CN110520443B - Fgf21模拟抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本披露涉及结合人β‑klotho的单克隆抗体和其抗原结合片段、以及包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物和治疗方法。

Description

FGF21模拟抗体及其用途
本申请要求于2017年2月8日提交的美国临时申请号62/456,609的权益，该临时申请通过引用以其全文特此并入。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并特此通过引用以其全文并入的序列表。创建于2018年1月19日的所述ASCII副本名为PAT057578-WO-PCT_SL.txt且大小为80,531字节。
技术领域
本披露涉及成纤维细胞生长因子21(FGF21)模拟抗体(mimetic antibody)。还披露了用于治疗FGF21相关障碍，例如肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征和其他代谢疾病，并且降低危重患者的死亡率和发病率的方法。
背景技术
成纤维细胞生长因子(FGF)家族的特征是22个遗传上不同的同源配体，其可以分为7个亚家族。根据公开文献，FGF家族目前由至少23个成员，即FGF-1至FGF-23组成(Reuss等人(2003)CellTissueRes.[细胞与组织研究]313:139-157)。
成纤维细胞生长因子21(FGF21)从小鼠胚胎中分离并且与FGF19和FGF23最接近。这一FGF亚家族调节对于经典FGF不常见的多种生理过程，即能量和胆汁酸稳态、葡萄糖和脂质代谢和磷酸盐以及维生素D稳态。此外，不同于经典FGF，这一亚家族以内分泌的方式作用(Moore,D.D.(2007)Science[科学]316,1436-8)。据报道，FGF21在肝脏中优先表达(Nishimura等人(2000)Biochimica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学学报],1492:203-206；专利公开WO 01/36640；和专利公开WO 01/18172)并且被描述为是缺血性血管疾病、伤口愈合和与肺功能、支气管功能或肺泡细胞功能缺失相关的疾病和多种其他障碍的治疗方法。
FGF21已被鉴定为是有效的代谢调节因子。向患有饮食诱导性或遗传型肥胖症和糖尿病的啮齿动物和恒河猴全身施与FGF21发挥很强的抗高血糖和降甘油三酯作用，并且使体重减轻(Coskun,T等人(2008)Endocrinology[内分泌学]149:6018-6027；Kharitonenkov,A.等人(2005)Journal of Clinical Investigation[临床研究杂志]115:1627-1635；Kharitonenkov,A.等人(2007)Endocrinology[内分泌学]148:774-781；Xu,J等人(2009)Diabetes[糖尿病]58:250-259)。FGF21是209个氨基酸的多肽，其含有28个氨基酸的前导序列。人FGF21与小鼠FGF21具有约79％氨基酸同一性并且与大鼠FGF21具有约80％氨基酸同一性。
在哺乳动物中，FGF凭借一组四个FGF受体，即FGFR1-4介导它们的作用，FGFR1-4进而以多种剪接变体形式表达。每个FGF受体含有细胞内酪氨酸激酶结构域(该结构域在配体结合时被活化)，产生涉及MAPK(Erk1/2)、RAF1、AKT1和STAT的下游信号传导通路(Kharitonenkov,A.等人(2008)BioDrugs[生物药物]22:37-44)。若干报道显示，FGFR1-3的“c”-报告基因剪接变体对β-klotho具有特异性亲和力并且可作为FGF21的内源性受体(Kurosu等人,2007J.Biol.Chem.[生物化学杂志]282:26687-26695；Ogawa等人,2007Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]104:7432-7437；Kharitonenkov等人,2008J.Cell Physiol.[细胞生理学杂志]215,1-7)。在3T3-L1细胞和白色脂肪组织中，FGFR1是目前最丰富的受体，并且因此最可能的是，FGF21在这一组织中的主要功能性受体是β-klotho-FGFR1c复合物。
尽管FGF21活化FGF受体和下游信号传导分子，包括FRS2a和细胞外信号调节激酶(ERK)，但是未检测到FGFR和FGF21的直接相互作用。此外，各种非脂肪细胞对FGF21无应答，尽管它们表达多种FGFR同种型。所有这些数据显示辅因子必须通过FGFR介导FGF21信号传导。研究鉴定了β-klotho(beta-klotho)，其作为对FGF21的细胞应答的决定簇，在肝脏、脂肪细胞和在胰腺中高度表达(Kurosu,H.等人(2007)J Biol Chem[生物化学杂志]282,26687-95)。β-klotho-FGFR复合物，而不仅仅是FGFR，体外结合FGF21(Kharitonenkov,A.等人(2008)J Cell Physiol[细胞生理学杂志]215,1-7)。FGF21结合与FGFR1c、2c或3c复合的β-klotho；但是不结合与FGFR4复合的β-klotho(Owen等人,2015Trends in Endocrinology[内分泌学趋势]26:22-29)。在FGF23-klotho-FGFR系统中鉴定了相似的机制(Urakawa,I.等人(2006)Nature[自然]444,770-4)。
首先在小鼠3T3-L1脂肪细胞葡萄糖吸收测定中鉴定了FGF21的生物活性(Kharitonenkov,A.等人(2005)J Clin Invest[临床研究杂志]115,1627-35)。随后，显示FGF21诱导胰岛素依赖性葡萄糖吸收和GLUT1表达。也已显示FGF21改善了一系列糖尿病啮齿动物模型中的高血糖症。此外，据发现，过表达FGF21的转基因小鼠对饮食诱导性代谢异常具有抗性，包括降低体重和脂肪质量，以及增强胰岛素敏感性(Badman,M.K.等人(2007)Cell Metab[细胞代谢]5,426-37)。向糖尿病非人灵长类(NHP)施与FGF21导致空腹血浆葡萄糖、甘油三酯、胰岛素和胰高血糖素水平下降，并且导致脂蛋白曲线的显著改善(包括HDL胆固醇接近80％的增长)(Kharitonenkov,A.等人(2007)Endocrinology[内分泌学]148,774-81)。重要的是，在该NHP研究期间，在任何点上均未观察到低血糖症。其他研究鉴定了FGF21是一种重要的内分泌激素，其有助于控制对空腹状态的适应。这提供了PPARα下游的先前缺少的环节，肝脏通过该环节与身体的其他部分通信以调节能量稳态生物学。对FGF21调节脂肪(脂肪分解)、肝脏(脂肪酸氧化和生酮作用)和大脑(休眠(torpor))的联合观察确认了FGF21是空腹应答的主要内分泌调节因子(Kharitonenkov,A.&Shanafelt,A.B.(2008)BioDrugs[生物药物]22,37-44)。
将FGF21直接用作生物治疗剂的问题是其半衰期非常短。在小鼠中，人FGF21的半衰期是0.5至1小时，并且在食蟹猴中，半衰期是2至3小时。此外，当野生型FGF21在药物配制品或制剂中使用时，它的稳定性受到防腐剂，例如，间甲酚的不利影响。
发明内容
本披露涉及FGF21模拟抗体，即，结合β-klotho并且活化人成纤维细胞生长因子21(在下文中有时称为“FGF21”)受体复合物和FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体依赖性信号传导)的单克隆抗体、其抗原结合片段和包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物和治疗方法。
在具体的方面，本披露的(FGF21模拟、β-klotho结合抗体的)抗原结合片段可以是具有FGF21样活性和选择性的分子，但是该分子还具有附加的治疗上所希望的特征例如蛋白质稳定性、低免疫原性、易于生产和所希望的体内半衰期。
本披露的单克隆FGF21模拟抗体、其抗原结合片段和包含该抗体或抗原结合片段的药物组合物可用于治疗FGF21相关障碍，例如肥胖症、2型糖尿病、1型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变、胃轻瘫和其他的代谢疾病，并且降低危重患者的死亡率和发病率。
在特定方面，本文所述的分离的FGF21模拟抗体或抗原结合片段结合β-klotho，其平衡解离常数(KD)小于或等于500pM或400pM，例如，如通过BIACORETM结合测定所确定的，并且还可活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50小于或等于50nM，例如，如通过细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化(pERK或磷酸-ERK)细胞测定所测量的。在特定方面，本文所述的分离的FGF21模拟抗体或抗原结合片段结合β-klotho，其平衡解离常数(KD)小于或等于300pM或400pM，例如，如通过BIACORETM结合测定所确定的，并且还可活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50小于或等于50nM，例如，如通过pERK细胞测定所测量的。
在特定方面，本文所述的分离的FGF21模拟抗体或抗原结合片段结合β-klotho，其平衡解离常数(KD)小于或等于100pM或50pM。例如，本文所述的分离的抗体或抗原结合片段可结合人β-klotho，其KD小于或等于100pM、小于或等于50pM、小于或等于45pM、小于或等于40pM、小于或等于35pM、小于或等于25pM或小于或等于15pM。更具体地，本文所述的分离的抗体或抗原结合片段还可结合人β-klotho，其KD小于或等于10pM，如通过BIACORETM结合测定或溶液平衡滴定测定(SET)所测量的；并且还可活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50小于或等于50nM，例如，如通过pERK细胞测定所测量的。
本披露涉及结合人和食蟹猴β-klotho的分离的抗体或其抗原结合片段。本披露还涉及结合β-klotho并且活化FGF21受体复合物和FGF21介导的信号传导的分离的抗体或其抗原结合片段(例如，FGF21受体依赖性信号传导)。在特定方面，本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段不活化人FGFR2c_β-klotho、FGFR3c_β-klotho或FGFR4_β-klotho受体复合物。
本披露还涉及结合β-klotho并且进一步竞争与表1中所述的抗体，例如，抗体NOV005或NOV006，结合的分离的抗体或其抗原结合片段。本披露还进一步涉及分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段与表1中所述的抗体例如，抗体NOV005或NOV006结合相同的表位。
如此处所述，抗体和/或其抗原结合片段之间的“竞争”意味着两种抗体(或其结合片段)结合相同的β-klotho表位(例如，如通过竞争性结合测定，通过本领域技术人员所熟知的任一方法所确定的)。如果所述竞争性抗体或其抗原结合片段与本披露的抗体或抗原结合片段结合相同的β-klotho表位或重叠的β-klotho表位，则该抗体或其抗原结合片段还与本披露的β-klotho抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)“竞争”。如本文所使用的，竞争性抗体或其抗原结合片段还可包括如下：(i)空间阻断本披露的抗体或抗原结合片段结合其靶标的竞争性抗体或其抗原结合片段(例如，如果所述竞争性抗体结合临近的、非重叠的β-klotho和/或β-klotho表位并且以物理的方式防止本披露的抗体或抗原结合片段结合其靶标)；和/或(ii)结合不同的、非重叠的β-klotho表位并且诱导β-klotho蛋白发生如下构象变化的竞争性抗体或其抗原结合片段，所述构象变化使得所述蛋白质不再以无该构象变化时具有的方式结合本披露的β-klotho抗体或抗原结合片段。
本文所述的分离的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可通过溶液平衡滴定法(SET)来测定。SET的方法是本领域已知的并且在下文中进一步详述。可替代地，本文所述的分离的抗体或片段的结合亲和力可通过Biacore测定来确定。Biacore动力学测定的方法是本领域已知的并且在下文中进一步详述。
该分离的FGF21模拟抗体或其抗原结合片段可用于提高FGF21受体复合物的活化，并且从而提高FGF21信号传导通路的活化。在特定的方面，分离的FGF21模拟抗体或其抗原结合片段可用于提高FGF21受体复合物的活化，并且从而使FGF21信号传导通路的活化提高了至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
如本文所述，该分离的FGF21模拟抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、人或人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、Fv片段、F(ab’)2片段或scFv片段和/或IgG同种型(例如，IgG1、IgG2或IgG4)。
如本文所述，该分离的FGF21模拟抗体或其抗原结合片段还可包括框架，在该框架中，氨基酸已被取代进来自各自的人VH或VL种系序列的抗体框架。
本披露的另一方面包括分离的抗体或其抗原结合片段，其具有表1中所述的Fab，例如，抗体NOV005或NOV006的完全重链和完全轻链序列。更具体地，该分离的抗体或其抗原结合片段可具有Fab NOV005或NOV006的重链和轻链序列。
本披露的另外的方面包括分离的抗体或其抗原结合片段，其包含如表1所述的Fab，例如NOV005或NOV006的重链和轻链可变结构域序列。更具体地，该分离的抗体或其抗原结合片段包含Fab NOV005或NOV006的重链和轻链可变结构域序列。
本披露还涉及包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的组合物(例如，药物组合物)、以及抗体组合物与药学上可接受的载体的组合。更具体地，本披露进一步包括药物组合物，所述药物组合物包含表1的抗体或其抗原结合片段，例如，像抗体NOV005或NOV006。本披露还涉及药物组合物，所述药物组合物包含表1的分离的抗体或其抗原结合片段(例如，抗体NOV005或NOV006)中的两个或更多个的组合。
本披露还涉及分离的核酸分子，其包含编码重链可变区的核酸序列，该重链可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。在特定方面，该核酸分子包含如下序列，该序列与选自下组的序列具有至少90％序列同一性，该组由SEQ ID NO:16、36或38组成。在本披露的另外的方面，本文所提供的核酸分子包含SEQ ID NO:16、36或38的核酸序列。
本披露还涉及分离的核酸分子，其包含编码具有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变区的核酸序列。在特定方面，该核酸分子包含如下序列，该序列与SEQ ID NO:27、54、33或40的核酸序列具有至少90％序列同一性。在本披露的另外的方面，本文所提供的核酸分子包含SEQ ID NO:27、54、33或40的核酸序列。
本披露还涉及载体，该载体包括本文所述的核酸分子中的一个或多个。在具体的方面，第一载体编码本文所提供的抗体(例如NOV005或NOV006)的重链可变区或重链，第二载体编码本文所提供的抗体(例如NOV005或NOV006)的轻链可变区或重链。将该第一载体和第二载体转导到宿主细胞中共表达以形成包含此类重链和此类轻链的抗体。
本披露还涉及分离的宿主细胞，其包括编码如上所述的抗体的重链的重组DNA序列和编码如上所述的抗体的轻链的第二重组DNA序列，其中所述DNA序列可操作地连接至启动子并且能够在宿主细胞中表达。可预期的是该抗体可以是人单克隆抗体。还可预期的是，该宿主细胞是非人哺乳动物细胞，例如CHO细胞或HEK293细胞。
本披露还涉及活化成纤维细胞生长因子21(FGF21)受体，并且从而活化FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体依赖性信号传导)，其中该方法包括使细胞与有效量的包含本文所述的分离的抗体或其抗原结合片段的组合物接触的步骤。
在一个特定的方面，可预期的是该细胞是人细胞。进一步预期的是该细胞是在受试者中。在一个实施例中，可预期的是该细胞是脂肪细胞。在其他实施例中，该细胞可以是肝细胞、胰腺细胞、内皮细胞、肌肉或肾细胞中的一种或多种。在具体的方面，仍然进一步期望的是该受试者是人。
本披露还涉及治疗、控制、改善或预防受试者中的FGF21相关障碍的方法，其中该方法包括施与受试者有效量的包含本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的组合物的步骤。在一个方面，该FGF21相关障碍是肥胖症。在一个方面，该FGF21相关障碍是2型糖尿病。可预期的是该受试者是人。
任一前述分离的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体或其抗原结合片段。
在以下方面中描述了本披露的非限制性实施例：
1.一种结合β-klotho的表位的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
含有SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
含有SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
含有SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
含有SEQ ID NO:19、31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
含有SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
含有SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
2.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
含有SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
含有SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
含有SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
含有SEQ ID NO:31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
含有SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
含有SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
3.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
含有SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
含有SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
含有SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
含有SEQ ID NO:19、31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
含有SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
含有SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
4.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3；
(ii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3；
(iii)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3；或(iv)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
5.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3；
(ii)含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3；
(iii)含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3；或(iv)含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
6.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19或31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
7.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19或31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
8.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的LCDR3。
9.如方面1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQID NO:23的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
10.如方面1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或片段提高了β-klotho和FGFR1c的活性。
11.如方面1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以小于或等于450pM的KD结合人β-klotho蛋白，如通过BIACORETM结合测定所测量的。
12.如方面1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含或主要由以下组成：(i)β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的一个或多个氨基酸；或(ii)来自β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的以下残基段246-265、536-550、834-857和959-986中的每一个的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基。
13.如方面1-9中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述表位包含或主要由以下组成：(i)β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或多个氨基酸；或(ii)来自β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的以下残基段646-670、696-700和646-689中的每一个的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基。
14.如方面1-13中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其能够以小于或等于50nM的EC50活化食蟹猴FGFR1c-β-klotho受体复合物，如通过pERK细胞测定所测量的。
15.如方面1-14中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或片段不接触人β-klotho(SEQ ID NO:52)的残基701(Tyr)或703(Arg)。
16.如方面1-15中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少90％或95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列或与其具有至少90％或95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
17.如方面1-16中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH。
18.如方面1-17中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的VL。
19.如方面17所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段包含(i)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，或(ii)含有SEQID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
20.如方面1-19中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体包含(i)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链，或(ii)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链。
21.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段与如方面1-20中任一项所述的分离的抗体或片段结合相同的表位，其中该抗体或抗原结合片段不包含(i)如表2中所示的抗体NOV004的组合CDR的或卡巴特(Kabat)CDR；和/或(ii)含有SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列的轻链可变区。
22.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或片段与如方面1-20中任一项所述的分离的抗体或片段竞争结合β-klotho，其中该抗体或抗原结合片段不包含(i)如表2中所示的抗体NOV004的组合的CDR或卡巴特CDR；和/或(ii)含有SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列的轻链可变区。
23.如方面1-20中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或片段不包含(i)如表2中所示的抗体NOV004的组合的CDR或卡巴特CDR；和/或(ii)含有SEQ IDNO:43或55的氨基酸序列的重链可变结构域和含有SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列的轻链可变区。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含上述方面中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
25.一种治疗代谢疾病的方法，该方法包括向患有代谢疾病的受试者施与有效量的包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。
26.如方面25所述的方法，其中该受试者患有肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高甘油三酯血症和代谢综合征中的一种或多种。
27.如方面25所述的方法，其中该受试者患有肥胖症、糖尿病和血脂紊乱中的一种或多种。
28.一种治疗心血管疾病的方法，该方法包括向患有心血管疾病的受试者施与有效量的包含如前述方面中任一项所述的抗体或片段的药物组合物。
29.如方面28所述的方法，其中该受试者患有动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭和冠心病中的一种或多种。
30.如方面1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用作药物。
31.一种减轻体重的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。
32.一种降低食欲或食物摄入的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。
33.一种降低受试者的血浆甘油三酯(TG)浓度或血浆总胆固醇(TC)浓度的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。
34.如方面31、32或33所述的方法，其中该受试者患有代谢疾病。
35.如方面34所述的方法，其中该受试者患有如下中的一种或多种：肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症和代谢综合征。
36.一种核酸，其编码如前述方面中的任一项所述的抗体中的一种或多种，或编码这些抗体中的任一种的VL和/或VH。
37.一种核酸，其包含与表1中所示的序列具有至少90％同一性的序列。
38.一种核酸，其包含与表1中所示的序列具有至少95％同一性的序列。
39.一种核酸，其包含表1中所示的序列。
40.一种载体，其包含如方面36、37、38或39所述的核酸。
41.一种宿主细胞，其包含如方面40所述的载体。
42.一种包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物用于治疗代谢疾病。
43.一种制备结合β-klotho的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在适于表达该抗体或其片段的条件下培养如方面41所述的宿主细胞的步骤。
44.如方面42所述的药物组合物，所述药物组合物中该代谢疾病是肥胖症、糖尿病、高甘油三酯血症或血脂紊乱。
45.一种包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物用于治疗心血管疾病。
46.一种包含如方面1-23中任一项所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物，所述药物组合物用于在减轻受试者体重的方法中、在降低受试者食欲或食物摄入的方法中、在降低受试者血浆甘油三酯(TG)浓度或血浆总胆固醇(TC)浓度的方法中使用。
47.如方面1-23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途，该药物用于治疗受试者代谢疾病、用于治疗受试者心血管疾病、用于减轻受试者体重、用于降低受试者食欲或食物摄入、用于降低受试者血浆TG浓度或血浆TC浓度。
附图说明
图1：通过NOV004、NOV005和NOV006对人(图1A)和食蟹猴(图1B)FGFR1c_β-klotho_HEK293细胞进行pERK活化。该pERK活化数据表示(i)NOV004活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别为约3nM和20nM；(ii)NOV005活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别为约3nM和16nM；和(iii)NOV006活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别为约4nM和18nM。
