BR112019016344A2 - anticorpos miméticos fgf21 e usos dos mesmos - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ß-klotho humana, e composições farmacêuticas e métodos de tratamento compreendendo as mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPOS MIMÉTICOS FGF21 E USOS DOS MESMOS. REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE [001] Este pedido reivindica o benefício ao Pedido de Patente Provisório US N^Q 62/456,609, depositado a 8 de fevereiro de 2017, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente em formato ASCII e é deste modo incorporada por referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada a 19 de janeiro de 2018, é nomeada PAT057578-WO-PCT_SL.txt e tem 80.531 bytes de tamanho.

CAMPO [003] A presente descrição refere-se a anticorpos miméticos do fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21). São também divulgados métodos para tratar distúrbios associados a FGF21, tais como obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, síndrome metabólica e outros distúrbios metabólicos e na redução da mortalidade e morbidade de pacientes graves.

ANTECEDENTES [004] A família do fator de crescimento de fibroblastos (FGF) é caracterizada por 22 ligantes geneticamente distintos, homólogos, que são agrupados em sete subfamílias. De acordo com a literatura publicada, a família de FGF consiste agora em pelo menos vinte e três membros, FGF-1 a FGF-23 (Reuss et al. (2003) Cell Tissue Res. 313:139-157).

[005] O fator de crescimento de fibroblastos 21 (FGF21) foi isolado de embriões de camundongos e está mais próximo de FGF19 e FGF23.

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Esta subfamília de FGF regula diversos processos fisiológicos incomuns aos FGFs clássicos, nomeadamente a homeostase de energia e ácidos biliares, o metabolismo de glucose e lipídeos e a homeostase da vitamina D e fosfato. Além disso, ao contrário dos FGFs clássicos, esta subfamília age de maneira endócrina (Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8). Foi descrito que FGF21 é preferencialmente expresso no fígado (Nishimura etal. (2000) Biochimicaet Biophysica Acta, 1492:203206; publicação de patente WO01/36640; e publicação de patente WO01/18172) e descrito como um tratamento para isquemia doença vascular, cicatrização de feridas e doenças associadas à perda da função das células pulmonares, dos brônquios ou alveolares e de numerosos outros distúrbios.

[006] O FGF21 foi identificado como um potente regulador metabólico. A administração sistêmica de FGF21 a roedores e macacos rhesus com obesidade induzida por dieta ou genética e diabetes exerce forte efeitos anti-hiperglicêmicos e de abaixamento de triglicerídeos, e redução de peso corporal (Coskun,T, et al. (2008) Endocrinology 149:6018-6027; Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635; Kharitonenkov, A., et al. (2007) Endocrinology 148:774-781; Xu, J, et al. (2009) Diabetes 58:250-259). O FGF21 é um polipeptídeo de 209 aminoácidos contendo uma sequência líder de 28 aminoácidos. O FGF21 humano tem cerca de 79% de identidade de aminoácidos com FGF21 de camundongo e cerca de 80% de identidade de aminoácidos com FGF21 de rato.

[007] Em mamíferos, os FGFs medeiam sua ação através de um conjunto de quatro receptores de FGF FGFR1-4 que, por sua vez, são expressos em múltiplas variantes emendadas. Cada receptor de FGF contém um domínio de tirosina quinase intracelular que é ativado com a ligação do ligando, levando a vias de sinalização a jusante envolvendo MAPKs (Erk1 /2), RAF1, AKT1 e STATs. (Kharitonenkov, A. etal. (2008)

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BioDrugs 22:37-44). Vários relatórios sugeriram que as variantes emendadas c-repórter de FGFR1-3 exibem afinidade específica para o β-klotho e poderíam atuar como receptores endógenos para o FGF21 (Kurosu et al., 2007 J. Biol. Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al.,

2007 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 104:7432-7437; Kharitonenkov et al.,

2008 J. Cell Physiol. 215, 1-7). Em células 3T3-L1 e tecido adiposo branco, o FGFR1 é de longe o receptor mais abundante, e é, portanto, muito provável que os principais receptores funcionais do FGF21 neste tecido sejam os complexos β-klotho-FGFRIc.

[008] Embora o FGF21 ative os receptores de FGF e moléculas sinalizadoras a jusante, incluindo FRS2a e quinase regulada por sinal extracelular (ERK), a interação direta de FGFRs e FGF21 não foi detectada. Além disso, várias células não adipócitas não respondem ao FGF21, embora expressem múltiplas isoformas do FGFR. Todos esses dados sugerem que um cofator deve mediar a sinalização do FGF21 através dos FGFRs. Estudos identificaram o beta-klotho (β-klotho), que é altamente expresso no fígado, adipócitos e no pâncreas, como um determinante da resposta celular ao FGF21 (Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95). O complexo β-klotho-FGFR, mas não o FGFR sozinho, liga-se ao FGF21 in vitro (Kharitonenkov, A., etal. (2008) J Cell Physiol 215, 1-7). O FGF21 liga-se ao β-klotho no complexo com FGFRIc, 2c ou 3c; mas não ao β-klotho no complexo com FGFR4 (Owen et al., 2015 Trends in Endocrinology 26: 22-29). Um mecanismo semelhante foi identificado no sistema FGF23-klotho-FGFR (Urakawa, I. etal. (2006) Nature 444, 770-4).

[009] A bioatividade de FGF21 foi primeiro identificada em um ensaio de absorção de glucose em adipócitos de camundongo 3T3-L1 (Kharitonenkov, A. et al. (2005) J Clin Invest 115, 1627-35). Subsequentemente, o FGF21 mostrou induzir a absorção de glucose independente de insulina e expressão de GLUT1. O FGF21 também

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4/201 demonstrou melhorar a hiperglicemia em uma série de modelos de roedores diabéticos. Adicionalmente, verificou-se que camundongos transgênicos que expressam FGF21 em excesso são resistentes a anomalias metabólicas induzidas por dieta, incluindo redução do peso corporal e da massa gorda, e melhorias na sensibilidade à insulina (Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37). A administração de FGF21 a primatas não humanos diabéticos (NHP) causou um declínio nos níveis plasmáticos de glucose, triglicerídeos, insulina e glucagon em jejum, e levou a melhorias significativas nos perfis de lipoproteínas, incluindo um aumento de quase 80% no colesterol HDL (Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81). Importantemente, hipoglicemia não foi observada em nenhum momento durante este estudo NHP. Outros estudos identificaram o FGF21 como um importante hormônio endócrino que ajuda a controlar a adaptação ao estado de jejum. Isso fornece um elo anteriormente ausente, a jusante do PPARa, pelo qual o fígado comunica com o resto do corpo na regulação da biologia da homeostase energética. As observações combinadas de que o FGF21 regula o tecido adiposo (lipólise), fígado (oxidação do ácido graxo e cetogênese) e cérebro (torpor) estabelecemno como um importante regulador endócrino da resposta ao jejum (Kharitonenkov, A. & Shanafelt, A.B (2008) BioDrugs 22, 37-44).

[0010] O problema com o uso do FGF21 diretamente como um bioterapêutico é que sua meia-vida é muito curta. Em camundongos, a meia-vida do FGF21 humano é de 0,5 a 1 hora e, em macacos cinomolgos, a meia-vida é de 2 a 3 horas. Além disso, quando o FGF21 de tipo selvagem é utilizado em formulações ou preparações farmacêuticas, a sua estabilidade é adversamente afetada por conservantes, por exemplo, m-cresol.

SUMÁRIO [0011] A presente descrição refere-se a anticorpos miméticos de

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FGF21, isto é, anticorpos monoclonais que se ligam ao beta-klotho (βklotho) e ativam o complexo do receptor do Fator de Crescimento Fibroblastos 21 humano (doravante, às vezes referido como FGF21) e sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, sinalização dependente do receptor de FGF21), seus fragmentos de ligação ao antígeno, e composições farmacêuticas e métodos de tratamento compreendendo os mesmos.

[0012] Em aspectos específicos, os fragmentos de ligação ao antígeno (do mimético de FGF21, anticorpos de ligação a β-klotho) da descrição podem ser moléculas com atividade e seletividade similar a FGF21, mas com adição de características terapeuticamente desejáveis, tais como a estabilidade da proteína, baixa imunogenicidade, facilidade de produção e uma meia-vida in vivo desejável.

[0013] Os anticorpos monoclonais FGF21 miméticos da presente descrição, seus fragmentos de ligação ao antígeno e composições farmacêuticas compreendendo os mesmos são úteis para o tratamento de distúrbios associados a FGF21, tais como obesidade, diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus tipo 1, pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, síndrome metabólica, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, gastroparesia e outros distúrbios metabólicos e na redução da mortalidade e morbidade de pacientes críticos.

[0014] Em aspectos particulares, anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou fragmentos de ligação ao antígeno, aqui descritos ligam-se a β-klotho, com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de menos do que ou igual a 500 pM ou 400 pM, por exemplo como

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6/201 determinado por o ensaio de ligação BIACORE™, e também podem ativar o complexo do receptor FGFR1c_p-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, por exemplo, como medida por ensaios celulares de fosforilação de quinase regulada por sinal (ERK, do inglês extracellular signal-regulated kinase) extracelular (pERK ou fosfo-ERK). Em aspectos particulares, anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou fragmentos de ligação ao antigeno, aqui descritos ligam-se a β-klotho, com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de menos do que ou igual a 300 pM ou 400 pM, por exemplo como determinado por o ensaio de ligação BIACORE™, e também podem ativar o complexo do receptor FGFR1c_p-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, por exemplo, como medida por ensaios celulares pERK.

[0015] Em aspectos particulares, os anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou fragmentos de ligação ao antigeno, aqui descritos ligam-se a β-klotho, com uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de menos do que ou igual a 100 pM ou 50 pM. Por exemplo, anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antigeno aqui descritos podem ligar-se a β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 100 pM, de menos do que ou igual a 50 pM, de menos do que ou igual a 45 pM, de menos do que ou igual a 40 pM, de menos do que ou igual a 35 pM, de menos do que ou igual a 25 pM, ou de menos do que ou igual a 15 pM. Mais especificamente, os anticorpos isolados ou fragmentos de ligação ao antigeno aqui descritos podem também ligarse a β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 10 pM, como medido por ensaio de ligação BIACORE™ ou ensaio de titulação de solução de equilíbrio (SET); e também podem ativar o complexo do receptor FGFR1cJ3-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, por exemplo, como medido por ensaios celulares pERK.

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7/201 [0016] A presente descrição refere-se a um anticorpo isolado, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho humana e de macaco cinomolgo. A presente descrição também se refere a um anticorpo isolado, ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se liga a β-Klotho e ativa o complexo do receptor de FGF21 e sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, sinalização dependente do receptor FGF21). Em aspectos particulares, um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito, não ativa complexos de receptor FGFR2cJ3-klotho, ΕΟΕΚ3ο_β-ΚΙοίίΊθ, ou FGFR4J3-klotho humanas.

[0017] A presente descrição também se refere a um anticorpo isolado, ou aos seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se liga a β-Klotho e ainda compete pela ligação com um anticorpo, tal como descrito na Tabela 1, por exemplo, anticorpo NGV005 ou NGV006. A presente descrição também se refere ainda a um anticorpo isolado, ou aos seus fragmentos de ligação ao antígeno, que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo tal como descrito na Tabela 1, por exemplo, anticorpo NGV005 ou NGV006.

[0018] Como aqui descrito, competição entre anticorpos e/ou seus fragmentos de ligação ao antígeno significa que ambos os anticorpos (ou os seus fragmentos de ligação) se ligam ao mesmo epítopo β-klotho (por exemplo, como determinado por um ensaio de ligação competitiva, por qualquer dos métodos bem conhecidos dos peritos na técnica). Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno também compete com um anticorpo β-klotho ou fragmento de ligação ao antígeno, da presente descrição (por exemplo, NGV005 ou NGV006), se o referido anticorpo competidor ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao mesmo epítopo de β-klotho, ou um epítopo sobreposto de β-klotho, como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição. Como aqui utilizado, um anticorpo competidor ou seu

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8/201 fragmento de ligação ao antígeno pode também incluir um que (i) bloqueia estericamente um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição da ligação ao seu alvo (por exemplo, se o referido anticorpo competidor se liga a um epítopo vizinho próximo, não sobreposto de β-Klotho e/ou epítopo β-klotho e evita fisicamente um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição de se ligar ao seu alvo); e/ou (ii) se liga a um epítopo não sobreposto de β-klotho diferente e induz uma alteração conformacional na proteína β-klotho de modo que a dita proteína não possa mais ser ligada por um anticorpo de β-klotho ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição, de uma maneira que ocorrería na ausência da referida mudança conformacional.

[0019] A afinidade de ligação de anticorpos isolados e seus fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos pode ser determinada por titulação de solução de equilíbrio (SET). Os métodos para SET são conhecidos na técnica e são descritos em maior detalhe abaixo. Alternativamente, a afinidade de ligação dos anticorpos isolados, ou fragmentos, aqui descritos pode ser determinada por ensaio Biacore. Os métodos para ensaios cinéticos Biacore são conhecidos na técnica e são descritos em maior detalhe abaixo.

[0020] Os anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser utilizados para aumentar a ativação do complexo receptor de FGF21 e, desse modo, a via de sinalização de FGF21. Em um aspecto particular, anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser utilizados para aumentar a ativação do complexo receptor de FGF21 e, desse modo, a via de sinalização de FGF21, por pelo menos cerca de 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%.

[0021] Os anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou seus

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9/201 fragmentos de ligação ao antígeno, como aqui descritos, podem ser anticorpos monoclonais, anticorpos humanos ou humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')2 ou fragmentos scFv e/ou isotipos de IgG (por exemplo, IgG 1, lgG2 ou lgG4).

[0022] Os anticorpos miméticos de FGF21 isolados, ou os seus fragmentos de ligação ao antígeno, como aqui descritos, podem também incluir uma estrutura principal na qual um aminoácido foi substituído na estrutura principal de anticorpo das respectivas sequências da linha germinativa VH ou VL humana.

[0023] Outro aspecto da presente descrição inclui um anticorpo isolado ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, tendo as sequências de cadeia pesada e leve completas de Fabs descritas na Tabela 1, por exemplo, anticorpo NOV005 ou NOV006. Mais especificamente, o anticorpo isolado ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ter as sequências de cadeia pesada e leve de Fab NOV005 ou NOV006.

[0024] Um outro aspecto da presente descrição inclui um anticorpo isolado ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, compreendendo as sequências de domínio variável de cadeia pesada e leve de Fabs descritos na Tabela 1, por exemplo NOV005 ou NOV006. Mais especificamente, o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende a sequência de domínio variável de cadeia pesada e leve do Fab NOV005 ou NOV006.

[0025] A presente descrição também se relaciona com composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um anticorpo isolado, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, aqui descritos (por exemplo, NOV005 ou NOV006), assim como, composições de anticorpos em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável. Especificamente, a

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10/201 presente descrição inclui ainda composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo ou fragmentos de ligação a antigeno da Tabela 1, tais como, por exemplo, anticorpo NOV005 ou NOV006. A presente descrição também se refere a composições farmacêuticas compreendendo uma combinação de dois ou mais dos anticorpos isolados ou seus fragmentos de ligação a antigeno da Tabela 1, por exemplo, anticorpo NOV005 ou NOV006.

[0026] A presente descrição também se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a região variável de cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. Em aspectos particulares, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência que tem, pelo menos, 90% de identidade de sequência com uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 16, 36 ou 38. Em um outro aspecto da presente descrição, uma molécula de ácido nucleico aqui fornecida compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16, 36 ou 38.

[0027] A presente descrição também se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32. Em aspectos particulares, a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com uma sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 27, 54, 33 ou 40. Em um outro aspecto da presente descrição, uma molécula de ácido nucleico aqui fornecida compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27, 54, 33 ou 40.

[0028] A presente descrição também se refere a um vetor que inclui uma ou mais das moléculas de ácido nucleico aqui descritas. Em aspectos específicos, um primeiro vetor codifica uma região variável de

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11/201 cadeia pesada ou de cadeia pesada de um anticorpo aqui fornecido, tal como NOV005 ou NOV006, um segundo vetor codifica uma região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada de um anticorpo aqui fornecido, tal como NOV005 ou NOV006. O primeiro vetor e o segundo vetor são transduzidos em uma célula hospedeira para coexpressão para formar anticorpos compreendendo essas cadeias pesadas e essas cadeias leves.

[0029] A presente descrição também se refere a uma célula hospedeira isolada que inclui uma sequência de DNA recombinante que codifica uma cadeia pesada do anticorpo descrito acima, e uma segunda sequência de DNA recombinante que codifica uma cadeia leve do anticorpo descrito acima, em que as referidas sequências de DNA estão ligadas de maneira funcional a um promotor e são capazes de serem expressas na célula hospedeira. Está contemplado que o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal humano. Está também contemplado que a célula hospedeira é uma célula de mamífero não humana, por exemplo, uma célula CHO ou uma célula HEK293.

[0030] A presente descrição também se relaciona com a ativação de um receptor do Fator de Crescimento de Fibroblastos 21 (FGF21), e, desse modo, a sinalização mediada pelo FGF21 (por exemplo, sinalização dependente do receptor de FGF21), em que o método inclui o passo de colocar em contato uma célula com uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmentos de ligação ao antígeno aqui descritos.

[0031 ] Em um aspecto particular, é contemplado que a célula é uma célula humana. É ainda contemplado que a célula está em um indivíduo. Em uma modalidade, é contemplado que a célula é um adipócito. Noutras modalidades, a célula pode ser um ou mais de hepatócitos, células pancreáticas, células endoteliais, células musculares ou renais. Em aspectos específicos, ainda é contemplado que o indivíduo é

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12/201 humano.

[0032] A presente descrição também se refere a um método para o tratamento, controle, melhoria, ou prevenção de um distúrbio associado a FGF21 em um indivíduo, em que o método inclui o passo de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo o anticorpo ou seus fragmentos de ligação do antígeno, aqui descritos (por exemplo, NOV005 ou NOV006). Em um aspecto, o distúrbio associado ao FGF21 é a obesidade. Em um aspecto, o distúrbio associado ao FGF21 é o diabetes tipo 2. Está contemplado que o indivíduo é humano.

[0033] Qualquer um dos anticorpos precedentes isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser um anticorpo monoclonal ou seus fragmentos de ligação ao antígeno.

[0034] As modalidades não limitativas da descrição são descritas nos seguintes aspectos:

[0035] 1. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

[0036] uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

[0037] uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

[0038] uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

[0039] uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 31,22 ou 25;

[0040] uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e [0041] uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

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13/201 [0042] 2. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

[0043] uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

[0044] uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

[0045] uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 [0046] ou 14;

[0047] uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31,22 ou 25;

[0048] uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e [0049] uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

[0050] 3. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

[0051] uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

[0052] uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

[0053] uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

[0054] uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 31,22 ou 25;

[0055] uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e [0056] uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a

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14/201 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

[0057] 4. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

[0058] (i) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

[0059] (ii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

[0060] (iii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; ou [0061] (iv) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a

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15/201 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0062] 5. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

[0063] (i) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

[0064] (ii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

[0065] (iii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

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16/201

22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; ou [0066] (iv) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0067] 6. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0068] 7. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a

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17/201 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0069] 8. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0070] 9. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com o aspecto 1, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[0071] 10. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-9, em que o referido anticorpo ou fragmento aumenta a atividade de β-klotho e FGFRIc.

[0072] 11.0 anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-9, que se liga a uma proteína β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 450 pM, como medida pelo ensaio de ligação de BIACORE™.

[0073] 12. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-9, em que o referido epítopo

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18/201 compreende, ou consiste essencialmente em, (i) um ou mais aminoácidos de resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52); ou (ii) um, dois, três, quatro, cinco, ou mais resíduos de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[0074] 13. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-9, em que o referido epítopo compreende, ou consiste essencialmente em, (i) um ou mais aminoácidos de resíduos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52); ou (ii) um, dois, três, quatro, cinco, ou mais resíduos de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[0075] 14. O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-13, que é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[0076] 15. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigeno, de qualquer um dos aspectos 1-14, em que o referido anticorpo ou fragmento não entra em contato com os resíduos 701 (Tyr) ou 703 (Arg) de β-klotho humana (SEQ ID NO: 52).

[0077] 16. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antigeno, de qualquer um dos aspectos 1-15, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% ou 95% de identidade dos mesmos; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 32 ou uma sequência

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19/201 de aminoácidos com pelo menos 90% ou 95% de identidade dos mesmos.

[0078] 17. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de qualquer um dos aspectos 1-16, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

[0079] 18. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de qualquer um dos aspectos 1-17, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.

[0080] 19. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, do aspecto 17, em que o anticorpo ou fragmento compreende (i) uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou (ii) uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[0081 ] 20. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de qualquer um dos aspectos 1-19, em que o anticorpo compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[0082] 21. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo isolado ou fragmento, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-20, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não compreende (i) CDRs combinadas ou de Kabat do anticorpo

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NOV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.

[0083] 22. Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo ou fragmento compete pela ligação a βklotho com um anticorpo isolado ou fragmento, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-20, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não compreende (i) CDRs combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57. [0084] 23. O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de qualquer um dos aspectos 1-20, em que o anticorpo ou fragmento não compreende (i) CDRs Combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) um domínio variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.

[0085] 24. Uma composição farmacêutica, compreendendo um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de um dos aspectos acima, e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0086] 25. Um método de tratamento de um distúrbio metabólico, compreendendo a administração, a um indivíduo afetado por um distúrbio metabólico, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23.

[0087] 26. O método do aspecto 25, em que o indivíduo é afetado por um ou mais de obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2,

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21/201 pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, hipertrigliceridemia e síndrome metabólica.

[0088] 27. O método do aspecto 25, em que o indivíduo é afetado por um ou mais de obesidade, diabetes e dislipidemia.

[0089] 28. Um método de tratamento de um distúrbio cardiovascular, compreendendo a administração, a um indivíduo afetado por um distúrbio cardiovascular, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores.

[0090] 29. O método do aspecto 28, em que o indivíduo é afetado por um ou mais de aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca e doença cardíaca coronária.

[0091] 30. Um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23, para utilização como um medicamento.

[0092] 31. Um método de redução do peso corporal, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23.

[0093] 32. Um método de redução do apetite ou da ingestão de alimentos, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23.

[0094] 33. Um método para reduzir as concentrações plasmáticas de triglicerídeos (TG) ou as concentrações plasmáticas de colesterol total (CT) em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma

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22/201 composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1 -23. [0095] 34. O método dos aspectos 31,32, ou 33, em que o indivíduo é afetado por um distúrbio metabólico.

[0096] 35. O método do aspecto 34, em que o indivíduo é afetado por um ou mais dos seguintes: obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia e síndrome metabólica.

[0097] 36. Um ácido nucleico que codifica um ou mais dos anticorpos, de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, ou uma VL e/ou VH de qualquer um dos anticorpos.

[0098] 37. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência com pelo menos 90% de identidade com as sequências estabelecidas na Tabela 1.

[0099] 38. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência com pelo menos 95% de identidade com as sequências estabelecidas na Tabela 1.

[00100] 39. Um ácido nucleico compreendendo uma sequência estabelecida na Tabela 1.

[00101] 40. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com os aspectos 36, 37, 38, ou 39.

[00102] 41. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor do aspecto 40.

[00103] 42. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23, para uso no tratamento de um distúrbio metabólico.

[00104] 43. Um método de preparação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho,

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23/201 compreendendo o passo de cultura da célula hospedeira, do aspecto 41, sob afeções adequadas para a expressão do anticorpo ou seu fragmento.

[00105] 44. A composição farmacêutica do aspecto 42, em que o distúrbio metabólico é a obesidade, diabetes, hipertrigliceridemia ou dislipidemia.

[00106] 45. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23, para uso no tratamento de um distúrbio cardiovascular.

[00107] 46. Uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23, para utilização em um método de redução do peso corporal, de um método de redução do apetite ou da ingestão de alimento, um método para reduzir concentrações de triglicerídeos no plasma (TG) ou concentrações plasmáticas de colesterol total (CT) em um indivíduo.

[00108] 47. Uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer um dos aspectos 1-23, na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico, para o tratamento de um distúrbio cardiovascular, para reduzir o peso corporal, para a redução do apetite ou a ingestão de alimentos, para redução das concentrações plasmáticas de TG ou concentrações plasmáticas de CT em um indivíduo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [00109] Figura 1: ativação de pERK de células FGFR1c_pklotho_HEK293 humanas (Fig. 1 A) e de macaco cinomolgo (Fig. 1B) por NOV004, NOV005 e NOV006. Os dados de ativação de pERK indicam que (i) o NOV004 ativou o complexo receptor FGFR1c_p-klotho humana e de macaco cinomolgo com EC50 de cerca de 3 nM e 20 nM,

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24/201 respectivamente; (ii) o NOV005 ativou o complexo receptor FGFR1c_pklotho humana e de macaco cinomolgo com EC50 de cerca de 3 nM e 16 nM, respectivamente; e (iii) 0 NOV006 ativou 0 complexo receptor FGFR1c_p-klotho humana e de macaco cinomolgo com EC50 de cerca de 4 nM e 18 nM, respectivamente.

[00110] Figura 2: Perfil de NOV004, NOV005 e NOV006 para ativação de pERK de células HEK293 humanas FGFR2c_p-klotho (Fig. 2A), FGFR3c_p-klotho (Fig. 2B) e FGFR4J3-klotho (Fig. 2C). FGF21 foi utilizado como um controle positivo para ativação de FGFR2c_p-klotho ou FGFR3c_p-klotho. FGF19 foi utilizado como um controle positivo para ativação do FGFR4_p-klotho.

[00111] Figura 3: Perfil de NOV004, NOV005 e NOV006 para atividade de FGF23 usando células HEK293 transfetadas com a-klotho, Egr1-luciferase e Renilla luciferase. FGF23 foi usado como controle positivo.

[00112] Figura 4: Atividade de ligação competitiva de NOV005 e NGV006 contra NGV004 para β-klotho humana. O sistema Forte Bio® Biosensor foi utilizado para determinar a atividade de ligação competitiva a β-klotho humana. No passo 1, β-klotho humana recombinante foi carregada no sensor, seguido de carregamento de NOV004 até à saturação no passo 2. Então NOV005 ou NOV006 foram carregados e atividade de ligação competitiva contra NOV004 foi detectada. A ausência de um segundo sinal de ligação indica que os anticorpos competem pela ligação à β-klotho humana. Um anticorpo não relacionado foi usado como um controle negativo, e 0 NOV004 foi usado como um controle positivo para a auto-competição.

[00113] Figura 5: Perfis de concentração-tempo de NOV004, NOV005 e NOV006 após injeção IV em ratos. Os animais exibiram uma Cmax média de aproximadamente 200 pg/mL 1 h após administração IV de NOV004 (Fig. 5A), NOV005 (Fig. 5B) ou NOV006 (Fig. 5C), com

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25/201 todos os três anticorpos mostrando perfis PK comparáveis.

[00114] Figura 6A: Duas doses subcutâneas de 1 mg/kg de NOV005 (n = 5 animais) ou veículo (n = 3 animais) foram administradas a macacos cinomolgos obesos normoglicémicos machos com uma semana de intervalo (dias de dosagem indicados por setas). Os dados de consumo de alimento para ração padrão foram normalizados como uma percentagem da linha de base com média de grupo ± SEM. Macacos consumiram frutas, legumes e amendoins como guloseimas durante todo o estudo.

[00115] Figura 6B: Duas doses subcutâneas de 1 mg/kg de NOV005 (n = 5 animais) ou veículo (n = 3 animais) foram administradas a macacos cinomolgos obesos normoglicémicos machos com uma semana de intervalo (dias de dosagem indicados por setas). Os pesos corporais da linha de base para NOV005 e animais tratados com veículo foram 11,3 + 1,2 e 11,4 + 1,3 kg, respectivamente. Os dados de peso corporal foram normalizados como uma percentagem da linha de base com a média do grupo (A) ± SEM e (B) dados de animais individuais apresentados.

DESCRIÇÃO DETALHADA [00116] A presente descrição baseia-se, em parte, na descoberta de moléculas de anticorpo que se ligam especificamente a β-klotho e levam à ativação de receptores FGF, por exemplo, FGFRIc, e à ativação de sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, sinalização dependente de receptor FGF21). A presente descrição refere-se a ambos os anticorpos completos formato IgG, bem como aos seus fragmentos de ligação ao antigeno, tais como fragmentos Fab (por exemplo, anticorpos NGV005 ou NGV006).

[00117] Por conseguinte, a presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo), composições farmacêuticas, métodos de

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26/201 produção, e métodos de utilização de tais anticorpos e composições. TERMINOLOGIA [00118] A menos que definidos de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que é habitualmente entendido pelo perito na técnica à qual pertence a presente descrição.

[00119] Tal como aqui utilizado, o termo FGF21 refere-se a um membro da família de proteínas do fator de crescimento de fibroblastos (FGF). Uma sequência de aminoácidos exemplificativa de FGF21 (N^Q de Acesso GenBank NP_061986.1) é apresentada como SEQ ID NO:1, a sequência de polinucleotídeos correspondente da qual é apresentada como SEQ ID NO:2 (referência NCBI número de sequência NM_019113.2).

[00120] Como aqui utilizado, o termo receptor de FGF21 refere-se a um receptor para FGF21 (Kharitonenkov,A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu,H, et al. (2007) JBC 282:2668726695; Ogawa, Y, etal. (2007) PNAS 104:7432-7437).

[00121] O termo polipeptídeo FGF21 refere-se a um polipeptídeo de ocorrência natural expresso em humanos. Para os fins desta descrição, o termo polipeptídeo FGF21 pode ser utilizado indistintamente para referir qualquer polipeptídeo FGF21 de tamanho completo, por exemplo, SEQ ID NO:1, que consiste em 209 resíduos de aminoácidos e que é codificado pela sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:2; qualquer forma madura do polipeptídeo, que consiste em 181 resíduos de aminoácidos, e na qual os 28 resíduos de aminoácidos na extremidade do terminal amino do polipeptídeo FGF21 de tamanho completo (isto é, que constituem o péptido sinal) foram removidos e suas variantes.

[00122] O termo anticorpo, tal como aqui utilizado, significa um anticorpo completo e qualquer fragmento de ligação ao antigeno (isto é,

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27/201 porção de ligação ao antígeno) ou cadeia única deste. Um anticorpo completo é uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfureto. Cada cadeia pesada é compreendida por uma região variável de cadeia pesada (abreviada no presente documento como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compreendida por três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida por uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente documento como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida por um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que estão mais conservadas, denominadas regiões de estrutura principal (FR). Cada VH e VL é composta por três CDR e quatro FR, dispostas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves podem conter um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema complementar clássico.

[00123] O termo porção de ligação ao antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, como aqui utilizado, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um dado antígeno (por exemplo, β-klotho). As funções de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo porção de ligação ao

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28/201 antígeno ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH1; um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfureto na região de dobradiça; um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al, 1989, Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH ou um domínio VL; e uma região determinante de complementaridade isolada (CDR).

[00124] Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, os mesmos podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante peptídico sintético que permite que sejam preparados como uma cadeia única de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); ver, por exemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; e Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única incluem uma ou mais porções de ligação ao antígeno ou fragmentos de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dos peritos na técnica, e os fragmentos são rastreados quanto à utilidade do mesmo modo que o são anticorpos intactos.

