JP6306605B2 - Ｅｐｏを標的とする抗体のための組成物および方法 - Google Patents

Ｅｐｏを標的とする抗体のための組成物および方法 Download PDF

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Description

背景技術
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病を伴う患者において最も一般的な合併症である。糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）は、ＤＲの任意の段階で生じることが可能であり、ＤＲを伴う患者における視力喪失の主要な原因である。追跡の１０年後におけるＤＭＥの発症率は、１型糖尿病において２０．１％であり、２型のインスリン依存性糖尿病において２５．４％であり、および２型の非インスリン依存性糖尿病において１３．９％であることが報告されている（Kleinら（1995）Ophthalmology 102、7〜16）。ＤＲにおける先駆的研究であるＥＴＤＲＳ試験（（1985）、Photocoagulation for Diabetic Macular Edema - Early Treatment Diabetic- Retinopathy Study Report. 1. Archives of Ophthalmology 103、1796〜1806）では、レーザー光凝固療法は、３歳時において、ＤＭＥを伴う眼における中程度の視力喪失の危険性を約５０％低減するが、視力が上昇するのは少数の眼に限られ、一部の眼は、集中的な処置の後でもなお、視力喪失したままであることが裏付けられた。近年、薬物療法および眼内薬物送達の進歩は、ＤＭＥの処置に明るい見通しを示している。ＤＭＥにおける２つの枢要なフェーズＩＩＩ試験のうちの１つであるＲＥＳＴＯＲＥ研究（Mitchellら（2011）Ophthalmology 118、615〜625）により、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）は、レーザー単独療法より良好であることが裏付けられた。臨床主要評価項目である最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の平均変化は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）群において著明に改善された（レーザー群の＋０．８文字と対比したＬｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）群の＋６．１文字；ｐ＜０．０００１）。ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＵＳＡ）およびＯｚｕｒｄｅｘ（登録商標）（デキサメタゾンの硝子体内インプラント；Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）（Doら（2011）Ophthalmology 118、1819〜1826; Hallerら（2010） Archives of Ophthalmology 128、289〜296）でも、同様の有益な効果が裏付けられている。しかし、Ｏｚｕｒｄｅｘで処置された眼のうちの１６％が、緑内障の危険性がある、眼内圧の増大を発症した。
ＤＭＥのこれらの新たな処置選択肢にもかかわらず、医療的必要は、依然として実質的に満たされていない。Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）枢要試験における眼のうちの約２５％では、１２カ月間にわたる処置の後でも、いかなる視力の上昇も見られず、眼のうちの約５０％は、２０／４０以下の視力のままであった。ゲノム規模の関連研究は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ：erythropoietin）プロモーター多型（Ｔ）についてホモ付着性の糖尿病患者は、増殖性ＤＲを発症する危険性が２．１７倍であることを指し示した（Tongら（2008） Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105、6998〜7003）。興味深いことに、ＥｐｏについてＴプロモーター対立遺伝子を伴う者は、硝子体中のＥｐｏ濃度が、Ｇ対立遺伝子を伴う者と比較して約７．５倍である（Tongら（2008） Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105、6998〜7003）。
糖尿病性網膜症、特に、ＤＭＥに有効な処置であって、現行の処置を置きかえるかまたは補充する処置を開発する必要が依然として存在する。
本発明は、Ｅｐｏおよび／またはダルベポエチンに結合する、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片に関する。
本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、Ｅｐｏおよび／またはダルベポエチンに、１００ｐＭ以下のＫＤで結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏおよび／またはダルベポエチンに、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３５ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２５ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１５ｐＭ以下、１４ｐＭ以下、１３ｐＭ以下、１２ｐＭ以下、１１ｐＭ以下、１０ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ヒトＥｐｏにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される３５ｐＭ以下のＫＤで、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により測定される６ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ダルベポエチンにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される２４ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される４ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。
本発明は、ヒト、カニクイザル、マウスおよび／またはラットＥｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、ヒトＥｐｏヘリックスＤおよびループＡ〜Ｂから選択されるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はさらに、ヒトＥｐｏヘリックスＤ、ループＡ〜Ｂ、およびヘリックスＡから選択されるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明の特定の態様では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）に結合しうる。他の態様では、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）に結合しうる。他の態様では、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）、およびヘリックスＡ（ヒトＥｐｏのアミノ酸４〜２６；配列番号８６）に結合しうる。本発明のさらなる態様では、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）、およびループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）に結合しうる。本発明のなおさらなる態様では、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）、およびヘリックスＡ（ヒトＥｐｏのアミノ酸４〜２６；配列番号８６）に結合しうる。本発明のなおさらなる態様では、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）、およびヘリックスＡ（ヒトＥｐｏのアミノ酸４〜２６；配列番号８６）に結合しうる。
本発明はまた、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸残基Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はさらに、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸残基Ｓｅｒ９、Ｇｌｎ１３、Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｙ１５８、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はなおさらに、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸残基Ｇｌｕ２３、Ａｓｐ４３、Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｒｇ１３１、Ａｒｇ１４３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Ｅｐｏに結合し、表１に記載されている抗体との結合についてさらに競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表１に記載されている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関する。
本発明はまた、Ｅｐｏに結合し、等電点（ｐＩ）が、８．２を超えるか、８．３を超えるか、８．４を超えるか、８．５を超えるか、または９．０を超える、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、カニクイザルＥｐｏ、マウスＥｐｏ、および／またはラットＥｐｏにも、１００ｐＭ以下、８０ｐＭ以下、７０ｐＭ以下、６０ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、４０ｐＭ以下、３５ｐＭ以下、３０ｐＭ以下、２５ｐＭ以下、２０ｐＭ以下、１５ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、４ｐＭ以下、３ｐＭ以下、２ｐＭ以下、１ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、カニクイザルＥｐｏ、マウスＥｐｏ、および／またはラットＥｐｏにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される８０ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される４０ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、カニクイザルＥｐｏにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される８０ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される８ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、マウスＥｐｏにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される４５ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される３７ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ラットＥｐｏにも、Ｂｉａｃｏｒｅにより測定される５７ｐＭ以下のＫＤで、またはＳＥＴにより測定される１３ｐＭ以下のＫＤで結合しうる。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片の結合アフィニティーは、ＳＥＴにより決定することができる。当技術分野では、ＳＥＴ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Ｂｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片を使用して、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１９０ｐＭ以下、１８０ｐＭ以下、１７５ｐＭ以下、１７０ｐＭ以下、１６０ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１２５ｐＭ以下、１１５ｐＭ以下、１１０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、または８０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害することができる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイにより測定されるＥｐｏ依存性の細胞増殖を、３３８ｐＭ以下、１８３ｐＭ以下、１７５ｐＭ以下、１７４ｐＭ以下、１４５ｐＭ以下、１１２ｐＭ以下、８９ｐＭ以下、または７４ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片を使用して、Ｂ細胞におけるＥｐｏ依存性の細胞増殖を阻害することができる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片を使用して、マウスＢ細胞におけるＥｐｏ依存性の細胞増殖を阻害することができる。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイにより測定されるＥｐｏ依存性の細胞増殖を、３５０ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、２００ｐＭ以下、１７５ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１２５ｐＭ以下、１１５ｐＭ以下、１１０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、９０ｐＭ以下、または８０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイにより測定されるＥｐｏ依存性の細胞増殖を、３３８ｐＭ以下、１７４ｐＭ以下、１１２ｐＭ以下、または７４ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。
本明細書で記載される単離抗体および抗原結合性断片を使用して、ヒトＢ細胞のＥｐｏ依存性の細胞増殖を阻害することができる。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイにより測定されるＥｐｏ依存性の細胞増殖を、２００ｐＭ以下、１９０ｐＭ以下、１８０ｐＭ以下、１７０ｐＭ以下、１６０ｐＭ以下、１５０ｐＭ以下、１２５ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、または９０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイにより測定されるＥｐｏ依存性の細胞増殖を、１８３ｐＭ以下、１７５ｐＭ以下、１４５ｐＭ以下、または８９ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害しうる。
単離抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を遮断することも可能であり、かつ／またはＥｐｏと細胞表面の結合を防止することも可能である。
本発明の別の態様は、ヒト、カニクイザル、マウスおよび／またはラットＥｐｏに特異的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、表１に記載されている抗体または抗原結合性断片との結合について競合する。
本明細書で記載される単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、モノクローナル抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはＳｃＦｖ断片、および／またはＩｇＧアイソタイプでありうる。
本明細書で記載される単離抗体またはそれらの抗原結合性断片はまた、アミノ酸が、ヒトＶＨ生殖細胞系列配列またはヒトＶＬ生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
本発明の別の態様は、表１に記載されているＦａｂの完全重鎖および軽鎖配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂのＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明のさらなる態様は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂのＮＶＳ１（それぞれ、配列番号１３および１４）、ＮＶＳ２（それぞれ、配列番号３３および３４）、ＮＶＳ３（それぞれ、配列番号５３および５４）、またはＮＶＳ４（それぞれ、配列番号７３および７４）の重鎖および軽鎖可変ドメイン配列を有しうる。
本発明はまた、配列番号１、２１、４１、および６１からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ１、配列番号２、２２、４２、および６２からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＥｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様では、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３をさらに含む。
本発明はまた、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ３を含み、ヒトＥｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Ｅｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片であって、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、およびＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を有し、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３が、配列番号１、２、３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号４、５、６を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３が、配列番号２１、２２、２３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号２４、２５、２６を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３が、配列番号４１、４２、４３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号４４、４５、４６を含むか、またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３が、配列番号６１、６２、６３を含み、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３が、配列番号６４、６５、６６を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
本発明はまた、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、配列番号１３、３３、５３、または７３の可変重鎖のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１４、３４、５４、または７４の可変軽鎖のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する抗体または抗原結合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定される、配列番号１３、３３、５３、または７３の重鎖可変ドメイン配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１４、３４、５４、または７４の軽鎖可変ドメイン配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有しうる。
本発明の一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。単離抗体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列をさらに含むことが可能であり、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、Ｅｐｏに対する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号１４、３４、５４、および７４から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合性断片は、Ｅｐｏに結合する。
本発明はまた、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン配列を含み、ヒトＥｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、Ｅｐｏに対する抗原結合性部位を形成する。
特に、Ｅｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１３および１４；３３および３４；５３および５４；または７３および７４の配列をそれぞれ含む、重鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
本発明はさらに、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、Ｅｐｏに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を有する。また、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３が、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定され、表１に記載されうることも企図される。
本発明はまた、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、Ｅｐｏに結合する。
本発明の別の態様では、Ｅｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５、３５、５５、または７５の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖と組み合わさって、ヒトＥｐｏに対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特に、軽鎖は、配列番号１６、３６、５６、または７６を含む配列を有しうる。特に、Ｅｐｏに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号１５および１６；３５および３６；５５および５６；または７５および７６のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖を有しうる。
本発明はなおさらに、配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、Ｅｐｏに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断片はまた、配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖も含む。
本発明はなおさらに、配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、この場合、前記抗体は、Ｅｐｏに結合する。
本発明はまた、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関する。とりわけ、本発明は、例えば、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４など、表１の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物をさらに含む。本発明はまた、表１の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの２つ以上の組合せを含む医薬組成物にも関する。
本発明はまた、配列番号１３、３３、５３、および７３から選択される配列を有する可変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１７、３７、５７、および７７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１７、３７、５７、または７７である。
本発明はまた、配列番号１４、３４、５４、および７４から選択される配列を有する可変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。本発明のさらなる態様では、配列は、配列番号１８、３８、５８、または７８である。
本発明はまた、配列番号１８、３８、５８、および７８からなる群から選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸にも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子のうちの１つまたは複数を含むベクターにも関する。
本発明はまた、本明細書で記載される核酸分子またはベクターのうちの１つまたは複数を含む単離宿主細胞にも関する。本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする組換えＤＮＡ配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第２の組換えＤＮＡ配列とを含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記ＤＮＡ配列は、プロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体でありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞であることも企図される。
本発明はまた、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップ（例えば、対象におけるＥｐｏを接触させるステップ）を含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。一態様では、方法は、細胞（例えば、Ｅｐｏを含む細胞）を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、対象におけるＥｐｏ依存性の細胞増殖を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させて、Ｅｐｏが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方法にも関する。一態様では、方法は、Ｅｐｏを含む細胞を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、対象におけるＥｐｏ依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖またはシグナル伝達を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させて、Ｅｐｏが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方法にも関する。細胞は、Ｂ細胞であることが企図される。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。
本発明はまた、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップ（例えば、対象におけるＥｐｏを接触させるステップ）を含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、Ｅｐｏと、対象の細胞上のＥｐｏ受容体の結合を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はなおさらに、Ｅｐｏと細胞の結合を阻害する方法であって、Ｅｐｏ（例えば、対象における）を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。一態様では、方法は、細胞（例えば、Ｅｐｏを含む細胞）を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はなおさらに、Ｅｐｏと、対象内の細胞の結合を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本発明はまた、対象における黄斑浮腫を処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、対象における黄斑浮腫を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、黄斑浮腫は、網膜血管疾患と関連する。黄斑浮腫と関連する網膜血管疾患は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含みうることが企図される。また、対象は、ヒトであることも企図される。
本発明はまた、対象における網膜血管疾患と関連する状態または障害を処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、対象における網膜血管疾患と関連する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、網膜血管疾患と関連する状態または障害は、糖尿病性網膜症であることが企図される。別の態様では、状態または障害は、加齢黄斑変性であることが企図される。網膜血管疾患と関連する状態または障害は、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症でありうることがなおさらに企図される。また、対象は、ヒトであることも企図される。
本発明はまた、対象における糖尿病性網膜症と関連する状態または障害を処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、対象における糖尿病性網膜症と関連する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。対象は、ヒトであることが企図される。
