečji Epo sa humanom spiralom B

Rb/Hu Epo varijanta 4: Zečji Epo sa humanom petljom B-C i spiralom C

Rb/Hu Epo varijanta 5: Zečji Epo sa humanom petljom C-D

Rb/Hu Epo varijanta 6: Zečji Epo sa humanom spiralom D

Postavka testa

[0295]

1. 25 ul Epo himera u PBS-u (2 ug/ml) naneto je na MSD standardnu ploču sa 384 bunarčića (Mesoscale Discovery, kat. br. L21XA-4) preko noći na 4°C.

2. Ploča je blokirana sa 90 ul PBS+5%BSA/0,1%Tween-20/0,1% TritonX-100 tokom 4 sata.

3. 500 nM Morphosys Epo Fab u razblaženjima PBS+2%BSA/0,1%Tween-20/0,1% TritonX-100 dodato je na ploču i inkubirano tokom 1 sata.

1

4. Ploča je isprana i inkubirana sa Sulfo-tag antihumanim IgG (Meso Scale Discovery, kat. br. R32AJ-1) radi Epo Fab ili vrsta odgovarajućih za referentne proteine/antitela (1 h)

5. Ploča je isprana i MSD rastvor za čitanje (Meso Scale Discovery, kat. R92TC-1) je dodat.

6. Očitavanje ploče

Opšti protokol

[0296] Standardne MSD ploče za hvatanje sa 384 bunarčića (Meso Scale Discovery) premazane su peptidom (5 ug/ml u PBS-u, New England Peptide LLC) ili Epo himerama (2 ug/ml u PBS-u) i inkubirane preko noći na 4°C. Biotinilovane skraćene varijante Epo (2 ug/ml u PBS-u) premazane su na standardne streptavidinske MSD ploče za hvatanje sa 384 bunarčića preko noći. Nakon pranja ploča 1X sa TBST (Thermo Scientific, kat. br. kat. br.

28360), ploče su blokirane u razblaživaču (PBS, 5% BSA, 0,1% Tween-20, 0,1% TritonX-100) tokom 4 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane 3X u TBST-u. Petsto nanomolarnih ili antieritropoetinskih fab je dodato MSD pločama prethodno premazanim peptidom/Epo varijantama tokom 1 sata. Ploče su isprane 3X u TBST-u i anti-humani IgG-Sulfotag (1 ug/ml, Meso Scale Discovery, kat. br. R32AJ-1) je dodat i inkubiran tokom 60 minuta. Ploče su isprane 3X u TBST-u i 1X pufer za čitanje T (Meso Scale Discovery, kat. br. R92TC-1) je dodat. Ploče su očitane na MSD Spector Imager 6000, i podaci su analizirani pomoću softvera GraphPad Prism v4.

Rezultati:

[0297] Rezultati su pokazali da su se antitela minimalno vezivala za sledeće domene (Tabela 7). Nema antitela vezanih za spiralu C.

Tabela 7:

1

(++) Dominantni epitop; (+) uočeno vezivanje

Kristalna struktura antitela u kompleksu sa Epo

[0298] Glikozilovani, rekombinantni humani eritropoetin (Epo) dobijen je od LEK Pharmaceuticals, Inc.