图2：针对人FGFR2c_β-klotho(图2A)、FGFR3c_β-klotho(图2B)和FGFR4_β-klotho(图2C)HEK293细胞的pERK活化的NOV004、NOV005和NOV006谱分析(profiling)。FGF21被用作阳性对照以活化FGFR2c_β-klotho或FGFR3c_β-klotho。FGF19被用作阳性对照以活化FGFR4_β-klotho。
图3：使用以α-klotho、Egr1-萤光素酶和海肾萤光素酶(Renilla luciferase)转染的HEK293细胞的针对FGF23活性的NOV004、NOV005和NOV006谱分析。FGF23被用作阳性对照。
图4：NOV005和NOV006相对NOV004对人β-klotho的竞争性结合活性。Forte 生物传感系统被用于测定对人β-klotho的竞争性结合活性。在步骤1中，将重组人β-klotho加载至传感器，随后加载NOV004直至在步骤2中饱和。然后加载NOV005或NOV006并且检测相对NOV004的竞争性结合活性。第二结合信号的缺少表示该抗体竞争与人β-klotho结合。使用不相关的抗体作为阴性对照，并且使用NOV004作为自我竞争的阳性对照。
图5：在大鼠中IV注射后的NOV004、NOV005和NOV006浓度-时间曲线。在IV施与NOV004(图5A)、NOV005(图5B)或NOV006(图5C)后，在1h时，动物示出大约200μg/mL的平均Cmax，其中全部三种抗体示出相当的PK曲线。
图6A：以一周的间隔，将两个皮下1mg/kg剂量的NOV005(n＝5只动物)或媒介物(n＝3只动物)施与雄性血糖正常的肥胖的食蟹猴(给药的天数用箭头指示)。将标准食物的摄食量数据归一化为根据组平均值±SEM的基线百分比。在整个研究过程中，猴消耗水果、蔬菜和坚果作为食物。
图6B：以一周的间隔，将两个皮下1mg/kg剂量的NOV005(n＝5只动物)或媒介物(n＝3只动物)施与雄性血糖正常的肥胖的食蟹猴(给药的天数用箭头指示)。NOV005和媒介物处理的动物的基线体重分别为11.3+1.2和11.4+1.3kg。将体重数据归一化为根据(A)组平均值±SEM和(B)示出的个体动物数据的基线百分比。
具体实施方式
本披露部分基于如下抗体分子的发现：这些抗体分子特异性地结合β-klotho并且导致FGF受体，例如，FGFR1c的活化，以及FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体依赖性信号传导)的活化。本披露涉及完全IgG形式抗体以及其抗原结合片段，例如Fab片段(例如，抗体NOV005或NOV006)。
因此，本披露提供了特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)的抗体、药物组合物、生产方法，以及使用此类抗体和组合物的方法。
术语
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。
如本文所使用的，术语“FGF21”是指成纤维细胞生长因子(FGF)蛋白质家族的成员。FGF21的示例性氨基酸序列(GenBank登录号NP_061986.1)如SEQ ID NO:1所示，其相应的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示(NCBI参考序列号NM_019113.2)。
如本文所使用的，术语“FGF21受体”是指FGF21的受体(Kharitonenkov,A等人(2008)Journal of Cellular Physiology[细胞生理学杂志]215:1-7；Kurosu,H等人(2007)JBC 282:26687-26695；Ogawa,Y等人(2007)PNAS 104:7432-7437)。
术语“FGF21多肽”是指在人类中表达的天然存在的多肽。出于本披露的目的，术语“FGF21多肽”可以互换使用以指代任何全长FGF21多肽(例如，SEQ ID NO:1，其由209个氨基酸残基组成并且由SEQ ID NO:2的核苷酸序列编码)；多肽的任何成熟形式(其由181个氨基酸残基组成，并且其中该全长FGF21多肽(即，其构成了信号肽)的氨基末端的28个氨基酸残基已除去)，以及其变体。
如本文使用的，术语“抗体”表示全抗体及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。全抗体是包含由二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包含一个结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补性决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”是指保留与给定抗原(例如，β-klotho)特异性结合的能力的完整抗体的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的抗原结合部分或抗原结合片段内的结合片段的实例包括Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，一种包含通过铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；和由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单一臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域或VL结构域组成的单结构域抗体(dAb)片段(Ward等人,1989Nature[自然]341:544-546)；以及分离的互补性决定区(CDR)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,1988Science[科学]242:423-426；和Huston等人,1988Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。此类单链抗体包含抗体的一个或多个抗原结合部分或片段。这些抗体片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
抗原结合片段还可以掺入到单结构域抗体、大型抗体(maxibodies)、微型抗体(minibodies)、胞内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和bis-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson,2005Nature Biotechnology[自然生物技术]23,9,:1126-1136)。可以基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)将抗体的抗原结合部分移植到支架中(参见美国专利号6,703,199，该专利描述了纤连蛋白多肽单体)。
可以将抗原结合片段掺入包含一对串联Fv片段(VH-CH1-VH-CH1)的单链分子中，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等人.(1995)Protein Eng.[蛋白质工程]8(10):1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
如本文所用，术语“亲和力”是指在单个抗原位点处抗体和抗原之间的相互作用强度。在每个抗原位点内，抗体“臂”的可变区通过弱非共价力在许多位点处与抗原相互作用；相互作用越多，亲和力越强。如本文使用的，对于抗体或其抗原结合片段(例如，Fab片段)术语“高亲和力”通常是指具有KD为10-9M或更低的抗体或抗原结合片段。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
如本文所用，术语“结合特异性”是指单个抗体结合位点仅与一种抗原决定簇反应的能力。
短语“特异性地(或选择性地)结合”至抗体(例如，β-klotho结合抗体)是指结合反应，其决定着蛋白质和生物制剂的异质群体中同源抗原(例如，人β-klotho或食蟹猴β-klotho)的存在。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性地结合的抗体”可互换使用。
术语“FGF21介导的”或相似术语是指如下事实：在结合β-klotho后，本披露的FGF21受体和/或这些抗体介导细胞应答和FGF21信号传导通路，从而触发多种生理作用，包括但不限于以下一个或多个的降低：血浆甘油三酯、血浆胰岛素、血浆葡萄糖、食物摄入和体重。
如本文所使用的“FGF21相关障碍”、“FGF21相关病症”、“与FGF21相关的疾病或病症”或相似的术语是指任何数量的病症或疾病，其中通过活化FGF21信号传导通路(例如，通过活化FGF21受体信号传导)寻求对这些病症或疾病进行预防、诊断和/或治疗。这些可包括特征为异常FGF21信号传导(例如，FGF21介导的信号传导和/或FGF21受体信号传导的异常活化)的病症、疾病或障碍。这些病症包括但不限于代谢、内分泌和心血管疾病，例如肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝脏疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、代谢综合征、急性心肌梗死、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变、胃轻瘫、与胰岛素受体严重失活突变相关的障碍和其他的代谢疾病，和降低危重患者的死亡率和发病率。
“2型糖尿病”是一种病症，其特征是在尽管可获得胰岛素的情况下仍有过度葡萄糖生产，并且由于不充分的葡萄糖清除，循环葡萄糖水平保持过分高的水平。
“1型糖尿病”是一种病症，其特征是由胰岛素的完全缺失导致的高血液葡萄糖水平。当身体的免疫系统攻击胰腺中的产生胰岛素的β细胞并且将它们摧毁时，这种现象就会发生。胰腺然后产生少量或不产生胰岛素。
“胰腺炎”是胰腺的炎症。
“血脂紊乱”是脂蛋白代谢疾病，包括脂蛋白过度产生或缺乏。血脂紊乱可以表现为在血液中总胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和甘油三酯浓度的提高，以及高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度的降低。
“非酒精性脂肪性肝炎(NASH)”是与酒精消耗不相关的肝脏疾病，其特征是肝细胞的脂肪变性，伴随着小叶内炎症和纤维化。
“葡萄糖耐受不良”或受损的葡萄糖耐受性(IGT)是与心血管病风险提高的相关的血糖代谢疾病的前糖尿病状态。前糖尿病病症防止受试者有效地将葡萄糖移入细胞中并且将其作为有效的能量来源利用，导致血液中的葡萄糖水平提高和一定程度的胰岛素抗性。
“高血糖症”被定义为血液中存在过度的糖(葡萄糖)。
“低血糖症”(还称为低血糖)在你的血液葡萄糖水平降至太低以至于不能为你的身体活动提供足够的能量时发生。
“高胰岛素血症”被定义为血液中高于正常水平的胰岛素。
“胰岛素抗性”被定义为其中正常量的胰岛素产生低于正常的生物应答的状态。
“肥胖症”，在人类受试者中,可以定义为如下：针对特定人群，体重高于理想体重的20％以上(R.H.Williams,Textbook of Endocrinology[内分泌学教科书],1974,第904-916页)。它也可以定义为体重指数(BMI，定义为一个人的体重(单位为千克)除以他的身高(单位为米)的平方)(kg/m2)大于或等于30。
“代谢综合征”可以定义为以下症状中的至少三种的集合：腹部脂肪--在大多数男性中，腰围为40英寸或更大；高血糖--空腹为至少110毫克每分升(mg/dl)；高甘油三酯--在血流中至少150mg/dL；低HDL--小于40mg/dl；以及血压为130/85mmHg或更高。
“高血压(Hypertension或high blood pressure)”是全身动脉血压暂时或持续升高至可能诱发心血管损伤或其他不良后果的水平。高血压被任意定义为收缩压高于140mmHg或舒张压高于90mmHg。
“心血管疾病”是与心脏或血管相关的疾病。
当斑块在将血液输送至头部、器官和四肢的动脉中聚集时，会发生“外周动脉疾病”。随着时间的推移，斑块会使动脉变硬和变窄，从而限制富氧血液流向器官和身体的其他部分。
“动脉粥样硬化”是一种血管疾病，其特征在于大中型动脉内膜中不规则分布的脂质沉积，其导致动脉腔变窄并最终发展为纤维化和钙化。病变通常是局灶性的，并且缓慢且间歇性进展。血流受限是大多数临床症状的原因，这些临床症状随病变的分布和严重程度而变化。
“中风”是与脑循环受损有关的任何急性临床事件，其持续时间超过24小时。中风涉及不可逆的脑损伤，其症状的类型和严重程度依赖于循环受损的脑组织的位置和程度。
“心力衰竭”，也称为充血性心力衰竭，是一种心脏无法再将足够的血液泵送到身体其他部位的病症。
“冠心病”，也称为冠状动脉疾病，是向心脏供血和氧气的小血管变窄。
“肾病(Kidney disease或nephropathy)”是肾脏的任何疾病。糖尿病肾病是1或2型糖尿病患者的发病率和死亡率的主要原因。
“糖尿病并发症”是由高血糖水平引起涉及其他身体功能，例如肾、神经(神经病变)、足(足溃疡和循环不良)和眼睛(例如视网膜病)的问题。糖尿病还会增加心脏病以及骨骼和关节障碍的风险。其他糖尿病长期并发症包括皮肤问题、消化问题、性功能障碍以及牙齿和牙龈问题。
“神经病变”是涉及颅神经或者外周或自主神经系统的任何疾病。
“胃轻瘫”是胃蠕动的衰弱，其导致肠道排空延迟。
本披露所涵盖的危重患者通常经历不稳定的代谢亢进状态。这种不稳定的代谢状态是由于底物代谢的变化，其可能导致一些营养素的相对缺乏。通常，会出现脂肪和肌肉的氧化增加。
此外，危重患者优选地是经历全身性炎症反应综合征或呼吸窘迫的患者。发病率降低意味着降低危重患者发生其他疾病、病症或症状或者降低其他疾病、病症或症状严重程度的可能性。例如，降低发病率可以对应于菌血症或败血症或者与多器官衰竭相关的并发症的发生率的降低。
术语“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。对于特定核酸序列，保守修饰的变体是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或在该核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，任何给定的蛋白质均可以由多个功能相同的核酸编码。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，该密码子可以改变为任何所述相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG--通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和TGG--通常是色氨酸的唯一密码子)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个所述序列中均隐含了编码多肽的核酸的每一种沉默变异。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，它们导致某个氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体是对本披露的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除这些多态变体、种间同源物和等位基因。以下8组含有互为保守替换的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins[蛋白质](1984))。在一些实施例中，术语“保守序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。
术语“表位”意指能够与抗体特异性结合的蛋白质决定簇。表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征、以及特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的差别在于：在变性溶剂的存在下，对构象表位(而不是非构象表位)的结合丧失。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区两者均衍生自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区还衍生自此类人序列，例如人种系序列或突变形式的人种系序列。本披露的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。
术语“人单克隆抗体”是指具有可变区的展现出单一结合特异性的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人序列。在一个实施例中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，所述杂交瘤包括从转基因非人动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该转基因非人动物具有与永生化细胞融合的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
“人源化”抗体是保留非人抗体的反应性同时在人中具有较低免疫原性的抗体。例如，这可以通过保留非人CDR区并用其人对应物(即，恒定区以及可变区的框架部分)替换抗体的其余部分来实现。参见，例如，Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],81:6851-6855,1984；Morrison和Oi,Adv.Immunol.[免疫学进展],44:65-92,1988；Verhoeyen等人,Science[科学],239:1534-1536,1988；Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],28:489-498,1991；以及Padlan,Molec.Immun.[分子免疫学],31:169-217,1994。人工程化技术的其他实例包括但不限于在US 5,766,886中披露的Xoma技术。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以寻求使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查所测量的最大对应时，如果两个序列具有规定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在规定区域上或当没有规定时则在整个序列上，60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，则两个序列是“基本上相同的”。任选地，同一性存在于长度为至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)的区域上，或更优选地在长度为100至500或1000或更多个核苷酸(或20、50、200或更多个氨基酸)的区域上。
对于序列比较，典型地一个序列充当参考序列，将测试序列与该参考序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法将基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用，“比较窗口”包括提及选自下组的多个邻接位置中的任何一个的区段，该组由从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150组成，其中在两个序列最佳比对后，可以将序列与相同数量的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是熟知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下来进行：例如，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482c的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443,1970的同源比对算法；通过搜索Pearson和Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:2444,1988的相似性方法；通过这些算法的计算机化实现(在威斯康星州麦迪逊市科学路575号(575Science Dr.,Madison,WI)的遗传学计算机组(Genetics Computer Group)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过手动校准和目视检查(参见例如，Brent等人,Current Protocols inMolecular Biology[当代分子生物学实验指南],John Wiley&Sons,Inc.[约翰威利父子出版公司](Ringbou编著,2003))。
适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的两个实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，所述长度为W的短字匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中点作为种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。字命中点沿着每个序列在两个方向上扩展，远至可以增加累积比对得分。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，字命中点向各方向的延伸终止：累积比对得分从其最大获得值跌落数量X；由于一个或多个负分残基比对的累积，累积得分走向零或更低；或到达任一序列的一端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915,1989)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如，Karlin和Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787,1993)。BLAST算法提供的一种相似度量度是最小总和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN算法(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.[计算机应用生物科学],4:11-17,1988)的算法，利用PAM120权重残基表、空位长度罚分为12、空位罚分为4来确定。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已经并入GCG软件包中的GAP程序(可以从万维网以gcg.com获得)中的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.[分子生物学杂志]48:444-453,1970)算法，利用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重为16、14、12、10、8、6或4以及长度权重为1、2、3、4、5或6来确定。
除了上述序列同一性百分比之外，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一个指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽典型地与第二多肽基本上相同，例如其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或它们的补体在严格条件下彼此杂交，如下所述。两个核酸序列基本上相同的又另一个指示是可使用相同的引物来扩增序列。
术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合β-klotho的分离的抗体基本上不含特异性结合除β-klotho以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合β-klotho的分离的抗体可以对其他抗原具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学品。
术语“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG如IgG1或IgG4)。同种型还包括这些类型之一的经修饰的形式，其中已经进行了修饰以改变Fc功能，例如，增强或降低效应子功能或结合Fc受体。
如本文所使用的术语“kassoc”或“ka”意在是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所使用的术语“kdis”或“kd”意在是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所使用的，术语“KD”意在是指解离常数，其获得自kd与ka的比率(即kd/ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域良好建立的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法包括使用生物传感系统例如系统测量表面等离子体共振，或通过溶液平衡滴定法(SET)测量溶液中的亲和力。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组合物的抗体分子的制品。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
所述术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。
除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。具体地，如下详述，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res[核酸研究].19:5081,1991；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem[生物化学杂志].260:2605-2608,1985；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98,1994)。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如DNA)区段之间的功能关系。典型地，该术语是指转录调节序列与已转录序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在适当的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则所述启动子或增强子序列可操作地连接至编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调节序列与转录序列在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调控序列如增强子不需要在物理上邻接或位于极为接近这些转录调控序列增强其转录的编码序列的位置。
如本文所用，术语“优化的”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞或生物(通常为真核细胞，例如毕赤酵母属的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。优化的核苷酸序列被工程化以完全或尽可能多地保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲代”序列。本文优化的序列已被工程化以具有在哺乳动物细胞中优选的密码子。然而，本文还设想了这些序列在其他真核细胞或原核细胞中的优化表达。由优化的核苷酸序列编码的氨基酸序列也称为优化的。
所述术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另外说明，否则特定的多肽序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体。
如本文使用的，术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，比如从动物(例如，小鼠)(该动物对于人免疫球蛋白是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；从转化以表达人抗体的宿主细胞中分离的抗体(例如，来自转染瘤中)；从重组，组合的人抗体文库中分离的抗体；以及通过任何其他方式(涉及将全部或部分的人免疫球蛋白基因、序列剪接到其他DNA序列)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列的和与其相关的序列，这些序列在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)是指已引入重组表达载体的细胞。应当理解，这种术语不仅意指特定的受试者细胞，而且意指这种细胞的子代。因为某些修饰可在后代中由于突变或环境影响而发生，这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包括在如在此使用的术语“宿主细胞”范围内。
所述术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物)例如非人灵长类(例如，食蟹猴)、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出时，否则所述术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。如本文所使用的，术语“食蟹猴(cyno)”或“食蟹猴(cynomolgus)”是指食蟹猴(Macaca fascicularis)。
如本文所用，在一个实施例中，术语任何疾病或障碍(例如，FGF21相关障碍)的“治疗(treating或treatment)”是指减轻疾病或障碍(即，减缓或阻止或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数、包括不能被患者辨别的那些。在仍另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)或在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。在又另一个实施例中，“治疗(treating或treatment)”是指预防或延迟疾病或障碍的发病或发展或进展。
与本文所述适应症(包括例如FGF21相关障碍)有关的“预防”是指在具有所述恶化风险的患者中预防或减缓例如FGF21相关疾病参数恶化的任何作用，如下所述。
所述术语“载体”意指能够转运与其连接的另一多核苷酸的多核苷酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接附加的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，例如腺相关病毒载体(AAV或AAV2)，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞中后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。此类的载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常呈质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本披露旨在包括这种其他形式的表达载体如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。