[00125] Fragmentos de ligação a antígenos também podem ser incorporados em anticorpos de domínio único, maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv (ver, por exemplo, Hollinger e Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Porções de ligação ao antígeno de anticorpos podem ser enxertadas em moldes baseados em polipeptídeos tal como uma Fibronectina tipo III (Fn3) (ver Patente US N^Q 6,703,199, que descreve

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29/201 monocorpos polipeptídicos de fibronectina).

[00126] Fragmentos de ligação ao antígeno podem ser incorporados em moléculas de cadeia única que compreendem um par de segmentos de Fv em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062; e Patente US N^Q 5,641,870).

[00127] O termo afinidade, conforme aqui usado, refere-se à força de interação entre anticorpo e antígeno em sítios antigênicos únicos. Dentro de cada sítio antigênico, a região variável do braço de anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com antígeno em diversos sítios; quanto mais interações, mais forte a afinidade. Como aqui utilizado, o termo afinidade elevada para um anticorpo ou seus fragmentos de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab) refere-se geralmente a um anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, com uma KD de 10’⁹ M ou inferior.

[00128] O termo aminoácido se refere a aminoácidos de ocorrência natural e sintéticos, assim como análogos de aminoácido e miméticos de aminoácido que funcionam de uma maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelo código genético, assim como aqueles aminoácidos que são posteriormente modificados, por exemplo, hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato e O-fosfosserina. Análogos de aminoácido se referem a compostos que têm a mesma estrutura química básica como um aminoácido de ocorrência natural, isto é, um carbono alfa que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo, homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos têm grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou cadeias principais peptídicas modificadas, mas mantêm a mesma estrutura química básica

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30/201 como um aminoácido de ocorrência natural. Miméticos de aminoácido se referem a compostos químicos que têm uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido de ocorrência natural.

[00129] O termo especificidade de ligação, como aqui utilizado, refere-se à capacidade de um sítio de combinação de anticorpo individual reagir com apenas um determinante antigênico.

[00130] A frase especificamente (ou seletivamente) se liga a um anticorpo (por exemplo, um anticorpo de ligação-p-klotho) refere-se a uma reação de ligação que é determinante da presença de um antigeno cognato (por exemplo, β-klotho humana ou β-klotho de cinomolgo) em uma população heterogênea de proteínas e outros biológicos. As frases um anticorpo que reconhece um antigeno e um anticorpo específico para um antigeno são aqui utilizadas indistintamente com o termo um anticorpo que se liga especificamente a um antigeno.

[00131] O termo mediado por FGF21 ou similar refere-se ao facto de o receptor FGF21 e/ou os anticorpos da presente descrição mediarem a resposta celular e a via de sinalização de FGF21 após ligação a β-klotho, desencadeando assim uma variedade de efeitos fisiológicos incluindo, mas não limitado a uma redução de um ou mais dos seguintes: triglicerídeos plasmáticos, insulina plasmática, glucose plasmática, ingestão de alimentos e peso corporal.

[00132] Um distúrbio associado a FGF21, afeção associada a FGF21, doença ou afeção associada a FGF21, ou termos semelhantes, como aqui utilizados, referem-se a qualquer número de afeções ou doenças para as quais a prevenção, diagnóstico, e/ou tratamento por ativação da via de sinalização de FGF21 (por exemplo, por ativação da sinalização do receptor de FGF21), é procurado. Estes podem incluir afeções, doenças ou distúrbios caracterizados por uma sinalização de FGF21 aberrante (por exemplo, ativação aberrante de

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31/201 sinalização mediada por FGF21 e/ou a sinalização do receptor de FGF21). Essas afeções incluem, mas não estão limitadas a, distúrbios metabólicos, endócrinos e cardiovasculares, como obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, síndrome metabólica, infarto agudo do miocárdio, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, gastroparesia, distúrbios associados a mutações de inativação graves no receptor de insulina e outros distúrbios metabólicos e na redução da mortalidade e morbidade de pacientes gravemente doentes.

[00133] Diabetes mellitus tipo 2 é uma afeção caracterizada pelo excesso de produção de glucose, apesar da disponibilidade de insulina, e os níveis circulantes de glucose permanecem excessivamente altos, como um resultado de uma depuração inadequada da glucose.

[00134] Diabetes mellitus tipo 1 é uma afeção caracterizada por níveis elevados de glucose no sangue causados pela carência total de insulina. Isso ocorre quando o sistema imunológico do corpo ataca as células beta produtoras de insulina no pâncreas e as destrói. O pâncreas então produz pouca ou nenhuma insulina.

[00135] Pancreatite é uma inflamação do pâncreas.

[00136] Dislipidemia é um distúrbio do metabolismo das lipoproteínas, incluindo superprodução ou deficiência de lipoproteínas. As dislipidemias podem manifestar-se pela elevação das concentrações de colesterol total, colesterol da lipoproteína de baixa densidade (LDL) e triglicerídeos, e uma diminuição na concentração de colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue.

[00137] Esteato-hepatite não alcoólica (NASH) é uma doença

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32/201 hepática, não associada ao consumo de álcool, caracterizada por alteração gordurosa dos hepatócitos, acompanhada de inflamação intralobular e fibrose.

[00138] Intolerância à Glucose, ou Anomalia da Tolerância à Glucose (AGT), é um estado pré-diabético de disglicemia que está associado ao aumento do risco de patologia cardiovascular. A afeção pré-diabética impede que um indivíduo mova a glucose para dentro das células de maneira eficiente e a utilize como fonte eficiente de combustível, levando a níveis elevados de glucose no sangue e um certo grau de resistência à insulina.

[00139] Hiperglicemia é definida como um excesso de açúcar (glucose) no sangue.

[00140] Hipoglicemia, também chamada de baixo nível de açúcar no sangue, ocorre quando o seu nível de glucose no sangue cai muito para fornecer energia suficiente para as atividades do seu corpo.

[00141] Hiperinsulinemia é definida como um nível de insulina maior que o normal no sangue.

[00142] Resistência à insulina é definida como um estado em que uma quantidade normal de insulina produz uma resposta biológica subnormal.

[00143] Obesidade, em termos do indivíduo humano, pode ser definida como aquele peso corporal acima de 20 por cento acima do peso corporal ideal para uma dada população (R.H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p. 904-916). Também pode ser definido como um índice de Massa Corporal (IMC, definido como o peso da pessoa em quilogramas dividido pelo quadrado da sua altura em metros (kg/m2)) como maior ou igual a 30.

[00144] Síndrome metabólica pode ser definida como um agrupamento de pelo menos três dos seguintes sinais: gordura abdominal - na maioria dos homens, uma cintura de 40 polegadas ou

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33/201 maior; açúcar elevado no sangue - pelo menos 110 miligramas por decilitro (mg/dL) após o jejum; triglicerídeos elevados - pelo menos 150 mg/dL na corrente sanguínea; HDL baixo - menos do que 40 mg/dL; e pressão arterial de 130/85 mmHg ou mais.

[00145] Hipertensão ou pressão alta que é uma elevação transitória ou sustentada da pressão arterial sistêmica a um nível provável de induzir danos cardiovasculares ou outras consequências adversas. Hipertensão tem sido arbitrariamente definida como uma pressão arterial sistólica acima de 140 mmHg ou uma pressão arterial diastólica acima de 90 mmHg.

[00146] Doenças cardiovasculares são doenças relacionadas com o coração ou vasos sanguíneos.

[00147] Doença arterial periférica ocorre quando a placa se acumula nas artérias que levam o sangue para a cabeça, órgãos e membros. Com o tempo, a placa pode endurecer e estreitar as artérias, o que limita o fluxo de sangue rico em oxigênio para órgãos e outras partes do corpo.

[00148] Aterosclerose é uma doença vascular caracterizada por depósitos lipídicos distribuídos irregularmente na íntima das artérias de grande e médio calibre, causando estreitamento dos lúmens arteriais e eventualmente levando à fibrose e calcificação. As lesões geralmente são focais e progridem de forma lenta e intermitente. A limitação do fluxo sanguíneo é responsável pela maioria das manifestações clínicas, que variam com a distribuição e gravidade das lesões.

[00149] Acidente vascular cerebral é qualquer evento clínico agudo relacionado ao comprometimento da circulação cerebral, que dura mais de 24 horas. Um acidente vascular cerebral envolve danos cerebrais irreversíveis, o tipo e gravidade dos sintomas, dependendo da localização e extensão do tecido cerebral cuja circulação foi comprometida.

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34/201 [00150] Insuficiência cardíaca, também chamada de insuficiência cardíaca congestiva, é uma afeção na qual o coração não consegue mais bombear sangue suficiente para o resto do corpo.

[00151] Doença cardíaca coronária, também chamada de doença arterial coronariana, é um estreitamento dos pequenos vasos sanguíneos que fornecem sangue e oxigênio para o coração.

[00152] Doença renal ou nefropatia é qualquer doença do rim. A nefropatia diabética é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em pessoas com diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2.

[00153] Complicações diabéticas são problemas, causados por níveis elevados de glucose no sangue, com outras funções do corpo, como rins, nervos (neuropatias), pés (úlceras do pé e má circulação) e olhos (por exemplo, retinopatias). Diabetes também aumentam o risco de doenças cardíacas e distúrbios ósseos e articulares. Outras complicações a longo prazo da diabetes incluem problemas de pele, problemas digestivos, disfunção sexual e problemas com dentes e gengivas.

[00154] Neuroapatias são quaisquer doenças envolvendo os nervos cranianos ou o sistema nervoso periférico ou autônomo.

[00155] Gastroparesia é a fraqueza do peristaltismo gástrico, que resulta no retardamento do esvaziamento dos intestinos.

[00156] Os pacientes gravemente doentes abrangidos pela presente descrição geralmente sofrem de um estado hipermetabólico instável. Este estado metabólico instável é devido a alterações no metabolismo do substrato, o que pode levar a deficiências relativas em alguns nutrientes. Geralmente, há um aumento da oxidação da gordura e do músculo.

[00157] Além disso, pacientes gravemente doentes são preferencialmente pacientes que sofrem de síndrome de resposta inflamatória sistêmica ou desconforto respiratório. Uma redução na

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35/201 morbidade significa reduzir a probabilidade de um paciente gravemente doente desenvolver doenças, afeções ou sintomas adicionais ou reduzir a gravidade de outras doenças, afeções ou sintomas adicionais. Por exemplo, reduzir a morbidade pode corresponder a uma diminuição na incidência de bacteremia ou sepse ou complicações associadas à falência múltipla de órgãos.

[00158] O termo variante conservativamente modificado se aplica a sequências tanto de aminoácidos quanto de ácidos nucleicos. Em relação a sequências de ácidos nucleicos particulares, variantes conservativamente modificadas se referem àqueles ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas ou em que o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos em sequências essencialmente idênticas. Devido à degenerescência do código genético, um número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Desse modo, em cada posição em que uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações de ácido nucleico são variações silenciosas, que são uma espécie de variações conservativamente modificadas. Cada sequência de ácidos nucleicos no presente documento que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. O perito na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que é comumente o único códon para metionina, e TGG, que é comumente o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.

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36/201 [00159] Para sequências de polipeptídeos, variantes conservativamente modificadas incluem substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de polipeptídeos que resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. Tais variantes modificadas de forma conservativa são adições a, e não excluem, variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da presente descrição. Os oito grupos seguintes contêm aminoácidos que são substituições conservativas uns dos outros: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M) (ver, por exemplo, Creighton, Proteins (1984)). Em algumas modalidades, a expressão modificações de sequências conservativas é usada para se referir a modificações de aminoácidos que não afetam nem alteram significativamente as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos.

[00160] O termo epítopo significa um determinante proteico capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos consistem usualmente em agrupamentos superficiais ativos quimicamente de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm usualmente características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de a ligação ao primeiro, mas não ao último ser perdida na presença de solventes desnaturantes. [00161] O termo anticorpo humano, conforme usado no presente documento, pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura principal quanto CDR são derivadas

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37/201 de sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, sequências da linha germinativa humana ou versões mutadas de sequências da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente descrição podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências humanas (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro, ou por mutação somática in vivo).

[00162] O termo anticorpo monoclonal humano refere-se a anticorpos que exibem uma única especificidade de ligação que têm regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura principal quanto de CDR são derivadas de sequências humanas. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[00163] Um anticorpo humanizado é um anticorpo que retém a reatividade de um anticorpo não humano enquanto é menos imunogênico em humanos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, retendo as regiões de CDRs não humanas e substituindo as restantes partes do anticorpo pelas suas contrapartes humanas (isto é, a região constante bem como as porções de estrutura principal da região variável). Ver, por exemplo, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 81:6851-6855, 1984; Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498,1991; e Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Outros exemplos de tecnologia de manipulação humana incluem, mas não estão limitados à tecnologia Xoma divulgada em US 5,766,886.

[00164] Os termos idêntico ou identidade percentual, no contexto

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38/201 de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. Duas sequências são substancialmente idênticas se duas sequências tiverem uma percentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (isto é, com 60% de identidade, opcional mente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% de identidade ao longo de uma região especificada, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada, medidas usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por alinhamento manual e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade existe ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 nucleotídeos (ou 10 aminoácidos) de comprimento, ou mais preferencialmente ao longo de uma região que tem 100 até 500 ou 1000 ou mais nucleotídeos (ou 20, 50, 200 ou mais aminoácidos) de comprimento.

[00165] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, são designadas coordenadas de subsequências, se necessário, e são designados parâmetros do programa de algoritmo de sequências. Parâmetros predefinidos do programa podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequências calcula então as identidades percentuais das sequências para as sequências de teste relativamente à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.

[00166] Uma janela de comparação, conforme usado no presente documento, inclui a referência a um segmento de qualquer uma das

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39/201 diversas posições contíguas selecionadas dentre o grupo que consiste em de 20 a 600, usualmente cerca de 50 a cerca de 200, mais usualmente cerca de 100 a cerca de 150, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem idealmente alinhadas. Os métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, pelo método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EUA 85:2444, 1988, por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).

[00167] Dois exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a identidade percentual de sequência e similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul etal., Nuc. Acids Res. 25:3.389 a 3.402, 1977; e Altschul etal., J. Mol. Biol. 215:403 a 410, 1990, respectivamente. O software para realizar análise BLAST está publicamente disponível junto ao National Center for Biotechnology Information. Esse algoritmo envolve identificar primeiramente pares de sequência de elevada pontuação (HSP) identificando palavras pequenas de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T de limite de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de banco de dados. T é denominado

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40/201 como o limite de pontuação de palavra de vizinhança (Altschul et a!., supra). Esses acertos de palavra de vizinhança inicial atuam como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longos contendo os mesmos. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência por tanto quanto a pontuação de alinhamento acumulativa possa ser aumentada. As pontuações acumulativas são calculadas com o uso, para sequências de nucleotídeos, dos parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai de uma quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa fica a zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou é alcançada a extremidade de qualquer uma das sequências. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrões um comprimento de palavra de 3 e expectativa (E) de 10, e os alinhamentos de matriz de pontuação BLOSUM62 (consultar Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89:10915, 1989) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas.

[00168] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5.873 a 5.787, 1993). Uma

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41/201 medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos podería ocorrer ao acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for de menos do que cerca de 0,2, mais preferencialmente, de menos do que cerca de 0,01 e, com máxima preferência, de menos do que cerca de 0,001.

[00169] A identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalos de 12 e uma penalidade de intervalos de 4. Adicionalmente, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácidos pode ser determinada com o uso do algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453, 1970), que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível na internet em gcg.com), com o uso de uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5 ou 6.

[00170] Além da identidade percentual de sequência indicada acima, outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico possui reatividade imunológica cruzada com os anticorpos que surgem contra o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Desse modo, um polipeptídeo é, tipicamente, substancialmente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Outra indicação de que duas

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42/201 sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas ou seus complementos se hibridizam uns aos outros sob condições estringentes, conforme descrito abaixo. Ainda outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que os mesmos iniciadores podem ser usados para amplificar a sequência.

[00171] O termo anticorpo isolado se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a β-klotho é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de β-klotho). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a β-klotho pode, no entanto, ter reatividade cruzada a outros antígenos. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e/ou produtos químicos.

[00172] O termo isotipo se refere à classe de anticorpo (por exemplo, IgM, IgE, IgG, tal como lgG1 ou lgG4) que é fornecida pelos genes da região constante de cadeia pesada. Isotipo também inclui versões modificadas de uma destas classes, onde modificações foram feitas para alterar a função Fc, por exemplo, para melhorar ou reduzir funções efetoras ou ligação a receptores Fc.

[00173] O termo k_assoc ou k_a, como aqui utilizado, pretende referirse à taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, enquanto o termo kdis ou kd,, como usado aqui, pretende referir-se à taxa de dissociação de uma interação particular anticorpo-antígeno. O termo Kd, como aqui utilizado, pretende referir-se à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de kd a k_a (ou seja, kd/k_a) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de Kd para anticorpos podem ser determinados utilizando métodos bem estabelecidos na técnica. Os métodos para determinar o Kd de um

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43/201 anticorpo incluem medir a ressonância de plasmon de superfície utilizando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore®, ou medir a afinidade em solução por titulação de solução de equilíbrio (SET).

[00174] Os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal como usados aqui se referem a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma única especificidade e afinidade de ligação por um epítopo particular.

[00175] O termo ácido nucleico é usado no presente documento indistintamente com o termo polinucleotídeo e se refere a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de fita única ou de dupla fita. O termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeo conhecidos ou resíduos ou ligações de cadeia principal modificados, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares como o ácido nucleico de referência e que são metabolizados de uma maneira similar aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, sem limite, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quiral, 2-Ometil ribonucleotídeos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

[00176] A menos que indicado de outro modo, uma sequência de ácido nucleico particular abrange também implicitamente variantes conservativamente modificadas destes (por exemplo, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, assim como a sequência indicada explicitamente. Especificamente, conforme detalhado abaixo, podem ser obtidas substituições de códons degenerados gerando sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de bases mistas e/ou desoxi-inosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.

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19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; e Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).

[00177] O termo ligado de maneira funcional se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de polinucleotídeo (por exemplo, DNA). Tipicamente, o termo se refere à relação funcional de uma sequência reguladora transcricional com uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora ou intensificadora é ligada de maneira funcional a uma sequência de codificação se estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira adequada ou outro sistema de expressão. De modo geral, sequências reguladoras transcricionais promotoras que são ligadas de maneira funcional a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, são cis-atuantes. Entretanto, algumas sequências reguladoras transcricionais, tais como intensificadores, não precisam ser fisicamente contíguas ou localizadas em estreita proximidade com as sequências de codificação cuja transcrição intensificam.

[00178] Como aqui usado, o termo otimizado significa que uma sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos com o uso de códons que são preferenciais na célula ou organismo de produção, de modo geral, uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é manipulada para manter completamente, ou o máximo possível, a sequência de aminoácidos originalmente codificada pela sequência de nucleotídeos de partida, que é também conhecida como a sequência parental. As sequências otimizadas aqui foram manipuladas para terem códons que são preferidos em células de mamífero. No entanto, a expressão otimizada destas sequências em outras células eucarióticas ou células procarióticas também é aqui prevista. As

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45/201 sequências de aminoácidos codificadas por sequências de nucleotídeos otimizadas são também referidas como otimizadas.

[00179] Os termos polipeptídeo e proteína são usados indistintamente no presente documento para referir um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido de ocorrência natural correspondente, assim como a polímeros de aminoácido de ocorrência natural e polímero de aminoácido de ocorrência não natural. A não ser que indicado de outro modo, uma sequência de polipeptídeos particular também abrange implicitamente variantes conservativamente modificadas da mesma.

[00180] O termo anticorpo humano recombinante, como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir do mesmo, anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpos humanos recombinantes e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolvem splicing de todo ou parte de um gene de imunoglobulina humana, sequências para outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões de estrutura principal e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser sujeitos a mutagênese in vitro (ou, quando é utilizado um animal transgênico para sequências de Ig humanas, mutagênese

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46/201 somática in vivo) e assim as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL de anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente no repertório da linha germinativa de anticorpos humanos in vivo.

[00181] O termo célula hospedeira recombinante (ou simplesmente célula hospedeira) se refere a uma célula na qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Deve ser entendido que tais termos pretendem referir-se não apenas à célula em questão, mas à descendência de tal célula. Uma vez que determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas, devido quer a mutação ou influências ambientais, tal descendência pode, de fato, não ser idêntica à célula parental, mas está ainda incluída no escopo do termo célula hospedeira, tal como aqui utilizado.

[00182] O termo indivíduo inclui animais humanos e animais não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados (por exemplo, mamíferos e não mamíferos), tais como primatas não humanos (por exemplo, macaco cinomolgo), ovelhas, cães, vacas, galinhas, anfíbios e répteis. Exceto quando indicado, os termos paciente ou indivíduo são usados indistintamente no presente documento. Como aqui utilizado, os termos cino ou cinomolgo referem-se ao macaco cinomolgo (Macaca fascicularis).

[00183] Conforme aqui usado, o termo tratando, ou tratamento de qualquer doença ou distúrbio (por exemplo, distúrbio associado a FGF21) se refere, em uma modalidade, à melhora da doença ou distúrbio (ou seja, retardar ou parar ou reduzir o desenvolvimento da doença ou pelo menos um dos seus sintomas clínicos). Em outra modalidade, tratando ou tratamento se refere a aliviar ou melhorar pelo menos um parâmetro físico, incluindo aqueles que podem não ser discerníveis pelo paciente. Em ainda outra modalidade, tratando ou

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47/201 tratamento se refere à modulação da doença ou distúrbio, seja fisicamente (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), fisiologicamente (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em ainda outra modalidade, tratando ou tratamento referese a prevenir ou retardar o aparecimento ou desenvolvimento ou progressão da doença ou distúrbio.

[00184] Prevenção no que se refere a indicações aqui descritas, incluindo, por exemplo, distúrbio associado a FGF21, significa qualquer ação que previne ou retarda um agravamento em, por exemplo, parâmetros de doença associada a FGF21, como descrito abaixo, em um paciente em risco para o referido agravamento.

[00185] O termo vetor pretende referir-se a uma molécula de polinucleotídeo capaz de transportar outro polinucleotídeo ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um plasmídeo, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor um vetor viral, tal como um vetor viral adenoassociado (AAV, ou AAV2), em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissômicos de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução na célula hospedeira e, desse modo, são replicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão ligados de maneira funcional. Tais vetores são aqui referidos como vetores de expressão recombinantes (ou simplesmente vetores de expressão).

[00186] Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No

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48/201 presente relatório descritivo, plasmídeo e vetor podem ser utilizados indistintamente uma vez que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada. No entanto, a presente descrição pretende incluir tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exemplo, a replicação defectiva de retrovirus, adenovirus e vírus adenoassociados), que servem funções equivalentes.

[00187] Modulação da atividade de FGF21, tal como aqui utilizado, refere-se a um aumento ou diminuição na atividade de FGF21 que pode ser um resultado de, por exemplo, a interação de um agente com um polinucleotídeo ou polipeptídeo FGF21, a ativação da via de sinalização de FGF21 e/ou ativação da sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, sinalização dependente do receptor de FGF21), e semelhantes. Por exemplo, a modulação de uma atividade biológica refere-se a um aumento ou diminuição de uma atividade biológica. A atividade de FGF21 pode ser avaliada por meios incluindo, sem limitação, o ensaio de níveis de glucose no sangue, insulina, triglicerídeos, ou de colesterol em um indivíduo; por avaliação dos níveis de polipeptídeo de beta-klotho e/ou receptores de FGF (por exemplo, o FGFR-1c); ou por avaliação da ativação da sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, de sinalização dependente do receptor de FGF21).

[00188] As comparações da atividade de FGF21 podem também ser realizadas, por exemplo, medindo os níveis de um biomarcador a jusante de FGF21 e medindo os aumentos na sinalização de FGF21. A atividade também pode ser avaliada medindo: sinalização celular; atividade de quinase; absorção de glucose em adipócitos; flutuações de insulina, triglicerídeos ou colesterol no sangue; alterações do nível de triglicerídeos no fígado ou lipídeos no fígado; interações entre FGF21 e/ou beta-klotho e um receptor de FGF21; ou fosforilação de um receptor de FGF21. Em algumas modalidades a fosforilação de um

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49/201 receptor de FGF21 pode ser a fosforilação da tirosina. Em algumas modalidades, a modulação da atividade de FGF21 pode causar modulação de um fenótipo relacionado com FGF21.

[00189] Um biomarcador a jusante de FGF21, como usado aqui, é um gene ou produto de gene, ou indícios mensuráveis de um gene ou produto de gene. Em algumas modalidades, um gene ou atividade que é um marcador a jusante de FGF21 apresenta um nível alterado de expressão, ou em um tecido vascular. Em algumas modalidades, uma atividade do marcador a jusante é alterada na presença de um modulador de FGF21. Em algumas modalidades, os marcadores a jusante exibem níveis alterados de expressão quando FGF21 é perturbada com um modulador de FGF21 da presente descrição. Marcadores a jusante de FGF21 incluem, sem limitação, a absorção de glucose ou 2-desoxi-glucose, pERK e outras proteínas fosforiladas ou acetiladas ou níveis de NAD.

[00190] Como aqui utilizado, o termo suprarregulamentado referese a um aumento, ativação ou estimulação de uma atividade ou quantidade. Por exemplo, no contexto da presente descrição, os moduladores de FGF21 podem aumentar a atividade do receptor betaklotho e/ou FGF21. Em uma modalidade, FGFR-1c pode ser suprarregulamentado em resposta a um modulador de FGF21. A suprarregulação pode também referir-se a uma atividade relacionada com FGF21, tal como, por exemplo, a capacidade para baixar os níveis de glucose, insulina, triglicerídeos, ou colesterol no sangue; reduzir os níveis de lipídeos ou triglicerídeos no fígado; reduzir o peso corporal; melhorar a tolerância à glucose, gasto de energia ou sensibilidade à insulina; ou causar fosforilação de um receptor de FGF21; ou aumentar um marcador a jusante de FGF21. O receptor de FGF21 pode ser βklotho e FGFR-1c. A regulação positiva pode ser pelo menos 25%, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 100%, pelo menos 150%,

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50/201 pelo menos 200%, pelo menos 250%, pelo menos 400%, ou pelo menos 500% em comparação com um controle.

[00191] Como aqui utilizado, o termo modulador refere-se a uma composição que modula um ou mais eventos fisiológicos ou bioquímicos associados a um distúrbio associado a FGF21, tal como diabetes mellitus tipo 1 ou tipo 2 ou uma afeção metabólica como a obesidade. Os referidos eventos incluem, mas não estão limitados à capacidade de reduzir os níveis de glucose, insulina, triglicerídeos ou colesterol no sangue; reduzir os níveis de lipídeos ou triglicerídeos no fígado; reduzir o peso corporal; e melhorar a tolerância à glucose, o gasto de energia ou a sensibilidade à insulina.

Proteínas de FGF21 [00192] A presente descrição fornece anticorpos miméticos de FGF21 (por exemplo, anticorpos monoclonais que se ligam a betaklotho (β-klotho)) que podem induzir a sinalização mediada por FGF21 (por exemplo, a sinalização mediada pelo receptor de FGF21), como aqui definido. In vivo, a forma madura de FGF21 é a forma ativa da molécula. Uma sequência exemplificativa de FGF21 humana de tipo selvagem tem referência NCBI sequência número NP_061986.1, e pode ser encontrada em tais patentes emitidas como, por exemplo, US 6,716,626 B1, por exemplo, como estabelecido a seguir (SEQ ID NO:1).

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51/201 [00193] A sequência de mRNA correspondente que codifica ο polipeptídeo FGF21 de comprimento total (referência NCBI sequência número NM_019113.2) é mostrada a seguir (SEQ ID NO:2)

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Ü.\\?ÜU?\í<^C;'··· <·^<Κ· r.G^hÇíCGÃ^·: ^CGAgQCC [00194] A sequência de FGF21 madura não possui uma sequência líder e pode também incluir outras modificações de um polipeptídeo, tais como processamento proteolítico do terminal amino (com ou sem uma sequência líder) e/ou do terminal carboxila, divagem de um polipeptídeo menor a partir de um precursor maior, glicosilação N-ligada e/ou Oligada, e outras modificações pós-tradução entendidas por aqueles peritos na técnica. Um exemplo representativo de uma sequência de FGF21 madura tem a seguinte sequência (SEQ ID NO:53, que representa as posições de aminoácidos 29-209 da sequência da proteína de comprimento total FGF21 (referência NCBI sequência número NP_061986.1)):

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53/201 [00195] A sequência de cDNA correspondente que codifica um polipeptídeo FGF21 maduro (SEQ ID NO:53) é mostrada abaixo (SEQ ID NO:63):

Anticorpos Miméticos de FGF21 e Fragmentos de Ligação ao Antígeno

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54/201 [00196] A presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana). Em algumas modalidades, a presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a β-klotho humana e de macaco cinomolgo. Os anticorpos da presente descrição incluem, mas não estão limitados a, os anticorpos monoclonais e Fabs humanos, isolados como descrito nos Exemplos.

[00197] A sequência de β-klotho de tipo selvagem tem a referência NCBI sequência número NP_783864.1 e pode ser encontrada na literatura como Xu, et al. (2007) J Biol Chem. 282(40):29069-72 e Lin, et al. (2007) J Biol Chem. 282(37):27277-84. O cDNA de comprimento total que codifica a β-klotho humana tem o número de Acesso do GenBank NM_175737). A sequência proteica é a seguinte (SEQ ID NO:52).

[00198] A presente descrição fornece anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a uma proteína βklotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo) e é capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc, em que o anticorpo é descrito na Tabela 1, por exemplo, NGV005 ou NGV006. Em aspectos específicos, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno aqui fornecidos, que se ligam

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55/201 especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo) e é capaz de ativar ou aumentar a atividade de complexo β-klotho/receptor FGFRIc, não é um anticorpo descrito na Tabela 2, por exemplo, NGV001, NGV002, NGV003 ou NGV004. Os anticorpos descritos na Tabela 2 foram descritos no Pedido de Patente Internacional PCT N^Q PCT/IB2016/054660 apresentado em 2 de agosto de 2016, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00199] A presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo), em que os anticorpos compreendem um domínio VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15. A presente invenção também fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho, em que os anticorpos compreendem uma CDR de VH tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR de VH listadas na Tabela 1, infra. Em particular, a presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo), em que os anticorpos compreendem (ou, em alternativa, consistem em) uma, duas, três, ou mais CDRs de VH tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR de VH listadas na Tabela 1, infra.

[00200] A presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho, os referidos anticorpos compreendem um domínio VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26 ou 32. A presente descrição também fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo), os referidos anticorpos compreendem uma CDR de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDR de VL listadas na Tabela 1,

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56/201 infra. Em particular, a presente descrição fornece anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo), os referidos anticorpos compreendem (ou, em alternativa, consistem em) uma, duas, três ou mais CDRs de VL tendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das CDRs de VL listadas na Tabela 1, infra.

[00201] Outros anticorpos da presente descrição incluem aminoácidos que sofreram mutação, tendo, contudo pelo menos 60, 70, 80, 85, 90 ou 95 porcento de identidade nas regiões de CDRs com as regiões de CDRs representadas nas sequências descritas na Tabela 1. Em algumas modalidades, inclui sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões de CDR em comparação com as regiões de CDR representadas na sequência descrita na Tabela 1.