本発明はまた、対象における黄斑浮腫と関連する状態または障害を処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、対象における黄斑浮腫と関連する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。黄斑浮腫と関連する状態または障害は、糖尿病性黄斑浮腫であることがさらに企図される。対象は、ヒトであることがさらに企図される。
本発明はまた、対象における増殖性糖尿病性網膜症を処置する方法であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、対象における増殖性糖尿病性網膜症を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。網膜静脈拡張を低下させ、血管漏出を低下させ、かつ／または眼内の血流を増大させる組成物を、対象の眼へと投与することがさらに企図される。対象は、ヒトであることがさらに企図される。
前出の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちのいずれも、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片でありうる。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィド結合により相互接続される少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメインであるＣＬを含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各ＶＨおよび各ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４からなる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」という用語は、所与の抗原（例えば、エリスロポエチン：Ｅｐｏ）に特異的に結合する能力を保持する、インタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、インタクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片という用語内に包含される結合性断片の例は、Ｆａｂ断片、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片；ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Wardら、1989 Nature 341:544〜546）；ならびに単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬドメインおよびＶＨドメインは、個別の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合、ＶＬ領域およびＶＨ領域は、対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知であり、例えば、Birdら、1988 Science 242:423〜426；およびHustonら、1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879〜5883を参照されたい）を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の１つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性についてスクリーニングされる。
抗原結合性断片はまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖ（例えば、HollingerおよびHudson、2005、Nature Biotechnology、23、9、1126〜1136を参照されたい）へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチド（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照されたい）に基づく足場へとグラフトすることができる。
抗原結合性断片は、相補的な軽鎖ポリペプチドと併せて抗原結合性領域の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む単鎖分子へと組み込むことができる（Zapataら、1995 Protein Eng. 8（10）:1057〜1062；および米国特許第５，６４１，８７０号）。
本明細書で使用される「アフィニティー」という用語は、単一の抗原性部位における抗体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片）について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、ＫＤが１０−９Ｍ以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
「アミノ酸」という用語は、自然発生のアミノ酸および合成アミノ酸のほか、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有する化合物を指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
本明細書で使用される「結合特異性」という用語は、１つの抗原決定基だけと反応する個別の抗原結合部位の能力を指す。
抗体（例えば、Ｅｐｏ結合性抗体）に「特異的に（または選択的に）結合する」という語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原（例えば、ヒトＥｐｏまたはカニクイザルＥｐｏ）の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
「網膜血管疾患と関連する状態または障害」という用語は、網膜が変性するかまたは機能不全となる状態、障害、または疾患を指す。これは、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、非増殖性糖尿病性網膜症（ＮＰＤＲ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含む。Ｅｐｏを阻害することにより処置しうる網膜血管疾患の解剖学的特徴は、黄斑浮腫、静脈拡張、血管蛇行、フルオレセイン血管造影により測定される血管漏出、網膜出血、および細小血管異常（例えば、毛細血管瘤、綿花状白斑、ＩＲＭＡ）、毛細血管脱落、白血球接着、網膜虚血症、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩血管新生、網膜内出血、硝子体内出血、黄斑部瘢痕、網膜下線維症、および網膜線維症を含む。
「糖尿病性網膜症と関連する状態または障害」という用語は、糖尿病（１型または２型）の、網膜血管系、網膜代謝、網膜色素上皮、血液網膜関門、または終末糖化産物（ＡＧＥ）の眼内レベル、アルドースレダクターゼ活性、グリコシル化ヘモグロビン、およびタンパク質キナーゼＣに対する影響の帰結として、網膜が変性するかまたは機能不全となる状態を指す。糖尿病性網膜症を伴う患者における視力喪失は、網膜虚血症、黄斑浮腫、血管漏出、硝子体内出血の結果、または網膜ニューロンにおけるグルコースレベルの上昇の直接的影響でありうる。Ｅｐｏを阻害することにより処置しうる糖尿病性網膜症の解剖学的特徴は、毛細血管瘤、綿花状白斑、静脈拡張、黄斑浮腫、網膜内細小血管異常（ＩＲＭＡ）、網膜内出血、血管増殖、乳頭の血管新生、ルベオーシス、および網膜虚血症を含む。「糖尿病性黄斑浮腫」は、糖尿病性網膜症を伴う対象において生じ、糖尿病性網膜症の任意の病期において生じうる。
「黄斑浮腫と関連する状態または障害」という用語は、網膜血管が体液を漏出する「黄斑浮腫」の結果として、黄斑の腫脹または肥厚が生じる状態または障害を指す。黄斑浮腫は、網膜血管疾患において生じ、網膜血管疾患の合併症であることが多い。黄斑浮腫と関連する具体的な状態または障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含む。Ｅｐｏの阻害による黄斑浮腫の処置は、眼底検査、光干渉断層法、および視力の改善により決定することができる。
「キメラ抗体」という用語は、（ａ）抗原結合性部位（可変領域）を、クラス、エフェクター機能、および／もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および／もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変された可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置きかえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識におけるその特異性を保持しうる。
「Ｅｐｏタンパク質」または「Ｅｐｏ抗原」または「ＥＰＯ」または「Ｅｐｏ」という用語は、互換的に使用され、異なる種におけるエリスロポエチンタンパク質を指す。例えば、ヒトＥｐｏは、表１：配列番号８１に示される配列を有する。他の種に由来するＥｐｏタンパク質の例は、表１、配列番号８２、８３、８４、または８５に提示する。ヒト、カニクイザル、マウス、ラットおよびウサギＥｐｏのタンパク質配列は、公表されており、表１に記載する。ヒトＥｐｏはまた、高グリコシル化することもできる。当技術分野では、高グリコシル化されたＥｐｏはまた、「ダルベポエチン」としても公知であり、ＬＥＫ Ｐｈａｒｍａｃｕｅｔｉｃａｌｓを含む多様な販売元から得ることができる。
「保存的に修飾された変異体」という用語は、アミノ酸配列および核酸配列のいずれにも適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンであるＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされるポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの１種である「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内の各コドン（通常メチオニンだけのコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンだけのコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が含意されている。
ポリペプチド配列では、「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸の、化学的に類似するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下の８つの群：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）は、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含有する（例えば、Creighton、Proteins（1984）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしないアミノ酸修飾を指すのに使用する。
「エピトープ」という用語は、抗体への特異的な結合が可能なタンパク質決定基を意味する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からなり、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導入された突然変異、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける体細胞突然変異により導入された突然変異）を含みうる。
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、単一の結合特異性を提示する抗体であって、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、（ｉ）ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマ、（ｉｉ）不死化細胞へと融合させたハイブリドーマにより作製する。
「ヒト化」抗体とは、ヒトにおける免疫原性は小さいが、非ヒト抗体の反応性を保持する抗体である。これは、例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、抗体の残りの部分を、それらのヒト対応物（すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分）で置きかえることにより達成することができる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、81:6851〜6855、1984; MorrisonおよびOi、Adv. Immunol.、44:65〜92、1988; Verhoeyenら、Science、239:1534〜1536、1988; Padlan、Molec. Immun.、28:489〜498、1991；およびPadlan、Molec. Immun.、31:169〜217、1994を参照されたい。ヒト操作技術の他の例は、ＵＳ５，７６６，８８６において開示されているＸｏｍａ技術を含むがこれらに限定されない。
２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一な」または１００％の「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、または手作業のアライメントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について比較され、配列決定された場合の、２つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドが同じであれば（すなわち、指定される領域にわたる、または、指定されない場合は、配列全体にわたる、６０％の同一性、任意選択で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有すれば）、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチド（または１０アミノ酸）の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、１００〜５００、または１０００ヌクレオチド以上（または２０、５０、または２００アミノ酸以上）の長さの領域にわたり存在する。
配列比較では、１つの配列が、それに照らして被験配列を比較する基準配列として働くことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列をコンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセントを計算する。
本明細書で使用される「比較域」は、２つの配列を最適に配列決定した後で、配列を、同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、２０〜６００、通例約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のうちのいずれか１つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、SmithおよびWaterman （1970） Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムにより行うこともでき、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970による相同性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444、1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うこともでき、手作業のアライメントおよび目視（例えば、Brentら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.（Ringbou編、2003）を参照されたい）により行うこともできる。
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適するアルゴリズムの２つの例は、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389〜3402、1977；およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403〜410、1990において記載されている、ＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアＴにマッチするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Ｗを同定することにより、高スコア配列対（ＨＳＰ）をまず同定することを伴う。Ｔを、隣接ワードスコア閾値（Altschulら、前出）と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリウォードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量Ｘだけ低下した場合；１つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積スコアが、ゼロ以下に低下した場合；または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方向へのワードヒットの拡張を停止させる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）では、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムでは、３のワード長、および１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915、1989を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性についての統計学的解析（例えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5787、1993を参照されたい）も実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指標をもたらす最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして比較したときの最小合計確率が約０．２未満であり、より好ましくは、約０．０１未満であり、最も好ましくは、約０．００１未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えられる。
２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントはまた、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へと組み込まれた、E. MeyersおよびW. Miller（Comput. Appl. Biosci.、4:11〜17、1988）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みづけ、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みづけを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（インターネット上のgcg.comで入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch（J. Mol, Biol. 48:444〜453、1970）によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
上記で言及した配列同一性百分率以外の、２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第１の核酸によりコードされるポリペプチドが、第２の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に交差反応性であることである。したがって、例えば、２つのペプチドが保存的置換だけによって異なる場合、ポリペプチドは、第２のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的である。２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、２つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマーを使用して配列を増幅しうることである。
「Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する」という用語は、Ｅｐｏにより刺激および／または誘導された細胞の活性化（例えば、細胞シグナル伝達）、複製、および／または増殖に干渉する抗Ｅｐｏ抗体の能力を指す。とりわけ、「〜を阻害する」とは、本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体またはその断片と接触させた後の対象における、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖または他のパラメータ（例えば、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達、血管新生）の、対照と比べて統計学的に有意な（すなわち、ｐ＜０．０５）低下を指す。本明細書で使用される「Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する」とはまた、下記で記載される網膜血管疾患と関連する状態または障害を伴うと診断された患者における、本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体による処置の後における視覚機能または網膜の解剖学的特徴の、臨床的に関与性の改善も指す場合がある。
本明細書で使用される「Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達を阻害する」とは、Ｅｐｏにより刺激または誘導された細胞内シグナル伝達経路の活性化の、統計学的に有意な（すなわち、ｐ＜０．０５）低下をもたらす、本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体の能力を指す。
「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、Ｅｐｏに特異的に結合する単離抗体は、Ｅｐｏ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、Ｅｐｏに特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および／または化学物質を実質的に含まない場合もある。
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によりもたらされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４などのＩｇＧ）を指す。アイソタイプはまた、これらのクラスのうちの１つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Ｆｃ機能を改変する、例えば、エフェクター機能またはＦｃ受容体への結合を増強または低減するように施されている。アイソタイプとはまた、軽鎖定常領域によりもたらされる抗体クラス（例えば、カッパ、ラムダ）も指す。
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語が、特定の抗体−抗原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間相互作用の解離速度を指すことを意図する。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度（Ｍ）として表す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
本明細書では、「核酸」という用語が、「ポリヌクレオチド」という用語と互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態または二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌクレオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。
別段に指し示されない限りにおいて、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる（Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081、1991; Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605〜2608、1985；およびRossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91〜98、1994）。
「作動可能に連結された」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
本明細書で使用される「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列を、産生細胞または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア（Pichia）属細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しかし、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されていると称する。
本明細書では、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語が、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペプチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物（例えば、マウス）またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させるように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを伴う、他の任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体など、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、ｉｎ ｖｉｖｏの体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、これらに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で天然には存在しない可能性がある配列である。
「組換え宿主細胞」（または、簡単に、「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図するものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、非ヒト霊長動物（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物および非哺乳動物）を含む。特記される場合を除き、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で使用される「カニクイザル（cyno）」または「カニクイザル（cynomolgus）」という用語は、カニクイザル（cynomolgus monkey）（カニクイザル（Macaca fascicularis））を指す。
一実施形態では、本明細書で使用される、任意の疾患または障害（例えば、網膜血管疾患、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫）「〜を処置すること」またはこれらの「処置」という用語は、疾患または障害を改善すること（すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少なくとも１つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること）を指す。別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能性があるパラメータを含む少なくとも１つの物理的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害を、物理的にモジュレートする（例えば、識別可能な症状の安定化）か、生理学的にモジュレートする（例えば、物理的パラメータの安定化）か、または物理的かつ生理学的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「〜を処置すること」または「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延させることを指す。網膜血管疾患と関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症と関連する状態もしくは障害、および／または黄斑浮腫と関連する状態もしくは障害を含む、本明細書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、下記で記載される、視覚機能、網膜の解剖学的特徴、網膜血管疾患のパラメータ、糖尿病性網膜症の疾患パラメータ、および／または黄斑浮腫の疾患パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある患者において防止するかまたは緩徐化する任意の作用を意味する。より具体的には、網膜血管疾患と関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症と関連する状態もしくは障害、および／または黄斑浮腫と関連する状態もしくは障害の「処置」とは、視覚機能および／または網膜の解剖学的特徴の改善または保存を結果としてもたらすか、またはこれを結果としてもたらすことが企図される任意の作用を意味する。当技術分野では、疾患の処置および／または防止を評価する方法が知られており、本明細書の下記で記載する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別のポリヌクレオチドを輸送することが可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントを、ウイルスゲノムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶまたはＡＡＶ２）などのウイルスベクターである。ある種のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）は、それらが導入された宿主細胞における自己複製が可能である。他のベクター（例えば、非哺乳動物のエピソームベクター）は、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または簡単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたらすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
