CN102858802A - 结合β-KLOTHO、FGF受体及其复合物的人抗原结合蛋白 - Google Patents

结合β-KLOTHO、FGF受体及其复合物的人抗原结合蛋白 Download PDF

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Abstract

本发明提供涉及或源自抗原结合蛋白激活FGF21介导信号传导的组合物和方法。在实施方案中，所述抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合蛋白诱导FGF21样信号传导。在一些实施方案中，抗原结合蛋白是与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、此类抗体的结合片段和衍生物以及多肽。其他实施方案提供了编码此类抗原结合蛋白和片段及其衍生物以及多肽的核酸、包含此类多核苷酸的细胞、制造此类抗原结合蛋白和片段及其衍生物以及多肽的方法，和使用此类抗原结合蛋白和片段及其衍生物以及多肽的方法，包括治疗或诊断患有2型糖尿病、肥胖症、NASH、代谢综合征和相关病症或疾患的受试者的方法。

Description

结合β-KLOTHO、FGF受体及其复合物的人抗原结合蛋白
本申请要求2009年12月7日提交的美国临时申请No.61/267,321和2010年9月10日提交的美国临时申请No.61/381,846的权益，所述文献通过引用的方式整体并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式经EFS-Web提交并且因而通过引用的方式整体并入的序列表。在2010年11月24日创建的所述ASCII副本命名为A-1519-WO-PCT.txt并且大小是645,894比特。
技术领域
本公开涉及编码抗原结合蛋白的核酸分子，其中所述抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合。本公开也提供与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白，包括诱导FGF21样信号传导的抗原结合蛋白，以及药物组合物，其包含与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白，包括诱导FGF21样信号传导的抗原结合蛋白，和用于使用此类核酸、多肽或药物组合物治疗代谢紊乱的方法。还提供了使用所述抗原结合蛋白的诊断方法。
背景
成纤维细胞生长因子21(FGF21)是分泌型多肽，其属于包括FGF19、FGF21和FGF23的成纤维细胞生长因子(FGF)亚家族(Itoh等人，(2004)Trend Genet.20：563-69)。FGF21是不典型的FGF，在于它是肝素非依赖的并且作为激素在调节葡萄糖、脂类和能量代谢方面发挥作用。
它在肝脏和胰中高度表达并且是主要在肝脏中表达的唯一FGF家族成员。过量表达FGF21的转基因小鼠显示缓慢生长率、低血浆葡萄糖和甘油三酯水平的代谢表型并且不存在年龄相关性2型糖尿病、胰岛增生和肥胖症。在啮齿类和灵长类模型中药理学施用重组FGF21蛋白导致标准的血浆葡萄糖水平、降低的甘油三酯和胆固醇水平和改善的葡萄糖耐量及胰岛素敏感性。此外，FGF21通过增加能量支出、身体活动性和代谢率而降低体重和体脂。实验性研究为药理学施用FGF21以治疗人中的2型糖尿病、肥胖症、血脂异常和其他代谢疾患或病症提供支持。
FGF21是肝脏来源的内分泌激素，它通过活化其受体刺激脂肪细胞中的葡萄糖摄入和脂质稳态。有趣地，除典型的FGF受体之外，FGF21受体还包含膜结合的β-Klotho作为必需辅因子。FGF21受体的活化导致对多种代谢参数的多种影响。
在哺乳动物中，FGF通过一组四种FGF受体FGFR 1-4介导它们的作用，这转而以多种剪接变体表达，例如，FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4。每种FGF受体含有一个胞内酪氨酸激酶结构域，该结构域一旦配体结合则激活，导致涉及MAPK(Erk1/2)、RAF1、AKT1和STAT的下游信号传导途径(Kharitonenkov等人，(2008)BioDrugs 22：37-44)。几篇报道表明，FGFR 1-3的“c”-报道基因剪接变体对β-Klotho显示特殊的亲和力并且可能充当FGF21的内源性受体(Kurosu等人，(2007)，J.Biol.Chem.282：26687-26695)；Ogawa等人，(2007)Proc Natl Acad Sci USA 104：7432-7437)；Kharitonenkov等人，(2008)J.Cell Physiol.215：1-7)。在大量表达β-Klotho和FGFR4的肝脏中，FGF21不诱导MAPK的磷酸化，尽管FGF21与β-Klotho-FGFR4复合物强烈结合。在3T3-L1细胞和白色脂肪组织中，FGFR1是迄今最丰富的受体，并且因此最有可能的是，FGF21在这种组织中的主要功能性受体是β-Klotho/FGFR1c复合物。
本公开提供了诱导FGF21样信号传导的人(或人源化)抗原结合蛋白，如单克隆抗体，例如，模拟FGF21功能的激动性抗体。这种抗体是这样的分子，其具有FGF21样活性和选择性，还具有抗体常见的增加的合乎治疗需要的特征，如蛋白质稳定性、缺少免疫原性、易于生产和体内长半寿期。
概述
提供了一种分离的抗原结合蛋白，其诱导FGF21介导的信号传导。
另外，提供了与以下中的至少一种特异性结合的分离的抗原结合蛋白：(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，其中所述抗原结合蛋白诱导FGF21介导的信号传导。
在一个实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含选自以下的氨基酸序列：(a)轻链CDR3，其包含选自以下的序列：(i)轻链CDR3序列，其与选自L1-L18的轻链CDR3序列SEQ ID NO：180-194中的CDR3序列相差不多于总计三个氨基酸添加、置换和/或缺失；(ii)QVWDX1X2SDHVV(SEQ ID NO：276)；(iii)QQX3GX4X5X6X7T(SEQID NO：283)；(iv)LQHNSYPLT(SEQ ID NO：267)；(v)MQSLQTPFT(SEQID  NO：268)；(vi)QQYNNWPPT(SEQ ID NO：269)；(vii)MQSIQLPRT(SEQ ID NO：270)；(viii)QQANDFPIT(SEQ IDNO：271)；(ix)MQALQTPCS(SEQ ID NO：272)；(b)重链CDR3序列，其包含选自以下的序列：(i)重链CDR3序列，其与选自H1-H18的重链CDR3序列SEQ ID NO：145-157中的CDR3序列相差不多于总计四个氨基酸添加、置换和/或缺失；(ii)X34X16X17X18GX19YYYX20GMDV(SEQ ID NO：322)；(iii)SLIVVX21VY X22LDX23(SEQ ID NO：326)；(iv)IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO：311)；(v)DPDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO：312)；(vi)TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO：313)；(vii)DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO：314)；(VIII)VRIAGDYY YYYGMDV(SEQ ID NO：315)；(ix)ENIVVIPAAIFAGWFDP(SEQ ID NO：316)；和(x)DRAAAGLHYYYGMDV(SEQ ID NO：317)；或(c)(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列)；其中，X1是G、S或N；X2是N、S或T；X3是C、Y或S；X4是G或S；X5是A或S；X6是P或F；X7是L或不存在；X34是I、V或S；X16是L或V；X17是L、T或V；X18是L、V、G或T；X19是A、G或不存在；X20是Y、C或D；X21是I或M；X22是A或V；并且X23是H或Y；并且其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
在另一个实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含：(a)选自以下的轻链CDR1序列：(i)轻链CDR1，其与L1-L18的CDR1序列SEQ IDNO：158-170相差不多于三个氨基酸添加、置换和/或缺失；(ii)RASQX9X10X11X12X13X14LA(SEQ ID NO：304)；(iii)GGNNIGSX15SVH(SEQ ID NO：307)；(iv)RSSQSLLX29X30NGX31X32X33LD(SEQ ID NO：310)；(v)RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：295)；(vi)RASQDIRYDLG(SEQ IDNO：296)；(vii)RASQGISIWLA(SEQ ID NO：297)；和(viii)KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO：298)；(b)选自以下的轻链CDR2序列：(i)轻链CDR2，其与L1-L18的CDR2序列SEQ ID NO：171-179相差不多于两个氨基酸添加、置换和/或缺失；(ii)LGSX27RAS(SEQ IDNO：290)；(iii)GX8SX28RAT(SEQ ID NO：294)；(iv)AASSLQS(SEQ IDNO：284)；(v)GVSTRAT(SEQ ID NO：285)；(vi)DDSDRPS(SEQ IDNO：286)；(vii)EVSNRFS(SEQ ID NO：287)；(c)选自以下的重链CDR1序列：(i)重链CDR1，其与H1-H18的CDR1序列SEQ ID NO：121-131相差不多于两个氨基酸添加、置换和/或缺失；和(ii)NARMGVX39(SEQ ID NO：352)；(iii)X40YGIH(SEQ ID NO：355)；(iv)DLSMH(SEQ ID NO：345)；(v)DAWMS(SEQ ID NO：346)；(vi)TYAMS(SEQ ID NO：347)；(vii)SYFWS(SEQ ID NO：348)；(viii)SYYWS(SEQ ID NO：131)；(ix)SGGYNWS(SEQ ID NO：349)；(d)选自以下的重链CDR2：(i)重链序列，其与H1-H18的CDR2序列SEQ IDNO：132-144相差不多于三个氨基酸添加、置换和/或缺失；(ii)HIFSNDEKSYSTSLKX24(SEQ ID NO：333)；(iii)X25ISGSGVSTX26YADSVKG(SEQ ID NO：338)；(iv)VIWYDGSX35KYYX36DSVKG(SEQ ID NO：341)；(v)X37IYX38SGSTX41(SEQ ID NO：344)；(vi)GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：327)；(vii)RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：328)；(viii)RIYTSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO：329)；(ix)RIKSKDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：330)；(x)RIKSKX42DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：483)；其中X9是N或S；X10是V或F；X11是D或S；X12是G或S；X13是S、N或T；X14是S或Y；X15是E或Q；X29是Y或H；X30是Y或S；X31是F或Y；X32是T或N；X33是Y或F；X27是N或D；X8是A或T；X28是S或F；X39是S或N；X24是S或N；X25是G或A；X26是H、Y或N；X35是D或I；X36是A或G；X37是N或R；X38是Y或T；X41是Y或N；X42是T或不存在；(e)(a)的轻链CDR1和(b)的轻链CDR2；(f)(a)的轻链CDR1和(c)的重链CDR1；(g)(a)的轻链CDR1和(d)的重链CDR2；(h)(b)的轻链CDR1和(c)的重链CDR1；(i)(c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；(j)(b)的轻链CDR2和(d)的重链CDR2；(k)(a)的轻链CDR1、(b)的轻链CDR2和(c)的重链CDR1；(l)(b)的轻链CDR2、(c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；(m)(a)的轻链CDR1、(c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；或(n)(a)的轻链CDR1、(b)的轻链CDR2、(c)的重链CDR2和(d)的重链CDR2，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
在又一个实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含：(a)包含以下序列的轻链可变域：(i)选自SEQ ID NO：158-170的轻链CDR1序列；(ii)选自SEQ ID NO：171-179的轻链CDR2序列；(iii)选自SEQ ID NO：180-194的轻链CDR3序列；和(b)包含以下序列的重链可变域：(i)选自SEQ ID NO：121-131的重链CDR1序列；(ii)选自SEQ ID NO：132-144的重链CDR2序列；和(iii)选自SEQ ID NO：145-157的重链CDR3序列；或(c)(a)的轻链可变域和(b)的重链可变域，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
在又一个实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含：(a)选自以下的轻链可变域序列：(i)具有与选自VL1-VL18轻链可变域序列SEQ IDNO：48-65有至少80％同一性的序列的氨基酸；(ii)由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列与编码VL1-VL18轻链可变域序列SEQ ID NO：48-65的多核苷酸序列有至少80％同一性；(b)选自以下的重链可变域序列：(i)与VH1-VH18重链可变域序列SEQ ID NO：66-84有至少80％同一性的氨基酸序列；(ii)由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列与编码VH1-VH18重链可变域序列SEQID NO：66-84的多核苷酸序列有至少80％同一性；或(c)(a)的轻链可变域和(b)的重链可变域；其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在特定实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含：(a)选自以下的轻链可变域序列：SEQ ID NO：48-65的VL1-VL18；(b)选自以下的重链可变域序列：SEQ ID NO：66-84的VL1-VL18；或(c)(a)的轻链可变域和(b)的重链可变域；其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在其他特定的实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含选自以下组合中的轻链可变域和重链可变域：VL1VH1、VL2VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL4VH5、VL5VH6、VL6VH7、VL7VH8、VL8VH8、VL9VH9、VL9VH10、VL10VH11、VL11VH11、VL12VH12、VL13VH13、VL14VH14、VL15VH15、VL16VH16、VL17VH17和VL18VH18，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在另外其他实施方案中，所提供的抗原结合蛋白还包含：(a)SEQ ID NO：10的轻链恒定序列；(b)SEQ ID NO：11的轻链恒定序列；(c)SEQ ID NO：9的重链恒定序列；或(d)SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：11的轻链恒定序列和SEQ ID NO：9的重链恒定序列。
所提供的抗原结合蛋白可以采取多种形式和可以是例如人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合性抗体片段、单链抗体、双抗体(diabody)、三链抗体(tetrabody)、四链抗体(tetrabody)、Fab片段、F(fab′)2片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体或在铰链区中具有至少一个突变的IgG4抗体。
在另一个实施方案中，与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合时，所提供的抗原结合蛋白：(a)以基本上与参比抗体相同的Kd结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物；(b)如ELK-萤光素酶报道基因测定法中所测量，诱导大于由包含SEQ ID NO：2的野生型FGF21标准物所诱导的信号传导10％以上的FGF21样信号传导；(c)在选自以下的测定法中显示10nM或更小的FGF21样信号传导的EC50：(i)FGFR1c/β-Klotho介导的基于体外重组细胞的测定法；和(ii)体外人脂肪细胞功能测定法；(d)在体外重组FGFR1c受体介导的报道基因测定法中在β-Klotho存在下对FGFR1c显示小于10nM的激动活性的EC50；和(e)在体外重组FGFR1c受体介导的报道基因测定法中在β-Klotho不存在下对FGFR1c显示大于1μM的激动活性的EC50；或(f)同参比抗体竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合，其中所述参比抗体包含选自VL1VH1、VL2VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL4VH5、VL5VH6、VL6VH7、VL7VH8、VL8VH8、VL9VH9、VL9VH10、VL10VH11、VL11VH11、VL12VH12、VL13VH13、VL14VH14、VL15VH15、VL16VH16、VL17VH17和VL18VH18中的轻链可变域序列和重链可变域序列的组合。在其他实施方案中，与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合时，所提供的抗原结合蛋白(a)在动物模型中降低血糖；(b)在动物模型中降低血脂水平；(c)在动物模型中降低胰岛素水平；或(d)(a)和(b)和(c)的两者或更多者。
在具体的实施方案中，所提供的抗原结合蛋白包含(a)SEQ IDNO：31、32、390-401、404-405中之一的重链；(b)包含SEQ ID NO：13、14、385-389、402-403中之一的轻链；或(c)包含(a)的重链和(b)的轻链的组合。
另外，提供了一种抗原结合蛋白，其能够结合野生型人β-Klotho(SEQ ID NO：7)但是不与β-Klotho的嵌合形式结合，其中所述β-Klotho的嵌合形式包含其中鼠β-Klotho序列在(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处替换野生型人残基人β-Klotho框架。
在另一个方面，本公开提供一种抗原结合蛋白，其能够在(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处结合野生型人β-Klotho(SEQ ID NO：7)。
在又一个方面，本公开提供一种抗原结合蛋白，其能够同根据权利要求8或13所述的抗原结合蛋白竞争与(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处的人野生型β-Klotho残基结合。
另外，提供一种药物组合物，其包含与其可药用载体掺和的本文提供的一种或多种抗原结合蛋白。
在又一个方面，也提供分离的核酸分子，其编码本文公开的抗原结合蛋白。在一些情况下，分离的核酸分子与控制序列有效连接。在实施方案中，此类核酸包含编码本文提供的抗原结合蛋白的轻链可变域、重链可变域或这二者的多核苷酸序列。在特定实施方案中，所述核酸包含(a)VL1-VL18(SEQ ID NO：48-65)；(b)VH1-VH18(SEQ ID NO：66-84)；或(c)(a)的一个或多个序列和(b)的一个或多个序列。
在另一个方面，也提供了表达载体和用所述表达载体转化或转染的宿主细胞，其中所述表达载体包含编码本文所公开的抗原结合蛋白的前述分离的核酸分子。
在另一个方面，还提供了制备与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性或选择性结合的抗原结合蛋白的方法，并且所述方法包括从分泌该抗原结合蛋白的宿主细胞中制备所述抗原结合蛋白的步骤。
其他实施方案提供了预防或治疗需要这种治疗的受试者中的疾患的方法，包括施用治疗有效量的本文提供的药物组合物至所述受试者，其中所述疾患是可通过降低血糖、胰岛素或血脂水平治疗的。在实施方案中，所述疾患是2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病或代谢综合征。
本文中更详细地描述这些方面和其他方面。提供的所述方面中的每一者可以包括本文提供的多种实施方案。因此预计，可以在描述的每个方面包括涉及一种要素或要素组合的每一个实施方案，并且明确考虑到上述方面和实施方案的全部此类组合。所公开的抗原结合蛋白和相关方法和组合物的其他特征、目的和优点在接下来的具体实施方案中是显而易见的。
附图简述
图1A-1B是显示人FGFR1c(GenBank登录号P11362；SEQ IDNO：356)和鼠FGFR1c(GenBank登录号NP_034336；SEQ ID NO：357)之间序列同源性的比对；突出显示多种特征，包括信号肽、跨膜序列、肝素结合区，并且提供共有序列(SEQ ID NO：358)。
图2a-2c是显示人β-Klotho(GenBank登录号NP_783864；SEQ IDNO：359)和鼠β-Klotho(GenBank登录号NP_112457；SEQ ID NO：360)之间序列同源性的比对；突出显示多种特征，包括跨膜序列和两个糖基水解酶结构域，并且提供共有序列(SEQ ID NO：361)。
图3是用FGF21-Alexa 647染色的细胞的流式细胞术图谱，所述FGF21-Alexa 647用作免疫原以产生抗原结合蛋白；该图显示FGF21R(包含FGFR1c和β-Klotho的复合物)的表达水平和与FGF21的结合。
图4是显示用作免疫原以产生抗原结合蛋白的Fc融合蛋白的序列(SEQ ID NO：362)；所述免疫原包含通过Gly5接头(SEQ ID NO：379)与IgG1Fc融合的人FGFR1c胞外结构域(ECD)；FGFR1c组分以大写字母显示，接头为斜体并且加下划线显示，并且Fc以小写字母显示。
图5是显示用作免疫原以产生抗原结合蛋白的Fc融合蛋白的序列(SEQ ID NO：363)；所述免疫原包含通过Gly5接头(SEQ ID NO：379)与IgG1Fc融合的人β-Klotho胞外结构域(ECD)；β-Klotho组分以大写字母显示，接头为斜体并且加下划线显示，并且Fc以小写字母显示。
图6是SDS PAGE凝胶，其显示从包含FGFR1c ECD-Fc和β-Klotho ECD-Fc的可溶性FGF21受体复合物的制备物中所实现的纯度水平，所述可溶性FGF21受体复合物用作免疫原以产生抗原结合蛋白。
图7是从如本文所述对重组CHO克隆2E10进行的ELK-萤光素酶报道基因测定法中生成的一系列曲线，其说明一些抗原结合蛋白在表达包含FGFR1c和β-Klotho的FGF21受体复合物的重组CHO细胞中诱导FGF21样信号传导的能力。
图8是从如本文所述的ERK1/2磷酸化测定法中生成的一系列曲线，其说明一些抗原结合蛋白在大鼠L6细胞中诱导FGF21样信号传导的能力。X-轴是抗原结合蛋白的浓度并且Y-轴是总ERK1/2中磷酸化ERK1/2的百分数。
图9是从如本文所述的ERK1/2磷酸化测定法中生成的一系列曲线，其说明L6细胞中抗原结合蛋白介导的FGF21样信号传导是FGFR1c/β-Klotho特异性的。
图10是从如本文所述的ERK磷酸化测定法中生成的一系列曲线，其说明一些抗原结合蛋白能够在人脂肪细胞细胞中诱导FGF21样信号传导。
图11a是一系列结合传感图(响应单位对时间)，其说明一些诱导FGF21介导的信号传导的抗原结合蛋白与人β-Klotho在24H11(组A)和17D8(组B)所代表的两个不同但部分重叠的结合位点处结合，而不诱导FGF21介导的信号传导的抗原结合蛋白(2G10，1A2)不与这些位点结合。
图11b是一系列结合传感图(响应单位对时间)，其说明在人β-Klotho上对39F7所代表的组C抗原结合蛋白鉴定的第三结合位点。
图12是一系列结合传感图(响应单位对时间)，其说明一些诱导FGF21-介导的信号传导的抗原结合蛋白(12E4、24H11、17C3、18B11)干扰β-Klotho与FGF21结合，而其他抗原结合蛋白(21H2、17D8、18G1)不干扰。
图13是一些产生的抗原结合蛋白的可变区的比对；鉴定了框架区和CDR区。图13以出现顺序分别公开SEQ ID NO：364、59、365、60、366、61、367、62、368、57、369、55、51-52、56、56、53-54、63-65、370、58、371、50、50、49、48、372、78、373、66-69、79、374、76、81、375、70、73、73、71-72、376、83、82、84、377、80、378、75和74。
图14是图，其图示地描述在肥胖食蟹猴中所进行的68天研究的研究设计。
图15是曲线图，其描述溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的AM膳食摄食量的影响。
图16是两个曲线图，其描述溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的果实摄取和PM摄食量的影响。
图17是曲线图，其描述溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的体重的影响。
图18是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的体质量指数(BMI)的影响。
图19是曲线图，其显示溶媒对所研究的肥胖食蟹猴的腹围(AC)的影响。
图20是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的皮褶厚度(SFT)的影响。
图21是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的葡萄糖耐量试验期间葡萄糖水平的影响。
图22是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的葡萄糖耐量试验期间血浆胰岛素水平的影响。
图23是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的空腹血糖水平的影响。
图24是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的空腹血浆胰岛素水平的影响。
图25是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的进食血糖水平的影响。
图26是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的进食血浆胰岛素水平的影响。
图27是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的空腹血浆甘油三酯水平的影响。
图28是曲线图，其显示溶媒和16H7对所研究的肥胖食蟹猴的进食血浆甘油三酯水平的影响。
图29是示意图，其描述了构建并用来研究抗原结合蛋白结合作用的人-鼠β-Klotho嵌合体。
图30是示意图，其描述了构建的人-鼠β-Klotho嵌合体并且还包括FGF21、16H7、37D3和39F7的定性结合数据。
图31A-C是一系列曲线，其描述构建的八种16H7和22H5变体的结合数据以及22H5和16H7的结合数据。
图32A-C是描述ELISA测定法结果的一系列曲线，所述结果用来说明几种22H5和16H7变体具有结合能力。
图33是比较所产生的几种22H5和17H7变体的脱离速率的条图。
图34是两条曲线，所述曲线描述了用FGF21滴定时39F11的结合曲线，和用39F11滴定时FGF21的结合曲线；所述曲线显示累加效应。
图35是两条曲线，所述曲线描述了用39F11滴定时16H7的结合曲线，和用16H7滴定时39F11的结合曲线；所述曲线显示累加效应。
详述
本文所用的章节标题仅用于组织目的并且不得解释为限制所描述的主题。
除非本文另外定义，否则与本申请相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文所要求，单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学及杂交相连使用的名称及其技术是本领域熟知和通常使用的那些。本申请的方法和技术通常根据本领域熟知和如本说明书通篇范围内引用及讨论的多种普通和更具体参考文献中所述的常规方法进行，除非另外说明。见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssociates(1992)，以及Harlow和Lane，Antibodies：A LaboratoryManual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)，所述文献通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域中通常所完成或如本文所述。通常，与本文所述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学相连使用的术语及其实验室方法和技术是本领域熟知和通常使用的那些。标准技术可以用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送及患者治疗。
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I.定义
如本文所用，术语“a(一个)”和“an(一个)”意指“一个或多个”，除非另有明确说明。
“抗原结合蛋白”是包含与抗原或靶结合的部分和任选地包含支架或框架部分的蛋白质，所述支架或框架部分允许抗原结合部分采取促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象。抗原结合蛋白的实例包括人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双抗体；三抗体；四抗体；Fab片段；F(ab′)2片段；IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体，及其片段。抗原结合蛋白可以包含例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的替代性蛋白质支架或人工支架。此类支架包括，但不限于抗体支架，其包含所导入以例如稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变，以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的支架。见，例如，Korndorfer等人，2003，Proteins：Structure，Function，and Bioinformatics，53(1)：121-129(2003)；Roque等人，Biotechnol.Prog.20：639-654(2004)。此外，可以使用肽抗体模拟物(“PAM”)，以及基于抗体模拟物的支架使用纤连蛋白组分作为支架。
抗原结合蛋白可以具有例如天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻链”(约25kDa)和一条“重链”(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分界定了主要负责效应子功能的恒定区。人轻链划分为κ和λ轻链。重链划分为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内部，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常见，Fundamental Immunology第7章(Paul，W.编著，第2版.Raven Press，N.Y.(1989))(通过引用的方式完整并入用于全部目的)。每个轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点，从而一个完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然存在的免疫球蛋白链显示相同的总体结构：由三个超变区(也称作互补性决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。从N端至C端，轻链和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。可以根据Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991中的定义将氨基酸指定至每个结构域。根据需要，CDR也可以再定义根据替代性命名方案，如Chothia的那种(见Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883或Honegger和Pluckthun，2001，J.Mol.Biol.309：657-670)。
在本公开的上下文中，当解离常数(KD)≤10-8M时，称抗原结合蛋白与其靶抗原“特异性结合”或“选择性结合”。当KD≤5x 10-9M时，抗体特异性以“高亲和力”结合抗原，并且当KD≤5x 10-10M时，抗体特异性以“非常高的高亲和力”结合抗原。在一个实施方案中，抗体将以约10-7M和10-12M之间的KD与FGFR1c、β-Klotho、FGFR1c和β-Klotho或包含FGFR1c和β-Klotho(包括人FGFR1c、人β-Klotho或人FGFR1c和人β-Klotho两者)的复合物结合，并且在又一个实施方案中，抗体将以KD≤5x 10-9结合。
除非另外说明，否则“抗体”指完整免疫球蛋白或指其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过酶切割或化学切割完整抗体而产生。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体(dAb)、包括互补性决定区(CDR)的片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四抗体和这样的多肽，所述多肽含有免疫球蛋白的足以对所述多肽赋予特异性抗原结合作用的至少一部分。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab′)2片段是具有在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体单臂的VL和VH结构域；并且dAb片段具有VH结构域、VL结构域或VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利No.6,846,634、6,696,245，美国申请公开No.05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958，Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
单链抗体(scFv)是其中VL和VH区通过接头(例如，氨基酸残基的合成性序列)连接以形成连续蛋白质链的抗体，其中所述接头足够地长以允许该蛋白质链自身回折并形成单价抗原结合位点(见，例如，Bird等人，Science 242：423-26(1988)和Huston等人，1988，Proc NatlAcad Sci USA 85：5879-83(1988))。双抗体是包含两条多肽链的双价抗体，其中每条多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，所述接头太短以致于不能允许相同链上的两个结构域之间配对，因而允许每个结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(见，例如，Holliger等人，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90：6444-48(1993)，和Poljak等人，Structure 2：1121-23(1994))。如果双抗体的两条多肽链是相同的，则因它们配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用来产生具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体是分别包含三条和四条可以是相同或不同的多肽链并且分别形成三个和四个可以是相同或不同的抗原结合位点的抗体。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用由Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991中描述的体系标识。根据需要，CDR也可以再定义根据替代性命名方案，如Chothia的那种(见Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883或Honegger&Pluckthun，2001，J.Mol.Biol.309：657-670)。一个或多个CDR可以共价或非共价地并入分子中以使该分子变成抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以将CDR并入作为更大多肽链的部分，可以将CDR共价地连接至另一条多肽链，或可以非共价地并入CDR。CDR允许抗原结合蛋白与特定目的抗原特异性结合。
抗原结合蛋白可以具有一个或多个结合位点。如果存在多于一个结合位点，所述结合位点可以彼此相同的或可以是不同的。例如，天然存在的人免疫球蛋白一般具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双官能的”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有源自人免疫球蛋白序列中的一个或多个可变区和恒定区的全部抗体。在一个实施方案中，全部可变域和恒定域源自人免疫球蛋白序列(完全人抗体)。这些抗体可以以多种方式制备，下文描述其实例，包括通过用目的抗原免疫小鼠，所述小鼠经基因修饰以表达源自人重链和/或轻链基因的抗体，如源自
Figure BDA00001983794100171
UltiMabTM或系统的小鼠。也可以使用基于噬菌体的方法。
人源化抗体具有与源自非人物种的抗体序列相差一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加的序列，从而当施用至人受试者时，人源化抗体与非人物种抗体相比较不可能诱导免疫应答和/或诱导较少的严重免疫应答。在一个实施方案中，将非人物种抗体的重链和/或轻链框架域和恒定域中的某些氨基酸突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，来自人抗体的恒定域与非人物种的可变域融合。在另一个实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列中的一个或多个氨基酸残基以降低非人抗体施用至人受试者时的可能免疫原性，其中改变的氨基酸残基对该抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键的，或对氨基酸序列做出的改变是保守性变化，从而人源化抗体与抗原的结合没有比非人抗体与该抗原的结合明显更差。怎样产生人源化抗体的实例可以在美国专利No.6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到。
术语“嵌合抗体”指含有来自一个抗体中的一个或多个区域和来自一个或多个其他抗体中的一个或多个区域的抗体。在一个实施方案中，一个或多个CDR源自人抗体，所述人抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在另一个实施方案中，全部的CDR源自人抗体，所述人抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在另一个实施方案中，将源自多于一种人抗体的全部的CDR混合并在嵌合抗体中匹配，其中所述人抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。例如，嵌合抗体可以包含来自第一人抗体的轻链中的CDR1，所述第一人抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFRlc、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物；包含来自第二人抗体的轻链中的CDR2和CDR3，所述第二人抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物；和包含来自第三抗体的重链中的CDR，所述第三抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。另外，框架区可以源自相同抗体之一，所述相同抗体结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，来自一个或多个不同抗体，如人抗体，或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体相同、同源或源自其中，而所述链的剩余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体或多个抗体相同、同源或源自其中。另外，包括此类抗体的片段，所述片段显示出所需生物学活性(例如与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的能力)。
术语“轻链”包括全长轻链和其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域在多肽的氨基端。轻链包括κ(“κ”)链和λ(“λ”)链。
术语“重链”包括全长重链和其具有足够可变区序列以赋予结合特异性的片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域在多肽的氨基端，并且CH结构域在羧基端，其中CH3最靠近多肽的羧基端。重链可以具有任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。
如本文所用，术语抗原结合蛋白的“免疫功能性片段”(或简单地叫做“片段”)，例如，抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)，是抗原结合蛋白，其包含缺少至少一些在全长链中存在的氨基酸但是能够与抗原特异性结合的抗体部分(无论该部分怎样获得或合成)。此类片段是有生物学活性的，因为它们与靶抗原特异性结合并且可以同其他抗原结合蛋白(包括完整抗体)竞争与给定表位的特异性结合。在一个方面，此种片段将保留至少一个在全长重链或重链中存在的CDR，并且在一些实施方案中将包含单条重链和/或轻链或其部分。这些生物学活性片段可以通过重组DNA技术或可以通过酶切割或化学切割包括完整抗体在内的抗原结合蛋白而产生。免疫功能性免疫球蛋白片段包括，但不限于，Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、结构域抗体和单链抗体，并且可以源自任何哺乳动物源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、骆驼(camelid)或兔。进一步构思了本文公开的抗原结合蛋白的功能性部分，例如，一个或多个CDR，可以与第二蛋白或与小分子共价地结合以产生指向身体内特定靶、拥有双官能治疗性能或具有延长血清半寿期的治疗剂。