[00202] A presente descrição também fornece moléculas de ácidos nucleicos ou polinucleotídeos compreendendo sequências de ácido nucleico que codificam VH, VL, a cadeia pesada de comprimento total, e a cadeia leve de comprimento total dos anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo). Tais sequências de ácidos nucleicos podem ser otimizadas para a expressão em células de mamíferos (por exemplo, a Tabela 1 mostra as sequências de ácidos nucleicos otimizadas para a cadeia leve e cadeia pesada dos anticorpos da presente descrição).

Tabela 1. Exemplos de Anticorpos e Fabs Miméticos de FGF21

	SEQ ID ÍNO:	Sequência de aminoácidos
NOV005
HCDR1 (Combinado)	6	GYSITSGYTWH
HCDR2 (Combinado)	7	YIHYSVYTNYNPSLKS
HCDR3 (Combinado)	8	RTTSLERYFDV
HCDR1 (Kabat)	9	SGYTWH

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HCDR2 (Kabat)	7	YIHYSVYTNYNPSLKS
HCDR3 (Kabat)	8	RTTSLERYFDV
HCDR1 (Chothia)	10	GYSITSGY
HCDR2 (Chothia)	11	HYSVY
HCDR3 (Chothia)	8	RTTSLERYFDV
HCDR1 (IMGT)	12	GYSITSGYT
HCDR2 (IMGT)	13	IHYSVYT
HCDR3 (IMGT)	14	ARRTTSLERYFDV
VH	15	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGY TWHWIRQHPGKGLEWIGYIHYSVYTNYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARR TTSLERYFDVWGQGTLVTVSS
DNA VH (vetor 1)	16	CAAGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCC TGGTCAAGCCTAGCCAGACCCTGTCCCTGAC CTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCC GGCTACACCTGGCACTGGATCCGGCAGCACC CCGGCAAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACAT CCACTACTCCGTGTACACCAACTACAACCCCA GCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCCGGGA CACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGT CCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTA CTACTGCGCCAGACGGACCACCTCCCTGGAA CGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACC CTGGTCACCGTGTCCTCT
DNA VH (vetor 2)	36	CAAGTCCAGCTGCAAGAATCCGGACCCGGCC TCGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGTCTCTCACT TGCACGGTGTCAGGCTACAGCATCACCAGCG GTTACACCTGGCACTGGATCAGGCAGCATCC TGGAAAGGGGCTGGAATGGATTGGGTACATT CACTACTCGGTGTACACCAACTACAACCCATC GCTCAAGTCGAGAGTCACCATTTCCCGGGAC ACCTCCAAGAACCAGTTCAGCCTCAAGCTGTC CTCTGTGACCGCCGCTGATACTGCCGTGTAC TATTGCGCACGCCGGACTACTTCCCTGGAGC GCTACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACTTT GGTCACCGTCAGCTCC

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Cadeia Pesada

I¹⁷ (QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGY ÍTWHWIRQHPGKGLEWIGYIHYSVYTNYNPSLKS (RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARR ÍTTSLERYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA (PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ÍALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG ÍTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP (PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC (VVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE (EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN ÍKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT (KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY (KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF (SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

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DNA Cadeia Pesadah8 ÍCAAGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCC ί (vetor 1) iTGGTCAAGCCTAGCCAGACCCTGTCCCTGAC ί

ÍCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCC ί ÍGGCTACACCTGGCACTGGATCCGGCAGCACC ί ^CCGGCAAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACAT ί ÍCCACTACTCCGTGTACACCAACTACAACCCCA ί ÍGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCCGGGA ÍCACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGTí iCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTA i ^CTACTGCGCCAGACGGACCACCTCCCTGGAA í ÍCGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACC í ÍCTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGG í ÍGGCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAG í iCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTG i ^GGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGC í ÍCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCT i ^GACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTG í ÍCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCA í ÍGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGG i ÍCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC í ÁAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGG í rfGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACAC í iCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTG í ÍGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAi ^GCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACC í ÍCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGT i ^CCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTG í ÍGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCC í ÍAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACT í ÍCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGT í ÍGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAG í rfACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGG í ÍCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGC í ÍCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTA í ÍCACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACC í ÍAAGAATCAAGTGTCCCTGACATGTCTGGTCAA í ^GGGCTTCTACCCTAGCGATATCGCCGTGGAA í ÍTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACT í ÍACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGA í ÍCGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCG í ÍTGG ACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGT i ^GTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG í iCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCC í rfGTCCCCTGGCAAG

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DNA Cadeia Pesada&7 ÍCAAGTCCAGCTGCAAGAATCCGGACCCGGCC ί (vetor 2) ÍTCGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGTCTCTCACT ί

TGCACGGTGTCAGGCTACAGCATCACCAGCG ί ÍGTTACACCTGGCACTGGATCAGGCAGCATCC ί ÍTGGAAAGGGGCTGGAATGGATTGGGTACATT ί ÍCACTACTCGGTGTACACCAACTACAACCCATC ί ÍGCTCAAGTCGAGAGTCACCATTTCCCGGGAC ί iACCTCCAAGAACCAGTTCAGCCTCAAGCTGTCí ÍCTCTGTGACCGCCGCTGATACTGCCGTGTAC í ÍTATTGCGCACGCCGGACTACTTCCCTGGAGC í ÍGCTACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACTTT í ÍGGTCACCGTCAGCTCCGCCAGCACTAAGGGC í ÍCCCAGCGTGTTTCCGCTGGCCCCCTCCTCCA í ÍAAAGCACCTCCGGCGGAACTGCCGCGCTCG í ^GATGTCTCGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCTÍ ÍGTGACAGTGTCATGGAACTCGGGAGCACTGA í ÇCAGCGGAGTGCATACTTTTCCCGCGGTCCT í ÍGCAGTCCTCCGGATTGTACAGCCTGTCATCG í ÍGTCGTGACCGTGCCGTCCTCATCGCTGGGCA i iCCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAAÍ ÍCCTAGCAACACCAAAGTGGATAAGCGGGTGG í ÃACCTAAGTCCTGCGACAAGACTCACACTTGT í ÍCCGCCATGCCCAGCGCCTGAACTCCTGGGTG í ÍGTCCTTCGGTGTTCCTGTTCCCGCCAAAGCC í ^GAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACGCCT í ÍGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGCTGTGTCAC í ÁTGAGGACCCTGAAGTCAAGTTCAATTGGTAC í ÍGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAG í ÍACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCA i ÍCCTACCGCGTCGTGTCGGTGCTGACCGTGTT í ÍGCACCAAGACTGGCTGAATGGAAAGGAGTAT í ÃAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCG í ÍCACCAATTGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAG í ÍGGACAGCCGCGCGAACCCCAAGTGTACACCC í ÍTTCCCCCGTCCCGGGAGGAAATGACCAAGAA i ÍTCAAGTCTCCCTGACTTGCCTTGTGAAGGGTT i ÍTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGA í ÍGTCAAACGGGCAGCCGGAAAACAACTACAAG í ÍACCACACCTCCGGTGCTGGATTCCGACGGCT í ÍCCTTCTTCTTGTACTCGAAGCTGACCGTGGAT í ÍAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCT i ^CCTGCTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCACAA í ÍCCACTACACTCAGAAGTCGCTCTCGCTGAGC í CCCGGGAAG

LCDR1 (Combinado) LCDR2 (Combinado)	19 |20	QASQDISNYLN YTSRLQS
LCDR3 (Combinado)	21	QQGNTLPYT
LCDR1 (Kabat)	19	QASQDISNYLN
LCDR2 (Kabat)	20	YTSRLQS
LCDR3 (Kabat)	21	QQGNTLPYT
LCDR1 (Chothia)	22	SQDISNY

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 64/234

61/201

LCDR2 (Chothia)	23	YTS
LCDR3 (Chothia)	24	GNTLPY
LCDR1 (IMGT)	25	QDISNY
LCDR2 (IMGT)	23	YTS
LCDR3 (IMGT)	21	QQGNTLPYT
VL	26	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSG SGADYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGQ GTKLEIK
DNA VL (vetor 1)	54	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAGCC TGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT CACCTGTCAGGCCTCCCAGGACATCTCCAAC TACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCA AGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCTCC CGGCTGCAGTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCT CCGGCTCTGGCTCTGGCGCCGACTACACCTT CACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATATC GCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCT GCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG GAAATCAAG
DNA VL (vetor 2)	27	GACATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCGTCCC TCTCCGCTTCCGTGGGAGATAGAGTGACCAT CACCTGTCAAGCCAGCCAGGATATTTCAAACT ACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCGGGGAA GGCTCCCAAGTTGCTCATCTACTACACATCGA GGCTGCAGTCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCTC CGGGTCCGGATCAGGCGCCGACTATACCTTC ACCATTTCCTCCCTGCAACCGGAGGACATTG CCACTTACTTCTGCCAACAAGGGAACACCCTG CCCTACACTTTCGGACAAGGAACTAAGCTGG AAATCAAG
Cadeia Leve	28	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSG SGADYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGQ GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 65/234

62/201

DNA Cadeia Leve (vetod29 ÍGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCCAGCC i

1) iTGTCCGCCTCCGTGGGCGACAGAGTGACCAT i ÍCACCTGTCAGGCCTCCCAGGACATCTCCAAC i iTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCA i ãggcccctaagctgctgatctactacacctcc i iCGGCTGCAGTCCGGCGTGCCCTCCAGATTCT i iCCGGCTCTGGCTCTGGCGCCGACTACACCTT i ÍCACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATATC i iGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCT i ÍGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTG i ígaaatcaagcgtacggtggccgctccctccg i ÍTGTTCATCTTCCCACCCTCCG ACGAGCAGCTG i íaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctgc i ítgaacaacttctaccctcgcgaggccaaagt i ÍGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAGAGC i íggcaactcccaggaatccgtcaccgagcagg i ÍACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTC i ÍCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAG i íaagcacaaagtgtacgcctgcgaagtgaccc i íaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtc i [ iCTTCAACCGGGGCGAGTGC

DNA Cadeia Leve (vetodõl ÍGACATCCAGATGACCCAGAGCCCGTCGTCCC i

2) ÍTCTCCGCTTCCGTGGGAGATAGAGTGACCAT i ÍCACCTGTCAAGCCAGCCAGGATATTTCAAACT i iACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCGGGGAA i ÍGGCTCCCAAGTTGCTCATCTACTACACATCGA i iGGCTGCAGTCCGGCGTGCCCAGCCGGTTCTC i :CGGGTCCGGATCAGGCGCCGACTATACCTTC ! íaccatttcctccctgcaaccggaggacattg i iCCACTTACTTCTGCCAACAAGGGAACACCCTG i ÍCCCTACACTTTCGGACAAGGAACTAAGCTGG i iAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCGCCGTCCGT i ÍGTTCATCTTCCCTCCTTCTGACGAGCAGCTCA i i AG AGCGGCACCGCGTCGGTGGTCTGCCTGCT i ;gaacaacttctacccacgggaggccaaggtc i ÍCAGTGGAAAGTGGATAACGCATTGCAGTCGG i iGAAACTCACAGGAGTCGGTGACCGAACAGGA i ÍCTCCAAAGACTCAACCTACTCCCTGTCCTCCA i iCTCTTACCCTGTCCAAGGCGGACTACGAAAA í ^GCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACCCAT i ÍCAGGGTCTGAGCAGCCCTGTGACTAAGAGCT i iTTAACCGCGGCGAATGC

NOV006 |hCDR1 (Combinado) |6 jGYSITSGYTWH |HCDR2 (Combinado) |7 jYIHYSVYTNYNPSLKS |HCDR3 (Combinado) |δ jRTTSLERYFDV

ÍHCDR1 (Kabat) |9 jSGYTWH

ÍHCDR2 (Kabat) |7 jYIHYSVYTNYNPSLKS

ÍHCDR3 (Kabat) |δ [RTTSLERYFDV

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 66/234

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HCDR1 (Chothia)	10	GYSITSGY
HCDR2 (Chothia)	11	HYSVY
HCDR3 (Chothia)	8	RTTSLERYFDV
HCDR1 (IMGT)	12	GYSITSGYT
HCDR2 (IMGT)	13	IHYSVYT
HCDR3 (IMGT)	14	ARRTTSLERYFDV
VH	15	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGY

DNA VH (vetor 1)

DNA VH (vetor 2)

Cadeia Pesada

TWHWIRQHPGKGLEWIGYIHYSVYTNYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARR TTSLERYFDVWGQGTLVTVSS

CAAGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCC TGGTCAAGCCTAGCCAGACCCTGTCCCTGAC CTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCC GGCTACACCTGGCACTGGATCCGGCAGCACC CCGGCAAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACAT CCACTACTCCGTGTACACCAACTACAACCCCA GCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCCGGGA CACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGT CCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTA CTACTGCGCCAGACGGACCACCTCCCTGGAA CGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACC CTGGTCACCGTGTCCTCT

CAAGTCCAGCTGCAAGAATCCGGACCCGGCC TCGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGTCTCTCACT TGCACGGTGTCAGGCTACAGCATCACCAGCG GTTACACCTGGCACTGGATCAGGCAGCATCC TGGAAAGGGGCTGGAATGGATTGGGTACATT CACTACTCGGTGTACACCAACTACAACCCATC GCTCAAGTCGAGAGTCACCATTTCCCGGGAC ACCTCCAAGAACCAGTTCAGCCTCAAGCTGTC CTCTGTGACCGCCGCTGATACTGCCGTGTAC TATTGCGCACGCCGGACTACTTCCCTGGAGC GCTACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACTTT GGTCACCGTCAGCTCC

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYSITSGY TWHWIRQHPGKGLEWIGYIHYSVYTNYNPSLKS RVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARR TTSLERYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN KALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 67/234

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DNA Cadeia Pesadabo iCAAGTGCAGCTGCAGGAATCTGGCCCTGGCC i (vetor 1) iTGGTCAAGCCTAGCCAGACCCTGTCCCTGAC i

ÍCTGCACCGTGTCCGGCTACTCCATCACCTCC i iGGCTACACCTGGCACTGGATCCGGCAGCACC i ÍCCGGCAAGGGCCTGGAATGGATCGGCTACAT i ÍCCACTACTCCGTGTACACCAACTACAACCCCA i iGCCTGAAGTCCAGAGTGACCATCTCCCGGGA i ÍCACCTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGT i iCCTCCGTGACCGCCGCTGACACCGCCGTGTA i ÍCTACTGCGCCAGACGGACCACCTCCCTGGAA i iCGGTACTTCGACGTGTGGGGCCAGGGCACC i iCTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCCACCAAGG i ÍGGCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAG i iCAAGTCCACCTCTGGCGGCACCGCCGCTCTG i ÍGGCTGCCTCGTGAAGGACTACTTCCCCGAGC i iCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCT i ÍGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTG i ÍCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCA i iGCGTCGTGACCGTGCCCTCCAGCTCTCTGGG i ÍCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCAC i ÍAAGCCCTCCAACACCAAAGTGGACAAGCGGG i ÍTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACAC i ÍCTGTCCTCCCTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTG i iGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAi ÍGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACC i iCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGCCGTGT i ÍCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTG i iGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCC i iAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACT i ÍCCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGT i iGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAG i ÍTACAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGG i iCCGCTCCCATCGAAAAGACCATCTCCAAGGC i iCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTA i ÍCACACTGCCTCCCAGCCGGGAAGAGATGACC i iAAGAATCAAGTGTCCCTGACATGTCTGGTCAA i ÍGGGCTTCTACCCTAGCGATATCGCCGTGGAA i ÍTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACT i iACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGA i ÍCGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCG i iTGG ACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGT i ÍGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG i iCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCC i TGTCCCCTGGCAAG

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 68/234

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DNA Cadeia PesadaÍ39 ÍCAAGTCCAGCTGCAAGAATCCGGACCCGGCC í (vetor 2) ÍTCGTCAAGCCGTCCCAGACTCTGTCTCTCACT i

ÍTGCACGGTGTCAGGCTACAGCATCACCAGCG í ÍGTTACACCTGGCACTGGATCAGGCAGCATCC i ÍTGGAAAGGGGCTGGAATGGATTGGGTACATT í ÍCACTACTCGGTGTACACCAACTACAACCCATC i ÍGCTCAAGTCGAGAGTCACCATTTCCCGGGAC i iACCTCCAAGAACCAGTTCAGCCTCAAGCTGTC í ÍCTCTGTGACCGCCGCTGATACTGCCGTGTAC í ÍTATTGCGCACGCCGGACTACTTCCCTGGAGC í ÍGCTACTTCGACGTCTGGGGCCAGGGCACTTT i ÍGGTCACCGTCAGCTCCGCCAGCACTAAGGGC i ÍCCCAGCGTGTTTCCGCTGGCCCCCTCCTCCA i ÍAAAGCACCTCCGGCGGAACTGCCGCGCTCG í ÍGATGTCTCGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCTÍ ígtgacagtgtcatggaactcgggagcactga i ÍCCAGCGGAGTGCATACTTTTCCCGCGGTCCT í ÍGCAGTCCTCCGGATTGTACAGCCTGTCATCG í ÍGTCGTGACCGTGCCGTCCTCATCGCTGGGCA i ÍCCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAAÍ ÍCCTAGCAACACCAAAGTGGATAAGCGGGTGG i ÍAACCTAAGTCCTGCGACAAGACTCACACTTGT í ÍCCGCCATGCCCAGCGCCTGAACTCCTGGGTG i ÍGTCCTTCGGTGTTCCTGTTCCCGCCAAAGCC í ÍGAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACGCCT í ÍGAAGTGACCTGTGTGGTGGTGGCTGTGTCAC i ÍATGAGGACCCTGAAGTCAAGTTCAATTGGTAC i ÍGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAG í ÃCCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCA i ÍCCTACCGCGTCGTGTCGGTGCTGACCGTGTT í ÍGCACCAAGACTGGCTGAATGGAAAGGAGTAT í ÍAAGTGCAAAGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCG í ÍCACCAATTGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAG i ÍGGACAGCCGCGCGAACCCCAAGTGTACACCC i ÍTTCCCCCGTCCCGGGAGGAAATGACCAAGAA í ÍTCAAGTCTCCCTGACTTGCCTTGTGAAGGGTT i ÍTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGA í ÍGTCAAACGGGCAGCCGGAAAACAACTACAAG i ACCACACCTCCGGTGCTGGATTCCGACGGCT í ÍCCTTCTTCTTGTACTCGAAGCTGACCGTGGAT i ÍAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGAAACGTGTTCT i ÍCCTGCTCCGTGATGCACGAAGCTCTGCACAA í ÍCCACTACACTCAGAAGTCGCTCTCGCTGAGC i CCCGGGAAG

LCDR1 (Combinado) LCDR2 (Combinado)	31 ,20	RASQDISNYLN YTSRLQS
LCDR3 (Combinado)	21	QQGNTLPYT
LCDR1 (Kabat)	31	RASQDISNYLN
LCDR2 (Kabat)	20	YTSRLQS
LCDR3 (Kabat)	21	QQGNTLPYT
LCDR1 (Chothia)	22	SQDISNY

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 69/234

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LCDR2 (Chothia)	23	YTS
LCDR3 (Chothia)	24	GNTLPY
LCDR1 (IMGT)	25	QDISNY
LCDR2 (IMGT)	23	YTS
LCDR3 (IMGT)	21	QQGNTLPYT
VL	32	EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISNYLN WYQQKPGQAPRLLIYYTSRLQSGIPARFSGSGS GADYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQ GTKLEIK
DNA VL (vetor 1)	33	GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCTGCCACCC TGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCT GAGCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCTCCAAC TACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCC AGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACTACACCTC CCGGCTGCAGTCCGGCATCCCTGCCAGATTC TCCGGCTCTGGCTCTGGCGCCGACTACACCC TGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTT CGCCGTGTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACC CTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC TGGAAATCAAG
DNA VL (vetor 2)	40	GAAATCGTGATGACTCAGTCCCCCGCCACTC TCTCCCTGTCCCCTGGCGAACGGGCCACCCT GTCGTGCCGGGCGTCGCAGGACATCTCAAAC TATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAC AGGCACCCAGGCTCCTGATCTACTACACCTC GCGCCTGCAATCCGGAATCCCAGCCCGCTTC TCCGGTTCCGGCTCCGGCGCTGATTACACCC TCACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTT CGCCGTGTACTTCTGTCAACAAGGAAACACC CTCCCGTACACATTTGGGCAGGGAACCAAGC TGGAGATTAAG
Cadeia Leve	34	EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQDISNYLN WYQQKPGQAPRLLIYYTSRLQSGIPARFSGSGS GADYTLTISSLQPEDFAVYFCQQGNTLPYTFGQ GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 70/234

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(DNA Cadeia Leve (vetor(35 1) I

GAGATCGTGATGACCCAGTCCCCTGCCACCC TGTCCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCT GAGCTGCCGGGCCTCCCAGGACATCTCCAAC TACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCC AGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACTACACCTC CCGGCTGCAGTCCGGCATCCCTGCCAGATTC TCCGGCTCTGGCTCTGGCGCCGACTACACCC TGACCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTT CGCCGTGTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACC CTGCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGC TGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTCCCTC CGTGTTCATCTTCCCACCCTCCGACGAGCAG CTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTCGTGTGCC TGCTGAACAACTTCTACCCTCGCGAGGCCAA AGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTGCAG AGCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGC AGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTC CTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTAC GAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGA CCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAA

(DNA Cadeia Leve (vetor(41 I2)

GTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC GAAATCGTGATGACTCAGTCCCCCGCCACTC TCTCCCTGTCCCCTGGCGAACGGGCCACCCT GTCGTGCCGGGCGTCGCAGGACATCTCAAAC TATCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAC AGGCACCCAGGCTCCTGATCTACTACACCTC GCGCCTGCAATCCGGAATCCCAGCCCGCTTC TCCGGTTCCGGCTCCGGCGCTGATTACACCC TCACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAGGACTT CGCCGTGTACTTCTGTCAACAAGGAAACACC CTCCCGTACACATTTGGGCAGGGAACCAAGC TGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCGCCGTC CGTGTTCATCTTCCCTCCTTCTGACGAGCAGC TCAAGAGCGGCACCGCGTCGGTGGTCTGCCT GCTGAACAACTTCTACCCACGGGAGGCCAAG GTCCAGTGGAAAGTGGATAACGCATTGCAGT CGGGAAACTCACAGGAGTCGGTGACCGAACA GGACTCCAAAGACTCAACCTACTCCCTGTCCT CCACTCTTACCCTGTCCAAGGCGGACTACGA AAAGCACAAGGTCTACGCCTGCGAAGTGACC CATCAGGGTCTGAGCAGCCCTGTGACTAAGA GCTTTAACCGCGGCGAATGC

Tabela 2: Anticorpos miméticos FGF21

(SEQ ID NO:	Sequência de Aminoácidos
NÕVÒÕ4
HCDR1 (Combinado) (6 HCDR2 (Combinado) 42	GYSITSGYTWH yihysvytnynpsvkg
HCDR3 (Combinado) (8	RTTSLERYFDV

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 71/234

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HCDR1 (Kabat)	:9	SGYTWH
HCDR2 (Kabat)		YIHYSVYTNYNPSVKG
HCDR3 (Kabat)	:8	RTTSLERYFDV
HCDR1 (Chothia)	ho	GYSITSGY
HCDR2 (Chothia)	h1	HYSVY
HCDR3 (Chothia)	Ιθ	RfYSLERYFDv
HCDR1 (IMGT)	12	GYSITSGYT
HCDR2 (IMGT)	h3	IHYSVYT
HCDR3 (IMGTj		ARRTtSLERYFDV
VH	43	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAVSGYSITSGY
		TWHWVRQAPGKGLEWLSYIHYSVYTNYNPSVK
		GRFTISRDTAKNSFYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
		RTTSLERYFDVWGQGTLVTVSS
DNA VH	44	GAAGTCCAACTCGTCGAATCCGGCGGCGGAC

TGGTCAAGCCGGGAGGATCGCTGAGACTGTC GTGCGCAGTGTCAGGGTACAGCATCACCTCC GGTTACACCTGGCACTGGGTCAGACAGGCGC CGGGAAAAGGCCTGGAATGGCTGTCCTACATT CATTACTCCGTGTACACTAACTACAACCCCTCA GTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCCGGGACA CTGCCAAGAATAGCTTCTATCTGCAAATGAACT CCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTA CTGCGCGAGGCGCACCACGTCCCTGGAGCGC TACTTTGACGTGTGGGGCCAGGGTACCCTCGT GACTGTGTCCTCG

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 72/234

69/201

Cadeia Pesada |45 ^ÉVQLVÉSGGGLVkPGGSLRLSCÀVSGYSITSGY Itwhwvrqapgkglewlsyihysvytnynpsvk Igrftisrdtaknsfylqmnslraedtavyycar |rTTSLERYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPL jAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG jALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGT jQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPP jCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV jVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE Iqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnka Ílaapiektiskakgqprepqvytlppsreemtkn Iqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennyktt jpPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV ÍMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 73/234

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Cadeia Pesada de DNÀ46

GAAGTCCAACTCGTCGAATCCGGCGGCGGAC Itggtcaagccgggaggatcgctgagactgtc Igtgcgcagtgtcagggtacagcatcacctcc jGGTTACACCTGGCACTGGGTCAGACAGGCGC jCGGGAAAAGGCCTGGAATGGCTGTCCTACATT jCATTACTCCGTGTACACTAACTACAACCCCTCA jGTGAAGGGGCGGTTCACCATCTCCCGGGACA ICTGCCAAGAATAGCTTCTATCTGCAAATGAACT ICCCTGCGGGCCGAGGATACCGCCGTGTACTA ICTGCGCGAGGCGCACCACGTCCCTGGAGCGC Itactttgacgtgtggggccagggtaccctcgt jGACTGTGTCCTCGGCTAGCACCAAGGGCCCC jTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTC jTACCTCCGGCGGCACAGCTGCTCTGGGCTGC jCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGAC Iagtgtcctggaactctggcgccctgacctctg Igcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcc Itccggcctgtactccctgtcctccgtggtcac Iagtgccttcaagcagcctgggcacccagacct Iatatctgcaacgtgaaccacaagccttccaac Iaccaaggtggacaagcgggtggagcctaagt |CCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCCTGC jCCTGCTCCTGAACTGCTGGGCGGCCCTTCTGT jGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCCAAGGACACCC jTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGC Igtggtggtggccgtgtcccacgaggatcctg Iaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtg Igaggtgcacaacgccaagaccaagcctcggg Iaggaacagtacaactccacctaccgggtggtg |tccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggc jTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCC jAACAAGGCCCTGGCCGCCCCTATCGAAAAGAC jAATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAA ICCCCAGGTGTACACCCTGCCACCCAGCCGGG Iaggaaatgaccaagaaccaggtgtccctgacc Tgtctggtcaagggcttctacccttccgatat

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 74/234

71/201

	ÇGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCT i GAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCA ÃACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCA GGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACG AGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCC CTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG
LCDR1 (Combinado)	49	^QASQDISNYLN
LCDR2 (Combinado)	Í20	:YTSRLQS
LCDR3 (Combinado)	”[21	QQGNTLPYT
LCDR1 (Kabat)	19	ÍQASQDISNYLN
LCDR2 (Kabat)	;20	:YTSRLQS
LCDR3 (Kabat)	12Ϊ	'''iQQGNfLF^ ]
LCDR1 (Chothia)	;22	^SQDISNY
LCDR2 (Chothia)	:23	;yts
LCDR3 (Chothia)	Í24	;gntlpy
LCDRÍ (IMGT)	25	QDISNY
LCDR2 (IMGT)	23	ÍYTS
LCDR3 (IMGT)	p1	^QQGNTLPYT
VL	Ί47	TDjQMTQSPSSLSASVGbRVTITCQÀSQDISNYLNl WYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFTGSGS gadytftisslqpediatyfcqqgntlpytfgqg tkleik
DNA VL	48	gatattcagatgactcagagcccctcctcgct i ctccgcctccgtgggggatcgcgtgacaatc ãcctgtcaagcgtcccaggacatctcaaacta cctgaactggtatcagcagaagccagggaag gccccgaagctgctgatctactacacttcgcg gctgcagtccggcgtgccgtcacggttcact ggctcgggctccggagcagactacaccttca ccattagcagcctgcagcccgaggacatcgct ;acctac 1 1 1 1GCCAACAAGGAAACACCCTGCC i ttacaccttcggacagggtactaagctggaaa tcaaa

Petição 870190088690, de 09/09/2019, pág. 75/234

72/201

Cadeia Leve	49 pIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLN WYQQKPGKAPKLLIYYTSRLQSGVPSRFTGSGS GADYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGQG TKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC
Cadeia Leve de DNA	Í5Õ GATATTCAGATGACTCAGAGCCCCTCCTCGCT CTCCGCCTCCGTGGGGGATCGCGTGACAATC ACCTGTCAAGCGTCCCAGGACATCTCAAACTA CCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAG GCCCCGAAGCTGCTGATCTACTACACTTCGCG GCTGCAGTCCGGCGTGCCGTCACGGTTCACT GGCTCGGGCTCCGGAGCAGACTACACCTTCA CCATTAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCT ACCTACTTTTGCCAACAAGGAAACACCCTGCC TTACACCTTCGGACAGGGTACTAAGCTGGAAA TCAAACGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTC ATCTTCCCCCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGA GCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAA CAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAG TGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGCA ACAGCCAGGAGAGCGTCACCGAGCAGGACAG CAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCC TGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCAT AAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGG GCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAAC AGGGGCGAGTGC
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Cadeia Pesada	(56 (QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYY INWVRQAPGQGLEWMGRIHPGSGNTYYNEKFQ GRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIL LLRSYGMDDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP SSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQT YICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK
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NOV002
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NOV003
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75/201 [Cadeia Pesada,6Ϊ [QVQLVQSGÀÉVkkPGSSVkVSCkÁSGYTFTDYYj HNWVRQAPGQGLEWMGRIHPGSGNTYYNEKFQ j Igrvtltadkststaymelsslrsedtavyycail j jLLRSYGMDDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPj jSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL [ |tsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqt| jYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP | Iapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvv I jAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY I Instyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkala j Iapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqv j jSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP [ jVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM [ jHEALHNHYTQKSLSLSPGK |VL [57[DVVMTQTPLSLSVTPGQPÀSISCkSSQSIVHSSG [ jNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF [ jSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYj | jTFGQGTKLEIK jCadeia Leve.............................[62...............OVVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSIVHSSG/ jNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF | |sgsgsgtdftlkisrveaedvgvyycfqgshipy| |tfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtas| IVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV [ Iteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevt j Ihqglsspvtksfnrgec [00203] Outros anticorpos da presente descrição incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos sofreram mutação, tendo, contudo, pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 porcento de identidade com as sequências descritas na Tabela

1. Algumas modalidades incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões variáveis em comparação com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 1, enquanto mantêm substancialmente a mesma atividade de ligação ao antigeno.

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76/201 [00204] Outros anticorpos da presente descrição incluem aqueles em que os aminoácidos ou ácidos nucleicos que codificam os aminoácidos sofreram mutação, tendo, contudo, pelo menos 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 porcento de identidade com as sequências descritas na Tabela 1. Algumas modalidades incluem sequências de aminoácidos mutantes em que não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos sofreram mutação nas regiões variáveis em comparação com as regiões variáveis representadas na sequência descrita na Tabela 1, enquanto mantêm substancialmente a mesma atividade de ligação ao antígeno.