ＥＰＯが、中心網膜における血管拡張を誘導することを示す図である。 抗ＥＰＯ Ｆａｂが、ウサギの眼におけるＥＰＯを中和することを示す図である。 抗ＥＰＯ Ｆａｂが、ウサギの眼におけるＥＰＯを中和することを示す図である。
本発明は部分的に、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体分子の発見に基づく。本発明は、完全ＩｇＧフォーマットの抗体、ならびにＦａｂ断片（例えば、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、およびＮＶＳ４を参照されたい）など、それらの抗原結合性断片の両方に関する。
したがって、本発明は、Ｅｐｏ（例えば、ヒトＥｐｏ、カニクイザルＥｐｏ、ラットＥｐｏ、およびマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体、医薬組成物、このような抗体および組成物の作製法および使用法を提供する。
Ｅｐｏ抗体および抗原結合性断片
本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏのほか、高グリコシル化ヒトＥｐｏ（ダルベポエチン）にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、実施例で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびＦａｂを含むがこれらに限定されない。
本発明は、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体であって、配列番号１３、３３、５３、または７３のアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＨ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＨ ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明は、Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する抗体であって、配列番号１４、３４、５４、または７４のアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれか１つのアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲを含む抗体も提供する。特に、本発明は、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体であって、以下の表１に列挙されるＶＬ ＣＤＲのうちのいずれかのアミノ酸配列を有する、１つ、２つ、３つ以上のＶＬ ＣＤＲを含む（または、代替的に、これらからなる）抗体を提供する。
本発明の他の抗体は、突然変異させているが、なお、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明の他の抗体は、ＣＤＲ領域内で、表１に記載されている配列内で描示されるＣＤＲ領域と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体のＶＨ、ＶＬ、全長重鎖、および全長軽鎖をコードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現について最適化することができる（例えば、表１は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化された核酸配列を示す）。
本発明の他の抗体は、アミノ酸またはアミノ酸をコードする核酸を突然変異させているが、表１に記載されている配列となお少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表１に記載されている配列内で描示された可変領域と比較した場合に、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下のアミノ酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
これらの抗体の各々は、Ｅｐｏに結合しうるので、ＶＨ配列、ＶＬ配列、全長軽鎖配列、および全長重鎖配列（アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と）を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のＥｐｏ結合性抗体を創出することができる。このような「混合し、マッチさせた」Ｅｐｏ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび実施例節で記載される他のアッセイ）を使用して調べることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置きかえるものとする。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖／全長軽鎖対合に由来する全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。したがって、一態様では、本発明は、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、Ｅｐｏ（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１３および１４のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。他の具体的な態様では、本発明は、配列番号３３および３４のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番号５３および５４のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番号７３および７４のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
別の態様では、本発明は、（ｉ）哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号１５、３５、５５、および７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたアミノ酸配列であって、配列番号１６、３６、５６、および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または（ｉｉ）その抗原結合性部分を含む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号１５および１６のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。他の具体的な態様では、本発明は、配列番号３５および３６のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番号５５および５６のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番号７５および７６のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
本明細書で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原特異性および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一般に、各重鎖可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがあり、各軽鎖可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）内には、３つのＣＤＲがある。
所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabatら（1991）、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikaniら、（1997）JMB 273、927〜948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）により記載されているスキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定することができる。
例えば、Ｋａｂａｔによれば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）内のＣＤＲアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。Ｃｈｏｔｈｉａによれば、ＶＨ内のＣＤＲアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされており、ＶＬ内のアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされている。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲ定義を組み合わせることにより、ＣＤＲは、ヒトＶＨ内のアミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）、ならびにヒトＶＬ内のアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）からなる。
別の態様では、本発明は、表１に記載されている重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含むＥｐｏ結合性抗体を提供する。抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１、２１、４１、または６１に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２、２２、４２、または６２に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３、２３、４３、または６３に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４、２４、４４、または６４に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５、２５、４５、または６５に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号６、２６、４６、または６６に示されている。これらのＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステムを使用して表される。
代替的に、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（Al-Lazikaniら、（1997）、JMB 273 927〜948）を使用して規定される通り、抗体のＶＨ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号７、２７、４７、または６７に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号８、２８、４８、または６８に示されている。抗体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号９、２９、４９、または６９に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、３０、５０、または７０に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、３１、５１、または７１に示されている。抗体のＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、３２、５２、または７２に示されている。
これらの抗体の各々は、Ｅｐｏに結合することが可能であり、抗原結合特異性は主に、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、およびＣＤＲ３領域によりもたらされることを踏まえれば、各抗体は、本発明の他のＥｐｏ結合性分子を創出するのに、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含有することが好ましいが、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる（すなわち、異なる抗体に由来するＣＤＲを、混合し、マッチさせることができる）。このような「混合し、マッチさせた」Ｅｐｏ結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載される結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＥＴ、Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して調べることができる。ＶＨ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＨ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。同様に、ＶＬ ＣＤＲ配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のＶＬ配列に由来するＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、および／またはＣＤＲ３配列を、構造的に類似するＣＤＲ配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のＶＨ配列およびＶＬ配列を、１つまたは複数のＶＨ ＣＤＲ領域配列および／またはＶＬ ＣＤＲ領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるＣＤＲ配列に由来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかであろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３、またはＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むことが可能であり、この場合、断片は、Ｅｐｏに、単一の可変ドメインとして結合する。
本発明のある種の実施形態では、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、表１に記載されているＦａｂの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原結合性断片は、ＦａｂのＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４の重鎖および軽鎖配列を有しうる。
本発明の他の実施形態では、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｋａｂａｔにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。本発明のさらに他の実施形態では、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定され、表１に記載されている、重鎖可変領域のＣＤＲ１、重鎖可変領域のＣＤＲ２、重鎖可変領域のＣＤＲ３、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む。
具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号２４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２５の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号２６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号４１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号４３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号４４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４５の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号４６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号６１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６２の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号６３の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号６４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６５の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号６６の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号１０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号１１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号１２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号２７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号２８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号２９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号３０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号３１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号３２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号４７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号４８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号４９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号５０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号５１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号５２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体であって、配列番号６７の重鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号６８の重鎖可変領域のＣＤＲ２、配列番号６９の重鎖可変領域のＣＤＲ３、配列番号７０の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、配列番号７１の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および配列番号７２の軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含む抗体を含む。
ある種の実施形態では、本発明は、表１に記載されている、Ｅｐｏに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、Ｅｐｏに結合する抗体または抗原結合性断片は、ＦａｂのＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４である。
抗体の可変領域または全長鎖が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もしくは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列と最も近似する（すなわち、同一性％が最大である）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができる。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しかし、ＶＨフレームワーク領域またはＶＬフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較した場合に、ヒトとして同定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、アミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％、なおまたは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。組換えヒト抗体は、ＶＨフレームワーク領域内またはＶＬフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、１０アミノ酸以下の差異を提示することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、５アミノ酸以下、なおまたは、４、３、２、または１アミノ酸以下の差異を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか、ＤＰ４７およびＤＰＫ９も含むがこれらに限定されない。
相同抗体
さらに別の実施形態では、本発明は、表１に記載されている配列と相同なアミノ酸配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、Ｅｐｏタンパク質（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に結合し、表１に記載されている抗体の所望の機能的特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、単離抗体またはその機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み；軽鎖可変ドメインは、配列番号 １４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含み；抗体は、Ｅｐｏ（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する。本発明のある種の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｋａｂａｔにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号１、２、３、４、５、および６；それぞれ、配列番号２１、２２、２３、２４、２５、および２６；それぞれ、配列番号４１、４２、４３、４４、４５、および４６；または、それぞれ、配列番号６１、６２、６３、６４、６５、および６６をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Ｃｈｏｔｈｉａにより規定される、ＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列、ＨＣＤＲ３配列、ＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列、例えば、それぞれ、配列番号７、８、９、１０、１１、および１２；それぞれ、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、および３２；それぞれ、配列番号４７、４８、４９、５０、５１、および５２；またはそれぞれ、配列番号６７、６８、６９、７０、７１、および７２をさらに含む。
他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、表１に示される配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。他の実施形態では、ＶＨアミノ酸配列および／またはＶＬアミノ酸配列は、１、２、３、４、または５カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一でありうる。表１に記載されている抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域およびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１３、３３、５３、または７３、および配列番号１４、３４、５４、または７４のそれぞれをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖アミノ酸配列および／または全長軽鎖アミノ酸配列は、表１に示される配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。配列番号１５、３５、５５、または７５のうちのいずれかの全長重鎖、および配列番号１６、３６、５６、または７６のうちのいずれかの全長軽鎖と大きな（すなわち、８０％以上の）同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
他の実施形態では、全長重鎖ヌクレオチド配列および／または全長軽鎖ヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
他の実施形態では、重鎖可変領域のヌクレオチド配列および／または軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、表１に示される配列と、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一でありうる。
本明細書で使用される、２つの配列の間の同一性パーセントとは、２つの配列の最適なアライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮する配列により共有される、同一な位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数×１００）である。２つの配列の間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
加えて、または代替的に、本発明のタンパク質配列は、公表されたデータベースに照らして検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさらに使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschulら、1990 J. Mol. Biol. 215:403〜10によるＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。
保存的修飾を伴う抗体
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのＣＤＲ配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＥｐｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号１、２１、４１、および６１、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号２、２２、４２、および６２、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号３、２３、４３、および６３、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ１アミノ酸配列が、配列番号４、２４、４４、および６４、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ２アミノ酸配列が、配列番号５、２５、４５、および６５、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のＣＤＲ３アミノ酸配列が、配列番号６、２６、４６、および６６、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、Ｅｐｏに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
他の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現について最適化されており、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの１つまたは複数は、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を有し、抗体は、本発明のＥｐｏ結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号１５、３５、５５、および７５、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号１６、３６、５６、および７６、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、Ｅｐｏ（例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏ）に特異的に結合する抗体を提供する。
同じエピトープに結合する抗体
本発明は、表１に記載されているＥｐｏ結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、Ｅｐｏ結合アッセイ（実施例で記載されるＥｐｏ結合アッセイなど）において、本発明の他の抗体と競合する（例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計学的に有意な形で競合的に阻害する）それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定することができる。本発明の抗体の、Ｅｐｏタンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力により、被験抗体が、その抗体と、Ｅｐｏへの結合について競合することが可能であり、このような抗体は、非限定的な理論によれば、Ｅｐｏタンパク質上の、それが競合する抗体と同じであるかまたは関連の（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した）エピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じＥｐｏ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができる。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明の抗体または抗原結合性断片のＥｐｏとの結合を、５０％を超えて阻害するとき、抗体は、結合について「競合する」。