“Fc区”含有两条重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。这两条重链片段由两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用固定在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条重链的含有VH结构域和CH1结构域的部分并且还含有CH1和CH2结构域之间的区域，从而链间二硫键可以在两个Fab′片段的两条重链之间形成以产生F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和含有CH1和CH2结构域之间恒定区的一部分的两条重链，从而链间二硫键在两条重链之间形成。F(ab′)2片段因而由两个Fab′片段组成，这两个Fab′片段由两条重链之间二硫键固定在一起。
“Fv区”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
“结构域抗体”是仅含有重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情况下，两个或更多个VH区以肽接头共价地连接以产生双价结构域抗体。双价结构域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
“半抗体(hemibody)”是免疫功能性免疫球蛋白构建体，其包含完整重链、完整轻链链和与完整重链Fc区配对的第二重链Fc区。可以，但是不必要，使用接头来接合重链Fc区和第二重链Fc区。在特定实施方案中，半抗体是本文公开的抗原结合蛋白的单价形式。在其他实施方案中，成对的带电荷残基可以用来将一个Fc区与第二Fc区缔合。第二重链Fc区可以包含例如SEQ ID NO：441，并且可以经接头(例如，SEQ ID NO：440)与轻链连接。示例性半抗体重链包含序列SEQ IDNO：453。
“双价抗原结合蛋白”或“双价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同抗原特异性。如本文所述，双价抗原结合蛋白和双价抗体可以是双特异性的。
多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向多于一个抗原或表位的一种抗原结合蛋白或抗体。
“双特异性”、“双特异性”或“双官能的”抗原结合蛋白或抗体分别是具有两个不同抗原结合位点的杂合抗原结合蛋白或抗体。双特异性抗原结合蛋白和抗体是多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体的种类并且可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤融合法或Fab′片段连接法。见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol.148：1547-1553。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将与两个不同表位结合，所述表位可以位于相同或不同的蛋白靶上。
当用于本公开的抗原结合蛋白时，术语“FGF21样信号传导”和“诱导FGF21样信号传导”意指抗原结合蛋白模拟或调节由结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物引起的体内生物效应并且诱导否则将因FGF21在体内与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合而产生的生物学反应。在评估抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能性片段)的结合作用和特异性时，在以下情况时，认为抗体或片段诱导生物反应：所述反应等于或大于5％并优选地等于或大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的包含SEQ ID NO：2的成熟形式(即，人FGF21序列的成熟形式)的野生型FGF21标准物的活性并且具有以下特性：显示出等于或多于于FGF21标准物5％的效能水平，其中在(1)实施例5的重组FGF21受体介导的萤光素酶报道因子细胞测定法；(2)实施例5的重组FGF21受体介导的细胞测定法中的ERK-磷酸化；和(3)在如实施例7所述的人脂肪细胞中的ERK-磷酸化中，EC50等于或小于100nM，例如，90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM或10nM。抗原结合蛋白的“效力”定义为在以下测定法中显示出等于或小于100nM，例如，90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM并优选小于10nM抗原结合蛋白的EC50：(1)实施例5的重组FGF21受体介导的萤光素酶报道因子细胞测定法；(2)实施例5的重组FGF21受体介导的细胞测定法中ERK-磷酸化；和(3)在如实施例7所述的人脂肪细胞中的ERK-磷酸化。
应当指出，并非全部的本公开抗原结合蛋白诱导FGF21介导的信号传导，也不是在全部情况下均需要这种特性。然而，不诱导FGF21介导的信号传导的抗原结合蛋白形成本公开的方面并且可以用作诊断试剂或其他应用。
如本文所用，术语“FGF21R”意指已知或疑似FGF21在体内形成的多聚受体复合物。在多个实施方案中，FGF21R包括(i)FGFR，例如，FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4，和(ii)β-Klotho。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。所述修饰包括碱基修饰如溴尿核苷和肌苷衍生物，核糖修饰如2′，3′-双脱氧核糖，和核苷酸间键修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、phoshoraniladate和磷酰胺酯。
术语“寡核苷酸”意指包含200个或更少核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是10至60个碱基长度。在其他实施方案中，寡核苷酸是12、13、14、15、16、17、18、19或20至40个核苷酸长度。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如，用于突变基因的构建中。寡核苷酸可以是有义或反义寡核苷酸。寡核苷酸可以包含用于检测分析的标记物，包括放射标记物、荧光标记物、半抗原或抗原性标记物。寡核苷酸可以例如用作PCR引物、克隆引物或杂交探针。
“分离的核酸分子”意指基因组来源、mRNA来源、cDNA来源或合成来源的DNA或RNA或其一些组合，它们不与这样的多核苷酸的全部或一部分连接，其中所述分离多核苷酸在自然界中存在，或者与所述分离多核苷酸在自然界中不与之连接的多核苷酸连接。为本公开的目的，应当理解“包含特定核苷酸序列的核酸分子”不包括完整的染色体。“包含”指明的核酸序列的分离核酸分子，除指明的序列之外，还可以包括直到10种或甚至直到20种其他蛋白质或其部分的编码序列，或可以包括控制所述核酸序列的编码区表达的有效连接的调节序列，和/或可以包括载体序列。
除非另外说明，否则本文讨论的任何单链多核苷酸序列左侧端是5′末端；双链多核苷酸序列的左侧方向称作5′方向。5′至3′添加新生RNA转录物的方向称作转录方向；在DNA链上具有与位于RNA转录物5′末端5′的RNA转录物相同的序列的序列区域称作“上游序列”；在DNA链上具有与位于RNA转录物3末端3′的RNA转录物相同的序列的序列区域称作“下游序列”。
术语“控制序列”指可以影响与之连接的编码序列的表达和加工多核苷酸序列。此类控制序列的性质可以取决于宿主生物。在特定的实施方案中，原核生物的控制序列可以包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。例如，真核生物的控制序列可以包括包含一个或多个转录因子识别位点的启动子、转录增强子序列和转录终止序列。“控制序列”可以包括前导序列和/或融合伴侣序列。
术语“载体”意指用来转移蛋白编码信息至宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
术语“表达载体”或“表达构建体”指适于转化宿主细胞并含有核酸序列的载体，其中所述核酸序列(与宿主细胞一起)指导和/或控制与之有效连接的一个或多个异源性编码区的表达。表达构建体可以包括，但不限于这样的序列，其影响或控制与之有效连接的编码区的转录、翻译并且(如果内含子存在)影响其RNA剪接。
如本文中所用，“有效连接”意指适用于本术语的组分处于允许它们在合适条件下实施其内在功能的关系。例如，载体中与某蛋白质编码序列“有效连接”的控制序列以这样的方式与之连接，从而在与该控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
术语“宿主细胞”意指已经用核酸序列转化或能够用核酸序列转化并且因而表达目的基因的细胞。该术语包括亲本细胞的子代，无论说是子代在形态或在遗传构成方面是否与原始亲本细胞相同，只要存在目的基因。
术语“转导”意指将基因从一个细菌至另一个细菌，通常借助噬菌体。“转导”还指通过复制缺陷型逆转录病毒获取和转移真核细胞序列。
术语“转染”意指外来或外源DNA被细胞摄入，并且当外源DNA已经导入细胞膜内部时，细胞已经“转染”。多种转染技术是本领域熟知的并且在本文中公开。见，例如，Graham等人，(1973)Virology52：456；Sambrook等人，(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，上文；Davis等人，(1986)Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier；Chu等人，(1981)Gene 13：197。此类技术可以用来将一个或多个外源DNA部分导入合适的宿主细胞内。
术语“转化”指细胞遗传特征的改变，并且细胞已经过修饰以含有新DNA或RNA时，它已经被转化。例如，在通过转染、转导或其他技术导入新遗传物质而使细胞距其天然状态受到基因修饰时，细胞被转化。在转染或转导后，起转化作用的DNA可以通过物理整合至细胞的染色体中而与细胞的DNA重组，或可以作为附加型元件短暂维持，而不复制，或可以作为质粒独立复制。当起转化作用的DNA随细胞分裂复制时，认为细胞已经“稳定转化”。
术语“多肽”或“蛋白质”在本文中互换地使用并且是指氨基酸残基的聚合物。本术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。本术语也可以包括已经修饰(例如，因添加糖残基以形成糖蛋白)或磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可以由天然存在的和非重组的细胞产生，或多肽和蛋白质可以由基因修饰的或重组的细胞产生。多肽和蛋白质可以包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子或具有天然序列的一个或多个氨基酸缺失、添加或置换的分子。术语“多肽”和“蛋白质”包括特异性或选择性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白或具有抗原结合蛋白的一个或多个氨基酸缺失、添加或置换的序列，其中所述抗原结合蛋白特异性或选择性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。术语“多肽片段”指与全长蛋白相比具有氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失的多肽。此类片段也可以与全长蛋白相比含有修饰的氨基酸。在某些实施方案中，片段是约5个至500个氨基酸长。例如，片段可以是至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450个氨基酸长。有用的多肽片段包括抗体的免疫功能性片段，包括结合结构域。在与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的抗原结合蛋白情况下，有用的片段包括但不限于CDR域、重链或轻链的可变域、抗体链的一部分或其仅包含两个CDR的可变区等。
术语“分离的蛋白质”指以下意思：主题蛋白质(1)不含通常发现与其在一起的至少一些其他蛋白质，(2)基本上不含来自相同来源(例如来自相同物种)的其他蛋白质，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已经与至少约50％在自然界中与之结合的多核苷酸、脂类、糖或其他物质分开，(5)与自然界中不与该蛋白质结合的多肽(通过共价或非共价相互作用)有效结合，或(6)不在自然界中出现。一般地，“分离的蛋白质”构成给定样品的至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何组合可以编码这种分离的蛋白质。优选地，分离的蛋白质基本上不含存在在其天然环境中存在的会干扰其治疗、诊断、预防、研究或其他用途的蛋白质或多肽或其他杂质。
多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)的“变体”包含氨基酸序列，其中对于另一个多肽序列，在氨基酸序列中插入、从其中缺失和/或置换一个或多个氨基酸残基。变体包括融合蛋白。
多肽“衍生物”是这样的多肽(例如，抗原结合蛋白或抗体)，所述已经以不同于插入、缺失或置换变体的一些方式而化学地修饰，例如，通过缀合至另一个化学部分而修饰。
如与生物物质如多肽、核酸、宿主细胞等相关的在本说明书通篇使用的术语“天然存在的”指自然界中存在的物质。
“抗原结合区”意指特异性结合所指定的抗原，例如，FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和β-Klotho的蛋白质或蛋白质部分。例如，将抗原结合蛋白的这种部分称作“抗原结合区”，其中所述部分含有与抗原相互作用并且对抗原结合蛋白赋予抗原特异性和亲和力的氨基酸残基。抗原结合区一般包括一个或多个“互补结合区”(“CDR”)。某些抗原结合区还包括一个或多个“框架区”。“CDR”是对抗原结合特异性和亲和力有贡献的氨基酸序列。“框架区”可以有助于维持CDR的正确构象以促进抗原结合区和抗原之间的结合。
在某些方面中，提供了结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的重组抗原结合蛋白。在这种语境下，“重组蛋白”是使用重组技术，即通过表达如本文所述的重组核酸产生的蛋白质。用于产生重组蛋的方法和技术是本领域熟知的。
在竞争靶上相同的表位或结合位点的抗原结合蛋白(例如，与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的中和性抗原结合蛋白、中和抗体、激动性抗原结合蛋白、激动性抗体和结合蛋白)的语境下使用时，“竞争”意指抗原结合蛋白之间如以下测定法中所确定的竞争，在所述测定法中，正在研究的抗原结合蛋白(例如，抗体或免疫功能性其片段)阻止或抑制参比分子(例如，参比配体或参比抗原结合蛋白如参比抗体)与共同抗原(例如，FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4、β-Klotho或其片段)特异性结合。许多类型的竞争性结合测定法可以用来确定试验分子是否与参比分子竞争结合。可以使用的测定法的实例包括固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(见，例如，Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见，例如，Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(见，例如，Harlow和Lane，(1988)Cold Spring Harbor，NewYork，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记物的固相直接标记RIA(见，例如，Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(见，例如，Cheung，等人，(1990)Virology176：546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。一般地，这种测定法涉及使用纯化的抗原，所述抗原与携带未标记的试验抗原结合蛋白或标记的参比抗原结合蛋白的固体表面或细胞结合。通过确定在试验抗原结合蛋白存在下与固体表面或细胞结合的标记物的量，测量竞争性抑制。通常，试验抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定法鉴定的抗原结合蛋白(竞争性抗原结合蛋白)包括与参比抗原结合蛋白相同的表位结合的抗原结合蛋白和与下述相邻表位结合的抗原结合蛋白，所述相邻表位充分地靠近参比抗原结合蛋白所结合的表位以便空间位阻出现。在本文的实施例中提供有关确定竞争性结合的方法的额外细节。通常，当竞争性抗原结合蛋白过量存在时，它将抑制参比抗原结合蛋白至与共同抗原的特异性结合至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情况下，抑制结合作用至少80％、85％、90％、95％或97％或更多。
术语“抗原”指这样的分子或分子的部分，所述分子能够由选择性结合剂(抗原结合蛋白(包括，例如，抗体或免疫功能功能性其片段)结合，并且也可以用于动物中以产生能够与该抗原结合的抗体。抗原可以拥有能够与不同抗原结合蛋白(例如抗体)相互作用的一个或多个表位。
术语“表位”意指靶分子的氨基酸，在抗原结合蛋白(例如，抗体)与靶分子结合时，所述氨基酸与该抗原结合蛋白接触。本术语包括当抗原结合蛋白(如抗体)与靶分子结合时接触到的靶分子的完整氨基酸列表的任何亚类。表位可以是连续或非连续的(例如，(i)在单链多肽中，在多肽序列内彼此不是连续的，但在靶分子的环境下由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基，或(ii)在包含两个或更多个独立组分(例如，(i)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4和(ii)β-Klotho的多聚体受体中，在一个或多个独立组分上存在，但仍由抗原结合蛋白结合的氨基酸残基)。在某些实施方案中，表位可以是模拟物，在于它们包含与用来产生抗原结合蛋白的抗原表位相似的三维结构，然而不包含或包含在用来产生抗原结合蛋白的这个表位中存在的仅一些氨基酸残基。最经常地，表位位于在蛋白质上，但是在一些情况下可以位于在其他种类的分子(如核酸)上。表位决定簇可以包括化学活跃的分子表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰或磺酰基团，并且可以具有特定三维结构性特征，和/或特定电荷特征。通常，对特定靶分子特异的抗原结合蛋白将优先识别蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶分子上的表位。
术语“同一性”指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所测定。“同一性百分数”意指在所比较的分子中氨基酸或核苷酸之间的相同残基的百分数并且基于正在比较的分子中最小者的大小来计算。对于这些计算，必须通过特殊的数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决比对中的空位(如果存在的话)。可以用来计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology，(Lesk，A.M.编著)，(1988)NewYork：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and GenomeProjects，(Smith，D.W.编著)，1993，New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著)，1994，New Jersey：Humana Press；von Heinje，G.，(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology，New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer，(Gribskov，M.和Devereux，J.编著)，1991，New York：M.Stockton Press；和Carillo等人，(1988)SIAM J. Applied Math.48：1073中描述的那些方法。
在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对。用来确定同一性百分数的计算机程序是GCG程序组，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res.12：387；GeneticsComputer Group，威斯康星大学，Madison，WI)。计算机算法GAP用来比对待确定序列同一性百分数的两个多肽或多核苷酸。将序列为它们相应的氨基酸或核苷酸的最佳匹配(“匹配跨度(matched span)”，如该算法确定)比对。随该算法一起使用空位开口罚分(其计算为3x平均对角线值，其中“平均对角线值”是正在使用的比较矩阵的对角线值的平均数；“对角线值”是由特定比较矩阵分配给每个完美氨基酸匹配的评分或数字)和空位延伸罚分(其通常是空位开口罚分1/10倍)，以及比较矩阵如PAM 250或BLOSUM 62。在某些实施方案中，本算法也使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，见Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure；对于BLOSUM 62比较矩阵，见Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)。
使用GAP程序确定多肽或核苷酸序列的同一性百分数的推荐参数如下：
算法：Needleman等人，1970，J.Mol.Biol.48：443-453；
比较矩阵：来自Henikoff等人，1992，上文的BLOSUM 62；
空位罚分：12(但是，对末端空位，无罚分)
空位长度罚分：4
相似性阈值：0
用于比对两个氨基酸序列的某些比对方案可以产生这两个序列的仅短区域的匹配，并且这种小的比对区域可以具有非常高的序列同一性，甚至在这两个全长序列之间不存在显著关系时也是如此。因而，如果想要产生跨越靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对，则可以调整选择的比对方法(例如，GAP程序)。
如本文所用，“基本上纯的”意指所描述的分子种类是存在的优势种类，即，以摩尔计，它比同一种混合物中的其他各个种类更丰富。在某些实施方案中，基本上纯的分子是组合物，其中目标种类包括存在的全部大分子种类的至少50％(以摩尔计)。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将包含该组合物中存在的全部大分子种类的至少80％、85％、90％、95％或99％。在其他实施方案中，将目标种类纯化到实质均一，其中不能通过常规检测方法在该组合物中检测到杂质种类并且因而该组合物由单一可检测大分子种类组成。
术语“治疗”和“治疗”指在治疗或改善损伤、病理或疾患方面成功的任何指标，包括任何客观或主观参数，如症状的减轻；消退；减少或使损伤、病理或疾患相对于患者更可耐受；退化或衰退的速率减慢；使退化的终点较不虚弱；改善患者的身体或精神状态。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括体格检查、神经精神性检查和/或精神病学评价的结果。例如，本文提出的某些方法可以预防地或作为紧急疗法用来治疗2型糖尿病、肥胖症和/或血脂异常，以降低血糖水平、降低循环型甘油三酯水平、降低循环型胆固醇水平和/或改善与2型糖尿病、肥胖症和血脂异常相关的症状。
“有效量”通常是足以降低症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在病因、防止症状和/或其潜在病因出现和/或改善或治疗因糖尿病、肥胖症和血脂异常所致或与之相关的损伤的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是足够以任何方式纠正疾病状态(例如，糖尿病、肥胖症或血脂异常)或症状、与所述疾病状态相关的特定状态或症状或者防止、阻碍、迟滞或逆转疾病状态或与疾病相关的任何其他不利症状进展的量。“预防有效量”是药物组合物的量，当施用至受试者时，所述量将具有预期的预防效果，例如，防止或延迟糖尿病、肥胖症或血脂异常的发作(或复发)或降低糖尿病、肥胖症或血脂异常或相关症状的发作(或复发)的似然性。完全的治疗或预防效果不必定因施用一个剂量而出现，并且可以仅在施用一系列的剂量后出现。因而，治疗性或预防有效量可以在一次或多次施用中施用。
“氨基酸”取其在本领域的通常含义。20种天然存在的氨基酸和它们缩写遵循常规用法。见Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub和D.R.Green编著)，Sinauer Associates：Sunderland，Mass.(1991)，所述文献通过引用并入本文用于任何目的。20种常规氨基酸、非天然或非天然存在的氨基酸如α-，α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸和其他非常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)也可以是多肽合适的组分并且包含于短语“氨基酸”内。非天然氨基酸(根据需要，可以替换本文公开的任何序列中的任何天然存在的氨基酸)的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和习惯，左侧方向是氨基端方向并且右侧方向是羧基端方向。可以插入抗原结合蛋白序列内或替换抗原结合序列中野生型残基的非天然存在的氨基酸的实例的非限制性名单包括β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和带有衍生化侧链的氨基酸。实例包括(呈L-形式或D-形式；缩写为括号中)：瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、Nα-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜氨酸(Nα-MeHoCit)、鸟氨酸(Orn)、Nα-甲基鸟氨酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高赖氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酸(hQ)、Nα-甲基精氨酸(NMeR)、Nα-甲基亮氨酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)、Nα-甲基谷氨酸(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)、八氢吲哚-2-羧酸(Oic)、3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)、2-茚满基甘氨酸(IgI)、对-碘代苯丙氨酸(pI-Phe)、对-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4-胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰赖氨酸(缩写为“K(Nε-glycyl)”或“K(glycyl)”或“K(gly)”)、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe或氨基-Phe)、苄基苯丙氨酸(benzylphe)、γ-羧基谷酸(γ-carboxyglu)、羟脯氨酸(hydroxypro)、对-羧基苯丙氨酸(Cpa)、α-氨基己二酸(Aad)、Nα-甲基缬氨酸(NMeVal)、N-α-甲基亮氨酸(NMeLeu)、Nα-甲基正亮氨酸(NMeNle)、环戊基甘氨酸(Cpg)、环己基甘氨酸(Chg)、乙酰基精氨酸(acetylarg)、α，β-二氨基丙酸(Dpr)、α，γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、环己基丙氨酸(Cha)、4-甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β，β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙氨酸(或联苯基丙氨酸；4Bip)、α-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、氨基已酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁连素、二氨基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、异锁连素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、4-羟脯氨酸(Hyp)、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-邻苯二甲酸(4APA)，和其他相似氨基酸及具体所列的那些氨基酸中任一者的衍生化形式。
II.总体概述
本文提供了结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白。本文公开的抗原结合蛋白的独特性质是这些蛋白质的激动性质，特别是模拟FGF21的体内作用和诱导FGF21样信号传导的能力。更突出和具体地，本文公开的一些抗原结合蛋白在几种基于细胞的体外测定法(包括实施例5的ELK-萤光素酶报道基因测定法)中在以下条件下诱导FGF21样信号传导：(1)与FGF21受体的结合和其活性是β-Klotho依赖的；(2)所述活性对FGFR1c/β-Klotho复合物具有选择性；(3)与FGFR1c/β-Klotho的结合触发FGF21样信号传导途径；和(4)效力(EC50)是与包含SEQ ID NO：2的成熟形式的野生型FGF21标准物可比，如以下基于细胞的测定法中所测量：(1)实施例5的重组FGF21受体介导的萤光素酶报道因子细胞测定法；(2)实施例5的重组FGF21受体介导的细胞测定法中的ERK-磷酸化；和(3)在如实施例7以更多细节所描述的人脂肪细胞中的ERK-磷酸化。因此，公开的抗原结合蛋白预期显示出与FGF21的天然生物学功能相一致的体内活性。这种特性使得所公开的抗原结合蛋白有希望成为治疗药用于治疗代谢疾病如2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病、代谢综合征和广义上其中需要模拟或增进FGF21体内作用的任何疾病或疾患。
在本公开的一些实施方案中，提供的抗原结合蛋白可以包含可将一个或多个互补性决定区(CDR)嵌入和/或连接至其中的多肽。在此类抗原结合蛋白中，可以将CDR嵌入“框架区”内，所述框架区使CDR定位，从而实现CDR的恰当抗原结合特性。通常，提供的此类抗原结合蛋白可以促进或增强FGFR1c和β-Klotho之间的相互作用并且可以明显诱导FGF21样信号传导。
本文所述的某些抗原结合蛋白是抗体或源自抗体。在某些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽结构基于抗体，所述抗体包括，但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(在本文中有时称作“抗体缀合物”)、半抗体及其片段。下文进一步描述多种结构。
本文提供的抗原结合蛋白已经证实与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合，并且特别与(i)人β-Klotho；(ii)人FGFR1c、人FGFR2c、人FGFR3c或人FGFR4；或(iii)包含人β-Klotho以及人FGFR1c、人FGFR2c、人FGFR3c和人FGFR4中之一的复合物结合。如本文提出的实施例中描述和其中所示，基于蛋白质印迹法结果，市售抗β-Klotho或抗FGFR1c抗体与变性的β-Klotho或FGFR1c结合，而抗原结合蛋白(激动性抗体)不结合。反过来，基于提供的FACS结果，提供的抗原结合蛋白识别细胞表面上的FGFR1c和β-Klotho的天然结构，而商业抗体不识别。见实施例9。提供的抗原结合蛋白因此模拟FGF21的天然体内生物学活性。因而，本文提供的抗原结合蛋白能够激活FGF21样信号传导活性。具体而言，公开的抗原结合蛋白可以具有一种或多种以下体内活性：诱导FGF21样信号转导途径、降低血糖水平、降低循环型脂质水平、改善代谢参数和因例如在疾患如2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病和代谢综合征中形成FGFR1c、β-Klotho和FGF21三元复合物而在体内诱导的其他生理作用。
与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)本文公开的包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白具有多种用途。一些抗原结合蛋白例如用于特异性结合测定法、用于亲和纯化(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4(包括这些公开的蛋白质的人形式)中之一的复合物，和用于鉴定具有FGF21样信号传导活性的其他激动剂的筛查分析法。
与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)本文公开的包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白可以在多种治疗应用中使用，如本文解释。例如，某些抗原结合蛋白用于治疗患者中与FGF21样信号传导过程相关的疾患，如减弱、减轻或治疗2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病和代谢综合征。抗原结合蛋白的其他用途包括，例如，诊断与β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4或FGF21相关的疾病或疾患，并且确定这些分子存在或不存在的筛查分析。本文所述的一些抗原结合蛋白可以用于治疗与降低的FGF21样信号传导活性相关的疾患、症状和/或病理。示例性疾患包括，但不限于糖尿病、肥胖症、NASH和血脂异常。
FGF21
本文公开的抗原结合蛋白诱导如本文定义的FGF21介导的信号传导。在体内，FGF21的成熟形式是该分子的活性形式。提供了编码全长FGF21的核苷酸序列；编码信号序列的核苷酸加下划线显示。ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCCAGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACAGAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGGACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTGAAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCCAGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTTGAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AATGTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAGTCC CCA CAC CGG GAC CCT GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTACCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAGCCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG GGA CCT TCC CAGGGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA(SEQ ID NO：1)
提供了全长FGF21的氨基酸序列；组成信号序列的氨基酸加下划线显示：
M D S D E T G F E H S G L W V S V L A G L L L G A C Q A H P I P D S S P L L Q F G G QV R Q R Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D G T V G G A A D Q S P E S L L Q L K AL K P G V I Q I L G V K T S R F L C Q R P D G A L Y G S L H F D P E A C S F R E L L L ED G Y N V Y Q S E A H G L P L H L P G N K S P H R D P A P R G P A R F L P L P G L P PA P P E P P G I L A P Q P P D V G S S D P L S M V G P S Q G R S P S Y A S(SEQ ID NO：2)
FGFR1c
与β-Klotho缔合时，本文公开的抗原结合蛋白与FGFR1c、尤其人FGFR1c结合。提供了编码人FGFR1c的核苷酸序列(GenBank登录号NM_023110)：
ATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCCTCTTCTGGGCTGTGCTGGTCACAGCCACACTCTGCACCGCTAGGCCGTCCCCGACCTTGCCTGAACAAGCCCAGCCCTGGGGAGCCCCTGTGGAAGTGGAGTCCTTCCTGGTCCACCCCGGTGACCTGCTGCAGCTTCGCTGTCGGCTGCGGGACGATGTGCAGAGCATCAACTGGCTGCGGGACGGGGTGCAGCTGGCGGAAAGCAACCGCACCCGCATCACAGGGGAGGAGGTGGAGGTGCAGGACTCCGTGCCCGCAGACTCCGGCCTCTATGCTTGCGTAACCAGCAGCCCCTCGGGCAGTGACACCACCTACTTCTCCGTCAATGTTTCAGATGCTCTCCCCTCCTCGGAGGATGATGATGATGATGATGACTCCTCTTCAGAGGAGAAAGAAACAGATAACACCAAACCAAACCGTATGCCCGTAGCTCCATATTGGACATCACCAGAAAAGATGGAAAAGAAATTGCATGCAGTGCCGGCTGCCAAGACAGTGAAGTTCAAATGCCCTTCCAGTGGGACACCAAACCCAACACTGCGCTGGTTGAAAAATGGCAAAGAATTCAAACCTGACCACAGAATTGGAGGCTACAAGGTCCGTTATGCCACCTGGAGCATCATAATGGACTCTGTGGTGCCCTCTGACAAGGGCAACTACACCTGCATTGTGGAGAATGAGTACGGCAGCATCAACCACACATACCAGCTGGATGTCGTGGAGCGGTCCCCTCACCGGCCCATCCTGCAAGCAGGGTTGCCCGCCAACAAAACAGTGGCCCTGGGTAGCAACGTGGAGTTCATGTGTAAGGTGTACAGTGACCCGCAGCCGCACATCCAGTGGCTAAAGCACATCGAGGTGAATGGGAGCAAGATTGGCCCAGACAACCTGCCTTATGTCCAGATCTTGAAGACTGCTGGAGTTAATACCACCGACAAAGAGATGGAGGTGCTTCACTTAAGAAATGTCTCCTTTGAGGACGCAGGGGAGTATACGTGCTTGGCGGGTAACTCTATCGGACTCTCCCATCACTCTGCATGGTTGACCGTTCTGGAAGCCCTGGAAGAGAGGCCGGCAGTGATGACCTCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTATTGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCATGGTGGGGTCGGTCATCGTCTACAAGATGAAGAGTGGTACCAAGAAGAGTGACTTCCACAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCTGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTTCTGGTTCGGCCATCACGGCTCTCCTCCAGTGGGACTCCCATGCTAGCAGGGGTCTCTGAGTATGAGCTTCCCGAAGACCCTCGCTGGGAGCTGCCTCGGGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCCCTGGGAGAGGGCTGCTTTGGGCAGGTGGTGTTGGCAGAGGCTATCGGGCTGGACAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCTGTGAAGATGTTGAAGTCGGACGCAACAGAGAAAGACTTGTCAGACCTGATCTCAGAAATGGAGATGATGAAGATGATCGGGAAGCATAAGAATATCATCAACCTGCTGGGGGCCTGCACGCAGGATGGTCCCTTGTATGTCATCGTGGAGTATGCCTCCAAGGGCAACCTGCGGGAGTACCTGCAGGCCCGGAGGCCCCCAGGGCTG GAATACTGCTACAACCCCAGCCACAACCCAGAGGAGCAGCTCTCCTCCAAGGACCTGGTGTCCTGCGCCTACCAGGTGGCCCGAGGCATGGAGTATCTGGCCTCCAAGAAGTGCATACACCGAGACCTGGCAGCCAGGAATGTCCTGGTGACAGAGGACAATGTGATGAAGATAGCAGACTTTGGCCTCGCACGGGACATTCACCACATCGACTACTATAAAAAGACAACCAACGGCCGACTGCCTGTGAAGTGGATGGCACCCGAGGCATTATTTGACCGGATCTACACCCACCAGAGTGATGTGTGGTCTTTCGGGGTGCTCCTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGCGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCACCGCATGGACAAGCCCAGTAACTGCACCAACGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCACAGAGACCCACCTTCAAGCAGCTGGTGGAAGACCTGGACCGCATCGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTACCTGGACCTGTCCATGCCCCTGGACCAGTACTCCCCCAGCTTTCCCGACACCCGGAGCTCTACGTGCTCCTCAGGGGAGGATTCCGTCTTCTCTCATGAGCCGCTGCCCGAGGAGCCCTGCCTGCCCCGACACCCAGCCCAGCTTGCCAATGGCGGACTCAAACGCCGCTGA (SEQ ID NO：3)
提供了人FGFR1c的氨基酸序列(GenBank登录号NP_075598)：
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGYKVRYATWSHMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQMMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNHNLLGACTQDGPLYVIVFYASKGNLRFYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR(SEQ ID NO：4).