[00205] Uma vez que cada um destes anticorpos se pode ligar a βklotho, as sequências de cadeia pesada de comprimento total e de cadeia leve de comprimento total, VH, VL (sequências de aminoácidos e as sequências de nucleotídeos codificando as sequências de aminoácidos) podem ser misturadas e correlacionadas para criar outros anticorpos de ligação a β-klotho da presente descrição. Tais anticorpos de ligação a β-klotho misturados e correlacionados podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica (por exemplo, ELISA e outros ensaios descritos na seção de Exemplos). Quando essas cadeias são misturadas e correlacionadas, uma sequência VH de um emparelhamento VH/VL particular deve ser substituída por uma sequência VH estruturalmente similar. Similarmente, uma sequência de cadeia pesada de comprimento total de um emparelhamento particular de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total deve ser substituída por uma sequência de cadeia pesada de comprimento total estruturalmente similar. Similarmente, uma sequência VL de um emparelhamento VH/VL particular deve ser substituída por uma sequência VL estruturalmente similar. Similarmente, uma sequência de cadeia leve de comprimento total de um emparelhamento particular de cadeia pesada de comprimento total / cadeia leve de comprimento total deve ser

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77/201 substituída por uma sequência de cadeia leve de comprimento total estruturalmente similar.

[00206] Consequentemente, em um aspecto, a presente descrição fornece um anticorpo isolado (por exemplo, um anticorpo monoclonal) ou uma sua região de ligação ao antígeno tendo: um domínio variável de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32, em que o anticorpo se liga especificamente a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e/ou de macaco cinomolgo).

[00207] Em outro aspecto, a presente descrição fornece (i) um anticorpo isolado tendo: uma cadeia pesada de comprimento total compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para expressão em uma célula de mamífero, de SEQ ID NO: 17, e uma cadeia leve de comprimento total compreendendo uma sequência de aminoácidos que foi otimizada para expressão em uma célula de mamífero, de SEQ ID NO: 28 ou 34; ou (ii) uma proteína funcional compreendendo uma sua porção de ligação ao antígeno. Mais especificamente, em certos aspectos, a presente descrição fornece um anticorpo isolado ou sua região de ligação ao antígeno, compreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo sequências de aminoácidos selecionadas a partir das SEQ ID NOs: 17 e 28; ou 17 e 34, respectivamente.

[00208] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma

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78/201 sequência de aminoácidos com pelo menos 90% ou 95% de identidade dos mesmos; e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 32 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% ou 95% de identidade dos mesmos.

[00209] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

[00210] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.

[00211] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento compreende uma (i) uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou (ii) uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[00212] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo

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79/201 isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo compreende uma (i) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.

[00213] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não compreende CDRs Combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004 como apresentado na Tabela 2.

[00214] Os termos região determinadora de complementaridade e CDR, como usados aqui, se referem às sequências de aminoácidos dentro de regiões variáveis de anticorpos que conferem especificidade e afinidade de ligação ao antígeno. Em geral existem três CDRs em cada região variável de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) e três CDRs em cada região variável de cadeia leve (LCDR1, LCDR2, LCDR3).

[00215] As fronteiras precisas de sequências de aminoácidos de uma dada CDR podem ser facilmente determinadas usando qualquer um de alguns esquemas bem conhecidos, incluindo os descritos por Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest', 5- Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeração de Kabat), ΑΙ-Lazikani et al., (1997) JMB

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273,927-948 (esquema de numeração de Chothia) e numeração de ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) (esquema de numeração de IMGT). Por exemplo, para formatos clássicos, sob Kabat, os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia pesada (VH) são numerados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); os resíduos de aminoácidos de CDR no domínio variável de cadeia leve (VL) são numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3). Sob Chothia, os aminoácidos de CDR no VH são numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3); e os resíduos de aminoácidos em VL são numerados 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) e 91-96 (LCDR3). Por combinação das definições de CDR de tanto Kabat como Chothia, as CDRs consistem nos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 95-102 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoácidos 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) e 89-97 (LCDR3) em VL humana. Sob IMGT, os resíduos de aminoácidos de CDR na VH são numerados aproximadamente 26-35 (CDR1), 51-57 (CDR2) e 93-102 (CDR3), e os resíduos de aminoácidos de CDR na VL são numerados aproximadamente 27-32 (CDR1), 50-52 (CDR2) e 89-97 (CDR3) (numerado de acordo com Kabat). Sob IMGT, as regiões de CDR de um anticorpo podem ser determinadas com o uso do programa IMGT/DomainGap Align. Por combinação das definições de CDR de tanto Kabat como Chothia, as CDRs Combinadas podem consistir nos resíduos de aminoácidos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) e 99-108 (HCDR3) em VH humana e resíduos de aminoácidos 24-39 (LCDR1), 55-61 (LCDR2) e 94-102 (LCDR3) em VL humana.

[00216] Em outro aspecto, a presente descrição fornece anticorpos de ligação a β-klotho que compreendem as CDR1s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada e cadeia leve, conforme descrito na Tabela 1, ou

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81/201 combinações das mesmas. Em aspectos específicos, essas CDRs são delineadas usando o sistema Kabat. Em outros aspectos específicos, essas CDRs são delineadas usando o sistema Combinado.

[00217] Dado que cada um destes anticorpos pode ligar-se a β-klotho e que a especificidade de ligação ao antigeno é fornecida principalmente pelas regiões de CDR1,2 e 3, as sequências de CDR1, e 3 de VH e as sequências de CDR1, 2 e 3 de VL podem ser misturadas e correlacionadas (isto é, CDRs de diferentes anticorpos podem ser misturadas e correlacionadas, embora cada anticorpo contenha preferencialmente uma CDR1,2 e 3 de VH e uma CDR1,2 e de VL para criar outras moléculas de ligação de β-klotho da presente descrição. Tais anticorpos de ligação a β-klotho misturados e correlacionados podem ser testados usando os ensaios de ligação conhecidos na técnica e os ensaios descritos em Exemplos (por exemplo, ensaios de ligação ELISA, SET, Biacore®). Quando sequências de CDR de VH são misturadas e correlacionadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VH particular deve ser substituída por uma sequência (ou sequências) de CDR estruturalmente similar. Similarmente, quando as sequências de CDR de VL são misturadas e correlacionadas, a sequência de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL particular deve ser substituída por uma sequência (ou sequências) de CDR estruturalmente similar. Será prontamente evidente para aquele de habilidade comum que sequências VH e VL inovadoras podem ser criadas substituindo-se uma ou mais sequências de região de CDR de VH e/ou VL por sequências estruturalmente similares das sequências de CDR mostradas no presente documento para anticorpos monoclonais da presente descrição. Para além do exposto, em uma modalidade, os fragmentos de ligação ao antigeno dos anticorpos aqui descritos podem compreender uma CDR1, 2, e 3 de VH, ou uma CDR 1, 2, e 3 de VL,

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82/201 em que o fragmento se liga a β-klotho como um único domínio variável. [00218] Em certas modalidades da presente descrição, os anticorpos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ter as sequências de cadeia pesada e leve dos Fabs descritos na Tabela 1. Mais especificamente, o anticorpo ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ter as sequências de cadeia pesada e leve de Fab NOV005 ou NOV006.

[00219] Em certas modalidades da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a βklotho compreende a região variável de cadeia pesada CDR1, CDR2 e CDR3 de Fab NOV005 ou NOV006, e região variável de cadeia leve CDR1, CDR2 e CDR3 de Fab NOV005 ou NOV006, por exemplo, como apresentado na Tabela 1.

[00220] Em outras modalidades da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em que se liga especificamente βklotho compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2 e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por Kabat e descrito na Tabela 1. Em ainda outras modalidades da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em que se liga especificamente β-klotho compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2 e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por Chothia e descrito na Tabela 1. Em ainda outras modalidades da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em que se liga especificamente β-klotho compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região

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83/201 variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2 e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por Kabat e Chothia Combinados e descrito na Tabela 1. Em ainda outras modalidades da presente descrição, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno em que se liga especificamente βklotho compreende uma região variável de cadeia pesada CDR1, uma região variável de cadeia pesada CDR2, uma região variável de cadeia pesada CDR3, uma região variável de cadeia leve CDR1, uma região variável de cadeia leve CDR2 e uma região variável de cadeia leve CDR3 como definido por IMGT e descrito na Tabela 1.

[00221] Em certas modalidades, a presente descrição inclui anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a β-klotho como descrito na Tabela 1, por exemplo, anticorpo NGV005 ou NGV006. Em uma modalidade preferida, o anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho e ativa o complexo do receptor FGF21 é Fab NGV005 ou NGV006.

[00222] Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFRIc^-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

(ii) uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

(iii) uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

(iv) uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a

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84/201 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 31,22 ou 25;

(v) uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e (vi) uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

[00223] Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor de FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

(ii) uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

(iii) uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

(iv) uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31,22 ou 25;

(v) uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e (vi) uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

[00224] Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

(i) uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo

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85/201 a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

(ii) uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

(iii) uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

(iv) uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 31,22 ou 25;

(v) uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e (vi) uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.

[00225] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00226] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo,

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86/201 complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00227] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[00228] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo,

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87/201 complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00229] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

(i) a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; ou (ii) a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de

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88/201

SEQ ID NO: 19, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00230] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFRIc^-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[00231] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFRIc^-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, compreende uma VH compreendendo HCDR1, HCDR2, e HCDR3, e uma VL compreendendo LCDR1, LCDR2, LCDR3, em que:

a HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, a HCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, a HCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, a LCDR1 compreende a sequência de aminoácidos de

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89/201

SEQ ID NO: 25, a LCDR2 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e a LCDR3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00232] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFRIc^-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma VH compreendendo CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e uma VL compreendendo CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00233] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFRIc^-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, compreende uma VH compreendendo CDRs HCDR1, HCDR2 e HCDR3 e uma VL compreendendo CDRs LCDR1, LCDR2 e LCDR3, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende: uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

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90/201

7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

[00234] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFRIc. Em aspectos específicos, o referido anticorpo ou seu fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFR1 c, por exemplo, como determinado por atividade de fosfo-ERK, em, pelo menos, cerca de 10% ou 20%. Em aspectos específicos, o referido anticorpo ou seu fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFR1 c, por exemplo, como determinado por atividade de fosfo-ERK, em, pelo menos, cerca de 30% ou 40%. Em aspectos específicos, o referido anticorpo ou seu fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFR1 c, por exemplo, como determinado por atividade de fosfo-ERK, em, pelo menos, cerca de 50% ou 60%. Em aspectos específicos, o referido anticorpo ou seu fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFR1 c, por exemplo, como determinado por atividade de fosfo-ERK, em, pelo menos, cerca de 70% ou 80%. Em aspectos específicos, o referido anticorpo ou seu fragmento aumenta a atividade de β-klotho e/ou FGFR1 c, por exemplo, como determinado por atividade de fosfo-ERK, em, pelo menos, cerca de 90% ou 95%.

[00235] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo,

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91/201 complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga a uma proteína β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 500 pM ou 450 pM, por exemplo, tal como determinado por ensaios de ligação de BIACORE™. Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga a uma proteína β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 450 pM ou 400 pM, por exemplo, tal como determinado por ensaios de ligação de BIACORE™.

[00236] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, se liga a uma proteína β-klotho humana com uma Kd de menos do que ou igual a 10 pM ou 20 pM, por exemplo, tal como determinado por ensaios de ligação de BIACORE™. [00237] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido epítopo de βklotho compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). [00238] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de

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92/201 ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[00239] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno protege um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 de β-klotho humana (SEQ ID NO:52), como determinado por troca de hidrogênio-deutério (HDx).

[00240] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno protege um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[00241] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o anticorpo ou seu fragmento não entra em contato com os resíduos 701 (Tyr) ou 703 (Arg) de β-klotho (SEQ ID NO: 52).

[00242] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo

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93/201 isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana, por exemplo, com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[00243] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana, por exemplo, com uma EC50 de menos do que ou igual a 100 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[00244] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana, por exemplo, com uma EC50 de menos do que ou igual a 40 nM ou 30 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[00245] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo,

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94/201 complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1c_β-klotho humana, por exemplo, com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, como medido por ensaios celulares pERK, e em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno não é capaz de ativar um complexo receptor FGFR2c^-klotho, um complexo receptor FGFR3c^-klotho, e/ou complexo receptor FGFR4β-klotho.

[00246] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1c_β-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 50 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[00247] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo do receptor de FGF21, por exemplo, complexo receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é capaz de ativar o complexo receptor FGFR1c_β-klotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 40 nM ou 30 nM, como medido por ensaios celulares pERK.

[00248] Em aspectos específicos, é aqui fornecido um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo monoclonal) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho e induz a atividade de um complexo receptor FGF21, por exemplo, complexo

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95/201 receptor FGFR1 ο-β-klotho, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno é capaz de ativar o complexo receptor ΕΟΕΡ1ο_βklotho de macaco cinomolgo com uma EC50 de menos do que ou igual a 20 nM, como medido por ensaios celulares pERK. Como aqui utilizado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia leve ou pesada ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são o produto de ou derivadas de uma sequência de linha germinativa particular se as regiões variáveis ou cadeias de comprimento total do anticorpo forem obtidas de um sistema que utiliza genes de imunoglobulina da linha germinativa humana. Tais sistemas incluem a imunização de um camundongo transgênico transportando genes de imunoglobulina humana com o antigeno de interesse ou o rastreamento de uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana apresentada em fago com o antigeno de interesse. Um anticorpo humano, que é o produto de ou derivado a partir de uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana, pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácidos do anticorpo humano com as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas da linha germinativa humana e da seleção da sequência de imunoglobulina da linha germinativa humana que está mais próxima em sequência (isto é, maior % de identidade) com a sequência do anticorpo humano.

[00249] Um anticorpo humano que é o produto de ou derivado a partir de uma sequência de imunoglobulina de linha germinativa humana em particular pode conter diferenças de aminoácidos, em comparação com a sequência de linha germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas de ocorrência natural ou introdução intencional de mutações dirigidas a sítio. No entanto, nas regiões de estrutura principal de VH ou VL, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90% idêntico na sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos codificada por um gene de

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96/201 imunoglobulina da linha germinativa humana e contém os resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando em comparação com as sequências de aminoácidos de imunoglobulina da linha germinativa de outras espécies (por exemplo, sequências da linha germinativa de murinos). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou, pelo menos, 95% ou mesmo pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa.

[00250] Tipicamente, um anticorpo humano recombinante exibirá não mais do que 10 diferenças de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa humana nas regiões de estrutura principal de VH ou VL. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir não mais que 5, ou mesmo não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido da sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linha germinativa. Exemplos de genes de imunoglobulina da linha germinativa humana incluem, mas não estão limitados aos fragmentos da linha germinativa de domínio variável descritos abaixo, bem como DP47 e DPK9.

Anticorpos homólogos [00251] Em ainda outra modalidade, a presente descrição fornece um anticorpo, ou um seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende as sequências de aminoácidos que são homólogas às sequências descritas na Tabela 1, e o anticorpo liga-se a uma proteína β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo), e retém as propriedades funcionais desejadas (por exemplo, ativando ou aumentando a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc e/ou uma ou mais atividades de FGF21) daqueles anticorpos descritos na Tabela 1.

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97/201 [00252] Por exemplo, a presente descrição fornece um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc), ou um seu fragmento de ligação ao antigeno funcional, que compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32; em que o anticorpo se liga especificamente a βklotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo) e induz atividade de β-klotho, e em que o domínio variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57. Em certos aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por Kabat, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por Chothia, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1, respectivamente. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por Combinado, por exemplo tal como apresentado na

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Tabela 1, respectivamente. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por IMGT, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1, respectivamente.

[00253] Por exemplo, a presente descrição fornece um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc), ou um seu fragmento de ligação ao antígeno funcional, que compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, em que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15; o domínio variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 26 ou 32; em que o anticorpo se liga especificamente a βklotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo) e em que o domínio variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57. Em certos aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por Kabat, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por

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Chothia, por exemplo, tal como apresentado na Tabela 1. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por Combinado, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1. Em certos outros aspectos da presente descrição as sequências de cadeia pesada e leve compreendem ainda as sequências HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tal como definido por IMGT, por exemplo tal como apresentado na Tabela 1.

[00254] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências estabelecidas na Tabela 1, em que o domínio variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto para uma substituição de aminoácido em não mais do que 1,2, 3, 4 ou 5 posições de aminoácidos. Um anticorpo que tem regiões VH e VL com elevada identidade (isto é, 80% ou mais) para as regiões VH e VL daquelas descritas na Tabela 1 pode ser obtido através de mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácidos nucleicos que codificam as SEQ ID NOs: 10, 30, 50 ou 70 e SEQ ID NOs: 20, 40, 60 ou 80, respectivamente, seguido de teste do anticorpo alterado codificado para função retida utilizando os ensaios funcionais aqui descritos, em que o domínio variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43

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100/201 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreendem uma sequência de aminoácidos apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.

[00255] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos de cadeia pesada de comprimento total e/ou sequências de aminoácidos de cadeia leve de comprimento total podem ser 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas na Tabela 1, em que a cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 56, 59 ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62. Um anticorpo tendo uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total tendo uma identidade elevada (ou seja, 80% ou mais) para a cadeia pesada de comprimento total de SEQ ID NO: 17, e cadeia leve de comprimento total de SEQ ID NO: 28 ou 34, podem ser obtidos por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam esses polipeptídeos, seguida por teste do anticorpo alterado codificado para a função retida utilizando os ensaios funcionais aqui descritos, em que cadeia não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 56, 59, ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62. Um anticorpo tendo uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total tendo uma identidade elevada (ou seja, 80% ou mais) para a cadeia pesada de comprimento total de SEQ ID NO: 17, e cadeia leve de comprimento

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101/201 total de SEQ ID NO: 28 ou 34, podem ser obtidos por mutagênese (por exemplo, mutagênese sítio-dirigida ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam esses polipeptídeos, seguida por teste do anticorpo alterado codificado para a função retida utilizando os ensaios funcionais aqui descritos, em que cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 56, 59, ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62. [00256] Em outras modalidades, as sequências de nucleotídeos de cadeia pesada de comprimento total e/ou sequências de nucleotídeos de cadeia leve de comprimento total podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas na Tabela 1, em que a cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 56, 59, ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62.

[00257] Em outras modalidades, sequências de nucleotídeos de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou sequências de nucleotídeos de regiões variáveis de cadeia leve podem ser 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências apresentadas na Tabela 1, em que a cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45, 56, 59, ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62.

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102/201 [00258] Como aqui utilizado, a identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas sequências (ou seja, identidade % é igual ao número de posições idênticas/número total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas e o comprimento de cada lacuna, que precisa ser introduzido para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação das sequências e a determinação da identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitativos abaixo.

[00259] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteína da presente descrição podem ainda ser utilizadas como uma sequência de pesquisa para realizar uma pesquisa contra bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Por exemplo, tais pesquisas podem ser realizadas usando o programa BLAST (versão 2.0) de Altschul, etal., 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10.

Anticorpos com Modificações Conservativas [00260] Em certas modalidades, um anticorpo da presente descrição tem uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais destas sequências de CDR especificaram sequências de aminoácidos com base nos anticorpos aqui descritos ou suas modificações conservativas, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos de ligação a β-klotho da presente descrição.

[00261] Consequentemente, a presente descrição fornece um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc), ou seu fragmento de ligação ao antigeno, que consiste em uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e

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CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3, em que: as sequências de aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR1 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19 e 31 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR2 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 20 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR3 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, e suas modificações conservativas; e o anticorpo ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam especificamente a β-klotho.

[00262] Consequentemente, a presente descrição fornece um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc), ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que consiste em uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3, em que: as sequências de aminoácidos de CDR1 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 9, 10 e 12 e suas modificações conservativas; as sequências de aminoácidos de CDR2 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que

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104/201 consiste em SEQ ID NO: 7, 11 e 13 e suas modificações conservatives; as sequências de aminoácidos de CDR3 da região variável de cadeia pesada são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 8 e 14 e suas modificações conservatives; as sequências de aminoácidos de CDR1 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19, 31,22 e 25 e suas modificações conservatives; as sequências de aminoácidos de CDR2 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 20 e 23 e suas modificações conservatives; as sequências de aminoácidos de CDR3 das regiões variáveis de cadeia leve são selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 21 ou 24, e suas modificações conservatives; e o anticorpo ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam especificamente a β-klotho.

[00263] Em um aspecto, a presente descrição proporciona um anticorpo isolado otimizado para a expressão em uma célula de mamífero que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia pesada tem sequências de aminoácidos selecionados dentre o grupo de SEQ ID NO: 15 e suas modificações conservatives; e a cadeia leve de comprimento total tem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 26 e 32, e suas modificações conservatives; e o anticorpo liga-se especificamente a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo), e em que a região variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.

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105/201 [00264] Em outras modalidades, o anticorpo da presente descrição é otimizado para a expressão em uma célula de mamífero tem uma sequência de cadeia pesada de comprimento total e uma sequência de cadeia leve de comprimento total, em que uma ou mais destas sequências especificou sequências de aminoácidos com base nos anticorpos aqui descritos ou suas modificações conservativas, e em que os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas de anticorpos de ligação a β-klotho da presente descrição. Consequentemente, a presente descrição proporciona um anticorpo isolado otimizado para a expressão em uma célula de mamífero que consiste em uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que a cadeia pesada de comprimento total tem sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo de SEQ ID NO: 17 e suas modificações conservativas; e a cadeia leve de comprimento total tem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo de SEQ ID NOs: 28 e 34, e suas modificações conservativas; e o anticorpo liga-se especificamente a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana e de macaco cinomolgo), e em que a cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, 56, 59, ou 61, e a cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, 58, 60 ou 62.

Anticorpos que se ligam ao(s) mesmo(s) epítopo(s) ou que compete(m) pela ligação ao(s) mesmo(s) epítopo(s) [00265] A presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo do receptor FGFR1 ο/β-klotho) que se ligam ao mesmo epítopo que os anticorpos de ligação a β-klotho descritos na Tabela 1 (por exemplo, NQV005 ou NQV006). Em um aspecto particular, tais anticorpos e

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106/201 fragmentos de ligação ao antígeno são capazes de aumentar a atividade de β-klotho e FGFRIc. Anticorpos adicionais, por conseguinte, podem ser identificados com base na sua capacidade para competirem (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação de, de uma maneira estatisticamente significativa) com outros anticorpos da presente descrição em ensaios de ligação a β-Klotho (tais como os descritos nos Exemplos). A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de anticorpos da presente descrição para uma proteína β-klotho demonstra que o anticorpo de teste pode competir com o anticorpo para a ligação a β-klotho; tal anticorpo pode, de acordo com a teoria não limitativa, ligar-se ao mesmo ou a um epítopo relacionado (por exemplo, estruturalmente similar ou espacialmente proximal) na proteína β-klotho, como o anticorpo com o qual compete. Em uma determinada modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em β-klotho como os anticorpos da presente descrição é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como aqui descrito. Como aqui utilizado, um anticorpo compete pela ligação quando o anticorpo competidor inibe a ligação a β-klotho de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da presente descrição em mais de 50% (por exemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) na presença de uma concentração equimolar de anticorpo competidor. Em uma determinada modalidade, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em β-klotho como os anticorpos da presente descrição é um anticorpo monoclonal humanizado. Tais anticorpos monoclonais humanizados podem ser preparados e isolados como aqui descrito.

[00266] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que se ligam ao mesmo epítopo como o anticorpo de ligação a β-klotho NOV005 ou

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NOV006.

[00267] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que se ligam ao mesmo epítopo como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.

[00268] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que se ligam ao mesmo epítopo como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

[00269] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[00270] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que se ligam a um epítopo sobreposto como o anticorpo de ligação a β-klotho NQV005 ou NQV006.

[00271] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a

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108/201 atividade de um complexo receptor FGFR1c/p-klotho) que se ligam a um epítopo sobreposto como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.

[00272] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFRIc^-klotho) que se ligam a um epítopo sobreposto como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

[00273] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFRIc^-klotho) que se ligam a um epítopo sobreposto como um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

[00274] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um epítopo de β-klotho, em que o referido o referido epítopo compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO: 52). Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade

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109/201 de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho, em que o referido epítopo compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 536-550 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho, em que o referido epítopo compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 834-857 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de βklotho, em que o referido epítopo compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[00275] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de β-klotho, em que o referido epítopo compreende um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52). Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de βklotho, em que o referido epítopo compreende dois ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52). Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou

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110/201 seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de βklotho, em que o referido epítopo compreende três ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52). Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de βklotho, em que o referido epítopo compreende aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52). Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um epítopo de βklotho, em que o referido epítopo compreende, pelo menos, um resíduo de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de aminoácidos: 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52).

[00276] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um ou mais epítopos de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a um ou mais epítopos de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 696-700 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por

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111/201 exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um ou mais epítopos de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[00277] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a um ou mais epítopos (por exemplo, epítopos descontínuos) de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700, e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um certo aspecto, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFR1 c) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a dois ou mais epítopos (por exemplo, epítopos descontínuos) de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700, e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a três ou mais epítopos (por exemplo, epítopos descontínuos) de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700, e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a três ou mais epítopos (por exemplo, epítopos

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112/201 descontínuos) de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700, e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52). Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFR1 c) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a três ou mais epítopos (por exemplo, epítopos descontínuos) de β-klotho, em que os referidos epítopos compreendem resíduos de aminoácidos de cada um dos seguintes intervalos de resíduos de aminoácidos: 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52).

[00278] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que protege, conforme determinado pela troca de hidrogênio-deutério (HDx), um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos seguintes peptídeos de β-klotho (SEQ ID NO: 52): resíduos de aminoácidos 245-266, 246-265, 343-349, 344-349, 421-429, 488-498, 509-524, 536-550, 568-576, 646-669, 646-670, 696-700, 773-804, 834857, e 959-986.

[00279] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que protege, conforme determinado pela troca de hidrogênio-deutério (HDx), os seguintes peptídeos de βklotho (SEQ ID NO: 52): resíduos de aminoácidos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986.

[00280] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que protege, conforme determinado

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113/201 pela troca de hidrogênio-deutério (HDx), os seguintes peptídeos de βklotho (SEQ ID NO: 52): resíduos de aminoácidos 245-266, 246-265, 343-349, 344-349, 421-429, 488-498, 509-524, 536-550, 568-576, 646669, 646-670, 696-700, 773-804, 834-857, e 959-986.

[00281] Em certos aspectos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que aumenta a atividade de β-klotho e FGFRIc, em que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno não entra em contato com os resíduos 701 (Tyr) ou 703 (Arg) de β-klotho humana (SEQ ID NO: 52).

[00282] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO: 52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogêniodeutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a βklotho, em que o referido anticorpo (por exemplo, um anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFRIc/βklotho) ou seu fragmento de ligação ao antígeno, entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 536-550 da sequência de βklotho (SEQ ID NO: 52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto particular, é aqui

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114/201 proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a βklotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 834-857 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento.

[00283] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com dois ou mais

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115/201 aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogêniodeutério ou mutagênese de varrimento. Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a βklotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com três ou mais aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com aminoácidos dos resíduos 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em aspectos específicos, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno entra em contato com, pelo menos, um resíduo de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de aminoácidos: 246-265, 536-550, 834-857 e 959-986 da sequência de βklotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, como determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou

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116/201 mutagênese de varrimento.

[00284] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogêniodeutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a βklotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 696-700 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais aminoácidos dos resíduos 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento.

[00285] Em um aspecto particular, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o

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117/201 referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco ou mais aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um certo aspecto, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais dos resíduos de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de aminoácidos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo βklotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com um ou mais dos resíduos de aminoácidos de cada uma das seguintes extensões de resíduos de aminoácidos 646-670, 696-700 e 646-689 da sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogênio-deutério ou mutagênese de varrimento. Em um aspecto específico, é aqui proporcionado um anticorpo isolado (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo β-klotho/receptor FGFRIc) ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga a β-klotho, em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno entra em contato com aminoácidos dos resíduos 646-670, 696-700 e 646-689 da

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118/201 sequência de β-klotho (SEQ ID NO:52), por exemplo, conforme determinado por cristalografia de raios X, ensaio de troca de hidrogêniodeutério ou mutagênese de varrimento.

[00286] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que competem com o anticorpo NQV005 ou NQV006 pela ligação a β-klotho.

[00287] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que competem pela ligação a β-klotho com um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.

[00288] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que competem pela ligação a β-klotho com um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

[00289] Em um aspecto particular, a presente descrição fornece anticorpos (por exemplo, anticorpo capaz de ativar ou aumentar a atividade de um complexo receptor FGFR1 ο/β-klotho) que competem pela ligação a β-klotho com um anticorpo de ligação a β-klotho, que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende a sequência de

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119/201 aminoácidos de SEQ ID NO: 32.

Anticorpos Modificados e Manipulados [00290] Um anticorpo (por exemplo, NQV005 ou NQV006) da presente descrição pode ainda ser preparado utilizando um anticorpo que possui uma ou mais sequências VH e/ou VL aqui mostradas como material de partida para manipular um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter as propriedades alteradas do anticorpo inicial. Um anticorpo pode ser manipulado através da modificação de um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo dentro de uma ou mais regiões de CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura principal. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser manipulado através da modificação de resíduos dentro da(s) região(ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo.

[00291] Um tipo de manipulação da região variável que pode ser realizada é o enxerto de CDR. Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que se situam nas seis regiões determinantes de cadeia pesada e leve de complementaridade (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversas entre os anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos de ocorrência natural específicos construindo vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertado em sequências de estrutura principal de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. etaL, 1998 Nature 332:323327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989

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Proc. Natl. Acad., EUA 86:10029-10033; Patente US N^Q 5,225,539 para Winter, e Patente US N^Q 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 de Queen etal.).

[00292] Consequentemente, outra modalidade da presente descrição refere-se a um anticorpo isolado, ou um seu fragmento de ligação ao antigeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de HCDR1 apresentadas na Tabela 1; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de HCDR2 apresentadas na Tabela 1; sequências de CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de HCDR3 apresentadas na tabela 1; e uma região variável de cadeia leve tendo sequências de CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de LCDR1 apresentadas na Tabela 1; sequências de CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de LCDR2 apresentadas na Tabela 1; e sequências de CDR3 que consistem em uma sequência de aminoácidos selecionada dentre as sequências de LCDR3 apresentadas na Tabela 1. Assim, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL de anticorpos monoclonais, mas podem conter sequências de estrutura principal diferentes a partir destes anticorpos.

[00293] Consequentemente, outra modalidade da presente descrição refere-se a um anticorpo isolado, ou um seu fragmento de ligação ao antigeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6 e 9; sequências de CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; sequências de CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e

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121/201 uma região variável de cadeia leve tendo sequências de CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 19 e 31; sequências de CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20; e sequências de CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Assim, tais anticorpos contêm as sequências de CDR de VH e VL de anticorpos monoclonais, mas podem conter sequências de estrutura principal diferentes a partir destes anticorpos. [00294] Tais sequências de estrutura principal podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinativa. Por exemplo, sequências de DNA da linha germinativa para genes de regiões variáveis de cadeias pesadas e leves humanas podem ser encontradas no banco de dados de sequências da linha germinativa humana VBase (disponível na internet em mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Department of Health and Human Services, Publicação NIH N^Q 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836; o conteúdo de cada urn deles é expressamente incorporado aqui por referência.