如本文所使用的，“FGF21活性的调节”是指FGF21活性的提高或降低，其可以是例如，药物与FGF21多核苷酸或多肽相互作用、FGF21信号传导通路的活化和/或FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体依赖性信号传导)的活化等的结果。例如，生物活性的调节是指生物活性的提高或降低。FGF21活性可以通过以下方式来评估，包括但不限于：测定受试者的血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平；评估β-klotho和/或FGF受体(例如，FGFR-1c)的多肽水平；或评估FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体依赖性信号传导)的活化。
FGF21活性的比较还可以通过例如测量FGF21下游生物标志物的水平和测量FGF21信号传导的提高来实现。活性还可通过测量以下来评估：细胞信号传导；激酶活性；葡萄糖吸收至脂肪细胞；血液胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平波动；肝脏脂质或肝脏甘油三酯水平变化；FGF21和/或β-klotho与FGF21受体的相互作用；或FGF21受体的磷酸化。在一些实施例中，FGF21受体的磷酸化可以是酪氨酸磷酸化。在一些实施例中，FGF21活性的调节可导致FGF21相关表型的调节。
如本文所使用的，“FGF21下游生物标志物”是基因或基因产物，或者基因或基因产物的可测量标记。在一些实施例中，作为FGF21的下游标志物的基因或活性示出改变的表达水平或示出在血管组织中水平改变。在一些实施例中，在FGF21调节剂的存在下，下游标志物的活性发生改变。在一些实施例中，当用本披露的FGF21调节剂干扰FGF21时，下游标志物示出改变的表达水平。FGF21下游标志物包括但不限于葡萄糖或2-二氧-葡萄糖吸收、pERK和其他的磷酸化或乙酰化蛋白质或NAD水平。
如本文所使用的，术语“上调”是指活性或量的提高、活化或刺激。例如，在本披露的上下文中，FGF21调节剂可提高β-klotho和/或FGF21受体的活性。在一个实施例中，可以上调FGFR-1c以应答FGF21调节剂。上调还可指FGF21相关活性，例如像，降低血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；降低肝脏脂质或甘油三酯水平的能力；降低体重的能力；改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力；或导致FGF21受体磷酸化的能力；或增加FGF21下游标志物的能力。该FGF21受体可以是β-klotho和FGFR-1c。上调可以是相对于对照提高至少25％、至少50％、至少75％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少400％或至少500％。
如本文所使用的，术语“调节剂”是指一种组合物，其调节与FGF21相关障碍，例如1或2型糖尿病或代谢病症(如肥胖症)相关的一个或多个生理或生物化学事件。所述事件包括但不限于降低血液葡萄糖、胰岛素、甘油三酯或胆固醇水平的能力；降低肝脏脂质或肝脏甘油三酯水平的能力；降低体重的能力；和改善葡萄糖耐受性、能量消耗或胰岛素敏感性的能力。
FGF21蛋白
本披露提供了FGF21模拟抗体(例如，结合β-klotho的单克隆抗体)，其可诱导FGF21介导的信号传导(例如，FGF21受体介导的信号传导)，如本文所定义。在体内，FGF21的成熟形式是分子的活性形式。示例性人FGF21野生型序列具有NCBI参考序列号NP_061986.1，并且可见于授权的专利例如像US 6,716,626B1，例如，如在下文中所示(SEQ IDNO:1)。
以下示出了编码全长FGF21多肽(NCBI参考序列号NM_019113.2)的相应的mRNA序列(SEQ ID NO:2)。
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成熟FGF21序列缺乏前导序列并且还可包括本领域技术人员所理解的多肽的其他修饰，例如氨基末端(具有或不具有前导序列)和/或羧基末端的蛋白水解、更小的多肽从更大的前体上裂解、N-连接和/或O-连接的糖基化和其他翻译后修饰。成熟FGF21序列的代表性实例具有以下序列(SEQ ID NO:53，其表示全长FGF21蛋白质序列(NCBI参考序列号NP_061986.1)的氨基酸位置29-209)：
以下示出了编码成熟FGF21多肽(SEQ ID NO:53)的相应的cDNA序列(SEQ ID NO:63)：
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FGF21模拟抗体&抗原结合片段
本披露提供了特异性地结合β-klotho(例如，人β-klotho)的抗体。在一些实施例中，本披露提供了特异性地结合人和食蟹猴β-klotho的抗体。本披露的抗体包括但不限于如实例中所述分离的人单克隆抗体和Fab。
该β-klotho野生型序列具有NCBI参考序列号NP_783864.1，并且可可见于如下文献中：Xu等人(2007)J Biol Chem.[生物化学杂志]282(40):29069-72和Lin等人(2007)JBiol Chem.[生物化学杂志]282(37):27277-84。编码人β-klotho的全长cDNA具有GenBank登录号NM_175737)。蛋白质序列如下(SEQ ID NO:52)。
本披露提供了抗体和其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和/或食蟹猴β-klotho)并且能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性，其中该抗体如表1所述，例如，NOV005或NOV006。在具体的方面，特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和/或食蟹猴β-klotho)并且能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的本文所提供的抗体及其抗原结合片段不是表2中所述的抗体，例如，NOV001、NOV002、NOV003或NOV004。表2所述的抗体已描述于2016年8月2日提交的PCT国际专利申请号PCT/IB2016/054660中，该文献通过引用以其全文并入本文。
本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和/或食蟹猴β-klotho)的抗体，其中该抗体包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH结构域。本披露还提供了特异性地结合β-klotho蛋白的抗体，其中该抗体包含具有如下表1中列出的VH CDR中的任一种的氨基酸序列的VH CDR。特别地，本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和食蟹猴β-klotho)的抗体，其中该抗体包含(或可替代地，由以下组成)：一个、两个、三个或更多个VH CDR，其具有如下表1中列出的VH CDR中的任一种的氨基酸序列。
本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白的抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的VL结构域。本披露还提供了特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和食蟹猴β-klotho)的抗体，所述抗体包含具有如下表1中所列出的VL CDR中的任一种的氨基酸序列的VL CDR。特别地，本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和食蟹猴β-klotho)的抗体，所述抗体包含(或可替代地，由以下组成)：一个、两个、三个或更多个VLCDR，其具有如下表1中所列出的VL CDR中的任一种的氨基酸序列。
本披露的其他抗体包括已经突变，但是CDR区与表1中所述的序列中描绘的CDR区仍具有至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸。在一些实施例中，其包括突变氨基酸序列，其中当与表1中描述的序列中描绘的CDR区相比时，CDR区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变。
本披露还提供了核酸分子或多核苷酸，其包含编码特异性地结合β-klotho蛋白(例如，人和食蟹猴β-klotho)的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的核酸序列。此类核酸序列可以被优化以在哺乳动物细胞中表达(例如，表1示出本披露的抗体的重链和轻链的优化的核酸序列)。
表1.FGF21模拟抗体和Fab的实例
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表2：FGF21模拟抗体
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本披露的其他抗体包括如下那些：其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已突变，但是与表1中所述的序列仍具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。一些实施例包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中所述的可变区相比时，可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变，同时保留基本上相同的抗原结合活性。
本披露的其他抗体包括如下那些：其中氨基酸或编码氨基酸的核酸已突变，但是与表1中所述的序列仍具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。一些实施例包括突变氨基酸序列，其中当与表1所述序列中所述的可变区相比时，可变区中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已经突变，同时保留基本上相同的抗原结合活性。
由于这些抗体中的每一种都可以结合β-klotho，因此VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码氨基酸序列的核苷酸序列)可以是“混合且匹配的”以产生本披露的其他β-klotho结合抗体。可以使用本领域已知的结合测定(例如，ELISA和实例部分中描述的其他测定)来测试此类“混合且匹配的”β-klotho结合抗体。当这些链被混合且匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列应当用结构上相似的VH序列替代。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长重链序列应当用结构上相似的全长重链序列替代。同样，来自特定VH/VL配对的VL序列应当用结构上相似的VL序列替代。同样，来自特定全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应当用结构上相似的全长轻链序列替代。
因此，在一个方面，本披露提供了分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合区，该抗体或抗原结合区具有：包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变结构域，和包含SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变结构域，其中该抗体特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)。
在另一方面，本披露提供了(i)分离的抗体，其具有：包含SEQ ID NO:17的已优化以在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长重链，和包含SEQ ID NO:28或34的已优化以在哺乳动物细胞中表达的氨基酸序列的全长轻链；或(ii)包含其抗原结合部分的功能性蛋白。更具体地，在某些方面，本披露提供了分离的抗体或其抗原结合区，该抗体或抗原结合区包含分别包含选自SEQ ID NO:17和28；或17和34的氨基酸序列的重链和轻链。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或片段包含：含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少90％或95％同一性的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列或与其具有至少90％或95％同一性的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或片段包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或片段包含含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的VL。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或片段包含(i)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL，或(ii)含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体包含(i)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链，或(ii)含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或抗原结合片段不包含如表2所示的抗体NOV004的组合的CDR或卡巴特CDR。
如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。通常，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任何一种容易地测定，这些方案包括描述于以下的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学重要性的蛋白序列]”,第5版,Public HealthService[美国国立卫生研究院],National Institutes of Health[公共卫生事业部],Bethesda,MD[马里兰州贝塞斯达市](“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB273,927-948(“乔西亚”编号方案)，和免疫遗传学(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,TheImmunologist[免疫学家],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据卡巴特，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据乔西亚，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚二者的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基编号为大约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基编号为大约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“卡巴特”编号)。在IMGT下，可以使用程序IMGT/DomainGapAlign确定抗体的CDR区。通过组合卡巴特和乔西亚二者的CDR定义，“组合的”CDR可由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和99-108(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-39(LCDR1)、55-61(LCDR2)和94-102(LCDR3)组成。
在另一方面，本披露提供了β-klotho结合抗体，该β-klotho结合抗体包含如表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合。在具体的方面，使用卡巴特系统描绘这些CDR。在另一具体的方面，使用组合的系统描绘这些CDR。
鉴于这些抗体中的每一种都可以与β-klotho结合且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2和CDR3区提供，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列可以“混合且匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合且匹配)，但每种抗体优选地含有VHCDR1、VH CDR2和VH CDR3以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3以产生本披露的其他β-klotho结合分子。可以使用本领域已知的结合测定和实例中描述的那些结合测定(例如，ELISA、SET、结合测定)来测试此类“混合且匹配的”β-klotho结合抗体。当混合并匹配VHCDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替代为一种或多种结构上相似的CDR序列。同样，当混合并匹配VL CDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应当替代为一种或多种结构上相似的CDR序列。对于普通技术人员来说容易清楚的是，可以通过取代来自对于本披露单克隆抗体的本文所示CDR序列的具有结构相似序列的一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。除前述以外，在一个实施例中，本文所述的的抗体的抗原结合片段包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，或VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3，其中该片段结合β-klotho作为单一可变结构域。
在本披露的某些实施例中，该抗体或其抗原结合片段可具有表1中所述的Fab的重链和轻链序列。更具体地，该抗体或其抗原结合片段可具有Fab NOV005或NOV006的重链和轻链序列。
在本披露的某些实施例中，特异性地结合β-klotho的该抗体或抗原结合片段包含Fab NOV005或NOV006的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及Fab NOV005或NOV006的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3，例如，如表1所示。
在本披露的其他实施例中，特异性地结合β-klotho的该抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如通过卡巴特所定义并且如表1中所述。在本披露的仍然其他实施例中，特异性地结合β-klotho的该抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如通过乔西亚所定义并且如表1中所述。在本披露的仍然其他实施例中，特异性地结合β-klotho的该抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如通过组合的卡巴特和乔西亚所定义并且如表1中所述。在本披露的仍然其他实施例中，特异性地结合β-klotho的该抗体或抗原结合片段包含重链可变区CDR1、重链可变区CDR2、重链可变区CDR3、轻链可变区CDR1、轻链可变区CDR2和轻链可变区CDR3，如通过IMGT所定义并且如表1中所述。
在某些实施例中，本披露包括特异性地结合如表1所述的β-klotho的抗体或抗原结合片段，例如，抗体NOV005或NOV006。在优选的实施例中，结合β-klotho并活化该FGF21受体复合物的该抗体或抗原结合片段是Fab NOV005或NOV006。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
(ii)包含SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
(iii)包含SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
(iv)包含SEQ ID NO:19、31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
(v)包含SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
(vi)包含SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
(ii)包含SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
(iii)包含SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
(iv)包含SEQ ID NO:31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
(v)包含SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
(vi)包含SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)包含SEQ ID NO:6、9、10或12的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1)；
(ii)包含SEQ ID NO:7、11或13的氨基酸序列的重链CDR2(HCDR2)；
(iii)包含SEQ ID NO:8或14的氨基酸序列的重链CDR3(HCDR3)；
(iv)包含SEQ ID NO:19、31、22或25的氨基酸序列的轻链CDR1(LCDR1)；
(v)包含SEQ ID NO:20或23的氨基酸序列的轻链CDR2(LCDR2)；和
(vi)包含SEQ ID NO:21或24的氨基酸序列的轻链CDR3(LCDR3)。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中
该HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中
该HCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中
该HCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中
该HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中
(i)该HCDR1包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；或
(ii)该HCDR1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中：
该HCDR1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中：
该HCDR1包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，该HCDR2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，该HCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，该LCDR1包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，该LCDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列，并且该LCDR3包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19或31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3的VH，以及含有CDR LCDR1、LCDR2和LCDR3的VL，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的HCDR1、含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的HCDR2、含有SEQID NO:8的氨基酸序列的HCDR3、含有SEQ ID NO:19或31的氨基酸序列的LCDR1、含有SEQ IDNO:20的氨基酸序列的LCDR2和含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的LCDR3。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或片段提高了β-klotho和/或FGFR1c的活性。在具体的方面，所述抗体或其片段使β-klotho和/或FGFR1c的活性提高了至少约10％或20％，例如如通过磷酸-ERK活性测定的。在具体的方面，所述抗体或其片段使β-klotho和/或FGFR1c的活性提高了至少约30％或40％，例如如通过磷酸-ERK活性测定的。在具体的方面，所述抗体或其片段使β-klotho和/或FGFR1c的活性提高了至少约50％或60％，例如如通过磷酸-ERK活性测定的。在具体的方面，所述抗体或其片段使β-klotho和/或FGFR1c的活性提高了至少约70％或80％，例如如通过磷酸-ERK活性测定的。在具体的方面，所述抗体或其片段使β-klotho和/或FGFR1c的活性提高了至少约90％或95％，例如如通过磷酸-ERK活性测定的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或抗原结合片段结合人β-klotho蛋白，其KD小于或等于500pM或450pM，例如，如通过BIACORETM结合测定所确定的。在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或抗原结合片段结合人β-klotho蛋白，其KD小于或等于450pM或400pM，例如，如通过BIACORETM结合测定所确定的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中该抗体或抗原结合片段结合人β-klotho蛋白，其KD小于或等于10pM或20pM，例如，如通过BIACORETM结合测定所确定的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述β-klotho的表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的一个或多个氨基酸。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或多个氨基酸。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或抗原结合片段保护人β-klotho(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的一个或多个氨基酸，如通过氢-氘交换(HDx)所测定的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或抗原结合片段包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或多个氨基酸。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或片段不接触人β-klotho(SEQ ID NO:52)的残基701(Tyr)或703(Arg)。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化人FGFR1c_β-klotho受体复合物，例如，以小于或等于50nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化人FGFR1c_β-klotho受体复合物，例如，以小于或等于100nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化人FGFR1c_β-klotho受体复合物，例如，以小于或等于40nM或30nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化人FGFR1c_β-klotho受体复合物，例如，以小于或等于50nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的，并且其中该抗体或其抗原结合片段不能够活化FGFR2c-β-klotho受体复合物、FGFR3c-β-klotho受体复合物和/或FGFR4-β-klotho受体复合物。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，以小于或等于50nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，以小于或等于40nM或30nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。
在具体的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，单克隆抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho的表位并诱导FGF21受体复合物，例如，FGFR1c-β-klotho受体复合物的活性，其中所述抗体或其抗原结合片段能够活化食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，以小于或等于20nM的EC50，如通过pERK细胞测定所测量的。如本文所用，人抗体包含重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果所述抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的，则所述重链或轻链可变区或全长重链或轻链是特定种系序列的“产物”或“衍生自”特定种系。这种系统包括用感兴趣的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或用感兴趣的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择在序列中与人抗体序列最接近(即，最大的同一性％)的人种系免疫球蛋白序列，可以照此来鉴定人抗体是人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列。
作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变而含有与种系序列相比的氨基酸差异。然而，在VH或VL框架区中，选择的人抗体的氨基酸序列通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)相比时将人抗体鉴定为属于人类的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。