本文所述的抗原结合蛋白结合FGFR1c的胞外部分。FGFR1c的胞外区域的实例是：
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNRMPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPS SGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLY(SEQ ID NO：5)
如本文所述，FGFR1c蛋白也可以包括片段。如本文所用，将所述术语互换地使用以意指一旦与β-Klotho和FGF21缔合，则诱导FGF21样信号传导活性的受体，尤其并且除非另外说明，是人受体。
术语FGFR1c还包括FGFR1c氨基酸序列的翻译后修饰形式，例如，可能的N-联糖基化位点。因而，抗原结合蛋白可以与在一个或多个位置处糖基化的蛋白质结合或从中产生。
β-Klotho
本文公开的抗原结合蛋白与β-Klotho、尤其人β-Klotho结合。提供了编码β-Klotho的核苷酸序列(GenBank登录号NM_175737)：
ATGAAGCCAGGCTGTGCGGCAGGATCTCCAGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCACTGATGAAATAACCACACGCTATAGGAATACAATGTCCAACGGGGGATTGCAAAGATCTGTCATCCTGTCAGCACTTATTCTGCTACGAGCTGTTACTGGATTCTCTGGAGATGGAAGAGCTATATGGTCTAAAAATCCTAATTTTACTCCGGTAAATGAAAGTCAGCTGTTTCTCTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTTCTGGGGTATTGGGACTGGAGCATTGCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGAAGGATGGAAAAGGACCTTCTATATGGGATCATTTCATCCACACACACCTTAAAAATGTCAGCAGCACGAATGGTTCCAGTGACAGTTATATTTTTCTGGAAAAAGACTTATCAGCCCTGGATTTTATAGGAGTTTCTTTTTATCAATTTTCAATTTCCTGGCCAAGGCTTTTCCCCGATGGAATAGTAACAGTTGCCAACGCAAAAGGTCTGCAGTACTACAGTACTCTTCTGGACGCTCTAGTGCTTAGAAACATTGAACCTATAGTTACTTTATACCACTGGGATTTGCCTTTGGCACTACAAGAAAAATATGGGGGGTGGAAAAATGATACCATAATAGATATCTTCAATGACTATGCCACATACTGTTTCCAGATGTTTGGGGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCATATCTAGTGGCTTGGCATGGGTATGGGACAGGTATGCATGCCCCTGGAGAGAAGGGAAATTTAGCAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACTTGATCAAGGCTCACTCGAAAGTTTGGCATAACTACAACACACATTTCCGCCCACATCAGAAGGGTTGGTTATCGATCACGTTGGGATCTCATTGGATCGAGCCAAACCGGTCGGAAAACACGATGGATATATTCAAATGTCAACAATCCATGGTTTCTGTGCTTGGATGGTTTGCCAACCCTATCCATGGGGATGGCGACTATCCAGAGGGGATGAGAAAGAAGTTGTTCTCCGTTCTACCCATTTTCTCTGAAGCAGAGAAGCATGAGATGAGAGGCACAGCTGATTTCTTTGCCTTTTCTTTTGGACCCAACAACTTCAAGCCCCTAAACACCATGGCTAAAATGGGACAAAATGTTTCACTTAATTTAAGAGAAGCGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACAACAACCCTCGAATCTTGATTGCTGAGAATGGCTGGTTCACAGACAGTCGTGTGAAAACAGAAGACACCACGGCCATCTACATGATGAAGAATTTCCTCAGCCAGGTGCTTCAAGCAATAAGGTTAGATGAAATACGAGTGTTTGGTTATACTGCCTGGTCTCTCCTGGATGGCTTTGAATGGCAGGATGCTTACACCATCCGCCGAGGATTATTTTATGTGGATTTTAACAGTAAACAGAAAGAGCGGAAACCTAAGTCTTCAGCACACTACTACAAACAGATCATACGAGAAAATGGTTTTTCTTTAAAAGAGTCCACGCCAGATGTGCAGGGCCAGTTTCCCTGTGACTTCTCCTGGGGTGTCACTGAATCTGTTCTTAAGCCCGAGTCTGTGGCTTCGTCCCCACAGTTCAGCGATCCTCATCTGTACGTGTGGAACGCCACTGGCAACAGACTGTTGCACCGAGTGGAAGGGGTGAGGCTGAAAACACGACCCGCTCAATGCACAGATTTTGTAAACATCA AAAAACAACTTGAGATGTTGGCAAGAATGAAAGTCACCCACTACCGGTTTGCTCTGGATTGGGCCTCGGTCCTTCCCACTGGCAACCTGTCCGCGGTGAACCGACAGGCCCTGAGGTACTACAGGTGCGTGGTCAGTGAGGGGCTGAAGCTTGGCATCTCCGCGATGGTCACCCTGTATTATCCGACCCACGCCCACCTAGGCCTCCCCGAGCCTCTGTTGCATGCCGACGGGTGGCTGAACCCATCGACGGCCGAGGCCTTCCAGGCCTACGCTGGGCTGTGCTTCCAGGAGCTGGGGGACCTGGTGAAGCTCTGGATCACCATCAACGAGCCTAACCGGCTAAGTGACATCTACAACCGCTCTGGCAACGACACCTACGGGGCGGCGCACAACCTGCTGGTGGCCCACGCCCTGGCCTGGCGCCTCTACGACCGGCAGTTCAGGCCCTCACAGCGCGGGGCCGTGTCGCTGTCGCTGCACGCGGACTGGGCGGAACCCGCCAACCCCTATGCTGACTCGCACTGGAGGGCGGCCGAGCGCTTCCTGCAGTTCGAGATCGCCTGGTTCGCCGAGCCGCTCTTCAAGACCGGGGACTACCCCGCGGCCATGAGGGAATACATTGCCTCCAAGCACCGACGGGGGCTTTCCAGCTCGGCCCTGCCGCGCCTCACCGAGGCCGAAAGGAGGCTGCTCAAGGGCACGGTCGACTTCTGCGCGCTCAACCACTTCACCACTAGGTTCGTGATGCACGAGCAGCTGGCCGGCAGCCGCTACGACTCGGACAGGGACATCCAGTTTCTGCAGGACATCACCCGCCTGAGCTCCCCCACGCGCCTGGCTGTGATTCCCTGGGGGGTGCGCAAGCTGCTGCGGTGGGTCCGGAGGAACTACGGCGACATGGACATTTACATCACCGCCAGTGGCATCGACGACCAGGCTCTGGAGGATGACCGGCTCCGGAAGTACTACCTAGGGAAGTACCTTCAGGAGGTGCTGAAAGCATACCTGATTGATAAAGTCAGAATCAAAGGCTATTATGCATTCAAACTGGCTGAAGAGAAATCTAAACCCAGATTTGGATTCTTCACATCTGATTTTAAAGCTAAATCCTCAATACAATTTTACAACAAAGTGATCAGCAGCAGGGGCTTCCCTTTTGAGAACAGTAGTTCTAGATGCAGTCAGACCCAAGAAAATACAGAGTGCACTGTCTGCTTATTCCTTGTGCAGAAG AAACCACTGATATTCCTGGGTTGTTGCTTCTTCTCCACCCTGGTTCTACTCTTATCAATTGCCATTTTTCAAAGGCAGAAGAGAAGAAAGTTTTGGAAAGCAAAAAACTTACAACACATACCATTAAAGAAAGGCAAGAGAGTTGTTAGCTAA(SEQ ID NO：6)
提供了全长人β-Klotho的氨基酸序列(GenBank登录号NP_783864)：
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本文所述的抗原结合蛋白结合β-Klotho的胞外部分。β-Klotho的胞外区域的实例是：
MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKP(SEQ ID NO：8.)
鼠形式的β-Klotho和片段及其子序列可以用于研究和/或构建本文提供的分子中。提供了编码鼠β-Klotho的核苷酸序列(GenBank登录号NM_031180)：
ATGAAGACAGGCTGTGCAGCAGGGTCTCCGGGGGAATGAATGGATTTTCTTCAGCTCTGATGAAAGAAACACACGCTCTAGGAAAACAATGTCCAACAGGGCACTGCAAAGATCTGCCGTGCTGTCTGCGTTTGTTCTGCTG CGAGCTGTTACCGGCTTCTCCGGAGACGGGAAAGCAATATGGGATAAAAAACAGTACGTGAGTCCGGTAAACCCAAGTCAGCTGTTCCTCTATGACACTTTCCCTAAAAACTTTTCCTGGGGCGTTGGGACCGGAGCATTTCAAGTGGAAGGGAGTTGGAAGACAGATGGAAGAGGACCCTCGATCTGGGATCGGTACGTCTACTCACACCTGAGAGGTGTCAACGGCACAGACAGATCCACTGACAGTTACATCTTTCTGGAAAAAGACTTGTTGGCTCTGGATTTTTTAGGAGTTTCTTTTTATCAGTTCTCAATCTCCTGGCCACGGTTGTTTCCCAATGGAACAGTAGCAGCAGTGAATGCGCAAGGTCTCCGGTACTACCGTGCACTTCTGGACTCGCTGGTACTTAGGAATATCGAGCCCATTGTTACCTTGTACCATTGGGATTTGCCTCTGACGCTCCAGGAAGAATATGGGGGCTGGAAAAATGCAACTATGATAGATCTCTTCAACGACTATGCCACATACTGCTTCCAGACCTTTGGAGACCGTGTCAAATATTGGATTACAATTCACAACCCTTACCTTGTTGCTTGGCATGGGTTTGGCACAGGTATGCATGCACCAGGAGAGAAGGGAAATTTAACAGCTGTCTACACTGTGGGACACAACCTGATCAAGGCACATTCGAAAGTGTGGCATAACTACGACAAAAACTTCCGCCCTCATCAGAAGGGTTGGCTCTCCATCACCTTGGGGTCCCATTGGATAGAGCCAAACAGAACAGACAACATGGAGGACGTGATCAACTGCCAGCACTCCATGTCCTCTGTGCTTGGATGGTTCGCCAACCCCATCCACGGGGACGGCGACTACCCTGAGTTCATGAAGACGGGCGCCATGATCCCCGAGTTCTCTGAGGCAGAGAAGGAGGAGGTGAGGGGCACGGCTGATTTCTTTGCCTTTTCCTTCGGGCCCAACAACTTCAGGCCCTCAAACACCGTGGTGAAAATGGGACAAAATGTATCACTCAACTTAAGGCAGGTGCTGAACTGGATTAAACTGGAATACGATGACCCTCAAATCTTGATTTCGGAGAACGGCTGGTTCACAGATAGCTATATAAAGACAGAGGACACCACGGCCATCTACATGATGAAGAATTTCCTAAACCAGGTTCTTCAAGCAATAAAATTTGATGAAATCCGCGTGTTTGGTTATACGGCCTGGACTCTCCTGGATGGCTTTGAGTGGCAGGATGCCTATACGACCCGACGAGGGCTGTTTTATGTGGACTTTAACAGTGAGCAGAAAGAGAGGAAACCCAAGTCCTCGGCTCATTACTACAAGCAGATCATACAAGACAACGGCTTCCCTTTGAAAGAGTCCACGCCAGACATGAA GGGTCGGTTCCCCTGTGATTTCTCTTGGGGAGTCACTGAGTCTGTTCTTAAGCCCGAGTTTACGGTCTCCTCCCCGCAGTTTACCGATCCTCACCTGTATGTGTGGAATGTCACTGGCAACAGATTGCTCTACCGAGTGGAAGGGGTAAGGCTGAAAACAAGACCATCCCAGTGCACAGATTATGTGAGCATCAAAAAACGAGTTGAAATGTTGGCAAAAATGAAAGTCACCCACTACCAGTTTGCTCTGGACTGGACCTCTATCCTTCCCACTGGCAATCTGTCCAAAGTTAACAGACAAGTGTTAAGGTACTATAGGTGTGTGGTGAGCGAAGGACTGAAGCTGGGCGTCTTCCCCATGGTGACGTTGTACCACCCAACCCACTCCCATCTCGGCCTCCCCCTGCCACTTCTGAGCAGTGGGGGGTGGCTAAACATGAACACAGCCAAGGCCTTCCAGGACTACGCTGAGCTGTGCTTCCGGGAGTTGGGGGACTTGGTGAAGCTCTGGATCACCATCAATGAGCCTAACAGGCTGAGTGACATGTACAACCGCACGAGTAATGACACCTACCGTGCAGCCCACAACCTGATGATCGCCCATGCCCAGGTCTGGCACCTCTATGATAGGCAGTATAGGCCGGTCCAGCATGGGGCTGTGTCGCTGTCCTTACATTGCGACTGGGCAGAACCTGCCAACCCCTTTGTGGATTCACACTGGAAGGCAGCCGAGCGCTTCCTCCAGTTTGAGATCGCCTGGTTTGCAGATCCGCTCTTCAAGACTGGCGACTATCCATCGGTTATGAAGGAATACATCGCCTCCAAGAACCAGCGAGGGCTGTCTAGCTCAGTCCTGCCGCGCTTCACCGCGAAGGAGAGCAGGCTGGTGAAGGGTACCGTCGACTTCTACGCACTGAACCACTTCACTACGAGGTTCGTGATACACAAGCAGCTGAACACCAACCGCTCAGTTGCAGACAGGGACGTCCAGTTCCTGCAGGACATCACCCGCCTAAGCTCGCCCCAGCCGCCTGGCTGTAACACCCTGGGGAGTGCGCAAGCTCCTTGCGTGGATCCGGAGGGAACTACAGAGACAGGGATATCTACATCACAGCCAATGGCATCGATGACCTGGCTCTAGAGGATGATCAGATCCGAAAGTACTACTTGGAGAAGTATGTCCAGGAGGCTCTGAAAGCATATCTCATTGACAAGGTCAAAATCAAAGGCTACTATGCATTCAAACTGACTGAAGAGAAATCTAAGCCTAGATTTGGATTTTTCACCTCTGACTTCAGAGCTAAGTCCTCTGTCCAGTTTTTACAGCAAGCTGATCAGCAGCAGTGGCCTCCCCGCTGAGAACAGAAGTCCTGCGTGTGGTCAGCCTGCGGAAGACACAGACTGCACCATTTGCTCATTTCTCGTGGAGAAGAAACCACTCATCTTCTTCGGTTGCTGCTTCATCTCCACTCTGGCTGTACTGCTATCCATCACCGTTTTTCATCATCAAAAGAGAAGAAAATTCCAGAAAGCAAGGAACTTACAAAATATACCATTGAAGAAAGGCCACAGCAGAGTTTTCAGCTAA(SEQID NO：469)
提供了全长鼠β-Klotho的氨基酸序列(GenBank登录号NP_112457)：
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCTICSFLVEKKPLIFFGCCFISTLAVLLSITVFHHQKRRKFQKARNLQNIPLKKGHSRVFS(SEQ ID NO：468)
如本文所述，β-Klotho蛋白也可以包括片段。如本文所用，将所述术语互换地使用以意指一旦与FGFR1c和FGF21缔合，则诱导FGF21样信号传导活性的共同受体，尤其并且除非另外说明，是人共同受体。
术语β-Klotho还包括β-Klotho氨基酸序列的翻译后修饰形式，例如，可能的N-联糖基化位点。因而，抗原结合蛋白可以与在一个或多个位置处糖基化的蛋白质结合或从中产生。
特异性结合β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4c中 一种或多种的抗原结合蛋白
提供了用于调节FGF21样信号传导的多种选择性结合剂。这些结合剂包括，例如含有抗原结合结构域(例如，单链抗体、结构域抗体、半抗体、免疫粘附和具有抗原结合区的多肽)和与FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和β-Klotho、尤其人FGFR1c和人β-Klotho特异性结合的抗原结合蛋白。所述结合剂中的一些例如用于模拟因FGFR1c与β-Klotho和与FGF21缔合所产生的信号传导作用，并且因而可以用来增强或调节与FGF21样信号传导相关的一种或多种活性。
通常，提供的抗原结合蛋白一般包含如本文所述的一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。在一些实施方案中，抗原结合蛋白由克隆天然地表达，而在其他实施方案中，该抗原结合蛋白可以包含(a)多肽框架结构和(b)插入所述多肽框架结构中和/或与之连接的一个或多个CDR。在一些这样的实施方案中，CDR形成由本文所述克隆表达的重链或轻链的组分；在其他实施方案中，可以将CDR插入其中不天然表达CDR的框架中。多肽框架结构可以采取多种不同的形式。例如，多肽框架结构可以是或包含天然存在的抗体或片段或其变体的框架，或它可以在性质上是完全合成的。下文进一步描述多种抗原结合蛋白结构的实例。
在其中抗原结合蛋白包含(a)多肽框架结构和(b)被插入多肽框架结构中和/或与之连接的一个或多个CDR的一些实施方案中，抗原结合蛋白的多肽框架结构是抗体或源自抗体，所述抗体包括，但不限于，单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文中有时称作“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合物(本文中有时称作“抗体缀合物”)，和每一者的部分或片段。在一些情况下，抗原结合蛋白是抗体的免疫学片段(例如，Fab、Fab′、F(ab′)2或scFv)。
如本文提供的某些抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4(包括这些蛋白质的人形式)中之一的复合物特异性结合。在一个实施方案中，抗原结合蛋白与包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的人FGFR1c和具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的人β-Klotho特异性结合，并且在另一个实施方案中，抗原结合蛋白与包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的人FGFR1c和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的人β-Klotho特异性结合并且诱导FGF21样信号传导。因而。抗原结合蛋白可以，但是不需要，诱导FGF21样信号传导。
抗原结合蛋白结构
与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4(包括本文提供的这些蛋白质的人形式)中之一的复合物特异性结合的一些抗原结合蛋白具有一般与天然存在的抗体相关的结构。这些抗体的结构单元一般包含一个或多个四聚体，每个四聚体由两个相同的对偶多肽链组成，不过一些种类的哺乳动物还产生具有仅单条重链的抗体。在常见的抗体中，每对或对偶物包括一条全长“轻链”(在某些实施方案中，约25kDa)和一条全长“重链”(在某些实施方案中，约50-70kDa)。每一单独的免疫球蛋白链由几个“免疫球蛋白结构域”组成，每个免疫球蛋白结构域由大约90至110个氨基酸组成并且表现特征性折叠样式。这些结构域组成抗体多肽的基本单元。每条链的氨基端部分一般包括主要负责抗原识别的可变域。羧基端部分在进化上比链的另一端更保守并且称作“恒定区”或“C区”。人轻链划分为κ(“κ”)和λ(“λ”)轻链。并且这些轻链的每一种含有一个可变域和一个恒定域。重链一般划分为μ、δ、γ、α或ε链，并且这些链将抗体同种型分别限定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有几个亚型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM亚型包括IgM和IgM2。IgA亚型包括IgA1和IgA2。在人中，IgA和IgD同种型含有四条重链和四条轻链；IgG和IgE同种型含有两条重链和两条轻链；并且IgM同种型含有五条重链和五条轻链。重链C区一般包含可以负责效应子功能的一个或多个结构域。重链恒定区结构域的数目将取决于同种型。例如，IgG重链各自含有三个C区结构域，称作CH1、CH2和CH3。提供的抗体可以具有这些同种型和亚型的任一种。在某些实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白是IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体。
在轻链和重链内部中，可变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸“J”区连接，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。见，例如，Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul，W.编著)1989，New York：Raven Press(因而通过引用的方式完整并入用于全部目的)。每个轻链/重链对的可变区一般形成抗原结合位点。
特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的示例性单克隆抗体的IgG2重链恒定域的一个实例具有以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTIMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGL PAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：9)
结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的示例性单克隆抗体的κ轻链恒定域的一个实例具有以下氨基酸序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：10).
结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的示例性单克隆抗体的λ轻链恒定域的一个实例具有以下氨基酸序列：
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：11)
免疫球蛋白链的可变区通常显示相同的总体结构，其包含由三个超变区(更经常称作“互补性决定区”或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。来自上文提到的每个重链/轻链对的两条链的CDR一般通过框架区对齐以形成与靶蛋白(例如，(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物)上的特定表位特异性结合的结构。从N端至C端，天然存在的轻链和重链可变区一般均遵循这些元件的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经提出一种编号体系以将数字分配给在这些结构域的每一者中占据位置的氨基酸。这种编号体系在Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，MD)中定义。根据需要，CDR也可以根据替代性命名方案再定义，如Chothia的那种(见Chothia&Lesk，1987，J. Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883或Honegger&Pluckthun，2001，J.Mol.Biol.309：657-670)。
表2中描述了本文提供的抗原结合蛋白的多种重链和轻链可变区。这些可变区的每一个可以分别与以上重链和轻链恒定区连接以形成完整的抗体重链和轻链。另外，可以合并如此产生的重链和轻链序列中的每一个以形成完整的抗体结构。应当理解本文提供的重链和轻链可变区也可以与具有与上文所列的示例性序列不同的序列的其他恒定域连接。
在表1A和1B中总结了所提供抗体的一些全长轻链和重链及其相应氨基酸序列的具体实例。表1A显示了示例性轻链序列，并且表1B显示了示例性重链序列。
表1A-示例性抗体轻链序列
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Figure BDA00001983794100491
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表1B-示例性抗体重链序列
Figure BDA00001983794100522
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Figure BDA00001983794100561
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Figure BDA00001983794100601
再次，表1B和下表6A中所列的示例性重链(H1、H2、H3等)的每一个可以与表1A和下表6A中所显示的任何示例性轻链组合以形成抗体。此类组合的实例包括H1与L1至L18中任一者组合；H2与L1至L18中任一者组合；H3与L1至L18中任一者组合等。在一些情况下，抗体包括来自表1A和1B和下表6A中所列那些中的至少一条重链和一条轻链；轻链和重链配对的具体实例包括L1与H1、L2与H2、L3与H3、L4与H4、L5与H5、L6与H6、L7与H7、L8与H8、L9与H9、L10与H10、L11与H11、L12与H12、L13与H13、L14与H14、L15与H15、L16与H16、L17与H17和L18与H18。除包含来自相同克隆的重链和轻链的抗原结合蛋白之外，来自第一克隆的重链可以与来自第二克隆的轻链配对(例如，来自46D11的重链与来自16H7的轻链配对或来自16H7的重链与来自46D11的轻链配对)。通常，此类配对可以包括，具有90％或更大同源性的VL可以与天然存在的克隆的重链配对。在一些情况下，抗体包含表1A与1B和下表6A中所列的两条不同重链和两条不同轻链。在其他情况下，抗体含有两条相同的轻链和两条相同的重链。作为实例，抗体或免疫功能性片段可以包括两条H1重链和两条L1轻链，或两条H2重链和两条L2轻链，或两条H3重链和两条L3轻链和如表1A与1B和下表6A中所列的成对轻链和成对重链的其他相似组合。
在本公开的另一个方面，提供“半抗体”。半抗体是单价抗原结合蛋白，其包含(i)完整轻链，和(ii)与Fc区(例如，SEQ ID NO：441的IgG2Fc区)融合的重链，任选地经接头融合。接头可以是(G4S)x接头，其中X是非零整数(例如，(G4S)8；SEQ ID NO：440)。半抗体可以使用所提供的重链和轻链组分构建。实施例14中公开了半抗体的具体实施例。
提供的其他抗原结合蛋白是通过表1A与1B和下表6A中所显示的重链和轻链组合所形成的抗体的变体，并且包含与这些链的氨基酸序列分别具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的轻链和/或重链。在一些情况下，此类抗体包括至少一条重链和一条轻链，而在其他情况下，变体形式含有两条相同的轻链和两条相同的重链。
抗原结合蛋白的可变域
另外，提供了抗原结合蛋白，其含有选自如表2B中所示的VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17和VH18中的抗体重链可变区和/或选自如表2A中所示VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17和VL18的抗体轻链可变区，和这些轻链和重链可变区的免疫功能性片段、衍生物、突变蛋白和变体。
表2A-示例性抗体可变轻链(V L )
Figure BDA00001983794100631
Figure BDA00001983794100641
Figure BDA00001983794100651
表2B-示例性抗体可变重链(V H )
Figure BDA00001983794100652
Figure BDA00001983794100661
Figure BDA00001983794100671
Figure BDA00001983794100681
Figure BDA00001983794100691
表2C-抗体可变轻链(V L )的编码序列
Figure BDA00001983794100692
Figure BDA00001983794100701
Figure BDA00001983794100711
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Figure BDA00001983794100771
Figure BDA00001983794100781
表2D-抗体可变重链(V H )的编码序列
Figure BDA00001983794100791
Figure BDA00001983794100801
Figure BDA00001983794100811
Figure BDA00001983794100821
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Figure BDA00001983794100841
Figure BDA00001983794100851
Figure BDA00001983794100861
Figure BDA00001983794100871
表2B中所列的重链可变区的每一个可以与表2A中所显示的任何轻链可变区组合以形成抗原结合蛋白。此类组合的实例包括VH1与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18中的任一者组合；VH2与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18中的任一者组合；VH3与VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18中的任一者组合等。
在一些情况下，抗原结合蛋白包括来自表2A和2B中所列的那些可变区中的至少一个重链可变区和/或一个轻链可变区。在一些情况下，抗原结合蛋白包括来自2B中所列的那些可变区中的两个不同重链可变区和/或轻链可变区。此类抗原结合蛋白的实例包含(a)一个VH1，和(b)VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17或VH18中的一种。另一个实例包含(a)一个VH2，和(b)VH1、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17或VH18中的一种。再次，另一个实例包含(a)一个VH3，和(b)VH1、VH2、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17或VH18等中的一种。
再次，此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL1，和(b)VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18中的一种。再次，此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL2，和(b)VL1、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11或VL12中的一种。再次，此类抗原结合蛋白的另一个实例包含(a)一个VL3，和(b)VL1、VL2、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18等中的一种。
重链可变区的多种组合可以与轻链可变区的多种组合中的任一种组合。
在其他实施方案中，抗原结合蛋白包含两个相同的轻链可变区和/或两个相同的重链可变区。作为实例，抗原结合蛋白可以是抗体或其免疫功能性片段，其包含与如表2A与2B中所列的成对轻链可变区和成对重链可变区组合的两个轻链可变区和两个重链可变区。
提供的一些抗原结合蛋白包含重链可变域，所述重链可变域包含仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处与选自VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17和VH18的重链可变域序列不同的氨基酸序列，其中每个这种序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或置换，其中所述缺失、插入和/或置换产生相对于前述可变域序列而言不多于15个氨基酸变化。在一些抗原结合蛋白中的重链可变区包含与重链可变区VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17和VH18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
某些抗原结合蛋白包含轻链可变域，所述轻链可变域包含仅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基处与选自VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17和VL18的轻链可变域序列不同的氨基酸序列，其中每个这种序列差异独立地是一个氨基酸的缺失、插入或置换，其中所述缺失、插入和/或置换产生相对于前述可变域序列而言不多于15个氨基酸变化。在一些抗原结合蛋白中的轻链可变区包含与轻链可变区VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17和VL18的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在其他情况下，抗原结合蛋白包含轻链可变域和重链可变域的以下配对：VL1与VH1、VL2与VH2、VL2与VH3、VL3与VH4、VL4与VH5、VL5与VH6、VL6与VH7、VL7与VH8、VL8与VH8、VL9与VH9、VL9与VH10、VL10与VH11、VL11与VH11、VL12与VH12、VL13与VH13、VL14与VH14、VL15与VH15、VL16与VH16、VL17与VH17和VL18与VH18。在一些情况下，以上配对中的抗原结合蛋白可以包含与所述可变域具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
另外，其他抗原结合蛋白，例如抗体或免疫功能性片段，包括如刚描述的变体重链和变体轻链的变体形式。
抗原结合蛋白CDR
在多个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白可以包含将一个或多个CDR移植、插入和/或连接至其中的多肽。抗原结合蛋白可以具有1、2、3、4、5或6个CDR。抗原结合蛋白因而可以具有例如一个重链CDR1(“CDRH1”)，和/或一个重链CDR2(“CDRH2”)，和/或一个重链CDR3(“CDRH3”)，和/或一个轻链CDR1(“CDRL1”)，和/或一个轻链CDR2(“CDRL2”)，和/或一个轻链CDR3(“CDRL3”)。一些抗原结合蛋白包括CDRH3和CDRL3。分别在表3A和3B中和在下表6C中标出特定的重链和轻链CDR。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用由Kabat等人在Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991中描述的体系标识。根据需要，CDR也可以再定义根据替代性命名方案，如Chothia的那种(见Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883或Honegger&Pluckthun，2001，J.Mol.Biol.309：657-670)。本文公开的某些抗体包含一个或多个氨基酸序列，其与表3A(CDRH)和表3B(CDRL)中和下表6C中提出一个或多个CDR的氨基酸序列相同或与之具有显著序列同一性。
表3A-示例性CDRH序列
Figure BDA00001983794100901
Figure BDA00001983794100911
Figure BDA00001983794100921
Figure BDA00001983794100931
表3B-示例性CDRL序列
Figure BDA00001983794100932
Figure BDA00001983794100941
Figure BDA00001983794100951
表3C-CDRH的编码序列
Figure BDA00001983794100952
Figure BDA00001983794100971
Figure BDA00001983794100981
Figure BDA00001983794100991
表3D-CDRL的编码序列
Figure BDA00001983794101001
Figure BDA00001983794101011
上文已经描述了在天然存在的抗体内部的CDR的结构和特性。简而言之，在传统的抗体中，将CDR嵌入重链和轻链可变区中的框架内部，其中它们构成负责抗原结合和识别的区域。可变区包含在框架区内部(由Kabat等人，1991命名为框架区1-4，FR1、FR2、FR3和FR4；还见Chothia和Lesk，1987，上文)的至少三个重链或轻链CDR，见上文(Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Public Health Service N.I.H.，Bethesda，MD；还见Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature342：877-883)。然而，如本文所述，本文提供的CDR可以不仅用来限定传统抗体结构的抗原结合结构域，还可以嵌入多种其他多肽结构中。
在一个方面，提供的CDR是(a)选自以下的CDRH：(i)选自SEQID NO：121-131的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：132-144的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：145-157的CDRH3；和(iv)在(i)、(ii)及(iii)中的CDRH，其含有不多于5、4、3、2或1个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入；(B)选自以下的CDRL：(i)选自SEQ IDNO：158-170的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：171-179的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：180-194的CDRL3；和(iv)在(i)、(ii)及(iii)中的CDRL，其含有不多于1、2、3、4或5个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入。
在另一个方面，抗原结合蛋白包含表3A与3B和下表6C中所列的CDR的1、2、3、4、5或6个变体形式，每个变体形式与表3A与3B和下表6C中所列的CDR序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。一些抗原结合蛋白包含表3A与3B和下表6C中所列的1、2、3、4、5或6个CDR，每个CDR与这些表中所列的CDR相差不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
在又一个方面，抗原结合蛋白包括CDRL1、CDRL2和CDRL3的以下组合：SEQ ID NO：167、176与190；SEQ ID NO：167、176与189、SEQ ID NO：166、176与188；SEQ ID NO：166、176与188；SEQ ID NO：161、174与183；SEQ ID NO：162、173与184；SEQID NO：162、173与186；SEQ ID NO：164、173与186；SEQ ID NO：160、173与182；SEQ ID NO：163、173与185；SEQ ID NO：163、173与185；SEQ ID NO：159、172与181；SEQ ID NO：165、175与187；SEQ ID NO：158、171与180；SEQ ID NO：168、171与191；SEQ ID NO：169、177与192；SEQ ID NO：170、178与193；SEQID NO：163、173与194；SEQ ID NO：163、173与194；和SEQ IDNO：163、179与194。