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのヘリックスＤドメイン（Ｅｐｏタンパク質のアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）に結合する。他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ヘリックスＡ（Ｅｐｏタンパク質のアミノ酸４〜２６；配列番号８６）およびＥｐｏのループＡ〜Ｂ（Ｅｐｏタンパク質のアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）に結合する。
他の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）に結合する。他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）に結合する。他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）、およびヘリックスＡ（ヒトＥｐｏのアミノ酸４〜２６；配列番号８６）に結合する。さらに他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）、およびループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）に結合する。他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、ＥｐｏのＤヘリックスドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸１３８〜１６２；配列番号８８）、ループＡ〜Ｂドメイン（ヒトＥｐｏのアミノ酸２７〜５５；配列番号８９）、およびヘリックスＡ（ヒトＥｐｏのアミノ酸４〜２６；配列番号８６）に結合する。
本発明の他の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）の４４〜５０、５２、５３、１４７、１５０、１５１、１５４、１５５、１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むエピトープに結合する。本発明の他の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）の９、１３、４４〜５３、１４７、１５０、１５１、１５４、１５５、１５８、１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むエピトープに結合する。本発明の他の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）の２３、４３〜５０、５２、５３、１３１、１４３、１４７、１５０、１５１、１５４、１５５、１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むエピトープに結合する。本発明の特定の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（４４〜５０位における）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（５２〜５３位における）、Ａｓｎ（１４７位における）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ（１５０〜１５１位における）、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（１５４〜１５５位における）、Ｇｌｕ（１５９位における）、およびＡｒｇ（１６２位における）を含むエピトープに結合する。本発明の他の特定の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸Ｓｅｒ（９位における）、Ｇｌｕ（１３位における）、Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（４４〜５０位における）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（５２〜５３位における）、Ａｓｎ（１４７位における）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ（１５０〜１５１位における）、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（１５４〜１５５位における）、Ｇｌｙ（１５８位における）、Ｇｌｕ（１５９位における）、およびＡｒｇ（１６２位における）を含むエピトープに結合する。本発明のなおさらなる態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトＥｐｏ（配列番号８１）のアミノ酸Ｇｌｕ（２３位における）、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（４３〜５０位における）、Ｌｙｓ−Ａｒｇ（５２〜５３位における）、Ａｒｇ（１３１位における）、Ａｒｇ（１４３位における）、Ａｓｎ（１４７位における）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ（１５０〜１５１位における）、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（１５４〜１５５位における）、Ｇｌｕ（１５９位における）、およびＡｒｇ（１６２位における）を含むエピトープに結合する。
本発明はまた、ヒトＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープであって、アミノ酸残基Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むエピトープも含み、この場合、エピトープに結合する抗体は、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害するであろう。また、本発明のエピトープに結合する抗体は、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖をさらに阻害することも企図される。
本発明は、ヒトＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープであって、アミノ酸残基Ｓｅｒ９、Ｇｌｕ１３、Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｙ１５８、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むエピトープをさらに含み、この場合、エピトープに結合する抗体は、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害するであろう。また、本発明のエピトープに結合する抗体は、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖をさらに阻害することも企図される。
本発明は、ヒトＥｐｏ上のコンフォメーショナルエピトープであって、アミノ酸残基Ｇｌｕ２３、Ａｓｐ４３、Ｔｈｒ４４、Ｌｙｓ４５、Ｖａｌ４６、Ａｓｎ４７、Ｐｈｅ４８、Ｔｙｒ４９、Ａｌａ５０、Ｌｙｓ５２、Ａｒｇ５３、Ａｒｇ１３１、Ａｒｇ１４３、Ａｓｎ１４７、Ａｒｇ１５０、Ｇｌｙ１５１、Ｌｙｓ１５４、Ｌｅｕ１５５、Ｇｌｕ１５９、およびＡｒｇ１６２を含むエピトープをなおさらに含み、この場合、エピトープに結合する抗体は、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害するであろう。また、本発明のエピトープに結合する抗体は、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖をさらに阻害することも企図される。
操作抗体および修飾抗体
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示されるＶＨ配列および／またはＶＬ配列のうちの１つまたは複数を有する抗体を使用して、本発明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内、および／または１つもしくは複数のフレームワーク領域内の１つまたは複数の残基を修飾することにより操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる。
実施しうる可変領域操作のうちの１つの種類は、ＣＤＲグラフティングである。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由で、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間の多様性が、ＣＤＲの外部の配列より大きい。ＣＤＲ配列は、大半の抗体−抗原間相互作用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグラフトされた特異的自然発生抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.ら、1998 Nature 332:323〜327; Jones, P.ら、1986 Nature 321:522〜525; Queen, C.ら、1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029〜10033；Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
したがって、本発明の別の実施形態は、配列番号１、２１、４１、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号２、２２、４２、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
代替的に、本発明の別の実施形態は、配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３配列のそれぞれを含む重鎖可変領域と、配列番号１０、３０、５０、および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１配列、配列番号１１、３１、５１、および７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１２、３２、５２、および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３配列のそれぞれを有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体のＶＨ ＣＤＲ配列およびＶＬ ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公表されたＤＮＡデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能である）のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kabat, E. A.ら、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、U.S. Department of Health and Human Services、NIH Publication第91-3242号; Tomlinson, I. M.ら、1992 J. Mol. Biol. 227:776〜798；およびCox, J. P. L.ら、1994 Eur. J Immunol. 24:827〜836においても見出すことができる。
本発明の抗体における使用のためのフレームワーク配列の例は、本発明の選択された抗体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使用されるコンセンサス配列および／またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレームワーク配列である。ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、およびＶＨ ＣＤＲ３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列、およびＶＬ ＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、ＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して、１つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらによる米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号；および同第６，１８０，３７０号を参照されたい）。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場として活用されうるフレームワークは、ＶＨ１Ａ、ＶＨ１Ｂ、ＶＨ３、Ｖｋ１、Ｖｌ２、およびＶｋ２を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1上のｖＢａｓｅデータベースにおいて見出すことができる。
したがって、本発明の実施形態は、配列番号１３、３３、５３、および７３からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号１４、３４、５４、および７４からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離Ｅｐｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片に関する。
可変領域修飾の別の種類は、「アフィニティー成熟」として公知の、ＶＨ ＣＤＲ１領域内、ＶＨ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＨ ＣＤＲ３領域内、ならびに／またはＶＬ ＣＤＲ１領域内、ＶＬ ＣＤＲ２領域内、および／もしくはＶＬ ＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の１つまたは複数の結合特性（例えば、アフィニティー）を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され、実施例でも提示される、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイにおいて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、ＣＤＲ領域内の、典型的には１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以下の残基も改変する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号１、２１、４１、および６１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１、２１、４１、もしくは６１と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号２、２２、４２、および６２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号２、２２、４２、もしくは６２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号３、２３、４３、もしくは６３と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号４、２４、４４、もしくは６４と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号５、２５、４５、もしくは６５と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号６、２６、４６、もしくは６６と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域からなる単離Ｅｐｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号７、２７、４７、もしくは６７と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１領域、配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号８、２８、４８、もしくは６８と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号 ９、２９、４９、もしくは６９と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３領域を有する重鎖可変領域と、配列番号１０、３０、５０、および７０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１０、３０ ５０、もしくは７０と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１領域、配列番号１１、３１、５１、および７１からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１１、３１、５１、もしくは７１と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２領域、ならびに配列番号１２、３２、５２、および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号１２、３２、５２、もしくは７２と比較して、１、２、３、４、もしくは５カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３領域を有する軽鎖可変領域とからなる単離Ｅｐｏ結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
抗原結合性ドメインの、代替的なフレームワークまたは足場へのグラフティング
結果として得られるポリペプチドが、Ｅｐｏに特異的に結合する少なくとも１つの結合性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体／免疫グロブリンのフレームワークまたは足場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリンまたはそれらの断片の５つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワーク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲをグラフトしうる非免疫グロブリン足場を使用して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のＥｐｏタンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン（Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、アンキリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；およびＡｂｌｙｎｘ ｎｖ、Ｚｗｉｊｎａａｒｄｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、リポカリン（Ｐｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、低分子モジュラー免疫医薬（Ｔｒｕｂｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）、マキシボディ（Ａｖｉｄｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）、プロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ ＡＧ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Ｓｃｉｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧｍｂＨ、Ｈａｌｌｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むがこれらに限定されない。
フィブロネクチン足場は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンの第１０モジュール（１０ Ｆｎ３ドメイン））に基づく。ＩＩＩ型フィブロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する（ＣＤＲと類似する）、２つのベータシートの間に分配された、７つまたは８つのベータ鎖を有する。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも３つのこのようなループがあり、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である（ＵＳ６，８１８，４１８を参照されたい）。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマＩｇＧ内の抗原認識単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連するが、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のために、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体のアフィニティー成熟の工程と類似する、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるループのランダム化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のＣＤＲで置きかえうる、足場として使用することができる。
アンキリン技術は、アンキリンに由来するリピートモジュールを伴うタンパク質を、異なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールとは、２つのアンチパラレルのα−ヘリックスおよびβ−ターンからなる、３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより大部分が最適化される。
アビマーは、ＬＲＰ−１など、天然のＡドメイン含有タンパク質に由来する。これらのドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、２５０を超えるタンパク質が、構造的にＡドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の（２つ〜１０の）異なる「Ａドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号；同第２００５００５３９７３号；同第２００５００４８５１２号；および同第２００６０００８８４４号において記載されている方法を使用して創出することができる。
アフィニティーリガンドであるアフィボディとは、プロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク質である。プロテインＡとは、細菌である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの１３が、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている５８アミノ酸からなる（例えば、ＵＳ５，８３１，０１２を参照されたい）。アフィボディ分子は、抗体を模倣し、１５０ｋＤａである抗体の分子量と比較して、分子量が６ｋＤａである。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同様である。
アンチカリンとは、Ｐｉｅｒｉｓ ＰｒｏｔｅｏＬａｂ ＡＧ社により開発された生成物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカリンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、１６０〜１８０アミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する４つのループのセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位を独自の工程で再形成することができる。４つのループのセットを突然変異誘発することによりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの１つのタンパク質である、オオモンシロチョウ（Pieris brassicae）のビリン結合性タンパク質（ＢＢＰ）が使用されている。アンチカリンについて記載する特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／１６８７３号にある。
アフィリン分子とは、タンパク質および低分子に対する特異的なアフィニティーのためにデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対するいかなる構造相同性も示さない。現在、２つのアフィリン足場が援用されており、それらのうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型で、高度な熱安定性を示し、ｐＨ変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに由来するタンパク質の例は、ＷＯ２００１／０４１４４において記載されており、「ユビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４／１０６３６８において記載されている。
タンパク質エピトープ模倣体（ＰＥＭ）とは、タンパク質間相互作用に関与する主要な二次構造である、タンパク質のベータ−ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの環状ペプチド様分子（分子量：１〜２ｋＤａ）である。
本発明は、Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。キメラ抗体またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトＥｐｏ結合性抗体は、ヒト対象へと投与された場合の抗原性がさらに低減されている。
ラクダ科動物抗体
ラマ種（アルパカ（Lama pacos）、ラマ（Lama glama）、およびビクーニャ（Lama vicugna））などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ（dromedary）（フタコブラクダ（Camelus bactrianus）およびヒトコブラクダ（Camelus dromaderius））ファミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺乳動物に由来するある種のＩｇＧ抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する抗体の場合の、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する、典型的な４つの鎖の四次構造とは構造的に異なっている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に公表されたＷＯ９４／０４６７８）を参照されたい。
ＶＨＨとして同定される小型の単一の可変ドメインである、ラクダ科動物抗体の領域は、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラクダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす遺伝子操作により得ることができる。１９９８年６月２日に取得された米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい。また、Stijlemans, B.ら、2004 J Biol Chem 279:1256〜1261; Dumoulin, M.ら、2003 Nature 424:783〜788; Pleschberger, M.ら、2003 Bioconjugate Chem 14:440〜448; Cortez-Retamozo, V.ら、2002 Int J Cancer 89:456〜62；およびLauwereys, M.ら、1998 EMBO J 17:3512〜3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ａｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラクダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
ラクダ科動物ナノボディの分子量は、ヒトＩｇＧ分子の分子量の約１０分の１で、タンパク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの１つの帰結は、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において用いられうることである。
低分子量およびコンパクトなサイズはさらに、熱安定性が極めて大きく、極端なｐＨおよびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボディを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へとたやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうることである。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。２００４年８月１９日に公表された米国特許出願第２００４０１６１７３８号を参照されたい。これらの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞内で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ、機能的である。
したがって、本発明の特色は、Ｅｐｏに対して高いアフィニティーを有するラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、Ｅｐｏまたはそのペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、Ｅｐｏ結合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例において記載されている、標的としてのＥｐｏを伴うパニング手順を使用する、適切に突然変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーからの選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシピエント対象における半減期が、４５分間〜２週間となるようにカスタマイズすることもできる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例えば、ＷＯ１９９４／００４６７８において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重鎖または軽鎖のＣＤＲ配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へとグラフトすることにより得る。