通常，重组人抗体在VH或VL框架区中显示出与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可以显示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。人种系免疫球蛋白基因的实例包括，但不限于如下所述的可变结构域种系片段，以及DP47和DPK9。
同源抗体
在又另一个实施例中，本披露提供了抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含与表1中所述的序列同源的氨基酸序列，并且该抗体结合β-klotho蛋白(例如，人和食蟹猴β-klotho)，并且保留了表1中所述的那些抗体的所希望的功能特性(例如，活化β-klotho/FGFR1c的受体复合物或提高其活性和/或活化FGF21或提高其一种或多种活性)。
例如，本披露提供了分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其功能性抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该重链可变结构域包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少80％、至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一的氨基酸序列；该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列至少80％、至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一的氨基酸序列；其中该抗体特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)并且诱导β-klotho的活性，并且其中该重链可变结构域不包含表2所示的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列。在本披露的某些方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过卡巴特定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过乔西亚定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过组合定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过IMGT定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如分别如表1所示。
例如，本披露提供了分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其功能性抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该重链可变结构域包含与SEQ ID NO:15的氨基酸序列至少80％、至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一的氨基酸序列；该轻链可变结构域包含与SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列至少80％、至少90％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一的氨基酸序列；其中该抗体特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)，并且其中该重链可变结构域不包含表2所示的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列。在本披露的某些方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过卡巴特定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过乔西亚定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过组合定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如如表1所示。在本披露的某些其他方面，该重链和轻链序列进一步包含如通过IMGT定义的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，例如如表1所示。
在其他实施例中，该VH和/或VL氨基酸序列可以与表1中所示的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一，其中该重链可变结构域不包含表2中所示的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列。在其他实施例中，该VH和/或VL氨基酸序列可以是同一的，除了在不超过1个、2个、3个、4个或5个氨基酸位置上具有氨基酸取代。具有与表1中所述的那些VH和VL区具有高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区的抗体可以通过以下方式获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)分别编码SEQ ID NO:10、30、50或70和SEQ ID NO:20、40、60或80的核酸分子，随后使用本文所述的功能性测定测试编码的改变的抗体的保留功能，其中该重链可变结构域不包含表2中所示的氨基酸序列，例如，SEQID NO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的氨基酸序列，例如，SEQID NO:47或57的氨基酸序列。
在其他实施例中，该全长重链和/或全长轻链氨基酸序列可以是与表1所示的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的，其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。具有与SEQ IDNO:17的全长重链和SEQ ID NO:28或34的全长轻链具有高(即，80％或更高)同一性的全长重链和全长轻链的抗体可以通过以下方式获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码此类多肽的核酸分子，随后使用本文所述的功能性测定测试编码的改变的抗体的保留功能，其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。具有与SEQ ID NO:17的全长重链和SEQ ID NO:28或34的全长轻链具有高(即，80％或更高)同一性的全长重链和全长轻链的抗体可以通过以下方式获得：诱变(例如，定点或PCR介导的诱变)编码此类多肽的核酸分子，随后使用本文所述的功能性测定测试编码的改变的抗体的保留功能，其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。
在其他实施例中，该全长重链和/或全长轻链核苷酸序列可以是与表1所示的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的，其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ IDNO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。
在其他实施例中，该重链核苷酸序列的可变区和/或轻链核苷酸序列的可变区可以是与表1所示的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的，其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。
如本文所用，两个序列之间的同一性百分比是序列共用的相同位置数量的函数(即，同一性％等于相同位置数量/位置总数x 100)，将缺口数量和每个缺口的长度考虑在内，需要引入它们以便最佳比对两个序列。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法完成，如下面的非限制性实例中所述。
另外或可替代地，本披露的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以在公共数据库中进行搜索，从而例如鉴定相关序列。例如，可以使用Altschul,等人,1990J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-10的BLAST程序(2.0版)进行此类搜索。
具有保守修饰的抗体
在某些实施例中，本披露的抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个基于本文所述的抗体或其保守修饰具有指定氨基酸序列，并且其中该抗体保留本披露的β-klotho结合抗体的所希望的功能特性。
因此，本披露提供了分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段由以下组成：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：该重链可变区CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO:6及其保守修饰组成的组；该重链可变区CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO:7及其保守修饰组成的组；该重链可变区CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO:8及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO:19和31及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO:20及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO:21及其保守修饰组成的组；并且该抗体或其抗原结合片段特异性地结合β-klotho。
因此，本披露提供了分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段由以下组成：包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：该重链可变区CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO:6、9、10和12及其保守修饰组成的组；该重链可变区CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO:7、11和13及其保守修饰组成的组；该重链可变区CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO:8和14及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR1氨基酸序列选自由SEQ ID NO:19、31、22和25及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR2氨基酸序列选自由SEQ ID NO:20和23及其保守修饰组成的组；该轻链可变区CDR3氨基酸序列选自由SEQ ID NO:21或24及其保守修饰组成的组；并且该抗体或其抗原结合片段特异性地结合β-klotho。
在一个方面，本披露提供了优化以在哺乳动物细胞中表达的分离的抗体，该抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区具有选自SEQ ID NO:15及其保守修饰的组的氨基酸序列；并且该全长轻链具有选自SEQ ID NO:26和32及其保守修饰的组的氨基酸序列；并且该抗体特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)，并且其中该重链可变区不包含表2所示的重链可变区氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的轻链可变区氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列。
在其他实施例中，本披露的抗体被优化以在哺乳动物细胞中表达并且具有全长重链序列和全长轻链序列，其中这些序列中的一个或多个基于本文所述的抗体或其保守修饰具有指定的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本披露的β-klotho结合抗体的所希望的功能特性。因此，本披露提供了优化以在哺乳动物细胞中表达的分离的抗体，该抗体由全长重链和全长轻链组成，其中该全长重链具有选自SEQ ID NO:17及其保守修饰的组的氨基酸序列；并且该全长轻链具有选自SEQ ID NO:28和34及其保守修饰的组的氨基酸序列；并且该抗体特异性地结合β-klotho(例如，人和食蟹猴β-klotho)，并且其中该重链不包含表2所示的重链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:45、56、59或61的氨基酸序列，并且该轻链不包含表2所示的轻链氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:49、58、60或62的氨基酸序列。
结合一个或多个相同的表位的抗体或者竞争结合一个或多个相同表位的抗体
本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与表1中所述的β-klotho结合抗体(例如，NOV005或NOV006)结合相同的表位。在特定的方面，此类抗体和抗原结合片段能够提高β-klotho和FGFR1c的活性。因此基于另外的抗体与本披露的其他抗体在β-klotho结合测定(例如实例中所述的那些)中竞争(例如，以统计学上显著的方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定这些另外的抗体。测试抗体抑制本披露的抗体与β-klotho蛋白结合的能力证明该测试抗体可以与该抗体竞争结合β-klotho；根据非限制性理论，此类抗体可以和与其竞争的抗体结合相同或相关(例如，结构上相似或空间上接近)的β-klotho蛋白上的的表位。在某个实施例中，与本披露的抗体结合相同的β-klotho上的表位的抗体是人单克隆抗体。可如本文所述那样制备和分离此类人单克隆抗体。如本文所使用的，在等摩尔浓度的竞争性抗体的存在下，当竞争性抗体抑制本披露的抗体或抗原结合片段的β-klotho结合超过50％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)时，该抗体“竞争”结合。在某个实施例中，与本披露的抗体结合相同的β-klotho上的表位的抗体是人源化单克隆抗体。可如本文所述那样制备和分离此类人源化单克隆抗体。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体NOV005或NOV006结合相同的表位。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体结合相同的表位，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体结合相同的表位，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了与β-klotho结合抗体结合相同的表位的抗体，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其结合与β-klotho结合抗体NOV005或NOV006重叠的表位。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其结合与β-klotho结合抗体重叠的表位，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其结合与β-klotho结合抗体重叠的表位，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其结合与β-klotho结合抗体重叠的表位，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265中的一个或多个氨基酸。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ IDNO:52)的残基536-550中的一个或多个氨基酸。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基834-857中的一个或多个氨基酸。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基959-986中的一个或多个氨基酸。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的一个或多个氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的两个或更多个氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的三个或更多个氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含来自以下区段的氨基酸残基中的每一个的至少一个氨基酸残基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的246-265、536-550、834-857和959-986。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的一个或多个表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670中的一个或多个氨基酸。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的一个或多个表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基696-700中的一个或多个氨基酸。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的一个或多个表位的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-689中的一个或多个氨基酸。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的一个或多个表位(例如，不连续表位)的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或两个或三个或四个或五个或更多个氨基酸。在某些方面，本文所提供的是结合β-klotho的两个或更多个表位(例如，不连续表位)的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或多个氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的三个或更多个表位(例如，不连续表位)的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或多个氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的三个或更多个表位(例如，不连续表位)的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的氨基酸。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的三个或更多个表位(例如，不连续表位)的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述表位包含来自以下范围中的每一个的氨基酸残基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的646-670、696-700和646-689。
在特定的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其如通过氢-氘交换(HDx)所测定的保护β-klotho(SEQ ID NO:52)的以下肽中的一个、两个、三个、四个、五个或更多个：氨基酸残基245-266、246-265、343-349、344-349、421-429、488-498、509-524、536-550、568-576、646-669、646-670、696-700、773-804、834-857和959-986。
在特定的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，抗体能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其如通过氢-氘交换(HDx)所测定的保护β-klotho(SEQ ID NO:52)的以下肽：氨基酸残基246-265、536-550、834-857和959-986。
在特定的方面，本文所提供的是分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其如通过氢-氘交换(HDx)所测定的保护β-klotho(SEQ ID NO:52)的以下肽：氨基酸残基245-266、246-265、343-349、344-349、421-429、488-498、509-524、536-550、568-576、646-669、646-670、696-700、773-804、834-857和959-986。
在某些方面，本文所提供的是提高β-klotho和FGFR1c的活性的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段不接触人β-klotho(SEQ ID NO:52)的残基701(Tyr)或703(Arg)。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基536-550中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基834-857中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基959-986中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的两个或更多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的三个或更多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基246-265、536-550、834-857和959-986中的氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触来自以下区段的氨基酸残基中的每一个的至少一个氨基酸残基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的246-265、536-550、834-857和959-986，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ IDNO:52)的残基696-700中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-689中的一个或多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。
在特定的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的残基646-670、696-700和646-689中的一个或两个或三个或四个或五个或更多个氨基酸，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在某一方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触来自以下区段的氨基酸残基中的每一个的一个或多个氨基酸残基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的646-670、696-700和646-689，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触来自以下区段的氨基酸残基中的每一个的一个或多个氨基酸残基：β-klotho序列(SEQ ID NO:52)的646-670、696-700和646-689，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。在具体的方面，本文所提供的是结合β-klotho的分离的抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段接触β-klotho序列(SEQ IDNO:52)的氨基酸残基646-670、696-700和646-689，例如，如通过X射线结晶学、氢-氘交换测定或扫描诱变所测定的。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与抗体NOV005或NOV006竞争结合β-klotho。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体竞争结合β-klotho，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体竞争结合β-klotho，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在特定的方面，本披露提供了抗体(例如，能够活化β-klotho/FGFR1c受体复合物或提高其活性的抗体)，其与β-klotho结合抗体竞争结合β-klotho，该β-klotho结合抗体包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
工程化和修饰的抗体
本披露的抗体(例如，NOV005或NOV006)还可以使用具有一种或多种本文所示的VH和/或VL序列的抗体作为起始材料来制备，以将修饰的抗体工程化，该修饰的抗体可以具有与起始抗体相比改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个残基将抗体工程化。另外或可替代地，可以通过修饰一个或多个恒定区内的残基将抗体工程化，例如从而改变抗体的一个或多个效应子功能。
可以进行的一种可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，CDR内的氨基酸序列在各个抗体之间比CDR外部的序列更加多样化。因为CDR序列与大多数抗体-抗原相互作用有关，所以可以通过构建表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的特性的重组抗体，所述表达载体包含被移植在来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上的来自所述特定天然存在的抗体的CDR序列(参见例如，Riechmann,L.等人,1998Nature[自然]332:323-327；Jones,P.等人,1986Nature[自然]321:522-525；Queen,C.等人,1989Proc.Natl.Acad.,U.S.A.[美国国家科学院院刊]86:10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。
因此，本披露的另一实施例涉及分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含：具有选自表1所示的HCDR1序列的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自表1所示的HCDR2序列的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自表1所示的HCDR3序列的氨基酸序列的CDR3序列；并且该抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区具有：具有选自表1所示的LCDR1序列的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自表1所示的LCDR2序列的氨基酸序列的CDR2序列；和由选自表1所示的LCDR3序列的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，还可含有来自这些抗体的不同框架序列。
因此，本披露的另一实施例涉及分离的抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含重链可变区，该重链可变区包含：含有选自由SEQ ID NO:6和9组成的组的氨基酸序列的CDR1序列；含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR2序列；含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3序列；并且该抗体或抗原结合片段包含轻链可变区，该轻链可变区具有：包含选自由SEQ ID NO:19和31组成的组的氨基酸序列的CDR1序列；包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR2序列；和包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，还可含有来自这些抗体的不同框架序列。
此类框架序列可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开参考文献获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(可从万维网以mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)中找到，以及在Kabat,E.A.,等人,1991Sequences of Proteins of Immunological Interest[免疫学相关蛋白质序列],第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242；Tomlinson,I.M.等人,1992J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]227:776-798；和Cox,J.P.L.等人,1994Eur.J Immunol.[欧洲免疫学杂志]24:827-836中找到；将其各自的内容通过引用公开并入本文中。