[00295] Um exemplo de sequências de estrutura principal para utilização nos anticorpos da presente descrição são aqueles que são estruturalmente semelhantes às sequências de estrutura principal utilizadas por anticorpos selecionados da presente descrição, por exemplo, sequências de consenso e/ou sequências de estrutura principal utilizadas pelos anticorpos monoclonais da presente descrição. As sequências de CDR1,2 e 3 de VH, e as sequências de CDR1,2 e 3 de VL, podem ser enxertadas em regiões de estrutura principal que possuem a sequência idêntica àquela encontrada no gene da

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122/201 imunoglobulina da linha germinativa, a partir da qual a sequência de estrutura principal deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões de estrutura principal que contenham uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linha germinativa. Por exemplo, verificou-se que em certos casos é benéfico mutar resíduos dentro das regiões de estrutura principal para manter ou aumentar a capacidade de ligação ao antigeno do anticorpo (ver, por exemplo, as Patentes US N^Q 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 e 6,180,370 de Queen et al.). As estruturas principais que podem ser utilizadas como moldes nos quais se constroem os anticorpos e os fragmentos de ligação ao antigeno, aqui descritos, incluem, mas não estão limitadas a VH1A, VH1B, VH3, Vk1, VI2 e Vk2. Estruturas principais adicionais são conhecidas na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, no banco de dados vBase na internet em vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1.

[00296] Consequentemente, uma modalidade da presente descrição refere-se a anticorpos de ligação a β-klotho isolados, ou seus fragmentos de ligação a antigeno, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos na região de estrutura principal de tais sequências, e que compreende ainda uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 26 ou 32, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos na região de estrutura principal de tais sequências, em que a região variável de cadeia pesada não compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43

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123/201 ou 55 e a região variável de cadeia leve não compreende uma sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve apresentada na Tabela 2, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.

[00297] Outro tipo de modificação de região variável é mutar os resíduos de aminoácidos dentro de regiões de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de VH e/ou VL, para melhorar, assim, uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse, conhecido como maturação de afinidade. Mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação(ões) e o efeito na ligação do anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo como aqui descrito e fornecido nos Exemplos. Modificações conservatives (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região de CDR são alterados.

[00298] Certos motivos da sequência de aminoácidos são conhecidos por sofrerem modificação pós-tradução (PTM) tal como glicosilação (isto é, NxS/T, x qualquer exceto P), oxidação de cisteínas livres, desamidação (por exemplo, NG) ou isomerização (por exemplo, DG). Se estiverem presentes nas regiões de CDR, esses motivos são idealmente removidos por mutagênese sítio-dirigida, a fim de aumentar a homogeneidade do produto.

[00299] O processo de maturação por afinidade é bem descrito na técnica. Entre os muitos sistemas de exposição, a apresentação de fagos (Smith GP (1985) Science 228: 1315-1317) e apresentação em células eucarióticas, tais como levedura (Boder ET e Wittrup KD (1997) Nature Biotechnology 15: 553-557) parecem ser os sistemas mais comumente utilizados para selecionar a interação anticorpo-antígeno.

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As vantagens desses sistemas de apresentação são que eles são adequados para uma ampla gama de antígenos e que o rigor da seleção pode ser facilmente ajustado. Na apresentação de fagos, fragmentos scFv ou Fab podem ser exibidos e em IgG de comprimento total de apresentação de levedura, adicionalmente. Esses métodos comumente aplicados permitem a seleção de variantes de anticorpos desejadas a partir de bibliotecas maiores com diversidades de mais de 10E7. Bibliotecas com menor diversidade, por exemplo, 10E3, podem ser rastreadas por microexpressão e ELISA.

[00300] Bibliotecas de variantes de anticorpo não direcionadas ou aleatórias podem ser geradas, por exemplo, por PCR propensa a erros (Cadwell RC e Joyce GF (1994) Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140) e fornecer uma abordagem muito simples, mas por vezes limitada. Outra estratégia é a diversificação dirigida por CDR de um candidato a anticorpo. Uma ou mais posições em uma ou mais CDRs podem ser especificamente dirigidas utilizando, por exemplo, oligos degenerados (Thompson J et al. (1996) J.Mol.Biol. 256: 77-88) mutagênese com trinucleotídeos (TRIM) (Kayushin AL et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755) ou qualquer outra abordagem conhecida na técnica.

[00301] Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona anticorpos isolados de ligação a β-klotho, ou seus fragmentos de ligação a antigeno, que consiste em uma região variável de cadeia pesada tendo uma região de CDR1 de VH que consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que possui a SEQ ID NO: 6 e 9 ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 6 e 9; uma região de CDR2 de VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três,

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125/201 quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 7; uma região de CDR3 de VH tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 8; uma região de CDR1 de VL tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 19 ou 31 ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 19 ou 31; uma região de CDR2 de VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com a SEQ ID NO: 20; e uma região de CDR3 de VL tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de aminoácidos tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NO: 21.

Enxertando Domínios de Ligação ao Antígeno em Estrutura principal ou Moldes Alternativos [00302] Pode ser empregue uma grande variedade de estrutura principal ou moldes de anticorpo/imunoglobulina, desde que o polipeptídeo resultante inclua, pelo menos, uma região de ligação que se ligue especificamente a β-klotho. Tais estruturas principal ou moldes incluem os 5 principais idiotipos de imunoglobulinas humanas, ou seus fragmentos, e incluem imunoglobulinas de outras espécies animais, de preferência tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeias pesadas únicas, tais como os identificados em camelídeos, são de particular interesse neste aspecto. Novas estruturas principais, moldes e fragmentos continuam a ser descobertos e desenvolvidos pelos

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126/201 peritos na técnica.

[00303] Em um aspecto, a presente descrição refere-se à geração de anticorpos baseados em não imunoglobulinas utilizando moldes de não imunoglobulinas nos quais CDRs da presente descrição podem ser enxertadas. Estrutura principal e moldes de não imunoglobulina conhecidos ou futuros podem ser empregues, desde que compreendam uma região de ligação específica para a proteína alvo de β-klotho. Estrutura principal ou moldes conhecidos de não imunoglobulinas incluem, mas não estão limitados a, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique, Suíça), domínios de anticorpos (Domantis, Ltd., Cambridge, MA e Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), pequenos imuno-farmacêuticos modulares (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gamacristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).

[00304] Os moldes de fibronectina baseiam-se no domínio da fibronectina do tipo III (por exemplo, o décimo módulo da fibronectina do tipo III (domínio 10 Fn3)). O domínio da fibronectina do tipo III tern 7 ou 8 fitas beta que estão distribuídas entre duas folhas beta, que se empacotam umas contra as outras para formar o núcleo da proteína, e contendo ainda alças (análogas a CDRs) que ligam as fitas beta umas às outras e são expostas a solventes. Há pelo menos três dessas alças em cada borda da sanduíche de folha beta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das cadeias beta (ver US 6,818,418). Estes moldes baseados em fibronectina não são uma imunoglobulina, embora a dobra global esteja intimamente relacionada com a do fragmento de anticorpo funcional mais pequeno, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento de antigeno total na IgG de camelo e lama. Devido a esta estrutura, o

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127/201 anticorpo de não imunoglobulina imita propriedades de ligação ao antígeno que são similares em natureza e afinidade às de anticorpos. Estes moldes podem ser utilizados em uma estratégia de aleatorização e de embaralhamento de alças in vitro que é semelhante ao processo de maturação por afinidade de anticorpos in vivo. Estas moléculas à base de fibronectina podem ser utilizadas como moldes onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas por CDRs da presente descrição utilizando técnicas de clonagem convencionais.

[00305] A tecnologia da anquirina baseia-se na utilização de proteínas com módulos de repetição derivados da anquirina como moldes para suportar regiões variáveis que podem ser utilizadas para ligação a diferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos que consiste em duas hélices α antiparalelas e uma volta β. A ligação das regiões variáveis é otimizada principalmente pelo uso de apresentação de ribossomo.

[00306] Avímeros são derivados de proteínas contendo o domínio A natural, tal como LRP-1. Estes domínios são utilizados por natureza para interações proteína-proteína e em mais de 250 proteínas humanas são estruturalmente baseados em domínios A. Os Avímeros consistem em vários monômeros de domínio A diferentes (2-10) ligados através de ligantes de aminoácidos. Avímeros podem ser criados para poderem ligar-se ao antígeno-alvo utilizando a metodologia descrita, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US N^Q 20040175756; 20050053973; 20050048512; e 20060008844.

[00307] Os ligantes de afinidade de aficorpos são pequenas proteínas simples compostas por um feixe de três hélices baseado no molde de um dos domínios de ligação IgG da Proteína A. A Proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Este domínio de molde consiste em 58 aminoácidos, dos quais 13 são aleatorizados para gerar bibliotecas de aficorpos com um grande

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128/201 número de variantes de ligantes (ver, por exemplo, US 5831012). As moléculas de aficorpos que imitam anticorpos têm um peso molecular de 6 kDa, comparado com o peso molecular dos anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar do seu pequeno tamanho, o sítio de ligação das moléculas de aficorpos é semelhante ao de um anticorpo.

[00308] Anticalinas são produtos desenvolvidos pela empresa Pieris ProteoLab AG. São derivados de lipocalinas, um grupo generalizado de proteínas pequenas e robustas que geralmente estão envolvidas no transporte ou armazenamento fisiológico de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líquidos corporais. A arquitetura da proteína é uma reminiscência de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis no topo de uma estrutura principal rígida. No entanto, em contraste com os anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, as lipocalinas são compostas por uma cadeia polipeptídica única com 160 a 180 resíduos de aminoácidos, sendo apenas marginalmente maior do que um único domínio de imunoglobulina. O conjunto de quatro alças, que compõe a bolsa de ligação, mostra uma plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias laterais. O sítio de ligação pode, assim, ser remodelado em um processo proprietário, a fim de reconhecer moléculas alvo prescritas de forma diferente, com elevada afinidade e especificidade. Uma proteína da família da lipocalina, a proteína de ligação à bilina (BBP) de Pieris Brassicae tem sido usada para desenvolver anticalinas por mutagenização do conjunto de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente descrevendo anticalinas encontra-se na Publicação PCT N^Q WO 199916873.

[00309] Moléculas de afilina são pequenas proteínas de não imunoglobulinas que são concebidas para afinidades específicas em relação a proteínas e moléculas pequenas. Novas moléculas de afilina podem ser muito rapidamente selecionadas a partir de duas bibliotecas,

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129/201 cada uma das quais é baseada em uma proteína molde derivada humana diferente. As moléculas de afilina não apresentam qualquer homologia estrutural às proteínas de imunoglobulinas. Atualmente, empregam-se dois moldes de afilina, um dos quais é gama cristalina, uma proteína de lente ocular estrutural humana e o outro são proteínas da superfamília de ubiquitina. Ambos os moldes humanos são muito pequenos, apresentam alta estabilidade térmica e são quase resistentes a mudanças de pH e agentes desnaturantes. Esta alta estabilidade é devida principalmente à estrutura da folha beta expandida das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas de gama cristalina são descritos em W0200104144 e exemplos de proteínas semelhantes a ubiquitina são descritos em W02004106368.

[00310] Os miméticos de epítopo de proteína (PEM) são moléculas semelhantes a peptídeos cíclicos, de tamanho médio (PM de 1-2 kDa) que imitam estruturas secundárias de grampo-beta de proteínas, as principais estruturas secundárias envolvidas nas interações proteínaproteína.

[00311] A presente descrição proporciona anticorpos totalmente humanos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho. Em certos aspectos, em comparação com os anticorpos quiméricos ou humanizados, os anticorpos de ligação a β-klotho humanas da presente descrição reduziram ainda mais a antigenicidade quando administrados a seres humanos.

Anticorpos de camelídeos [00312] Proteínas de anticorpos obtidas de membros da família de camelos e dromedários (Camelus bactrianus e Calelus dromaderius), incluindo novos membros do mundo, como espécies de lama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna) foram caracterizadas quanto ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG desta família de mamíferos como

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130/201 encontrados na natureza não possuem cadeias leves, e são assim estruturalmente distintos da estrutura quaternária típica de quatro cadeias, tendo duas cadeias pesadas e duas leves, para anticorpos de outros animais. Ver PCT/EP93/02214 (WO 94/04678 publicado em 3 de março de 1994).

[00313] Uma região do anticorpo camelídeo que é o pequeno domínio variável único identificado como VHH pode ser obtida por manipulação para produzir uma pequena proteína com alta afinidade para um alvo, resultando em uma proteína derivada de anticorpo de baixo peso molecular conhecida como um nanocorpo de camelídeo. Ver Patente US número 5,759,808 emitida a 2 de junho de 1998; ver também Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. etal. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; e Lauwereys, M. etal. 1998 EMBO J 17: 35123520. As bibliotecas manipuladas de anticorpos e fragmentos de anticorpos de camelídeos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, de Ablynx, Ghent, Bélgica. Tal como com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo de camelídeo pode ser alterada de forma recombinante para obter uma sequência que se assemelhe mais a uma sequência humana, por exemplo, o nanocorpo pode ser humanizado. Assim, a baixa antigenicidade natural dos anticorpos de camelídeos para humanos pode ser ainda mais reduzida.

[00314] O nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular de aproximadamente um décimo do da molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma consequência do pequeno tamanho é a capacidade dos nanocorpos de camelídeos se ligarem a sítios antigênicos que são funcionalmente invisíveis a proteínas de anticorpos maiores, isto é, os nanocorpos de

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131/201 camelídeos são úteis como reagentes que detectam antígenos que são de outra forma crípticos usando técnicas imunológicas clássicas e como possíveis agentes terapêuticos. Assim, outra consequência do pequeno tamanho é que um nanocorpo de camelídeo pode inibir como resultado da ligação a um sítio específico em um sulco ou fenda estreita de uma proteína alvo e, portanto, pode servir em uma capacidade que mais se assemelha à função de um fármaco de baixo peso molecular clássico do que a de um anticorpo clássico.

[00315] O baixo peso molecular e o tamanho compacto resultam ainda em nanocorpos de camelídeos sendo extremamente termoestáveis, estáveis a pH extremo e à digestão proteolítica e pouco antigênicos. Outra consequência é que os nanocorpos de camelídeos se movem prontamente do sistema circulatório para os tecidos e até atravessam a barreira hematoencefálica e podem tratar distúrbios que afetam o tecido nervoso. Os nanocorpos podem facilitar ainda mais o transporte de fármacos através da barreira hematoencefálica. Ver pedido de patente US 20040161738 publicado em 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas com a baixa antigenicidade para os seres humanos indicam um grande potencial terapêutico. Além disso, estas moléculas podem ser completamente expressas em células procarióticas, tais como E. coli e são expressas como proteínas de fusão com bacteriófagos e são funcionais.

[00316] Consequentemente, uma característica da presente descrição é um anticorpo ou nanocorpo de camelídeo com afinidade específica para a β-klotho (por exemplo, β-klotho humana). Em certas modalidades aqui, o anticorpo ou nanocorpo de camelídeo é produzido naturalmente no animal camelídeo, ou seja, é produzido pelo camelídeo após imunização com β-klotho ou seu fragmento peptídico, utilizando técnicas descritas aqui para outros anticorpos. Alternativamente, os nanocorpos de camelídeos de ligação a β-klotho são manipulados, ou

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132/201 seja, produzidos por seleção de uma biblioteca de fagos apresentando proteínas de nanocorpos de camelídeos mutagenizadas apropriadamente utilizando procedimentos de panning com β-klotho como um alvo como descrito nos exemplos aqui. Os nanocorpos manipulados podem ainda ser personalizados por manipulação genética para ter uma meia-vida em um sujeito receptor de 45 minutos a duas semanas. Em uma modalidade específica, o anticorpo ou nanocorpo de camelídeo é obtido enxertando as sequências de CDRs de cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da presente descrição em sequências de estrutura principal de anticorpo de domínio único ou de nanocorpo, como descrito por exemplo em PCT/EP93/02214.

Moléculas Biespecíficas e Anticorpos Multivalentes [00317] Em outro aspecto, a presente descrição apresenta moléculas biespecíficas ou multiespecíficas compreendendo um anticorpo de ligação a β-kotho, ou seu fragmento, da presente descrição, por exemplo, anticorpo NOV005 ou NOV006. Um anticorpo da presente descrição, ou suas regiões de ligação ao antígeno, pode ser derivado ou ligado à outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligando para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas-alvo. O anticorpo da presente descrição pode na verdade ser derivado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais do que dois sítios de ligação diferentes e/ou moléculas alvo; tais moléculas multiespecíficas também têm a intenção de serem abrangidas pelo termo molécula biespecífica tal como aqui utilizado. Para criar uma molécula biespecífica da presente descrição, um anticorpo da presente descrição pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não

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133/201 covalente ou outra) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou ligação mimética, tal que resulta uma molécula biespecífica.

[00318] Consequentemente, a presente descrição inclui moléculas biespecíficas compreendendo, pelo menos, uma primeira especificidade de ligação para β-klotho e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo alvo é outro epítopo de β-klotho diferente do primeiro epítopo alvo.

[00319] Além disso, para a presente descrição, em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, em adição ao primeiro e segundo epítopo alvo.

[00320] Em um aspecto, as moléculas biespecíficas da presente descrição compreendem, como especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, ou seu fragmento de anticorpo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou uma cadeia única. O anticorpo pode também ser uma cadeia leve ou dímero de cadeia pesada, ou qualquer seu fragmento mínimo, tal como um Fv ou um construto de cadeia única como descrito em Ladner et al. Patente US N^Q 4,946,778.

[00321] Diacorpos são moléculas bivalentes, biespecíficas, nas quais os domínios VH e VL são expressos em uma cadeia polipeptídica única, conectados por um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios VH e VL emparelham com domínios complementares de outra cadeia, criando assim dois sítios de ligação ao antígeno (ver, por exemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Os diacorpos podem ser produzidos expressando duas cadeias polipeptídicas com a estrutura VHA-VLB e VHB-VLA (configuração VH-VL), ou VLA-VHB e VLB-VHA (configuração VL-VH) dentro da mesma célula. A maioria deles pode ser

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134/201 expressa em forma solúvel em bactérias. Diacorpos de cadeia única (scDb) são produzidos por ligação das duas cadeias polipeptídicas formadoras de diacorpos com um ligante de aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos (ver Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb pode ser expresso em bactérias na forma monomérica ativa e solúvel (ver Holliger e Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45 (34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1 ):21-36; Pluckthun e Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Um diacorpo pode ser fundido a Fc para gerar urn didiacorpo (ver Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).

[00322] Outros anticorpos que podem ser empregues nas moléculas biespecíficas da presente descrição são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

[00323] As moléculas biespecíficas podem ser preparadas por conjugação das especificidades de ligação constituintes, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e depois conjugada entre si. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de ligação cruzada pode ser utilizada para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de ligação cruzada incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) e 4-(Nmaleimidometil)ciclo-hexano-1 -carboxilato de sulfossuccinimidila (sulfoSMCC) (ver, por exemplo, Karpovsky etal., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 82:8648). Outros métodos incluem os descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.

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78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação são SATAe sulfo-SMCC, ambos disponíveis na Pierce Chemical Co. (Rockford, IL). [00324] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados por ligação sulfidrila das regiões de dobradiça no terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particular, a região de dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação. [00325] Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou proteína de fusão Fab x ligando. Uma molécula biespecífica da presente descrição pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Os métodos para preparar moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, na Patente US Número 5,260,203; Patente US Número 5,455,030; Patente US Número

4,881,175;	Patente	US	Número	5,132,405;	Patente	US	Número
5,091,513;	Patente	US	Número	5,476,786;	Patente	US	Número
5,013,653;	Patente	US	Número	5,258,498; e	Patente	US	Número

5,482,858.

[00326] A ligação das moléculas biespecíficas aos seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (REA), análise FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio Western Blot. Cada um destes ensaios detecta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular

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136/201 utilizando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.

[00327] Em outro aspecto, a presente descrição proporciona compostos multivalentes compreendendo pelo menos duas porções idênticas ou diferentes de ligação ao antígeno dos anticorpos da presente invenção que se ligam a β-klotho. As porções de ligação ao antígeno podem ser ligadas entre si através de fusão proteica ou ligação covalente ou não covalente. Alternativamente, foram descritos métodos de ligação para as moléculas biespecíficas. Compostos tetravalentes podem ser obtidos, por exemplo, por ligação cruzada de anticorpos dos anticorpos da presente descrição com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da presente descrição, por exemplo, Fc ou a região de dobradiça.

[00328] Os domínios de trimerização são descritos por exemplo em patente Boreana EP 1 012 280B1. Os módulos de pentamerização são descritos por exemplo em PCT/EP97/05897.

Anticorpos com Meia-Vida Prolongada [00329] A presente descrição proporciona anticorpos (por exemplo, NOV005 ou NOV006) que se ligam especificamente a proteína β-klotho que tem uma meia-vida prolongada in vivo.

[00330] Muitos fatores podem afetar a meia-vida de uma proteína in vivo. Para exemplos, filtração renal, o metabolismo no fígado, degradação por enzimas proteolíticas (proteases), e respostas imunogênicas (por exemplo, proteína de neutralização por anticorpos e a absorção por macrófagos e células dendríticas). Pode ser utilizada uma variedade de estratégias para prolongar a meia-vida dos anticorpos da presente descrição. Por exemplo, por ligação química com polietilenoglicol (PEG), reCODE PEG, anticorpo molde, ácido polissiálico (PSA), hidroxietil-amido (HES), ligantes de ligação a albumina, e escudos de carboidratos; por fusão genética para proteínas

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137/201 de ligação a proteínas do soro, tais como albumina, IgG, FcRn, e transferência; por meio de acoplamento (geneticamente ou quimicamente) para outras porções de ligação que se ligam a proteínas do soro, tais como, nanocorpos, Fabs, DARPins, avímeros, aficorpos e anticalinas; por fusão genética para rPEG, albumina, domínio de albumina, proteínas de ligação a albumina, e Fc; ou por incorporação em nano-transportadores, formulações de liberação lenta ou dispositivos médicos.

[00331] Para prolongar a circulação no soro de anticorpos in vivo, moléculas poliméricas inertes, tais como PEG de alto peso molecular, podem ser ligadas aos anticorpos ou a seu fragmento, com ou sem um ligante multifuncional, através da conjugação sítio-específica do PEG ao terminal C ou N dos anticorpos ou via grupos epsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. Para peguilação de um anticorpo, o anticorpo, ou seu fragmento, tipicamente é feito reagir com polietilenoglicol (PEG), tal como um derivado de éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG se ligam ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A peguilação pode ser realizada por uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero análogo reativo solúvel em água). Como aqui utilizado, o termo polietilenoglicol pretende abranger qualquer uma das formas de PEG que foram utilizadas para derivar outras proteínas, tais como (C1C10)alcoxi- mono ou arilóxi-polietilenoglicol ou polietilenoglicolmaleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Derivação de polímeros lineares ou ramificados que resulta em perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação pode ser monitorado de perto por SDS-PAGE e espectrometria de massa para assegurar a conjugação adequada de moléculas de PEG com os anticorpos. O PEG que não reagiu pode ser separado a partir de conjugados de anticorpo-PEG por cromatografia de

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138/201 exclusão de tamanho ou de troca iônica. Os anticorpos derivados de PEG podem ser testados relativamente à atividade de ligação, bem como à eficácia in vivo utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo, por imunoensaios aqui descritos. Os métodos para a peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da presente descrição. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 de Nishimura etal. e EP 0 401 384 de Ishikawa etal.

[00332] Outras tecnologias modificadas de peguilação incluem a reconstituição quimicamente da tecnologia de manipulação direcionada ortogonal (ReCODE PEG), que incorpora cadeias laterais quimicamente especificadas em proteínas biossintéticas por meio de um sistema reconstituído que inclui tRNA sintetase e tRNA. Esta tecnologia permite a incorporação de mais de 30 novos aminoácidos em proteínas biossintéticas em células de E. coli, levedura e mamífero. O tRNA incorpora um aminoácido não nativo em qualquer lugar em que um códon âmbar está posicionado, convertendo o âmbar de um codão de terminação em um que sinaliza a incorporação do aminoácido quimicamente especificado.

[00333] A tecnologia de peguilação recombinante (rPEG) também pode ser usada para a extensão da meia-vida no soro. Esta tecnologia envolve a fusão genética de uma cauda de proteína não estruturada de 300-600 aminoácidos a uma proteína farmacêutica existente. Uma vez que o peso molecular aparente de uma tal cadeia proteica não estruturada é cerca de 15 vezes maior do que o seu peso molecular real, a meia-vida no soro da proteína é grandemente aumentada. Em contraste com a PEGuilação tradicional, que requer conjugação química e re-purificação, o processo de fabricação é grandemente simplificado e o produto é homogêneo.

[00334] A polissialização é outra tecnologia que utiliza o polímero natural de ácido polissiálico (PSA) para prolongar a vida ativa e melhorar

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139/201 a estabilidade de peptídeos e proteínas terapêuticos. O PSA é um polímero de ácido siálico (um açúcar). Quando utilizado para entrega de fármacos proteicos e peptídicos terapêuticos, o ácido polissiálico proporciona um microambiente protetor na conjugação. Isso aumenta a vida ativa da proteína terapêutica na circulação e impede que ela seja reconhecida pelo sistema imunológico. O polímero de PSA é encontrado naturalmente no corpo humano. Foi adotado por certas bactérias que evoluíram ao longo de milhões de anos para revestir suas paredes com ele. Estas bactérias naturalmente polissialiladas foram então capazes, em virtude de mimetismo molecular, de despistar o sistema de defesa do corpo. PSA, tecnologia furtiva final da natureza, pode ser facilmente produzido a partir dessas bactérias em grandes quantidades e com características físicas predeterminadas. O PSA bacteriano é completamente não imunogênico, mesmo quando acoplado a proteínas, por ser quimicamente idêntico ao PSA no corpo humano.

[00335] Outra tecnologia inclui o uso de derivados de hidroxietilamido (HES) ligados a anticorpos. O HES é um polímero natural modificado derivado do amido de milho ceroso e pode ser metabolizado pelas enzimas do corpo. As soluções de HES são geralmente administradas para substituir o volume sanguíneo deficiente e melhorar as propriedades reológicas do sangue. Hesilação de um anticorpo permite o prolongamento da meia-vida na circulação, aumentando a estabilidade da molécula, bem como reduzindo a depuração renal, resultando em um aumento da atividade biológica. Variando diferentes parâmetros, tais como o peso molecular do HES, uma ampla gama de conjugados de anticorpo HES pode ser personalizada.

[00336] Anticorpos tendo uma meia-vida aumentada in vivo também podem ser gerados, introduzindo uma ou mais modificações de aminoácidos (por exemplo, substituições, inserções ou deleções) para

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140/201 um domínio constante de IgG, ou seu fragmento de ligação ao FcRn (de preferência um Fc ou fragmento do domínio Fc de dobradiça). Ver, por exemplo, Publicação Internacional N° WO 98/23289; Publicação Internacional N^Q WO 97/34631; e Patente US N^Q 6,277,375.

[00337] Além disso, os anticorpos podem ser conjugados com albumina (por exemplo, albumina de soro humano; HSA) de modo a tornar o anticorpo ou fragmento de anticorpo mais estável in vivo ou ter uma meia-vida mais longa in vivo. As técnicas são bem conhecidas na técnica, ver, por exemplo, as Publicações Internacionais N^Q WO 93/15199, WO 93/15200 e WO 01/77137; e Patente Européia N^Q EP 413,622. Adicionalmente, no contexto de um anticorpo biespecífico como descrito acima, as especificidades do anticorpo podem ser concebidas de tal modo que um domínio de ligação do anticorpo se liga a FGF21 enquanto um segundo domínio de ligação do anticorpo se liga a albumina no soro, preferencialmente HSA.

[00338] As estratégias para aumentar a meia-vida são especialmente úteis em nanocorpos, ligantes à base de fibronectina e outros anticorpos ou proteínas para os quais é desejada meia-vida in vivo aumentada.

Conjugados de Anticorpo [00339] A presente descrição fornece anticorpos ou seus fragmentos que se ligam especificamente a uma proteína β-klotho recombinantemente fundida ou conjugada quimicamente (incluindo tanto conjugações covalentes e não covalentes) a uma proteína heteróloga ou polipeptídeo (ou seu fragmento, preferencialmente a um polipeptídeo de, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a presente descrição fornece proteínas de fusão compreendendo um fragmento de ligação ao antigeno (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv,

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141/201 fragmento F(ab)2, um domínio VH, um CDR de VH, um domínio VL ou um CDR de VL) de um anticorpo aqui descrito, por exemplo, NOV005 ou NOV006, e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogo. Métodos para fundir ou conjugar proteínas, polipeptídeos ou peptídeos a um anticorpo ou a um fragmento de anticorpo são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patentes US N^Q 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 e 5,112,946; Patentes Européias N^Q EP 307,434 e EP 367,166; Publicações Internacionais N^Q WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; e Vil et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89:11337- 11341.

[00340] Proteínas de fusão adicionais podem ser geradas através de técnicas de embaralhamento de genes, embaralhamento de motivos, embaralhamento de éxons e/ou embaralhamento de códons (coletivamente referido como embaralhamento de DNA). O embaralhamento de DNA pode ser usado para alterar as atividades de anticorpos da presente descrição ou seus fragmentos (por exemplo, anticorpos ou seus fragmentos com afinidades mais elevadas e menores taxas de dissociação). Ver, genericamente, as Patentes US N^Q 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252 e 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, etal., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313 (cada uma destas patentes e pedidos são incorporados aqui por referência na sua totalidade). Anticorpos ou seus fragmentos, ou os anticorpos codificados ou seus fragmentos, podem ser alterados ao serem submetidos a mutagênese aleatória por PCR propensa a erros, inserção aleatória de nucleotídeos ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo codificando um anticorpo ou seu fragmento que se liga especificamente a uma proteína β-klotho pode ser recombinado

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142/201 com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.

[00341] Além disso, os anticorpos ou seus fragmentos podem ser fundidos com sequências marcadoras, tais como um peptídeo para facilitar a purificação. Em modalidades preferenciais, a sequência de aminoácidos marcadores é um peptídeo de hexa-histidina (SEQ ID NO: 64), tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outras, muitas das quais se encontram comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86:821-824, por exemplo, a hexahistidina (SEQ ID NO: 64) proporciona purificação conveniente da proteína de fusão. Outras etiquetas de peptídeos úteis para purificação incluem, mas não se limitam a, etiqueta hemaglutinina (HA), que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina influenza (Wilson etal., 1984, Cell 37:767), e a etiqueta flag.

[00342] Em outras modalidades, os anticorpos da presente descrição ou os seus fragmentos são conjugados com um agente de diagnóstico ou detectável. Tais anticorpos podem ser úteis para monitorização ou prognóstico do início, desenvolvimento, progressão e/ou gravidade de uma doença ou distúrbio como parte de um procedimento de ensaio clínico, tal como determinar a eficácia de uma terapia particular. Tal diagnóstico e detecção pode ser conseguido pelo acoplamento do anticorpo a substâncias detectáveis, incluindo, mas não limitado a, várias enzimas, tais como, mas não se limitando a, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos protéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tal como, mas não limitado a, luminol;

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143/201 materiais bioluminescentes, tais como, mas não limitados a, luciferase, luciferina, e aquorina, materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, iodo (1311, 1251, 1231, e 1211,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115ln, 113ln, 112ln, e 1111n,), tecnécio (99Tc), tálio (201ΊΊ), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdênio (99Mo), xénon (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51 Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; e metais emissores de positrons usando várias tomografias de emissão de positrons e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. [00343] A presente descrição abrange ainda utilizações de anticorpos ou seus fragmentos conjugados com uma porção terapêutica. Um anticorpo ou seu fragmento pode ser conjugado a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon metálico radioativo, por exemplo, emissores alfa. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células. [00344] Além disso, um anticorpo ou seu fragmento pode ser conjugado com uma porção terapêutica ou porção de fármaco que modifica uma dada resposta biológica. As porções terapêuticas e as porções de fármaco não devem ser entendidas como limitadas a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de fármaco pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo tendo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, toxina da cólera ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, interferon a, interferon β, fator de crescimento dos nervos, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador do plasminogênio em tecidos, um agente apoptótico, um agente antiangiogênico; ou um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma

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144/201 linfoquina.