在额外的方面，抗原结合蛋白包括CDRH1、CDRH2和CDRH3的以下组合：SEQ ID NO：122、133与146；SEQ ID NO：122、133与147；SEQ ID NO：122、133与148；SEQ ID NO：122、134与148；SEQ ID NO：124、136与150；SEQ ID NO：124、138与152；SEQID NO：124、139与152；SEQ ID NO：124、137与151；SEQ ID NO：124、137与151；SEQ ID NO：131、140与153；SEQ ID NO：125、140与153；SEQ ID NO：123、135与149；SEQ ID NO：123、135与149；SEQ ID NO：121、132与145；SEQ ID NO：126、133与154；SEQ ID NO：130、144与157；SEQ ID NO：127、135与155；SEQID NO：129、142与156；SEQ ID NO：128、141与156；和SEQ IDNO：128、143与156。
在另一个方面，抗原结合蛋白包括CDRL1、CDRL2及CDRL3与CDRH1、CDRH2及CDRH3的以下组合：SEQ ID NO：167、176及190；SEQ ID NO：167、176及189、SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：166、176及188；SEQ ID NO：161、174及183；SEQID NO：162、173及184；SEQ ID NO：162、173及186；SEQ ID NO：164、173及186；SEQ ID NO：160、173及182；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：163、173及185；SEQ ID NO：159、172及181；SEQ ID NO：165、175及187；SEQ ID NO：158、171及180；SEQ ID NO：168、171及191；SEQ ID NO：169、177和192；SEQID NO：170、178及193；SEQ ID NO：163、173及194；SEQ ID NO：163、173和194；SEQ ID NO：163、179及194与SEQ ID NO：122、133及146；SEQ ID NO：122、133及147；SEQ ID NO：122、133及148；SEQ ID NO：122、134及148；SEQ ID NO：124、136及150；SEQ ID NO：124、138及152；SEQ ID NO：124、139及152；SEQID NO：124、137及151；SEQ ID NO：124、137及151；SEQ ID NO：131、140及153；SEQ ID NO：125、140及153；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：123、135及149；SEQ ID NO：121、132及145；SEQ ID NO：126、133及154；SEQ ID NO：130、144及157；SEQ ID NO：127、135及155；SEQ ID NO：129、142及156；SEQID NO：128、141及156；以及SEQ ID NO：128、143及156。
共有序列
在又一个方面，本文公开的CDR包括源自相关单克隆抗体组的共有序列。如本文所述，“共有序列”指氨基酸序列，其具有众多序列当中共同的保守氨基酸和在给定氨基酸序列内部变动的可变氨基酸。提供的CDR共有序列包括与CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2和CDRL3中的每一者相对应的CDR。
使用与所公开抗体的VH和VL相对应的CDR的标准分析，确定共有序列，所述抗体中一些抗体特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。通过在与VH或VL相对应的相同序列内部保持所述CDR连续而确定共有序列。
轻链CDR3
组1
LQHNSYPLT(SEQ ID NO：267)
组2
MQSLQTPFT(SEQ ID NO：268)
组3
QQYNNWPPT(SEQ ID NO：269)
组4
MQSIQLPRT(SEQ ID NO：270)
组5
QQANDFPIT(SEQ ID NO：271)
组6
MQALQTPCS(SEQ ID NO：272)
组7
QVWD  G N  SDHVV(SEQ ID NO：273)
QVWD  N T  SDHVV(SEQ ID NO：274)
QVWD  S S  SDHVV(SEQ ID NO：275)
QVWD X1 X2 SDHVV(SEQ ID NO：276)
其中X1是G、S或N并且X2是S、T或N。
组8
QQ  C  G  S  S  P  L  T(SEQ ID NO：277)
QQ  Y  G  G  S  P  L  T(SEQ ID NO：278)
QQ  Y  G  S  A  P  L  T(SEQ ID NO：279)
QQ  Y  G  S  S  F     T(SEQ ID NO：280)
QQ  Y  G  S  S  P  L  T(SEQ ID NO：281)
QQ  S  G  S  S  P  L  T(SEQ ID NO：282)
QQ  X3 G  X4 X5 X6 X7 T(SEQ ID NO：283)
其中X3是C、Y或S，X4是S或G，X5是S或A，X6是P或F，并且X7是L或不存在。
轻链CDR2
组1
AASSLQS(SEQ ID NO：284)
组2
GVSTRAT(SEQ ID NO：285)
组3
DDSDRPS(SEQ ID NO：286)
组4
EVSNRFS(SEQ ID NO：287)
组5
L G S  N  R A S(SEQ ID NO：288)
L G S  D  R A S(SEQ ID NO：289)
L G S  X27R A S(SEQ ID NO：290)
其中X27是N或D。
组6
G A  S  S   RAT(SEQ ID NO：291)
G T  S  S   RAT(SEQ ID NO：292)
G A  S  F   RAT(SEQ ID NO：293)
G X8 S  X28 RAT(SEQ ID NO：294)
其中X8是A或T，并且X28是S或F。
轻链CDR1
组1
RASQSVNSNLA(SEQ ID NO：295)
组2
RASQDIRYDLG(SEQ ID NO：296)
组3
RASQGISIWLA(SEQ ID NO：297)
组4
KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO：298)
组5
RASQ N F  D S S  S LA(SEQ ID NO：299)
RASQ N F  D S S  Y LA(SEQ ID NO：300)
RASQ S V  S G N  Y LA(SEQ ID NO：301)
RASQ S V  S G T  Y LA(SEQ ID NO：302)
RASQ N F  D S N  Y LA(SEQ ID NO：303)
RASQ X9X10X11X12X13X14LA(SEQ ID NO：304)
其中X9是A或S，X10是V或F，X11是D或S，X12是G或S，X13是S、N或T，并且X14是S或Y。
组6
GGNNIGS  E  SVH(SEQ ID NO：305)
GGNNIGS  Q  SVH(SEQ ID NO：306)
GGNNIGS X15 SVH(SEQ ID NO：307)
其中X15是E或Q。
组7
RSSQSLL  Y Y   NGF  T  Y LD(SEQ ID NO：308)
RSSQSLL  H S   NGY  N  F LD(SEQ ID NO：309)
RSSQSLL  X29X30NG X31X32X33LD(SEQ ID NO：310)
其中X29是Y或H，X30是Y或S，X31是F或Y，X32是T或N，并且X33是Y或F。
重链CDR3
组1
IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO：311)
组2
DPDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO：312)
组3
TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO：313)
组4
DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO：314)
组5
VRIAGDYYYYYGMDV(SEQ ID NO：315)
组6
ENIVVIPAAIFAGWFDP(SEQ ID NO：316)
组7
DRAAAGLHYYYGMDV(SEQ ID NO：317)
组8
I L  L  L G A YYY Y GMDV(SEQ ID NO：318)
I L  L  V G A YYY C  GMDV(SEQ ID NO：319)
V V  T  G G   YYY D GMDV(SEQ ID NO：320)
S V  V  T G G YYY D GMDV(SEQ ID NO：321)
X34X16X17X18GX19YYY X20GMDV(SEQ ID NO：322)
其中X34是I、V或S，X16是L或V，X17是L、T或V，X18是L、V、G或T，X19是A、G或不存在，并且X20是Y、C或D。
组9
SLIVV    I  VY  A    LD  H(SEQ ID NO：323)
SLIVV    I  VY  A    LD  Y(SEQ ID NO：324)
SLIVV    M  VY  V    LD  Y(SEQ ID NO：325)
SLIVV    X21VY  X22  LD  X23(SEQ ID NO：326)
其中X21是I或M，X22是A或V，并且X23是H或Y。
重链CDR2
组1
GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO：327)
组2
RIKSK  T  DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：328)
RIKSK     DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：330)
RIKSK X42 DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO：483)
其中X42是T或不存在。
组3
HIFSNDEKSYSTSLK S(SEQ ID NO：331)
HIFSNDEKSYSTSLK N(SEQ ID NO：332)
HIFSNDEKSYSTSLK X24(SEQ ID NO：333)
其中X24是S或N。
组4
G ISGSGVST  H  YADSVKG(SEQ ID NO：334)
G ISGSGVST  Y  YADSVKG(SEQ ID NO：335)
A ISGSGVST  Y  YADSVKG(SEQ ID NO：336)
A ISGSGVST  N  YADSVKG(SEQ ID NO：337)
X25ISGSGVST X26YADSVKG(SEQ ID NO：338)
其中X25是G或A并且X26是H、Y或N。
组5
VIWYDGS D   KYY A   DSVKG(SEQ ID NO：339)
VIWYDGS I   KYY G   DSVKG(SEQ ID NO：340)
VIWYDGS X35 KYY X36 DSVKG(SEQ ID NO：341)
其中X35是D或I并且X36是A或G。
组6
N IY Y  SGST Y YNPSLKS(SEQ ID NO：342)
R IY T  SGST Y YNPSLKS(SEQ ID NO：343)
R IY T  SGST N YNPSLKS(SEQ ID NO：329)
X37IY X38SGST X41YNPSLKS(SEQ ID NO：344)
其中X37是N或R，X38是Y或T，并且X41是Y或N。
重链CDR1
组1
DLSMH(SEQ ID NO：345)
组2
DAWMS(SEQ ID NO：346)
组3
TYAMS(SEQ ID NO：347)
组4
SYFWS(SEQ ID NO：348)
组5
SGGYNWS(SEQ ID NO：349)
组6
NARMGV  S(SEQ ID NO：350)
NARMGV  N(SEQ ID NO：351)
NARMGV X39(SEQ ID NO：352)
其中X39是S或N。
组7
S YGIH(SEQ ID NO：353)
N YGIH(SEQ ID NO：354)
X40YGIH(SEQ ID NO：355)
其中X40是S或N。
在一些情况下，抗原结合蛋白包含具有以上共有序列之一的至少一个重链CDR1、CDR2或CDR3。在一些情况下，抗原结合蛋白包含具有以上共有序列之一的至少一个轻链CDR1、CDR2或CDR3。在其他情况下，抗原结合蛋白包含根据以上共有序列的至少两个重链CDR，和/或以上共有序列的至少两个轻链CDR。在另外其他情况下，抗原结合蛋白包含根据以上共有序列的至少三个重链CDR，和/或以上共有序列的至少三个轻链CDR。
示例性抗原结合蛋白
根据一个方面，分离的抗原结合蛋白包含(a)选自以下的一个或多个重链互补性决定区(CDRH)：(i)选自SEQ ID NO：121-131的CDRH1；(ii)选自SEQ ID NO：132-144的CDRH2；(iii)选自SEQ ID NO：145-157的CDRH3；和(iv)在(i)、(ii)及(iii)中的CDRH，其含有不多于1、2、3、4或5个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入；(b)选自以下的一个或多个轻链互补性决定区(CDRL)：(i)选自SEQ IDNO：158-170的CDRL1；(ii)选自SEQ ID NO：171-179的CDRL2；(iii)选自SEQ ID NO：180-194的CDRL3；和(iv)在(i)、(ii)及(iii)中的CDRL，其含有不多于5、4、3、2或1个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入；或(c)(a)的一个或多个重链CDRH和(b)的一个或多个轻链CDRL。
在另一个实施方案中，所述CDRH与选自SEQ ID NO：121-157的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和/或所述CDRL与选自SEQ IDNO：158-194的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。在又一个实施方案中，VH选自SEQ ID NO：121-157，和/或VL选自SEQ ID NO：158-194。
根据一个方面，分离的抗原结合蛋白包含(a)选自以下的一个或多个可变重链(VH)：(i)SEQ ID NO：121-157；(ii)(i)的VH，其含有不多于5、4、3、2或1个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入；(b)选自以下的一个或多个可变轻链(VL)：(i)SEQ ID NO：158-194；(ii)(i)的VL，其含有不多于5、4、3、2或1个氨基酸的一个或多个氨基酸置换、缺失或插入；或(c)(a)的一条或多条可变重链和(b)的一条或多条可变轻链。
在另一个实施方案中，可变重链(VH)与选自SEQ ID NO：121-157的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，和/或可变轻链(VL)与选自SEQ IDNO：158-194的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％.98％或99％序列同一性。
在一个方面，还提供与表位特异性结合的抗原结合蛋白，其中所述表位包含来自FGFR1c、FGRF2c、FGFR3c和FGFR4的一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，还提供与表位特异性结合的抗原结合蛋白，其中所述表位包含来自β-Klotho的一个或多个氨基酸残基。
在另一个方面，还提供与表位特异性结合的抗原结合蛋白，其中所述表位包含来自β-Klotho的一个或多个氨基酸残基和来自FGFR1c、FGRF2c、FGFR3c或FGFR4的一个或多个氨基酸残基。
在又一个实施方案中，上文所述的分离的抗原结合蛋白包含第一氨基酸序列，其包含本文公开的CDRH共有序列的至少一个，和第二氨基酸序列，其包含本文公开的CDRL共有序列的至少一个。
在一个方面，第一氨基酸序列包含所述CDRH共有序列的至少两个，和/或第二氨基酸序列包含所述CDRL共有序列的至少两个。在某些实施方案中，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列彼此共价地结合。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：146的CDRH3、SEQ ID NO：133的CDRH2和SEQ IDNO：122的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：190的CDRL3、SEQ ID NO：176的CDRL2和SEQ IDNO：167的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：147的CDRH3、SEQ ID NO：133的CDRH2和SEQ IDNO：122的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：189的CDRL3、SEQ ID NO：176的CDRL2和SEQ IDNO：167的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：148的CDRH3、SEQ ID NO：133的CDRH2和SEQ IDNO：122的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：188的CDRL3、SEQ ID NO：176的CDRL2和SEQ IDNO：166的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：148的CDRH3、SEQ ID NO：134的CDRH2和SEQ IDNO：122的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：188的CDRL3、SEQ ID NO：176的CDRL2和SEQ IDNO：166的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：150的CDRH3、SEQ ID NO：136的CDRH2和SEQ IDNO：124的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：183的CDRL3、SEQ ID NO：174的CDRL2和SEQ IDNO：161的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：152的CDRH3、SEQ ID NO：138的CDRH2和SEQ IDNO：124的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：184的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：162的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：152的CDRH3、SEQ ID NO：139的CDRH2和SEQ IDNO：124的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：186的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：162的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：151的CDRH3、SEQ ID NO：137的CDRH2和SEQ IDNO：124的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：186的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：164的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：151的CDRH3、SEQ ID NO：137的CDRH2和SEQ IDNO：124的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：182的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：160的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：153的CDRH3、SEQ ID NO：140的CDRH2和SEQ IDNO：131的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：185的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：163的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：153的CDRH3、SEQ ID NO：140的CDRH2和SEQ IDNO：125的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：185的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：163的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：149的CDRH3、SEQ ID NO：135的CDRH2和SEQ IDNO：123的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：181的CDRL3、SEQ ID NO：172的CDRL2和SEQ IDNO：159的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：149的CDRH3、SEQ ID NO：135的CDRH2和SEQ IDNO：123的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：187的CDRL3、SEQ ID NO：175的CDRL2和SEQ IDNO：165的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：145的CDRH3、SEQ ID NO：132的CDRH2和SEQ IDNO：121的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：180的CDRL3、SEQ ID NO：171的CDRL2和SEQ IDNO：158的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：154的CDRH3、SEQ ID NO：133的CDRH2和SEQ IDNO：126的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：191的CDRL3、SEQ ID NO：171的CDRL2和SEQ IDNO：168的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：157的CDRH3、SEQ ID NO：144的CDRH2和SEQ IDNO：130的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：192的CDRL3、SEQ ID NO：177的CDRL2和SEQ IDNO：169的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：155的CDRH3、SEQ ID NO：135的CDRH2和SEQ IDNO：127的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：193的CDRL3、SEQ ID NO：178的CDRL2和SEQ IDNO：170的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：156的CDRH3、SEQ ID NO：142的CDRH2和SEQ IDNO：129的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：194的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：163的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：156的CDRH3、SEQ ID NO：141的CDRH2和SEQ IDNO：128的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：194的CDRL3、SEQ ID NO：173的CDRL2和SEQ IDNO：163的CDRL1。
在又一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白的第一氨基酸序列包含SEQ ID NO：156的CDRH3、SEQ ID NO：143的CDRH2和SEQ IDNO：128的CDRH1，和/或分离的抗原结合蛋白的第二氨基酸序列包含SEQ ID NO：194的CDRL3、SEQ ID NO：179的CDRL2和SEQ IDNO：163的CDRL1。
在又一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4A中所显示的重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18中的至少两个CDRH序列。在另外又一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4B中所显示的轻链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18中的至少两个CDRL序列。在再一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4A中所显示的重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18中的至少两个CDRH序列，和如表4B中所显示的重链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18中的至少两个CDRL序列。
在另外又一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4A中所显示的重链序列H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17或H18中的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列。在又一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4B中所显示的轻链序列L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17或L18中的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列。
在又一个实施方案中，抗原结合蛋白包含如表4A和4B中所显示的L1和H1、或L2和H2、或L3和H3、或L3和H4、或L4和H5、或L5和H6、或L6和H7、或L7和H8、或L8和H7、或L9和H9、或L9和H10、或L10和H11、或L11和H11、或L12和H12、或L13和H13、或L14和H14、或L15和H15、或L16和H16、或L17和H17、或L18和H18的全部六个CDR。
表4A-重链序列
Figure BDA00001983794101161
Figure BDA00001983794101171
表4B-轻链序列
Figure BDA00001983794101181
Figure BDA00001983794101191
在一个方面，本文提供的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的分离的抗原结合蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、多特异性抗体或其抗体片段。
在另一个实施方案中，本文提供的分离的抗原结合蛋白的抗体片段可以是Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、双抗体或单链抗体分子。
在某些实施方案中，本文提供的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的分离抗原结合蛋白是人抗体并且可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
在另一个实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的分离的抗原结合蛋白包含如表1A-1B中所述的轻链或重链多肽。在另一个实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白包含可变轻链或可变重链结构域，如表2A-2B中所列的那些。在另外其他实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白包含如表3A-3B、4A-4B和下表6C中所述的一个、两个或三个CDRH或一个、两个或三个CDRL。此类抗原结合蛋白并且实际上本文公开的任何抗原结合蛋白可以是用一个或多个PEG分子PEG化，所述PEG分子是例如具有选自5K、10K、20K、40K、50K、60K、80K、100K或大于100K分子量的PEG分子。
在又一个方面，本文提供的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的任何抗原结合蛋白可以与标记基团缀合并且可以同本文提供的分离抗原结合蛋白之一的抗原结合蛋白竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的胞外部分结合。在一个实施方案中，施用至患者时，本文提供的分离的抗原结合蛋白可以降低血糖水平、降低甘油三酯和胆固醇水平或改善其他血糖参数和心血管风险因素。
如将理解，对于包含多于一个在表3A-3B和表4A-4B中提供的CDR的任何抗原结合蛋白，独立选自所述序列的CDR的任何组合可以是有用的。因而，可以产生具有1、2、3、4、5或6个独立选择的CDR的抗原结合蛋白。然而，如本领域那些技术人员将理解，具体实施方案通常利用非重复性的CDR的组合，例如，抗原结合蛋白通常不用两个CDRH2区等产生。
下文更详细地讨论本文提供的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的一些抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白和结合表位和结合结构域
例如当提及抗原结合蛋白结合在(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物上的表位或β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4的胞外结构域时，其含义是该抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的指定部分特异性结合。～在一些实施方案中，例如，在其中抗原结合蛋白仅结合FGFR1c或β-Klotho的某些情况下，抗原结合蛋白可以特异性结合至由指定残基组成(例如，β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4的指定区段，如实施例14中公开的那些残基)的多肽。在其他实施方案中，例如，在抗原结合蛋白与β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中的一种或多种相互作用的某些情况下，抗原结合蛋白可以结合β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中的残基、残基序列或区域，这取决于抗原结合蛋白识别的哪种受体。在另外其他实施方案中，抗原结合蛋白将结合包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一(例如FGFR1c)的复合物的残基、残基序列或区域。
在前述实施方案的任意一个中，这种抗原结合蛋白不需要接触(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的每个残基或所提及蛋白质或复合物的胞外结构域。在(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物或所提及蛋白质或复合物的胞外结构域内部的每个单个氨基酸置换或缺失也不一定明显影响结合亲和力。
抗原结合蛋白的表位特异性和结合结构域可以由多种方法确定。例如，一些方法可以使用截短的抗原部分。其他方法利用在一个或多个残基处突变的抗原，如通过使用丙氨酸扫描型或精氨酸扫描型方法或通过产生并且研究其中两种蛋白质之间交换多个结构域、区域或氨基酸的嵌合蛋白(例如，一种或多种抗原或靶蛋白的小鼠和人形式)或通过蛋白酶保护测定法。
竞争性抗原结合蛋白
在另一个方面，提供了抗原结合蛋白，其与所示例的抗体或功能性片段竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合
Figure BDA00001983794101221
此类抗原结合蛋白也可以与本文所示例的抗原结合蛋白中的一个表位相同的表位或与重叠表位结合。竞争或结合至与所示例的抗原结合蛋白相同的表位的抗原结合蛋白和片段预期显示相似的功能特征。所示例的抗原结合蛋白和片段包括具有重链和轻链H1-H18和L1-L18、可变区结构域VL1-VL18和VH1-VH18和本文提供的CDR(包括表1、2、3和4中的那些CDR)的那些。因而，作为具体实施例，提供的抗原结合蛋白包括与以下抗体竞争的那些抗原结合蛋白，其中所述抗体包含：
(a)1、2、3、4、5个或全部6个针对表3A和3B及表4A和4B以及下表6C中所列的抗体列出的CDR；
(b)选自VL1-VL18和VH1-VH18并且针对2A和2B中所列的抗体列出的VH和VL；或
(c)如针对1A和12B及下表6A中所列抗体指明的两条轻链和两条重链。
因而，在一个实施方案中，本公开提供了同参比抗体竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的抗原结合蛋白，其中所述参比抗体包含选自L1H1、L2H2、L3H3、L3H4、L4H5、L5H6、L6H7、L7H8、L8H8、L9H9、L9H10、L10H11、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17或L18H18的轻链可变域序列和重链可变域序列的组合。在另一个实施方案中，本公开提供了同参比抗体竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的人抗体，其中所述参比抗体为17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5。
在又一个实施方案中，提供了分离的人抗体，所述人抗体以基本上与参比抗体相同的Kd结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物；在体外ELK-萤光素酶测定法中启动FGF21样信号传导至与参比抗体相同的程度；降低血糖；降低血清脂质水平；和/或同所述参比抗体竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合，其中所述参比抗体选自17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5。
可以使用任何适合的测定法确定与抗体竞争的能力，如实施例8中描述的那种测定法，其中抗原结合蛋白17C3、22H5、16H7、24H11、18G1、17D8、26H11、12E4、12C11、21H2、21B4、18B11.1、18B11.2、20D4、46D11、40D2、37D3、39F7、39F1或39G5可以用作参比抗体。
单克隆抗体
提供的抗原结合蛋白包括与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合并诱导FGF21样信号传导至多种程度的单克隆抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的任何技术产生，例如，通过永生化免疫计划完成后从转基因动物收获的脾细胞。脾细胞可以使用本领域已知的任何技术永生化，例如，通过将它们与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在杂交瘤融合方法中使用的骨髓瘤细胞优选地不产生抗体、具有高融合效率和酶缺陷，所述酶缺陷使这些细胞不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。用于小鼠融合物中的合适细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul；用于大鼠融合物中的合适细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一些情况下，通过以下方式产生杂交瘤细胞：将动物(例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物)用FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和/或β-Klotho免疫原(例如，如实施例2和3中所示的包含FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4和/或β-Klotho的胞外结构域的可溶性复合物；上面表达有FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4和/或β-Klotho的胞外结构域的膜，如实施例1和3中所示；或表达FGFR1c和/或β-Klotho的完整细胞，如实施例1和3中所示)免疫；从免疫的动物收获脾细胞；将收获的脾细胞与骨髓瘤细胞系融合，从而产生杂交瘤细胞；从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并且鉴定产生抗体的杂交瘤细胞系，其中所述抗体与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合(例如，如实施例4中所述)和可以诱导FGF21样信号传导(例如，如实施例5-7中所述)。此类杂交瘤细胞系和由它们产生的单克隆抗体形成本公开的方面。
可以使用本领域已知的任何技术纯化由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可以进一步筛选杂交瘤或mAb以鉴定具有特定性能(如诱导FGF21样信号传导的能力)的mAb。本文提供此类筛选的实例。
嵌合抗体和人源化抗体
基于前述序列，可以轻易地产生嵌合抗体和人源化抗体。一个实例是嵌合抗体，其是由来自不同抗体的蛋白质区段组成的抗体，所述蛋白质区段共价地连接以产生有功能的免疫球蛋白轻链或重链或其免疫功能性部分。通常，重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，同时所述链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗中的相应序列相同或同源。涉及嵌合抗体的方法，见例如，美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，1985，Proc Natl Acad Sci USA81：6851-6855，所述文献在此通过引用并入。CDR移植法例如在美国专利No.6,180,370、No.5,693,762、No.5,693,761、No.5,585,089和No.5,530,101中描述。
通常，产生嵌合抗体的目的是产生其中来自预期患者/受体物种的氨基酸的数目最大化的嵌合体。一个实例是“CDR移植”抗体，其中所述抗体包含来自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的一个或多个互补性决定区(CDR)，同时所述抗体链的其余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源。为在人中使用，来自啮齿类抗体的可变区或所选择的CDR经常移植至人抗体中，替换人抗体的天然存在的可变区或CDR。
一个有用的嵌合抗体类型是“人源化抗体”。通常，人源化抗体从最初在非人动物中产生的单克隆抗体产生。在这种单克隆抗体中的某些氨基酸残基，一般来自该抗体的非抗原识别部分，经修饰以与相应同种型的人抗体中的相应残基同源。人源化可以例如使用多种方法，通过将至少一部分啮齿类可变区替换为人抗体的相应区域而进行(见，例如，美国专利No.5,585,089和No.5,693,762；Jones等人，1986，Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-27；VerHoeyen等人，1988，Science 239：1534-1536)。