二特異性分子および多価抗体
別の態様では、本発明は、本発明のＥｐｏ結合性抗体またはその断片を含む二特異性分子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なくとも２つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）へと連結することもできる。本発明の抗体は実際、３つ以上の異なる結合性部位および／または標的分子に結合する多特異性分子を作り出すように誘導体化することもでき、他の２つ以上の機能的分子へと連結することもでき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、または結合性模倣体など、１つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で）ことができる。
したがって、本発明は、Ｅｐｏに対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第２の標的エピトープは、第１の標的エピトープと異なる、Ｅｐｏの別のエピトープである。
加えて、二特異性分子が多特異性である本発明では、分子は、第１の標的エピトープおよび第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性もさらに含みうる。
一実施形態では、本発明の二特異性分子は、結合特異性として、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはＬａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号において記載されている、Ｆｖもしくは単鎖構築物など、その任意の最小断片でありうる。
ダイアボディとは、同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短すぎるリンカーにより接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインを単一のポリペプチド鎖上で発現させた、二価の二特異性分子である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対合し、これにより、２つの抗原結合性部位を創出する（例えば、Holligerら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444〜6448; Poljakら、1994 Structure 2:1121〜1123を参照されたい）。ダイアボディは、ＶＨＡ−ＶＬＢおよびＶＨＢ−ＶＬＡ構造（ＶＨ−ＶＬ立体配置）、またはＶＬＡ−ＶＨＢおよびＶＬＢ−ＶＨＡ構造（ＶＬ−ＶＨ立体配置）を伴う２つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができる。単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、２つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約１５アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する（HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45（3〜4）:128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2（1）:21〜36を参照されたい）。ｓｃＤｂは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現させることができる（HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45（34）:128〜30; Wuら、1996 Immunotechnology、2（1）:21〜36; PluckthunおよびPack、1997 Immunotechnology、3（2）:83〜105; Ridgwayら、1996 Protein Eng.、9（7）:617〜21を参照されたい）。ダイアボディをＦｃへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出すことができる（Luら、2004 J. Biol. Chem.、279（4）:2856〜65を参照されたい）。
本発明の二特異性分子内で援用しうる他の抗体は、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
二特異性分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、構成要素である結合特異性をコンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovskyら、1984 J. Exp. Med. 160:1686； Liu, MAら、1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus、1985 Behring Ins. Mitt. 78号、118〜132; Brennanら、1985 Science 229:81〜83；およびGlennieら、1987 J. Immunol. 139:2367〜2375において記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれも、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
結合特異性が、抗体である場合、それらは、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域をスルフヒドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、１つのスルフヒドリル残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
代替的に、いずれの結合特異性も、同じベクター内でコードさせ、同じ宿主細胞内で発現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、２つの結合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号；米国特許第５，４５５，０３０号；米国特許第４，８８１，１７５号；米国特許第５，１３２，４０５号；米国特許第５，０９１，５１３号；米国特許第５，４７６，７８６号；米国特許第５，０１３，６５３号；米国特許第５，２５８，４９８号；および米国特許第５，４８２，８５８号において記載されている。
それらの特異的な標的に対する二特異性分子の結合は、例えば、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ解析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害アッセイ）、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬（例えば、抗体）を援用することにより、特に対象となるタンパク質−抗体間複合体の存在が検出される。
別の態様では、本発明は、Ｅｐｏに結合する、本発明の抗体の少なくとも２つの同一であるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Ｆｃ領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
三量体化ドメインについては、例えば、Ｂｏｒｅａｎによる特許であるＥＰ１０１２２８０Ｂ１において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、ＷＯ１９９８／０１８９４３において記載されている。
半減期を延長した抗体
本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した、Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
例えば、腎臓における濾過、肝臓における代謝、タンパク質分解性酵素（プロテアーゼ）による分解、および免疫原性応答（例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロファージおよび樹状細胞による取込み）など、多くの因子が、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ｒｅＣＯＤＥ ＰＥＧ、抗体足場、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、ＩｇＧ、ＦｃＲｎ、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質との遺伝子融合により、ナノボディ、Ｆａｂ、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、アフィボディ、およびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする（遺伝子的または化学的に）ことにより、ｒＰＥＧ、アルブミン、アルブミンのドメイン、アルブミン結合性タンパク質、およびＦｃとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体の血清中循環を延長するため、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、不活性のポリマー分子を、ＰＥＧの、抗体のＮ末端もしくはＣ末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をＰＥＧ化するには、抗体またはその断片を、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的である。ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似する反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」および「ＰＥＧ」という用語は、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまたは分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により緊密にモニタリングして、ＰＥＧ分子の抗体への適正なコンジュゲーションを確認することができる。反応しなかったＰＥＧは、サイズ除外クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性について調べることができる。当技術分野では、タンパク質をＰＥＧ化する方法が知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＮｉｓｈｉｍｕｒａらによるＥＰ０１５４３１６およびＩｓｈｉｋａｗａらによるＥＰ０４０１３８４を参照されたい。
他の改変されたＰＥＧ化技術は、ｔＲＮＡシンセターゼおよびｔＲＮＡを含む再構成系を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直交性直接操作技術（reconstituting chemically orthogonal directed engineering technology）（ＲｅＣＯＤＥ ＰＥＧ）を含む。この技術は、３０を超える新たなアミノ酸の、大腸菌（E. coli）細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質への組込みを可能とする。ｔＲＮＡは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込みシグナルを伝達するコドンへと転換する。
組換えＰＥＧ化技術（ｒＰＥＧ）はまた、血清半減期の延長にも使用することができる。この技術は、３００〜６００アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの分子量は、その実際の分子量の約１５倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のＰＥＧ化とは対照的に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
ポリシアリル化は、天然のポリマーであるポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して、活性寿命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術である。ＰＳＡとは、シアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系により認識されることを防止する。ＰＳＡポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。ＰＳＡは、数百万年にわたり、それらの壁をＰＳＡでコーティングするように進化したある種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術であるＰＳＡは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易に作製することができる。細菌ＰＳＡは、ヒト体内ではＰＳＡと化学的に同一であるので、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーであり、体内の酵素により代謝されうる。ＨＥＳ溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のＨＥＳ化は、分子の安定性を増大させることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。ＨＥＳの分子量など、異なるパラメータを改変することにより、広範にわたるＨＥＳ抗体コンジュゲートをカスタマイズすることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長した抗体はまた、１つまたは複数のアミノ酸修飾（すなわち、置換、挿入、または欠失）を、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ結合性断片（好ましくはＦｃドメイン断片またはヒンジＦｃドメイン断片）へと導入しても作り出すことができる。例えば、国際特許公開第ＷＯ９８／２３２８９号、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号；および米国特許第６，２７７，３７５号を参照されたい。
さらに、抗体または抗体断片を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてより安定的とするか、またはｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン；ＨＳＡ）へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法が周知であり、例えば、国際特許公開第ＷＯ９３／１５１９９号、同第ＷＯ９３／１５２００号、および同ＷＯ０１／７７１３７号；ならびに欧州特許第ＥＰ０４１３６２２号を参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体の１つの結合性ドメインが、Ｅｐｏに結合するのに対し、抗体の第２の結合性ドメインは、血清アルブミン、好ましくは、ＨＳＡに結合するようにデザインすることもできる。
半減期を延長するための戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長が所望される、ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質においてとりわけ有用である。
抗体コンジュゲート
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチドへと（またはその断片、好ましくは、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００アミノ酸のポリペプチドへと）、組換えにより融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた（共有結合的コンジュゲーションおよび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む）、Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ＶＨドメイン、ＶＨ ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ ＣＤＲ）と、異種タンパク質、異種ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、および同第５，１１２，９４６号；欧州特許第ＥＰ０３０７４３４および同第ＥＰ０３６７１６６号；国際特許公開第ＷＯ９６／０４３８８号および同第ＷＯ９１／０６５７０号；Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535〜10539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590〜5600；およびVilら、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337〜11341を参照されたい。
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリング（まとめて、「ＤＮＡシャフリング」と称する）の技法を介して作り出すことができる。ＤＮＡシャフリングを援用して、本発明の抗体またはそれらの断片の活性を改変する（例えば、アフィニティーが大きく、解離速度が小さい抗体またはそれらの断片）ことができる。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、および同第５，８３７，４５８号；Pattenら、1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8:724〜33; Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16（2）:76〜82; Hanssonら、1999、J. Mol. Biol. 287:265〜76；ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、Biotechniques 24（2）:308〜313（これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる）を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされる抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変することができる。Ｅｐｏタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の異種分子の１つまたは複数の成分、モチーフ、区間、一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
さらに、抗体またはそれらの断片は、精製を容易とするペプチドなどのマーカー配列へと融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それらのうちの多くが市販されている中でとりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ、９１３１１）において提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentzら、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821〜824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Wilsonら、1984、Cell 37:767）に対応するヘマグルチニン（「ＨＡ」）タグ、および「フラッグ」タグを含むがこれらに限定されない。
他の実施形態では、本発明の抗体またはそれらの断片を、診断剤または検出可能薬剤へとコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、および／または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部としてモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素；ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがこれらに限定されない補欠分子族；ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料；ルミノールなどであるがこれらに限定されない発光材料；ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがこれらに限定されない生物発光材料；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、および１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、および１１１Ｉｎ）、テクネシウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎなどであるがこれらに限定されない放射性材料；ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングすることにより達成することができる。
本発明は、治療用部分へとコンジュゲートさせた抗体またはそれらの断片の使用もさらに包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を含む。
さらに、抗体またはその断片は、所与の生物学的応答を修飾する治療用部分または薬物部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタンパク質は、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、抗血管新生剤；または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパク質を含みうる。
さらに、抗体は、２１３Ｂｉなどのアルファ放射体などの放射性金属イオン、１３１Ｉｎ、１３１ＬＵ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含むがこれらに限定されない放射性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤などの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれらの全体において組み込まれる、Denardoら、1998、Clin Cancer Res. 4（10）:2483〜90; Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10（4）:553〜7；およびZimmermanら、1999、Nucl. Med. Biol. 26（8）:943〜50において記載されている。
治療用部分を、抗体へとコンジュゲートさせるための技法は周知であり、例えば、Arnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら（編）、243〜56頁（Alan R. Liss, Inc. 1985）; Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（2版）、Robinsonら（編）、623〜53頁（Marcel Dekker, Inc. 1987）; Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら（編）、475〜506頁（1985）; 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら（編）、303〜16頁（Academic Press 1985）；およびThorpeら、1982、Immunol. Rev. 62:119〜58を参照されたい。
抗体はまた、特に、イムノアッセイまたは標的抗原の精製に有用な固体支持体へと付着させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに限定されない。
本発明の抗体を作製する方法
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したＥｐｏ結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつかは、配列番号１３、３３、５３、もしくは７３に示される重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、および／または配列番号１４、３４、５４、もしくは７４に示される軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、表１において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表１において同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に（例えば、少なくとも６５、８０％、９５％、または９９％）同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、Ｅｐｏ抗原結合能を呈示することが可能である。
本発明ではまた、上記で示したＥｐｏ結合性抗体の重鎖または軽鎖に由来する少なくとも１つのＣＤＲ領域、および、通例３つ全てのＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドも提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したＥｐｏ結合性抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするであろう。
本発明の核酸分子は、抗体の可変領域および定常領域の両方をコードしうる。本発明の核酸配列のうちのいくつかは、配列番号１５、３５、５５、または７５に示される成熟重鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一な成熟重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他のいくつかの核酸配列は、配列番号１６、３６、５６、または７６に示される成熟軽鎖配列と実質的に（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）同一な成熟軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
ポリヌクレオチド配列は、デノボの固相ＤＮＡ合成、またはＥｐｏ結合性抗体またはその結合性断片をコードする既存の配列（例えば、下記の実施例で記載される配列）に対するＰＣＲによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、Narangら、1979、Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法；Brownら、Meth. Enzymol. 68:109、1979によるホスホジエステル法；Beaucageら、Tetra. Lett., 22:1859、1981によるジエチルホスホルアミダイト法；および米国特許第４，４５８，０６６号による固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。ＰＣＲによる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification、H.A. Erlich（編）、Freeman Press、NY、NY、1992；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innisら（編）、Academic Press、San Diego、CA、1990; Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19:967、1991；およびEckertら、PCR Methods and Applications 1:17、1991において記載されている通りに実施することができる。
本発明ではまた、上記で記載したＥｐｏ結合性抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、Ｅｐｏ結合性抗体鎖または結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド、典型的に、タンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを伴うエピソームベクター、およびヒト人工染色体を含む（例えば、Harringtonら、Nat Genet 15:345、1997を参照されたい）。例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞内のＥｐｏ結合性ポリヌクレオチドおよびＥｐｏ結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｂ、およびｐＴｈｉｏＨｉｓ Ｃ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ｂ、およびｐＥＢＶＨｉｓ Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＭＰＳＶベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスに基づくベクター、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）を含む。Brentら、前出; Smith、Annu. Rev. Microbiol. 49:807、1995；およびRosenfeldら、Cell 68:143、1992を参照されたい。
発現ベクターの選択は、その中でベクターを発現させる、意図される宿主細胞に依存する。発現ベクターは、Ｅｐｏ結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列（例えば、エンハンサー）を含有することが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、アラビノース、ｌａｃＺ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモーターを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができる。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、Ｅｐｏ結合性抗体鎖または断片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強することもできる（例えば、Scharfら、Results Probl. Cell Differ. 20:125、1994；およびBittnerら、Meth. Enzymol., 153:516、1987を参照されたい）。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させることができる。