可用于本披露的抗体的框架序列的实例是与本披露的所选择的抗体所使用的框架序列结构相似的那些序列，例如，本披露的单克隆抗体所使用的共有序列和/或框架序列。可以将VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3序列以及VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3序列移植到框架区上，所述框架区具有与框架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的序列相同的序列，或可以将CDR序列移植到与种系序列相比含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现在某些情况下使框架区内的残基突变以维持或增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，Queen等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370)。可以用作支架来在其上构建本文所述的抗体或抗原结合片段的框架包括但不限于VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2和Vk2。另外的框架是本领域已知的并且可见于例如，万维网vBase数据库，vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&MMN_position＝1:1。
因此，本披露的实施例涉及分离的β-klotho结合抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段包含重链可变区(该重链可变区包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或在此类序列的框架区具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列)并且进一步包含轻链可变区(该轻链可变区具有选自由SEQ ID NO:26或32组成的组的氨基酸序列，或在此类序列的框架区具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列)，其中该重链可变区不包含表2所示的重链可变区氨基酸序列，例如，SEQ IDNO:43或55的氨基酸序列，并且该轻链可变区不包含表2所示的轻链可变区氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:47或57的氨基酸序列。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，从而改善感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)，称为“亲和力成熟”。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入一个或多个突变，并且可以在如本文所述且在实例中提供的体外或体内测定中评估对抗体结合或其他感兴趣的功能特性的影响。可以引入保守修饰(如上所讨论的)。所述突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基被改变。
已知某些氨基酸序列基序经历翻译后修饰(PTM)例如糖基化(即，NxS/T，x为任意但非P)、游离半胱氨酸的氧化、脱酰胺基作用(例如NG)或异构化作用(例如DG)。如果存在于CDR区，通过定点诱变以理想地除去那些基序从而提高产物均匀性。
亲和力成熟的过程在本领域有很好的描述。在许多展示系统中，噬菌体展示(Smith GP(1985)Science[科学]228:1315-1317)和在真核细胞例如酵母上展示(Boder ET和Wittrup KD(1997)Nature Biotechnology[自然生物技术]15:553-557)似乎是用于选择抗体-抗原相互作用的最常见的应用系统。这些展示系统的优点是它们适用于范围较广的抗原，并且可以容易地调节选择严格性。在噬菌体展示中，可以展示scFv或Fab片段并且在酵母展示中可以展示另外的全长IgG。那些通常应用的方法允许从具有大于10E7的多样性的较大文库中选择所希望的抗体变体。具有较小多样性的文库，例如10E3，可以通过微表达和ELISA来筛选。
可以例如通过易错PCR(Cadwell RC和Joyce GF,(1994)Mutagenic PCR.[诱变PCR]PCR Methods Appl.[PCR方法应用]3:S136-S140)产生非靶标或任意抗体变体文库，并且非靶标或任意抗体变体文库提供非常简单，但是有时有限制的方法。另一策略是抗体候选物的CDR定向多样化。可以使用例如变性的寡核苷酸(Thompson J等人(1996)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]256:77-88)三核苷酸诱变(TRIM)(Kayushin AL等人(1996)Nucleic Acids Res.[核酸研究]24:3748-3755)或任何其他本领域已知的方法特异性地靶向一个或多个CDR中的一个或多个位置。
因此，在另一实施例中，本披露提供了分离的β-klotho结合抗体或其抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段由重链可变区组成，该重链可变区具有由选自具有SEQ ID NO:6和9的组的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6和9相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列或与SEQID NO:7相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VHCDR2区；具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VH CDR3区；具有选自由SEQ ID NO:19或31组成的组的氨基酸序列或与SEQ ID NO:19或31相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与SEQID NO:20相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与SEQ ID NO:21相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
移植抗原结合结构域至可替代的框架或支架中
可以使用多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要所得多肽包含特异性结合β-klotho的至少一个结合区即可。此类框架或支架包括5种主要独特型的人免疫球蛋白或其片段，并且包括其他动物物种的免疫球蛋白，优选具有人源化方面。就这点而言，单个重链抗体如在骆驼科动物中鉴定的那些抗体是特别令人感兴趣的。本领域技术人员将继续发现和开发新的框架、支架和片段。
在一个方面，本披露涉及使用非免疫球蛋白支架生成基于非免疫球蛋白的抗体，在所述非免疫球蛋白支架上可以移植本披露的CDR。可以使用已知的或未来的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对靶β-klotho蛋白有特异性的结合区即可。已知的非免疫球蛋白框架或支架包括但不限于纤连蛋白(化合物治疗剂公司(Compound Therapeutics,Inc.),马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham))、锚蛋白(分子配偶体公司(Molecular PartnersAG),瑞士苏黎世(Zurich))、结构域抗体(Domantis,Ltd.,马萨诸塞州坎布里奇(Cambridge),和Ablynx nv,比利时Zwijnaarde)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG,德国弗赖辛(Freising))、小型模块化免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.,华盛顿州西雅图(Seattle))、maxybody(Avidia,Inc.,加利福尼亚州山景城(Mountain View))、蛋白质A(亲合体公司(Affibody AG),瑞典)和affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil ProteinsGmbH,德国哈雷(Halle))。
纤连蛋白支架基于纤连蛋白III型结构域(例如，III型纤连蛋白的第十个模块(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布在两个β片层之间的7或8个β链，它们自身彼此包裹以形成蛋白质的核心且还含有将β链彼此连接且暴露于溶剂中的环(类似于CDR)。在β片层夹心的每个边缘处存在至少三个这样的环，其中所述边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见US 6,818,418)。这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白，但整体折叠与最小功能性抗体片段(重链可变区)的折叠密切相关，所述最小功能性抗体片段包含骆驼和美洲驼IgG中的完整抗原识别单元。由于这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗原结合特性，其在性质和亲和力上与抗体的那些抗原结合特性相似。这些支架可用于体外环随机化和改组策略，其类似于体内抗体亲和力成熟的过程。这些基于纤连蛋白的分子可以用作支架，其中可以使用标准克隆技术用本披露的CDR替代分子的环区。
锚蛋白技术基于使用具有锚蛋白衍生的重复模块的蛋白质作为支架，该支架用于承载可用于结合不同的靶标的可变区。锚蛋白重复模块是33个氨基酸多肽，其由两个反平行的α-螺旋和β-转角组成。可变区的结合主要通过使用核糖体展示来优化。
Avimer衍生自含有天然A结构域的蛋白质，如LRP-1。这些结构域天然地用于蛋白质间相互作用，并且在人类中超过250种蛋白质在结构上基于A结构域。Avimer由经由氨基酸接头连接的许多不同的“A结构域”单体(2-10)组成。可以使用例如美国专利申请公开号20040175756、20050053973、20050048512和20060008844中描述的方法产生可与靶抗原结合的Avimer。
亲合体(affibody)亲和配体是由基于蛋白质A的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束组成的小而简单的蛋白质。蛋白A是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的表面蛋白。该支架结构域由58个氨基酸组成，其中13个随机化以生成具有大量配体变体的亲合体文库(参见例如，US 5,831,012)。亲合体分子类似抗体，其分子量为6kDa，而抗体的分子量为150kDa。尽管其尺寸小，但是亲合体分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
Anticalin是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们衍生自脂质运载蛋白，脂质运载蛋白是一种广泛分布的小而健壮的蛋白质，其通常参与化学敏感或不溶性化合物的生理运输或储存。几种天然脂质运载蛋白存在于人体组织或体液中。蛋白质结构让人联想到免疫球蛋白，其中高变环在刚性框架的顶部。然而，与抗体或其重组片段相反，脂质运载蛋白由仅略微大于单个免疫球蛋白结构域的具有160至180个氨基酸残基的单个多肽链组成。构成结合口袋的四个环的组显示出明显的结构可塑性并且容许各种侧链。因此，结合位点可以在专有过程中重新成形，以便以高亲和力和特异性识别不同形状的规定靶分子。脂质运载蛋白家族的一种蛋白质，欧洲粉蝶的后胆色素结合蛋白(BBP)已被用于通过诱变四个环的组来产生anticalin。描述anticalin的专利申请的一个实例是PCT公开号WO199916873。
Affilin分子是小的非免疫球蛋白，其针对对于蛋白质和小分子的特定亲和力而设计。可以从两个文库中非常快速地选择新的affilin分子，每个文库基于不同的人源支架蛋白。Affilin分子不显示与免疫球蛋白的任何结构同源性。目前，使用两种affilin支架，其中一种是γ晶体，即人结构性眼晶状体蛋白质，而另一种是“泛素”超家族蛋白质。两种人支架都非常小，显示出高温稳定性并且几乎耐受pH变化和变性剂。这种高稳定性主要是由于蛋白质的扩大的β片层结构。WO 200104144中描述了γ晶体衍生蛋白的实例，并且WO2004106368中描述了“泛素类”蛋白质的实例。
蛋白质表位模拟物(PEM)是中等大小的环状肽类分子(MW 1-2kDa)，其模拟蛋白质的β-发夹二级结构，它是参与蛋白质间相互作用的主要二级结构。
本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白的完全人抗体。在某些方面，与嵌合或人源化抗体相比，当施与人受试者时，本披露的人β-klotho结合抗体进一步具有降低的抗原性。
骆驼科动物抗体
从包括新的世界成员如美洲驼物种(Lama paccos、大羊驼和瘦驼)在内的骆驼和单峰骆驼(双峰骆驼和Calelus dromaderius)家族成员获得的抗体蛋白质已经关于大小、结构复杂性和对于人类受试者的抗原性进行了表征。来自自然界中发现的该哺乳动物家族的某些IgG抗体缺乏轻链，因此在结构上不同于来自其他动物的抗体的具有两条重链和两条轻链的典型四链四级结构。参见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的WO 94/04678)。
通过基因工程化获得骆驼科动物抗体的区域(它是被鉴定为VHH的小的单个可变结构域)以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，从而产生称为“骆驼科动物纳米抗体”的低分子量抗体衍生蛋白。参见授权于1998年6月2日的美国专利号5,759,808；还参见Stijlemans,B.等人,2004J Biol Chem[生物化学杂志]279:1256-1261；Dumoulin,M.等人,2003Nature[自然]424:783-788；Pleschberger,M.等人,2003Bioconjugate Chem[生物缀合化学]14:440-448；Cortez-Retamozo,V.等人,2002Int J Cancer[国际癌症杂志]89:456-62；和Lauwereys,M.等人,1998EMBO J[欧洲分子生物学组织杂志]17:3512-3520。骆驼科动物抗体和抗体片段的工程化文库可例如从比利时根特(Ghent)的Ablynx公司商购获得。与非人来源的其他抗体一样，可以重组改变骆驼科动物抗体的氨基酸序列以获得更接近地类似于人序列的序列，即纳米抗体可以是“人源化的”。因此，可以进一步降低骆驼科动物抗体对人的天然低抗原性。
骆驼科动物纳米抗体的分子量为人IgG分子的约十分之一，并且该蛋白质的物理直径仅为几纳米。小尺寸的一个结果是骆驼科动物纳米抗体结合抗原位点的能力，所述抗原位点对于较大的抗体蛋白质是功能上不可见的，即，骆驼科动物纳米抗体可用作检测对于使用经典免疫学技术而言隐蔽的抗原的试剂，以及可用作可能的治疗剂。因此，小尺寸的又另一个结果是骆驼科动物纳米抗体可以由于结合靶蛋白的沟槽或狭窄裂缝中的特异性位点而抑制，因此可以具有与经典抗体相比更接近地类似于经典低分子量药物的功能的能力。
低分子量和紧凑的尺寸还导致骆驼科动物纳米抗体极其热稳定、对极端pH和蛋白水解消化稳定，并且抗原性差。另一个结果是骆驼科动物纳米抗体容易从循环系统移动到组织中，甚至穿过血脑屏障并且可以治疗影响神经组织的障碍。纳米抗体还可以促进跨越血脑屏障的药物转运。参见2004年8月19日公开的美国专利申请20040161738。这些特征与对人的低抗原性相结合显示了巨大的治疗潜力。此外，这些分子可以在原核细胞例如大肠杆菌中完全表达，并且表达为具有噬菌体的融合蛋白并且是功能性的。
因此，本披露的特征是对β-klotho(例如人β-klotho)具有特异性亲和力的骆驼科动物抗体或纳米抗体。在本文的某些实施例中，骆驼科动物抗体或纳米抗体在骆驼科动物中天然产生，即，在使用针对其他抗体的本文所述的技术用β-klotho或其肽片段免疫后，由骆驼科动物产生。可替代地，β-klotho结合骆驼科动物纳米抗体被工程化，即如本文实例中所述通过以β-klotho为靶标使用淘选程序，例如从展现出适当诱变的骆驼科动物纳米抗体蛋白质的噬菌体文库中选择产生。通过基因工程可以进一步定制工程化纳米抗体，以在受体受试者中具有45分钟至两周的半衰期。在一个具体实施例中，骆驼科动物抗体或纳米抗体通过将本披露的人抗体的重链或轻链的CDR序列移植到纳米抗体或单结构域抗体框架序列中而获得，如例如PCT/EP93/02214中所述。
双特异性分子和多价抗体
在另一方面，本披露的特征在于双特异性或多特异性分子，其包含本披露的β-klotho结合抗体或其片段，例如，抗体NOV005或NOV006。本披露的抗体或其抗原结合区可以衍生化或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)，以生成结合少两个不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上，本披露的抗体可以衍生化或连接至多于一种的其他功能分子，以生成结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；此类多特异性分子也旨在由本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为了产生本披露的双特异性分子，本披露的抗体可以功能性地连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或其他方式)至一种或多种其他结合分子，如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。
因此，本披露包括双特异性分子，其包含对β-klotho的至少一种第一结合特异性和对第二靶表位的第二结合特异性。例如，第二靶表位是不同于第一靶表位的β-klotho的另一表位。
另外，对于双特异性分子是多特异性的本披露，除了第一和第二靶表位之外，所述分子还可以包含第三结合特异性。
在一个方面，本披露的双特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段的结合特异性，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体也可以是轻链或重链二聚体或其任何最小片段，如Ladner等人的美国专利号4,946,778中所述的Fv或单链构建体。
双抗体是二价双特异性分子，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，通过接头连接，所述接头太短而不允许在同一链上的两个结构域之间配对。VH和VL结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:6444-6448；Poljak等人,1994Structure[结构]2:1121-1123)。可以通过在相同细胞内表达具有结构VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL构型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)的两条多肽链来产生双抗体。它们中的大多数可以在细菌中以可溶性形式表达。单链双抗体(scDb)通过将两个形成双抗体的多肽链与约15个氨基酸残基的接头连接而产生(参见Holliger和Winter,1997CancerImmunol.Immunother.[癌症免疫学，免疫疗法],45(3-4):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology[免疫技术],2(1):21-36)。scDb可以在细菌中以可溶的活性单体形式表达(参见Holliger和Winter,1997Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学，免疫疗法],45(34):128-30；Wu等人,1996Immunotechnology[免疫技术],2(1):21-36；Pluckthun和Pack,1997Immunotechnology[免疫技术],3(2):83-105；Ridgway等人,1996ProteinEng.[蛋白质工程],9(7):617-21)。双抗体可以与Fc融合以生成“二-双抗体”(参见Lu等人,2004J.Biol.Chem.[生物化学杂志],279(4):2856-65)。
可用于本披露的双特异性分子的其他抗体是鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。
双特异性分子可以通过使用本领域已知的方法缀合组分结合特异性来制备。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以单独生成，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白质A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等人,1984J.Exp.Med.[实验医学杂志]160:1686；Liu,MA等人,1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:8648)。其他方法包括Paulus,1985Behring Ins.Mitt.[贝林研究所通讯]第78期,118-132；Brennan等人,1985Science[科学]229:81-83以及Glennie等人,1987J.Immunol.[免疫学杂志]139:2367-2375中描述的那些方法。缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(罗克福德(Rockford),伊利诺伊州)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以通过两条重链的C-末端铰链区的巯基键合而缀合。在具体实施例中，铰链区被修饰为例如在缀合之前含有奇数个巯基残基。
可替代地，两种结合特异性可以在相同载体中编码，并在相同宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，该方法特别有用。本披露的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203、美国专利号5,455,030、美国专利号4,881,175、美国专利号5,132,405、美国专利号5,091,513、美国专利号5,476,786、美国专利号5,013,653、美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858。
双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来证实。这些测定中的每一种通常通过使用对感兴趣的复合物有特异性的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白质-抗体复合物的存在。
在另一方面，本披露提供了多价化合物，其包含本披露的结合β-klotho的抗体的至少两个相同的或不同的抗原结合部分。抗原结合部分可以经由蛋白质融合或者共价或非共价连接而连接在一起。可替代地，已经描述了双特异性分子的连接方法。可以例如通过本披露的抗体与结合本披露的抗体的恒定区，例如Fc或铰链区的抗体的交联抗体来获得四价化合物。
三聚结构域描述于例如Borean专利EP 1 012 280B1中。五聚模块描述于例如PCT/EP97/05897中。
具有延长的半衰期的抗体
本披露提供了特异性地结合β-klotho蛋白的抗体(例如NOV005或NOV006)，其在体内具有延长的半衰期。
许多因素可以影响蛋白质在体内的半衰期。例如，肾过滤、肝代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性应答(例如通过抗体中和蛋白质和通过巨噬细胞和树突细胞摄取)。可以使用多种策略来延长本披露的抗体的半衰期。例如，通过与聚乙二醇(PEG)、reCODEPEG、抗体支架、聚唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体和碳水化合物屏蔽的化学连接；通过与结合血清蛋白(如白蛋白、IgG、FcRn)的蛋白质的基因融合和转移；通过与结合血清蛋白的其他结合部分(如纳米抗体、Fab、DARPin、avimer、亲合体和anticalin)偶联(遗传地或化学地)；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合蛋白和Fc的基因融合；或通过掺入纳米载体、缓释配制品或医疗装置中。
为了延长体内抗体的血清循环，可以通过PEG与抗体的N-末端或C-末端的位点特异性缀合或经由赖氨酸残基上存在的ε-氨基，将惰性聚合物分子(如高分子量PEG)附接至具有或不具有多功能接头的抗体或其片段。为了使抗体聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团附接至该抗体或抗体片段的条件下使该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过酰化反应或烷基化反应采用反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。将使用导致最小生物活性损失的直链或支链聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱法密切监测缀合程度，以确保PEG分子与抗体的适当缀合。可以通过尺寸排阻或通过离子交换色谱法将未反应的PEG与抗体-PEG缀合物分离。可以使用本领域技术人员公知的方法，例如通过本文所述的免疫测定，测试PEG衍生化抗体的结合活性以及体内效果。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本披露的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
其他修饰的聚乙二醇化技术包括重构化学正交定向工程技术(ReCODE PEG)，其经由包含tRNA合成酶和tRNA的重构系统将化学上指定的侧链掺入生物合成蛋白中。该技术能够将超过30个新氨基酸掺入大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中的生物合成蛋白中。tRNA在琥珀密码子所定位的任何位置掺入非天然氨基酸，从而将琥珀从终止密码子转换成发出掺入化学上指定的氨基酸的信号的密码子。
重组聚乙二醇化技术(rPEG)也可用于血清半衰期延长。该技术一般包括将300-600个氨基酸非结构化蛋白质尾部与现有的药物蛋白质基因融合。因为此类非结构化蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，所以蛋白质的血清半衰期大大增加。与需要化学缀合和再纯化的传统PEG化相反，所述制备过程大大简化并且产物是均匀的。
聚唾液酸化是另一种技术，它利用天然聚合物聚唾液酸(PSA)来延长活性寿命和提高治疗性肽和蛋白质的稳定性。PSA是唾液酸的聚合物(一种糖)。当用于蛋白质和治疗性肽药物递送时，聚唾液酸在缀合时提供保护性微环境。这增加了治疗性蛋白质在循环中的活性寿命并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物天然存在于人体中。它被某些细菌采用，这些细菌已经进化了数百万年以用它来包被其细胞壁。然后，这些天然的聚唾液酸化细菌凭借分子模拟能够阻止身体的防御系统。PSA-大自然的终极秘密技术，可以容易地大量产自这种细菌并具有预定的物理特征。即使与蛋白质偶联，细菌PSA也是完全非免疫原性的，因为它在化学上与人体中的PSA相同。
另一种技术包括使用与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物。HES是一种衍生自蜡质玉米淀粉的修饰天然聚合物，并可以通过人体的酶代谢。通常施与HES溶液以替代缺乏的血液体积并改善血液的流变学特性。抗体的Hes化能够通过增加分子的稳定性以及通过降低肾清除率来延长循环半衰期，从而导致生物活性增加。通过改变不同的参数如HES的分子量，可以定制多种HES抗体缀合物。
还可以生成具有增加的体内半衰期的抗体，其将一个或多个氨基酸修饰(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选Fc或铰链Fc结构域片段)。参见，例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利号6,277,375。
此外，抗体可以与白蛋白(例如人血清白蛋白；HSA)缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或在体内具有更长的半衰期。这些技术是本领域中公知的，参见例如，国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622。此外，在上述双特异性抗体的背景中，可以这样设计抗体的特异性，使得抗体的一个结合结构域结合FGF21，而抗体的第二结合结构域结合血清白蛋白，优选HSA。
增加半衰期的策略尤其可用于纳米抗体、基于纤连蛋白的结合剂以及需要增加体内半衰期的其他抗体或蛋白质。
抗体缀合物
本披露提供了与β-klotho蛋白特异性结合的抗体或其片段，该β-klotho蛋白重组融合于或化学缀合(包括共价和非共价缀合)至异源蛋白或多肽(或其片段，优选地至至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白。特别地，本披露提供了融合蛋白，其包含本文所述的抗体(例如，NOV005或NOV006)的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)，和异源蛋白、多肽或肽。将蛋白质、多肽或肽与抗体或抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:10535-10539；Zheng等人,1995,J.Immunol.[免疫学杂志]154:5590-5600；和Vil等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术生成另外的融合蛋白。可采用DNA改组来改变本披露的抗体或其片段的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的抗体或其片段)。通常参见，美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；Patten等人,1997,Curr.OpinionBiotechnol.[当前生物技术观点]8:724-33；Harayama,1998,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]16(2):76-82；Hansson等人,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:265-76；以及Lorenzo和Blasco,1998,Biotechniques[生物技术]24(2):308-313(这些专利和出版物中的每一篇均通过引用以其全文特此并入)。抗体或其片段或编码的抗体或其片段可以通过在重组之前通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变。编码特异性结合β-klotho蛋白的抗体或其片段的多核苷酸可以与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，抗体或其片段可以与标记序列例如肽融合以促进纯化。在优选的实施例中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽(SEQ ID NO:64)，例如pQE载体中提供的标签(凯杰公司(QIAGEN,Inc.)，伊顿大街(Eton Avenue)9259号，加利福尼亚州查茨沃思(Chatsworth)，91311)等，其中许多是商购可得的。如Gentz等人,1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:821-824中所述，例如六组氨酸(SEQ ID NO:64)为融合蛋白的纯化提供了方便。可用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell[细胞]37:767)的血凝素(“HA”)标签和“flag”标签。