在一个方面，将本文(例如，在表3和4中)提供的抗体的轻链可变区和重链可变区的CDR移植至源于相同或不同系统发生物种的抗体的框架区(FR)。例如，重链可变区和轻链可变区VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17或VH18和/或VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VH12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17或VL18的CDR可以移植至共有性人FR。为产生共有性人FR，来自几个人重链或轻链氨基酸序列的FR可以比对以鉴定共有氨基酸序列。在其他实施方案中，将本文公开的重链或轻链的FR替换为来自不同重链或轻链的FR。在一个方面，不替换抗原结合蛋白(例如，抗体)的重链和轻链的FR中的罕有氨基酸，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，而替换其余的FR氨基酸。“罕有氨基酸”是特殊氨基酸，所述特定氨基酸处于通常在FR中找不到这种特殊氨基酸的位置内。可选地，从一条重链或轻链移植的可变区可以与下述恒定区一起使用，所述恒定区与如本文公开的那种特定重链或轻链的恒定区不同。在其他实施方案中，移植的可变区是单链Fv抗体的部分。
在某些实施方案中，来自除人之外的物种的恒定区可以随人可变区一起使用以产生杂合抗体。
完全人抗体
完全人抗体也由本公开提供。用于制造对给定抗原特异而不使人暴露于这种抗原的完全人抗体(“完全人抗体”)的方法是可获得的。为实现完全人抗体的产生而提供的一种具体手段是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入其中内源性Ig基因已经失活的小鼠是在小鼠(一种可以用任何合乎需要的抗原进行免疫的动物)中产生完全人单克隆抗体(mAb)的一种手段。使用完全人抗体可以最小化有时可能因施用作为治疗药的小鼠mAb或小鼠源mAb至人所引起的免疫原性和过敏性反应。
例如，完全人抗体可以通过免疫转基因动物(一般是小鼠)产生，其中所述转基因动物能够在不存在内源免疫球蛋白生产的情况下产生人抗体库。用于这个目的的抗原一般具有六个或更多个连续氨基酸，并且任选地与载体如半抗原缀合。见，例如，Jakobovits等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，(1993)Nature 362：255-258；和Bruggermann等人，(1993)Year in Immunol.7：33。在这种方法的一个实例中，通过以下方式产生转基因动物：使其中编码小鼠免疫球蛋白重链和轻链的内源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，并且将含有编码人重链和轻链蛋白的基因座的人基因组DNA大片段插入小鼠基因组内。部分地修饰的动物，其具有少于人免疫球蛋白基因座的完全补体，随后杂交以获得具有全部所需免疫系统修饰的动物。当施用免疫原时，这些转基因动物产生对该免疫原具有免疫特异性但是具有人而非鼠氨基酸序列(包括可变区)的抗体。对于此类方法的其他细节，见，例如，WO96/33735和WO94/02602。涉及转基因小鼠的用于制造人抗体的额外方法在美国专利No.5,545,807；No.6,713,610；No.6,673,986；No.6,162,963；No.5,545,807；No.6,300,129；No.6,255,458；No.5,877,397；No.5,874,299和No.5,545,806中；在PCT公开WO91/10741，WO90/04036中并且在EP 546073B1和EP 546073A1中描述。
上述的转基因小鼠，在本文中称作“HuMab”小鼠，含有人免疫球蛋白基因微基因座，所述微基因座编码未重排的人重链([μ，mu]和[β，γ])和[κ，kappa]轻链免疫球蛋白序列，连同使内源性μ[mu]和κ[κ]链基因座失活的靶向突变(Lonberg等人，1994，Nature 368：856-859)。因而，所述小鼠显示出减少的小鼠IgM或[κ，kappa]的表达和免疫应答，并且导入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgG[κ，kappa]单克隆抗体(Lonberg等人，上文；Lonberg和Huszar，(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding和Lonberg，(1995)Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠的制备在Taylor等人，(1992)Nucleic Acids Res 20：6287-6295；Chen等人，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，(1994)Nature 368：856-859；Lonberg，(1994)Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg和Huszar，(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding和Lonberg，(1995)Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中详述；前述参考文献因而通过引用整体并入用于全部目的。进一步见美国专利No.5,545,806；No.5,569,825；No.5,625,126；No.5,633,425；No.5,789,650；No.5,877,397；No.5,661,016；No.5,814,318；No.5,874,299；和No.5,770,429；以及美国专利No.5,545,807；国际公开No.WO 93/1227；WO 92/22646和WO 92/03918，全部专利的公开内容因而通过引用整体并入用于全部目的。用于在这些转基因小鼠中产生人抗体的技术也在WO 98/24893，和Mendez等人，(1997)Nature Genetics 15：146-156中公开，所述文献在此通过引用并入。例如，HCo7和HCo12转基因小鼠系可以用来产生与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合和可以诱导FGF21样信号传导的抗原结合蛋白(例如，抗体)。下文本实施例中提供关于使用转基因小鼠产生人抗体的进一步细节。
使用杂交瘤技术，可以从如那些上述的转基因小鼠中产生并选出具有所需特异性的抗原特异性人mAb。此类抗体可以使用合适的载体和宿主细胞进行克隆和表达，或所述抗体可以从培养的杂交瘤细胞收获。
完全人抗体也可以源自噬菌体展示文库(如公开于Hoogenboom等人，(1991)J.Mol.Biol.227：381；和Marks等人，(1991)J.Mol.Biol.222：581中)。噬菌体展示技术通过将抗体库展示在丝状噬菌体的表面上并且随后通过噬菌体与所选择抗原的结合来选择噬菌体而模拟免疫选择作用。一个这样的技术在PCT公开No.WO 99/10494中描述(在此通过引用并入)，所述文献描述了使用这种方法分离对MPL-受体和msk-受体具有高亲和力和有功能的激动性抗体。
双特异性或双官能抗原结合蛋白
另外，提供了包含如上文所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区的双特异性和双官能抗体。在一些情况下，双特异性或双官能抗体可以是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于，杂交瘤融合法或Fab′片段连接法。见，例如，Songsivilai和Lachmann，1990，Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992，J.Immunol148：1547-1553。当本公开的抗原结合蛋白结合(i)β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4中的一种或多种；或(ii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物时，这种结合可以导致FGF21样活性的激活，如通过实施例5-7中所述的FGF21样功能性和信号传导测定法测量；当这种抗原结合蛋白是抗体时，将它称作激动性抗体。
多种其他形式
本公开中提供的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的一些抗原结合蛋白包括本文公开的抗原结合蛋白的变体形式(例如，具有表1-4中所列的序列的那些)。
在多个实施方案中，本文公开的抗原结合蛋白可以包含一个或多个非天然存在的氨基酸。例如，一些抗原结合蛋白具有在一个或多个于表1-4中所列的重链或轻链、可变区或CDR内的一个或多个非天然存在的氨基酸置换。非天然氨基酸(根据需要，可以替换本文公开的任何序列中的任何天然存在的氨基酸)的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文所用的多肽符号中，根据标准用法和习惯，左侧方向是氨基端方向并且右侧方向是羧基端方向。可以插入抗原结合蛋白序列内或替换抗原结合序列中野生型残基的非天然存在的氨基酸的实例的非限制性名单包括β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和带有衍生化侧链的氨基酸。实例包括(处于L-形式或D-形式；缩写为括号中)：瓜氨酸(Cit)、高瓜氨酸(hCit)、Nα-甲基瓜氨酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜氨酸(Nα-MeHoCit)、鸟氨酸(Orn)、Nα-甲基鸟氨酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸(Sar)、高赖氨酸(hLys或hK)、高精氨酸(hArg或hR)、高谷氨酸(hQ)、Nα-甲基精氨酸(NMeR)、Nα-甲基亮氨酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高赖氨酸(NMeHoK)、Nα-甲基谷氨酸(NMeQ)、正亮氨酸(Nle)、正缬氨酸(Nva)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)、八氢吲哚-2-羧酸(Oic)、3-(1-萘基)丙氨酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙氨酸(2-Nal)、1，2，3，4-四氢异喹啉(Tic)、2-茚满基甘氨酸(IgI)、对-碘代苯丙氨酸(pI-Phe)、对-氨基苯丙氨酸(4AmP或4-氨基-Phe)、4-胍基苯丙氨酸(Guf)、甘氨酰赖氨酸(缩写为“K(Nε-glycyl)”或“K(glycyl)”或“K(gly)”)、硝基苯丙氨酸(nitrophe)、氨基苯丙氨酸(aminophe或氨基-Phe)、苄基苯丙氨酸(benzylphe)、γ-羧基谷酸(γ-carboxyglu)、羟脯氨酸(hydroxypro)、对-羧基苯丙氨酸(Cpa)、α-氨基己二酸(Aad)、Nα-甲基缬氨酸(NMeVal)、N-α-甲基亮氨酸(NMeLeu)、Nα-甲基正亮氨酸(NMeNle)、环戊基甘氨酸(Cpg)、环己基甘氨酸(Chg)、乙酰基精氨酸(acetylarg)、α，β-二氨基丙酸(Dpr)、α，γ-二氨基丁酸(Dab)、二氨基丙酸(Dap)、环己基丙氨酸(Cha)、4-甲基-苯丙氨酸(MePhe)、β，β-二苯基-丙氨酸(BiPhA)、氨基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙氨酸(或联苯基丙氨酸；4Bip)、α-氨基异丁酸(Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、γ-氨基丁酸、氨基已酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁连素、二氨基庚二酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别-羟赖氨酸、异锁连素、别-异亮氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、4-羟脯氨酸(Hyp)、γ-羧基谷氨酸、-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-甲基精氨酸、4-氨基-邻苯二甲酸(4APA)，和其他相似氨基酸及具体所列的那些氨基酸中任一者的衍生化形式。
另外，抗原结合蛋白可具有在一个或多个于表1-4中所列的重链或轻链、可变区或CDR内的一个或多个保守性氨基酸置换。天然存在的氨基酸可以基于常见侧链特性划分成以下类组：
1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu；Ile；
2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn；Gln；
3)酸性：Asp、Glu；
4)碱性：His、Lys、Arg；
5)影响链取向的残基：Gly、Pro；和
6)芳香性：Trp、Tyr、Phe。
保守性氨基酸置换可以参与这些类组之一的成员与同一类组的另一个成员交换。保守氨基酸置换可以包括通常通过化学肽合成而不借助生物系统中合成而掺入的非天然氨基酸残基。见下表5。这些包括肽模拟物和氨基酸部分的其他逆转或颠倒形式。
非保守性置换可以参与以上类组之一的成员与来自另一个类组的成员交换。可以将此类置换的残基导入与人抗体同源的抗体区域或分子的非同源区内。
在产生此类变化时，根据某些实施方案，可以考虑氨基酸的疏水指数。通过赋予每种氨基酸一个数值(“亲水指数”)并随后沿肽链反复平均化这些值，计算蛋白质的疏水谱。每种氨基酸已经基于其疏水性和电荷特征赋予疏水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域理解疏水谱在赋予蛋白质交互性生物学功能方面的重要性(见，例如，Kyte等人，1982，J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些氨基酸可以替换具有相似疏水指数或评分的其他氨基酸并且仍保留相似的生物学活性。在基于疏水指数产生变化时，在某些实施方案中，包括其疏水指数在±2范围内的氨基酸的置换。在一些方面，包括在±1范围内的那些氨基酸，并且在其他方面，包括在±0.5范围内的那些氨基酸。
本领域中还理解，相似氨基酸的替换可以基于亲水性而有效地进行，特别在如此所产生的生物学上有功能的蛋白质或肽意图用于免疫学实施方案中的情况下，如本发明的情况下。在某些实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性，如由其相邻氨基酸的亲水性决定，与该蛋白质的免疫原性和抗原结合作用或免疫原性相关，即，与该蛋白质的生物学特性相关。
以下亲水性值已经分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值产生变化时，在某些实施方案中，包括其亲水性值在±2范围内的氨基酸的置换。在其他实施方案中，包括在±1范围内的那些氨基酸置换，并且在另外其他实施方案中，包括在±0.5范围内的那些氨基酸置换。在一些情况下，也可以基于亲水性鉴定来自一级氨基酸序列的表位。这些区域也称作“表位核心区”。
表5中描述示例性保守性氨基酸置换。
表5
保守性氨基酸置换
  原始残基   示例性置换
  Ala   Ser
  Arg   Lys
  Asn   Gln，His
  Asp   Glu
  Cys   Ser
  Gln   Asn
  Glu   Asp
  Gly   Pro
  His   Asn，Gln
  Ile   Leu，Val
  Leu   Ile，Val
  Lys   Arg；Gln，Glu
  Met   Leu，Ile
  Phe   Met，Leu，Tyr
  Ser   Thr
  Thr   Ser
  Trp   Tyr
  Tyr   Trp，Phe
  Val   Ile，Leu
技术人员将能够使用熟知技术连同本文提供的信息确定如本文所述的多肽的合适变体。本领域技术人员可以通过靶向据信对活性不重要的区域而鉴定分子中可以被改变而不破坏活性的合适区域。技术人员还将能够鉴定分子中在相似多肽之间保守的残基和部分。在其他实施方案中，可能对生物学活性或对结构重要的区域甚至可以进行保守性氨基酸置换，而不破坏生物学活性或不利地影响多肽结构。
另外，本领域技术人员可以回顾结构-功能研究，鉴定出相似多肽中对活性或结构重要的残基。就这种比较而言，可以预测蛋白质中氨基酸残基的重要性，所述氨基酸残基与相似蛋白质中对活性或结构重要的氨基酸残基相对应。本领域技术人员可以选择化学相似的氨基酸置换用于预测重要的此类氨基酸残基。
本领域技术人员也可以相对于相似多肽中的结构而分析三维结构和氨基酸序列。就此类信息而言，本领域技术人员可以预测抗体的氨基酸残基相对于其三维结构的比对。本领域技术人员可以选择不对预测位于蛋白质表面上的氨基酸残基作出剧烈改变，因为此类残基可能参与同其他分子的重要相互作用。另外，本领域技术人员可以产生在每个所需的氨基酸残基处含有单一氨基酸置换的试验变体。这些变体可以随后使用FGF21样信号传导的测定法进行筛选(见，本文提供的实施例)，因而产生关于哪个氨基酸可以改变和哪个氨基酸不得改变的信息。换而言之，基于从此类例行实验搜集的信息，本领域技术人员可以轻易地确定其中应当避免单独或与其他突变组合时进一步置换的氨基酸位置。
许多科学论文已经致力于二级结构的预测。见，Moult，(1996)Curr.Op.in Biotech.7：422-427；Chou等人，(1974)Biochem. 13：222-245；Chou等人，(1974)Biochemistry 113：211-222；Chou等人，(1978)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148；Chou等人，(1979)Ann.Rev.Biochem.47：251-276；和Chou等人，(1979)Biophys.J.26：367-384。另外，计算机程序目前可用于辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法基于同源性建模。例如，具有大于30％的序列同一性或大于40％的相似性的两个多肽或蛋白质可能具有相似的结构拓朴学。蛋白质结构性数据库(PDB)的增长已经提供了增强的二级结构可预测性，包括多肽或蛋白质结构内部潜在的折叠数。见，Holm等人，(1999)Nucl.Acid.Res.27：244-247。已经提出(Brenner等人，(1997)Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)，在给定的多肽或蛋白质中存在有限数目的折叠并且一旦已经求得临界结构数，则结构性预测将变得明显更精确。
预测二级结构的额外方法包括“线性法(threading)”(Jones，(1997)Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，(1996)Structure4：15-19)、“图谱分析”(Bowie等人，(1991)Science 253：164-170；Gribskov等人，(1990)Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，(1987)Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)，和“进化连锁”(见，上文Holm，(1999)；和上天Brenner，(1997))。
在一些实施方案中，作出以下氨基酸置换，它们：(1)降低蛋白酶解敏感性，(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变配体或抗原结合亲和力，和/或(4)赋予或修饰此类多肽上的其他他物理化学或功能特征。例如，可以在天然存在的序列中进行单个或多个氨基酸置换(在某些实施方案中，保守性氨基酸置换)。可以在位于形成分子间接触的结构域外部的抗体部分中进行置换。在此类实施方案中，可以利用基本上不改变亲本序列的结构性特征的保守性氨基酸置换(例如，不破坏作为亲本或天然抗原结合蛋白的特征的二级结构的一个或多个氨基酸替换)。现有技术认可的多肽二级和三级结构的实例在Proteins，Structures and MolecularPrinciples(Creighton编著)，1984，W. H.New York：Freeman andCompany；Introduction to Protein Structure(Branden和Tooze，编著)，1991，New York：Garland Publishing；和Thornton等人，(1991)Nature354：105(所述文献各自通过引用并入本文中)描述。
额外的优选抗体变体包括半胱氨酸变体，其中，亲本或天然氨基酸序列中的一个或多个半胱氨酸残基被缺失或替换为另一个氨基酸(例如，丝氨酸)。半胱氨酸变体是有用的，特别当抗体必须再折叠成生物学活性构象时。半胱氨酸变体可以具有比天然抗体更少的半胱氨酸残基，并且一般是偶数个，以最小化因未配对的半胱氨酸所致的相互作用。
所公开的重链和轻链、可变区结构域和CDR可以用来制备含有抗原结合区的多肽，其中所述抗原结合区可以特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物并且可以诱导FGF21样信号传导。例如，可以将表3和4中所列的一个或多个CDR共价或非共价地并入分子(例如，多肽)以产生免疫粘附。免疫粘附可以将CDR并入作为更大多肽链的部分，可以将CDR共价地连接至另一条多肽链，或可以非共价地并入CDR。所述CDR使免疫粘附能够与特定目的抗原(例如，(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物或其上面的表位)特异性结合。
所公开的重链和轻链、可变区结构域和CDR可以用来制备含有抗原结合区的多肽，其中所述抗原结合区可以特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物并且可以诱导FGF21样信号传导。例如，可以将表3和4中所列的一个或多个CDR并入结构性上与“半”抗体相似的分子(例如，多肽)，其中所述的“半”抗体包含与Fc片段配对的抗原结合蛋白的重链、轻链，从而所述抗原结合区是单价(类似于Fab片段)，但是具有二聚体Fc部分。
还提供了基于本文所述的可变区结构域和CDR的模拟物(例如，“肽模拟物(peptide mimetic)”或“肽模拟物(peptidomimetics)”)。这些类似物可以是肽、非肽或肽与非肽区域的组合。Fauchere，1986，Adv.Drug Res.15：29；Veber和Freidinger，1985，TINS第392页；和Evans等人，1987，J.Med.Chem.30：1229，所述文献通过引用并入本文用于任何目的。结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物可以用来产生相似的治疗或预防效果。经常借助计算机化分子建模开发此类化合物。通常，肽模拟物是这样的蛋白质，它们在结构上与显示所需生物学活性(如本文中特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的能力)的抗体相似，但是通过本领域熟知的方法使一个或多个肽键任选地由选自以下的键替换：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(顺式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-和-CH2SO-。用相同类型的D-氨基酸系统性置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如，D-赖氨酸替换L-赖氨酸)可以在某些实施方案中用来产生更稳定的蛋白质。此外，包含共有序列或基本上相同的共有序列变异的受约束肽可以通过本领域已知的方法(Rizo和Gierasch，1992，Ann.Rev.Biochem.61：387)，所述文献通过引用并入本文)，例如通过添加内部半胱氨酸残基来产生，其中所述内部半胱氨酸残基能够形成使所述肽环化的分子内二硫键。
还提供了本文描述的抗原结合蛋白的衍生物，所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。衍生化的抗原结合蛋白可以包含赋予抗体或片段所需特性(如特定用途中增加的半寿期)的任何分子或物质。衍生化的抗原结合蛋白可以包含，例如，可检测(或标记)部分(例如，放射性分子、比色分子、抗原分子或酶分子、可检测珠(如磁珠或电子致密(例如，金)珠或与另一个分子结合的分子(例如，生物素或链霉亲和素)、治疗性或诊断性部分(例如，放射性、细胞毒或药物活性部分)或增加抗原结合蛋白针对特定用途(例如，施用至受试者，如人受试者，或其他体内或体外用途)的适应性的分子。可以用来衍生抗原结合蛋白的分子的实例包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。连接白蛋白的和PEG化的抗原结合蛋白衍生物可以使用本领域熟知的技术制备。某些抗原结合蛋白包含如本文所述的PEG化单链多肽。在一个实施方案中，抗原结合蛋白与转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体缀合或以其它方式连接。TTR或TTR变体可以用例如选自葡聚糖、聚(正-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚丙烯氧化物/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇和聚乙烯醇的化学品化学地修饰。
其他衍生物包括抗原结合蛋白的共价或聚集性缀合物，其中所述抗原结合蛋白与其他蛋白质或多肽特异性结合本文公开的(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，如通过表达重组融合蛋白，所述重组融合蛋白包含与诱导FGF21样信号传导的抗原结合蛋白的N端或C端融合的异源性多肽。例如，缀合肽可以是异源信号(或前导)多肽，例如，酵母α前导序列或如表位标签那样的肽。本公开的含有抗原结合蛋白的融合蛋白可以包含为促进纯化或鉴定抗原结合蛋白的所添加的肽，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物(例如，多组氨酸标签)并且可以诱导FGF21样信号传导。特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白也可以与如Hopp等人，1988，Bio/Technology 6：1204；和美国专利No.5,011,912中所述的FLAG肽连接。FLAG肽是高度抗原性的并且提供由特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，从而能够快速分析和快捷纯化所表达的重组蛋白。用于制备其中FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂是可商业获得的(Sigma，St.Louis，MO)。
包含一种或多种抗原结合蛋白的多聚体形成本公开的另一个方面，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。多聚体可以采取共价或非共价连接的二聚体、三聚体或更高级多聚体的形式。构思了包含两种或更多种抗原结合蛋白的多聚体用作治疗药、诊断剂和用作其他用途，这种多聚体的一个实例是同型二聚体，其中所述抗原结合蛋白结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物并且可以诱导FGF21样信号传导。其他示例性多聚体包括异源二聚体、同型三聚体、异源三聚体、同型四聚体、异源四聚体等。
一个实施方案涉及包含多种抗原结合蛋白的多聚体，所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，所述复合物经肽部分之间的共价或非共价相互作用接合，所述肽部分与特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白融合。此类肽可以是肽接头(间隔区)或具有促进多聚化的特性的肽。亮氨酸拉链和源自抗体的某些多肽属于可以促进与之连接的抗原结合蛋白多聚化的肽，如本文更详细地所述。
在特定的实施方案中，多聚体包含两个至四个结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白。多聚体的抗原结合蛋白部分可以处于任一种上述形式，例如，变体或片段。优选地，多聚体包含具有特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的能力的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，使用源自免疫球蛋白的多肽，制备低聚物。制备包含与抗体源多肽的多个部分(包括Fc结构域)融合的某些异源多肽的融合蛋白已经由例如Ashkenazi等人，(1991)Proc Natl Acad SciUSA 88：10535；Byrn等人，(1990)Nature 344：677；和Hollenbaugh等人，1992″Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins(免疫球蛋白融合蛋白的构建)″，在Current Protocols in Immunology，Suppl.4，第10.19.1-10.19.11页中描述。
一个实施方案包含二聚体，所述二聚体包含通过将抗原结合蛋白与抗体Fc区融合而产生的两个融合蛋白，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。所述二聚体可以例如通过以下方式产生：将编码融合蛋白的基因融合物插入适宜的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达这个基因融合物并且允许表达的融合蛋白装配成很像抗体的分子，因此链间二硫键在Fc部分之间形成以产生该二聚体。
如本文所用的术语“Fc多肽”包括源自抗体Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。还包括含有促进二聚化的铰链区的此类多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(和从中形成的低聚物)提供了通过亲和层析在蛋白A或蛋白G柱上便捷纯化的优点。
在PCT申请WO 93/10151和美国专利No.5,426,048和No.5,262,522中描述的一种合适Fc多肽是从人IgG1抗体Fc区的N端铰链区延伸至天然C端的单链多肽。另一种有用的Fc多肽是在美国专利No.5,457,035中和在Baum等人，(1994)EMBO J.13：3992-4001中描述的Fc突变蛋白。这种突变蛋白的氨基酸序列与WO 93/10151中提出的天然Fc序列相同，除了氨基酸19已经从Leu变成Ala，氨基酸20已经从Leu变成Glu，并且氨基酸22已经从Gly变成Ala之外。突变蛋白显示降低的Fc受体亲和力。
在其他实施方案中，如本文公开的重链和/或轻链的抗原结合蛋白的可变部分可以替换抗体重链和/或轻链的可变部分。
可选地，低聚物是带有或没有肽接头(间隔肽)的包含多种抗原结合蛋白的融合蛋白，所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。在合适的肽接头当中是美国专利No.4,751,180和No.4,935,233中所描述的那些肽接头。
用于制备包含抗原结合蛋白的低聚衍生物的另一种方法涉及亮氨酸拉链的用途，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。亮氨酸拉链结构域是这样的肽，所述肽促进包含这些肽的蛋白质寡聚化。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白质中鉴定出来(Landschulz等人，(1988)Science 240：1759)，并且自此已经在多种不同蛋白质中找到。在已知的亮氨酸拉链当中具有二聚化或三聚化的天然存在肽及其衍生物。适于产生可溶性低聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的实例在PCT申请WO94/10308中描述，并且源自肺表面活性蛋白D(SPD)在Hoppe等人，(1994)FEBS Letters 344：191中描述，所述文献在此通过引用并入。允许与其融合的异源性蛋白稳定三聚化的修饰的亮氨酸拉链的用途在Fanslow等人，(1994)Semin.Immunol.6：267-278中描述。在一种方法中，包含抗原结合蛋白片段或其衍生物的重组融合蛋白与亮氨酸拉链肽融合并且在合适的宿主细胞中表达，其中所述抗原结合蛋白片段或衍生物特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，并且形成的可溶性低聚抗原结合蛋白片段或其衍生物从培养上清液回收。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白具有小于1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM的KD(平衡结合亲和力)。
在另一个方面，本公开提供了具有至少1天体外或体内半寿期的抗原结合蛋白(例如，当施用至人受试者时)。在一个实施方案中，抗原结合蛋白具有至少三天的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有四天或更长的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有八天或更长的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有十天或更长的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有十一天或更长的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其部分具有十五天或更长的半寿期。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分经过衍生化或修饰，从而与未衍生化或未修饰的抗体相比，它具有更长的半寿期。在另一个实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白含有增加血清半寿期的点突变，如2000年2月24日公布的WO 00/09560(通过引用并入)中所述。
糖基化
特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白可以具有与天然种类中存在的糖基化模式不同或改变的糖基化模式。如本领域已知，糖基化模式可以取决于蛋白质的序列(例如下文讨论，存在或不存在特定的糖基化氨基酸残基)或其中产生该蛋白质的宿主细胞或生物。下文讨论特定的表达系统。
多肽的糖基化一般是N-联或O-联的。N-联指糖部分与天冬酰胺残基侧链的接合。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸之外的任意氨基酸，是糖部分与天冬酰胺侧链酶促连接的识别序列。因而，这些三肽序列的任一种在多肽中的存在产生潜在的糖基化位点。O-联糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸、最常见与丝氨酸或苏氨酸的连接，虽然也可以利用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
添加糖基化位点至抗原结合蛋白通过改变氨基酸序列而方便地实现，从而该抗原结合蛋白含有一个或多个上述的三肽序列(对于N-联糖基化位点而言)。这种改变也可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加或置换至起始序列来产生(对于O-联糖基化位点而言)。处于便利，抗原结合蛋白氨基酸序列可以通过DNA水平的改变、尤其通过在预先选择的碱基处突变编码靶多肽的DNA加以改变，从而产生会翻译成所需氨基酸的密码子。
增加抗原结合蛋白上糖部分的数目的另一个手段是将糖苷化学地或酶促地与蛋白质偶联。这些方法是有利的，在于它们不需要在具有N-联和O-联糖基化的糖基化能力的宿主细胞中产生蛋白质。取决于所用的偶联模型，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离硫氢基，如半胱氨酸的那些硫氢基、(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些游离羟基、(e)芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法在WO 87/05330以及在Aplin和Wriston(1981)CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页中描述。
可以化学或酶促地完成起始抗原结合蛋白上存在的碳水化合物部分的移除。化学去糖基化要求蛋白质暴露至化合物三氟乙磺酸或等同化合物。这种处理导致除连接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖的切除，而留下多肽原封不动。化学去糖基化由Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys.259：52和由Edge等人，(1981)Anal.Biochem.118：131描述。酶促切除多肽上的糖部分可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol.138：350所描述。可以通过使用化合物衣霉素阻止在潜在糖基化位点处的糖基化，如Duskin等人，(1982)，J.Biol.Chem.257：3105所描述。衣霉素阻断蛋白质-N-糖苷键的形成。
因此，本公开的方面包括特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白的糖基化变体，其中与亲本多肽的氨基酸序列相比，糖基化位点的数目和/或类型已经改变。在某些实施方案中，抗体蛋白变体包含比天然抗体更多或更少的N-联糖基化位点数目。N-联糖基化位点以这样的序列特征：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中命名为X的氨基酸残基可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸残基。产生这种序列的氨基酸残基置换提供了添加N-联糖链的潜在新位点。可选地，消除或改变这种序列的置换将防止添加天然多肽中存在的N-联碳糖链。例如，糖基化可以通过缺失Asn或通过用不同的氨基酸替换Asn来减少。在其他实施方案中，产生一个或多个新的N-联位点。抗体一般在Fc区中具有N-联糖基化。
标记物和效应子基团
在一些实施方案中，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白包含一个或多个标记物。术语“标记基团”或“标记物”意指任何可检测标记物。合适的标记基团的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素、磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团经多种长度的间隔臂与抗原结合蛋白缀合以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的多种方法是本领域已知的并且如适合，可以使用。
术语“效应子基团”意指充当细胞毒药物的任何基团，其与特异性结合一种(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白缀合。合适效应子基团的实例是放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他合适的基团包括毒素、治疗性基团或化疗基团。合适基团的实例包括刺孢霉素、澳瑞司他汀(auristatin)、格尔德霉素和cantansine。在一些实施方案中，效应子基团经各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白缀合以减少潜在的空间位阻。
通常，标记物根据将检出它们的测定法分成多种类型：a)同位素标记物，其可以是放射性或重同位素；b)磁性标记物(例如，磁颗粒)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)由第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，标记基团经各种长度的间隔臂与抗原结合蛋白缀合以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的多种方法是本领域已知的。
具体的标记物包括光学染料，包括，但不限于发色团、磷光体和荧光团，其中后者在许多情况下是特异性的。荧光团可以是“小分子”荧光剂(fluore)或蛋白质荧光剂。
“荧光标记物”意指可以因内在荧光特性而检测到的任何分子。合适的荧光标记物包括，但不限于，荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿、茋、萤黄、瀑布蓝、得克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒冈绿、Alexa-Fluor染料类(Alexa Fluor350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、AlexaFluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、AlexaFluor 660、Alexa Fluor 680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明，和得克萨斯红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。合适的光学染料(包括荧光团)在Molecular ProbesHandbook中由Richard P.Haugland描述，所述文献在此明确地通过引用并入。