[0299] Epo je deglikozilovan koristeći proteinsku smešu za deglikozilaciju (New England Biolabs, kat. br. P6039S). 30 mg hEpo je kombinovano sa 1 ml proteinske smeše za deglikozilaciju i inkubirano na 37°C tokom 1 sata, kada je deglikozilacija bila nedovršena, kako pokazuje SDS-PAGE. Dodatnih 0,5 ml proteinske smeše za deglikozilaciju je zatim dodato u Epo i inkubirano još 1 sat na 37°C. Analiza gela je pokazala skoro potpunu deglikozilaciju Epo. Ovaj protein je zatim dalje prečišćen koristeći kolonu 120 ml Superdex75 (GE Healthcare, kat. br.28-9893-33) ekvilibrisanu u 25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. Frakcije eluiranja koje sadrže najveći nivo deglikozilacije hEpo su objedinjene. Proteinski kompleksi su formirani kombinovanjem 5 mg deglikozilovanog Epo sa 7 mg NVS3, nakon čega sledi inkubacija na ledu tokom 1 sata. Smeša proteinskog kompleksa je zatim koncentrovana i naneta na 120 ml Superdex 75, ekvilibrisana u 25mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl. Frakcije koje sadrže SDS-gelom procenjene stehiometrijske odnose Epo:NVS3 su objedinjene i koncentrovane do 19 mg/ml (koncentracija procenjena pomoću LCUV) (PRONOVA br. 27SN). Ekrani za kristalizaciju su postavljeni koristeći ovaj koncentrovani kompleks Epo:NVS3. Kristali su uzgajani tehnikom difuzije pare sedeće kapi, gde kapi sadrže jednake zapremine proteina i rastvora iz rezervoara. Kristali su nastali na 4°C uz sledeće stanje rezervoara: 0,1 M Hepes pH 7,0, 12% PEG3350, 50 mM cink acetat dehidrat. Kristali su zamrznuti koristeći sledeći rastvor za krio zaštitu: : 0,1 M Hepes pH 7,0, 15% PEG3350, 50 mM cink acetat dehidrat, 22% glicerola.

[0300] Difrakcioni podaci kristalnog kompleksa Epo:NVS3 sakupljeni su na 17-ID snopu zraka na naprednom izvoru fotona (Argonne National Laboratory, SAD). Podaci su obrađeni

1

i skalirani na 2,6Å koristeći autoPROC (Global Phasing, LTD) u prostornoj grupi C2 sa dimenzijama ćelije a=125,57 Å, b=150,15 Å, c=163,84 Å, alfa=90°, beta=110,81°, gama=90°. Struktura Epo:NVS3 je razrešena molekulskom zamenom koristeći Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674). Fab iz 3H0T strukture u PDB bazi podataka (Berman 2000) podeljen je na varijabilne i konstantne domene i struktura humanog eritropoetina Syed et. al., Nature.1998 Oct 1;395(6701):511-6, PDB kod 1EER, korišćena je kao model za pretragu.

[0301] Finalni model, koji sadrži 3 molekula kompleksa Epo:NVS3 po asimetričnoj jedinici, izgrađen je u COOT (Emsley i Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) i prečišćen do R i Rslobodnovrednosti od 23,0%, odnosno 26,7%, sa rmsd od 0,010 Å i 1,34° za dužinu veze, odnosno uglove veze, koristeći PHENIX (Adams et al., Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)).

[0302] Kristalna struktura Epo:NVS3 je rastvorena i prečišćena do 2,6 Å. To je dalo asimetričnu jedinicu sastavljenu od tri proteinska kompleksa Epo:NVS2, od kojih je svaki sastavljen od jednog Fab vezanog za jedan Epo protein. Dva ova kompleksa grade cinkom posredovani dimer, a treći ispoljava više b-faktore i slabiju gustinu. Interakcije od Fab do Epo su posredovane petljama regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) iz teških i lakih lanaca NVS3. Konformacione promene Epo u poređenju sa 1EER su ograničene na petlje distalne od Fab vezujućeg epitopa, sa RMSD od 0,5 Å za svih 144 poravnatih aminokiselina. Teški i laki lanci Fab NVS3 pokazuju tipične nabore slične imunoglobulinu za domene.

[0303] Kristalna struktura Epo:NVS3 je korišćena za identifikaciju Epo epitopa antigen vezujućeg fragmenta NVS3. Interakciona površina na Epo je formirana prvenstveno putem ostataka koji sadrže ostatak Ser<9>, Glu<13>, ostatke Thr<44>do Arg<53>i ostatke Asn<147>do Arg<162>. Oni odgovaraju sekundarnim strukturnim elementima Epo označenim kao α-spiralaA, petlja βA-αB i α-spirala D. Ovi ostaci su formirali trodimenzionalnu površinu koju prepoznaje NVS3. Interakcije uključuju interakcije skeleta, interakcije posredovane rastvaračem i neposredne interakcije bočnog lanca.