在其他实施例中，本披露的抗体或其片段缀合至诊断剂或可检测剂。这种抗体可用于监测或预后疾病或病症的发作、发展、进展和/或严重程度，其作为临床试验程序(如确定特定疗法的效果)的一部分。这种诊断和检测可以通过将抗体与可检测物质偶联来实现，该可检测物质包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光材料，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发光材料，例如但不限于荧光素酶、荧光素和水母素；放射性物质，例如但不限于碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本披露进一步包括与治疗部分缀合的抗体或其片段的用途。抗体或其片段可以与治疗部分如细胞毒素，例如细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子(例如α-发射体)缀合。细胞毒素剂或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何药物。
此外，抗体或其片段可以与调节给定生物应答的治疗部分或药物部分缀合。治疗部分或药物部分不应解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所期望生物活性的蛋白质、肽或多肽。这种蛋白质可包括例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原活化物、凋亡剂、抗血管生成剂；或生物应答调节剂如淋巴因子。
此外，抗体可以与治疗部分如放射性金属离子(如α-发射体，如213Bi)或用于将放射性金属离子(包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)与多肽缀合的大环螯合剂缀合。在某些实施例中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)，其可以经由接头分子连接至抗体。此类接头分子是本领域公知的，并且描述于Denardo等人,1998Clin Cancer Res.[临床癌症研究]4(10):2483-90；Peterson等人,1999,Bioconjug.Chem.[生物缀合化学]10(4):553-7；和Zimmerman等人,1999,Nucl.Med.Biol.[核医学和生物学]26(8):943-50，每一篇文献均通过引用以其全文并入。
用于将治疗部分与抗体缀合的技术是公知的，参见例如，Arnon等人,“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy[癌症疗法中用于药物免疫靶向的单克隆抗体]”,在Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy[单克隆抗体和癌症疗法],Reisfeld等人,(编著),第243-56页(艾伦丽思出版社公司(Alan R.Liss,Inc.)1985)中；Hellstrom等人,“Antibodies For Drug Delivery[用于药物递送的抗体]”,在Controlled Drug Delivery[药物控制释放](第2版)、Robinson等人(编著),第623-53页(马塞尔德克尔出版社公司(Marcel Dekker,Inc.)1987)中；Thorpe,“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review[癌症疗法中细胞毒性剂的抗体载体：综述]”,在Monoclonal Antibodies[单克隆抗体]84:Biological AndClinical Applications[生物和临床应用]、Pinchera等人(编著),第475-506页(1985)中；“Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy[放射标记的抗体在癌症疗法中的治疗用途的未来前景]”,在Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy[用于癌症检测和治疗的单克隆抗体],Baldwin等人(编著),第303-16页(Academic Press[学术出版社]1985)中以及Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.[免疫学综述]62:119-58。
抗体也可以附接至固体支持物，这尤其科用于免疫测定或靶抗原的纯化。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
产生抗体的方法
编码抗体的核酸
本披露提供了基本上纯化的核酸分子，其编码包含上述β-klotho结合抗体链的区段或结构域的多肽。本披露的一些核酸包含编码SEQ ID NO:15所示的重链可变区的核苷酸序列，和/或编码SEQ ID NO:26或32所示的轻链可变区的核苷酸序列。在具体的方面，本文所提供的核酸分子是在表1中鉴定的那些，例如，包含编码VH的SEQ ID NO:16、36或38的序列的核酸分子或包含编码VL的SEQ ID NO:27、54、33或40的序列的核酸分子。本披露的一些其他的核酸分子包含核苷酸序列，该核苷酸序列与表1中鉴定的那些的核苷酸序列是基本上同一的(例如，至少65％、80％、95％或99％)，例如，包含编码VH的SEQ ID NO:16、36或38的序列的核酸分子，或包含编码VL的SEQ ID NO:27、54、33或40的序列的核酸分子。当从适当的表达载体表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能够显示出FGF21抗原结合能力。
本披露还提供的是多核苷酸，其编码本文所示的(例如，表1所示的那些)β-klotho结合抗体的重链和/或轻链的全部或基本上全部可变区序列。在具体的方面，本披露提供了多核苷酸，其编码β-klotho结合抗体NOV005的全部或基本上全部VH和/或VL。在具体的方面，本披露提供了多核苷酸，其编码β-klotho结合抗体NOV005的全部或基本上全部重链和/或轻链。在具体的方面，本披露提供了多核苷酸，其编码β-klotho结合抗体NOV006的全部或基本上全部VH和/或VL。在具体的方面，本披露提供了多核苷酸，其编码β-klotho结合抗体NOV006的全部或基本上全部重链和/或轻链。
由于密码的简并性，多种核酸序列将编码免疫球蛋白氨基酸序列中的每一种。例如，SEQ ID NO:16和36是两个核酸序列，其编码NOV005的VH，并且SEQ ID NO:27和54是两个核酸序列，其编码NOV005的VL。
本披露的核酸分子可编码抗体的可变区和恒定区。本披露的一些核酸序列包含编码重链序列的核苷酸，该重链序列与SEQ ID NO:17所示的重链序列是基本上同一的(例如，至少80％、90％或99％)。一些其他的核酸序列包含编码轻链序列的核苷酸，该轻链序列与SEQ ID NO:28或34所示的轻链序列是基本上同一的(例如，至少80％、90％或99％)。在具体的方面，本文所提供的核酸分子是在表1中鉴定的那些，例如，包含编码重链的SEQ ID NO:18、37、30或39的序列的核酸分子，或包含编码轻链的SEQ ID NO:29、51、35或41的序列的核酸分子。
在具体的方面，本文所提供的是包含编码VH的SEQ ID NO:16的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VH的SEQ ID NO:36的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VH的SEQ ID NO:38的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VL的SEQ ID NO:27的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VL的SEQ ID NO:54的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VL的SEQ ID NO:29的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码VL的SEQ ID NO:51的核酸序列的多核苷酸。
在具体的方面，本文所提供的是包含编码重链的SEQ ID NO:18的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码重链的SEQ ID NO:37的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码重链的SEQ ID NO:30的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码重链的SEQ ID NO:39的核酸序列的多核苷酸。
在具体的方面，本文所提供的是包含编码轻链的SEQ ID NO:29的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码轻链的SEQ ID NO:51的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码轻链的SEQ ID NO:35的核酸序列的多核苷酸。在具体的方面，本文所提供的是包含编码轻链的SEQ ID NO:41的核酸序列的多核苷酸。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或通过PCR诱变编码β-klotho结合抗体或其结合片段的现有序列(例如，如下文实例中所述的序列)来产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法完成，例如Narang等人,1979,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:90的磷酸三酯方法；Brown等人,Meth.Enzymol.[酶学方法]68:109,1979的磷酸二酯方法；Beaucage等人,Tetra.Lett.[四面体快报],22:1859,1981的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体支持方法。通过PCR向多核苷酸序列引入突变可以如以下文献中所述进行，例如PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification[PCR技术：DNA扩增的原理和应用],H.A.Erlich(编辑),Freeman Press[弗里曼出版社],纽约,纽约州,1992；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications[PCR方案：方法和应用指南],Innis等人,(编辑),Academic Press[学术出版社],San Diego[圣地亚哥],加利福尼亚州,1990；Mattila等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]19:967,1991；以及Eckert等人,PCR Methods and Applications[PCR方法和应用]1:17,1991。
本披露还提供的是用于产生本文所述的β-klotho结合抗体，例如，NOV005或NOV006的表达载体和宿主细胞。多种表达载体可以用来表达编码β-klotho结合抗体链或结合片段的多核苷酸。基于病毒的载体和非病毒表达载体均可用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒、附加型载体(典型地具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒)以及人类人工染色体(参见例如，Harrington等人,Nat Genet.[自然遗传学]15:345,1997)。例如，可用于哺乳动物(例如人)细胞中表达FGF21结合多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B和C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B和C(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州圣地亚哥)、MPSV载体和本领域已知用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP EB病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)(SFV)的载体。参见，Brent等人,同上；Smith,Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年度评论]49:807,1995；和Rosenfeld等人,Cell[细胞]68:143,1992。
表达载体的选择取决于待表达该载体的预期宿主细胞。典型地，表达载体含有与编码β-klotho结合抗体链或片段的多核苷酸可操作地连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施例中，采用诱导型启动子以防止插入的序列在诱导条件之外的条件下表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除了启动子之外，还可能需要或期望其他调节元件以高效表达β-klotho结合抗体链或片段。这些元件典型地包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，Scharf等人,Results Probl.Cell Differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和Bittner等人,Meth.Enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，SV40增强子或CMV增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与通过插入的FGF21结合抗体序列编码的多肽形成融合蛋白。更常见的是，所插入的β-klotho结合抗体序列在包含在载体中之前与信号序列连接。用于接收编码β-klotho结合抗体轻链和重链可变结构域的序列的载体有时也编码恒定区或其部分。此类载体允许将可变区表达为具有恒定区的融合蛋白，从而导致产生完整抗体或其片段。典型地，此类恒定区是人类的。
用于携带并表达β-klotho结合抗体链的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露多核苷酸的原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括杆菌(如枯草杆菌)和其他肠杆菌科(如沙门氏菌属、沙雷氏菌属)以及各种假单胞菌属的种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，这些表达载体典型地含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制的起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地任选使用操纵基因序列控制表达，并且具有核糖体结合位点序列等，以用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达本披露的FGF21结合多肽。也可以使用与杆状病毒载体组合的昆虫细胞。
在一些优选实施例中，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的β-klotho结合多肽。例如，它们可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，实例中描述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或含有外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，以下举例说明的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些包括任何正常的必死或正常或异常的永生的动物或人细胞。例如，已经开发了许多能够分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B细胞和杂交瘤。利用哺乳动物组织细胞培养表达多肽一般在例如Winnacker,FROM GENES TO CLONES[从基因到克隆],VCH出版商,纽约,纽约州,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可包含表达控制序列，如复制起点、启动子和增强子(参见例如，Queen等人,Immunol.Rev.[免疫学评论]89:49-68,1986)，和必要的处理信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或衍生自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的和/或可调控的或可调节的。可用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP polIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人CMV立即早期启动子)、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有感兴趣的多核苷酸序列的表达载体的方法根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(一般参见Sambrook等人，同上)。其他方法包括例如电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、冲击法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子、与疱疹病毒结构蛋白VP22的融合物(Elliot和O'Hare,Cell[细胞]88:223,1997)、药物增强的DNA摄取和离体转导。对于重组蛋白的长期高产量生产，通常期望稳定的表达。例如，可以使用含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择性标志物基因的本披露的表达载体来制备稳定表达β-klotho结合抗体链或结合片段的细胞系。在引入载体后，可以使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将它们转换为选择性培养基。选择性标志物的目的是赋予选择抗性，并且它的存在允许在选择性培养基中成功地表达引入的序列的细胞的生长。可以使用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖抗性、稳定转染的细胞。
单克隆抗体生成
单克隆抗体(mAb)可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein,1975Nature[自然]256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用许多产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的动物系统包括鼠、大鼠和兔系统。小鼠中的杂交瘤产生是建立良好的程序。免疫方案和分离免疫脾细胞用于融合的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
可以基于如上所述制备的鼠单克隆抗体的序列来制备本披露的嵌合抗体或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠杂交瘤中获得，并使用标准分子生物学技术工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠可变区与人恒定区连接(参见，例如，美国专利号4,816,567(术语Cabilly等人))。为产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠CDR区域插入人框架中。参见，例如，美国专利号5225539(属于Winter)和美国专利号5530101、5585089、5693762和6180370(属于Queen等人)。
在某些实施例中，本披露的抗体是人单克隆抗体。可以使用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来生成这种针对β-klotho的人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中统称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(梅达瑞克斯公司(Medarex,Inc.))包含编码未重排的人重链(μ和γ)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(miniloci)，以及使内源μ和K链基因座失活的靶向突变(参见，例如，Lonberg等人,1994Nature[自然]368(6474):856-859)。因此，小鼠表现出小鼠IgM或K的表达降低，并且对免疫有应答，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGK单克隆(Lonberg,N.等人,1994同上；在Lonberg,N.,1994Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]113:49-101中的综述；Lonberg,N.和Huszar,D.,1995Intern.Rev.Immunol.[国际免疫学评述]13:65-93,以及Harding,F.和Lonberg,N.,1995Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学学术年报]764:536-546)。HuMAb小鼠的制备和用途以及由此类小鼠进行的基因组修饰被进一步描述于以下文献中：Taylor,L.等人,1992Nucleic Acids Research[核酸研究]20:6287-6295；Chen,J.等人.,1993International Immunology[国际免疫性]5:647-656；Tuaillon等人,1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]94:3720-3724；Choi等人,1993Nature Genetics[自然遗传学]4:117-123；Chen,J.等人,1993EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:821-830；Tuaillon等人,1994J.Immunol.[免疫学杂志]152:2912-2920；Taylor,L.等人,1994International Immunology[国际免疫学]579-591；以及Fishwild,D.等人,1996Nature Biotechnology[自然生物技术]14:845-851，将所有这些文献的内容通过引用以其全文特别特此并入。另外参见，美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429，全部属于Lonberg和Kay；美国专利号5,545,807(属于Surani等人)；PCT公开号WO 92103918、WO93/12227、WO 94/25585、WO 97113852、WO 98/24884和WO 99/45962(均属于Lonberg和Kay)；以及PCT公开号WO 01/14424(属于Korman等人)。
在另一个实施例中，本披露的人抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠中产生。此类小鼠，在本文中被称为“KM小鼠”，在PCT公开WO 02/43478(属于Ishida等人)中有详细描述。
仍然进一步，表达人免疫球蛋白基因的可替代的转基因动物系统是本领域可获得的，并且可用于产生本披露的β-klotho结合抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(安根尼克斯公司(Abgenix,Inc.))的可替代的转基因系统。这样的小鼠描述于例如，美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和6,162,963(属于Kucherlapati等人)。
此外，表达人免疫球蛋白基因的可替代的转染色体动物系统是本领域可获得的，并且可用于产生本披露的β-klotho结合抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的被称为“TC小鼠”的小鼠；这样的小鼠描述于Tomizuka等人,2000Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]97:722-727中。此外，本领域已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等人,2002Nature Biotechnology[自然生物技术]20:889-894)，并且可以用于产生本披露的FGF21结合抗体。
还可以使用针对筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备本披露的人单克隆抗体。用于分离人抗体的这种噬菌体展示方法在本领域中建立或在以下实例中描述。参见例如：美国专利号5,223,409、5,403,484和5,571,698，属于Ladner等人；美国专利号5,427,908和5,580,717，属于Dower等人；美国专利号5,969,108和6,172,197，属于McCafferty等人；和美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915和6,593,081，属于Griffiths等人。
本披露的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠制备，人免疫细胞已经重建至该SCID小鼠中，使得免疫时可以产生人抗体应答。这种小鼠描述于Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
框架或Fc工程化
本披露的工程化抗体包括如下那些：其中已对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰，例如以改善抗体的特性。通常进行此类的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”为对应的种系序列。更确切地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定此类残基。为了使框架区序列恢复为其种系构型，可以通过例如定点诱变将体细胞突变“回复突变”为种系序列。此类的“回复突变的”抗体也旨在包括在本披露中。
另一种类型的框架修饰包括使框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基突变以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。此方法也称为“去免疫化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步详细描述。
除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或作为在框架或CDR区内进行的修饰的替代方案，可以将本披露的抗体工程化以包含Fc区内的修饰，通常是为了改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本披露的抗体可以经化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接至抗体)或经修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。以下更详细地描述了这些实施例中的每一个。Fc区中残基的编号是卡巴特的EU索引的编号。
在一个实施例中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如有利于轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施例中，使抗体的Fc铰链区突变以降低抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域中，使得抗体具有相对于天然Fc铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白质A(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一个实施例中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在又其他实施例中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲代抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一个实施例中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替代，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
在另一个实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在另一个实施例中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法由Presta在PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已经绘制了人IgG1上针对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,2001J.Biol.Chen.[生物化学杂志]276:6591-6604)。
在还另一个实施例中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备非糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对“抗原”的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。此类的方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在该宿主细胞中表达本披露的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，其编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。Presta在PCT公开WO 03/035835中描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在所述宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了如下细胞系，该细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体显示出增加的二等分GlcNac结构，该二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180)。
工程化改变的抗体的方法