発現ベクターはまた、挿入されたＥｐｏ結合性抗体配列によりコードされるポリペプチドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入されたＥｐｏ結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結することが多い。Ｅｐｏ結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードする配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれらの一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもたらす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
Ｅｐｏ結合性抗体鎖を保有し、これを発現させるための宿主細胞は、原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。大腸菌（E. coli）は、本発明のポリヌクレオチドをクローニングし、発現させるのに有用な１つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物宿主は、枯草菌（Bacillus subtilis）などの桿菌、およびサルモネラ（Salmonella）属種、セラチア（Serratia）属種、および多様なシュードモナス（Pseudomonas）属種など、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合性の発現制御配列（例えば、複製起点）を含有する発現ベクターも作製することができる。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のＥｐｏ結合性ポリペプチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のＥｐｏ結合性ポリペプチドを発現させ、作製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系（例えば、実施例で記載される、１Ｄ６．Ｃ９骨髄腫ハイブリドーマクローン）の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する哺乳動物細胞系（例えば、下記で例示されるＳＰ２／０骨髄腫細胞）の場合もある。哺乳動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、ＣＨＯ細胞系、多様なＣｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、形質転換Ｂ細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクトな免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポリペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Winnacker、FROM GENES TO CLONES、VCH Publishers、N.Y.、N.Y.、1987において一般に論じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（例えば、Queenら、Immunol. Rev. 89:49〜68、1986を参照されたい）、ならびにリボソーム結合性部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含みうる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および／またはモジュレート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳＶプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト即初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、および当技術分野で公知のプロモーター−エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
対象のポリヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを導入する方法は、細胞宿主の種類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用することができる（一般に、Sambrookら、前出を参照されたい）。他の方法は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェクション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるＶＰ２２との融合体（ElliotおよびO'Hare、Cell 88:223、1997）、ＤＮＡの薬剤増強型取込み、およびｅｘ ｖｉｖｏにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、Ｅｐｏ結合性抗体鎖または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エレメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で１〜２日間にわたり成長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
本発明のモノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、KohlerおよびMilstein、1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む様々な技法により作製することができる。例えば、Ｂリンパ球のウイルス性形質転換または発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技法を援用することができる。
ハイブリドーマを調製するための動物系は、マウス系、ラット系、およびウサギ系を含む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野では、融合体のための免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび免疫化法が知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順もまた公知である。
本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、上記で記載した通りに調製されるマウスモノクローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を使用して、非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙらによる米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）を使用して、マウス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法を使用して、マウスＣＤＲ領域を、ヒトフレームワークへと挿入することができる。例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる米国特許第５２２５５３９号；ならびにＱｕｅｅｎらによる米国特許第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５６９３７６２号；および同第６１８０３７０号を参照されたい。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。Ｅｐｏを指向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して作り出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソームマウスは、本明細書で、それぞれ、ＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと称するマウスを含み、本明細書ではまとめて、「ヒトＩｇマウス」と称する。
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、内因性μ鎖遺伝子座および内因性κ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と併せて、再配列されていないヒト重（μおよびγ）鎖免疫グロブリン配列およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonbergら、1994 Nature 368（6474）: 856〜859を参照されたい）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を作り出す（Lonberg, N.ら、1994 前出; Lonberg, N.、1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49〜101において総説される; Lonberg, N.およびHuszar, D.、1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65〜93；ならびにHarding, F.およびLonberg, N.、1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536〜546）。ＨｕＭＡｂマウスの調製および使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの修飾は、それらの全ての内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L.ら、1992 Nucleic Acids Research 20:6287〜6295; Chen, J.ら、1993 International Immunology 5: 647〜656; Tuaillonら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720〜3724; Choiら、1993 Nature Genetics 4:117〜123; Chen, J.ら、1993 EMBO J. 12: 821〜830; Tuaillonら、1994 J. Immunol. 152:2912〜2920; Taylor, L.ら、1994 International Immunology 579〜591；ならびにFishwild, D.ら、1996 Nature Biotechnology 14: 845〜851においてさらに記載されている。さらに、全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；および同第５，７７０，４２９号；Suraniらによる、米国特許第５，５４５，８０７号；全てがＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙによる、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２１０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７１１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号；ならびにＫｏｒｍａｎらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１４４２４号も参照されたい。
別の実施形態では、本発明のヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細書で「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、ＩｓｈｉｄａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号において詳細に記載されている。
当技術分野ではなおさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスジェニック動物系も入手可能であり、本発明のＥｐｏ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）と称する代替的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号；同第６，０７５，１８１号；同第６，１１４，５９８号；同第６，１５０，５８４号；および同第６，１６２，９６３号において記載されている。
当技術分野ではさらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現させる代替的なトランスクロモソーム動物系も入手可能であり、本発明のＥｐｏ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが、このようなマウスは、Tomizukaら、2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722〜727において記載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有するウシも記載されており（Kuroiwaら、2002 Nature Biotechnology 20:889〜894）、本発明のＥｐｏ結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当技術分野では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立されているか、または下記の実施例で記載する。例えば、Ｌａｄｎｅｒらによる米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８号；Ｄｏｗｅｒらによる米国特許第５，４２７，９０８号；および同第５，５８０，７１７号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらによる米国特許第５，９６９，１０８号；および同第６，１７２，１９７号；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらによる米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号；および同第６，５９３，０８１号を参照されたい。
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫化するとヒト抗体応答を作り出しうるようにヒト免疫細胞を再構成した、ＳＣＩＤマウスを使用して調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらによる米国特許第５，４７６，９９６号；および同第５，６９８，７６７号において記載されている。
フレームワークまたはＦｃの操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、ＶＨおよび／またはＶＬ内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、１つの手法は、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すには、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、本発明により包含されることを意図する。
フレームワーク修飾の別の種類は、１つもしくは複数のフレームワーク領域内の残基、なおまたは、１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の残基を突然変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法はまた、「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
フレームワーク内またはＣＤＲ領域内に施された修飾に加えて、またはこれと代替的に、本発明の抗体は、Ｆｃ領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、Ｆｃ受容体の結合、および／または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾することもでき（例えば、１つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することができる）、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の１つまたは複数の機能的特性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記でさらに詳細に記載する。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、ＫａｂａｔによるＥＵインデックスである。
一実施形態では、ヒンジ領域内のシステイン残基の数を改変する、例えば、増大または減少させるように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号においてさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、または抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインＡ（ＳｐＡ）への結合が、天然Ｆｃ−ヒンジドメインのＳｐＡへの結合と比べて損なわれるように、１つまたは複数のアミノ酸突然変異を、Ｆｃ−ヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間界面領域へと導入する。この手法は、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を延長するように修飾する。多様な手法が可能である。例えば、以下の突然変異：Ｗａｒｄによる米国特許第６，２７７，３７５号において記載されている、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆのうちの１つまたは複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号；および同第６，１２１，０２２号において記載されている、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、ＣＨ１領域内またはＣＬ領域内で改変することもできる。
さらに他の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を、抗体のエフェクター機能を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原結合能は保持するように、１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。この手法は、両方ともＷｉｎｔｅｒらによる米国特許第５，６２４，８２１号；および同第５，６４８，２６０号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、抗体が、Ｃ１ｑへの結合を改変し、かつ／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる米国特許第６，１９４，５５１号においてさらに詳細に記載されている。
別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を改変して、これにより、補体に結合する抗体の能力を改変する。この手法は、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９４／２９３５１号においてさらに記載されている。
さらに別の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ／またはＦｃγ受容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ００／４２０７２号においてさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上の、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されている（Shields, R.L.ら、2001 J. Biol. Chen. 276:6591〜6604を参照されたい）。
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、脱グリコシル化抗体（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く）を作製することができる。グリコシル化は、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数のグリコシル化部位を改変することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、１つまたは複数のアミノ酸置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号；および同第６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
加えて、または代替的に、フコシル残基の量を低減した低フコシル化抗体または二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製することもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を増大させることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野では、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、ＨａｎｇらによるＥＰ１，１７６，１９５は、このような細胞系内で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０３５８３５号は、フコースをＡｓｎ（２９７）連結された炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコシル化も結果としてもたらす、変異体のＣＨＯ細胞系である、Ｌｅｃｌ３細胞について記載している（また、Shields, R.L.ら、2002 J. Biol. Chem. 277:26733〜26740も参照されたい）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５４３４２号は、操作細胞系内で発現させた抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増大を結果としてもたらす二分枝型ＧｌｃＮａｃ構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現させるように操作された細胞系について記載している（また、Umanaら、1999 Nat. Biotech. 17:176〜180も参照されたい）。
改変抗体を操作する方法
上記で論じた通り、本明細書で示されるＶＨ配列およびＶＬ配列または全長重鎖および全長軽鎖配列を有するＥｐｏ結合性抗体は、全長重鎖配列および／もしくは全長軽鎖配列、ＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾することにより、新たなＥｐｏ結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって、本発明の別の態様では、本発明のＥｐｏ結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトＥｐｏに結合し、また、Ｅｐｏの１つまたは複数の機能的特性も阻害すること（例えば、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害する、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する）など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する、構造的に関連するＥｐｏ結合性抗体を創出する。
例えば、本発明の抗体の１つまたは複数のＣＤＲ領域またはそれらの突然変異は、組換えにより、公知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組み合わせて、組換えにより操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるＥｐｏ結合性抗体を創出することができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料は、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域である。操作抗体を創出するのに、本明細書で提示されるＶＨ配列および／もしくはＶＬ配列のうちの１つもしくは複数、またはそれらの１つもしくは複数のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情報を、元の配列に由来する「第２世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、次いで、「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、修飾Ｅｐｏ結合性抗体を調製するための方法であって、ａ）配列番号１、２１、４１、および６１からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２、２２、４２、および６２からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号３、２３、４３、および６３からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号４、２４、４４、および６４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号５、２５、４５、および６５からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号６、２６、４６、および６６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とを含むＥｐｏ結合性抗体を作製するステップと、ｂ）重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出するステップと、ｃ）改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、配列番号７、２７、４７、および６７からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号８、２８、４８、および６８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号９、２９、４９、および６９からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号１０、３０、５０、および７０からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１１、３１、５１、および７１からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、ならびに／または配列番号１２、３２、５２、および７２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とからなるＥｐｏ結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞における発現について最適化されたＥｐｏ結合性抗体であって、配列番号１５、３５、５５、および７５の群から選択される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号１６、３６、５６、および７６の群から選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるＥｐｏ結合性抗体を調製し、全長重鎖抗体配列および／または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽鎖のフレームワーク領域内である。
改変抗体配列はまた、ＣＤＲ３配列、またはＵＳ２００５０２５５５５２において記載されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、ＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列には多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製することができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することができる。
標準的な分子生物学の技法を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび／またはマウスＥｐｏに特異的に結合すること；ならびに抗体が、Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイおよび／またはＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイにおいて、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるＥｐｏ結合性抗体の機能的特性のうちの１つ、一部、または全部を保持する抗体である。
本発明の抗体を操作する方法のある種の実施形態では、Ｅｐｏ結合性抗体コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ、結果として得られる修飾Ｅｐｏ結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および／または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然変異法が記載されている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開第ＷＯ０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載している。代替的に、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開第ＷＯ０３／０７４６７９号は、コンピュータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法について記載している。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、脱アミド化部位を除去するように操作されている。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引き起こすことが公知である。脱アミドは、生体活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる（Anal Chem. 2005年3月1日;77（5）:1432〜9）。