Tabela 8: Epo interagujući ostaci sa NVS3

1

[0304] Epo ostaci koji sadrže atome u kontaktu sa NVS3 su navedeni u Tabeli 9. Definisano je da je kontakt u okviru od 5 Å od NVS3, kako bi se uzele u obzir potencijalne interakcije posredovane vodom.

Tabela 9:

1

*Pozicija sekvence u odnosu na SEQ ID NO: 81

[0305] Navedeni su Epo ostaci koji sadrže atome u kontaktu sa NVS2. Definisano je da je kontakt u okviru od 5 Å od proteinskog partnera, kako bi se uzele u obzir potencijalne interakcije posredovane vodom.

Tabela 10:

11

*Pozicija sekvence u odnosu na SEQ ID NO: 81

Primer 5: Model in vivo

Primer 5a: Mišji model edema oka

[0306] C57/Bl6 miševima (Taconic) subretinalno su injektovani ssAAV2-EPO-eGFP (DR005) i ssAAV2-EGFP (TM003) (kontrola). Miševi su žrtvovani tri nedelje (21 dan) nakon injekcije. Mrežnjače su ravno postavljene, i merena je veličina krvnog suda.

Metode:

Subretinalna injekcija ssAAV2-EPO-eGFP i ssAAV2-eGFP

[0307] 8 nedelja stari C57/Bl6 su podeljeni u dve grupe (10 miševa svaka, 20 očiju/grupi) i subretinalno injektovani sa 1 µl ssAAV2 sa 2x10<9>DRP/µl. Prva grupa (kontrola) je primila subretinalni ssAAV2-EPO (TM003), a druga (eksperimentalna) ssAAV2- eGFP (DR005). Dejstvo Epo miša na vaskularne promene mrežnjače ispitano je na ravnim nosačima mrežnjače 21 dan nakon injekcije.

[0308] Testirani AAV (adeno asocirani virus) bili su: ssAAV2-EPO-eGFP [(AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP) od Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill, serijski br. AV3782] i ssAAV2-GFP [(AAV2-eGFP) od Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill: serijski br. AV3725].

Procedura:

[0309] AAV vektori su isporučeni pomoću subretinalne injekcije na oba oka testiranih miševa. Sve opisane procedure su obavljane u aseptičkim uslovima, koristeći sterilne reagense, špriceve i odgovarajući PPE.

1. Miševi su imobilisani i zenice su im raširene pomoću kapi ciklopentolata (1%), a zatim kapi 2,5% fenilefrina.

2. Životinja je zatim i.p. anestezirana avertinom (250 mg/kg). Rožnjača je topikalno anestezirana kapljicom 0,5% proparakaina.

3. Nakon postavljanja životinje pod hirurški mikroskop, mikroskalpelom je načinjen nazalni rez od 0,5 mm, iza limbusa.

4. Tupa igla pričvršćena na Hamilton špric od 10 µl tangencijalno je ubačena kroz skleralni rez ka temporalnoj mrežnjači. Igla je napredovala sve dok se nije javio otpor.

5. 1 μl ssAAV2 vektora (ili ssAAV2-EPO-eGFP ili ssAAV2-GFP, oba sadrže fluorescein razblažen 1:50 radi vizuelizacije isporuke) polako je injektovano u subretinalni prostor.

6. Oko je pregledano pod hirurškim mikroskopom. Uspešna subretinalna injekcija je potvrđena vizuelizacijom odvajanja mrežnjače koja sadrži fluorescein.

7. Injekcija je ocenjena zavisno od stepena oštećenja mrežnjače (vizuelizovano veličinom krvarenja) i oštećenja sočiva.

8. Životinja je okrenuta na drugu stranu, i postupak je ponovljen.