如上所述，本文所示的具有VH和VL序列或全长重链和轻链序列的β-klotho结合抗体可用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或与其附接的一个或多个恒定区来产生新的β-klotho结合抗体。因此，在本披露的另一方面，本披露的β-klotho结合抗体的结构特征被用于产生结构相关的β-klotho结合抗体，这些抗体保留了本披露的抗体的至少一种功能特性，例如结合人β-klotho并且还活化FGF21受体复合物的一个或多个功能特性(例如，活化FGF21受体信号传导)。
例如，本披露的抗体的一个或多个CDR区或其突变可以是与已知的框架区和/或其他的CDR重组组合以产生本披露的另外的、重组工程化的β-klotho结合抗体，如上所述。其他类型的修饰包括先前部分中描述的那些修饰。用于工程化方法的起始材料是本文提供的一种或多种VH和/或VL序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不必实际制备(即，表达为蛋白质)具有本文提供的一种或多种VH和/或VL序列的抗体或其一个或多个CDR区。相反，一种或多种序列中包含的信息用作起始材料以产生衍生自一种或多种原始序列的一种或多种“第二代”序列，然后该一种或多种“第二代”序列进行制备并表达为蛋白质。
因此，在另一实施例中，本披露提供了制备β-klotho结合抗体(例如，NOV005或NOV006)的方法，该抗体包含具有SEQ ID NO:6或9的CDR1序列、SEQ ID NO:7的CDR2序列和/或SEQ ID NO:8的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和具有SEQ ID NO:19或31的CDR1序列、SEQ ID NO:20的CDR2序列和/或SEQ ID NO:21的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；该方法包括任选地改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和表达该改变的抗体序列作为蛋白质。
因此，在另一实施例中，本披露提供了制备优化以在哺乳动物细胞中表达的β-klotho结合抗体的方法，该抗体由以下组成：包含SEQ ID NO:17的序列的全长重链抗体序列；和包含SEQ ID NO:28或34的序列的全长轻链抗体序列；该方法包括任选地改变全长重链抗体序列和/或全长轻链抗体序列中的至少一个氨基酸残基以产生至少一个改变的抗体序列；和表达该改变的抗体序列作为蛋白质。在一个实施例中，重链或轻链的改变在重链和轻链的框架区中。
还可以通过筛选具有如US 2005/0255552所述的固定的CDR3序列或最小必需结合决定簇以及CDR1和CDR2序列的多样性的抗体文库来制备改变的抗体序列。所述筛选可以根据适合于筛选来自抗体文库的抗体的任何筛选技术进行，如噬菌体展示技术。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。由一种或多种改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的β-klotho结合抗体的一种、一些或全部功能特性的抗体，所述功能特性包括但不限于与人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠β-klotho特异性结合；并且该抗体在FGFR1c_β-klotho_HEK293 pERK细胞测定中活化FGF21介导的信号传导，例如，FGF21受体依赖性信号传导。
在本披露的工程化抗体的方法的某些实施例中，可以沿着全部或部分β-klotho结合抗体编码序列随机或选择性地引入突变并且可以筛选所得的修饰的β-klotho结合抗体的结合活性和/或如本文所述的其他功能特性。本领域中已经描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配或其组合产生并筛选抗体突变的方法。可替代地，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学特性的方法。
在本披露的某些实施例中，以工程化抗体来除去脱酰胺基作用的位点。已知脱酰胺基作用导致肽或蛋白质中的结构和功能变化。脱酰胺基作用可导致降低的生物活性、以及蛋白质药物的药代动力学和抗原性改变(Anal Chem.[分析化学]2005年3月1日；77(5):1432-9)。
在本披露的某些实施例中，该抗体已工程化以提高pI并且改善它们的药物样特性。蛋白质的pI是分子的总体生物物理学特性的主要决定因素。已知具有低pI的抗体溶解性较差，稳定性较差且易于聚集。进一步，具有低pI的抗体的纯化是具有挑战性的，并且尤其在供临床使用而扩大规模期间可能是有问题的。增加本披露的抗β-klotho抗体或Fab的pI改善了它们的溶解度，使得抗体能够以更高的浓度配制(>100mg/ml)。高浓度(例如>100mg/ml)的抗体的配制品提供了能够通过玻璃体内注射向患者的眼睛施与更高剂量的抗体的优点，这反过来可以减少给药频率，这是治疗慢性病包括心血管疾病的显著优点。更高的pI还可以增加抗体的IgG形式的FcRn介导的再循环，从而使药物在体内持续更长的时间，并且需要更少的注射次数。最后，由于更高的pI，抗体的总体稳定性显著提高，导致更长的保质期和体内生物活性。优选地，该pI大于或等于8.2。
可以使用本领域可获得的和/或本文描述的标准测定如实例中所述的那些测定(例如，ELISA)评估改变的抗体的功能特性。
预防和治疗用途
通过施与有需要的受试者有效量的本披露的抗体或抗原结合片段，例如，NOV005或NOV006，如本文所述的结合β-klotho的抗体(例如，NOV005或NOV006)及其抗原结合片段可以在治疗有用的浓度下用于治疗与异常FGF21信号传导(例如，FGF21介导的信号传导和/或FGF21受体信号传导的异常活化)相关的疾病或障碍。本披露提供了通过施与有需要的受试者有效量的本披露的抗体，例如，NOV005或NOV006治疗FGF21相关代谢疾病的方法。本披露提供了通过施与有需要的受试者有效量的本披露的抗体，例如，NOV005或NOV006治疗FGF21相关心血管疾病的方法。
本披露的抗体(例如，NOV005或NOV006)尤其可用于治疗、预防和改善FGF21相关病症和障碍，包括但不限于代谢、内分泌和心血管疾病，例如肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝脏疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高甘油三酯血症、代谢综合征、急性心肌梗死、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭、冠心病、肾病、糖尿病并发症、神经病变、胃轻瘫、与胰岛素受体严重失活突变相关的障碍和其他的代谢疾病，和降低危重患者的死亡率和发病率。
本披露的抗体(例如，NOV005或NOV006)尤其可用于治疗、诊断、减轻、改善或预防多种疾病、障碍或病症，包括但不限于与胰岛素抗性相关的代谢疾病，例如2型糖尿病、1型糖尿病、胰岛素受体突变障碍(INSR障碍，例如，B型胰岛素抗性)、非酒精性脂肪性肝脏疾病(NAFLD)和局部脂肪营养不良的各种形式(包括遗传性局部脂肪营养不良和HIV高效抗逆转录病毒治疗(HIV-HAART)诱导的局部脂肪营养不良)以及与胰岛素产生相关的疾病(例如，1型糖尿病)，和降低危重患者的死亡率和发病率。
已经描述了具有不同表型的INSR的多个失活突变。患者通常表现出对胰岛素作用的严重抗性，其在青春期时发展为高血糖症。目前的护理标准是当受试者出现高血糖时用非常高剂量的胰岛素治疗，这通常不足以控制高血糖症。
在特定方面，本披露的抗体(例如，NOV005或NOV006)尤其可用于治疗或控制1型糖尿病、血脂紊乱、高血糖症、低血糖症、葡萄糖耐受不良、高甘油三酯血症或HIV-HAART诱导的局部脂肪营养不良。
本披露的抗体还可以与其他药物组合使用，用于预防、治疗或改善FGF21相关障碍。例如，他汀类疗法可用于与本披露的FGF21模拟抗体和抗原结合片段组合用于治疗患有心血管疾病或代谢疾病的患者。
在特定方面，本文所提供的是一种减轻受试者的体重的方法(例如，减轻至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少12％、至少15％或至少20％)，该方法包括施与有需要的受试者有效量的药物组合物，该组合物包含结合β-klotho并能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性的本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)。
在特定方面，本文所提供的是一种降低受试者食欲或食物摄入的方法(例如，减轻至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少12％、至少15％或至少20％)，该方法包括施与有需要的受试者有效量的药物组合物，该组合物包含结合β-klotho并能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性的本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)。
在特定方面，本文所提供的是降低受试者血浆甘油三酯(TG)浓度或血浆总胆固醇(TC)浓度的方法(例如，降低至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少12％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)，该方法包括施与有需要的受试者有效量的药物组合物，该组合物包含结合β-klotho并能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性的本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)。
在本文所提供的方法的具体的方面，该受试者患有代谢疾病，例如肥胖症、1型和2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高甘油三酯血症和代谢综合征。在本文所提供的方法的具体的方面，该受试者患有心血管疾病。在特定方面，该受试者是人。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的肥胖症的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的2型糖尿病的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的1型糖尿病的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的脂肪营养不良，例如HIV-HAART诱导的局部脂肪营养不良的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的NASH的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
在某些方面，本文所提供的是一种治疗或控制受试者的胰岛素受体突变障碍的方法，该方法包括施与有需要的受试者有效量的包含本文所述的抗体或抗原结合片段(例如，NOV005或NOV006)的药物组合物，该抗体或抗原结合片段结合β-klotho并且能够提高β-klotho/FGFR1c受体复合物的活性。
药物组合物
本披露提供了包含与药学上可接受的载体一起配制的β-klotho结合抗体(完整或结合片段)的药物组合物。该组合物可另外地含有一种或多种适用于治疗或预防例如心血管疾病的其他治疗剂。药学上可接受的载体增强或稳定该组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
本披露的药物组合物可通过本领域已知的各种方法施与。施与途径和/或方式根据所希望的结果而变化。优选地，施与可以是玻璃体内、静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下或在靶标部位附近施与。药学上可接受的载体应适合于玻璃体内、静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施与(例如，通过注射或输注)。根据施与途径，活性化合物(即抗体，双特异性和多特异性分子)可以包被在材料中以保护化合物免受酸和可能使化合物失活的其他自然条件的作用。在具体的方面，用于本文所提供的方法的包含本文所述的β-klotho结合抗体例如抗体NOV005或NOV006的药物组合物通过皮下施与。在具体的方面，用于本文所提供的方法的包含本文所述的β-klotho结合抗体例如抗体NOV005或NOV006的药物组合物通过静脉施与。
该组合物应该是无菌和流动的。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)和氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药物(例如单硬脂酸铝或明胶)来实现可注射组合物的长期吸收。
本披露的药物组合物可以按照本领域公知和常规实施的方法制备。参见例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy[药学的科学与实践],MackPublishing Co.[马克出版公司],第20版,2000；和Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems[缓释和控释药物递送系统],J.R.Robinson编,Marcel Dekker,Inc.[马塞尔德克尔出版社公司],纽约,1978。药物组合物优选在GMP条件下制备。通常，治疗有效(effective或efficacious)剂量的β-klotho结合抗体用于本披露的药物组合物中。通过本领域技术人员已知的常规方法将β-klotho结合抗体配制成药学上可接受的剂型。调节剂量方案以提供最佳的希望应答(例如，治疗应答)。例如，如由治疗情况的紧急状态所指示的，可以施与单次推注，可以随着时间的过去施与若干个分次剂量，或可以按比例地减少或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便给药和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待被治疗的受试者的单元剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所要求的药物载体联合产生所希望的治疗效果的预定量的活性化合物。
可以改变本披露的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，该活性成分的量有效地实现对于特定的患者、组合物和给药方式的所需的治疗应答，而对该患者没有毒性。所选的剂量水平取决于多种因素，包括所用的本披露的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施与途径、给药时间、正在使用的特定化合物的排泄速率、治疗的持续时间、与所用特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、正在治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史。
医生或兽医可以以低于达到期望治疗效果所需的水平开始药物组合物中使用的本披露的抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。通常，用于治疗本文所述的心血管疾病的本披露的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施与方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是人动物、施与的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以优化安全性和功效。在特定的实施例中，对于用抗体全身施与，剂量范围为约0.0001至100mg/kg或0.01至15mg/kg宿主体重。示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次全身施与。示例性治疗方案需要每两周或每月一次或每3至6个月一次或按需要(PRN)全身施与。
抗体通常在多种情况下施与。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中β-klotho结合抗体的血液水平所示，间隔也可以是无规律的。另外，可替代的给药间隔可以由医生确定并且每月或按有效性的需要施与。在一些全身施与方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中达到25-500μg/ml。可替代地，抗体可以作为持续释放配制品施与，在这种情况下需要不太频繁的施与。剂量和频率根据患者中抗体的半衰期而不同。通常，人源化抗体示出比嵌合抗体和非人抗体更长的半衰期。施与的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内以相对不频繁的间隔施与相对较低的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施与相对较高的剂量直至疾病进展减少或终止，并且优选直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，可以向患者施与预防性方案。
实例
提供以下实例以进一步说明本发明，但不限制其范围。本发明的其他变型对于本领域普通技术人员来说是容易清楚的，并且由所附权利要求涵盖。
实例1：抗体筛选和生产
制备人FGFR1c_β-klotho_300.19细胞用作抗原
生产稳定表达人FGFR1c(1-386aa)和β-klotho的300.19细胞以用作完整的细胞抗原。将编码人β-klotho的全长cDNA(GenBank登录号NM_175737)克隆到pEF1/Myc-His B(英杰公司(Invitrogen)目录号V92120)的EcoRI和EcoRV位点。将编码人FGFR1c的氨基酸1-386的cDNA(GenBank登录号NM_023106)克隆到pEF6/Myc-His B(英杰公司(Invitrogen)，目录号V96220)的BamHI和NotI位点。在两个构建体中，Kozak序列(CACC)被包括其中，紧挨在起始密码子前面，并且在载体中的Myc-His标签前面添加终止密码子。将鼠前B 300-19细胞与β-klotho和FGFR1c质粒通过电穿孔使用Amaxa Nucleofector装置和Nucleofector试剂盒(龙沙集团(Lonza)，目录号VCA-1003)共转染。使用1mg/ml遗传霉素(英杰公司(Invitrogen)，目录号10131)和8μg/ml杀稻瘟菌素(英杰公司(Invitrogen)，目录号46-1120)3周来选择稳定的克隆。
制备表达FGFR/β-klotho的HEK293细胞用于细胞测定
为测试β-klotho抗体的结合特异性、功能活性或直向同源物交叉反应性，使用标准Lipofectamine 2000转染和细胞克隆选择方法，产生了稳定表达人FGFR1c_β-klotho、人FGFR2c_β-klotho、人FGFR3c_β-klotho、人FGFR4_β-klotho或食蟹猴FGFR1c_β-klotho的HEK293细胞。
使用了以下编码全长人β-klotho(NM_175737)、人FGFR1c(NM_023106)、人FGFR2c(NP_001138387)、人FGFR3c(NP_000133)或人FGFR4(NP_998812)cDNA的哺乳动物表达质粒：对于食蟹猴β-klotho，使用基于人和恒河猴β-klotho序列的引物将全长序列从食蟹猴脂肪组织cDNA(博诚公司(BioChain)，目录号C1534003-Cy)中PCR扩增并克隆。使用基于人FGFR1c序列(#NM_023106)的引物，将食蟹猴FGFR1c cDNA从食蟹猴脂肪组织cDNA(博诚公司(BioChain)，目录号C1534003-Cy)中克隆并在氨基酸水平上与人FGFR1c示出100％同一。因此，由于人和食蟹猴FGFR1c氨基酸序列是同一的，上述人FGFR1c cDNA构建体被用于制备HEK293细胞，其稳定表达食蟹猴β-klotho和人FGFR1c(#NM_023106)。
测定抗体与β-klotho的结合亲和力
使用Biacore动力学分析测定抗体的结合亲和力。将S系列传感器芯片CM5(GE医疗保健公司(GE Healthcare)，目录号BR-1005-30)平衡至环境温度持续大约30分钟。将系统用1x HBS-EP+缓冲液(10x溶液，GE医疗保健公司(GE Healthcare)，目录号BR-1006-69)启动并且将芯片加载到Biacore仪器上。使用BIAnormalizing(GE医疗保健公司(GEHealthcare)，目录号BR-1006-51)溶液将芯片标准化并且将芯片用50mM NaOH，在全部流动路径上使用60μL/分钟的流速来调节。将30秒的注射重复三次，伴随停顿时间60秒。将10mM乙酸钠(pH 5.0)以60μL/分钟注射120秒并且重复两次。在开始一个新的循环以使用人抗体捕获试剂盒(GE医疗保健公司(GE Healthcare)，目录号BR-1008-39)固定抗人IgG Fc之后，将该抗人Fc Ab在固定缓冲液(10mM乙酸钠，pH 5.0)中稀释至50μg/mL。将胺偶联试剂以1:1(EDC和NHS)混合并且以10μL/分钟注射7分钟。然后将抗人Fc Ab以10μL/分钟注射6分钟。最后，将乙醇胺以10μL/分钟注射7分钟，伴随停顿时间60秒。这会导致大约8000-10000RU的固定。然后我们针对NOV004、NOV005和NOV006进行了测试注射，其Rmax为10RU(捕获水平＝约28RU)。这使用10uL/mL的流速和3M MgCl2再生缓冲液完成。由于芯片表面、IgG亲和力、IgG蛋白质质量的变化和稀释的差异，每次评估每个流动小室。我们以0.5ug/mL的IgG浓度开始并且根据样品注射的结果提高(或降低)该浓度。例如，如果在15秒内观察到100RU，那么我们将Ab溶液稀释至0.25ug/mL并且重复注射。在每个流动小室中测定每个抗体的捕获参数后，使各种浓度的人β-klotho经过该芯片并且通过Biacore动力学计算ka(1/Ms)、kd(1/s)、KD(M)和Rmax(RU)。
测定不同抗体是否竞争结合β-klotho
使用Forte Bio来测定抗体是否竞争结合人β-klotho。将全部样品和试剂用PBS缓冲液以1/10(v/v)比率稀释在10x动力学缓冲液(Forte Bio目录号18-1092)中。将人β-klotho(RD系统公司(R and D Systems)5889-KB-050)用动力学缓冲液稀释至所希望的浓度(5ug/ml)。将人β-klotho加载至抗his传感器(Forte Bio，目录号18-5114)20秒，然后将抗体1加载400秒至传感器上直到达到饱和条件(200nM)。最后，在200nM，在200nM抗体1的存在下将竞争性抗体加载至传感器100秒。第二结合信号的缺少表示该抗体竞争与人β-klotho结合。
使用pERK细胞测定测量FGFR_β-klotho受体活化
使用标准技术进行细胞培养并且测量磷酸-ERK 1/2(pERK)水平。简而言之，在37℃在5％CO2中，将稳定表达人FGFR1c_β-klotho、人FGFR2c_β-klotho、人FGFR3c_β-klotho、人FGFR4_β-klotho或食蟹猴FGFR1c_β-klotho的HEK293细胞维持在含有10％FBS(海克隆公司(HyClone)，SH30071)、杀稻瘟菌素(英杰公司(Invitrogen)，A1113902)和遗传霉素(英杰公司(Invitrogen)，10131035)的DMEM培养基(英杰公司(Invitrogen)，11995)中。将细胞接种到384-孔的聚D-赖氨酸包被的板(BD生物科学公司(BD Biosciences)，354663)上并且在37℃在5％CO2中孵育过夜，随后进行血清饥饿。
将杂交瘤上清液或β-klotho抗体在Freestyle 293培养基中稀释并且将各种浓度的抗体添加到板中。在孵育之后，洗涤细胞，然后将细胞用裂解缓冲液裂解。将细胞裂解物转移至384-孔测定板((珀金埃尔默公司(PerkinElmer)，目录号6008280)上并且使用AlphaScreen SureFireTM pERK 1/2试剂盒(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer)，TGRES10K)来测量磷酸-ERK 1/2水平。使用标准AlphaScreen设置在EnVision 2104多标记读数仪(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))上对板进行读数。使用等式Y＝下部+(上部-下部)/(1+10^((LogEC50-X)x坡面))和GraphPad Prism 5软件，将剂量应答数据作图为pERK活性相对基线的倍数相比于蛋白质浓度，以测定EC50值。
单克隆抗体的制备
在Balb/c(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)菌株：BALB/cJ)或Bcl2 22wehi(杰克逊实验室(Jackson Laboratory)菌株：C.Cg-Tg(BCL2)22Wehi/J)小鼠中通过完整细胞免疫产生抗人β-klotho抗体，基本如Dreyer等人(2010)(Dreyer AM等人(2010)BMCBiotechnology[BMC生物技术]10:87)所述。
简而言之，将1x 107人FGFR1c_β-klotho_300.19细胞以10至30天的间隔注射到Balb/c小鼠中六次。第一次完整细胞注射用弗氏完全佐剂(Freund’s Complete Adjuvant)(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)F5881)完成。不混合细胞和佐剂，而是在两个相邻的但是不同的皮下位点分别注射。在这些之后，用Sigma佐剂系统(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)S6322)或不用佐剂腹膜内注射相同的细胞。
使用Bcl2 22wehi小鼠，以七天的间隔将1x 107人FGFR1c_β-klotho_300.19细胞注射到这些动物中四次。第一次注射用弗氏完全佐剂(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)F5881)完成。将细胞和佐剂在两组的两个相邻的但是不同的皮下位点上分别注射。在没有佐剂的情况下皮下完成随后的细胞注射。
通过荧光活化的细胞分选(FACS)测定来测量免疫小鼠中的免疫应答。使用稀释1,000或10,000倍的来自免疫小鼠的血清来染色人FGFR1c_β-klotho_HEK和人FGFR1c_β-klotho_300.19细胞，随后染色别藻蓝素(APC)抗鼠IgG检测二抗(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoResearch)目录号115-136-071)。在Becton Dickinson LSRII或Fortessa流式细胞仪上读取荧光。选择具有最高滴度的四只小鼠进行电融合。
杂交瘤筛选、亚克隆和选择
将2x 108个脾细胞(spleenoctye)和5x 107个融合配偶体F0细胞(ATCC，CRL-1646)在Cytofusion培养基(LCM-C，细胞波科学公司(Cyto Pulse Sciences))中洗涤并且使用Hybrimune波形发生器(细胞波科学公司(Cyto Pulse Sciences)，型号CEEF-50B)根据制造商的说明书使用600伏的脉冲峰值融合。将细胞以3,000个F0细胞/孔的计算密度接种到384孔板中并且在HAT选择培养基(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)目录号H0262)中培养。
使用高通量FACS平台(Anderson,Paul.Automated Hybridoma Screening,Expansion,Archiving and Antibody Purification.[自动化杂交瘤筛选、扩增、存档和抗体纯化]于：3rd Annual 2014SLAS Conference.[2014年第3届SLAS会议]2014年1月18-22日,加利福尼亚州圣地亚哥)进行初次筛选。简而言之，将杂交瘤上清液与稳定表达和不表达人FGFR1c_β-klotho的细胞系一起孵育并且用抗鼠IgG-APC二抗(杰克逊免疫研究实验室公司(Jackson ImmunoReseach)目录号115-136-071)测定抗体结合。
同时针对四种带条形码的细胞系：300.19亲代细胞、人_FGFR1c_β-klotho_300.19细胞、亲代HEK 293细胞和人FGFR1c-β-klotho_HEK 293细胞，测试来自各杂交瘤上清液的抗体的结合。在初次筛选中选择348个命中。将初次命中在96孔板中扩大并且再次在人FGFR1c_β-klotho_HEK 293细胞上通过FACS确认结合，产生了122个确认的命中。使用本文所述的磷酸-ERK 1/2测定，分析115次FACS结合再确认的命中的含有HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培养基的上清液中人FGFR1c_β-klotho受体复合物的细胞活化。
扩增上清液中具有最高磷酸-ERK 1/2细胞活性的杂交瘤，并从其上清液中纯化IgG。使用实例2所述的磷酸-ERK 1/2测定，分析来自74个杂交瘤的纯化的IgG中的人FGFR1c_β-klotho受体复合物的细胞活化。使用实例2所述的磷酸-ERK 1/2测定，分析来自对人FGFR1c_β-klotho受体复合物的磷酸-ERK 1/2活化具有最好效力的杂交瘤的IgG对食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物的直向同源物交叉反应性以及对人FGFR2c_β-klotho和人FGFR3c_β-klotho受体复合物的选择性。基于这些分析结果，选择一些杂交瘤克隆，例如，127F19，用于进一步分析。特别地，分析了最有效力的、纯化的IgG，例如克隆127F19的交叉反应性并且其示出活化食蟹猴FGFR1c_β-Klotho，而不活化人FGFR2c_β-Klotho、FGFR3c_β-Klotho、FGFR4_β-Klotho或Klotho_FGFR。所选择的IgG，例如克隆127F19，结合表达β-Klotho或FGFR1c_β-Klotho的细胞，而不结合只表达FGFR1c的细胞。
为评估表达α-klotho的细胞中的127F19信号传导，将HEK293细胞用α-klotho、Egr1-萤光素酶和Renilla萤光素酶转染。简而言之，将HEK293细胞在DMEM、10％FBS中培养并且以30000个细胞/孔接种并且使用Lipofectamine 2000用Klotho、Egr-1-luc和TK-Rennila转染。次日，在补充有0.1％FBS的DMEM中将FGF23、FGF21和127F19稀释至所指示的浓度并且添加至转染的细胞中过夜。通过双重Glo萤光素酶测定试剂盒(Dual-Gloluciferase assay kit)(普洛麦格公司(Promega)，E2920)根据制造商的说明书检测萤光素酶活性。正如预期的，需要α-klotho表达用于其信号传导的FGF23示出强烈的萤光素酶表达。然而，FGF21或127F19均未示出任何显著的萤光素酶表达，这说明α-klotho不作为FGF21或这些FGF21模拟抗体的共受体。
单克隆抗体的人源化和亲和力成熟
人源化
人源化的过程在本领域有很好的描述(Jones PT等人(1986)Nature[自然]321:522-525；Queen C等人(1989)PNAS USA 86:10029-10033；Riechmann L等人(1988)Nature[自然]33:323-327；Verhoeyen M等人(1988)Science[科学]239:1534-1536)。术语人源化描述了非人抗体，例如鼠衍生的抗体的抗原结合位点向人受体框架，例如人种系序列的转移(Retter I等人(2005).Nucleic Acids Res.[核酸研究]33:D671-D674)。