本発明のある種の実施形態では、抗体は、ｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように操作されている。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ｐＩが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しやすいことが公知である。さらに、ｐＩが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の抗Ｅｐｏ抗体またはＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、抗体を高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、網膜血管疾患を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。ｐＩの増大はまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎを媒介するリサイクリングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、ｐＩの増大に起因して、抗体の全体的な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびｉｎ ｖｉｖｏにおける生体活性の延長がもたらされる。ｐＩは、８．２以上であることが好ましい。
改変抗体の機能的特性は、実施例において示されるアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）など、当技術分野において利用可能であり、かつ／または本明細書で記載される標準的なアッセイを使用して評価することができる。
予防的使用および治療的使用
本明細書で記載されるＥｐｏに結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、Ｅｐｏレベルの上昇および／またはＥｐｏ活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、網膜血管疾患と関連する状態または障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、糖尿病性網膜症（ＤＲ）と関連する状態または障害を処置する方法を提供する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、黄斑浮腫と関連する状態または障害を処置する方法を提供する。本発明はまた、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）を処置する方法も提供する。本発明はさらに、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）を処置する方法も提供する。なおさらに、本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、加齢黄斑浮腫（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および／または未熟児網膜症を処置するための方法も提供する。本発明はまた、ベータサラセミアおよび／またはがんを処置する方法も提供する。
本発明はまた、Ｅｐｏレベルの上昇および／またはＥｐｏ活性の増大と関連する疾患または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、網膜血管疾患と関連する状態または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、糖尿病性網膜症（ＤＲ）と関連する状態または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、および／または増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）と関連する状態または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はなおさらに、加齢黄斑浮腫（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および／または未熟児網膜症の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、ベータサラセミアおよび／またはがんの処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。より具体的には、Ｅｐｏレベルの上昇および／またはＥｐｏ活性の増大と関連する疾患または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片のうちのいずれか１つに加えて、表１に記載されている抗体または抗原結合性断片でもありうる。なおさらに、網膜血管疾患と関連する状態または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片のうちのいずれか１つに加えて、表１に記載されている抗体または抗原結合性断片でもありうる。本発明の抗体は、とりわけ、網膜血管疾患と関連する状態または障害（例えば、ＤＲ、ＤＭＥ、ＮＰＤＲ、ＰＤＲ、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および／または未熟児網膜症）の進行を防止し、網膜血管疾患と関連する黄斑浮腫を処置または防止し、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ＲＴＭ）注射の頻度を低減し、網膜血管疾患の進行に起因する視力喪失を改善するのに使用することができる。本発明の抗体はまた、網膜血管疾患を伴う患者を処置するための抗ＶＥＧＦ療法と組み合わせても使用することができる。
一態様では、本発明は、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップ（例えば、対象におけるＥｐｏを接触させるステップ）を含み、特に、組成物が、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる方法に関する。一態様では、方法は、細胞（例えば、Ｅｐｏを含む細胞）を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、対象におけるＥｐｏ依存性の細胞増殖を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、Ｂ細胞でありうるであろう。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
細胞増殖は、例えば、細隙灯生体顕微鏡法、光干渉断層法、カラー眼底撮影、およびフルオレセイン血管造影により測定することができる（Hengら、Diabet. Med. 2013年6月、30（6）:640〜50）。加えて、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片の、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖を阻害する能力は、下記で記載されるＦ３６Ｅ細胞増殖アッセイまたはＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイなどのアッセイを使用して測定することもできる。
本発明はまた、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させて、Ｅｐｏが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方法にも関する。一態様では、方法は、Ｅｐｏを含む細胞を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、対象におけるＥｐｏ依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
ＥｐｏのＥｐｏＲへの結合は、ホスファチジル−イノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）／Ａｋｔ、ＭＡＰキナーゼ、ＳＴＡＴ５、およびタンパク質キナーゼＣを含む下流のシグナル伝達経路の活性化をもたらす、ＪＡＫ２キナーゼを介するシグナル伝達を誘導する（Jelkmann、2007; Jelkmann、2004）。ＥｐｏまたはＥｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）は、内皮細胞、平滑筋細胞、およびＣＮＳ細胞などの異なる細胞型により内因的に産生されることが報告されている（OgunsholaおよびBogdanova、2013）。Ｅｐｏが結合してＥｐｏＲが活性化すると、カルシウムの輸送（Korbelら、2004）、細胞の生存（Vellyら、2010）、神経保護（Grimmら、2002）、および血管新生（Ribatti、2010; Ribattiら、2003）などの異なる活性をもたらす、下流のシグナル伝達経路が誘発されうる。したがって、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達の阻害は、これらのシグナル伝達経路のうちの１つまたは複数の活性を測定することにより決定することができる。例えば、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達の阻害は、ＪＡＫ２キナーゼ、ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ、ＭＡＰキナーゼ、ＳＴＡＴ５、またはタンパク質キナーゼＣを測定することにより決定することができる。当技術分野では、これらのシグナル伝達経路を測定する方法が知られており、このような経路の活性を測定するためのキットも市販されている。加えて、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達の阻害は、上記で記載した細胞増殖を測定することにより決定することもできる。細胞増殖は、対象（例えば、血管新生）における細胞増殖の場合もあり、下記で記載されるＦ３６Ｅ細胞増殖アッセイまたはＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイなどのアッセイを使用して測定される場合もある。一態様では、Ｅｐｏ依存性の細胞シグナル伝達は、本明細書で記載される抗体の存在下で、対照と比べて統計学的に有意に（ｐ＜０．０５）低下する。
本発明はまた、Ｅｐｏ依存性の細胞増殖またはシグナル伝達を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させて、Ｅｐｏが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方法にも関する。細胞は、Ｂ細胞であることが企図される。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。
本発明はまた、ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合を阻害する方法であって、Ｅｐｏを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップ（例えば、対象におけるＥｐｏを接触させるステップ）を含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。本発明はまた、Ｅｐｏと、対象の細胞上のＥｐｏ受容体の結合を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関し、特に、組成物は、抗体のＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、またはＮＶＳ４を含みうる。細胞は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。ＥｐｏとＥｐｏ受容体の結合の阻害は、Khankinら、PLoS ONE、2010 5:e9246により記載されている通りに測定することができる。
網膜血管疾患および網膜血管疾患と関連する黄斑浮腫の処置および／または防止は、眼科医または医療ケア従事者が、視覚機能および／または網膜の解剖学的特徴についての臨床的に関与性の測定を使用して決定することができる。網膜血管疾患と関連する状態または障害の処置とは、視覚機能および／または網膜の解剖学的特徴の改善または保存を結果としてもたらすか、または結果としてもたらすことが企図される、任意の作用（例えば、本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体の投与）を意味する。加えて、網膜血管疾患と関連する状態または障害に関する場合の防止とは、本明細書で規定される、視覚機能、網膜の解剖学的特徴、および／または網膜血管疾患パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある患者において防止するかまたは緩徐化する、任意の作用（例えば、本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体の投与）を意味する。
視覚機能は、例えば、視力、低照度による視力、視野、中心視野、周辺視力、コントラスト感度、暗順応、フォトストレスリカバリー、色彩弁別、読取り速度、支援デバイス（例えば、大型活字、拡大デバイス、望遠鏡）への依存性、顔認識、自動車運転時の習熟度、１つまたは複数の日常生活活動を実施する能力、および／または患者により報告された、視覚機能と関連する満足度を含みうる。
視覚機能の例示的な尺度は、スネレン視力、ＥＴＤＲＳ視力、低輝度視力、アムスラーグリッド、ゴールドマン視野、ハンフリー視野、マイクロ視野測定、ペリー−ロブソンチャート、スキルカード、石原カラープレート、ファーンズワースＤ１５色覚検査またはファーンズワースＤ１００色覚検査、標準的な網膜電図、多焦点網膜電図、妥当性の確認された読取り速度検査、顔認識、運転シミュレーション、および患者により報告された満足度を含む。したがって、ＥＴＤＲＳスケール上の視力が、２行（または１０文字）以上向上するか、またはこれに２行（または１０文字）以上の低下が見られなければ、血管疾患および／または黄斑浮腫の処置が達成されたということができる。加えて、対象の読取り速度（１分間当たりのワード数）が、少なくとも１０％増大するか、またはこれに１０％の減少が見られない場合も、血管疾患および／または黄斑浮腫の処置がなされたということができる。加えて、対象の石原検査において正確に同定されたプレートまたはファーンズワース検査において正確に配列されたディスクの比率が、少なくとも２０％増大するか、またはこれに２０％の低下が見られない場合も、血管疾患および／または黄斑浮腫の処置がなされたということができる。さらに、例えば、対象による、あらかじめ指定された程度の暗順応までの時間が、少なくとも１０％短縮されるか、またはこれに１０％以上の延長が見られない場合も、網膜血管疾患および／または黄斑浮腫の処置がなされたということができる。加えて、例えば、対象において、有資格の医療ケア従事者（すなわち、眼科医）により決定される視角として表される視覚暗点の総面積が少なくとも１０％低減されるか、またはこれに１０％以上の増大が見られない場合も、網膜血管疾患および／または黄斑浮腫の処置がなされたということができる。
処置または防止されうる網膜の解剖学的特徴の所望されない態様は、例えば、毛細血管瘤、黄斑浮腫、綿花状白斑、網膜内細小血管異常（ＩＲＭＡ）、毛細血管脱落、白血球接着、網膜虚血症、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩血管新生、網膜内出血、硝子体内出血、黄斑部瘢痕、網膜下線維症、および網膜線維症、静脈拡張、血管蛇行、血管漏出を含む。したがって、例えば、黄斑浮腫の処置は、光干渉断層法により測定される、中心網膜サブフィールド厚の２０％以上の低減により決定することができる。
網膜の解剖学的特徴を評価する例示的な手段は、眼底検査、眼底撮影、フルオレセイン血管造影、インドシアニングリーン血管造影、光干渉断層法（ＯＣＴ）、スペクトラルドメイン光干渉断層法、走査レーザー検眼鏡、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生検、剖検、および免疫組織化学を含む。したがって、フルオレセイン血管造影により決定される漏出面積が１０％低減されれば、対象における血管疾患および／または黄斑浮腫が処置されたということができる。
本発明の治療剤で処置される対象にはまた、全ての形態のインスリンおよび降圧薬など、糖尿病と関連する状態を処置する公知の方法を伴う他の治療剤も投与することができる。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および／または未熟児網膜症などの眼疾患の処置および／または防止は、眼科医または医療ケア従事者が、上記で記載した尺度のうちのいずれかにより、視覚機能および／または網膜の解剖学的特徴についての臨床的に関与性の測定を使用して決定することができる。本明細書で記載される尺度が、本明細書の各眼疾患およびあらゆる眼疾患に適用されるわけではないが、当業者は、所与の眼疾患を処置するのに使用されうる、視覚機能および／または網膜の解剖学的特徴についての臨床的に関与性の測定を認識するであろう。
本発明の治療剤を、別の薬剤と併せて投与する場合、２つの薬剤は、いずれの順序で逐次的に投与することもでき、同時に投与することもできる。いくつかの態様では、本発明の抗体は、第２の薬剤（例えば、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））による治療もまた施される対象へと投与する。他の態様では、結合性分子は、外科処置と共に投与する。
Ｅｐｏ結合性抗体による組合せ処置に適する薬剤は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、他の受容体チロシンキナーゼ阻害剤、またはＨＩＦ−１を媒介する経路をモジュレートする他の実体の活性をモジュレートすることが可能な、当技術分野で公知の薬剤を含む。これらの経路を阻害することが報告されている他の薬剤は、ラニビズマブ、ベビシズマブ、ペガプタニブ、アフリベルセプト、パゾパニブ、ソラフィニブ、スニチニブ、およびラパマイシンを含む。コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤＳ、およびＴＮＦ−α阻害剤などの抗炎症剤を伴う組合せ処置もまた、網膜血管疾患および黄斑浮腫、例えば、糖尿病性網膜症およびＤＭＥの処置において有益でありうるであろう。
組合せ治療レジメンは、追加的な場合もあり、相乗作用的結果（例えば、網膜症の重症度の２つの薬剤を組み合わせた使用について予測される軽減を超える軽減）をもたらす場合もある。いくつかの実施形態では、本発明は、網膜血管疾患および黄斑浮腫、とりわけ、上記で記載したＤＭＥおよび／またはＰＤＲを含む糖尿病性網膜症を防止および／または処置するための組合せ治療であって、本発明のＥｐｏ結合性抗体および抗ＶＥＧＦ剤などの抗血管新生剤を伴う組合せ治療を提供する。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたＥｐｏ結合性抗体（インタクトなまたは結合性断片）を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、糖尿病性網膜症の処置または防止に適する１つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。
本発明の医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することができる。投与経路および／または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば、注射または注入による）に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
組成物は、滅菌であり、かつ、流体であるものとする。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
本発明の医薬組成物は、当技術分野において周知であり、日常的に実施されている方法に従い調製することができる。例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、Mack Publishing Co.、20版、2000；およびSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照されたい。医薬組成物は、ＧＭＰ条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中では、Ｅｐｏ結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用することが典型的である。Ｅｐｏ結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答（例えば、治療的応答）をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示されるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することがとりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のための単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性とならずに、特定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
医師または獣医師は、医薬組成物中で援用される本発明の抗体の投与を、所望の治療効果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される網膜血管疾患を処置するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるのか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投与量は、宿主の体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇの範囲であり、より通例では、宿主の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１５ｍｇの範囲である。抗体の硝子体内投与では、投与量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ〜眼１つ当たり１０ｍｇの範囲でありうる。より具体的には、用量は、眼１つ当たり１ｍｇ〜眼１つ当たり９ｍｇ、眼１つ当たり２ｍｇ〜眼１つ当たり８ｍｇ、眼１つ当たり３ｍｇ〜眼１つ当たり７ｍｇ、眼１つ当たり４ｍｇ〜眼１つ当たり６ｍｇ、または眼１つ当たり４．５ｍｇ〜眼１つ当たり５．５ｍｇの範囲でありうる。ある種の場合には、用量は、眼１つ当たり０．１ｍｇ、眼１つ当たり０．２ｍｇ、眼１つ当たり０．３ｍｇ、眼１つ当たり０．４ｍｇ、眼１つ当たり０．５ｍｇ、眼１つ当たり０．６ｍｇ、眼１つ当たり０．７ｍｇ、眼１つ当たり０．８ｍｇ、眼１つ当たり０．９ｍｇ、眼１つ当たり１ｍｇ、眼１つ当たり２ｍｇ、眼１つ当たり３ｍｇ、眼１つ当たり４ｍｇ、眼１つ当たり５ｍｇ、眼１つ当たり６ｍｇ、眼１つ当たり７ｍｇ、眼１つ当たり８ｍｇ、眼１つ当たり９ｍｇ、または眼１つ当たり１０ｍｇでありうる。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与を伴う。例示的な処置レジメは、２週間ごとに１回、または毎月１回、または３〜６カ月ごとに１回の全身投与、または必要に応じた（ＰＲＮ）全身投与を伴う。
抗体は通例、複数回投与する。単回の投与の間の間隔は、毎週、毎月、または毎年でありうる。間隔はまた、患者におけるＥｐｏ結合性抗体の血中レベルを測定することにより指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。有効性は、病変の成長、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）のレスキュー速度、光干渉断層法（ＯＣＴ）により決定される網膜厚、および視力に基づく。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血漿中濃度１〜１０００μｇ／ｍｌを達成するように調整し、いくつかの方法では、２５〜５００μｇ／ｍｌを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるのか治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されるものであり、その範囲を限定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らかであろうし、付属の特許請求の範囲によっても包含される。
実施例１：アフィニティー成熟Ｅｐｏ抗体の作製
完全ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して、本明細書で記載されるＥｐｏ結合性抗体を作り出した。
液相パニングおよび固相パニングにおいて、ビオチニル化および非ビオチニル化ヒトおよびカニクイザルＥｐｏを使用した。標準的パニングならびにＲａｐＭＡＴ法（Prasslerら、（2009）Immunotherapy 1（4）:571〜583）を実施した。二次スクリーニングおよびＲａｐＭＡＴパニングの後、クローンを、配列解析のために選択し、８つの抗体のセットを、ＦａｂＣｙｓフォーマットへの転換、生殖細胞系列化、ｐＩの最適化、および脱アミド化部位の除去について選択した。ＦａｂＣｙｓの作製は、特許権のあるＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）法により達成した。ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）は、大量のＦａｂクローンを、ＩｇＧおよびＦａｂＣｙｓフォーマットへと簡便かつ効率的に転換するための２ステップ法として実施した。第１のクローニングステップにおいて、ＢｓｉＷＩ／ＭｆｅＩ消化（κプールのための）またはＨｐａＩ／ＭｆｅＩ消化（λプールのための）およびその後のライゲーションを介して、真核発現カセットを、発現ベクターであるｐＭＯＲＰＨ（登録商標）ｘ１１（ＨｕＣＡＬ ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）のための）へと導入した。これに続き、ＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ（κプールおよびλプール）を使用して発現カセットを含有するＦａｂプールを消化する、第２のクローニングステップを行い、その後、哺乳動物細胞における発現のために、ｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ＩｇＧ１ｆアクセプターベクターまたはｐＭｏｒｐｈ（登録商標）４＿ｈ＿ＦａｂＣｙｓアクセプターベクターへとクローニングした。この研究計画では、固有の、配列決定され、特徴付けられたＦａｂだけにＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）を適用した。したがって、ＲａｐＣＬＯＮＥ（登録商標）の後では、全てのクローンが回収された。
低値のｐＩ（＜８．２）は一般に、安定性および凝集を含む生物物理的特性の不良と関連する。８つの最終候補（ＨＣＤＲ３に固有のクローン）を、生殖細胞系列化、ｐＩの最適化、および脱アミド化部位の除去について選択し、合計１２の生殖細胞系列化変異体をもたらした。１２のＶＬ遺伝子（１１３１７、１１３２４、１１３３１、および１１３４５については２つずつ）および１つのＶＨ（１１３２４）を合成した。おそらく、ＰＴＭを伴う候補の早期の除外に起因して、１１３１７（ＶＬ）、１１３３２（ＶＬ）、および１１３８０（ＶＨ）だけが、生殖細胞系列化により除去される脱アミド化部位を含有した。生殖細胞系列化は一般に、最も近縁の生殖細胞系列へ施した。ｐＩを増大させるため、候補のうちの６つのために、最も近縁の生殖細胞系列である３ｒの代わりに、またはこれに加えて、ラムダ生殖細胞系列である３ｈを選択した。加えて、３つの候補のために、ラムダ３ｊ変異体を構築して、危険性を最小化した（１１３１７、１１３３１および１１３４５）。
上記で言及した通り、タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵となる決定因子である。ファージディスプレイライブラリーから同定された抗Ｅｐｏ ＦａｂのｐＩは、８．２未満であった。製造特性を改善するために、抗体を、それらのｐＩを増大させ、それらの薬物様特性を改善するように、特異的に操作した。抗Ｅｐｏ ＦａｂのｐＩを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、Ｆａｂを高濃度（＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することが可能となった。Ｆａｂを高濃度（例えば、＞１００ｍｇ／ｍｌ）で製剤化することにより、高用量のＦａｂを、患者の眼へと、硝子体内注射を介して投与することを可能とする利点がもたらされ、これにより、湿潤型ＡＭＤおよび糖尿病性網膜症を含むがこれらに限定されない、慢性眼疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とすることができる。
結果として得られるＦａｂ（ＮＶＳ１、ＮＶＳ２、ＮＶＳ３、およびＮＶＳ４）を、表１に示す。
実施例２：最適化された抗体の特徴付け
以下の実施例は、抗体アフィニティーを測定するのに使用しうる方法について記載する。当技術分野では、結合アフィニティーを測定するこれらの方法および他の方法が知られている。
アフィニティーの決定
Ｅｐｏに対する抗体のアフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により測定した。Ｅｐｏ結合のための各技術および対応する平均結果についての説明を下記に記載する。モデル化仮説は、系内のＥｐｏの濃度、Ｅｐｏ生合成の反応速度および半減期のほか、所望の投与スケジュールを考慮に入れるが、これは、Ｅｐｏに対するアフィニティーが５０ｐＭ未満のＦａｂは、遊離Ｅｐｏのレベルを低下させるのに十分であることを示唆している。
Ｂｉａｃｏｒｅによる決定
相互作用の反応速度、すなわち、複合体の形成速度（ｋａ）および解離速度（ｋｄ）は、センサーグラム内の情報から決定することができる。試料が、調製されたセンサー表面上を通過するときに、結合が生じれば、センサーグラム内の応答が増大する。平衡に達すれば、定常シグナルが見られるであろう。試料を緩衝液で置きかえると、結合した分子は解離し、応答は低下する。Ｂｉａｃｏｒｅ査定ソフトウェアは、データを、相互作用モデルへと当てはめることにより、ｋａ値およびｋｄ値を得る。
方法を実行するために、３つのフローセルを活用した。フローセル１（ｆｃ１：flow cell 1）は、Ｅｐｏ Ｆａｂを捕捉せず、Ｅｐｏの抗体でコーティングされたチップ表面への非特異的な結合を評価する基準として用いられた。いずれの捕捉ステップおよび結合ステップも、フローセル２〜４上で実行した。
捕捉ステップ：２０のＲｍａｘを達成するための、ｆｃ２〜４上の抗ｈｕ Ｆａｂの捕捉レベルは、約５０ＲＬであった。１ｕｇ／ｕｌの濃度の抗ｈｕ Ｆａｂに、１０μｌ／分の流速で、Ｆｃ２〜４上を流動させた。
相対Ｒｍａｘの計算は、以下の通りである。
Ｆａｂ：Ｒｍａｘ＝ＲＬ×（ＭＷａｎａｌｙｔｅ／ＭＷｌｉｇａｎｄ）×化学量論値２０＝ＲＬ×（２１．４／５０）×１＝５０ＲＬ