[00345] Além disso, um anticorpo pode ser conjugado com porções terapêuticas, tais como um íon metálico radioativo, tais como emissores alfa, tais como 213BÍ ou quelantes macrocíclicos úteis para a conjugação de íons radiometais incluindo, mas não limitado a, 131 In, 131 LU, 131Y, 131 Ho, 131 Sm, a polipeptídeos. Em certas modalidades, o quelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecanoN,N',N,N'-tetra-acético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são comumente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et a/., 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, cada um aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00346] As técnicas para conjugação de porções terapêuticas de anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, em Controlled Drug Delivery (2- Ed.), Robinson et al. (eds.), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), páginas 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy, em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), páginas 30316 (Academic Press 1985), e Thorpe etal., 1982, Immunol. Rev. 62:11958.

[00347] Anticorpos podem também ser ligados a suportes sólidos,

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145/201 que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antigeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não se limitam a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, policloreto de vinila ou polipropileno.

Métodos de Produção de Anticorpos

Ácidos Nucleicos que Codificam os Anticorpos [00348] A presente descrição proporciona moléculas de ácidos nucleicos substancialmente purificadas que codificam polipeptídeos compreendendo os segmentos ou domínios das cadeias de anticorpo de ligação a β-klotho, descrito acima. Alguns dos ácidos nucleicos da presente descrição compreendem a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 15, e/ou a sequência de nucleotídeos que codifica a região variável de cadeia leve mostrada na SEQ ID NO: 26 ou 32. Em um aspecto específico, moléculas de ácidos nucleicos aqui proporcionadas são as identificadas na Tabela 1, por exemplo, moléculas de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16, 36 ou 38 codificando uma VH, ou moléculas de ácidos nucleicos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 27, 54, 33 ou 40 codificando uma VL. Algumas outras moléculas de ácido nucleico da presente descrição compreendem sequências de nucleotídeos que são substancialmente idênticas (por exemplo, pelo menos 65, 80%, 95%, ou 99%) com as sequências de nucleotídeos das identificadas na Tabela 1, por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 16, 36 ou 38 codificando uma VH, ou moléculas de ácidos nucleicos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 27, 54, 33 ou 40 codificando uma VL. Quando expressos a partir de vetores de expressão apropriados, os polipeptídeos codificados por estes polinucleotídeos são capazes de exibir capacidade de ligação ao antigeno FGF21.

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146/201 [00349] Também são proporcionados na presente descrição polinucleotídeos que codificam toda ou substancialmente toda a sequência da região variável de uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve do anticorpo de ligação a β-klotho aqui apresentado, por exemplo, os apresentados na Tabela 1. Em aspectos específicos, a presente descrição proporciona polinucleotídeos que codificam a totalidade ou substancialmente a totalidade de VH e/ou VL de um anticorpo NOV005 de ligação a β-klotho. Em aspectos específicos, a presente descrição proporciona polinucleotídeos que codificam a totalidade ou substancial mente a totalidade de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo NOV005 de ligação a β-klotho. Em aspectos específicos, a presente descrição proporciona polinucleotídeos que codificam a totalidade ou substancialmente a totalidade de VH e/ou VL de um anticorpo NOV006 de ligação a β-klotho. Em aspectos específicos, a presente descrição proporciona polinucleotídeos que codificam a totalidade ou substancialmente a totalidade de cadeia pesada e/ou cadeia leve de um anticorpo NOV006 de ligação a β-klotho.

[00350] Devido à degenerescência do código, uma variedade de sequências de ácido nucleico codificará cada uma das sequências de aminoácidos da imunoglobulina. Por exemplo, SEQ ID NOs: 16 e 36 são duas sequências de ácido nucleico que codificam uma VH de NQV005 e SEQ ID NOs: 27 e 54 são duas sequências de ácido nucleico que codificam uma VL de NQV005.

[00351] As moléculas de ácido nucleico da presente descrição podem codificar tanto uma região variável como uma região constante do anticorpo. Algumas das sequências de ácido nucleico da presente descrição compreendem nucleotídeos que codificam uma sequência de cadeia pesada que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 90% ou 99%) à sequência de cadeia pesada apresentada na SEQ ID NO: 17. Algumas outras sequências de ácido nucleico

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147/201 compreendendo nucleotídeo que codifica uma sequência de cadeia leve que é substancialmente idêntica (por exemplo, pelo menos 80%, 90% ou 99%) à sequência de cadeia leve apresentada na SEQ ID NO: 28 ou 34. Em aspectos específicos, moléculas de ácidos nucleicos aqui proporcionadas são as identificadas na Tabela 1, por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 18, 37, 30 ou 39 que codificam uma cadeia pesada, ou moléculas de ácidos nucleicos compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29, 51,35, ou 41 que codificam uma cadeia leve.

[00352] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16 codificando uma VH. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 36 codificando uma VH. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 38 codificando uma VH. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27 codificando uma VL. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 54 codificando uma VL. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29 codificando uma VL. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 51 codificando uma VL.

[00353] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18 codificando uma cadeia pesada. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37 codificando uma cadeia pesada. Em

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148/201 um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 30 codificando uma cadeia pesada. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39 codificando uma cadeia pesada.

[00354] Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 29 codificando uma cadeia leve. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 51 codificando uma cadeia leve. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35 codificando uma cadeia leve. Em um aspecto específico, é aqui fornecido um polinucleotídeo compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41 codificando uma cadeia leve.

[00355] As sequências de polinucleotídeos podem ser produzidas por síntese de DNA de fase sólida de novo ou por mutagênese por PCR de uma sequência existente (por exemplo, sequências conforme descritas nos Exemplos abaixo) que codifica um anticorpo de ligação a β-klotho ou seu fragmento de ligação. A síntese química direta de ácidos nucleicos pode ser realizada pelos métodos conhecidos na técnica, tal como o método de fosfotriéster de Narang et a!., 1979, Meth. Enzymol. 68:90; o método de fosfodiéster de Brown etal., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; e o método de suporte sólido da Patente US N^Q 4,458,066. A introdução de mutações a uma sequência de polinucleotídeos por PCR pode ser realizada conforme descrito em, por exemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.),

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Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila etal., Nucleic Acids Res. 19:967,1991; e Eckert etal., PCR Methods and Applications 1:17,1991. [00356] A presente descrição também fornece vetores de expressão e células hospedeiras para produzir os anticorpos de ligação a β-klotho aqui descritos, por exemplo, NOV005 ou NOV006. Vários vetores de expressão podem ser empregados para expressar os polinucleotídeos que codificam as cadeias de anticorpo ou fragmentos de ligação a βklotho. Vetores de expressão com base viral ou não viral podem ser usados para produzir os anticorpos em uma célula hospedeira de mamífero. Sistemas e vetores não virais incluem plasmídeos, vetores epissômicos, tipicamente com um cassete de expressão para expressar uma proteína ou RNA, e cromossomos artificiais humanos (ver, por exemplo, Harrington et al., Nat Genet 15:345, 1997). Por exemplo, vetores não virais úteis para expressão dos polinucleotídeos e polipeptídeos de ligação a FGF21 em células de mamíferos (por exemplo, seres humanos) incluem pThioHis A, B & C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B & C (Invitrogen, San Diego, CA), vetores MPSV e inúmeros outros vetores conhecidos na técnica por expressarem outras proteínas. Os vetores virais úteis incluem vetores com base em retrovirus, adenovirus, vírus adenoassociados, herpes vírus, vetores com base em SV40, papilomavírus, vírus Epstein Barr HBP, vetores de vírus da vaccinia e vírus Semliki Forest (SFV). Ver, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; e Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.

[00357] A escolha do vetor de expressão depende das células hospedeiras pretendidas nas quais o vetor deve ser expresso. Tipicamente, os vetores de expressão contêm um promotor e outras sequências reguladoras (por exemplo, intensificadores) que são ligadas de maneira funcional aos polinucleotídeos que codificam uma cadeia ou fragmento de anticorpo de ligação a β-klotho. Em algumas modalidades,

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150/201 um promotor induzível é empregado para evitar a expressão de sequências inseridas exceto sob condições indutoras. Os promotores induzíveis incluem, por exemplo, arabinose, lacZ, promotor de metalotioneína ou um promotor de choque térmico. As culturas de organismos transformados podem ser expandidas sob condições não indutoras sem enviesar a população a codificar as sequências cujos produtos de expressão são melhor tolerados pelas células hospedeiras. Adicionalmente aos promotores, outros elementos reguladores podem também ser exigidos ou desejados para expressão eficiente de uma cadeia ou fragmento de anticorpo de ligação a β-klotho. Esses elementos incluem tipicamente um códon de iniciação de ATG e sítio de ligação a ribossomo adjacente ou outras sequências. Adicionalmente, a eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores apropriados para o sistema de célula em uso (ver, por exemplo, Scharf etal., Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; e Bittner et al., Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por exemplo, o intensificador de SV40 ou intensificador de CMV pode ser usado para aumentar a expressão em células hospedeiras de mamíferos.

[00358] Os vetores de expressão podem também fornecer uma posição de sequência de sinal de secreção para formar uma proteína de fusão com polipeptídeos codificados por sequências de anticorpo de ligação a FGF21 inseridas. Mais frequentemente, as sequências de anticorpo de ligação a β-klotho inseridas são ligadas a uma sequência de sinal antes da inclusão no vetor. Os vetores a serem usados para receber sequências que codificam domínios variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo de ligação a β-klotho também codificam, por vezes, regiões constantes ou partes das mesmas. Tais vetores permitem a expressão das regiões variáveis como proteínas de fusão com as regiões constantes levando, assim, à produção de anticorpos intactos ou fragmentos dos mesmos. Tipicamente, tais regiões constantes são

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151/201 humanas.

[00359] As células hospedeiras para abrigar e expressar as cadeias de anticorpo de ligação a β-klotho podem ser procarióticas ou eucarióticas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil para clonar e expressar os polinucleotídeos da presente revelação. Outros hospedeiros microbianos adequados para uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis e outras enterobacteriaceae, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies de Pseudomonas. Nesses hospedeiros procarióticos, podem também ser produzidos vetores de expressão, que contêm tipicamente sequências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Adicionalmente, qualquer número dentre uma variedade de promotores bem conhecidos estará presente, tal como o sistema promotor de lactose, um sistema promotor de triptofano (trp), um sistema promotor de beta-lactamase ou um sistema promotor de fago lambda. Os promotores controlam tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências de sítio de ligação a ribossomo e similares, para iniciar e concluir a transcrição e a tradução. Outros micróbios, tais como levedura, podem também ser empregados para expressar polipeptídeos de ligação a β FGF21 da presente descrição. Podem também ser usadas células de inseto em combinação com vetores de baculovírus.

[00360] Em algumas modalidades preferidas, células hospedeiras de mamífero são usadas para expressar e produzir os polipeptídeos de ligação a β-klotho da presente descrição. Por exemplo, as mesmas podem ser ou uma linha celular de hibridoma que expressa genes de imunoglobulina endógenos (por exemplo, o clone de hibridoma de mieloma 1 D6.C9 conforme descrito nos Exemplos) ou uma linha celular de mamífero que abriga um vetor de expressão exógeno (por exemplo, as células de mieloma SP2/0 exemplificadas abaixo). As mesmas

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152/201 incluem qualquer célula humana ou animal mortal normal ou normal ou imortal anormal. Por exemplo, foram desenvolvidas várias linhas de células hospedeiras adequadas com a capacidade de secretar imunoglobulinas intactas, incluindo as linhas de células CHO, várias linhas de células Cos, células HeLa, linhas de células de mieloma, células B transformadas e hibridomas. O uso de cultura celular de tecido de mamífero para expressar polipeptídeos é discutido genericamente em, por exemplo, Winnacker, FROM GENES TO CLONES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Os vetores de expressão para células hospedeiras de mamífero podem incluir sequências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um intensificador (ver, por exemplo, Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68, 1986), e sítios de informações de processamento necessários, tais como sítios de ligação a ribossomo, sítios de splicing de RNA, sítios de poliadenilação e sequências terminadoras transcricionais. Esses vetores de expressão usualmente contêm promotores derivados de genes de mamíferos ou de vírus de mamíferos. Os promotores adequados podem ser constitutivos, específicos para tipo de célula, específicos para estágio e/ou moduláveis ou reguláveis. Os promotores úteis incluem, porém sem limitação a, o promotor de metalotioneína, o promotor tardio principal de adenovirus constitutivo, o promotor de MMTV induzível por dexametasona, o promotor de SV40, o promotor de MRP pollll, o promotor de MPSV constitutivo, o promotor de CMV induzível por tetraciclina (tal como o promotor de CMV precoce imediato humano), o promotor de CMV constitutivo e combinações de promotorintensificador conhecidas na técnica.

[00361] Os métodos para introduzir vetores de expressão contendo as sequências de polinucleotídeos de interesse variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, enquanto o

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153/201 tratamento com fosfato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros celulares (ver, de modo geral, Sambrook et al., supra). Outros métodos incluem, por exemplo, eletroporação, tratamento com fosfato de cálcio, transformação mediada por lipossoma, injeção e microinjeção, métodos balísticos, virossomas, imunolipossomas, conjugados de policátiomácido nucleico, DNA nu, virions artificiais, fusão à proteína estrutural do herpes vírus VP22 (Elliot e O'Hare, Cell 88:223, 1997), absorção de DNA intensificada por agente e transdução ex vivo. Para produção de alto rendimento a longo prazo de proteínas recombinantes, a expressão estável será frequentemente desejada. Por exemplo, linhas celulares que expressam estavelmente cadeias de anticorpo ou fragmentos de ligação β-klotho podem ser preparadas usando vetores de expressão da presente descrição que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a introdução do vetor, as células podem ser deixadas proliferar por 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meios seletivos. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite a proliferação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas em meios seletivos. Células resistentes estavelmente transfectadas podem ser proliferadas com o uso de técnicas de cultura de tecido adequadas para o tipo de célula. Geração de anticorpos monoclonais [00362] Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpos monoclonais, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de células somáticas de Kohler e Milstein, 1975 Nature 256: 495. Muitas técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser utilizadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

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154/201 [00363] Os sistemas animais para preparar hibridomas incluem os sistemas de murino, rato e coelho. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

[00364] Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente descrição podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal de murino preparado como descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeias pesadas e leves pode ser obtido a partir do hibridoma de murino de interesse e manipulado para conter sequências de imunoglobulina não murinas (por exemplo, humanas) utilizando técnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas a regiões constantes humanas, utilizando métodos conhecidos na técnica (ver por exemplo, Patente US N° 4,816,567 de Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões de CDR de murino podem ser inseridas em uma estrutura principal humana utilizando métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US N^Q 5225539 de Winter, e Patentes US N^Q 5530101; 5585089; 5693762 e 6180370 de Queen etal.

[00365] Em uma certa modalidade, os anticorpos da presente descrição são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra a β-klotho podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos portando partes do sistema imunológico humano em vez do sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos aqui referidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são referidos colectivamente

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155/201 como camundongos Ig humanos.

[00366] O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém miniloci do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeias pesadas (μ e γ) e leves κ humanas não rearranjadas, juntamente com mutações direcionadas que inativam os loci endógenos de cadeia μ e κ (ver, por exemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos apresentam expressão reduzida de camundongo IgM ou κ, e em resposta à imunização, os transgenes das cadeias pesadas e leves humanas introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar IgGK monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al., 1994 supra, revisto em Lonberg, N., 1994, Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, Lonberg, N. e Huszar, D., 1995, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação e utilização de camundongos HuMAb, e as modificações genômicas transportadas por esses camundongos, é ainda descrito em Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647656;Tuaillon etal., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon etal., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. etal., 1994 International Immunology 579-591; e Fishwild, D. etal., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são por este meio especificamente incorporados por referência na sua totalidade. Ver ainda as Patentes US N^Q 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; e 5,770,429; todas para Lonberg e Kay; Patente US N^Q 5,545,807 de Surani et al.; Publicações PCT N^Q WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT N^Q WO 01/14424 de

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156/201

Korman et al.

[00367] Noutra modalidade, os anticorpos humanos da presente descrição podem ser criados utilizando um camundongo que transporta sequências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomos, tais como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humana e um transcromossomo de cadeia leve humana. Tais camundongos, aqui referidos como camundongos KM, são descritos em detalhe na publicação PCT WO 02/43478 de Ishida etal.

[00368] Ainda adicionalmente, sistemas animais transgênicos alternativos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar anticorpos de ligação a β-klotho da presente descrição. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.) pode ser usado. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes US N^Q 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 e 6,162,963 de Kucherlapati etal.

[00369] Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos que expressam genes da imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar anticorpos de ligação a β-klotho da presente descrição. Por exemplo, podem ser utilizados camundongos que portam tanto um transcromossomo de cadeia pesada humana como um transcromossomo de cadeia leve humana, referidos como camundongos CT; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 97:722727. Além disso, vacas portadoras de transcromossomos de cadeias pesadas e leves humanas têm sido descritos na técnica (Kuroiwa et al, 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser utilizadas para criar anticorpos de ligação a FGF21 da presente descrição.

[00370] Os anticorpos monoclonais humanos da presente descrição

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157/201 também podem ser preparados utilizando métodos de apresentação de fagos para rastreamento de bibliotecas de genes de imunoglobulinas humanas. Tais métodos de apresentação de fagos para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Ver, por exemplo: Patentes US N^Q 5,223,409; 5,403,484; e 5,571,698 de Ladner et al.; Patentes US N^Q 5,427,908 e 5,580,717 de Dower et al.; Patentes US N^Q 5,969,108 e 6,172,197 de McCafferty et al.; e Patentes US N^Q 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 e 6,593,081 de Griffiths et al.

[00371] Os anticorpos monoclonais humanos da presente descrição podem também ser preparados utilizando camundongos SCID nos quais as células imunitárias humanas foram reconstituídas de modo a que uma resposta de anticorpos humanos possa ser gerada após a imunização. Tais camundongos são descritos, por exemplo, nas Patentes US N^Q 5,476,996 e 5,698,767 de Wilson etal.

Manipulação de Estrutura principal ou Fc [00372] Os anticorpos manipulados da presente descrição incluem aqueles nos quais as modificações foram feitas a resíduos estrutura principal dentro de VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações de estrutura principal são feitas para reduzir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é mutação reversa de um ou mais resíduos de estrutura principal para a sequência de linha germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura principal que diferem da sequência de linha germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados comparando-se as sequências de estrutura principal de anticorpo com as sequências de linha germinativa das quais o anticorpo é derivado. Para devolver as sequências de região de estrutura principal à sua configuração de linha

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158/201 germinativa, as mutações somáticas podem sofrer mutação reversa para a sequência de linha germinativa, por exemplo, por mutagênese sítio-dirigida. Tais anticorpos com mutação reversa são também destinados a serem abrangidos pela presente descrição.

[00373] Outro tipo de modificação de estrutura principal envolve realizar mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura principal ou mesmo dentro de uma ou mais regiões de CDR, para remover epítopos de célula T para, assim, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Essa abordagem é também denominada desimunização e é descrita em maior detalhe na Publicação de Patente US N^Q 20030153043 de Carr etal.

[00374] Adicionalmente, ou em alternativa, às modificações feitas dentro das regiões de estrutura principal ou de CDR, os anticorpos da presente descrição podem ser manipulados para incluir modificações dentro da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida sérica, fixação de complemento, ligação de receptor Fc e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da presente descrição pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou ser modificadas para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em maior detalhe abaixo. A numeração de resíduos na região Fc é a do índice EU de Kabat.

[00375] Em uma modalidade, a região de dobradiça de CH1 é modificada de modo que o número de resíduos de cisteína na região de dobradiça seja alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Essa abordagem é descrita adicionalmente na Patente US N^Q 5,677,425 de Bodmer etal. O número de resíduos de cisteína na região de dobradiça de CH1 é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias

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159/201 leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[00376] Em outra modalidade, a região de dobradiça Fc de um anticorpo é mutada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento de dobradiça Fc de modo que o anticorpo tenha ligação comprometida de proteína estafilocócica A (SpA) em relação a ligação de SpA de domínio de dobradiça Fc. Essa abordagem é descrita em maior detalhe na Patente US N^Q 6,165,745 de Ward etal.

[00377] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar a sua meia-vida biológica. São possíveis várias abordagens. Por exemplo, podem ser introduzidas uma ou mais das seguintes mutações: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente US N^Q 6,277,375 de Ward. Em alternativa, para aumentar a meia-vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região de CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação ao receptor de salvamento retirado de duas alças de um domínio de CH2 de uma região Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patentes US N^Q 5,869,046 e 6,121,022 de Presta et al.

[00378] Ainda em outras modalidades, a região Fc é alterada substituindo pelo menos um resíduo de aminoácido por um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tenha uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retenha a capacidade de ligação ao antigeno do anticorpo original. O ligante efetor para o qual é alterada a afinidade pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem é descrita, em mais detalhe nas Patentes US. N^Q 5,624,821 e 5,648,260, ambas de Winter

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160/201 et al.

[00379] Em outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados a partir de resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente, de modo que o anticorpo tenha ligação C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida ou suprimida. Essa abordagem é descrita em maior detalhe na Patente US N^Q 6,194,551 de Idusogie etal.

[00380] Em outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para assim alterarem a capacidade do anticorpo de corrigir o complemento. Esta abordagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 94/29351 de Bodmer etal.

[00381] Em ainda outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcy por modificação de um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita adicionalmente na publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação na lgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação melhorada foram descritas (ver Shields, R.L. etal., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).

[00382] Ainda em outra modalidade, é modificada a glicosilação de um anticorpo. Por exemplo, pode ser feito um anticorpo aglicosilado (ou seja, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, para aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser alcançadas, por exemplo, por alteração de um ou mais sítios de glicosilação dentro da sequência do anticorpo. Por exemplo, podem ser feitas uma ou mais substituições de aminoácidos que resultem na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura principal de região variável para assim eliminar glicosilação nesse sítio. Tal aglicosilação pode aumentar

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161/201 a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhe nas Patentes US N^Q 5,714,350 e 6,350,861 de Co etal. [00383] Adicionalmente ou alternativamente, pode ser produzido um anticorpo que possua um tipo alterado de glicosilação, tal como um anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac bissectoras aumentadas. Tais padrões de glicosilação alterados demonstraram aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser conseguidas por, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada têm sido descritas na técnica e podem ser utilizadas como células hospedeiras para expressar anticorpos recombinantes da presente descrição para desse modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1,176,195 de Hang et al. descreve uma linha celular com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, o qual codifica uma transferase fucosil, de tal modo que os anticorpos expressos em tal uma linha celular exibem hipofucosilação. A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma variante da linha celular CHO, células Lecl3, com capacidade reduzida para ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), resultando também na hipofucosilação de anticorpos expressos nessa célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 de Umana et al. descreve linhas celulares manipuladas para expressar transferases glicosil modificadoras de glicoproteínas (por exemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIH)) tais que os anticorpos expressos nas linhas celulares manipuladas exibem estruturas GlcNac bissectoras aumentadas que resultam no aumento da atividade ADCC dos anticorpos (ver também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

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162/201

Métodos de Manipulação de Anticorpos Alterados [00384] Como discutido acima, os anticorpos de ligação a β-klotho tendo sequências de VH e VL ou sequências de cadeias pesadas e leves de comprimento total aqui mostradas podem ser usadas para criar novos anticorpos de ligação a β-klotho modificando as sequências de cadeia pesada e/ou de cadeia leve, sequências de VH e/ou VL, ou a(s) região(ões) constante(s) ligada(s) a elas. Assim, em outro aspecto da presente descrição, as características estruturais de um anticorpo de ligação a β-klotho da presente descrição são utilizadas para criar anticorpos de ligação a β-klotho estruturalmente relacionados, que retêm, pelo menos, uma propriedade funcional dos anticorpos da presente descrição, tal como a ligação a β-klotho humana e ativação também de uma ou mais propriedades funcionais do complexo receptor de FGF21 (por exemplo, ativação de sinalização de receptor de FGF21). [00385] Por exemplo, uma ou mais regiões de CDR dos anticorpos da presente descrição, ou suas mutações, podem ser combinadas de forma recombinante com regiões de estrutura principal conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos de ligação a β-klotho adicionais manipulados de forma recombinante, da presente descrição, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de manipulação é uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui fornecidas, ou uma ou mais regiões de CDRs das mesmas. Para criar o anticorpo manipulado, não é necessário preparar realmente (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo tendo uma ou mais das sequências VH e/ou VL aqui proporcionadas, ou uma ou mais regiões de CDR das mesmas. Pelo contrário, a informação contida na(s) sequência(s) é utilizada como material de partida para criar uma sequência de segunda geração derivada da(s) sequência(s) original(ais) e depois a(s) sequência(s) de segunda geração é(são) preparada(s) e expressa(s) como uma

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163/201 proteína.

[00386] Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método para a preparação de um anticorpo de ligação a β-klotho (por exemplo, NOV005 ou NOV006) compreendendo uma sequência de anticorpo da região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 6 ou 9, uma sequência de CDR2 de SEQ ID NO: 7 e/ou uma sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 8; e uma sequência de anticorpo da região variável de cadeia leve tendo uma sequência de CDR1 da SEQ ID NO: 19 ou 31, uma sequência de CDR2 de SEQ ID NO: 20 e/ou uma sequência de CDR3 de SEQ ID NO: 21; opcionalmente, alterando pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência do anticorpo da região variável de cadeia pesada e/ou a sequência de anticorpo da região variável de cadeia leve para criar, pelo menos, uma sequência de anticorpo alterada; e expressando a sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[00387] Consequentemente, em uma outra modalidade, a presente descrição proporciona um método para a preparação de um anticorpo de ligação a β-klotho otimizado para a expressão em uma célula de mamífero que consiste em: uma sequência de anticorpo de cadeia pesada de comprimento total que compreende uma sequência de SEQ ID NO: 17; e uma sequência de anticorpo de cadeia leve de comprimento total compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 28 ou 34; opcionalmente, alterando pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de cadeia pesada de comprimento total e/ou a sequência de anticorpo de cadeia leve de comprimento total para criar, pelo menos, uma sequência de anticorpo alterada e expressando a sequência de anticorpos alterada como uma proteína. Em uma modalidade, a alteração de cadeia pesada ou leve está na região de estrutura principal de cadeia pesada ou leve.

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164/201 [00388] A sequência de anticorpo alterada pode também ser preparada por rastreamento de bibliotecas de anticorpos com sequências de CDR3 fixas ou determinantes de ligação essenciais mínimas, tal como descrito no documento US2005/0255552 e diversidade nas sequências de CDR1 e CDR2. O rastreamento pode ser realizado de acordo com qualquer tecnologia de rastreamento apropriada para rastreamento de anticorpos a partir de bibliotecas de anticorpos, tal como tecnologia de apresentação em fagos.

[00389] Técnicas-padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpos alterada. O anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alterada(s) é aquele que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos de ligação a β-klotho aqui descritas, cujas propriedades funcionais incluem, mas não se limitam a, ligação específica a β-klotho humana, de cinomolgo, rato e/ou camundongo; e o anticorpo ativa a sinalização mediada por FGF21, por exemplo, sinalização dependente do receptor de FGF21, em um ensaio celular pERK FGFR1c_ βklotho_HEK293.

[00390] Em certas modalidades dos métodos de manipulação de anticorpos da presente descrição, podem ser introduzidas mutações ao acaso ou seletivamente ao longo de toda ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo de ligação a β-klotho e os anticorpos de ligação a β-klotho modificados resultantes podem ser rastreados quanto a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como aqui descritas. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCTWO 02/092780 por Short descreve métodos para a criação e o rastreamento de mutações de anticorpos usando mutagênese de saturação, a montagem de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 de Lazar et al. descreve métodos de utilização de métodos

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165/201 de rastreamento computacionais para otimizar as propriedades físicoquímicas dos anticorpos.

[00391 ] Em certas modalidades da presente descrição, os anticorpos foram manipulados para remover sítios de desamidação. A desamidação é conhecida por causar alterações estruturais e funcionais em um peptídeo ou proteína. A desaminação pode resultar em diminuição da bioatividade, bem como alterações na farmacocinética e antigenicidade da proteína farmacêutica. (Anal Chem. 2005 Mar 1 ;77(5):1432-9).

[00392] Em certas modalidades da presente descrição, os anticorpos foram manipulados para aumentar pl e melhorar as suas propriedades semelhantes a fármacos. O pl de uma proteína é um determinantechave das propriedades biofísicas gerais de uma molécula. Anticorpos com baixos pis são conhecidos por serem menos solúveis, menos estáveis e propensos à agregação. Além disso, a purificação de anticorpos com baixo pl é desafiadora e pode ser problemática, especialmente durante o aumento de escala para uso clínico. O aumento do pl dos anticorpos anti-p-klotho, ou Fabs, da presente descrição melhorou a sua solubilidade, permitindo que os anticorpos fossem formulados em concentrações mais altas (> 100 mg/mL). A formulação dos anticorpos em altas concentrações (por exemplo, > 100mg/mL) oferece a vantagem de poder administrar doses mais altas dos anticorpos nos olhos dos pacientes por meio de injeções intravítreas, o que, por sua vez, pode reduzir a frequência de dosagem, uma vantagem significativa para o tratamento de doenças crônicas, incluindo doenças cardiovasculares. Pis mais altos também podem aumentar a reciclagem mediada por FcRn da versão IgG do anticorpo, permitindo assim que o fármaco persista no corpo por um período mais longo, exigindo menos injeções. Finalmente, a estabilidade geral dos anticorpos é significativamente melhorada devido ao maior pl resultando

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166/201 em maior vida útil e bioatividade in vivo. De preferência, o pl é maior ou igual a 8,2.

[00393] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas utilizando ensaios padrão disponíveis na técnica e/ou aqui descritos, tais como os apresentados nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).

Usos profiláticos e terapêuticos [00394] Anticorpos que se ligam a β-klotho como descrito aqui (por exemplo, NOV005 ou NOV006) e seus fragmentos de ligação ao antígeno, podem ser usados em uma concentração terapeuticamente útil para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado à sinalização aberrante de FGF21 (por exemplo, ativação aberrante de sinalização mediada por FGF21 e/ou a sinalização do receptor de FGF21), por administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da presente descrição, por exemplo, NGV005 ou NGV006. A presente descrição proporciona um método de tratamento de distúrbios metabólicos associados a FGF21 por administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente descrição, por exemplo, NGV005 ou NGV006. A presente descrição proporciona um método de tratamento de distúrbios cardiovasculares associados a FGF21 por administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz dos anticorpos da presente descrição, por exemplo, NGV005 ou NGV006.