人源化抗体的主要基本原理见于最小化在人中发展对抗体的免疫应答的风险(Rebello PR等人(1999)Transplantation[移植]68:1417-1420)。抗原结合位点包含互补决定区(CDR)(Chothia C和Lesk AM(1987)Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]196:901-917；Kabat E等人(1991)无名氏第5版编辑；NIH公开号91:3242)和CDR外的位置，即在直接或间接影响结合的可变结构域(VL和VH)的框架区中。例如，可以在位于CDR2与CDR3之间的名称为“外”环区中发现可直接影响结合的框架残基。间接影响结合的残基例如可见于名称为游标区(Foote J,Winter G.(1992)Journal of Molecular Biology[分子生物学杂志]224:487-499)。它们被认为支持CDR构象。当选择合适的受体框架以最小化框架区中最终人源化抗体与人种系受体序列的偏差数量时，考虑CDR之外的那些位置。
测试多种人种系受体框架的轻链和重链的人源化。例如，测试人框架VBase_VH4_4-30.1和VBase_VH3_3-21的重链的人源化，并且测试人框架VBase_VK1_O18和VBase_VK3_L25的轻链的人源化。
序列优化亲和力成熟
已知某些氨基酸序列基序经历翻译后修饰(PTM)例如糖基化(即，NxS/T，x为任意但非P)、游离半胱氨酸的氧化、脱酰胺基作用(例如NG)或异构化作用(例如DG)。如果存在于CDR区，通过定点诱变以理想地除去那些基序从而提高产物均匀性。
亲和力成熟的过程在本领域有很好的描述。在许多展示系统中，噬菌体展示(Smith GP,1985,Filamentous fusion phage:novel expression vectors that displaycloned antigens on the virion surface[丝状融合噬菌体：在病毒体表面上展示克隆抗原的新型表达载体].Science[科学]228:1315-1317)和在真核细胞例如酵母上展示(BoderET和Wittrup KD,1997,Yeast surface display for screening combinatorialpolypeptide libraries.[用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示]NatureBiotechnology[自然生物技术]15:553-557)似乎是用于选择抗体-抗原相互作用的最常见的应用系统。这些展示系统的优点是它们适用于范围较广的抗原，并且可以容易地调节选择严格性。在噬菌体展示中，可以展示scFv或Fab片段并且在酵母展示中可以展示另外的全长IgG。那些通常应用的方法允许从具有大于10E7的多样性的较大文库中选择所希望的抗体变体。具有较小多样性的文库，例如10E3，可以通过微表达和ELISA来筛选。可以例如通过易错PCR(Cadwell RC和Joyce GF,1994Mutagenic PCR.[诱变PCR]PCR Methods Appl.[PCR方法应用]3:S136-S140)产生非靶标或任意抗体变体文库，并且非靶标或任意抗体变体文库提供非常简单，但是有时有限制的方法。另一策略是抗体候选物的CDR定向多样化。可以使用例如变性的寡核苷酸(Thompson J等人,1996,Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop ofhuman immunodeficiency virus:use of phage display to improve affinity andbroaden strain reactivity.[针对人免疫缺陷病毒的第三高变环的高亲和力人单克隆抗体的亲和力成熟：使用噬菌体展示来改善亲和力和扩大菌株反应性]J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]256:77-88)、三核苷酸诱变(TRIM)(Kayushin AL等人,1996,A convenientapproach to the synthesis of trinucleotide phosphoramidites--synthons for thegeneration of oligonucleotide/peptide libraries.[合成三核苷酸亚磷酰胺-用于产生寡核苷酸/肽文库的合成子的合适方法]Nucleic Acids Res.[核酸研究]24:3748-3755)或任何其他本领域已知的方法特异性地靶向在一个或多个CDR中的一个或多个位置。对人源化候选物进行氨基酸修饰以除去PTM。
表达质粒的产生
编码人源化VL和VH结构域的DNA序列以GeneArtTM(生命技术公司(LifeTechnologies Inc.)，德国雷根斯堡(Regensburg))订购，包含针对智人的密码子优化。将编码VL和VH结构域的序列通过从GeneArt衍生的载体切割和粘贴从而亚克隆到适于在哺乳动物细胞中分泌的表达载体中。将重链和轻链克隆到单独的表达载体中以允许共转染。表达载体的元件包括启动子(巨细胞病毒(CMV)增强子-启动子)、促进分泌的信号序列、多腺苷酸化信号和转录终止子(牛生长激素(BGH)基因)、允许在原核生物中游离型复制和复制的元件(例如SV40起点和ColE1或本领域已知的其他元件)和允许选择的元件(氨苄青霉素抗性基因和吉欧霉素标记)。
人源化抗体候选物的表达和纯化
组成型表达SV40大T抗原(HEK293-T ATCC11268)的人胚肾细胞是用于瞬时表达人源化和/或优化的IgG蛋白的常用宿主细胞系之一。使用PEI(聚乙烯亚胺，MW 25.000线性，波利塞斯公司(Polysciences)，USA目录号23966)作为转染试剂进行转染。
根据亲和力在HiTrap ProtA SuRe柱上进行第一次纯化。测试洗脱液的聚集(SEC-MALS)和纯度(SDS-PAGE、LAL和MS)。如果需要，将来自第一次纯化的汇集物加载到SPX(Hi Load 16/60Superdex 200级120mL)(GE医疗保健公司(GE-Healthcare))上。NOV004、NOV005和NOV006是衍生自小鼠杂交瘤127F19的人源化mAb。选择IgG1 L234A/L235A(LALA)或IgG1κD265A/P329A(DAPA)同种型作为预防措施以降低抗体促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力(参见例如，Hezareh M等人(2001)Journal of Virology[病毒学杂志]75:12161-12168)。作为IgG1(DAPA)同种型的人源化候选物NOV004、NOV005和NOV006如所述表达和纯化。
实例2：单克隆抗体的体外表征
进行了体外工作以示出NOV004、NOV005和NOV006的结合和细胞活性特性。使用如实例1所述的Biacore评估mAb与人β-klotho的KD。NOV004、NOV005和NOV006的KD分别计算为约3xE-10M、3xE-10M和4xE-10M。
使用如在实例1中所述的pERK测定来描述mAb以测定FGFR_β-klotho受体活性。NOV004活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别计算为约3nM和20nM(图1)。NOV005活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别计算为约3nM和16nM(图1)。NOV006活化人和食蟹猴FGFR1c_β-klotho受体复合物，其EC50分别计算为约4nM和18nM(图1)。NOV005、NOV006和NOV006不活化人FGFR2c_β-klotho、FGFR3c_β-klotho或FGFR4_β-klotho受体复合物(图2)。如实例1所述，分析mAb的FGF23活性。NOV005、NOV006和NOV004未示出FGF23活性(图3)。Forte Bio数据示出NOV005和NOV006与NOV004竞争结合人β-klotho(图4)。
通过人β-klotho细胞外结构域与具有人IgG1-LALA同种型的NOV004版本的氢氘交换的表位定位研究示出，以下肽在mAb-β-klotho ECD复合物中受到显著保护：246-265、343-349、421-429、488-498、509-524、536-550、568-576、646-669、773-804、834-857、And和959-986aa；并且示出，以下区域受到最强烈保护：246-265、536-550、834-857和959-986aa(数据未示出；参见PCT国际申请公开号WO 2017/021893，其通过参考以全文并入本文中)。这些研究(与结合、活性和竞争数据组合)表明，NOV005和NOV006也将显著地保护此类β-klotho ECD区。
实例3：大鼠中的单克隆抗体的药代动力学曲线
动物和维持条件
根据实验动物护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory动物)(国家研究委员会实验动物资源研究所(Institute of Laboratory AnimalResources,National Research Council))提供了动物护理和管理。所有程序均由美国卫生与人力资源服务部(US Department of Health and Human Services)制定的标准管理，并根据诺华生物医学研究所(Novartis Institutes for BioMedical Research，NIBR)动物护理和使用委员会批准的方案进行。将雄性斯普拉-道来大鼠(Sprague-Dawley rat)(n＝3只/组)饲养在架子(该架子被配置以随意自动提供水)上的固体底笼中，在12小时光照/黑暗循环(早上6点至下午6点)中保持，并且可以自由地获取标准的啮齿动物食物(Harlan-Teklad公司；马里兰州弗雷德里克；目录号8604)。将饲养箱保持在68°F至76°F之间，湿度为30％至70％。
NOV004、NOV005或NOV006制备和给药
在使用前，将NOV004、NOV005和NOV006在10mM His/His-HCl、220mM蔗糖中的储备溶液在冷藏下解冻。在给药的早晨，将所有三种抗体在PBS中稀释至大约3mg/mL，并将适当的体积吸入给药注射器(3mL/kg)中并保持在室温中直至施与。将动物置于管限制器中并通过静脉内(IV)注射向尾静脉(10mg/kg)施与NOV004、NOV005或NOV006。
血液样品收集
在给药后第-3(基线)、第0天(给药后1和6h)和第1、2、3、4、8、16和28天收集血液样品。从第0天所给的剂量施与结束开始计时所有时间点。在每个时间点，将大约70μl(70μL)血液收集到含有EDTA的BD Microtainer收集/分离管中(BD公司(Becton,Dickinson,andCompany)；新泽西州富兰克林湖；目录号365973)。用纱布施加压力以止血。将样品以20,817x g离心10min，然后将约30μL血浆转移至0.2mL Thermo-strip管(赛默科技公司(Thermo-Scientific)；宾夕法尼亚州匹茨堡；目录号AB-0451)中并在80℃冷冻。每次收集后，将大鼠放回它们居住的笼中。
血浆总NOV004、NOV005或NOV006浓度的测量
使用定制夹心免疫测定定量大鼠血浆中的人IgG(即NOV004、NOV005或NOV006)，其中使用了山羊抗人Fc-γ抗体(KPL#109-005-098)作为捕获抗体并且将具有HRP标记的山羊抗人-IgG作为检测抗体。将捕获抗体(2μg/mL在PBS中，30μL/孔)包被在384孔白色微量滴定板上(Greiner Bio-One公司；北卡罗来纳州门罗；目录号781074)。将板在室温(RT)孵育过夜，无需振荡。在不洗涤的情况下吸出包被溶液后，向每个孔中添加90μL的1x牛奶稀释液/封闭溶液(KPL；马里兰州盖瑟斯堡；目录号50-82-01)并将板在RT孵育2h。在孵育结束时，吸出溶液并将板在-80℃储存在含有干燥剂的箔袋中。
在测定当天，通过在酪蛋白缓冲液(包括缓冲液阴性对照)中连续稀释来制备16种NOV004、NOV005和NOV006标准浓度，范围为0.244-4000pM。将所有研究样品在酪蛋白缓冲液中以1:50手动稀释并且然后使用Biomek Fx连续稀释5倍，总共进行三次稀释。将板在RT孵育2h并且然后用磷酸盐洗涤缓冲液(90μL/孔)洗涤3次。将HRP标记的山羊抗人IgG(400ng/mL在酪蛋白缓冲液中，30μL/孔)添加到每个板中并将板在RT孵育1h。将板用磷酸盐洗涤缓冲液(90μL/孔)洗涤3次，并且然后添加KPL LumiGLO化学发光底物(30μL/孔；目录号54-61-00)。在SpectraMax M5读板仪(分子仪器公司(Molecular Devices))上在所有波长下立即读取化学发光，积分时间为50ms。从NOV004、NOV005或NOV006标准曲线中内插血浆样品中的人Fc浓度(pM)，乘以稀释系数，并转换为nM浓度。
在IV施与NOV004、NOV005或NOV006后，在1h时，动物示出平均Cmax为大约200μg/mL。NOV004、NOV005和NOV006在斯普拉-道来大鼠中示出相等的PK曲线(图5)。
实例4：可开发性和配制品评估
进行抗体NOV004、NOV005和NOV006的生产方法和配制品研究。在先前的NOV004评估期间观察到的高分子量物质(HMW)的形成说明了溶液中的高度聚集并促使研发和评估具有相当的功能活性但具有更好的生产和配制品特征的其他FGF21模拟抗体，例如，没有至很少观察到HMW形成(例如，小于20％、小于15％、小于10％或小于5％)。
编码抗体NOV005和NOV006的DNA序列，包括针对智人的密码子优化，订购于GeneArtTM(生命技术公司(Life Technologies Inc.)德国雷根斯堡)和ATUM(加利福尼亚州门洛帕克)。将表达NOV004、NOV005和NOV006的载体线性化并转染到CHO细胞系中。使用10nM甲氨蝶呤(MTX)选择汇集物直至恢复至>95％生存力。选择每个分子的一个汇集物用于波生产(wave production)并适当地放大。13天后收获来自波生产的培养物上清液并过滤。
使用用于标准抗体的双柱色谱法纯化方法处理NOV005和NOV006的波收获材料-使用亲和色谱法(树脂-GE Healthcare MabSelect SuRe)捕获并使用阳离子交换色谱法(CEC)(树脂-Fractogel EMD SO3-)进行抛光。将捕获的材料进行病毒失活(将pH调节至3.5，在该pH在室温孵育70min，然后将pH调节至5.0)和无菌过滤，然后通过CEC处理。在CEC之后，使用切向流过滤，将材料渗滤以缓冲液交换到10mM组氨酸/组氨酸-HCl(pH 5.0)中。随后，将材料浓缩至约200mg/mL，以提供用于配制品研究的材料。例如，在配制品缓冲液中评估抗体，并测定某些参数，特别是在40℃下4周后HMW的形成。下表3总结了评估在40℃下4周后在NOV004、NOV005和NOV006样品中观察到的HMW形成的示例性实验的数据。
表3：高分子量物质(HMW)形成
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LOQ＝定量限
相对于NOV004，NOV005和NOV006的序列差异赋予储存后HMW形成的显著改善。NOV005和NOV006在40℃4周后均表现出大约小于1％的HMW形成，而NOV004在40℃4周后表现出高得多的HMW形成，大约64％的HMW形成。
下面提供NOV005和NOV004的VH和VL的序列比对：
VH
同一性：79.2
相似性：88.3％
VL
同一性：99.1％
相似性：100.0％
该数据示出NOV005和NOV006令人惊讶地表现出最小的聚集倾向，如通过与NOV004相比的HMW形成所表明的，并且表明NOV005和NOV006表现出适合于药物配制品的特征，并且这些特征对于药物配制品是更优选的。
实例5：在肥胖的食蟹猴中的研究
研究了FGF21模拟mAb(例如NOV004、NOV005或NOV006)对肥胖食蟹猴的摄食量、体重和血浆生物标志物的影响。
示例性方案：
五只雄性食蟹猴用间隔一周施与(研究第0和7天)的两次皮下(s.c.)、1mg/kg剂量的FGF21模拟mAb，例如NOV004、NOV005或NOV006处理并且在给药后超过100天评估摄食量、体重和血浆生物标志物。对于每次给药，将动物限制在它们居住的笼中，收集血液样品，并且然后给每只动物皮下剂量为1mg/kg的FGF21模拟mAb，例如NOV004、NOV005或NOV006。摄食量测量在第一次给药前1周开始并持续整个研究。将研究饮食在喂食前称重，并且每天分成两等份。第二天早上，收集剩下的饮食并称重。计数掉入承接盘中的颗粒(每个1g)的数量，并将其与剩余食物的重量相加。每日摄食量计算为所提供食物的重量减去所收集的食物。不测量水果和蔬菜的消耗。使用量表上的动态特征，每周三个早晨(在采血或给药之前)一式两份地测量非进食体重。
血浆FGF21模拟mAb浓度的测量
使用基于ELISA的夹心免疫测定定量食蟹猴血浆中的人Fc IgG。将抗人IgG小鼠IgG1(一种抗人IgG的小鼠单克隆抗体)用作捕获抗体。将白色葛莱娜(Greiner)384孔板用2μg/mL抗人IgG小鼠IgG1(30μL/孔)包被并在室温(RT)孵育过夜。吸出包被抗体并在RT以90μL/孔添加1x牛奶阻断剂(KPL#50-82-01)2h。吸出封闭溶液并且将板在-80℃储存在含有干燥剂的板袋中直至测定。在测定当天，将板和试剂置于RT下。通过在定制的酪蛋白样品稀释液中将纯化的IgG从4000pM稀释至16pM并包括缓冲液对照来制备标准品。将样品以1:50、1:250、1:1250和1:6250在与标准品相同的稀释液中一式两份稀释，并且然后将标准品、稀释的样品和对照在RT添加至板中2h(所有步骤的工作体积均为30μL/孔)。然后用基于磷酸盐的洗涤缓冲液将板洗涤3次。将辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人Fc-γ抗体在RT添加至板中1小时，并且然后用基于磷酸盐的洗涤缓冲液洗涤板3次。将化学发光底物添加至板中，并立即在发光读板仪上对板进行读数。
每个板一式三份测定FGF21模拟mAb(例如NOV004、NOV005或NOV006)标准品。一式两份测定稀释的血浆样品。从IgG标准曲线内插未知样品。使用SoftMax Pro软件5.4.1版进行曲线拟合、反算、回收％和样品浓度内插。绘制由IgG标准品产生的信号并使用4-参数逻辑曲线拟合选项拟合。从FGF21模拟mAb标准曲线内插血浆样品中的Fc浓度(pM)并乘以稀释系数。确定了测定定量下限(LLOQ)和定量上限(ULOQ)。LLOQ和ULOQ定义为较低和较高标准浓度，其中100％回收率±20％并且CV<20％，并且然后乘以稀释系数。
抗药抗体的检测
血浆样品在LowCross缓冲液中以1:5稀释(博卡科学公司(Boca Scientific)；佛罗里达州波卡拉顿；目录号100 500)。制备含有在LowCross缓冲液中的0.6μg/mL生物素标记的FGF21模拟mAb和0.6μg/mL洋地黄毒苷标记的FGF21模拟mAb的反应混合物。将稀释的血浆(80μL)与160μL反应混合物在96孔U形底板中组合(BD Falcon公司；马萨诸塞州比勒利卡；目录号351177)。用封口膜密封板的边缘，并将板在振荡平台上于37℃孵育2h(150rpm，避光)。然后将每份混合物的等分试样(100μL)转移到链霉亲和素包被的96孔板(Roche；目录号11734776001)的两个孔中，首先用由含有0.05％(v/v)Tween-20的1X PBS组成的洗涤缓冲液(每孔300μL)洗涤3次。将板密封，并且然后在RT在振荡平台上孵育1h(300rpm，避光)。将板用洗涤缓冲液(每孔300μL)洗涤3次，并且然后向每个孔中添加在LowCross缓冲液中以1:2500稀释的100μL抗洋地黄毒苷过氧化物酶_POD Fab片段(罗氏公司(Roche)；目录号11633716001)。将板密封，在RT在振荡平台上孵育45分钟(300rpm，避光)，并且然后用洗涤缓冲液(每孔300μL)洗涤3次。将TMB单组分HRP微孔底物(Bethyl实验室(BethylLaboratories)；得克萨斯州蒙哥马利；目录号E102；100μL/孔)添加至每个孔中，并蓝色显色9-10分钟，避光。通过向每个孔中添加100μL的0.18N H2SO4终止显色反应，将板短暂振荡，并在OD450下测量黄色。
血浆葡萄糖浓度的测量
使用Autokit葡萄糖测定法测量血浆葡萄糖浓度(Wako化学公司(WakoChemicals)；弗吉尼亚州里士满；目录号439-90901)。通过将校准品稀释至500、200、100、50、20和0mg/dL标准品来制备标准曲线。在透明、平底、96孔板(赛默科技公司(ThermoScientific)；目录号269620)中，将预热至37℃的测定试剂(300μL)添加至2μL血浆、标准品和对照样品中。将板在板振荡器上混合30s并且然后在37℃孵育5min。在20s混合后，使用Molecular Devices SPECTRAmax PLUS 384(加利福尼亚州森尼维耳市)在505/600nm处对板进行读数。将样品葡萄糖浓度通过与标准曲线比较来计算。
血浆胰岛素浓度的测量
根据制造商的说明书，使用Millipore Human Insulin Specific RIA试剂盒(马萨诸塞州比勒利卡；目录号HI-14K)测定血浆胰岛素浓度。将适量的测定缓冲液、标准品或稀释的血浆样品与125I-胰岛素和抗胰岛素抗体在5mL、75x 12mm PP SARSTEDT管(目录号55.526)中混合。将管涡旋，覆盖，并在RT孵育20h。孵育后，添加1mL沉淀试剂(4℃)，并且涡旋管并在4℃孵育30分钟。将所有管离心30min(在4℃ 3000rpm)，倾析上清液，并在PerkinElmer WIZARD2自动γ计数器(型号2470；珀金埃尔默公司(PerkinElmer)；马萨诸塞州沃尔瑟姆)上计数颗粒。通过与使用已知量的胰岛素产生的标准曲线比较来计算胰岛素浓度。
血浆甘油三酯浓度的测量
使用甘油三酯(GPO)液体试剂组(Pointe Scientific公司；密歇根州坎顿；目录号T7532-500)测量血浆甘油三酯(TG)浓度。将预热的测定试剂(300μL，37℃)添加到透明的、平底96孔板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；马萨诸塞州图克斯伯里；目录号269620)中的5μL血浆中。将板在板振荡器上混合30s，并且然后置于37℃的培养箱中5min。在20s混合后，用SPECTRAmax PLUS读板仪在500nm处测量吸光度。通过与使用已知量的TG标准品(Pointe Scientific公司；目录号T7531-STD)产生的校准曲线比较来计算TG浓度。
血浆胆固醇浓度的测量：
血浆总胆固醇(TC)使用胆固醇(液体)试剂组(Pointe Scientific公司；目录号C7510-500)定量。将预热的测定试剂(200μL，37℃)添加到透明的、平底96孔测定板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；目录号269620)中的10μL血浆中。将板在板振荡器上混合30s并且然后在37℃孵育5min。在混合20s后，在SPECTRAmax PLUS读板仪上测量500nm处的吸光度。通过与使用已知量的胆固醇标准品(Stanbio实验室(StanbioLaboratory)；得克萨斯州伯尼；目录号1012-030)产生的校准曲线比较来计算胆固醇浓度。
血浆高密度脂蛋白胆固醇浓度的测量
为了测定高密度脂蛋白(HDL)胆固醇浓度，将50μL血浆样品与50μL胆固醇沉淀试剂(Wako化学公司(Wako Chemicals)；弗吉尼亚州里士满；目录号431-52501)在0.5mL微量离心管中组合，并且短暂地涡旋。将管置于室温下10min，并且然后在4℃以2000x g离心10min。离心后，除去大约一半的上清液(含有原始血浆样品的HDL胆固醇部分)，并将10μL用于上述胆固醇测定。
血浆β-羟基丁酸酯浓度的测量
使用β-羟基丁酸酯LiquiColor测试试剂盒(Stanbio实验室(StanbioLaboratory)；目录号2440-058)测量血浆β-羟基丁酸酯(β-HB)浓度。在透明的、平底96孔板(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)；目录号269620)中，将测定试剂R1(215μL预热至37℃)添加至20μL质量对照或血浆样品中。将板在板振荡器上混合30s，并且然后置于37℃的培养箱中5min。在SPECTRAmax PLUS读板仪中测量505nm处的预读吸光度。将测定试剂R2(35μL预热至37℃)添加至每个孔中，并将板再次在板振荡器上混合30s并在37℃孵育5min。在20s混合后，在505nm处测量最终吸光度，从中减去预读值。通过与使用已知量的β-HB校准品(Wako诊断公司(Wako Diagnostics)；弗吉尼亚州里士满；目录号412-73791)产生的校准曲线比较来计算β-HB浓度。
统计分析
使用GraphPad Prism(版本6.05；GraphPad软件；加利福尼亚州拉荷亚)进行统计学分析。将每只动物的食物摄入数据标准化为基线的百分比(计算为第-6至0天的平均值)并且然后计算组平均值±平均数标准误差(SEM)；通过非参数弗里德曼检验与邓氏多重比较后测试(Dunn’s multiple comparisons post-test)，将每一天与第0天进行比较。体重表示为组平均值±平均数标准误差(SEM)，计算为基线的百分比(计算为第-7、-5、-3和0天的平均值)。还通过非参数弗里德曼检验和邓氏多重比较后测试来分析原始体重和血浆生物标志物数据。P<0.05被认为是显著的。
实例6：在肥胖的食蟹猴中的研究
为了评估NOV005在雄性血糖正常的肥胖食蟹猴中的作用，相隔一周施与两次皮下1mg/kg剂量的NOV005(n＝5只动物)或媒介物(n＝3只动物)。以下总结了中期研究结果：
·NOV005降低了标准食物的摄食量，在NOV005处理的动物中，与基线相比峰平均值减少约60％(图6A)，并且与基线相比，平均峰重量减少约10％(图6B)
·分析来自非空腹动物的血浆中脂质和碳水化合物代谢的生物标志物的变化：
o在第35天与基线相比，在NOV005处理的动物中观察到血浆TG水平的平均值降低为约65％
o在第35天与基线相比，NOV005还降低了总胆固醇和胰岛素，但是这些变化没有统计学上的意义
o将在研究结束时测量的其他生物标志物包括脂联素、β-羟基丁酸酯、ApoCIII、HDL-C和脂蛋白谱
表0 NOV005改善了肥胖的食蟹猴的血浆生物标志物水平
值表示组平均值±SEM。
1从非空腹动物中收集了血液用于生物标志物测量。
2基线值反映第-7、-3和0天的平均值。
3计算每个个体的变化百分比并且然后根据组平均值±SEM计算平均值。
*P<0.05，相对于基线，通过非参数弗里德曼检验(Friedman test)与邓氏后测试(Dunn’s post-test)进行。
通过引用结合
本文引用的所有参考，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考，在它们尚未的程度上，通过引用以其全文特此并入。

Claims (21)

1.一种结合β-klotho的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链可变区(VH)；和含有SEQ ID NO:26或32的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
2.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的VL。
3.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VL。
4.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链。
5.如权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含含有SEQ IDNO:17的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含如前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，和药学上可接受的载体。
7.有效量的包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的用途，用于制备治疗代谢疾病的药物，其中所述代谢疾病是如下中的一种或多种：肥胖症、1型糖尿病、2型糖尿病、胰腺炎、血脂紊乱、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖症、高甘油三酯血症和代谢综合征。
8.如权利要求7所述的用途，其中所述代谢疾病是如下中的一种或多种：肥胖症、1型糖尿病、2型糖尿病、高甘油三酯血症和血脂紊乱。
9.有效量的包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的用途，用于制备治疗心血管疾病的药物，其中所述心血管疾病是：动脉粥样硬化、外周动脉疾病、中风、心力衰竭和冠心病中的一种或多种。
10.有效量的包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的用途，用于制备减轻体重的药物。
11.有效量的包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的用途，用于制备降低食欲或食物摄入的药物。
12.有效量的包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物的用途，用于制备降低受试者的血浆甘油三酯(TG)浓度或血浆总胆固醇(TC)浓度的药物。
13.一种核酸，其编码如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，包含SEQ ID NO:16、36或38所示的重链可变区中的和SEQ ID No:54、27、33或40所示的轻链可变区中的核苷酸序列。
14.如权利要求13所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID No:18、37、30或39所示的重链区中的和SEQ ID No:29、51、35或41所示的轻链区中的核苷酸序列。
15.如权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID No:16或36所示的重链可变区中的和SEQID No:54或27所示的轻链可变区中的核苷酸序列。
16.如权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID No:16或38所示的重链可变区中的和SEQID No:33或40所示的轻链可变区中的核苷酸序列。
17.如权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID No:18或37所示的重链区中的和SEQ IDNo:29或51所示的轻链区中的核苷酸序列。
18.如权利要求13所述的核酸，其包含SEQ ID No:30或39所示的重链区中的和SEQ IDNo:35或41所示的轻链区中的核苷酸序列。
19.一种载体，其包含如权利要求13-18中任一项所述的核酸。
20.一种宿主细胞，其包含如权利要求19所述的载体。
21.一种制备结合β-klotho的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在适于表达该抗体或其抗原结合片段的条件下培养如权利要求20所述的宿主细胞的步骤。
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