合适的蛋白质性荧光标记物还包括，但不限于绿色荧光蛋白，包括海肾(Renilla)、Ptilosarcus或水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等人，(1994)Science 263：802-805)、EGFP(C1ontech Labs.，Inc.，Genbank登录号U55762)、蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.，Quebec，加拿大；Stauber，(1998)Biotechniaques 24：462-471；Heim等人，(1996)Curr.Biol.6：178-182)、增强的黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Labs.，Inc.)、萤光素酶(Ichiki等人，(1993)J.Immunol.150：5408-5417)、β-半乳糖苷酶(Nolan等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利No.5292658，No.5418155、No.5683888、No.5741668、No.5777079、No.5804387、No.5874304、No.5876995、No.5925558)。
抗原结合蛋白的制备
提供的非人抗体可以例如源自任何产生抗体的动物，如小鼠、大鼠、兔、山羊、驴或非人灵长类(如猴(例如，食蟹猴或猕猴)或猿(例如，黑猩猩)。非人抗体可以例如用于体外细胞培养和基于细胞培养物的应用或任何其他应用中，其中针对抗体的免疫应答不出现或是不明显的，可以防止、不受关注或是想要的。在某些实施方案中，抗体可以通过用全长β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4(实施例1)，用β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4(实施例2)或β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4(实施例1)中两者的胞外结构域，用表达FGFR1c、β-Klotho或同时表达FGFR1c和β-Klotho的完整细胞(实施例1和3)，用从表达FGFR1c、β-Klotho或同时表达FGFR1c和β-Klotho(实施例1和3)的细胞制备的膜，用融合蛋白例如包含与Fc融合的FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和β-Klotho(或其胞外结构域)的Fc融合物(实施例2和3)和本领域已知的其他方法(例如，如本文提出的实施例中所述的方法)免疫来产生。可选地，某些非人抗体可以通过采用作为β-Klotho、FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4中一种或多种的区段的氨基酸免疫来产生，其中所述区段形成与本文提供的某些抗体相结合的表位的部分。抗体可以是多克隆的、单克隆的，或可以通过表达重组DNA在宿主细胞中合成。
如上文所述，完全人抗体可以通过免疫含有人免疫球蛋白基因座的转基因动物或通过选择表达人抗体库的噬菌体展示文库来制备。
单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein，(1975)Nature 256：49的标准体细胞杂交技术。可选地，用于产生单克隆抗体的其他技术可以使用，例如，B-淋巴细胞的病毒性或致瘤性转化。用于制备杂交瘤的一种合适动物系统是鼠系统，这是十分成熟的方法。用于分离免疫的脾细胞以进行融合的免疫操作方案和技术是本领域已知的。对于此类方法，来自免疫小鼠的B细胞与合适的永生化融合伴侣(如鼠骨髓瘤细胞系)融合。此外，如果需要，可以免疫大鼠或其他哺乳动物，替代小鼠，并且来自此类动物的B细胞可以与鼠骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤。可选地，可以使用来自除小鼠之外的来源的骨髓瘤细胞系。用于制造杂交瘤的融合方法也是熟知的。SLAM技术也可以在抗体的生产中使用。
提供的单链抗体可以通过经氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变域(Fv区)片段，产生单一多肽链而形成。此类单链Fvs(scFv)可以通过在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNA之间融合编码肽接头的DNA来制备。根据这两个可变域之间柔性接头的长度，所得到的多肽可以自身回折以形成抗原结合单体，或它们可以形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人，(1997)Prot.Eng.10：423；Kortt等人，(2001)Biomol.Eng.18：95-108)。通过合并包含VL和VH的多肽，可以形成与不同表位结合的多聚scFv(Kriangkum等人，(2001)Biomol.Eng.18：31-40)。为产生单链抗体所开发的技术包括在美国专利No.4,946,778；Bird，(1988)Science 242：423；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，(1989)Nature334：544，de Graaf等人，(2002)Methods Mol Biol.178：379-387中描述的那些。源自本文提供的抗体的单链抗体包括，但不限于包含表2中所述的重链可变区和轻链可变区的可变域组合、或轻链可变域和重链可变域组合的scFv，其中所述轻链可变域和重链可变域包含表3和4中所述的CDR。
可以使用亚类转换方法，将本文提供的属于一个亚类的抗体变成来自不同亚类的抗体。因而，例如，IgG抗体可以衍生自IgM抗体，并且反之亦然。此类技术允许制备新抗体，所述新抗体拥有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合特性，还显示与不同于亲本抗体的抗体同种型或亚类相关的生物学特性。可以使用重组DNA技术。可以在此类方法中使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如，编码所需同种型的抗体的恒定域的DNA。见，例如，Lantto等人，(2002)Methods Mol.Biol 178：303-316。
因而，提供的抗体包括包含例如上文所述的可变域组合、具有所需同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgD)以及Fab或其F(ab′)2片段的那些抗体。另外，如果需要IgG4，也可能需要在铰链区中导入点突变(CPSCP->CPPCP(以出现顺序分别是SEQ IDNO 380-381))(如Bloom等人，(1997)Protein Science 6：407中所述，所述文献通过引用并入本文)以减轻形成可能在IgG4抗体中导致异质性的H链内二硫键的趋势。
另外，用于衍生具有不同特性的抗体(即，改变结合针对这些抗体的抗原的亲和力)的技术也是已知的。称作链改组的这样一项技术包括将免疫球蛋白可变域基因库展示在丝状噬菌体的表面上，经常称作噬菌体展示法。链改组已经用来制备针对半抗原2-苯基噁唑-5-酮的高亲和力抗体，如Marks等人，(1992)BioTechnology 10：779描述。
可以对表2中描述的重链可变区及轻链可变区或表3A与3B、4A与4B和下表6C中描述的CDR进行保守性修饰(和对编码性核酸进行相应修饰)以产生具有功能性和生物化学特征的抗原结合蛋白。上文描述了用于实现此类修饰的方法。
特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物中的一种或多种的抗原结合蛋白可以进一步以多种方式修饰。例如，如果这些抗原结合蛋白可用于治疗性目的，则它们可以与聚乙二醇缀合(PEG化)以延长血清半寿期或增强蛋白质递送。可选地，主题抗体或其片段的V区可以与不同抗体分子的Fc区融合。可以修饰用于这个目的的Fc区，从而它不结合补体，因而降低使用融合蛋白作为治疗剂时在患者中诱导细胞裂解的似然性。此外，主题抗体或其功能片段可以与人血清白蛋白缀合以增强抗体或其片段的血清半寿期。抗原结合蛋白或其片段的另一个有用融合伴侣是转甲状腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚体的能力，因而抗体-TTR融合蛋白可以形成多价抗体，所述多价抗体可以增加抗体的结合和力。
可选地，本文所述的抗原结合蛋白的功能性和/或生物化学特征的明显修饰可以通过在重链和轻链的氨基酸序列中产生置换来实现，所述置换在其维持(a)置换区域内分子骨架的结构例如折叠或螺旋构象、(b)所述分子在靶位点处的电荷或疏水性或(c)侧链体积方面的作用明显不同。“保守性氨基酸置换”可以涉及将天然氨基酸残基置换为对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷具有微小影响或没有影响的非天然残基。见上文表5。此外，还可以将多肽中的任何天然残基置换为丙氨酸，如先前对于丙氨酸扫描诱变所述。
主题抗体的氨基酸置换(无论保守还是非保守性)可以由本领域技术人员通过施加常规技术来实现。氨基酸置换可以用来鉴定本文提供的抗体的重要残基，或用来增加或减少这些抗体针对(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物中一种或多种的亲和力，或用于修饰本文所述的其他抗原结合蛋白的结合亲和力。
表达抗原结合蛋白的方法
本文提供了包含如上文所述的至少一个多核苷酸的质粒、表达载体、转录盒或表达盒的形式的表达系统和构建体，以及包含此类表达系统或构建体的宿主细胞。
可以通过众多常规技术的任一项技术制备本文提供的抗原结合蛋白。例如，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白可以使用本领域已知的任何技术，由重组表达系统产生。见，例如，Monoclonal Antibodies，Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，Kennet Kennet等人(编著)Plenum Press，New York(1980)；和Antibodies：ALaboratory Manual Harlow和Lane(编著)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)。
抗原结合蛋白可以在杂交瘤细胞系中(例如，尤其抗体可以在杂交瘤中表达)或在除杂交瘤之外的细胞系中表达。编码抗体的表达构建体可以用来转化哺乳动物、昆虫或微生物宿主细胞。转化可以使用将多核苷酸导入宿主细胞中的任何已知方法进行，包括例如将多核苷酸包装在病毒或噬菌体中并且通过本领域已知(如美国专利No.4,399,216；No.4,912,040；No.4,740,461；No.4,959,455所例举)的转染方法，用构建体转导宿主细胞。所用的最佳转化方法将取决于转化哪种类型的宿主细胞。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域熟知的，并且包括但不限于，葡聚糖介导的转染法、磷酸钙沉淀法、聚凝胺介导转染法、原生质体融合法、电穿孔法、多核苷酸在脂质体中的包囊法、核酸与带正电荷脂类混合，和直接微量注射DNA至胞核中。
重组表达构建体一般包含编码多肽的核酸分子，所述多肽包含以下的一种或多种：本文提供的一个或多个CDR；轻链恒定区；轻链可变区；重链恒定区(例如，CH1、CH2和/或CH3)；和/或抗原结合蛋白的另一个支架部分。使用标准连接技术，将这些核酸序列插入适宜的表达载体中。在一个实施方案中，将重链或轻链恒定区附着于抗β-Klotho、抗-FGFR1c、抗-FGFR2c、抗-FGFR3c、抗-FGFR4或者β-Klotho以及FGFR1c-特异性重链或轻链可变区的C端并且连接到表达载体中。一般选择在所用的具体宿主细胞中有功能的载体(即，该载体与宿主细胞装置相容，允许扩增，和/或基因的表达可以发生)。在一些实施方案中，使用这样的载体，其使用蛋白质报道基因如二氢叶酸还原酶，利用蛋白质-片段互补测定法(见例如，美国专利No.6,270,964，所述专利在此通过引用并入)。合适的表达载体可以例如从Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences(以前的“Clontech”)购买。用于克隆和表达所述抗体和片段的其他有用载体包括在Bianchi和McGrew，(2003)Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44中描述的那些，所述文献在此通过引用并入。额外的合适的表达载体例如在Methods Enzymol.，第185卷(D.V.Goeddel编著)，1990，New York：Academic Press中讨论。
一般，在任何宿主细胞中使用的表达载体将含有用于质粒维持和用于克隆并表达外源核苷酸序列的序列。在某些实施方案中，统称为“侧翼序列”的此类序列一般将包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码多肽分泌物的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区和选择标记元件。下文讨论这些序列中的每一种。
任选地，载体可以含有“标签”编码序列，即，位于抗原结合蛋白编码序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；所述寡核苷酸序列编码polyHis(如hexaHis(SEQ ID NO：382))或存在对应市售抗体的另一个“标签”如FLAG、HA(流感病毒血凝素)或myc。这种标签一般在多肽表达时与多肽融合，并且可以充当亲和纯化或检测来自宿主细胞的抗原结合蛋白的手段。亲和纯化可以使用针对该标签的抗体作为亲和基质，例如通过柱层析完成。任选地，该标签可以随后通过多种手段(如使用某些裂解用肽酶)从纯化的抗原结合蛋白中移除。
侧翼序列可以是同源的(即，来自作为宿主细胞的相同物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株之外的物种)、杂合的(即，来自多于一种来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。因而，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物、任何脊椎或无脊椎生物或任何植物，前提是所述侧翼序列在宿主细胞装置中有功能并且可以由其激活。
载体中有用的侧翼序列可以通过本领域熟知的几种方法中的任一种获得。一般，本文有用的侧翼序列先前已经通过基因定位和/或通过限制性核酸内切酶消化被鉴定并且因而可以使用适宜的限制性核酸内切酶从适宜的组织源分离。在一些情况下，侧翼序列的完整核苷酸序列可以是已知的。这里，侧翼序列可以使用本文所述的用于核酸合成或克隆的方法合成。
无论侧翼序列的全部或仅一部分是否已知，它均可以使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用来自同一个或另一个物种的合适探针如寡核苷酸和/或侧翼序列片段筛选基因组文库而获得。在侧翼序列不是已知的情况下，含有侧翼序列的DNA片段可以从可能含有例如编码序列或甚至另一个基因或多个基因的较大DNA片段中分离。分离可以通过限制性核酸内切酶消化来完成，以产生适宜的DNA片段，随后使用琼脂糖凝胶纯化、
Figure BDA00001983794101501
柱层析(Chatsworth，CA)或技术人员已知的其他方法分离。选择合适酶以实现这个目的对于本领域技术人员将是容易明显的。
复制起点一般是商业购买的那些原核表达载体的部分，并且所述复制起点辅助该载体在宿主细胞中的扩增。如果选择的载体不含复制位点的来源，则其可以基于已知的序列化学地合成并且连接至载体中。例如，来自质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适于大多数革兰氏阴性细菌，并且多种病毒来源(例如，SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳头瘤病毒如HPV或BPV)是用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制组分的来源(例如，经常使用SV40来源的原因仅在于它还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列一般位于多肽编码区末端的3′并且起到终止转录的作用。通常，原核细胞中的转录终止序列是G-C丰富片段，后接多T序列。尽管序列容易地从文库中克隆或甚至作为载体的部分而商业地购得，但是它也可以使用核酸合成方法(如本文所述的那些方法)轻易地合成。
选择标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长所必需的蛋白质。常见的选择标记基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予针对抗生素或其他毒素的抗性，例如，针对原核宿主细胞的氨苄青霉素、四环素或卡那霉素；(b)补足细胞营养缺陷；或(c)供应从复杂或确定成分培养基不可获得的关键养分。具体的选择标记是卡那霉素耐药基因、氨苄青霉素耐药基因和四环素耐药基因。有利地，新霉素耐药基因也可以用于原核和真核宿主细胞中的选择。
其他可选择的基因可以用来扩增将要表达的基因。扩增是这样的过程，其中产生对于生长或细胞存活重要的蛋白质所需要的基因在连续世代的重组细胞的染色体内串联重复。哺乳动物细胞的合适的选择标记的实例包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子的胸苷激酶基因。将哺乳动物细胞转化体置于选择压力下，其中仅转化体因载体中存在的可选择基因而单独适于存活。通过在下述条件下培养转化的细胞施加选择压力，在所述条件下培养基中选择剂的浓度连续地增加，从而导致可选择基因和编码另一个基因(如结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白)的DNA的扩增。因此，增加量的多肽(如抗原结合蛋白)从扩增的DNA中合成。
核糖体位点通常是mRNA翻译起始必需的并且以Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)为特征。所述元件一般位于启动子的3′和待表达多肽的编码序列的5′。
在一些情况下，如真核宿主细胞表达系统中需要糖基化的情况下，可以操作多种前序列或原序列以改善糖基化或产率。例如，可以改变特定信号肽的肽酶切割位点或添加也可以影响糖基化的原序列。最终蛋白质产物可以在-1位置(相对于成熟蛋白的第一氨基酸)具有伴随表达的一个或多个额外氨基酸，所述氨基酸可能没有完全移除。例如，最终蛋白质产物可以具有在肽酶切割位点中存在的与氨基端连接的一个或两个氨基酸残基。可选地，一些酶切割位点的使用可以产生略微截短形式的所需多肽，如果所述酶在成熟多肽内部的这类区域切割。
表达和克隆过程一般将含有由宿主生物识别并且与编码抗原结合蛋白的分子有效连接的启动子，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。启动子是位于结构基因(通常约100至1000bp以内)的起始密码子上游(即，5′)的控制结构基因转录的非转录序列。启动子习惯上归入两个类别之一：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子响应于培养条件的某种变化(如存在或不存在某种养分或温度变化)而启动在它们控制下增加的来自DNA的转录水平。另一方面，组成型启动子均匀地转录与它们有效连接的基因，即，很少控制或不控制基因表达。由多种潜在宿主细胞识别的大量启动子是熟知的。合适的启动子通过以下方式与编码包含抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA有效连接：借助限制性酶消化从来源DNA中取出所述启动子并且将所需的启动子序列插入载体中。
随酵母宿主一起使用的合适启动子也是本领域熟知的。酵母增强子有利地随酵母启动子一起使用。随哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子是熟知的，并且包括，但不限于从病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、鸟肉瘤病毒、细胞巨化病毒、逆转录病毒、肝炎病毒和猴病毒40(SV40)的基因组中获得的那些启动子。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可感兴趣的额外启动子包括，但不限于：SV40早期启动子(Benoist和Chambon，(1981)Nature 290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；罗氏肉瘤病毒3′长末端重复序列中含有的启动子(Yamamoto等人，(1980)Cell 22：787-797)；疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；来自金属硫蛋白基因的启动子和调节序列(Prinster等人，(1982)Nature 296：39-42)；和原核启动子如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。另外，感兴趣的是以下动物转录控制区，它们显示组织特异性并且已经在转基因动物中使用：在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，(1984)Cell 38：639-646；Ornitz等人，(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，(1987)Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，(1985)Nature 315：115-122)；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，(1984)Cell38：647-658；Adames等人，(1985)Nature 318：533-538；Alexander等人，(1987)Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸细胞、乳腺细胞、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，(1986)Cell 45：485-495)；在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，(1987)Genes and Devel.1：268-276)；在肝脏中有活性的α-甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，(1985)Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，(1987)Science 253：53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，(1987)Genes and Devel.1：161-171)；在髓样细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人，(1985)Nature 315：338-340；Kollias等人，(1986)Cell 46：89-94)；在脑内的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，(1987)Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，(1985)Nature 314：283-286)；和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，(1986)Science234：1372-1378)。
增强子序列可以插入载体中以通过高等真核生物增加编码轻链或重链的DNA的转录，其中所述轻链或重链包含了特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白，例如特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的人抗原结合蛋白。增强子是作用于启动子以增加转录的顺式作用DNA元件，通常长度约10-300bp。增强子是相对不依赖方向和位置的，已经在转录单元5′和3′位置处找到。从哺乳动物基因可获得的几个增强子序列是已知的(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)。然而，一般使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、细胞巨化病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于激活真核启动子的示例性增强元件。尽管增强子可以在载体中位于编码序列的5′或3′，然而它一般位于启动子5′的位点处。编码适宜的天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列可以并入表达载体中以促进抗体的胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于其中待产生抗体的宿主细胞的类型，并且异源信号序列可以替换天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中有功能的信号肽的实例包括以下信号肽：在美国专利No.4,965,195中描述的白介素-7(IL-7)的信号序列；在Cosman等人，(1984)Nature 312：768中描述的白介素受体-2的信号序列；在EP专利号0367566中描述的白介素受体-4信号肽；在美国专利No.4,968,607中描述的I型白介素-1受体信号肽；在EP专利号0 460 846中描述的II型白介素-1受体信号肽。
提供的表达载体可以从起始载体如市售载体中构建。此类载体可以但是不需要含有全部所需的侧翼序列。在本文所述的一个或多个侧翼序列并不已经存在于载体中的情况下，可以分别获得它们并且将其连接入载体中。用于获得每种侧翼序列的方法是本领域技术人员熟知的。
在已经构建载体并且已经将编码包含抗原结合蛋白(其特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物)的轻链、重链或轻链及重链的核酸分子插入载体的正确位点后，可以将所完成的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可以通过熟知方法完成抗原结合蛋白的表达载体向所选择宿主细胞的转化，所述方法包括转染法、感染法、磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、微量注射法、脂质体转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法或其他已知技术。选择的方法将部分地与待使用宿主细胞的类型相关。这些方法和其他合适的方法是技术人员熟知的，并且例如在Sambrook等人，(2001)，上文中描述。
在适宜条件下培养时，宿主细胞合成抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白随后可以从培养基(如果宿主细胞将它分泌至培养基中)或从产生抗原结合蛋白的宿主细胞收集(如果抗原结合蛋白不分泌)。适宜宿主细胞的选择将取决于多种因素，如所需的表达水平、活性(如糖基化或磷酸化)所需要或必需的多肽修饰和折叠成生物活性分子的难易性。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系是本领域熟知的，并且包括但不限于从美国典型培养物保藏中心(ATCC)可获得的永生化细胞系，包括，但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)和许多其他细胞系。在某些实施方案中，细胞系可以通过确定哪种细胞系具有高表达水平并且组成型产生具有所需结合特性的抗原结合蛋白(例如，结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的能力)进行选择。在另一个实施方案中，可以选择来自B细胞系的细胞系，所述细胞系不产生自身抗体，但是具有产生和分泌异源抗体的能力。诱导FGF21样信号传导的能力也可以形成选择标准。
抗原结合蛋白针对诊断的和治疗性目的的用途
本文公开的抗原结合蛋白用于检测生物学样品中的(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物和鉴定产生(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物中的一种或多种的细胞或组织。例如，本文公开的抗原结合蛋白可以用于诊断测定法，例如，检测和/或定量在组织或细胞中表达的(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的结合测定法。与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白可以用于治疗在有需要的患者中与FGF21样信号传导相关的疾病(如2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病和代谢综合征)。通过形成包含抗原结合蛋白和(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的信号传导复合体，可以模拟和/或增强FGF21的天然体内活性，其在体内与相关启动信号传导的FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4和β-Klotho相关，从而导致治疗效果。
适应症
与人FGF21相关的疾病或疾患包括患者中的发作(至少部分地)由诱导FGF21样信号传导引起的任何疾病或疾患，所述FGF21样信号传导在体内因形成包含FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4和β-Klotho以及FGF21的复合物而启动。疾病或疾患的严重性也可以通过诱导FGF21样信号传导来降低。可以用所述抗原结合蛋白治疗的疾病和疾患的实例包括2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病和代谢综合征。
本文所述的抗原结合蛋白可以用来治疗2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病和代谢综合征，或可以用作预防性疗法，例如每天、每周、每两周、每月、每两月、每两年等施用以预防或降低症状的频率和/或严重性，例如，升高的血糖水平、升高的甘油三酯和胆固醇水平，从而提供改进的血糖和心血管风险因素谱。
诊断方法
本文所述的抗原结合蛋白可以用于诊断目的以检测、诊断或监测与FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c、FGFR4、β-Klotho、FGF21或其组合相关的疾病和/或疾患。另外，提供这样的方法，其使用本领域技术人员已知的传统免疫组织学方法(例如，Tijssen，1993，Practice andTheory of Enzyme Immunoassays，第15卷(编者R.H.Burdon和P.H.vanKnippenberg，Elsevier，Amsterdam)；Zola，(1987)MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.)；Jalkanen等人，(1985)J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人，(1987)J.Cell Biol.105：3087-3096)检测(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物在样品中的存在。检测(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物可以在体内或体外进行。
本文提供的诊断性应用包括使用抗原结合蛋白来检测(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的表达和/或与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合。用于检测(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的存在的方法的实例包括免疫测定法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。
对于诊断性应用，抗原结合蛋白一般将用可检测标记物基团标记。合适的标记基团包括，但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素、磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或由第二报道基因(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)识别的预定的多肽表位。在一些实施方案中，标记基团经多种长度的间隔臂与抗原结合蛋白缀合以减少潜在的空间位阻。用于标记蛋白质的多种方法是本领域已知的并且可以使用。
在另一个方面，抗原结合蛋白可以用来鉴定出表达(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的细胞或细胞。在具体实施方案中，将抗原结合蛋白用标记基团标记，并且检测标记的抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的结合。在又一个具体实施方案中，在体内检测抗原结合蛋白与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的结合。在又一个具体实施方案中，使用本领域已知的技术分离并测量抗原结合蛋白。见例如，Harlow和Lane，(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor(1991版和定期增补)；John E.Coligan，编著(1993)Current Protocols InImmunology New York：John Wiley&Sons。
提供了检测试验分子存在的另一个方面，其中所述试验分子同如本文公开的所提供抗原结合蛋白竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合。一种这样的测定法的实例可以涉及在所述试验分子存在或不存在时检测溶液中游离抗原结合蛋白的量，其中所述溶液含一定量的(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物中的一种或多种。游离抗原结合蛋白(即，未与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的抗原结合蛋白)的量增加表明，试验分子能够同所述抗原结合蛋白竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合。在一个实施方案中，抗原结合蛋白用标记基团标记。可选地，将试验分子标记，并且在抗原结合蛋白存在或不存在下，监测游离试验分子的量。
治疗的方法：药物制剂和施用途径
还提供了使用抗原结合蛋白的方法。在一些方法中，将抗原结合蛋白提供给患者。抗原结合蛋白诱导FGF21样信号传导。
也提供了包含治疗有效量的一种或多种抗原结合蛋白和可药用稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或辅助剂的药物组合物。此外，包括通过施用这种药物组合物治疗患者的方法。术语“患者”包括人患者。
可接受的制剂材料是在所用的剂量和浓度上对接受者无毒的。在具体实施方案中，提供了包含治疗有效量的人抗原结合蛋白的药物组合物，其中所述人抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选地是在所用的剂量和浓度上对接受者无毒的。在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于修饰、维持或保持例如，组合物的pH、重量克分渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶出或释放速率、吸收或渗透的制剂材料。在此类实施方案中，合适的制剂材料包括，但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物药；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如碳酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基β-环糊精)；填料；单糖；二糖；和其他糖(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、矫味剂和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(如Pluronics、PEG、山梨聚糖酯、聚山梨酯如聚山梨酯20、聚山梨酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇、山梨醇)；递送溶媒；稀释剂；赋形剂和/或药物辅助剂。见，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，(A.R.Gennaro编著)，1990，Mack Publishing Company。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期施用途径、递送形式和所需剂量确定。见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，上文。在某些实施方案中，此类组合物可以影响公开的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。在某些实施方案中，药物组合物中的主要溶媒或载体可以在性质上是水性或非水性的。例如，合适的溶媒或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能补充有肠胃外施用的组合物中常见的其他材料。中性缓冲的盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性溶媒。在具体实施方案中，药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且可以还包括山梨醇或合适替代物。在某些实施方案中，可以通过将具有所需纯净程度的所选组合物与冻干饼或水溶液形式的任选配制剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences，上文)混合，制备包含抗原结合蛋白的组合物以用于储存，所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。另外，在某些实施方案中，可以使用适宜的赋形剂如蔗糖，将结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白配制为冻干物。
可以选择所述药物组合物用于肠胃外递送。可选地，可以选择所述组合物用于吸入或用于经消化道递送，如口服递送。此类可药用组合物的制备属于本领域技术范围内。
制剂组分优选地以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液用来维持组合物在生理pH或在略微较低的pH上，一般在约5至约8的pH范围内。
当考虑肠胃外施用时，治疗性组合物可以以无热原、肠胃外可接受的水溶液形式提供，所述水溶液包含在可药用溶媒中的所需抗原结合蛋白。用于肠胃外注射的特别合适的溶媒是无菌蒸馏水，在其中将抗原结合蛋白配制为恰当保存的无菌等渗溶液。在某些实施方案中，制备可以涉及将所需的分子连同可以提供产品的受控或持续释放的试剂(如可注射微球体、生物易蚀粒子、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠或脂质体)一起配制，其中所述产品可以通过贮库型注射来递送。在某些实施方案中，也可以使用透明质酸，这可以产生促进循环中持久持续时间的效果。在某些实施方案中，可植入的药物递送装置可以用来导入所需的抗原结合蛋白。
将某些药物组合物配制用于吸入。在一些实施方案中，与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合的抗原结合蛋白配制为可吸入的干燥散剂。在具体实施方案中，抗原结合蛋白吸入溶液也可以连同用于气雾剂递送的推进剂一起配制。在某些实施方案中，可以将溶液喷雾。肺部施用和制剂方法因此在国际专利申请号PCT/US94/001875中进一步描述，所述专利通过引用并入并且描述了化学修饰的蛋白质的肺部递送。一些制剂可以口服施用。以这种方式施用的特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白可以连同或不连同复配固体剂型如片剂和胶囊剂时习惯使用的载体一起配制。在某些实施方案中，胶囊剂可以设计成在胃肠道中当生物利用率最大化和预全身性降解最小化时的位点处释放制剂的活性部分。可以包含额外物质以促进抗原结合蛋白的吸收。也可以使用稀释剂、矫味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、助悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。