9. Nakon injekcije, na oba oka je nanet antibiotički melem.

Disekcija mrežnjače, snimanje i kvantifikacija na ravnom nosaču za mrežnjaču:

[0310]

0,1 ml konkavalina-A (Con-A) je ubrizgano (i.v., repna vena) 1 do 5 minuta pre eutanazije (CO2)

2. Oči su enukleirane i fiksirane u paraformaldehidu (4% u PBS-u) tokom dva sata. Potom su održavane na 4°C u PBS puferu tokom 1-3 dana do disekcije

3. Rožnjača i sočivo su uklonjeni, i mrežnjača je disecirana sa zadnje očne šupljine (pigmentni epitel mrežnjače/horoida)

4. Četiri radijalna reza su načinjena na mrežnjači, i postavljena je na ravni nosač u Vectashield medijumu za nosač sa fotoreceptorskim slojem okrenutim nadole.

5. Nakon montiranja, ravni nosači su centrirani na centralnu mrežnjaču (koristeći glavu optičkog nerva kao referencu) i Con-A obeleženi krvni sudovi mrežnjače snimljeni su pri 20X koristeći Zeiss sistem za snimanje (AxioVision)

6. Softver AxioVision je korišćen za merenje prečnika krvnih sudova centralne mrežnjače koji su 200 µm udaljeni od glave optičkog nerva.

7. Dobijeni podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism.

Rezultati i zaključak:

[0311] Kvantifikacija prečnika suda otkrila je da je ssAAV2-EPO indukovao značajno (* p<0,001) širenje krvnih sudova u centralnoj mrežnjači u poređenju sa ssAAV2-GFP i

11

naivnim očima (6 očiju) (Slika 1). Nije pronađena značajna razlika prilikom poređenja ssAAV2-GFP sa naivnom grupom. Uzorci su analizirani pomoću jednostranog ANOVA testa sa Danetovim post-test (C) reprezentativnim ravnim nosačima za svaku grupu. Dugotrajna isporuka Epo pomoću AAV2-Epo-eGFP dovela je do statistički značajnog povećanja venskog kalibra (Slika 1), što je ključna oznaka dijabetičkog edema makule kod ljudi. Shodno tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje venskog kalibra u oku primenom anti-Epo antitela koje je ovde opisano na ispitaniku u terapeutski delotvornoj količini.

Primer 5b: In vivo efikasnost anti-Epo antitela

[0312] In vivo aktivnost i terapeutska efikasnost ovde opisanih anti-Epo antitela može da se proceni na mišjem modelu edema oka koji je prethodno opisan.

In vivo izazov na mišjem modelu

[0313] 8 nedelja starim C57B6 miševima subretinalno je injektovano jedno od sledećeg.

Grupe:

Grupa 1: AAV2-eGFP sa titrom 2 x 10<9>DRP sa titrom, 1 ul/oku, n = 20 očiju 10 miševa

Grupa 2: AAV2-Epo-eGFP sa titrom 2 x 10<9>DRP, 1 ul/oku, n = 20 očiju 10 miševa

Grupa 3: AAV2-Epo-eGFP sa titrom 2 x 10<9>, 1 ul/oku, anti-Epo Fab, 100 ug/oku, 1 nedeljno, n = 20 očiju 10 miševa

[0314] Dejstvo odgovarajuće doziranih anti-Epo antitela je ispitano na mišjem modelu merenjem prečnika krvnih sudova 2 nedelje nakon injekcije.

[0315] AAV-GFP (AAV2-eGFP) i AAV2-Epo-eGFP (AAV2-CMV-mEpo-IRES-eGFP) od Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina at Chapel Hill.

[0316] Intraokularna injekcija anti-Epo antitela će inhibirati širenje krvnih sudova i anti-Epo antitela ublažavaju dejstvo Epo na smanjeni protok krvi i hipoksične uslove u mrežnjači. Stoga se očekuje da će anti-Epo antitela smanjiti patologiju mrežnjače, što se takođe vidi kod pacijenata sa vaskularnim bolestima mrežnjače, poput vlažne AMD i dijabetičke retinopatije.