[00395] Os anticorpos da presente descrição (por exemplo, NOV005 ou NOV006) podem ser utilizados, inter alia, para prevenir tratar, prevenir e melhorar as afeções ou distúrbios associados a FGF21, incluindo, mas não limitados a distúrbios metabólicos, endócrinos e cardiovasculares, tal como a obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, doença hepática gordurosa não alcoólica

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167/201 (NAFLD), esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, hipertrigliceridemia, síndrome metabólica, infarto agudo do miocárdio, hipertensão, doença cardiovascular, aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca, doença cardíaca coronária, doença renal, complicações diabéticas, neuropatia, gastroparesia, distúrbios associados a mutações de inativação graves no receptor de insulina e outros distúrbios metabólicos e na redução da mortalidade e morbidade de pacientes gravemente doentes.

[00396] Os anticorpos da presente descrição (por exemplo, NOV005 ou NOV006) podem ser utilizados, inter alia, para tratar, diagnosticar, melhorar ou prevenir uma série de doenças, distúrbios ou afeções, incluindo, mas não limitado a doenças metabólicas associadas com resistência à insulina, como diabetes mellitus tipo 2, diabetes mellitus tipo 1, distúrbios de mutação do receptor de insulina (distúrbios INSR, por exemplo, resistência à insulina do Tipo B), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) e várias formas de lipodistrofia parcial incluindo lipodistrofia parcial familiar, terapia antirretroviral altamente ativa contra o HIV (HIV-HAART) induziu lipodistrofia parcial, bem como doenças associadas à produção de insulina (por exemplo, diabetes mellitus tipo 1) e na redução da mortalidade e morbidade de pacientes gravemente doentes.

[00397] Múltiplas mutações de inativação de INSR foram descritas com fenótipos variados. Os pacientes tipicamente apresentam resistência grave à ação da insulina, que evolui para hiperglicemia no momento da puberdade. O padrão atual de tratamento é o tratamento com doses muito altas de insulina quando os indivíduos se tornam hiperglicêmicos, o que geralmente é inadequado no controle da hiperglicemia.

[00398] Em aspectos particulares, os anticorpos da presente

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168/201 descrição (por exemplo, NOV005 ou NOV006) podem ser usados, inter alia, para tratar ou gerir diabetes mellitus tipo 1, dislipidemia, hiperglicemia, hipoglicemia, intolerância à glucose, hipertrigliceridemia ou Lipodistrofia Parcial Induzida por HIV-HAART.

[00399] Os anticorpos da presente descrição também podem ser utilizados em combinação com outros agentes para a prevenção, tratamento, ou melhoria de distúrbios associados a FGF21. Por exemplo, terapias de estatina podem ser utilizadas em combinação com os anticorpos miméticos FGF21 e fragmentos de ligação ao antigeno da presente descrição para o tratamento de pacientes com distúrbios cardiovasculares ou metabólicos.

[00400] Em aspectos particulares, é aqui fornecido um método de redução do peso corporal (por exemplo, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20%) em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno aqui descrito (por exemplo, NOV005 ou NOV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo βklotho/receptor FGFRIc.

[00401] Em aspectos particulares, é fornecido aqui um método de redução do apetite ou ingestão de alimentos (por exemplo, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20%) em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno aqui descrito (por exemplo, NOV005 ou NOV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade

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169/201 do complexo β-klotho/receptor FGFRIc.

[00402] Em aspectos particulares, é aqui fornecido um método de redução (por exemplo, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%) de concentrações plasmáticas de triglicerídeos (TG) ou concentrações plasmáticas de colesterol total (CT) em um indivíduo, compreendendo administrar a um indivíduo em sua necessidade, uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NGV005 ou NGV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo βklotho/receptor FGFRIc.

[00403] Em aspectos específicos dos métodos aqui proporcionados, o indivíduo é afetado por um distúrbio metabólico, tal como a obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, esteatohepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glucose, hiperglicemia, hipertrigliceridemia e síndrome metabólica. Em aspectos específicos dos métodos aqui proporcionados, o indivíduo é afetado por um distúrbio cardiovascular. Em aspectos particulares, o indivíduo é ser humano.

[00404] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de tratamento ou controle da obesidade em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NGV005 ou NGV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFRIc.

[00405] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de

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170/201 tratamento ou controle de diabetes tipo 2 em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NOV005 ou NOV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFR1 c. [00406] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de tratamento ou controle de diabetes tipo 1 em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NGV005 ou NGV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFRIc. [00407] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de tratamento ou controle de lipodistropia, tal como lipodistrofia parcial induzida por HIV-HAART, em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NGV005 ou NGV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFRIc.

[00408] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de tratamento ou controle de NASH em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NGV005 ou NGV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFRIc.

[00409] Em certos aspectos, é aqui fornecido um método de tratamento ou controle de um distúrbio de mutação do receptor de

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171/201 insulina em um indivíduo, compreendendo a administração a um indivíduo em sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno aqui descrito (por exemplo, NOV005 ou NOV006) que se liga a β-klotho e é capaz de aumentar a atividade do complexo β-klotho/receptor FGFRIc.

Composições Farmacêuticas [00410] A presente descrição proporciona composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos de ligação a β-klotho (fragmentos intactos ou de ligação) formulados juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável. As composições podem adicionalmente conter um ou mais outros agentes terapêuticos que são adequados para tratar ou prevenir, por exemplo, distúrbios cardiovasculares. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis aumentam ou estabilizam a composição, ou podem ser utilizados para facilitar a preparação da composição. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis.

[00411] Uma composição farmacêutica da presente descrição pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A via e/ou o modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. É preferível que a administração seja intravítrea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, ou subcutânea, ou administrada proximal ao sítio do alvo. O transportador farmaceuticamente aceitável deve ser adequado para administração intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutânea, parentérica, espinal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, ou seja, anticorpo, molécula

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172/201 biespecífica e multiespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Em um aspecto específico, uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação a βklotho aqui descrito, tal como anticorpo NOV005 ou NOV006, para utilização nos métodos aqui fornecidos, é administrada por via subcutânea. Em um aspecto específico, uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de ligação a β-klotho aqui descrito, tal como anticorpo NOV005 ou NOV006, para utilização nos métodos aqui fornecidos, é administrada por via intravenosa.

[00412] A composição deve ser estéril e fluida. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensioativos. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol ou sorbitol e cloreto de sódio na composição. A absorção a longo prazo das composições injetáveis pode ser provocada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

[00413] As composições farmacêuticas da presente descrição podem ser preparadas de acordo com métodos bem conhecidos e rotineiramente praticados na técnica. Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20- ed., 2000; e Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978. As composições farmacêuticas são preferencialmente fabricadas sob condições de GMP. Tipicamente, uma dose terapeuticamente eficaz ou dose eficaz do anticorpo de ligação a β-klotho é empregue nas composições farmacêuticas da presente descrição. Os anticorpos de ligação a βklotho são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente

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173/201 aceitáveis por métodos convencionais conhecidos dos peritos na técnica. Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionarem a resposta desejada ideal (p.ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parentéricas em forma unitária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma unitária de dosagem, como usada no presente documento, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o transportador farmacêutico requerido.

[00414] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente descrição podem ser variados de forma a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para se alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores incluindo a atividade das composições particulares da presente descrição empregadas, ou seu éster, sal ou amida, a via de administração, o momento de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, afeção, saúde geral e histórico médico prévio do paciente sendo tratado e fatores similares.

[00415] O médico ou veterinário pode começar com doses dos anticorpos da presente descrição empregados na composição

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174/201 farmacêutica a níveis mais baixos do que o requerido para alcançar o efeito terapêutico desejado e aumentar gradual mente a dosagem até que o efeito desejado seja alcançado. Em geral, doses eficazes das composições da presente descrição, para o tratamento de distúrbios cardiovasculares aqui descritos, variam dependendo de muitos factores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento precisam ser tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Em uma modalidade particular, para administração sistêmica, com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, ou de 0,01 a 15 mg/kg, de peso corporal do hospedeiro. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Um regime de tratamento exemplificativo implica a administração sistêmica uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses ou conforme necessário (PRN).

[00416] O anticorpo é geralmente administrado em múltiplas ocasiões. Intervalos entre doses únicas podem ser semanais, mensais ou anuais. Intervalos também podem ser irregulares como indicado medindo os níveis no sangue de anticorpo de ligação a β-klotho no paciente. Além disso, intervalos de dosagem alternativos podem ser determinados por um médico e administrados mensalmente ou conforme necessário para serem eficazes. Em alguns métodos de administração sistêmica, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo no plasma de 1-1000 pg/mL e em alguns métodos 25-500 pg/mL. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que é necessária administração menos frequente. A dosagem e a

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175/201 frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanizados apresentam meia-vida mais longa que a dos anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração podem variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam recebendo tratamento ao longo do resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente elevada em intervalos relativamente curtos é por vezes necessária até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e de preferência até que o paciente mostre uma melhoria parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, o paciente pode ser administrado um regime profilático.

EXEMPLOS [00417] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar ainda mais a invenção, mas não para limitar seu escopo. Outras variantes da invenção serão prontamente evidentes para um perito na técnica e estão abrangidas pelas reivindicações anexas.

Exemplo 1: Rastreamento e Produção de Anticorpo

Preparação de células FGFRIc β-klotho 300.19 humanas para uso como um antigeno [00418] Células 300.19 que expressam estavelmente FGFRIc humano (1-386 aa) e β-klotho foram geradas para uso como um antigeno celular completo. O cDNA de comprimento total que codifica β-klotho humana (número de acesso Genbank NM_175737) foi clonado nos sítios EcoRI e EcoRV de pEF1/Myc-His B (Invitrogen Cat. #V92120). O cDNA que codifica os aminoácidos 1-386 de FGFRIc humano (número de acesso Genbank NM_023106) foi clonado nos sítios BamHI e NoÜ de pEF6/Myc-His B (Invitrogen, Cat. número

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V96220). Em ambos aos construtos uma sequência de Kozak (CACC) foi incluída imediatamente antes do códon de iniciação e um códon de terminação foi adicionado antes da etiqueta Myc-His no vetor. Células 300-19 de murino pré-B foram co-transfectadas com plasmideos FGFRIc e β-klotho por eletroporação utilizando o dispositivo Amaxa Nucleofector e kit Nucleofector (Lonza, Cat # VCA-1003). Os clones estáveis foram selecionados usando 1 mg/mL de Geneticina (Invitrogen, Cat # 10131) e 8 pg/mL de Blasticidina (Invitrogen, Cat # 46-1120) durante 3 semanas.

Preparação de células HEK293 expressando FGFR/g-klotho para uso em ensaios celulares [00419] Para testar a especificidade de ligação, atividade funcional, ou reatividade cruzada ortóloga de anticorpos β-klotho, células HEK293 expressando estavelmente FGFR1cJ3-klotho humana, FGFR2cJ3klotho humana, ΡΟΡΚ3ο_β-ΜοίίΊθ humana, FGFR4cJ3-klotho humana ou ΡΟΡΚ1ο_βΨΙοίίιο de macaco cinomolgo foram produzidos utilizando transfecção padrão com Lipofectamina 2000 e métodos de seleção de clone de células.

[00420] Os seguintes plasmideos de expressão de mamífero que codificam cDNAs de β-klotho (NM_175737), FGFRIc humano (NM_023106), FGFR2c humano (NP_001138387), FGFR3c humano (NP_000133), ou FGFR4 humano (NP_998812) de comprimento total foram usados para: β-klotho de macaco cinomolgo, a sequência de comprimento total foi amplificada por PCR a partir de cDNA de tecido adiposo de macaco cinomolgo (BioChain, Cat. #C1534003-Cy) com iniciadores baseados nas sequências de β-klotho humana e de macaco Rhesus e clonados. O cDNA de FGFRIc de macaco cinomolgo foi clonado a partir de cDNA de tecido adiposo de macaco cinomolgo (BioChain, Cat. #C1534003-Cy) utilizando iniciadores baseados na sequência de FGFRIc humana (#NM_023106) e mostrou-se 100%

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177/201 idêntica ao nível de aminoácidos para FGFRIc humano. Assim, o construto de cDNA de FGFRIc humano descrito acima foi usado para produzir células HEK293 que expressavam de forma estável β-klotho e FGFR1 c humano de macaco cinomolgo (#NM_023106) uma vez que as sequências de aminoácidos de FGFRIc humano e de macaco cinomolgo são idênticas.

[00421] Determinar a afinidade de ligação de anticorpos a β-klotho [00422] As afinidades de ligação dos anticorpos foram determinadas utilizando análise cinética Biacore. Um chip CM5 com sensor S Series (GE Healthcare, Cat. N^Q BR-1005-30) foi equilibrado para a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. O sistema foi preparado com 1x HBS-EP + tampão (10x soln, GE Healthcare, Cat. N^Q BR-1006-69) e o chip foi carregado no instrumento Biacore. O chip foi normalizado usando solução BIA normalizante (GE Healthcare, Cat. N° BR-1006-51) e o chip foi condicionado com NaOH 50 mM usando uma taxa de fluxo de 60 pL/minuto para todos os caminhos de fluxo. A injeção de 30 segundos foi repetida três vezes com um tempo de espera de 60 segundos. Injetou-se acetato de sódio 10 mM pH 5,0 a 60 pL/minuto durante 120 segundos e repetiu-se duas vezes. Após, um novo ciclo foi iniciado para imobilizar Fc IgG anti-humana usando o Kit de Captura de Anticorpo Humano (GE Healthcare, Cat. N^Q BR-1008-39). O Fc Ab antihumano foi diluído para 50 pg/mL em tampão de imobilização (acetato de sódio 10 mM, pH 5,0). Os reagentes de acoplamento de amina foram misturados 1:1 (EDC e NHS) e injetados durante 7 minutos a 10 pL/minuto. Em seguida, o Fc Ab anti-humano foi injetado durante 6 minutos a 10 pL/minuto. Por fim, etanolamina foi injetada durante 7 minutos a 10 pL/minuto com um tempo de espera de 60 segundos. Isso deve resultar na imobilização de aproximadamente 8000-10000 RU. Em seguida, realizamos injeções de teste para uma Rmax de 10 RUs (níveis de captura = ~ 28 RUs) para NGV004, NGV005 e NGV006. Isto foi feito

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178/201 usando uma taxa de fluxo de 10 pL/mL e um tampão de regeneração de MgCl2 3 M. Cada célula de fluxo foi avaliada cada vez devido a alterações na superfície do chip, afinidade de IgGs, qualidade da proteína IgG e diferenças nas diluições. Começamos com uma concentração de IgG de 0,5 pg/mL e aumentamos (ou diminuímos) a concentração dependendo dos resultados das injeções da amostra. Por exemplo, se foi observado 100 UR em 15 segundos, então diluímos a solução de Ab para 0,25 pg/mL e repetimos as injeções. Após a determinação dos parâmetros de captura para cada anticorpo em cada célula de fluxo, β-klotho humana em várias concentrações foi passada sobre o chip e ka (1/Ms), kd (1/s), KD (M), e Rmax (RU) foram calculados pela cinética de Biacore.

Determinando se diferentes anticorpos se ligam competitivamente a βklotho [00423] O Forte Bio foi utilizado para determinar se os anticorpos se ligam competitivamente a β-klotho humana. Todas as amostras e reagentes foram diluídos em tampão cinético 10x (Forte Bio cat# 181092) com tampão PBS com uma razão de 1/10 (v/v). β-Klotho humana (Sistemas R e D 5889-KB-050) foi diluída com tampão cinético para a concentração desejada (5 ug/mL). β-Klotho humana foi carregada em um sensor anti-his (Forte Bio, cat# 18-5114) durante 20 segundos, depois o anticorpo 1 foi carregado durante 400 segundos no sensor até que as condições de saturação foram atingidas (200 nM). Por fim, o anticorpo competidor foi carregado no sensor durante 100 segundos a 200 nM na presença de 200 nM de anticorpo 1. A ausência de um segundo sinal de ligação indica que os anticorpos competem pela ligação a β-klotho humana.

Medindo a ativação do receptor FGFR β-klotho usando um ensaio de células pERK [00424] Utilizaram-se técnicas-padrão para cultura de células e para

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179/201 medir os níveis de fosfo-ERK 1/2 (pERK). Resumidamente, células HEK293 que expressam estavelmente FGFR1c_p-klotho humana, FGFR2c_p-klotho humana, FGFR3c_p-klotho humana, FGFR4_pklotho humana ou FGFR1c_p-klotho de macaco cinomolgo foram mantidas em meio DMEM (Invitrogen, 11995) contendo 10% de FBS (Hyclone, SH30071), blasticidina (Invitrogen, A1113902) e Geneticina (Invitrogen, 10131035) a 37 ^QC em CO2 a 5%. As células foram plaqueadas em placas de 384 poços de poli-D-lisina-revestidas (BD Biosciences, 354663) e incubadas durante a noite a 37 °C em CO2 a 5%, seguido por privação de soro.

[00425] Os sobrenadantes de hibridoma ou os anticorpos β-klotho foram diluídos em meio Freestyle 293 e várias concentrações dos anticorpos foram adicionadas à placa. Após a incubação, as células foram lavadas, depois lisadas com tampão de lise. Os lisados celulares foram transferidos para uma placa de ensaio de 384 poços (PerkinElmer, Cat. #6008280) e 0 Kit AlphaScreen SureFire™ pERK 1/2 (PerkinElmer, TGRES10K) foi usado para medir os níveis de fosfo-ERK 1/2. As placas foram lidas no leitor multi-rótulo EnVision 2104 (Perkin Elmer) usando as configurações padrão da AlphaScreen. Os dados de resposta à dose foram representados graficamente à medida que a atividade de pERK dobrou sobre a concentração basal versus proteína para determinar os valores de EC50 usando a equação Y = fundo + (Topo-fundo)/(1+10^A((LogEC50-X) x HilISIope)) e Software GraphPad Prism 5.

Preparação de anticorpos monoclonais [00426] Anticorpos anti^-klotho humanas foram gerados em Balb/c (estirpe Jackson Laboratory: Camundongos BALB/cJ) ou Bcl2 22 wehi (estirpe de Jackson Laboratory: C.Cg-Tg(BCL2)22Wehi/J) por imunizações de células inteiras essencialmente como descrito em Dreyer et al (2010) (Dreyer AM et.al. (2010) BMC Biotechnology 10:87).

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180/201 [00427] Resumidamente, 1x10⁷ células FGFR1c_p-klotho_300.19 humanas foram injetadas em camundongos Balb/c seis vezes em intervalos de 10 a 30 dias. As primeiras injeções de células inteiras foram feitas com adjuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich F5881). Células e adjuvantes não foram misturados, mas injetados separadamente em dois sítios subcutâneos próximos, mas distintos. Estes foram seguidos mais tarde por injeções intraperitoneais das mesmas células com o Sistema Adjuvante Sigma (Sigma-Aldrich S6322) ou sem adjuvante.

[00428] Utilizando camundongos Bcl2 22 wehi, 1x10⁷ células FGFR1c_p-klotho_300.19 humanas foram injetadas nestes animais quatro vezes em intervalos de sete dias. As primeiras injeções foram feitas com Adjuvante Completo de Freund (Sigma-Aldrich F5881). As células e o adjuvante foram injetados separadamente em dois conjuntos de dois sítios subcutâneos próximos mas distintos. As injeções subsequentes de células foram realizadas subcutaneamente sem adjuvante.

[00429] As respostas imunológicas nos camundongos imunizados foram medidas por um ensaio de separação de células ativadas por fluorescência (FACS). O soro dos camundongos imunizados diluídos 1.000 ou 10.000 vezes foi usado para corar células FGFR1c_pklotho_HEK humanas e células FGFR1c_ p-klotho_300.19 humanas, seguido por um anticorpo de detecção secundário de alofibocianina (APC) IgG anti- murino (Jackson ImmunoResearch Cat# 115-136-071). A fluorescência foi lida em um citômetro de fluxo Becton Dickinson LSRII ou Foressa. Quatro camundongos com o maior título foram escolhidos para eletrofusões.

Triagem, subclonaqem e seleção de hibridoma [00430] 2x10⁸ esplenócitos e 5x10⁷ células F0 parceiras de fusão (ATCC, CRL-1646) foram lavadas em Meio de Cytofusion (LCM-C, Cyto

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Pulse Sciences) e fundidas usando um Gerador de Forma de Onda Hybrimune (Cyto Pulse Sciences, modelo CEEF-50B) de acordo com as especificações do fabricante, com um pulso de pico de 600 volts. As células foram plaqueadas em placas de 384 poços a uma densidade calculada de 3000 células F0 por poço e cultivadas em meio de seleção HAT (Sigma-Aldrich Cat. H0262).

[00431] O rastreamento principal foi realizado usando uma plataforma FACS de alto rendimento (Anderson, Paul. Automated Hybridoma Screening, Expansion, Archiving and Antibody Purification. Em: 3- Conferência Anual SLAS 2014. 18 a 22 de janeiro de 2014, San Diego, CA). Resumidamente, os sobrenadantes de hibridoma foram incubados com linhas celulares que expressam e não expressam FGFR1c_p-klotho estavelmente e a ligação do anticorpo foi determinada com um anticorpo secundário IgG-APC anti-murino (Jackson ImmunoReseach Cat# 115-136-071).

[00432] Os anticorpos de cada sobrenadante de hibridoma foram testados quanto à ligação simultaneamente contra quatro linhas de células com código de barras: células 300.19 parentais, células humanas FGFR1c_p-klotho_300.19, células HEK 293 parentais e células FGFR1c-p-klotho_HEK 293 humanas. 348 acertos foram escolhidos no rastreamento principal. Os acertos primários foram expandidos em placas de 96 poços e a ligação foi novamente confirmada em células FGFR1 c_p-klotho_HEK 293 humanas por FACS, produzindo 122 acertos confirmados. Os sobrenadantes contendo o meio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) de 115 acertos de ligação reconfirmados por FACS foram perfilados para a ativação celular do complexo receptor FGFR1c_p-klotho humana utilizando o ensaio fosfo-ERK 1/2 aqui descrito.

[00433] Os hibridomas com a atividade celular mais elevada de fosfoERK 1/2 nos seus sobrenadantes foram expandidos e as IgG foram

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182/201 purificadas a partir dos seus sobrenadantes. As IgGs purificadas de 74 hibridomas foram perfiladas para ativação celular do complexo receptor FGFR1c_p-klotho humana utilizando o ensaio fosfo-ERK 1/2 descrito no Exemplo 2. IgGs de hibridomas com a melhor potência para a ativação de fosfo-ERK 1/2 do complexo receptor FGFR1c_p-klotho humana foram perfilados para reatividade cruzada ortóloga ao complexo FGFR1c_p-klotho de macaco cinomolgo e seletividade para os complexos receptores FGFR2c_p-klotho humana e FGFR3c_p-klotho humana utilizando o ensaio de fosfo-ERK 1/2 descrito no Exemplo 2. Com base nestes resultados de perfil, alguns clones de hibridoma, por exemplo, 127F19, foram selecionados para perfilação adicional. Em particular, as IgGs mais potentes e purificadas, tais como o clone 127F19, foram perfiladas para reatividade cruzada e mostraram ativar o FGFR1c_p-klotho de macaco cinomolgo; mas não FGFR2c_p-klotho, FGFR3c_p-klotho, FGFR4_p-klotho ou Klotho_FGFR humanos. As IgG selecionadas, por exemplo, o clone 127F19, ligaram-se a células que expressam β-klotho ou FGFR1cJ3-klotho e não a células que expressam apenas FGFRIc.

[00434] Para avaliar a sinalização 127F19 em células que expressam α-klotho, as células HEK293 foram transfectadas com α-klotho, Egr1 luciferase e Renilla luciferase. Resumidamente, as células HEK293 foram cultivadas em DMEM, 10% de FBS e plaqueadas a 30000 células/poço e transfectadas com Klotho, Egr-1-luc e TK-Rennila utilizando Lipofectamina 2000. No dia seguinte, FGF23, FGF21 e 127F19 foram diluídos até à concentração indicada em DMEM suplementado com 0,1% de FBS e adicionados a células transfectadas durante a noite. As atividades de luciferase foram detectadas pelo kit de ensaio de luciferase Dual-Glo (Promega, E2920) de acordo com as instruções do fabricante. Como esperado, FGF23, que requer a expressão de α-klotho para a sua sinalização, mostrou forte expressão

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183/201 de luciferase. No entanto, nem FGF21 nem 127F19 mostraram qualquer expressão significativa de luciferase, sugerindo que α-klotho não atua como correceptor para FGF21 ou para estes anticorpos miméticos de FGF21.

Humanização e maturação de afinidade de anticorpos monoclonais Humanização [00435] O processo de humanização está bem descrito na técnica (Jones PT et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen C et al. (1989) PNAS EUA 86:10029-10033; Riechmann L etal. (1988) Nature 33:323327; Verhoeyen M et al. (1988) Science 239: 1534-1536). O termo humanização descreve a transferência do sítio de ligação ao antigeno de um anticorpo não-humano, por exemplo um anticorpo derivado de murino, a uma estrutura principal aceptor humano, por exemplo, uma sequência da linha germinativa humana (Retter I et al. (2005). Nucleic Acids Res. 33:D671-D674.).

[00436] A principal justificação para a humanização de um anticorpo é vista na minimização do risco de desenvolver uma resposta imunogênica ao anticorpo em humanos (Rebello PR et al. (1999) Transplantation 68: 1417-1420). O sítio de ligação ao antigeno compreende as regiões determinantes complementares (CDRs) (Chothia C e Lesk AM (1987) Journal of Molecular Biology 196:901 -917; Kabat E et al. (1991) Anon. 5- Edição ed; Publicação NIH N^Q 91: 3242) e posições fora da CDR, isto é, na região de estrutura principal dos domínios variáveis (VL e VH) que afetam direta ou indiretamente a ligação. Os resíduos de estrutura principal que podem afetar diretamente a ligação podem, por exemplo, ser encontrados na assim chamada região de laço externa localizada entre CDR2 e CDR3. Os resíduos que afetam indiretamente a ligação são, por exemplo, encontrados nas assim chamadas Zonas Vernier (Foote J, Winter G. (1992) Journal of Molecular Biology 224:4 87-499). Acredita-se que os

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184/201 mesmos suportem a conformação de CDR. Essas posições fora das CDRs são consideradas ao escolher uma estrutura principal aceitador adequado para minimizar o número de desvios do anticorpo humanizado final para a sequência aceitadora de linha germinativa humana nas regiões de estrutura principal.

[00437] Múltiplas estruturas principais aceptoras de linha germinativa humana foram testados para humanização tanto de cadeia leve quanto de cadeia pesada. Por exemplo, as estruturas principais humanas VBase_VH4_4-30.1 e VBase_VH3_3-21 foram testadas para a humanização de cadeia pesada, e as estruturas principais humanas VBase_VK1_O18 e VBase_VK3_L25 foram testadas para humanização de cadeia leve.

Otimização de Sequência de Maturação por Afinidade [00438] Certos motivos da sequência de aminoácidos são conhecidos por sofrerem modificação pós-tradução (PTM) tal como glicosilação (isto é, NxS/T, x qualquer exceto P), oxidação de cisteínas livres, desamidação (por exemplo, NG) ou isomerização (por exemplo, DG). Se estiverem presentes nas regiões de CDR, esses motivos são idealmente removidos por mutagênese sítio-dirigida, a fim de aumentar a homogeneidade do produto.

[00439] O processo de maturação por afinidade é bem descrito na técnica. Entre os muitos sistemas de apresentação, apresentação de fagos (Smith GP, 1985, Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228:1315-1317) e apresentação em células eucarióticas, tais como levedura (Boder ET e Wittrup KD, 1997, Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15: 553-557) parecem ser os sistemas mais comumente utilizados para selecionar a interação anticorpo-antígeno. As vantagens desses sistemas de apresentação são que eles são adequados para uma ampla

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185/201 gama de antígenos e que o rigor da seleção pode ser facilmente ajustado. Na apresentação de fagos, fragmentos scFv ou Fab podem ser apresentados e em IgG de comprimento total de levedura, adicionalmente. Esses métodos comumente aplicados permitem a seleção de variantes de anticorpos desejadas a partir de bibliotecas maiores com diversidades de mais de 10E7. Bibliotecas com menor diversidade, por exemplo, 10E3, podem ser rastreadas por microexpressão e ELISA. Bibliotecas de variantes de anticorpo não direcionadas ou aleatórias podem ser geradas, por exemplo, por PCR propensa a erros (Cadwell RC e Joyce GF, 1994, Mutagenic PCR. PCR Methods Appl. 3: S136-S140) e fornecer uma abordagem muito simples, mas por vezes limitada. Outra estratégia é a diversificação dirigida por CDR de um candidato a anticorpo. Uma ou mais posições em uma ou mais CDRs podem ser direcionadas especificamente usando, por exemplo, mutagênese com trinucleotídeo (TRIM) oligos degenerados (Thompson J et al., 1996, Affinity maturation of a high-affinity human monoclonal antibody against the third hypervariable loop of human immunodeficiency virus: use of phage display to improve affinity and broaden strain reactivity. J.Mol.Biol. 256: 77-88) (Kayushin AL et al., 1996, A convenient approach to the synthesis of trinucleotide phosphoramidites-synthons for the generation of oligonucleotide/peptide libraries. Nucleic Acids Res. 24: 3748-3755) ou qualquer outra abordagem conhecida na técnica. Modificações de aminoácidos foram feitas para candidatos de humanização para remover PTM.

Geração de Plasmídeos de Expressão [00440] Sequências de DNA que codificam domínios VL e VH humanizados foram encomendadas a GeneArt™ (Life Technologies Inc., Regensburg, Alemanha), incluindo otimização de códons para homosapiens. Sequências que codificam domínios VL e VH foram

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186/201 subclonadas por cortar e colar, a partir dos vetores derivados de GeneArt em vetores de expressão adequados para secreção em células de mamíferos. As cadeias pesadas e leves foram clonadas em vetores de expressão individual para permitir cotransfecção. Os elementos do vetor de expressão incluem um promotor (promotor-intensificador de citomegalovírus (CMV)), uma sequência de sinal para facilitar a secreção, um sinal de poliadenilação e terminador de transcrição (gene de Hormônio de Crescimento Bovino (BGH)), um elemento permitindo replicação epissomal e replicação em procariotas (por exemplo, origem SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e elementos para permitir a seleção (gene de resistência a ampicilina e marcador de zeocina).

Expressão e Purificação de Candidatos a Anticorpos Humanizados [00441] As células do Rim Embrionárias Humanas que expressam constitutivamente 0 antígeno T grande de SV40 (HEK293-T ATCC11268) são uma das linhas celulares hospedeiras comumente utilizadas para a expressão transiente de proteínas IgG humanizadas e/ou otimizadas. As transfecções foram realizadas utilizando PEI (Polietilenimina, PM 25.000 linear, Polysciences, EUA Cat. N^Q 23966) como reagente de transfecção.

[00442] Uma primeira purificação foi realizada por afinidade em uma coluna HiTrap ProtA MabSelect®SuRe. O eluato foi testado quanto a agregação (SEC-MALS) e pureza (SDS-PAGE, LAL e MS). Se necessário, os grupos da primeira purificação foram carregados com um SPX (Hi-Load 16/60 Superdex 200 graus 120 mL (GE-Helthcare). NGV004, NGV005, e NGV006 são mAbs humanizados derivados do hibridoma 127F19 de camundongo. Os isotipos lgG1 L234A/L235A (LALA) ou IgGlK D265A/P329A (DAPA) foram selecionados como medidas preventivas para reduzir a capacidade do anticorpo de promover citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

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187/201 (ADCC) e citotoxicidade dependente de complemento (CDC) (ver, por exemplo, Hezareh M etal. (2001) Journal of Virology 75:12161-12168). Os candidatos à humanização NOV004, NOV005 e NOV006, que são isotipos IgG 1 (DAPA), foram expressos e purificados como descrito.