一些药物组合物包含有效量在具有适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的一种或多种人抗原结合蛋白，所述人抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。通过将片剂溶解于无菌水或另一个适宜溶媒中，可以制备单位剂量形式的溶液。合适的赋形剂包括，但不限于，惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
额外的药物组合物将对本领域技术人员是显而易见的，包括在持续或受控递送制剂中包含抗原结合蛋白的制剂，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。用于配制多种其他持续或受控递送工具如脂质体载体、生物易蚀微粒子或多孔珠和贮库型注射剂的技术也是本领域技术人员已知的。见例如，国际专利申请号PCT/US93/00829，所述专利通过引用并入并且描述了用于递送药物组合物的多孔聚合微粒子的受控释放。持续释放制备物可以包括成型物品(例如薄膜或微胶囊)形式的半通透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公开No.EP 058481中公开，所述的每份专利通过引用并入)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers 2：547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，Chem.Tech.12：98-105)、乙烯-醋酸乙烯酯(Langer等人，1981，上文)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开No.EP133,988)。持续释放组合物也可以包括脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的几种方法中的任一种制备。见，例如，Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开号EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949，所述文献通过引用并入。
用于体内施用的药物组合物一般作为无菌制备物提供。消毒可以通过经无菌滤膜过滤而完成。当组合物冻干时，使用这种方法的消毒可以在冻干和重构之前或之后实施。用于肠胃外施用的组合物可以按冻干形式或以溶液形式贮存。肠胃外组合物通常置入具有无菌接口的容器中，例如，静脉内输液袋或具有皮下注射针头可穿透的塞子的小瓶。
在某些实施方案中，将表达如本文公开的重组抗原结合蛋白的细胞包囊化用于递送(见，Invest.Ophthalmol Vis Sci (2002)43：3292-3298和Proc.Natl.Acad.Sciences USA (2006)103：3896-3901)。
在某些制剂中，抗原结合蛋白具有至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml或150mg/ml的浓度。一些制剂含有缓冲液、蔗糖和聚山梨酯。一种制剂的实例是含有50-100mg/ml抗原结合蛋白、5-20mM乙酸钠、5-10％w/v蔗糖和0.002-0.008％w/v聚山梨酯的制剂。例如，某些制剂含有在9-11mM乙酸钠缓冲液、8-10％w/v蔗糖和0.005-0.006％w/v聚山梨酯中的65-75mg/ml抗原结合蛋白。某些此类制剂的pH在4.5-6范围内。其他制剂具有5.0-5.5的pH(例如，pH5.0、5.2或5.4)。
一旦已经配制药物组合物，它可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干的粉末贮存于无菌小瓶中。此类制剂可以以即用型形式或施用之前重构的形式(例如，冻干)贮存。还提供用于产生单剂量施用单元的药盒。某些药盒含有第一容器，其具有干燥的蛋白质，和第二容器，其具有含水制剂。在某些实施方案中，提供了含有单腔和多腔室预充填注射器(例如，液体注射器和冻干剂注射器(lyosyringe))的药盒。待使用的含有抗原结合蛋白的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗背景和目标。本领域技术人员会理解，治疗的适宜剂量水平将部分地根据所递送的分子、正在使用的抗原结合蛋白的适应症、施用途径和患者的体格大小(体重、体表面或器官尺寸)和/或状况(年龄和总体健康)变动。在某些实施方案中，临床医生可以调节剂量并且调整施用途径以获得最佳治疗效果。
根据上文提到的因素，常见的剂量可以是约1μg/kg至高达约30mg/kg或更多。在具体实施方案中，剂量可以是10μg/kg直至约30mg/kg、任选地0.1mg/kg直至约30mg/kg、备选地0.3mg/kg直至约20mg/kg。在一些应用中，剂量是0.5mg/kg至20mg/kg。在一些情况下，抗原结合蛋白以0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg或20mg/kg给药。一些治疗方案中的剂量方案是剂量0.3mg/kg每周一次、0.5mg/kg每周一次、1mg/kg每周一次、3mg/kg每周一次、10mg/kg每周一次或20mg/kg每周一次。
给药频率将取决于所用的配方中特定抗原结合蛋白的药物代谢动力学参数。一般，临床医生施用所述组合物直至达到实现所需效果的剂量。组合物可以因此随时间推移作为单一施用或作为两个或更多个剂量施用(其可以但是不需要含有相同量的所需分子)或作为经植入装置或导管的连续输注施用。适宜的剂量可以通过使用适宜剂量-反应数据确定。在某些实施方案中，抗原结合蛋白可以经过延长的时间段施用至患者。抗原结合蛋白的长期施用使得通常与不是完全人的抗原结合蛋白(例如在非人动物中产生的针对人抗原的抗体，例如，在非人物种中产生的非完全人抗体或非人抗体)相关的不利免疫或过敏反应最小化。
药物组合物的施用途径依据已知的方法，例如，口服、经静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、肝门内或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置施用。在某些实施方案中，组合物可以通过团注注射施用或通过输注连续地施用或通过植入装置来施用。
组合物还可以通过植入所需分子已经被吸收到或包裹到上面的膜、海绵或另一种适宜材料而局部施用。在某些实施方案中，在使用植入装置的情况下，该装置可以植入任何适合的组织或器官中，并且所需分子的递送可以经扩散、定时释放大丸剂或连续施用进行。
离体地使用抗原结合蛋白药物组合物也可以是合乎需要的。在此类情况下，从取出患者的细胞、组织或器官暴露于抗原结合蛋白药物组合物，然后将所述细胞、组织和/或器官是植入返回该患者中。
具体而言，特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物的抗原结合蛋白可以通过植入已经使用如本文所述的那些方法加以基因工程化以表达并分泌所述多肽的某些细胞来递送。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体的、异源的或异种的。在某些实施方案中，细胞可以永生化。在其他实施方案中，为了降低免疫反应的可能性，可以将细胞包囊化以避免浸润周围组织。在其他实施方案中，包囊材料一般是生物相容性的半通透性聚合物壳或膜，所述的壳和膜允许蛋白质产物的释放，但是防止细胞遭受患者的免疫系统或来自周围组织的其他有害因素破坏。
联合疗法
在另一个方面，本公开提供了与一种或多种其他疗法一起，用本公开的治疗性抗原结合蛋白如本文所述的完全人治疗性抗体治疗糖尿病受试者的方法。在一个实施方案中，这种联合疗法实现加合或协同效应。所述抗原结合蛋白可以与目前可用的2型糖尿病或肥胖症疗法中的一种或多种疗法组合施用。用于糖尿病的这些疗法包括双胍(二甲双胍)和磺酰脲(如格列本脲、格列吡嗪)。涉及维持葡萄糖稳态的额外疗法包括PPARγ激动剂(吡格列酮、罗格列酮)；列奈类(美格列奈、瑞格列奈和那格列奈)；DPP-4抑制剂(
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和
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)和α葡糖苷酶抑制剂(阿卡波糖、伏格列波糖)。
糖尿病的额外联合疗法包括可注射疗法如胰岛素和肠促胰岛素模拟物(
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)，其他GLP-1(胰高血糖素肽)类似物如利拉鲁肽(liraglutide)，其他GLP-1R激动剂和
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(普兰林肽(pramlintide))。
涉及体重减轻的额外联合疗法包括
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和
Figure BDA00001983794101657
实施例
以下实施例(包括所实施的实验和实现的结果)仅出于说明目的而提供并且不得解释成限制性。
实施例1
制备用作抗原的过量表达FGFR1c的细胞
将编码全长人FGFR1c多肽的核酸序列(SEQ ID NO：4；图1A-1B)和编码全长人β-Klotho多肽的独立序列(SEQ ID NO：7；图2A-2C)亚克隆至合适的哺乳动物细胞表达载体(例如，pcDNA3.1 Zeo、pcDNA3.1Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA)或pDSRα20中。pDSRα20载体含有用于表达目的基因的SV40早期启动子和用于在CHODHFR(-)宿主细胞如AM1 CHO(DG44的衍生物，CHO DHFR(-))中选择的小鼠DHFR表达盒。
将AM-1CHO细胞以每个100mm培养皿1.5x106个细胞接种。在24小时后，细胞用pDSRα20/huFGFR1c和pDSRα20/huβ-Klotho的线性化DNA和FuGene6(Roche Applied Science)共转染。在转染后2天，转染的细胞经胰蛋白酶消化并接种至含有10％透析的FBS并且没有次黄嘌呤补充物的CHO DHFR选择性生长培养基中。在2周后，所得到的转染集落经胰蛋白酶消化并汇集。
HEK293T细胞用基于载体的在pcDNA3.1系列或pTT14(由Durocher，NRCC开发的表达载体，带有与pTT5相似的CMV启动子和EBVori以及嘌呤霉素选择标记)中的全长huFGFR1c和huβ-Klotho转染并且根据与用于CHO转染和选择的方法相似的方法用相应的药物选择。
使用Alexa 647-标记的FGF21，将FGF21R(即，FGFR1c和β-Klotho)转染的AM1CHO或293T细胞汇集物反复地分选。作为细胞表面染色试剂，将FGF21用Alexa 647-NHS按照制造商(MolecularProbes，Inc.目录号A 2006)推荐的方法标记。Alexa 647-标记的FGF21显示对表达FGF21R受体而不是未转染的亲本细胞的细胞特异性染色(图3)。在最终分选结束时，将高表达细胞收集、扩充和冷冻至小瓶中。制备AM-1/huFGF21R细胞用于免疫，并且293T/huFGF21R细胞用于免疫后通过FACS滴定小鼠血清和用于结合杂交瘤上清液通过FMAT的筛选(见实施例4)。
实施例2
制备用作抗原的可溶性FGFR1c/β-Klotho复合物
在pTT14或pcDNA3.1表达载体中产生可溶性FGF21受体构建体。FGFR1c ECD-Fc构建体(SEQ ID NO：362，图4)包含与Fc(SEQ IDNO：384)融合的FGFR1c的N端胞外结构域(氨基酸残基#1-374；SEQID NO：5)。β-Klotho ECD-Fc构建体(SEQ ID NO：363，图5)包含与Fc(SEQ ID NO：384)融合的β-Klotho的N端胞外结构域(氨基酸残基#1-996；SEQ ID NO：8)。
HEK293细胞(293F，Invitrogen)用huFGFR1c ECD-Fc/pTT5、huβ-Klotho ECD-Fc/pTT14-puro和dGFP/pcDNA3.1-Neo转染，并且在相应药物存在下选择，随后基于dGFP表达进行反复的FACS分选。将细胞在HyperFlasks(Corning)中补充有非必需氨基酸的无血清Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)内生长育4天，并且收获条件培养基(CM)以用于纯化。
将293CM浓缩6倍并且施加至在PBS中平衡的蛋白A FF。蛋白质用Pierce Gentle Ag/Ab洗脱缓冲液洗脱。蛋白A汇集物对20mMTris-HCl，pH 7，10mM NaCl透析并且施加至pH 7.0的SP HP。FGFR1cECD-Fc存在于穿流(FT)中，并且异源二聚体用线性梯度0-0.4MNaCl，20mM Tris-HCl pH 7.0洗脱。N端氨基酸测序验证了纯化的可溶性FGF21R是由(1：1)比率的FGFR1c ECD-Fc和β-K1otho ECD-Fc组成的异源二聚体。使用纯化的可溶性FGF21R-Fc(图6)作为用于免疫的抗原。
实施例3
单克隆抗体的制备
使用一种或多种合适形式的FGF21受体抗原实施免疫，所述FGF21受体抗原包括：(1)在细胞表面表达全长人FGFR1c和β-Klotho的CHO转染子的细胞结合受体，其通过用编码SEQ ID NO：4的人全长FGFR1c多肽的cDNA(还见图1a-b)和编码SEQ ID NO：7的人β-Klotho多肽的cDNA(还见图2a-c)转染CHO细胞来获得；(2)来自表达FGF21R受体复合物的前述细胞的膜提取物；或(3)通过共表达FGFR1c的N端胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：5；还见图4)和β-Klotho的N端胞外结构域(ECD)(SEQ ID NO：8；还见图5)可获得的可溶性FGF21R受体或(4)其组合。
将合适量的免疫原(即，10μg/小鼠的可溶性FGF21R或3-4x106个细胞/小鼠的稳定转染CHO细胞的或者150μg/小鼠的从稳定表达FGF21R的CHO细胞中制备的纯化FGF21R膜)根据1996年12月3日提交的美国专利申请系列No.08/759,620以及国际专利申请No.WO 98/24893和WO 98/07409中公开的方法用于XenoMouseTM中的初始免疫，其公开内容均通过引用并入。在初始免疫后，免疫原(5μg/小鼠的可溶性FGF21R或1.7x 106个FGF21R转染的细胞或75μg纯化的FGF21R膜)的后续强化免疫按方案施用和维持在小鼠中诱导合适的抗FGF21R滴度所必需的持续时间。滴度由合适的方法，例如由酶免疫测定法、荧光激活细胞分选(FACS)或由其他方法(包括酶免疫测定法和FACS的组合)测定。
鉴定显示合适滴度的动物，并且淋巴细胞从引流淋巴结获得，并且如果需要，汇集用于每一个队列。将淋巴细胞从淋巴样组织中通过在合适的培养基(例如，Dulbecco改良Eagle培养基；DMEM；从Invitrogen，Carlsbad，CA可获得)中研磨以从组织释放细胞，并且悬浮于DMEM中。将B细胞使用标准方法选择和/或扩充，并且使用本领域已知的技术与合适的融合伴侣(例如，非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653细胞)(美国典型培养物保藏中心CRL 1580；Kearney等人，J.Immunol.123，1979，1548-1550)融合。
在一种合适的融合方法中，将淋巴细胞与融合伴侣细胞以1：4的比率混合。通过400x g离心4分钟温和地沉淀细胞混合物，滗析上清液，并且将细胞混合物温和地混合(例如，使用1ml吸管)。用PEG/DMSO(聚乙二醇/二甲基亚砜；从Sigma-Aldrich，St.Louis MO获得；每百万个淋巴细胞1ml)诱导融合。将PEG/DMSO在温和搅拌下经1分钟缓慢地添加，随后混合1分钟。将IDMEM(无谷氨酰胺的DMEM；每百万个B细胞2ml)随后在2分钟内添加，伴以温和搅拌，随后在3分钟内添加额外的IDMEM(每百万个B细胞8ml)。
将融合的细胞沉淀(6分钟400x g)并且重悬于每百万个B细胞20ml选择培养基中(例如，含有重氮丝氨酸和次黄嘌呤[HA]并根据需要含有其他补充物质的DMEM)。细胞在37℃孵育20-30分钟并且随后重悬于200ml选择培养基中并且在T175瓶中培养三至四天，之后在96孔板中接种。
使用标准技术，将细胞分配至96孔板中以最大化所产生集落的克隆性。在培养几天后，收集上清液并且进行如下文详述的筛选测定法，包括证实与人FGF21受体的结合、特异性和/或物种交叉反应性。进一步选择阳性细胞并使其接受标准克隆和亚克隆技术处理。克隆系在体外扩充，并且获得分泌的人抗体用于分析。
以这种方式，小鼠用表达全长FGF21R的细胞或膜或可溶性FGF21R胞外结构域免疫，在大约1个月至3.5个月时间范围内免疫11-17次。获得了分泌FGF21R特异性抗体的几个细胞系，并且进一步表征抗体。其序列在本文和序列表中提出，并且提供使用这些抗体的多种试验的结果。
实施例4
通过FMAT选择结合抗体
培养14天后，借助荧光计量微体积分析技术(FMAT)，通过针对CHO AM1/huFGF21R细胞系或重组HEK293细胞筛选，对杂交瘤上清液筛选FGF21R特异性单克隆抗体，其中所述细胞系或细胞用人FGF21R转染并且针对亲本CHO或HEK293细胞反向筛选。简而言之，将Freestyle培养基(Invitrogen)中的细胞以50μL/孔的体积接种至384孔FMAT平板中，对于稳定转染子，密度是4,000个细胞/孔并且对于亲本细胞，密度是16,000个细胞/孔，并且将细胞在37℃孵育过夜。随后添加10μL/孔的上清液，并且将平板在4℃孵育大约1小时，此后添加浓度为2.8μg/ml(400ng/mL终浓度)的10μL/孔的抗人IgG-Cy5第二抗体。平板随后在4℃孵育1小时，并且使用FMAT细胞检测系统(Applied Biosystems)读取荧光。
总计，超过3,000份杂交瘤上清液由FMAT方法鉴定为与表达FGF21受体的细胞结合，但不亲本细胞与结合。这些上清液随后在如下文描述的FGF21功能测定法中检验。
实施例5
选择诱导FGF21样信号传导的抗体
开展实验以使用合适的FGF21报道基因测定法鉴定模拟野生型FGF21活性(例如，诱导FGF21样信号传导的能力)的功能性抗体。所公开的FGF21报道基因测定法借助MAPK途径读数度量FGFR信号传导的激活。β-Klotho是FGF21信号传导的共同受体，并且虽然因其非常短的胞质域而认为β-Klotho不具有任何内在信号传导能力，但FGF21需要通过FGFR诱导信号传导。
实施例5.1
ELK-萤光素酶报道基因测定法
使用重组人293T肾细胞或CHO细胞体系进行ELK-萤光素酶测定法。具体而言，将宿主细胞工程化以过量表达β-Klotho和萤光素酶报道基因构建体。所述报道基因构建体含有编码GAL4-ELK1和5xUAS-Luc的序列，其为受含有五个串联Gal4结合位点副本的启动子驱动的萤光素酶报道基因。FGF21受体复合物在这些重组报道细胞系中的活化诱导胞内信号转导，这转而导致ERK和ELK磷酸化。萤光素酶活性受磷酸化ELK的水平调节，并且用来间接地检测和定量FGF21活性。
在一个实施例中，CHO细胞使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，根据制造商的操作方案用表达β-Klotho、FGFR1c和报道质粒：5xGal4-萤光素酶(在萤光素酶上游具有5xGal4结合位点的最小TK启动子)和Gal4-ELK1依次转染。当Gal4-ELK1被ERK磷酸化时，Gal4-ELK1与Gal4结合位点结合并且激活转录。萤光素酶转录并且因而在这种情况下其相应酶活性受磷酸化ELK1的水平调节，并且用来间接地检测和定量FGF21活性。
基于10-20倍的最佳分析窗口用在单一nM范围内显示EC50的天然FGF21，选择克隆2E10作为FGF21萤光素酶报道细胞系。
对于所述测定法，将ELK-萤光素酶报道细胞接种于96孔分析平板内和进行血清饥饿过夜。在37度添加FGF21或试样持续6小时。随后使平板冷却至室温并且细胞裂解物中的萤光素酶活性用Bright-Glo(Promega)测量。
实施例5.2
ERK-磷酸化测定法
开发了替代性宿主细胞系，具体是L6(一种大鼠成肌细胞细胞系)，并且将其用于鉴定具有FGF21样信号传导活性的抗体。大鼠L6细胞系是用于活性测定法的合乎需要的宿主细胞，因为已知它表达最低水平的内源性FGF受体。L6细胞不应答于FGF21，甚至用β-Klotho表达载体转染时也是如此，并且因此提供更清晰的背景(Kurosu等人，(2007)，J.Biol.Chem.282，26687-26695))。
L6细胞在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中维持。细胞使用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)，根据制造商的操作方案，用表达β-Klotho以及各个FGFR的质粒转染。
对L6细胞中FGF信号传导的分析如文献(Kurosu等人，(2007)，J.Biol.Chem.282，26687-26695)中所述进行。在FGF21或试验分子处理和在液氮中速冻后10分钟，将细胞培养物收集、在裂解缓冲液中均化并且使用抗磷酸-p44/42MAP激酶(ERK1/2)抗体和抗ERK抗体(Cell Signaling)进行蛋白质印迹分析。以这种方式确定磷酸化ERK对总ERK蛋白的百分比。
此外，也可以开发和使用频繁用于细胞因子受体的基于因子依赖性小鼠BaF3细胞的增殖测定法。
在基于CHO细胞(克隆2E10)的人FGF21ELK-萤光素酶报道基因测定法中检验的杂交瘤上清液当中，与作为阳性对照的20nMFGF21相比，超过30份上清液鉴定为阳性(＞5％的FGF21活性)。抗体随后从这些阳性上清液的杂交瘤培养物的条件培养基中纯化并且在基于CHO细胞的ELK-萤光素酶报道基因测定法再次检验。图7显示在剂量-反应效力测定法中具有小于1μg/ml(或6.7nM)的估计EC50的代表性抗体。所述活性在基于L6细胞的ERK1/2磷酸化测定法(图8)中得到证实，EC50小于10nM，这与CHO稳定细胞系2E10中的ELK-萤光素酶测定法相一致。
实施例6
FGF21样信号传导的诱导是对FGFR1c/β-Klotho复合物特异性 的
已经报道FGF21与β-Klotho配对时经包含FGFR1c、2c、3c和4的多种受体复合物发送信号。FGF21激动性抗体的选择性在用表达相应FGFR和β-Klotho的载体转染的大鼠成肌细胞L6细胞中检验。图9中所示的结果表明，与β-Klotho配对时，该活性经FGFR1c而不经FGFR2c、3c或4选择性和排他地介导，原因是直至100nM激动性抗体时，没有对后三种受体检测到活性。这种独特的选择性强烈地提示，这些抗体的作用是β-Klotho依赖性，然而它必须还特别包含信号传导复合物的FGFR1c组分。
实施例7
在原代人脂肪细胞中的活性
FGF21在培养的脂肪细胞中刺激葡萄糖摄入和脂分解，并且认为脂肪细胞比重组报道细胞体系更有生理意义。
证实一组抗体在人脂肪细胞测定法中显示出与FGF21相似的Erk-磷酸化活性(图10)，估计的EC50小于10nM。
实施例8
竞争结合和表位结合
为比较在FGF21受体上抗体结合位点的相似性，进行一系列竞争结合实验并且由Biacore测量。在一个实施例中(和如图11中所示)，将两个代表性FGF21受体激动抗体(24H11和17D8)和一个非功能的FGF21受体结合抗体(1A2.1)固定在传感器芯片表面上。可溶性人FGFR1c/β-Klotho ECD-Fc复合物或β-Klotho随后在固定抗体表面上捕获。最后，将几种试验FGF21受体抗体逐个注射在所捕获的可溶性人FGF21受体或β-Klotho上。如果注射的抗体识别与固定抗体所识别的结合位点不同的结合位点，则会观察到第二结合事件。如果抗体识别了十分相似的结合位点，将不会观察到更多的结合。
如(图11A)中所示，对于所检验的激动性抗体，存在两个不同但部分重叠的结合位点。一个位点被24H11、21H2、18B11.1和17C3覆盖(组A)并且另一个位点被17D8、12E4和18G1覆盖(组B)。两个非功能抗体2G10和1A2与彼此不同和与组A和B中激动性抗体所覆盖的两个位点不同的位点结合。与组A表位结合的其他功能抗体包括20D4、22H5、16H7、40D2和46D11。通过这种方法证实其他两个功能抗体26H11和37D3结合了由组B抗体覆盖的相同位点。此外，对于39F11、39F7和39G5(组C)，鉴定到功能抗体的第三结合位点，它们似乎与组A和B结合位点不同(图11B)。
另一项Biacore分析用固定在传感器芯片上的生物素化-FGF21。随后使单独或与各个试验抗体以100nM混合的10nM可溶性β-Klotho通过芯片。(图12)显示，组A中的几种激动性抗体(24H11，18B11，17C3)和抗体12E4(来自组B)在结合于可溶性β-Klotho结合方面与FGF21显著竞争，而非功能抗体2G10和1A2和几种其他功能抗体不显示与FGF21竞争结合。
图11C汇总获得的结合结果。
实施例9
天然及变性结构的识别
研究了公开的抗原结合蛋白识别变性和天然结构的能力。方法和结果如下。
实施例9.1
FGF21受体激动性抗体不识别变性结构，如由FACS所显示
来自稳定表达FGF21受体(FGFR1c和β-Klotho)的CHO细胞或CHO亲本细胞的细胞裂解物用不含β-巯基乙醇(非还原性条件)的样品缓冲液稀释。在4-20％SDS-PAGE凝胶上，将每条泳道20μl细胞裂解物加载到以分子量标记泳道分隔的相邻泳道上。在电泳后，将凝胶印迹到0.2μ硝酸纤维素滤膜上。印迹物用Tris-缓冲盐水/Triton-X(TBST)加5％脱脂乳(封闭缓冲液)处理30分钟。随后将印迹物沿着分子量标记泳道切开。印迹物条随后用TBST/5％乳中的FGF21受体激动性抗体(12C3、26H11、12E4、21H2、18B11或20D4)和市售山羊抗鼠βKlotho或小鼠抗huFGFR1(R&D Diagnostics)探测。将印迹物在室温与抗体孵育1小时，随后用TBST+1％乳洗涤3次。印迹物随后用抗人或抗山羊IgG-HRP第二抗体探测20分钟。将印迹物用TBST洗涤3次15分钟，随后用Pierce Supersignal West Dura显影试剂处理(1分钟)并且对Kodak Biomax X射线胶片曝光。
市售抗β-Klotho以及抗FGFR1抗体检测到SDS-PAGE中的相应受体蛋白，表明它们与变性的受体蛋白结合。相反，所检验的FGF21受体激动性抗体没有一个检测到相应的蛋白质种类，表明有别于与变性序列结合的商业抗体，它们与天然构象表位结合。
实施例9.2
FGF21受体激动性抗体与天然受体结构结合，如由FACS所显 示
用几种市售可得的FGFR1c和β-Klotho抗体和几种公开的FGF21受体激动性抗体进行FACS结合分析。所述实验如下进行。
稳定表达FGF21受体的CHO细胞用R&D Systems小鼠抗huFGFR1、山羊抗muβ-Klotho或FGF21受体抗体24H11、17C3、17D8、18G1或2G10(100μl PBS/0.5％BSA中每1x106个细胞1μg)处理。将细胞在4℃与抗体孵育，随后用PBS/BSA洗涤两次。细胞随后在4℃用FITC-标记的第二抗体处理，随后洗涤两次。将细胞重悬于1mlPBS/BSA中，并且使用FACS Calibur仪分析抗体结合。
与蛋白质印迹法结果一致，所检验的全部FGF21受体激动性抗体在FACS中均良好地与细胞表面FGF21受体结合，而市售抗β-Klotho或抗FGFR1抗体均不结合。这种观察结果进一步证实，FGF21受体激动性抗体识别天然结构，而针对受体组分的商业抗体不识别。
实施例10
精氨酸扫描
如上文所述，产生和表征结合人FGF21R(例如，FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和β-Klotho)的抗原结合蛋白。为确定人FGFR1c和/或β-Klotho上与这些各异抗原结合蛋白结合的中和性决定簇，可以构建众多的突变FGFR1c和/或β-Klotho蛋白，其在人FGFR1c和/或β-Klotho的所选择氨基酸残基处具有精氨酸置换。精氨酸扫描是现有技术认可的其中抗体或其他蛋白质与另一种蛋白质结合的评价方法，见，例如Nanevicz等人，(1995)J.Biol.Chem.，270：37，21619-21625和Zupnick等人，(2006)J.Biol.Chem.，281：29，20464-20473。通常，精氨酸侧链带正电荷并且与其他氨基酸相比是相对庞大的，这可以破坏抗体与导入突变的抗原区域结合。精氨酸扫描是确定某残基是否是中和性决定簇和/或表位的部分的方法。
可以选择遍及人FGFR1c和/或β-Klotho胞外结构域分布的多个氨基酸用于突变成精氨酸。这种选择可以偏向于带电荷或极性氨基酸，以使残基位于表面的可能性最大化并且降低突变导致错误折叠蛋白质的似然性。使用本领域已知的标准技术，可以基于Stratagene
Figure BDA00001983794101751
II操作方案试剂盒(Stratagene/Agilent，Santa Clara，CA)提供的标准，设计含有突变残基的有义和反义寡核苷酸。可以使用
Figure BDA00001983794101752
II试剂盒(Stratagene)进行野生型(WT)FGFR1c和/或β-Klotho序列的诱变。可以设计嵌合构建体以编码在胞外结构域羧基端上的FLAG-组氨酸标签(六个组氨酸(SEQ ID NO：382))以借助这个多His标签促进纯化。
使用Bio-Plex工作站和软件(BioRad，Hercules，CA)，可以进行多通道分析，以通过分析示例性人FGFR1c和/或β-Klotho mAb与精氨酸突变体相对于野生型FGFR1c和/或β-Klotho蛋白的差异性结合而确定人FGFR1c和/或β-Klotho上的决定簇。任何数目的五His包被珠的珠代码(“五-His”公开为SEQ ID NO：383)(Qiagen，Valencia，CA；见www1.qiagen.com)可以用来捕获加组氨酸标签的蛋白质。珠代码可以允许FGFR1c和/或β-Klotho精氨酸突变体和野生型人FGFR1c和/或β-Klotho的多路复合。
为制备所述珠，将100μl野生型FGFR1c和/或β-Klotho以及来自瞬时表达培养物的FGFR1c和/或β-Klotho精氨酸突变体上清液与五-His珠(“五-His”公开为SEQ ID NO：383)在4℃结合过夜或在室温结合2小时，伴以激烈振摇。所述珠随后按照制造商的操作方案洗涤，并且将珠组(bead set)汇集和等分至96孔过滤平板(Millipore，Bellerica，MA，产品号MSBVN1250)的2或3列分别用作一式两份或一式三份分析点。将稀释4倍的100μl抗FGFR1c和/或抗β-Klotho抗体添加至孔内，在室温孵育1小时，并且洗涤。将100μl的1∶100稀释的PE缀合的抗人IgG Fc(Jackson Labs.，Bar Harbor，ME，产品号109-116-170)添加每个孔，在室温孵育1小时并且洗涤。将珠重悬于1％BSA中，振摇3分钟并且在Bio-Plex工作站上读取。将结合于FGFR1c和/或β-Klotho精氨酸突变体蛋白的抗体与结合于来自相同汇集物的人FGFR1c和/或β-Klotho野生型的抗体比较。可以进行在大约5个对数标度范围内的抗体滴定。FGFR1c和/或β-Klotho精氨酸突变体蛋白质的中位数荧光强度(MFI)可以图示为最大野生型人FGFR1c和/或β-Klotho信号的百分比。这些突变体可以视为因瞬时培养物中不良表达导致珠上的蛋白质浓度太低或可能错误折叠并从分析中排出，其中对于所述突变体，来自全部抗体的信号低于截值，例如30％的野生型FGFR1c和/或β-Klotho。增加FGFR1c和/或β-KlothomAb的EC50达某个截值(例如，3倍或更大)(例如，由GraphPad
Figure BDA00001983794101761
所计算)的突变可以(即，精氨酸置换)视为不利地影响FGFR1c和/或β-Klotho mAb结合。通过这些方法，阐明了多种FGFR1c和/或β-Klotho抗体的中和性决定簇和表位。
实施例11
嵌合受体的构建
在确定与这些多样抗原结合蛋白结合的人FGFR1c和/或β-Klotho上的活化决定簇的另一个方法中，可以构建人和小鼠种类之间的特定嵌合FGFR1c和/或β-Klotho蛋白，如前述那样在瞬时或稳定的293或CHO细胞中表达并且检验。例如，可以构建嵌合FGF21受体，其包含天然的人FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4，在一个实施例中构建了与嵌合人/小鼠β-Klotho配对的FGFR1c，其中在人β-Klotho上的所选区域或序列由相应的小鼠残基系统地替换(见，例如，图2A-2C)。类似地，天然人β-Klotho与嵌合人/小鼠FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4配对，在一个实施例中，构建了其中人FGFR1c上的所选区域或序列由相应的小鼠残基系统替换的FGFR1c(见，例如，图1A-1B的比对)。基于嵌合FGF21受体，通过在前面实施例4、5、6和7中描述的结合分析或活性测量，可以推导出参与抗原结合蛋白的结合和/或活性的关键序列。
实施例11.1特定嵌合体的构建
使用实施例14中描述的方法，构建人β-Klotho嵌合体。在图29中描述所构建的嵌合体的示意图；概而言之，产生的嵌合体包含(从N端至C端)人β-Klotho序列与鼠β-Klotho序列的融合，所述的鼠β-Klotho融合物与人β-Klotho序列融合。使用人β-Klotho(SEQ IDNO：8)作为其中插入鼠β-Klotho区(全长序列在SEQ ID NO：468中显示)的框架。插入的鼠β-Klotho区如下：
鼠残基82P-520P
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFP(SEQ ID NO：470)
鼠残基506F-1043S
FPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCTICSFLVEKKPLIFFGCCFISTLAVLLSITVFHHQKRRKFQKARNLQNIPLKKGHSRVFS(SEQ ID NO：471)
鼠残基1M-193L
MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTL(SEQ ID NO：472)
鼠残基82P-302S
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRG VNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKA HSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGS(SEQ ID NO：473)
鼠残基194Y-416G
YHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLN WIKLEYDDPQILISENG(SEQ IDNO：474)
鼠残基302S-506F
SHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWI KLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGF(SEQ ID NO：475)
鼠残基416G-519P
GWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGEPLKESTPDMKGRF(SEQ ID NO：476)
鼠残基507P-632G
PLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLG(SEQ ID NO：477)
鼠残基520P-735A
PCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGA(SEQ ID NO：478)
鼠残基632G-849Q
GVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMN TAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAE
PANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQ(SEQ ID NO：479)
鼠残基735A-963S
AVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSS(SEQ IDNO：480)
鼠残基1M-81F
MKTGCAAGSPGNEWIFFS SDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTF(SEQ ID NO：481)
鼠残基82P-193L
PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTL(SEQ IDNO：482)
使用鼠β-Klotho序列所产生的嵌合体包含以下组分：
Figure BDA00001983794101781
Figure BDA00001983794101791
Figure BDA00001983794101801
产生的嵌合体包含以下氨基酸序列：
(i)huβ_Klotho(1-81，523-1044)(muβKLOTHO 82-520)MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLL SIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS(SEQ ID NO：455)
(ii)huβ_Klotho(1-507)(muβKLOTHO 506F-1045S)MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSSVLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAENRSPACGQPAEDTDCTICSFLVEKKPLIFFGCCFISTLAVLLSITVFHHQKRRKFQKARNLQNIPLKKGHSRVFS(SEQ ID NO：456)
(iii)huβ_Klotho(194-1044)(muβKLOTHO 1-L193)MKTGCAAGSPGNEWIFFSSDERNTRSRKTMSNRALQRSAVLSAFVLLRAVTGFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFEN SSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS(SEQ ID NO：457)
(iv)huβ_Klotho(1-81，303-1044)(muβKLOTHO 82P-302S)MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYLAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS(SEQ ID NO：458)
(v)huβ_Klotho(1-193，419-1044)(muβKLOTHO Y194-416G)MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSN GGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDQQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ ID NO：459)
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在L6细胞中检验本文提供的多种抗原结合蛋白以及人FGF21激活嵌合体的能力。图30使观察的结果与每一个检验的分子关联。
这些数据表明，尽管人FGF21能够激活与全部人/小鼠β-Klotho嵌合体组合的FGFR1c(“+”符号表示对受体的活性)，然而将小鼠序列替换至人β-Klotho中影响16H7、37D3和39F7的活性。见图30。这些结果表示，β-Klotho序列1-81、302-522和849-1044对于激动性抗原结合蛋白的活性是重要的并且可以代表对其功能而言重要的表位。
实施例12
蛋白酶保护分析
可以通过用特定蛋白酶(例如，AspN、Lys-C、胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶)将人FGF21受体切割成肽来鉴定被抗原结合蛋白结合的人FGF21受体区域，其中所述的抗原结合蛋白结合人FGF21受体，例如，FGFR1c、β-Klotho或FGFR1c和β-Klotho复合物。随后可以测定所得到的人FGF21受体肽(即，来自FGFR1c部分和β-Klotho部分的含二硫键和不含二硫键的肽片段)序列。在一个实施例中，人FGF21受体的可溶性形式，例如，包含本文所述的FGFR1c ECD-Fc和β-Klotho ECD-Fc异源二聚体的复合物，可以通过将0.1M磷酸钠(pH6.5)中1.0mg/ml的约100μg可溶性FGF21受体在37℃与2μgAspN孵育20小时，用AspN(其在天冬氨酸后和在氨基端处的一些谷氨酸残基处切割)消化。
AspN消化物的肽图谱随后可以在HPLC色谱上生成，而采用相似量的抗体的对照消化预期基本上抵抗AspN内切蛋白酶。可以随后进行蛋白酶保护测定法以在抗原结合蛋白存在下确定人FGF21受体的蛋白酶水解消化。这种测定法的一般原理是抗原结合蛋白与FGF21受体的结合可以导致保护某些特定蛋白酶切割位点，并且这种信息可以用来确定FGF21受体中结合抗原结合蛋白的区域或部分。
简而言之，肽消化物可以进行HPLC肽段作图：收集各个峰，并且通过在线电喷雾电离LC-MS(ESI-LC-MS)分析和/或通过N端测序法鉴定肽并作图。可以使用离线分析用窄孔反相C18柱(AgilentTechnologies)并且使用LC-MS用毛细管反相C 18柱(The SeparationGroup)，进行这些研究的HPLC分析。HPLC肽段作图可以用0.05％三氟乙酸(流动相A)至0.05％三氟乙酸中的90％乙腈的线性梯度进行。柱可以以想要的流率用窄孔HPLC(离线或在线LC-MS分析)和用毛细管HPLC(在线LC-MS分析)展开。
序列分析可以通过在线LC-MS和通过Edman测序法，对回收自HPLC的肽峰实施。可以进行肽消化物的在线ESI LC-MS分析以测定由HPLC分离的肽的精确质量和序列。因而可以确定在来自蛋白酶消化的肽峰中存在的所选择肽的身份。