Primer 6: In vivo neutralizacija slobodnog EPO

Primer 6a: In vivo neutralizacija slobodnog EPO koristeći anti-Epo Fab

[0317] In vivo aktivnost i terapeutska efikasnost anti-EPO antitela je ispitana u zečjim očima na sledeći način. Zečevima je intravitrealno dozirano anti-EPO Fab, NVS2 (1 mg/oku) i izazvani su intravitrealnom dozom EPO (3 ug/oku) četiri dana kasnije. Životinje su žrtvovane i izvađeno je okularno tkivo, uključujući staklasto telo. Količina slobodnog EPO i ukupnog EPO u staklastom telu određena je kako je opisano u nastavku.

Nivoi ukupnog/slobodnog EPO:

[0318] Testovi su obavljeni koristeći standardne vezujuće MSD ploče (Meso-Scale Discovery, 384 bunarčića: MSD kat. br. L21XA), koristeći pufer za premazivanje (PBS) i inkubacioni pufer (PBS sa 2% BSA (Sigma kat. br. A4503) i 0,1% Tween20 i 0,1% Triton-X).

[0319] Antitela za hvatanje su premazana sa 1 µg/ml u PBS-u (25 µl) i inkubirana preko noći na 4°C. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje (PBS sa 0,05% Tween20) i blokirane sa 25

11

µl inkubacionog pufera na RT tokom 2 h. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Razblaženja staklastih tela u inkubacionom puferu su dodata ploči (25 µl) i inkubirana tokom 60 min na RT. Humani rekombinantni darbepoetin je korišćen kao standard (A000123, počevši od 2 µg/ml). Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Dodato je 25 µl primarnog antitela (1 µg/ml u inkubacionom puferu) i inkubirano RT tokom 60 minuta. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Dodano je 25 µl sekundarnih Sulfo-TAG antitela protiv vrsta (1:1000 u inkubacionom puferu) i inkubirano na RT tokom 60 min. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje i dodato je 25 µl 1x MSD pufera za očitavanje T (sa surfaktantom, MSD kat. br. R92TC-1). Ploče su očitane na MSD Spector Imager 6000.

Rezultati i zaključak:

11

[0320] Ukupni nivoi EPO izmereni u staklastom telu životinja kojima je ubrizgan anti-EPO ili nosač bili su slični očekivanim (Slika 2). Suprotno tome, nije izmeren slobodni EPO u staklastom telu zečeva injektovanih sa anti-EPO Fab, ali prosečno ~ 100 ng/ml slobodnog EPO je izmereno u staklastom telu zečeva kojima je injektovan nosač. Anti-EPO Fab primenjen intravitrealno u potpunosti je neutralisao nivoe slobodnog EPO u skladu sa očekivanjima.

Primer 6b: In vivo neutralizacija slobodnog EPO koristeći anti-Epo Fab

[0321] In vivo aktivnost i terapeutska efikasnost anti-EPO antitela je ispitana u zečjim očima na sledeći način. Zečevi su intravitrealno dozirani sa prethodno pomešanim rastvorom anti-EPO Fab, NVS2 (1 mg/oku) i EPO (3 ug/oku). Životinje su žrtvovane i izvađeno je okularno tkivo, uključujući staklasto telo. Količina slobodnog EPO i ukupnog EPO u staklastom telu određena je kako je opisano u nastavku. Napomena: Neke oči su primile prethodno pomešani rastvor anti-EPO Fab, EPO i VEGF.

Nivoi ukupnog/slobodnog EPO:

[0322] Testovi su obavljeni koristeći standardne vezujuće MSD ploče (Meso-Scale Discovery, 384 bunarčića: MSD kat. br. L21XA), koristeći pufer za premazivanje (PBS) i inkubacioni pufer (PBS sa 2% BSA (Sigma kat. br. A4503) i 0,1% Tween20 i 0,1% Triton-X).