Exemplo 2: Caracterização in vitro de anticorpos monoclonais [00443] O trabalho in vitro foi realizado para mostrar as propriedades de ligação e atividade celular de NOV004, NOV005 e NOV006. Utilizouse Biacore como descrito no Exemplo 1 para estimar as Kds dos mAbs para a β-klotho humana. NOV004, NOV005 e NOV006 têm Kds calculadas em cerca de 3xE-10M, 3xE-10M, e 4xE-10M, respectivamente.

[00444] O ensaio de pERK como descrito no Exemplo 1 foi utilizado para perfilar mAbs para a atividade do receptor FGFRJS-klotho. NOV004 ativou o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana e de macaco cinomolgo com ECsos calculadas como sendo cerca de 3 nM e 20 nM, respectivamente (Figura 1). NOV005 ativou o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana e de macaco cinomolgo com EC50S calculadas como sendo cerca de 3 nM e 16 nM, respectivamente (Figura 1). NOV006 ativou o complexo receptor FGFR1cJ3-klotho humana e de macaco cinomolgo com ECsos calculadas como sendo cerca de 4 nM e 18 nM, respectivamente (Figura 1). NOV005, NOV006 e NOV006 não ativaram os complexos receptor FGFR2cJ3-klotho, FGFR3cJ3-klotho, ou FGFR4J3-klotho (Figura 2). Os mAbs foram perfilados para a atividade de FGF23 como descrito no Exemplo 1. NOV005, NOV006 e NOV004 não exibiram atividade de FGF23 (Figura 3). Os dados de Forte Bio mostram que NOV005 e NOV006 competem com o NOV004 pela ligação a β-klotho humana (Figura 4).

[00445] Estudos de mapeamento de epítopo pela troca de hidrogênio deutério do domínio extracelular de β-klotho humana com uma versão de NOV004 que possui um isotipo lgG1-LALA humano mostram que os

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188/201 seguintes peptídeos estão significativamente protegidos no complexo ECD mAb-p-klotho: aa 246-265, 343-349, 421-429, 488-498, 509-524, 536-550, 568-576, 646-669, 773-804, 834-857, e 959-986 e que as seguintes regiões são mais fortemente protegidas: aa 246-265, 536550, 834-857 e 959-986 (dados não apresentados; ver a publicação de pedido internacional PCT N^Q WO 2017/021893, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade). Estes estudos, em combinação com os dados de ligação, de atividade e de competição, indicam que NOV005 e NOV006 também iriam proteger significativamente tais regiões ECD de β-Klotho.

Exemplo 3: Perfis farmacocinéticos de anticorpos monoclonais em camundongos

Animais e condições de manutenção [00446] O cuidado e a criação de animais foram fornecidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council). Todos os procedimentos foram regidos pelos padrões estabelecidos pelo Department of Health and Human Services dos EUA e realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Animais do Institutes for BioMedical Research (NIBR) da Novartis. Ratos machos Sprague-Dawley (n = 3/grupo) foram alojados em gaiolas de fundo sólido em uma estante equipada para fornecer automaticamente água ad libitum, mantidos em um ciclo de 12 h de luz/escuro (06:0018:00), e dado acesso livre a ração padrão para roedores (HarlanTeklad; Frederick, MD; cat# 8604). O biotério foi mantido entre 68 e 76°F com 30 a 70% de umidade.

Preparação e dosagem de NQV004, NQV005 ou NQV006 [00447] Soluções de estoque de NGV004, NGV005 e NGV006 em His/His-HCI 10 mM, sacarose 220 mM foram descongeladas sob refrigeração antes da utilização. Na manhã da dosagem, todos os três

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189/201 anticorpos foram diluídos para aproximadamente 3 mg/mL em PBS e os volumes apropriados foram coletados em seringas doseadoras (3 mL/kg) e mantidos à temperatura ambiente até à administração. Os animais foram colocados em retentores de tubo e administrados com NOV004, NOV005 ou NOV006 por via intravenosa (IV) na veia da cauda (10 mg/kg).

Coleta de amostra de sangue [00448] As amostras de sangue foram coletados no dia -3 (linha de base), no dia 0 (1 e 6 h pós-dose) e nos dias 1,2, 3, 4, 8, 16 e 28 pósdose. Todos os pontos temporais foram cronometrados a partir do final da administração da dose administrada no dia 0. Em cada momento, aproximadamente 70 μΙ_ (70 μΙ_) de sangue foram coletados em tubos de recolha/separação BD Microtainer com EDTA (Becton, Dickinson, and Company; Franklin Lakes, NJ; cat# 365973). A pressão foi aplicada com gaze para parar o sangramento. As amostras foram centrifugadas durante 10 min a 20.817 x g, e, em seguida, ~30 mL de plasma foram transferidos para tubo Thermo-strip de 0,2 mL (Thermo-Scientific; Pittsburg, PA; cat# AB-0451) e congelados a 80 °C. Os ratos foram devolvidos à sua gaiola depois de cada coleta.

Medição das concentrações totais de NQV004, NQV005 ou NQV006 no plasma [00449] A IgG humana (isto é, NOV004, NOV005 ou NOV006) em plasma de rato foi quantificada usando um imunoensaio sanduíche personalizado com um anticorpo Fc-gama anti-Humano de cabra (KPL #109-005-098) como anticorpo de captura e IgG anti-humano de cabra com um marcador de HRP como anticorpo de detecção. O anticorpo de captura (2 pg/mL em PBS, 30 pL/poço) foi revestido em placas de microtitulação brancas de 384 poços (Greiner Bio-One; Monroe, NC; cat N^Q 781074). As placas foram incubadas durante a noite à temperatura ambiente (TA) sem agitação. Após a aspiração da solução de

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190/201 revestimento sem lavagem, 90 pLde solução Diluente/Bloqueio Leite 1x (KPL; Gaithersburg, MD; cat. N^Q 50-82-01) foram adicionados a cada poço e as placas foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. No final da incubação, a solução foi aspirada e as placas foram armazenadas em bolsas de alumínio com dessecante a -80 °C.

[00450] No dia do ensaio, foram preparadas dezesseis concentrações padrão de NOV004, NOV005 e NOV006, variando de 0,244-4000 pM, por diluição em série em tampão de Caseína, incluindo um controle negativo em tampão. Todas as amostras do estudo foram diluídas 1:50 manualmente em tampão de Caseína e depois diluídas em série 5 vezes usando um Biomek Fx para um total de três diluições. As placas foram incubadas durante 2 h à TA e depois lavadas 3 vezes com tampão de lavagem de fosfato (90 pL/poço). Foi adicionado IgG antihumano de cabra marcado com HRP (400 ng/mL em tampão de Caseína, 30 mL/poço) a cada placa e as placas foram incubadas durante 1 h à TA. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem de fosfato (90 pL/poço) e, em seguida, foi adicionado o Substrato Quimioluminescente KPL LumiGLO (30 pL/poço; cat. N^Q 5461-00). A quimioluminescência foi lida imediatamente em um leitor de placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) em todos os comprimentos de onda com um tempo de integração de 50 ms. As concentrações de Fc humano (pM) em amostras de plasma foram interpeladas a partir das curvas padrão de NOV004, NOV005 ou NOV006, multiplicadas por fatores de diluição, e convertidos em concentrações nM.

[00451] Os animais exibiram Cmax média de aproximadamente 200 pg/mL em 1 h após a administração IV de NCV004, NCV005 ou NOV006. NOV004, NOV005 e NOV006 exibiram perfis de PK equivalentes em ratos Sprague-Dawley (Figura 5).

Exemplo 4: Avaliações de desenvolvimento e formulação [00452] O processo de produção e os estudos de formulação dos

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191/201 anticorpos NOV004, NOV005 e NOV006 foram realizados. A formação observada de espécies de alto peso molecular (HMW) durante avaliações anteriores de NOV004 sugeriu um alto grau de agregação em solução e estimulou o desenvolvimento e avaliação de outros anticorpos miméticos de FGF21 que possuem atividades funcionais comparáveis, mas melhores perfis de produção e formulação, por exemplo, nenhuma a pouca (por exemplo, menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 10%, ou menos do que 5%) formação observada de HMW.

[00453] As sequências de DNA que codificam anticorpos NGV005 e NGV006, incluindo a otimização de códon para homosapiens, foram encomendadas a GeneArt™ (Life Technologies Inc. Regensburg, Alemanha) e ATUM (Menlo Park, CA). Vetores expressando NGV004, NGV005 e NGV006 foram linearizados e transfectados em uma linha celular CHO. Os grupos foram selecionados utilizando 10 nM de metotrexato (MTX) até ser recuperado até > 95% de viabilidade. Um grupo para cada molécula foi selecionado para a produção de ondas e ampliado apropriadamente. O sobrenadante da cultura da produção de ondas foi coletado após 13 dias e filtrado.

[00454] O material de colheita de onda de NGV005 e NGV006 foi processado usando dois processos de purificação por cromatografia em coluna para anticorpos padrão - capturados usando cromatografia de afinidade (resina - GE Healthcare MabSelect SuRe) e polidos usando cromatografia de troca catiônica (CEC) (resina - Fractogel EMD SO3-). O material capturado foi submetido a Inativação Viral (ajuste do pH para 3,5, incubação a este pH à temperatura ambiente durante 70 min seguido de ajuste do pH para 5,0) e filtração estéril antes do processamento através de CEC. Após CEC, o material foi diafiltrado para trocar o tampão em histidina/histidina-HCI a 10 mM, pH 5,0 utilizando filtração de fluxo tangencial. Subsequentemente, o material

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192/201 foi concentrado para cerca de 200 mg/mL para fornecer material para estudos de formulação. Por exemplo, os anticorpos foram avaliados em tampões de formulação e certos parâmetros foram determinados, em particular, formação de HMW após 4 semanas a 40 °C. A Tabela 3 abaixo resume os dados de uma experiência exemplificativa que avalia a formação de HMW observada em amostras de NOV004, NOV005 e NOV006 após 4 semanas a 40°C.

Tabela 3: Formação de espécies de alto peso molecular (HMW)

Molécula	Concentração (mg/mL)	Formulação	%HMW (Valor absoluto)
To	4 semanas a 40°C
NOV004	150	Hist/HCI 20 mM, Sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 5,5	n.a	n.a
Hist/HCI 20 mM, sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 6,5	1,2	64
NOV005	150	Hist/HCI 20 mM, Sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 5,5	0,2	0,8
Hist/HCI 20 mM, sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 6,5	0,2	0,6
NOV006	150	Hist/HCI 20 mM, Sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 5,5	<LOQ	0,7
Hist/HCI 20 mM, sacarose 220 mM, PS20 0,04%, pH 6,5	<LOQ	0,6

LOQ = limite de quantificação [00455] As diferenças nas sequências de NOV005 e NOV006, em relação ao NOV004, conferiram melhoria significativa na formação de HMW após o armazenamento. Tanto NOV005 como NOV006 exibiram aproximadamente menos do que 1% de formação de HMW a 40 °C durante 4 semanas, enquanto NOV004 exibiu formação de HMW muito mais elevada, aproximadamente 64% de formação de HMW a 40 °C durante 4 semanas.

[00456] O alinhamento de sequência de VH e VL de NOV005 e

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NOV004 é fornecido abaixo:

VH

Identidade: 79,2

Semelhança: 88,3%

VL

Identidade: 99,1%

Semelhança: 100,0%

[00457] Estes dados mostram que NOV005 e NOV006 surpreendentemente exibiram tendências de agregação mínimas como indicado pela formação de HMW em contraste com NOV004, e sugerem que NOV005 e NOV006 exibem características adequadas, e seriam mais preferíveis, para uma formulação farmacêutica.

Exemplo 5: Estudo em Macacos Cinomolqos Obesos [00458] Os efeitos de mAbs miméticos de FGF21, tais como NOV004, NOV005 ou NOV006, no consumo de alimentos, peso corporal e biomarcadores plasmáticos em macacos cinomolgos obesos são estudados.

Protocolos Exemplificativos:

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194/201 [00459] Cinco macacos cinomolgos machos são tratados com duas doses subcutâneas (sc) de 1 mg/kg de mAbs miméticos de FGF21, tais como NGV004, NGV005 ou NGV006, a serem administradas com uma semana de intervalo (dias de estudo 0 e 7) e são avaliados o consumo de alimentos, pesos corporais e os biomarcadores plasmáticos por mais de 100 dias após a dose. Para cada dose, os animais são retidos em sua gaiola, amostras de sangue são coletadas, e então cada animal recebe uma dose subcutânea de 1 mg/kg de mAbs miméticos de FGF21, tal como NGV004, NGV005 ou NGV006. As medições do consumo de alimentos começam 1 semana antes da primeira dose e continuam durante o estudo. A dieta do estudo é pesada antes da alimentação e é dividida em duas porções iguais para cada dia. Na manhã seguinte, a dieta restante é coletada e pesada. O número de péletes (1 g cada) descartados na bandeja de captura é contado e é adicionado ao peso do restante alimento. O consumo diário de alimentos é calculado como o peso dos alimentos fornecidos menos os alimentos coletados. O consumo de frutas e vegetais não é medido. Os pesos corporais não alimentados são medidos em duplicado, três manhãs por semana (antes da coleta de sangue ou dosagem), usando o recurso dinâmico na escala.

Medição das concentrações miméticas de mAb de FGF21 no plasma [00460] A IgG Fc humana no plasma de macaco cinomologo é quantificada utilizando um imunoensaio de sanduíche baseado em ELISA. Utiliza-se lgG1 de camundongo de IgG anti-humana, um anticorpo monoclonal de camundongo contra IgG humana, como anticorpo de captura. Placas de 384 poços brancas, Greiner, são revestidas com 2 pg/mL de lgG1 de camundongo de IgG anti-humana (30 pL/poço) e são incubadas durante a noite à temperatura ambiente (TA). Anticorpos de revestimento são aspirados e 1x bloqueador de leite (KPL #50-82-01) é adicionado a 90 pL/poço durante 2 horas à TA. A

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195/201 solução de bloqueio é aspirada e as placas são armazenadas a -80 °C em sacos de placas com dessecante até ao ensaio. No dia do ensaio, as placas e reagentes são trazidos para a TA. Os padrões são feitos diluindo a IgG purificada de 4000 a 16 pM em diluente de amostra de caseína personalizada e incluindo um controle de tampão. As amostras são diluídas em duplicado 1:50, 1:250, 1:1250 e 1:6250 no mesmo diluente dos padrões, e então padrões, amostras diluídas e controles são adicionados à placa durante 2 h à TA (o volume de trabalho para todas as etapas foi de 30 pL/poço). As placas são então lavadas 3 vezes com um tampão de lavagem à base de fosfato. Anticorpo Fc-gama antihumano marcado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) é adicionado à placa durante 1 hora à TA, e depois as placas são lavadas 3 vezes com um tampão de lavagem à base de fosfato. O substrato quimioluminescente é adicionado à placa e a placa é imediatamente lida em um leitor de placas de luminescência.

[00461] Os padrões de mAb mimético de FGF21, por exemplo, NOV004, NOV005 ou NOV006, são analisados em triplicado por placa. As amostras de plasma diluído são analisadas em duplicado. Amostras desconhecidas são interpeladas a partir da curva padrão de IgG. O ajuste de curva, o cálculo de retorno, a % de recuperação e a interpelação das concentrações da amostra são realizados usando o SoftMax Pro Software v5.4.1. O sinal gerado pelos padrões de IgG foi plotado e ajustado usando uma opção de ajuste de curva logística de 4 parâmetros. As concentrações de Fc (pM) nas amostras de plasma são interpeladas a partir da curva padrão do mAb mimético de FGF21 e multiplicadas por fatores de diluição. O limite inferior de quantificação do ensaio (LLOQ) e o limite superior de quantificação (ULOQ) são determinados. LLOQ e ULOQ são definidos como a concentração padrão inferior e superior com 100% de recuperação ± 20% e CV <20% e depois multiplicados pelos fatores de diluição.

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196/201

Detecção de anticorpos anti-fármaco [00462] As amostras de plasma são diluídas 1:5 em tampão LowCross (Boca Scientific; Boca Raton, FL; cat. N^Q 100 500). A mistura reacional é preparada contendo 0,6 pg/mL de mAb mimético de FGF21 marcado com biotina e 0,6 pg/mL de mAb mimético de FGF21 marcado com digoxigenina em tampão LowCross. O plasma diluído (80 pL) é combinado com 160 pL de Mistura Reacional em placas de 96 poços com fundo em U (BD Falcon; Billerica, MA; cat N^Q 351177). As bordas das placas são seladas com Parafilme e as placas são incubadas em uma plataforma de agitação a 37 °C durante 2 h (150 rpm, protegidas da luz). Uma alíquota de cada mistura (100 pL) é então transferida para poços duplicados de placas de 96 poços revestidos com estreptavidina (Roche; cat. N^Q 11734776001), que são primeiro lavados 3 vezes com tampão de lavagem consistindo em 1X PBS contendo 0,05% (v/v) de Tween-20 (300 pL por poço). As placas são seladas e depois incubadas à TA em uma plataforma de agitação durante 1 h (300 rpm, protegidas da luz). As placas são lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (300 pL por poço) e, em seguida, 100 pL de fragmento Fab anti-digoxigenina peroxidase_POD (Roche; cat. N^Q 11633716001) diluído 1:2500 em tampão LowCross são adicionados a cada poço. As placas são seladas, são incubadas à TA em uma plataforma de agitação durante 45 minutos (300 rpm, protegidas da luz) e depois são lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (300 pL por poço). Um Substrato Micropoço HRP de Um Componente TMB (Bethyl Laboratories; Montgomery TX; cat N^Q E102; 100 pL/poço) é adicionado a cada poço e foi desenvolvida uma cor azul durante 9-10 min, protegido da luz. A reação de cor é interrompida pela adição de 100 pL de H2SO4 0,18 N a cada poço, as placas são agitadas brevemente, e a cor amarela é medida a DO450.

Medição das concentrações de glucose no plasma [00463] As concentrações de glucose no plasma são medidas

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197/201 usando um ensaio de glucose Autokit (Wako Chemicals, Richmond, VA; catálogo N^Q 439-90901). Uma curva padrão é preparada diluindo o calibrador para padrões de 500, 200, 100, 50, 20 e 0 mg/dL. O reagente de ensaio (300 μΙ_), pré-aquecido a 37 °C, é adicionado a 2 μΙ_ de plasma, padrões e amostras de controle em uma placa de 96 poços de fundo plano e transparente (Thermo Scientific; cat N^Q 269620). A placa é misturada em um agitador de placas durante 30 s e depois incubada a 37°C durante 5 min. Após uma mistura de 20 s, a placa é lida a 505/600 nm utilizando um dispositivo Molecular Devices SPECTRAmax PLUS 384 (Sunnyvale, CA). As concentrações de glucose da amostra são calculadas comparando com a curva padrão.

Medição das concentrações de insulina no plasma [00464] As concentrações de insulina no plasma são determinadas utilizando o Kit RIA específico de Insulina Humana Millipore (Billerica, MA; cat N^Q HI-14K.) de acordo com as instruções do fabricante.

[00465] Quantidades apropriadas de tampão de ensaio, padrões ou amostra de plasma diluído são misturadas com ¹²⁵l-lnsulina e anticorpo anti-insulina em tubos SARSTEDT PP de 5 mL, 75 x 12 mm (Cat N^Q 55,526). Os tubos são colocados em vórtice, cobertos e incubados durante 20 horas à TA. Após a incubação, 1 mL de reagente de precipitação a 4 °C é adicionado e os tubos são colocados em vórtice e incubados durante 30 min. a 4 °C. Todos os tubos são centrifugados durante 30 min (3000 rpm a 4°C), os sobrenadantes são decantados e os péletes são contados em um Contador Gama Automático PerkinElmer WIZARD2 (modelo N^Q 2470; PerkinElmer; Waltham, MA). As concentrações de insulina são calculadas comparando com uma curva padrão gerada usando quantidades conhecidas de insulina. Medição das concentrações de triglicerídeos no plasma [00466] As concentrações de triglicerídeos (TG) plasmáticos são medidas usando o conjunto do Reagente Líquido de Triglicerídeos

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198/201 (GPO) (Pointe Scientific; Canton, Ml; cat N^Q T7532-500). O reagente de ensaio pré-aquecido (300 μΙ_, 37 °C) é adicionado a 5 μΙ_ de plasma em uma placa de 96 poços de fundo plano e transparente (Thermo Fisher Scientific; Tewksbury, MA; cat N^Q 269620). A placa é misturada em um agitador de placas durante 30 s e depois é colocada em uma incubadora a 37°C durante 5 min. Após uma mistura de 20 s, a absorbância é medida a 500 nm com um leitor de placas SPECTRAmax PLUS. As concentrações de TG são calculadas comparando com uma curva de calibração gerada usando quantidades conhecidas de um padrão de TG (Pointe Scientific; cat N^Q T7531-STD).

Medição das concentrações de colesterol plasmático:

[00467] O colesterol total (CT) plasmático é quantificado utilizando o conjunto de Reagente de Colesterol (Líquido) (Pointe Scientific; cat N^Q C7510-500). O reagente de ensaio pré-aquecido (200 pL, 37 °C) é adicionado a 10 pL de plasma em uma placa de ensaio de 96 poços de fundo plano e transparente (Thermo Fisher Scientific; Cat N^Q 269620). A placa é misturada em um agitador de placas durante 30 s e depois incubada a 37 °C durante 5 min. Após uma mistura de 20 s, a absorbância é medida a 500 nm em um leitor de placas SPECTRAmax PLUS. As concentrações de colesterol são calculadas comparando com uma curva de calibração gerada usando quantidades conhecidas de um padrão de colesterol (Stanbio Laboratory; Boerne, TX; cat N^Q1012-030). Medição das concentrações plasmáticas de colesterol de lipoproteína de alta densidade [00468] Para determinação das concentrações de colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL), 50 pL de amostra de plasma são combinados com 50 pL de Reagente de Precipitação de Colesterol (Wako Chemicals; Richmond, VA; cat. N^Q 431-52501) em um tubo de microcentrifuga de 0,5 mL e é brevemente colocado em vórtice. O tubo é colocado à temperatura ambiente durante 10 min e depois é

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199/201 centrifugado a 2000 x g durante 10 min a 4 °C. Após a centrifugação, aproximadamente metade do sobrenadante (contendo a porção de colesterol HDL da amostra de plasma original) é removida e 10 μΙ_ são utilizados para o ensaio de colesterol descrito acima.

Medição das concentrações plasmáticas de β-hidroxibutirato [00469] As concentrações de β-hidroxibutirato (β-ΗΒ) no plasma são medidas utilizando o kit LiquiColor Test de β-hidroxibutirato (Stanbio Laboratory;, cat N^Q 2440-058). Reagente de ensaio R1 (215 pL préaquecido a 37°C) é adicionado a 20 pL de controle de qualidade ou amostra de plasma em uma placa de 96 poços de fundo plano e transparente (Thermo Fisher Scientific; cat. N^Q 269620). A placa é misturada em um agitador de placas durante 30 s e depois colocada em uma incubadora a 37^QC durante 5 min. A pré-leitura da absorvância é medida a 505 nm em um leitor de placas SPECTRAmax PLUS. O reagente de ensaio R2 (35 pL pré-aquecido a 37°C) é adicionado a cada poço e a placa é novamente misturada em um agitador de placas durante 30 s e é incubada a 37 °C durante 5 min. Após uma mistura de 20 s, a absorvância final é medida a 505 nm a partir da qual o valor de pré-leitura foi subtraído. As concentrações de β-ΗΒ são calculadas comparando com uma curva de calibração gerada usando quantidades conhecidas de um calibrador β-ΗΒ (Wako Diagnostics; Richmond, VA; cat. N^Q 412-73791).

Análises estatísticas [00470] As análises estatísticas são realizadas usando o GraphPad Prism (versão 6.05; GraphPad Software; La Jolla, CA). Os dados de ingestão de alimentos para cada animal são normalizados como uma percentagem da linha de base (calculada como a média dos dias -6 a 0) e, em seguida, as médias do grupo ± erros padrão da média (SEM) são calculados; cada dia é comparado ao dia 0 pelo teste não paramétrico de Friedman com comparações múltiplas de pós-teste de Dunn. Os

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200/201 pesos corporais são apresentados como médias de grupo ± erros padrão da média (SEM) calculados como percentagem da linha de base (calculada como a média dos dias -7, -5, -3 e 0). Os dados do peso corporal e do biomarcador plasmático também são analisados por teste não paramétrico de Friedman com comparações múltiplas de pós-teste de Dunn. P <0,05 é considerado significativo.

Exemplo 6: Estudo em Macacos Cinomolqo Obesos [00471] Para avaliar os efeitos de NOV005 em macacos cinomolgo obesos normoglicémicos machos, duas doses subcutâneas de 1 mg/kg de NOV005 (n = 5 animais) ou veículo (n = 3 animais) foram administradas com uma semana de intervalo. Os resultados do estudo provisório estão resumidos abaixo:

• NOV005 reduziu o consumo de alimento para ração padrão, com um pico de redução média de cerca de 60% em comparação com o valor da linha de base (Figura 6A) e um pico de redução média de peso de cerca de 10% em comparação com valores da linha de base nos animais tratados NOV005 (Figura 6B) • O plasma de animais não submetidos a jejum foi analisado quanto a alterações nos biomarcadores do metabolismo dos lipídeos e carboidratos:

o Foi observada uma diminuição média de cerca de 65% para os níveis de TG no plasma em animais tratados com NGV005 em comparação com os valores da linha de base no dia 35 o NGV005 também diminuiu o colesterol total e a insulina em comparação com o valor da linha de base no dia 35, mas essas mudanças não foram estatisticamente significativas o Outros biomarcadores que serão medidos no final do estudo incluem os perfis de adiponectina, β-hidroxibutirato, ApoCIII, HDL-C e lipoproteína

Tabela 0 NOV005 melhorou os níveis de biomarcadores

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201/201 plasmáticos em macacos cinomolgo obesos

Biomarcador1	Linha de Base2	Dia 35	%Δ Média3
Triglicerídeos (mg/dL)	177 ± 13	47 ± 15	-65 ±12*
Colesterol total (mg/dL)	108 ±2	90 ±9	-17 ±6
Glucose (mg/dL)	64 ±4	66 ±9	3 ±7
Insulina (gU/mL)	212 ±33	29 ±7	-54 ± 15

Valores representam médias de grupo ± SEM.

¹Sangue foi coletado de animais não submetidos a jejum para medições de biomarcadores.

²Os valores de linha de base refletem a média dos dias -7, -3 e 0.

³A alteração da percentagem foi calculada para cada indivíduo e, em seguida, a média para a média do grupo ± SEM.

*P < 0,05 vs linha de base por teste não paramétrico de Friedman com pós-teste de Dunn.

Incorporação por Referência [00472] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patentes, artigos, livros e semelhantes, e as referências aí citadas, na medida em que já não são, são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Claims (38)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno que se liga a β-klotho, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

   uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

   uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

   uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

   uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 31,22 ou 25;

   uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.
2. 2. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

   uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

   uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

   uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

   uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31,22 ou 25;

   uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a

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   2/11 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.
3. 3. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

   uma CDR1 de cadeia pesada (HCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 9, 10 ou 12;

   uma CDR2 de cadeia pesada (HCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, 11 ou 13;

   uma CDR3 de cadeia pesada (HCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou 14;

   uma CDR1 de cadeia leve (LCDR1) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, 22 ou 25;

   uma CDR2 de cadeia leve (LCDR2) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 ou 23; e uma CDR3 de cadeia leve (LCDR3) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ou 24.
4. 4. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno compreende:

   (i) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (ii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a

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   3/11 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (iii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; ou (iv) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
5. 5. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

   (i) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma

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   4/11

   LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (ii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (iii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; ou (iv) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.
6. 6. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:

   (i) uma HCDR1 compreendendo a sequência de

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   5/11 aminoácidos de SEQ ID NO: 6, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (ii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 ou 31, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21;

   (iii) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   22, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; ou (iv) uma HCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, uma HCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, uma HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, uma LCDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   23, e uma LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

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   6/11

   ID NO: 21.
7. 7. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ou uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% ou 95% de identidade dos mesmos; e (ii) uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26 ou 32 ou uma sequência de aminoácidos com, pelo menos, 90% ou 95% de identidade dos mesmos.
8. 8. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.
9. 9. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 ou 32.
10. 10. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende um (i) uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, ou (ii) uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32 .
11. 11. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID

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    NO: 28, ou (ii) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
12. 12. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo isolado ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não compreende (i) CDRs combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.
13. 13. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compete pela ligação a β-klotho com um anticorpo isolado ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno não compreende (i) CDRs combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.
14. 14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento não compreende (i) CDRs Combinadas ou de Kabat do anticorpo NQV004, como apresentado na Tabela 2; e/ou (ii) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 ou 55 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de

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    8/11 aminoácidos de SEQ ID NO: 47 ou 57.
15. 15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. 16. Método de tratamento de um distúrbio metabólico, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um indivíduo afetado por um distúrbio metabólico, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é afetado por um ou mais dos seguintes: obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia e síndrome metabólica.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é afetado por um ou mais dos seguintes: obesidade, diabetes, hipertrigliceridemia e dislipidemia.
19. 19. Método de tratamento de um distúrbio cardiovascular, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, a um indivíduo afetado por um distúrbio cardiovascular, de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é afetado por um ou mais de aterosclerose, doença arterial periférica, acidente vascular cerebral, insuficiência cardíaca e doença cardíaca coronária.

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21. 21. Anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para utilização como um medicamento.
22. 22. Método de redução do peso corporal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14.
23. 23. Método de redução do apetite ou da ingestão de alimentos, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14.
24. 24. Método para reduzir as concentrações plasmáticas de triglicéridos (TG) ou as concentrações plasmáticas de colesterol total (CT) em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14.
25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 22, 23, ou 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é afetado por um distúrbio metabólico.
26. 26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é afetado por um ou mais dos seguintes: obesidade, diabetes mellitus tipo 1 e tipo 2, pancreatite, dislipidemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperglicemia e síndrome metabólica.

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27. 27. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica para um ou mais dos anticorpos, como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, ou para uma VL e/ou VH de qualquer um dos anticorpos.
28. 28. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência com, pelo menos, 90% de identidade com as sequências estabelecidas na Tabela 1.
29. 29. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência com, pelo menos, 95% de identidade com as sequências estabelecidas na Tabela 1.
30. 30. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência estabelecida na Tabela 1.
31. 31. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, como definido nas reivindicações 27, 28, 29 ou 30.
32. 32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 31.
33. 33. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, para uso no tratamento de um distúrbio metabólico.
34. 34. Método de preparação de um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que se liga a β-klotho, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de cultura da célula hospedeira, como definida na reivindicação 32, sob condições adequadas para a expressão do anticorpo ou um seu fragmento.
35. 35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o distúrbio metabólico é a obesidade, diabetes, hipertrigliceridemia e dislipidemia.
36. 36. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno,

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    11/11 como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14, para uso no tratamento de um distúrbio cardiovascular.
37. 37. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 14, para utilização em um método de redução do peso corporal, de um método de redução do apetite ou da ingestão de alimento, um método para reduzir concentrações de triglicerídeos no plasma (TG) ou concentrações plasmáticas de colesterol total (CT) em um indivíduo.
38. 38. Uso do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antigeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio metabólico, para o tratamento de um distúrbio cardiovascular, para reduzir o peso corporal, para a redução do apetite ou a ingestão de alimentos, para redução das concentrações plasmáticas de TG ou concentrações plasmáticas de CT em um indivíduo.