实施例13
食蟹猴研究
使用实施例1-3中公开的方法，产生了编码本文中命名为16H7的抗原结合蛋白的构建体。将16H7如实施例1-5中所述那样表达、纯化和表征，并且在肥胖食蟹猴中研究。16H7是完全人IgG1抗体并且由上文表1-4中提供的序列描述。
实施例13.1
研究设计
该研究是在肥胖食蟹猴实施。猴子为8-19岁。它们的体重是7-14kg并且BMI是36-74kg/m2。猴在开始施用化合物之前适应6周。在适应时间期间，使猴子熟悉研究相关的流程，包括椅约束、皮下注射(PBS，0.1mL/kg)、管饲(水，10mL/kg)和为取得非OGTT及OGTT样品的抽血。在4周训练后，测量基线OGTT和血浆代谢参数。选择20只猴子并且随机分配至两个治疗组以实现相似的体重基线水平、葡萄糖OGTT图和血浆葡萄糖水平及甘油三酯水平。
研究以盲知方式(blinded fashion)实施。溶媒(n＝10)，16H7(n＝10)。每隔一周给予化合物(5mg/kg)。在动物不予注射16H7的那一周，它们改为接受溶媒注射。在2次注射16H7后，在额外6周期间，监测动物的化合物洗净和从治疗中恢复。在整个研究期间监测摄食量、体重、临床化学和OGTT。每次就餐时，测量摄食量。每周测量体重。在不同天收集空腹和进食状态下的血样以测量葡萄糖、胰岛素和甘油三酯水平。在开始研究后，每隔两周进行OGTT。将开始治疗日命名为0，并且详细的研究计划在图14中显示。
在这个实施例中呈现的结果代表经过68天研究所收集的数据。
实施例13.2
16H7对摄食量的影响
将动物一天两次饲喂，其中每只动物接受适应期间所建立的120g配制食物。在每次就餐后，将剩余的食物移除并且称重以计算摄食量。采食时间是从早晨8:00至早晨8:30(±30分钟)和随后下午4:30至5:00PM(±30分钟)。每天在11:30至午后12:30(±30分钟)向每只动物供应水果(150g)。
与溶媒相比，16H7减少猴中的摄食量。在治疗约21天，该效果减弱并且摄食量返回至接近于基线或对照水平。16H7对早晨摄食量没有显著影响(图15)并且在处理期间仅轻微地减少午后膳食摄食量(图16)。第49天后，观察到早晨摄食量的增加(图15)。在整个研究期间(并且甚至在适应时间期间)，与溶媒组相比，水果摄取量似乎在16H7组中降低。总体上，16H7在抑制摄食量方面显示明显效果。
实施例13.3
16H7对体重的影响
在整个研究期间每周监测体重。在4周治疗期间，用溶媒治疗的动物的体重保持恒定，而用16H7治疗的动物的体重进行性减低。截至6周洗净期结束，体重不返回至基线(图17)。
实施例13.4
16H7对身体质量指数(BMI)、腹围(AC)和皮褶厚度(SFT)的影响
在整个研究期间，当取得体重时，施用试验化合物之前和之后，每周监测BMI、AC和SFT。BMI定义为个体体重除以其身高的平方。SFT是用卡尺测量时皮肤及皮肤下脂肪的双层的厚度。BMI、SFT和AC是体成分的相对精确、简单和廉价量度，尤其指示皮下脂肪。用溶媒治疗的动物在整个研究期间显示相对稳定的BMI、SFT和AC。用16H7治疗的动物在4周研究期间显示降低的BMI、AC和SFT水平，表明16H7化合物结果导致脂肪质量的减少。结果分别在图18-20中显示。截至6周洗净期结束，这些测量的参数不返回至基线值。
实施例13.5
16H7对口服葡萄糖耐量试验(OGTT)的影响
在开始治疗之前和之后实施OGTT。在16H7注射之前，测量OGTT期间的葡萄糖水平和胰岛素水平的基线值(分别是，图21和22)并且它们在溶媒组和16H7组之间不存在统计显著差异。给药后OGTT在治疗时间期间每隔两周并且在3周洗净期后进行。在4周治疗和3周洗净期后，16H7略微改善葡萄糖耐量。所用的动物模型不是葡萄糖非耐受的，这解释了所观察到的适度效果(图21)。胰岛素水平在用16H7治疗的动物中统计显著地降低(在治疗2周后进行的OGTT期间时间0处、在治疗4周后进行的OGTT期间时间0和15分钟处观察、和在治疗2周后进行的OGTT期间时间0和60分钟处观察到显著性)(图22)。
实施例13.6
16H7对空腹和进食血糖水平和胰岛素水平的影响
血液从空腹过夜的动物或在进食情况下在下午采食后收集。在空腹情况下，每次注射后5天每周实施抽血。在进食情况下，第一次注射后在第2、11、16、25和46天实施抽血。16H7不降低空腹或进食血糖水平(图23和25)。在用16H7治疗的任何猴中没有观察到低血糖症。然而，16H7的确导致空腹和进食血浆胰岛素水平的统计显著降低(图24和26)。
实施例13.7
16H7对甘油三酯水平的影响
从收集用于葡萄糖和胰岛素测量的相同样品中取得量值。在空腹或进食条件下测量时，甘油三酯水平在用16H7治疗的动物中显著降低(图27和28)。
实施例13.8
结论
在雄性肥胖食蟹猴内实施的研究中，用16H7治疗的动物显示改善的代谢参数。体重减低并且身体组成改善。观察到的摄食量短期减低，并且在进入研究约21天时，该效果减弱并且摄食量恢复至基线或对照水平。空腹胰岛素水平和甘油三酯水平也因而16H7减低。OGTT期间测量的胰岛素水平也改善。
实施例14
抗原结合蛋白16H7和22H5的变体形式
将本文在表1-4中所述的抗原结合蛋白16H7和22H5突变以赋予分子不同的特性，如溶解性、pI、总电荷、在人和在动物模型中的免疫原性、稳定性等的变化。所述突变包括在分子的轻链(命名为“LC”，SEQ ID NO：14)或重链(命名为“HC”，SEQ ID NO：32)中的添加、缺失或置换。所公开的单点突变单独地产生，或将两个或更多个突变组合。
导入16H7重链和轻链序列的突变和突变组合的实例包括：
I83K(16H7重链中)(SEQ ID NO：396)
E16Q(16H7重链中)+V24F(16H7重链中)+I83T(16H7重链中)+S100I(16H7重链中)+T119L(16H7重链中)(SEQ ID NO：395)
D109S(16H7重链中)(SEQ ID NO：401)
缺失Y107(16H7重链中)(SEQ ID NO：400)
在Y107的N端侧插入Y残基(16H7重链中)(SEQ ID NO：405)
D88R+P89A+V90E(16H7重链中)(SEQ ID NO：398)
D49Y(16H7轻链中)(SEQ ID NO：386)
D49A(16H7轻链中)(SEQ ID NO：387)
D91A(16H7轻链中)(SEQ ID NO：388)
D49A(16H7轻链中D91A(16H7轻链中)(SEQ ID NO：389)
Q16K(16H7轻链中)(SEQ ID NO：385)
导入22H5重链和轻链序列的突变和突变组合的实例包括：
N92Q(22H5轻链中)(SEQ ID NO：402)
S94A(22H5轻链中)(SEQ ID NO：403)
C109S(22H5重链中)(SEQ ID NO：404)
类似地，产生的抗原结合蛋白包含以下的16H7重链和轻链对：
(i)与包含I83K的16H7重链(SEQ ID NO：396)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(ii)与包含E16Q、V24F、I83T、S100I、T119L的16H7重链(SEQID NO：395)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(iii)与包含D109S的16H7重链(SEQ ID NO：401)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(iv)与包含Y107缺失的16H7重链(SEQ ID NO：400)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(v)与包含在Y107的N端侧插入Y残基的16H7重链(SEQ IDNO：405)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(vi)与包含D88R、P89A、V90E的16H7重链(SEQ ID NO：398)配对的16H7轻链(SEQ ID NO：14)；
(vii)与包含D49Y的16H7轻链(SEQ ID NO：386)配对的16H7重链(SEQ ID NO：32)；
(viii)与包含D49A(LC)的16H7轻链(SEQ ID NO：387)配对的16H7重链(SEQ ID NO：32)；
(xi)与包含D91A的16H7轻链(SEQ ID NO：388)配对的16H7重链(SEQ ID NO：32)；
(ix)与包含D49A、D91A的16H7轻链(SEQ ID NO：389)配对的16H7重链(SEQ ID NO：32)；
(x)与包含Q16K(LC)的16H7轻链(SEQ ID NO：385)配对的16H7重链(SEQ ID NO：32)；
和以下的22H5重链和轻链序列对：
(xi)与包含N92Q(LC)的22H5轻链(SEQ ID NO：402)配对的22H5重链(SEQ ID NO：31)；
(xii)与包含S94A(LC)的22H5轻链(SEQ ID NO：403)配对的22H5重链(SEQ ID NO：31)；
(xiii)与包含C109S(LC)的22H5重链(SEQ ID NO：404)配对的22H5链链(SEQ ID NO：13)；
(xiv)与包含酪氨酸残基在位置107处插入的22H5重链(SEQ IDNO：405)配对的22H5链链(SEQ ID NO：13)；
在表6中显示所产生轻链变体的氨基酸序列：
表6A
16H7和22H5变体的氨基酸序列
Figure BDA00001983794101921
Figure BDA00001983794101931
Figure BDA00001983794101941
Figure BDA00001983794101951
Figure BDA00001983794101961
Figure BDA00001983794101971
Figure BDA00001983794101981
Figure BDA00001983794102001
Figure BDA00001983794102011
Figure BDA00001983794102021
Figure BDA00001983794102031
Figure BDA00001983794102041
Figure BDA00001983794102051
Figure BDA00001983794102061
Figure BDA00001983794102081
Figure BDA00001983794102091
Figure BDA00001983794102101
表6B
16H7和22H5变体的核酸序列
Figure BDA00001983794102111
Figure BDA00001983794102121
Figure BDA00001983794102131
Figure BDA00001983794102141
Figure BDA00001983794102151
Figure BDA00001983794102161
Figure BDA00001983794102171
Figure BDA00001983794102181
Figure BDA00001983794102191
Figure BDA00001983794102201
Figure BDA00001983794102211
Figure BDA00001983794102221
Figure BDA00001983794102231
Figure BDA00001983794102241
Figure BDA00001983794102251
Figure BDA00001983794102261
Figure BDA00001983794102271
表6C
变体的CDR氨基酸序列
Figure BDA00001983794102272
Figure BDA00001983794102281
表6D
变体的CDR核酸序列
Figure BDA00001983794102282
Figure BDA00001983794102291
Figure BDA00001983794102301
Figure BDA00001983794102311
Figure BDA00001983794102321
额外地，产生和研究了“半抗体”。这种结构包含与16H7重链的工程化形式配对的16H7轻链(L3；SEQ ID NO：50)；工程化的链包含经(G4S)8接头(SEQ ID NO：440)与IgG2Fc序列(SEQ ID NO：441)连接的16H7重链(SEQ ID NO：32)，所述的IgG2Fc序列与16H7重链的
Fc序列配对。半抗体的组分部分具有以下序列：
16H7重链
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLIMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO：32)
接头
GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：440)IgG2Fc
ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：441)
完整半抗体重链具有下文显示的氨基酸序列：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLIMTNMDPVDTATYYCARSVVTGGYYYDGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPFNNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：453)
其由以下序列编码：
ATGGACATGAGGGTGCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTGTGGCTGAGAGGTGCGCGCTGTCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCCTGTGCTGGTGAAACCCACAGAGACCCTCACGCTGACCTGCACCGTGTCTGGGTTCTCACTCAACAATGCTAGAATGGGTGTGAGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCCCTGGAGTGGCTTGCACACATTTTTTCGAATGACGAAAAATCCTACAGCACATCTCTGAAGAGCAGGCTCACCATCTCCAAGGACACCTCCAAAAGCCAGGTGGTCCTAATTATGACCAACATGGACCCTGTGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGGTCAGTAGTAACTGGCGGCTACTACTACGACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTAGTGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTGCAGCAGAAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTCACCGTGCCCAGCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTGGAGCGGAAGTCCAGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCCCCTCCTGTGGCCGGACCTAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGGGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAACAGTTCAACAGCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTCCTCACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCATGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCGGAGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGAAGTGGAGGGGGCGGATCTGGTGGTGGAGGCAGCGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGTGGAGGATCCGGTGGAGGCGGCTCAGGTGGCGGCGGAAGCGAGAGAAAGTCCTCCGTGGAGTGTCCACCATGCCCTGCTCCACCAGTGGCTGGCCCTTCCGTCTTTCTCTTTCCACCTAAACCTAAGGATACACTCATGATCTCCAGAACTCCAGAGGTCACATGTGTGGTCGTCGATGTCAGTCATGAGGATCCTGAAGTCCAGTTTAACTGGTATGTGGATGGCGTCGAAGTCCATAATGCTAAGACAAAACCTCGCGAAGAACAGTTTAACTCCACCTTTAGAGTCGTGAGCGTGCTGACAGTCGTCCATCAGGATTGGCTCAATGGGAAAGAATACAAATGTAAAGTCTCTAACAAAGGACTGCCCGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAAACAAAGGGGCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTCTACACACTCCCACCCTCCAGAGAAGAGATGACAAAAAATCAGGTGTCACTCACCTGTCTGGTCAAGGGGTTTTACCCCTCCGACATTGCCGTGGAATGGGAATCCAATGGGCAGCCTGAAAACAATTATAAGACTACACCTCCTATGCTCGACTCTGATGGGAGTTTCTTTCTCTACTCTAAACTCACAGTGGATAAGTCTAGATGGCAGCAGGGGAATGTCTTTTCCTGCTCCGTCATGCATGAAGCTCTCCACAATCATTATACACAGAAGTCTTTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG(SEQ ID NO：454)
实施例14.1
工程化抗体的β-Klotho结合ELISA。
使用ELISA测定法检验16H7和22H5的工程化形式的β-Klotho结合作用。ELISA的条件如下。
链霉亲和素包被的Maxisorp平板在4度与2μg/ml β-Klotho孵育过夜。将抗体以始于1μM的3倍连续稀释物添加，在室温持续1小时。HRP缀合的抗人Fc用作检测抗体。信号用Lumiglo显现并且在Envision上读取。
ELISA测定法的结果在图32A-32C中显示并且表明，大部分16H7变体与人β-Klotho结合，除了在位置107处携带酪氨酸插入的突变体之外。
实施例14.2
与天然受体结构结合的16H7和22H5的工程化变体，如由FACS 所显示
FACS结合分析用16H7和22H5的几种工程化形式进行。所述实验如下进行。
稳定表达FGF21受体的CHO细胞用亲本抗体16H7和22H5并且还用它们的工程化变体(100μl PBS/0.5％BSA中每1x106个细胞1μg)处理。将细胞在4℃与抗体孵育，随后用PBS/BSA洗涤两次。细胞随后在4℃用FITC-标记的第二抗体处理，随后洗涤两次。将细胞重悬于1ml PBS/BSA中，并且使用FACS Calibur仪分析抗体结合。
与ELISA结果一致，所检验的FGF21受体激动性抗体的大部分工程化变体在FACS中均良好地与细胞表面FGF21受体结合。这种观察结果进一步证实，FGF21受体激动性抗体的定向工程化维持与天然结构的结合。在其中将CDR3工程化以在位置Y107处包括酪氨酸的一个突变体中，观察到与细胞表面受体的结合作用完全丧失，这类似于ELISA结果。这个观察结果指出CDR3环在与天然构象结合方面的作用。
实施例14.3
16H7和22H5变体在原代人脂肪细胞中的活性
FGF21在培养的脂肪细胞中刺激葡萄糖摄入和脂分解，并且因此经常认为脂肪细胞是更有生理意义的。证实16H7和22H5的一组工程化变体在人脂肪细胞测定法中显示出与FGF21相似的Erk-磷酸化活性，估计的EC50小于10nM，如表7中所示。
表7
变体在人脂肪细胞测定法中的活性
Figure BDA00001983794102361
Figure BDA00001983794102371
实施例14.4
Biacore结合实验和脱离速率测量
使用Biacore测定法检验16H7和22H5变体与人β-Klotho的结合。简而言之，使用胺偶联试剂(General Electronics，Piscataway，NJ)，将小鼠抗His抗体(Qiagen，Valencia，CA)固定在CM5芯片上。将加His-标签的人重组β-Klotho捕获在第二流动小室上至～100RU。使用第一流动小室作为背景对照。将100nM mAb稀释于PBS加0.1mg/mlBSA，0.005％P20中，并且注射到捕获于抗His抗体表面的β-Klotho上。为动力学测量，将稀释于PBS加0.1mg/ml BSA，0.005％P20中的0.78～100nM mAb注射在β-Klotho表面上。
表8中汇总所检验的变体：
表8
结合和脱离速率实验中所研究的变体
Figure BDA00001983794102381
Figure BDA00001983794102391
在所检验的工程化mAb当中，它们中的大部分显示与人β-Klotho牢固结合，除了显示不结合的#15之外。下表9显示100nM mAb与抗His上捕获的β-Klotho结合。图33显示脱离速率的比较。
表9
与β-Klotho结合
  样品   K脱离(1/s)
  #20，P60896.3   1.9E-04
  #11，P60883.3   2.6E-04
  #23，P60899.2   3.0E-04
  22H5   3.1E-04
  #18，P60894.3   3.1E-04
  #6，P60898.3   3.5E-04
  #13，P60882.3   4.4E-04
  #7，P60897.3   5.2E-04
  #8，P60886.3   53E-04
实施例15
抗原结合蛋白的组合显示累加效应
选择代表不同结合仓(binding bin)(图11a和11b)的抗原结合蛋白并且在报道基因测定法中成对地检验以确定成对分子是否以累加方式发挥作用。测定法如下进行。
在第一天，将AM-1/D FGFR1c+3-Klotho Luc克隆以20K个细胞/孔接种在96孔平板中的DMEM+10％FBS培养基内。将平板孵育过夜。次日，将培养基更换为分析培养基(DMEM+0.2％FBS)并孵育过夜。从抗体工作原液(PBS中的1mg/mL)中，将所研究的每个抗体以2μg/ml稀释度在分析培养基中制备。将待检验的100μL每种抗体在U-底平板中合并。将分析培养基从细胞上移除，并且将50μL抗体混合物转移细胞上。将抗体混合物在细胞上孵育5小时。最后，按照制造商的说明书，用SteadyGlo萤光素酶试剂(50μl/孔)读出每种样品。
下表10是从本研究所观察到的活性的总结(来自报道基因测定法的FGF21活性％)；表11表述了相对于仓所观察到的活性。
表10
抗体组合活性(％)
Figure BDA00001983794102401
表11
成对表达的抗体组合
Figure BDA00001983794102402
Figure BDA00001983794102411
令人惊讶地，几对分子显示累加效应。分别如34和35图中所示，在实施例5的报道基因测定法中测量时，39F11和FGF21显示累加效应，如16H7和39H11那样。
总结来自这组实验的数据，观察到，来自相同结合仓的抗原结合蛋白(例如16H7)与20D4配对时(二者均来自组A)，总和的活性不累加的。当12E4与26H11配对时(二者均来自组B)，也观察这种情况。另外，来自非重叠仓的配对抗原结合蛋白显示累加活性，例如，16H7(组A)与26H11或12E4(组B)配对或与39F7(组C)配对。进一步，当来自组A但是不来自组C的Ab组合时，抗原结合蛋白26H11和12E4(组B)显示累加效应，表明在组B和组C的结合位点之间可能存在一些重叠和/或由来自组B和组C的抗原结合蛋白诱导的活化构象不是互相兼容的。最后，如预期那样，当功能性抗原结合蛋白与结合至来自组A、B或C的不同和非重叠结合位点的非功能抗原结合蛋白(例如，2G10)配对时，对于来自组A、B或C的功能抗原结合蛋白的活性不存在影响。
总体而言，这份数据表明，所公开的抗原结合蛋白可以共同施用以增强给定的抗原结合蛋白可以对其自身产生的影响。
本文引用的每份参考文献通过引用的方式整体并入用于它教导的全部内容和用于全部目的。
本发明在范围方面不受本文所述的具体实施方案限制，所述实施方案意在说明本公开的各个方面，并且功能上等同的方法和组分形成本公开的多个方面。实际上，本公开的多种修改形式，除了所显示和本文描述的那些之外，将因前文描述和附图而对本领域技术人员变得显而易见。这类修改意在落入所附权利要求的范围内。

Claims (26)

1. 一种分离的抗原结合蛋白，其诱导FGF21介导的信号传导。
2. 一种分离的抗原结合蛋白，其与以下中的至少一种特异性结合：
(i) β-Klotho；
(ii) FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；和
(iii) 包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物，其中所述抗原结合蛋白诱导FGF21介导的信号传导。
3. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含选自以下的氨基酸序列：
(a) 轻链CDR3，其包含选自以下的序列：
(i)  轻链CDR3序列，其与选自L1-L18的轻链CDR3序列SEQ ID NO:180-194中的CDR3序列相差不多于总计三个氨基酸添加、置换和/或缺失；
(ii) QVWDX1X2SDHVV(SEQ ID NO:276)；
(iii) QQX3GX4X5X6X7T(SEQ ID NO:283)；
(iv) LQHNSYPLT(SEQ ID NO:267)；
(v) MQSLQTPFT(SEQ ID NO:268)；
(vi) QQYNNWPPT(SEQ ID NO:269)；
(vii) MQSIQLPRT(SEQ ID NO:270)；
(viii) QQANDFPIT(SEQ ID NO:271)；
(ix) MQALQTPCS(SEQ ID NO:272)；
(b) 重链CDR3序列，其包含选自以下的序列：
(i) 重链CDR3序列，其与选自H1-H18的重链CDR3序列SEQ ID NO:145-157中的CDR3序列相差不多于总计四个氨基酸添加、置换和/或缺失；
(ii) X34X16X17X18GX19YYYX20GMDV(SEQ ID NO:322)；
(iii) SLIVVX21VYX22LDX23(SEQ ID NO:326)；
(iv) IVVVPAAIQSYYYYYGMGV(SEQ ID NO:311)；
(v) DPDGDYYYYGMDV(SEQ ID NO:312)；
(vi) TYSSGWYVWDYYGMDV(SEQ ID NO:313)；
(vii) DRVLSYYAMAV(SEQ ID NO:314)；
(viii) VRIAGDYYYYYGMDV(SEQ ID NO:315)；
(ix) ENIVVIPAAIFAGWFDP(SEQ ID NO:316)；和
(x) DRAAAGLHYYYGMDV(SEQ ID NO:317)；或
(c) (a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列；
其中，
X1是G、S或N；
X2是N、S或T；
X3是C、Y或S；
X4是G或S；
X5是A或S；
X6是P或F；
X7是L或不存在；
X34是I、V或S；
X16是L或V；
X17是L、T或V；
X18是L、V、G或T；
X19是A、G或不存在；
X20是Y、C或D；
X21是I或M；
X22是A或V；并且
X23是H或Y；
并且其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
4. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) 选自以下的轻链CDR1序列：
(i) 轻链CDR1，其与L1-L18的CDR1序列SEQ ID NO:158-170相差不多于三个氨基酸添加、置换和/或缺失；
(ii) RASQ X9 X10X11X12X13X14LA(SEQ ID NO:304)；
(iii) GGNNIGSX15SVH(SEQ ID NO:307)；
(iv) RSSQSLLX29X30NGX31X32X33LD(SEQ ID NO:310)；
(v) RASQSVNSNLA(SEQ ID NO:295)；
(vi) RASQDIRYDLG(SEQ ID NO:296)；
(vii) RASQGISIWLA(SEQ ID NO:297)；和
(viii) KSSQSLLQSDGKTYLY(SEQ ID NO:298)；
(b) 选自以下的轻链CDR2序列：
(i) 轻链CDR2，其与L1-L18的CDR2序列SEQ ID NO:171-179相差不多于两个氨基酸添加、置换和/或缺失；
(ii) LGSX27RAS(SEQ ID NO:290)；
(iii) GX8SX28RAT(SEQ ID NO:294)；
(iv) AASSLQS(SEQ ID NO:284)；
(v) GVSTRAT(SEQ ID NO:285)；
(vi) DDSDRPS(SEQ ID NO:286)；
(vii) EVSNRFS(SEQ ID NO:287)；
(c) 选自以下的重链CDR1序列：
(i) 重链CDR1，其与H1-H18的CDR1序列SEQ ID NO:121-131相差不多于两个氨基酸添加、置换和/或缺失；和
(ii) NARMGVX39(SEQ ID NO:352)；
(iii) X40YGIH(SEQ ID NO:355)；
(iv) DLSMH(SEQ ID NO:345)；
(v) DAWMS(SEQ ID NO:346)；
(vi) TYAMS(SEQ ID NO:347)；
(vii) SYFWS(SEQ ID NO:348)；
(viii) SYYWS(SEQ ID NO:131)；
(ix) SGGYNWS(SEQ ID NO:349)；
(d) 选自以下的重链CDR2：
(i) 重链序列，其与H1-H18的CDR2序列SEQ ID NO:132-144相差不多于三个氨基酸添加、置换和/或缺失；
(ii) HIFSNDEKSYSTSLKX24(SEQ ID NO:333)；
(iii) X25ISGSGVSTX26YADSVKG(SEQ ID NO:338)；
(iv) VIWYDGSX35KYYX36DSVKG(SEQ ID NO:341)；
(v) X37IYX38SGSTX41YNPSLKS(SEQ ID NO:344)；
(vi) GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQ ID NO:327)；
(vii) RIKSKTDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:328)；
(viii) RIYTSGSTNYNPSLKS(SEQ ID NO:329)；
(ix) RIKSKDGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:330)；
(x) RIKSKX42DGGTTDYAAPVKG(SEQ ID NO:483)；
其中
X9是N或S；
X10是V或F；
X11是D或S；
X12是G或S；
X13是S、N或T；
X14是S或Y；
X15是E或Q；
X29是Y或H；
X30是Y或S；
X31是F或Y；
X32是T或N；
X33是Y或F；
X27是N或D；
X8是A或T；
X28是S或F；
X39是S或N；
X24是S或N；
X25是G或A；
X26是H、Y或N；
X35是D或I；
X36是A或G；
X37是N或R；
X38是Y或T；
X41是Y或N；
X42是T或不存在；
(e) (a)的轻链CDR1和(b)的轻链CDR2；
(f) (a)的轻链CDR1和(c)的重链CDR1；
(g) (a)的轻链CDR1和(d)的重链CDR2；
(h) (b)的轻链CDR1和(c)的重链CDR1；
(i) (c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；
(j) (b)的轻链CDR2和(d)的重链CDR2；
(k) (a)的轻链CDR1、(b)的轻链CDR2和(c)的重链CDR1；
(l) (b)的轻链CDR2、(c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；
(m) (a)的轻链CDR1、(c)的重链CDR1和(d)的重链CDR2；或
(n) (a)的轻链CDR1、(b)的轻链CDR2、(c)的重链CDR2和(d)的重链CDR2，
其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
5. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) 包含以下序列的轻链可变域：
(i) 选自SEQ ID NO：158-170的轻链CDR1序列；
(ii) 选自SEQ ID NO：171-179的轻链CDR2序列；
(iii) 选自SEQ ID NO：180-194的轻链CDR3序列；和
(b) 包含以下序列的重链可变域：
(i) 选自SEQ ID NO：121-131的重链CDR1序列；
(ii) 选自SEQ ID NO：132-144的重链CDR2序列；和
(iii) 选自SEQ ID NO：145-157的重链CDR3序列；或
(c) (a)的轻链可变域和(b)的重链可变域，
其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
6. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) 选自以下的轻链可变域序列：
(i) 具有与选自VL1-VL18轻链可变域序列SEQ ID NO：48-65有至少80%同一性的序列的氨基酸；
(ii) 由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列与编码VL1-VL18轻链可变域序列SEQ ID NO：48-65的多核苷酸序列有至少80%同一性；
(b) 选自以下的重链可变域序列：
(i) 与VH1-VH18重链可变域序列SEQ ID NO：66-84有至少80%同一性的氨基酸序列；
(ii) 由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列与编码VH1-VH18重链可变域序列SEQ ID NO：66-84的多核苷酸序列有至少80%同一性；或
(c) (a)的轻链可变域和(b)的重链可变域；
其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
7. 根据权利要求6所述的抗原结合蛋白，包含：
(a) 选自以下的轻链可变域序列：SEQ ID NO：48-65的VL1-VL18；
(b) 选自以下的重链可变域序列：SEQ ID NO：66-84的VH1-VH18；或
(c) (a)的轻链可变域和(b)的重链可变域，
其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
8. 根据权利要求7所述的抗原结合蛋白，其中所述轻链可变域和重链可变域选自以下组合：VL1VH1、VL2VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL4VH5、VL5VH6、VL6VH7、VL7VH8、VL8VH8、VL9VH9、VL9VH10、VL10VH11、VL11VH11、VL12VH12、VL13VH13、VL14VH14、VL15VH15、VL16VH16、VL17VH17和VL18VH18，其中所述抗原结合蛋白特异性结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物。
9. 根据权利要求8所述的抗原结合蛋白，还包含：
(a) SEQ ID NO:10的轻链恒定序列；
(b) SEQ ID NO:11的轻链恒定序列；
(c) SEQ ID NO:9的重链恒定序列；或
(d) SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的轻链恒定序列和SEQ ID NO:9的重链恒定序列。
10. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合性抗体片段、单链抗体、双抗体、三链抗体、四链抗体、Fab片段、F(fab')2片段、结构域抗体、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体、IgG4抗体或在铰链区中具有至少一个突变的IgG4抗体。
11. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合时，所述抗原结合蛋白：
(a) 以基本上与参比抗体相同的Kd结合(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物；
(b) 如ELK-萤光素酶报道基因测定法中所测量，诱导大于由包含SEQ ID NO:2的成熟形式的野生型FGF21标准物所诱导的信号传导10%以上的FGF21样信号传导；
(c) 在选自以下的测定法中显示10nM或更小的FGF21样信号传导的EC50：
(i)  FGFR1c/β-Klotho介导的基于体外重组细胞的测定法；和
(ii) 体外人脂肪细胞功能测定法；
(d) 在体外重组FGFR1c受体介导的报道基因测定法中在β-Klotho存在下对FGFR1c显示小于10nM的激动活性的EC50；和
(e) 在体外重组FGFR1c受体介导的报道基因测定法中在β-Klotho不存在下对FGFR1c显示大于1μM的激动活性的EC50；或
(f) 同参比抗体竞争与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合，其中所述参比抗体包含选自VL1VH1、VL2VH2、VL3VH3、VL3VH4、VL4VH5、VL5VH6、VL6VH7、VL7VH8、VL8VH8、VL9VH9、VL9VH10、VL10VH11、VL11VH11、VL12VH12、VL13VH13、VL14VH14、VL15VH15、VL16VH16、VL17VH17和VL18VH18中的轻链可变域序列和重链可变域序列的组合。
12. 根据权利要求11所述的抗原结合蛋白，其中与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物结合时，所述抗原结合蛋白：
(a) 在动物模型中降低血糖；
(b) 在动物模型中降低血脂水平；
(c) 在动物模型中降低胰岛素水平；或
(d) (a)和(b)和(c)的两种或更多种。
13. 根据权利要求1所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含：
(a) 包含SEQ ID NO：31、32、390-401、404-405中之一的重链；
(b) 包含SEQ ID NO:13、14、385-389、402-403中之一的轻链；或
(c) 包含(a)的重链和(b)的轻链的组合。
14. 一种抗原结合蛋白，其能够结合野生型人β-Klotho (SEQ ID NO:7)但是不与β-Klotho的嵌合形式结合，其中所述β-Klotho的嵌合形式包含其中鼠β-Klotho序列在(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处替换野生型人残基的人β-Klotho框架。
15. 一种抗原结合蛋白，其能够在(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处结合野生型人β-Klotho(SEQ ID NO:7)。
16. 一种抗原结合蛋白，其能够同根据权利要求8或13所述的抗原结合蛋白竞争与(a)位置1-80、(b)位置303-522、(c)位置852-1044和(d)其组合中的至少一种位置处的人野生型β-Klotho残基结合。
17. 一种药物组合物，包含与其可药用载体掺和的根据权利要求1所述的一种或多种抗原结合蛋白。
18. 一种药物组合物，包含与其可药用载体掺和的根据权利要求11所述的一种或多种抗原结合蛋白。
19. 一种分离的核酸，其包含编码根据权利要求6所述的抗原结合蛋白的轻链可变域、重链可变域或这二者的多核苷酸序列。
20. 根据权利要求19所述的分离的核酸，其中所述序列包含：
(a) VL1-VL18(SEQ ID NO：48-65)；
(b) VH1-VH18(SEQ ID NO：66-84)；或
(c) (a)的一个或多个序列和(b)的一个或多个序列。
21. 一种表达载体，其包含根据权利要求20所述的核酸。
22. 一种分离的细胞，其包含根据权利要求21所述的核酸。
23. 一种分离的细胞，其包含根据权利要求22所述的表达载体。
24. 一种产生与(i)β-Klotho；(ii)FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c或FGFR4；或(iii)包含β-Klotho以及FGFR1c、FGFR2c、FGFR3c和FGFR4中之一的复合物特异性结合的抗原结合蛋白的方法，其包括将根据权利要求23所述的宿主细胞在允许它表达所述抗原结合蛋白的条件下孵育。
25. 一种预防或治疗需要这种治疗的受试者中的疾患的方法，其包括施用治疗有效量的根据权利要求17所述的组合物至所述受试者，其中所述疾患是可通过降低血糖、胰岛素或血脂水平治疗的。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述疾患是2型糖尿病、肥胖症、血脂异常、NASH、心血管疾病或代谢综合征。
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