11

[0323] Antitela za hvatanje su premazana sa 1 µg/ml u PBS-u (25 µl) i inkubirana preko noći na 4°C. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje (PBS sa 0,05% Tween20) i blokirane sa 25 µl inkubacionog pufera na RT tokom 2 h. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Razblaženja staklastih tela u inkubacionom puferu su dodata ploči (25 µl) i inkubirana tokom 60 min na RT. Humani rekombinantni darbepoetin je korišćen kao standard (A000123, počevši od 2 µg/ml). Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Dodato je 25 µl primarnog antitela (1 µg/ml u inkubacionom puferu) i inkubirano RT tokom 60 minuta. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje. Dodano je 25 µl sekundarnih Sulfo-TAG antitela protiv vrsta (1:1000 u inkubacionom puferu) i inkubirano na RT tokom 60 min. Ploče su isprane 3x u puferu za ispiranje i dodato je 25 µl 1x MSD pufera za očitavanje T (sa surfaktantom, MSD kat. br. R92TC-1). Ploče su očitane na MSD Spector Imager 6000.

11

Rezultati i zaključak:

[0324] Ukupni nivoi EPO izmereni u staklastom telu životinja kojima je ubrizgan anti-EPO ili nosač bili su slični očekivanim (Slika 3). Suprotno tome, nije izmeren slobodni EPO u staklastom telu zečeva injektovanih sa anti-EPO Fab, dok je prosečno ~ 200 ng/ml slobodnog EPO izmereno u staklastom telu zečeva kojima je injektovan nosač (Slika 3). Čini se da prisustvo VEGF nema nikakvo dejstvo na izmerene nivoe slobodnog i ukupnog EPO. Anti-EPO Fab primenjen intravitrealno u potpunosti je neutralisao nivoe slobodnog EPO u skladu sa očekivanjima.

11

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji vezuju humani eritropoetin (Epo) i sadrže sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca Fab NVS1 predstavljene sa SEQ ID NO: 13, odnosno 14; Fab NVS2 predstavljene sa SEQ ID NO: 33, odnosno 34; Fab NVS3 predstavljene sa SEQ ID NO: 53, odnosno 54; ili Fab NVS4 predstavljene sa SEQ ID NO: 73, odnosno 74.

2. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrže sekvence varijabilnog domena teškog i lakog lanca Fab NVS2 predstavljene sa SEQ ID NO: 33, odnosno 34.

3. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 1, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrže sekvence teškog lanca i lakog lanca SEQ ID NO: 15, odnosno 16; SEQ ID NO: 35, odnosno 36; SEQ ID NO: 55, odnosno 56; ili SEQ ID NO: 75, odnosno 76.

4. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema zahtevu 3, pri čemu antitelo ili njegov antigen vezujući fragment sadrže sekvence teškog lanca i lakog lanca SEQ ID NO: 35, odnosno 36.

5. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od prethodnih zahteva.

6. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen teškog lanca i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 17, 37, 57 i 77.

7. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen teškog lanca i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 37.

8. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira teški lanac i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 39.

9. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen lakog lanca i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom izabranom od SEQ ID NO: 18, 38, 58 i 78.

10. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira varijabilni domen lakog lanca i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 38.

11. Molekul nukleinske kiseline iz zahteva 5, pri čemu navedeni molekul nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira laki lanac i navedena sekvenca ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 40.

12. Vektor koji sadrži molekul nukleinske kiseline iz bilo kog od zahteva 5 do 11.

13. Izolovana ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu iz bilo kog od zahteva 5 do 11 ili vektor iz zahteva 12.

14. Kompozicija koja sadrži antitelo ili antigen vezujući fragment iz bilo kog od zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač.

15. Kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u inhibiciji EPO zavisne proliferacije ćelija kod ispitanika.

16. Kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju vaskularne bolesti mrežnjače kod ispitanika.

17. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu je vaskularna bolest mrežnjače kod ispitanika povezana sa bolešću ili stanjem odabranim od: dijabetičke retinopatije, dijabetičkog edema makule, proliferativne dijabetičke retinopatije, neproliferativne dijabetičke retinopatije, starosne degeneracije makule, okluzije vene mrežnjače, multifokalnog horoiditisa, miopične horoidne neovaskularizacije i/ili retinopatije nedonoščadi.

18. Kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za upotrebu u lečenju edema makule.