解析物は、２０ｎＭの濃度で始めて、長い解離および短い解離のための２．５ｎＭの二連を伴う８つの１：２希釈を含んだ。解析物は、６０μｌ／分の流速で、２４０秒間にわたりランさせた。解離時間は、４０００秒間および６００秒間に設定した。解離時間は、ＮＶＳ２およびＮＶＳ４の１０ｎＭ、２．５ｎＭ、および０．３１２５ｎＭの解析物濃度について、４０００秒間に設定した。試料を注射した後、再生緩衝液による洗浄ステップを施した。
再生は、全てのフローセル上で、各サイクルの終了時において実施した。この方法のための再生条件は、６０ｕｌ／分で１００秒間にわたる、１０％の水酸化ナトリウムを伴う１％のリン酸とした。
他の全てのランニング条件は、２５℃、１×ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ型番ＢＲ−１００６−６９）中で実行した。結果として得られるシグナルは、二重基準化により、すなわち、屈折率値を、基準フローセルから減じるステップと、解析物を伴わない結合ステップとにより調整した。データは、１０Ｈｚで収集し、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して解析した。このプログラムでは、各相互作用についての速度およびアフィニティー定数を決定するのに、グローバルフィッティング解析法が使用される。
Ｂｉａｃｏｒｅによる結合反応速度決定の結果を、表２に示す。示される通り、本明細書で記載される抗体は、４０ｐＭ以下であることが典型的なＫＤ値で、ヒトＥｐｏへの高アフィニティーの結合を呈示した。
ＳＥＴによる決定
ＳＰＲなど、センサー表面を使用する反応速度アッセイとは対照的に、ＳＥＴとは、溶液中のアフィニティーを決定する方法である。ＳＥＴは、反応速度データを与えることのない、平衡における測定である。
ＳＥＴでは、定常量の抗体を、異なる濃度の抗原と共に、平衡に達するまでインキュベートする。平衡化溶液中の遊離抗体の濃度は、溶液を、抗原でコーティングされたＭＳＤ（商標）プレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標））上に適用した後で、ＥＣＬ標識された二次抗体を伴うインキュベーションおよびシグナル強度の測定を行うことにより決定する。抗原濃度が低ければ、強いシグナルが達成される（プレート上の抗原に高濃度の遊離抗体が結合する）のに対し、抗原濃度が高ければ、抗体は、抗原に完全に捕捉され、弱いシグナルを結果としてもたらす。マッチング範囲内で十分な濃度の抗原がマッチング可能であれば、適切な当てはめモデルを使用する滴定曲線により、アフィニティーの妥当な決定が可能となる。完全な滴定のためには、予測されるＫＤの少なくとも１０倍の抗原濃度を適用しなければならない。アッセイ内で適用される抗体の定常濃度は、ＫＤの範囲内にあるか、またはＫＤを下回るものとする（表３）。
ＳＥＴによりＫＤを決定するには、抗体タンパク質の単量体画分（解析的ＳＥＣにより解析された単量体含量のうちの少なくとも９０％；それぞれ、ＦａｂのためのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、またはＩｇＧのためのＴｏｓｏｈ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ））を使用した。
溶液中のアフィニティーの決定は基本的に、文献（Friguetら、305〜19）において記載されている通りに実施した。ＳＥＴ法の感度および精度を改善するために、ＳＥＴを、古典的ＥＬＩＳＡに基づく技術から、ＥＣＬに基づく技術へと移行させた（Haenelら、2005）。
Ｅｐｏ抗体を、インキュベーション緩衝液（２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ａ４５０３）および１％のＴｗｅｅｎ２０および１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ型番２３４７２９）を伴うＰＢＳ）中の一定濃度まで希釈し、インキュベーション緩衝液中のＥｐｏの系列希釈液（１：５）へと添加した。
最終の最高Ｅｐｏ濃度：
ヒト、Ｈｕ−ダルベポエチン、カニクイザル、マウス、ラット＝１０ｎＭ
ウサギ＝１００ｎＭ
Ｆａｂの最終濃度：
ＮＶＳ２：ウサギ＝３０ｐＭを除き、２ｐＭ
ＮＶＳ３：ウサギ＝５ｐＭを除き、２ｐＭ
ＮＶＳ４：ウサギ＝１０ｎＭを除き、２ｐＭ
ＮＶＳ１：２ｐＭ
試料は、室温で一晩にわたるインキュベーションにより平衡に到達させた。
ストレプトアビジンでコーティングした標準的なＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；３８４ウェル：ＭＳＤ型番Ｌ１１ＳＡ）を、２５μｌのインキュベーション緩衝液で、室温で１時間にわたりブロッキングした。プレートを、ＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴う２５ｍＭのＴＢＳ）中で、３回にわたり洗浄した。０．１μｇ／ｍｌのビオチニル化Ｅｐｏを、２５μｌのインキュベーション緩衝液中に添加し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴ緩衝液中で、３回にわたり洗浄した。Ｆａｂを含有する試料およびＥｐｏ滴定物を、プレート（２５μｌ）へと添加し、室温で１５分間にわたりインキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴ緩衝液中で、３回にわたり洗浄した。２５μｌの検出抗体を添加し（抗ヒト（ヤギ）Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ；インキュベーション緩衝液中に１：１０００；ＭＳＤ型番Ｒ３２ＡＪ−１）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄し、１倍濃度のＭＳＤ Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤；ＭＳＤ型番Ｒ９２ＴＣ−１を伴う）５０μｌを添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００上で読み取った。
３回の実験を別個の日に実施し、各データ点は３連とした。
データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ４を使用して解析し、各値からバックグラウンド（ウェルの平均がＦａｂを含有しない）を減じた。Ｘ軸値（溶液中のＥｐｏ濃度）を、ｌｏｇ１０ｘへと変換した。
ＫＤ値（ＫＤ）は、以下のモデル：
Ｙ＝（Ｔｏｐ−（（Ｔｏｐ／（２×Ｆａｂ））×（（（（１０ｘ）＋Ｆａｂ）＋ＫＤ）−（（（（（（１０ｘ）＋Ｆａｂ）＋ＫＤ）×（（（１０ｘ）＋Ｆａｂ）＋ＫＤ））−（（４×（１０ｘ））×Ｆａｂ））０．５））））
［式中、
Ｔｏｐ＝抗原濃度＝０のときのシグナル
ｘ＝溶液中のＥｐｏ濃度
Ｆａｂ＝Ｆａｂ濃度に対する制約は、１ｐＭに設定した］
から当てはめた。
Ｅｐｏ Ｆａｂのアフィニティーは、ＳＥＴアッセイを使用して決定し、結果として得られるＫＤ値（［ｐＭ］濃度）を、表３にまとめる。ＮＶＳ２は、ヒトＥｐｏ、ヒトダルベポエチン、およびカニクイザルＥｐｏに、１０ｐＭ未満のＫＤで結合した。ＮＶＳ２はまた、マウスＥｐｏにも、５０ｐＭ未満のＫＤで結合し、ラットＥｐｏにも、２０ｐＭ未満のＫＤで結合した。ＮＶＳ３は、ヒトＥｐｏ、ヒトダルベポエチン、カニクイザルＥｐｏ、マウスＥｐｏ、およびラットＥｐｏに、５ｐＭ未満のＫＤで結合した。ＮＶＳ４は、ヒトＥｐｏ、ヒトダルベポエチン、カニクイザルＥｐｏ、マウスＥｐｏ、およびラットＥｐｏに、１０ｐＭ未満のＫＤで結合した。
実施例３：Ｅｐｏの阻害は、細胞増殖を誘導した
成長および生存のためにエリスロポエチンに依存する細胞を活用して、Ｅｐｏ依存性の増殖阻害による抗Ｅｐｏ治療剤の効力を測定することができる（Chibaら、1991）。
実施例３ａ：Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞増殖アッセイ
このアッセイでは、Ｅｐｏ受容体を発現しているマウスＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞）におけるＥｐｏ誘導性細胞増殖を阻害するＥｐｏ抗体の能力が裏付けられる。Ｂａ／Ｆ３細胞とは、ＩＬ−３依存性の成長および生存のための細胞であり、多様な発がん性チロシンキナーゼで形質転換されると、ＩＬ−３に依存しない形で成長することが示されている。ＥｐｏＲで安定的にトランスフェクトすると、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞は、ＩＬ−３非依存性となる。製造元の指示書に従い、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイス（Ａｍａｘａ；Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）ＩＩ）を使用する、Ａｍａｘａヌクレオフェクションシステム（型番ＶＣＡ−１００３、Ａｍａｘａ ＧｍｂＨ）を使用して、ヒトＥｐｏＲを保有する哺乳動物の発現プラスミドであるｐｃＤＮＡ３．１を、Ｂａ／Ｆ３細胞へとトランスフェクトした。
細胞の維持
成長培地：ＲＰＭＩ１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ／１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ／１Ｕ／ｍｌのＥｐｏ
アッセイ培地：ＲＰＭＩ１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ／１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ
Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞は、成長培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ／１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ／１Ｕ／ｍｌのＥｐｏ）中で維持した。１ｍｌ当たり約１×１０６個の細胞の細胞は、１ｍｌ当たり０．４〜０．６×１０５個の細胞へと分裂した（３〜４日ごとに）。
Ｅｐｏ誘導性細胞増殖アッセイ
１．実験の前日、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞を、遠心分離により調製して、成長培地を除去し、その後、細胞を、Ｅｐｏを含有しないアッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０／１０％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ／１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢ）中に再懸濁させた。
２．実験日において、細胞を、アッセイ培地中で２〜３回にわたり洗浄し（１０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離し）、１ｍｌ当たり１．２５×１０５個の細胞でアッセイ培地中に再懸濁させた。
３．２５００個の細胞を、３８４ウェル黒色プレート（底部透明で、ＴＣ処置されている）内の各アッセイウェルへと添加した。
４．最終Ｅｐｏ濃度が、所望の最終濃度の２倍となるように、Ｅｐｏを、３８４ウェルマイクロプレート内で、アッセイ培地により系列希釈した。
５．（３連で）系列希釈されたＥｐｏ ２０μｌを、３８４ウェル黒色プレートの、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞を含有する試料ウェルへと、３連で添加した。
６．プレートを、遠心分離機により、１０００ｒｐｍで３０〜６０秒間にわたりスピンし、３７℃、５％のＣＯ２で４８時間にわたりインキュベートした。
７．終点の４時間前に、８μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを、全てのウェルへと添加し、３７℃、５％のＣＯ２で再インキュベートした。
８．４時間後に、プレートを、Ｐａｒａｄｉｇｍ ＭｕｌｔｉｍｏｄｅＳＷを伴うＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐａｒａｄｉｇｍまたは同等なスキャナー上で読み取った。
９．Ｅｐｏは、ベースラインの４倍のＢａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖を刺激した。Ｅｐｏは、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲを、１１．２ｐＭの平均および１０ｐＭ〜２６ｐＭの範囲のＥＣ５０で刺激した。
１０．抗Ｅｐｏ抗体を、アッセイ培地中に４ｎｇ／ｍｌのＥｐｏを含有する３８４ウェルマイクロプレート内、３連で系列希釈し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。
１１．ウェル１つ当たり２０μｌの、上記のＥｐｏ／抗Ｅｐｏ抗体混合物を、ウェル当たり２５００個のＢａＦ３／ＥｐｏＲ細胞をあらかじめ播種された、黒色に壁面処理された３８４ウェルプレートへと添加した。
１２．インキュベーション後、上記のステップ７〜９で概括した通りにプレートを加工した。
結果
４８時間後、Ｅｐｏ抗体は、１ｎｇ／ｍｌのＥｐｏの存在下で、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖を阻害した。抗体は、Ｂａ／Ｆ３−ＥｐｏＲ細胞の増殖を、３５０ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害した。
実施例３ｂ：Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイ
Ｆ３６Ｅ細胞は、増殖のために、Ｅｐｏに高度に依存する。上記で記載した方法を使用する、Ｅｐｏによる刺激は典型的に、ベースラインの６倍超のシグナルを結果としてもたらす。この曲線のＥＣ５０は、７ｐＭである。
Ｅｐｏ誘導性Ｆ３６Ｅ細胞増殖アッセイの中和のプロトコール
抗Ｅｐｏ治療用抗体をスクリーニングし、開発のための候補を選択するのに、骨髄親細胞系に由来するＥｐｏ依存性リンパ球様不死化細胞系であるＦ３６Ｅ細胞系を使用する増殖アッセイを使用した。
細胞の維持
組換え高グリコシル化ヒトＥｐｏであるダルベポエチンを、細胞の維持および本明細書で記載される細胞増殖アッセイに使用した。ダルベポエチンは、Ｆ３６Ｅ細胞内の増殖を、組換えヒトＥｐｏ（６３．２ｐｇ／ｍｌのダルベポエチンおよび８１．２５ｐｇ／ｍｌのエリスロポエチン；ＬＵ−１５４３２、４４頁を参照されたい）と同等なＥＣ５０で刺激する。Ｆ３６Ｅ細胞は、成長培地（ＲＰＭＩ１６４０／５％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ／５．２Ｕ／ｍｌのｄＥｐｏ）中、１ｍｌ当たりの細胞０．２５×１０６個の最小密度〜１ｍｌ当たりの細胞１．０×１０６個の最大密度で、継代１０代まで維持した。
Ｅｐｏ誘導性増殖アッセイのプロトコール
１．Ｅｐｏを、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０／５％のＦＢＳ／１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で、所望の最終濃度の４倍である４ｎｇ／ｍｌまで希釈した。
２．抗Ｅｐｏ抗体を、アッセイ培地中で、最終濃度の４倍である２００ｎＭまで希釈した。この濃度を、アッセイ培地中６つの点にわたり系列希釈した。陽性基準抗体（例えば、Ｅｐｏ２６）および陰性基準抗体（例えば、抗ニワトリリゾチームモノクローナル抗体）について希釈を反復した。
３．７．５ｕｌの希釈ｄＥｐｏおよび７．５ｕｌの抗Ｅｐｏ抗体系列希釈液を、３８４ウェルポリプロピレンマイクロプレート内、３連で混合し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。
４．Ｆ３６Ｅ細胞（３８４ウェルプレート１枚当たり２×１０６個）をペレット化し、成長培地を吸引し、細胞をアッセイ培地中で１回洗浄し（１２００ｒｐｍで５分間にわたり遠心分離し）、次いで、アッセイ培地中に１ｍｌ当たりの細胞３．３３×１０５個まで再懸濁させた。
５．ウェル１つ当たりの細胞１５μｌ（ウェル１つ当たりの細胞５，０００個）を、３８４ウェルポリスチレン細胞培養プレート内の全てのウェルへと添加した。
６．１５ｕｌの抗体−Ｅｐｏ混合物を、細胞へと添加した。
７．３７℃、５％のＣＯ２で６８時間にわたりインキュベートした。
８．ウェル１つ当たり８μｌのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを添加し、３７℃、５％のＣＯ２で４時間にわたりインキュベートした。
９．Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒまたは同等なスキャナー上、５６０（２０）Ｅｘ／５９０（１０）Ｅｍで蛍光を測定した。
１０．平均ＲＦＵ＋／−標準偏差を、抗体ｎＭと対比してプロットし、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｚｍソフトウェアで非線形回帰曲線へと当てはめることにより、ＩＣ５０を決定した。
結果
抗Ｅｐｏ抗体は、Ｆ３６Ｅ細胞増殖を、２００ｐＭ以下のＩＣ５０で阻害した。
実施例４：エピトープの結合
合成ペプチドおよびペプチド切断研究
ヒトＥｐｏ（ｈＥｐｏ）の構造ドメインに対応する合成ペプチドである、ｈＥｐｏのドメイン切断、またはｈＥｐｏおよびヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）の部分を含有するキメラ分子を、合成するかまたは組換えにより発現させた。合成ペプチドへの陽性結合は、Ｅｐｏのそのドメイン内に含有される残基が、抗Ｅｐｏ抗体への結合に関与することを指し示した。切断されたタンパク質では、結合の喪失により、切断された部分の抗Ｅｐｏ抗体への結合への関与が指し示された。しかし、結合の喪失は、切断が、抗Ｅｐｏ抗体への結合に影響を及ぼすように、残りのタンパク質の構造を著明に改変する可能性を除外しなかった。ヒトＥｐｏ−ヒトＴＰＯキメラは、構造の維持を可能としながら、なおエピトープマッピングも許容した。ｈＴＰＯの一部分を含有する変異体への結合の喪失は、ｈＥｐｏ内の相同領域が、抗Ｅｐｏ抗体への結合に重要であることを指し示した。
抗エリスロポエチン抗体のペプチドエピトープマッピング
エリスロポエチンのヘリックスに対応する以下の６つのペプチド（表６）を合成した。
アッセイ手順
１．３８４ウェルＭＳＤ ｓｔａｎｄａｒｄプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｌ２１ＸＡ−４）上で、ＰＢＳ中２５ｕｌのペプチド（５ｕｇ／ｍｌ）を一晩にわたりコーティングした。
２．プレートを、９０ｕｌのＰＢＳ＋５％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、４時間にわたりブロッキングした。
３．ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００による希釈液中５００ｎＭのＭｏｒｐｈｏｓｙｓ Ｅｐｏ Ｆａｂを、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。
４．プレートを洗浄し、Ｅｐｏ Ｆａｂまたは基準タンパク質／抗体に適切な種に対する、Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ抗ヒトＩｇＧ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ３２ＡＪ−１）と共にインキュベートした（１時間）。
５．プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ９２ＴＣ−１）を添加した。
６．プレートを読み取る。
エリスロポエチンの切断変異体を伴う抗エリスロポエチン抗体についてのエピトープマッピング
Ｅｐｏ変異体１：ヘリックスＡ
Ｅｐｏ変異体２：ヘリックスＡ、ループＡ〜Ｂ
Ｅｐｏ変異体３：ヘリックスＡ、ループＡ〜Ｂ、ヘリックスＢ
Ｅｐｏ変異体４：ヘリックスＡ、ループＡ〜Ｂ、ヘリックスＢ、ループＢ〜Ｃ、ヘリックスＣ
Ｅｐｏ変異体５：全長エリスロポエチン
アッセイ手順
１．標準的なストレプトアビジン３８４ウェルプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｌ２１ＳＡ−１）を、ＨＥＫ２９３により発現させたビオチニル化Ｅｐｏ変異体で、４℃で一晩にわたりコーティングした。
２．プレートを、９０ｕｌのＰＢＳ＋５％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、４時間にわたりブロッキングした。
３．プレートを洗浄し、５００ｎＭのＭｏｒｐｈｏｓｙｓ Ｅｐｏ Ｆａｂを、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。
４．プレートを洗浄し、Ｅｐｏ Ｆａｂまたは基準タンパク質／抗体に適切な種に対する、Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ抗ヒトＩｇＧ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ３２ＡＪ−１）と共にインキュベートした（１時間）。
５．プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ９２ＴＣ−１）を添加した。
６．プレートを読み取る。
Ｅｐｏ／トロンボポエチン（Ｔｐｏ）キメラ体およびウサギＥｐｏ／ヒトＥｐｏキメラ体による、抗エリスロポエチン抗体についてのエピトープマッピング
Ｅｐｏ／Ｔｐｏキメラ体
Ｅｐｏ／Ｔｐｏ変異体１：ＴｐｏヘリックスＡを伴うヒトＥｐｏ
Ｅｐｏ／Ｔｐｏ変異体２：ＴｐｏループＡ〜Ｂを伴うヒトＥｐｏ
Ｅｐｏ／Ｔｐｏ変異体３：ＴｐｏヘリックスＢを伴うヒトＥｐｏ
Ｅｐｏ／Ｔｐｏ変異体４：ＴｐｏヘリックスＣを伴うヒトＥｐｏ
Ｅｐｏ／Ｔｐｏ変異体５：ＴｐｏヘリックスＤを伴うヒトＥｐｏ
ウサギＥｐｏ／ヒトＥｐｏキメラ体
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体１：ヒトヘリックスＡを伴うウサギＥｐｏ
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体２：ヒトループＡ〜Ｂを伴うウサギＥｐｏ
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体３：ヒトヘリックスＢを伴うウサギＥｐｏ
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体４：ヒトループＢ〜ＣおよびヘリックスＣを伴うウサギＥｐｏ
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体５：ヒトループＣ〜Ｄを伴うウサギＥｐｏ
Ｒｂ／Ｈｕ Ｅｐｏ変異体６：ヒトヘリックスＤを伴うウサギＥｐｏ
アッセイ手順
１．３８４ウェルＭＳＤ ｓｔａｎｄａｒｄプレート（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｌ２１ＸＡ−４）上で、ＰＢＳ中２５ｕｌのＥｐｏキメラ体（２ｕｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩にわたりコーティングした。
２．プレートを、９０ｕｌのＰＢＳ＋５％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、４時間にわたりブロッキングした。
３．ＰＢＳ＋２％のＢＳＡ／０．１％のＴｗｅｅｎ−２０／０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００による希釈液中５００ｎＭのＭｏｒｐｈｏｓｙｓ Ｅｐｏ Ｆａｂを、プレートへと添加し、１時間にわたりインキュベートした。
４．プレートを洗浄し、Ｅｐｏ Ｆａｂまたは基準タンパク質／抗体に適切な種に対する、Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ抗ヒトＩｇＧ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ３２ＡＪ−１）と共にインキュベートした（１時間）。
５．プレートを洗浄し、ＭＳＤ Ｒｅａｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ９２ＴＣ−１）を添加した。
６．プレートを読み取る。
一般的なプロトコール
標準的な捕捉用３８４ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）上で、ペプチド（ＰＢＳ中５ｕｇ／ｍｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＬＬＣ）またはＥｐｏキメラ体（ＰＢＳ中２ｕｇ／ｍｌ）をコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。標準的なストレプトアビジン捕捉用３８４ウェルＭＳＤプレートを、ビオチニル化切断Ｅｐｏ変異体（ＰＢＳ中に２ｕｇ／ｍｌ）で一晩にわたりコーティングした。プレートをＴＢＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；型番２８３６０）で１回洗浄した後で、プレートを、希釈液（ＰＢＳ、５％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中、室温で４時間にわたりブロッキングした。プレートを、ＴＢＳＴ中で３回にわたり洗浄した。５００ナノモルの抗エリスロポエチンｆａｂを、ペプチド／Ｅｐｏ変異体であらかじめコーティングしたＭＳＤプレートへと１時間にわたり添加した。プレートを、ＴＢＳＴ中で３回にわたり洗浄し、抗ヒトＩｇＧ−Ｓｕｌｆｏｔａｇ（１ｕｇ／ｍｌ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ３２ＡＪ−１）を添加し、６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴ中で３回にわたり洗浄し、１倍濃度のＲｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ；型番Ｒ９２ＴＣ−１）を添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００上で読み取り、データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアｖ４を使用して解析した。
結果：
結果は、抗体の以下のドメイン（表７）への結合は、最小限であることを指し示した。ヘリックスＣに結合する抗体は見られなかった。
Ｅｐｏと複合した抗体の結晶構造
グリコシル化組換えヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、ＬＥＫ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから受領した。
Ｅｐｏは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；型番Ｐ６０３９Ｓ）を使用して脱グリコシル化させた。３０ｍｇのｈＥｐｏを、１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘと組み合わせ、３７℃で１時間にわたりインキュベートしたが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定される通り、この時点における脱グリコシル化は不完全であった。次いで、さらなる０．５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄｅ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｍｉｘを、Ｅｐｏへと添加し、３７℃で１時間にわたりさらにインキュベートした。ゲル解析は、Ｅｐｏのほぼ完全な脱グリコシル化を示した。次いで、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化させた、１２０ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；型番２８−９８９３−３３）を使用して、このタンパク質をさらに精製した。ｈＥｐｏの最高レベルの脱グリコシル化を含有する溶出画分をプールした。５ｍｇの脱グリコシル化させたＥｐｏを、７ｍｇのＮＶＳ３と組み合わせた後、氷上で１時間にわたるインキュベーションにより、タンパク質複合体を形成した。次いで、タンパク質複合体ミックスを濃縮し、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化させた、１２０ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５へと適用した。ＳＤＳ−ゲルで査定した化学量論比のＥｐｏ：ＮＶＳ３を含有する画分をプールし、１９ｍｇ／ｍｌ（ＬＣＵＶにより推定される濃度）（ＰＲＯＮＯＶＡ；型番２７ＳＮ）まで濃縮した。結晶化スクリーンは、この濃縮されたＥｐｏ：ＮＶＳ３複合体を使用して準備した。結晶は、等容量のタンパク質およびレザバー溶液を含有する液滴を伴う、シッティングドロップ蒸気拡散法により成長させた。結晶は、以下のレザバー条件：０．１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１２％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭの酢酸亜鉛二水和物により、４℃で形成された。結晶は、以下の低温保護溶液：０．１ＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１５％のＰＥＧ３３５０、５０ｍＭの酢酸亜鉛二水和物、２２％のグリセロールを使用して凍結させた。
Ｅｐｏ：ＮＶＳ３複合体の結晶回折データは、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）のビームライン１７−ＩＤで収集した。ａｕｔｏＰＲＯＣ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ，ＬＴＤ）を使用して、空間群Ｃ２内でデータを加工し、細胞の寸法を、ａ＝１２５．５７Å、ｂ＝１５０．１５Å、ｃ＝１６３．８４Å、アルファ＝９０°、ベータ＝１１０．８１°、ガンマ＝９０°として、２．６Åでスケーリングした。Ｅｐｏ：ＮＶＳ３構造は、Ｐｈａｓｅｒを使用する分子置換（McCoyら、（2007） J. Appl. Cryst. 40:658〜674）により解いた。ＰＤＢデータベース内の３ＨＯＴ構造（Berman 2000）に由来するＦａｂを、可変ドメインと定常ドメインとにスプリットさせ、ヒトエリスロポエチン構造（Syedら、Nature. 1998年10月1日、395（6701）:511〜6；ＰＤＢコード：１ＥＥＲ）を検索モデルとして使用した。
最終モデルは、非対称ユニット１つ当たり３つのＥｐｏ：ＮＶＳ３複合体分子を含有し、ＣＯＯＴ（Emsley & Cowtan（2004） Acta Cryst. 60:2126〜2132）により構築し、ＰＨＥＮＩＸを使用して、それぞれ、２３．０％および２６．７％のＲ値およびＲｆｒｅｅ値まで精緻化したところ、結合長および結合角のそれぞれについてのｒｍｓｄは、０．０１０Åおよび１．３４°であった（Adamsら、Acta Cryst. D66、213〜221（2010））。
Ｅｐｏ：ＮＶＳ３の結晶構造を解き、２．６Åまで精緻化した。これにより、各々が１つのＥｐｏタンパク質に結合した１つのＦａｂからなる、３つのＥｐｏ：ＮＶＳ２タンパク質複合体からなる非対称ユニットが明らかになった。これらの複合体のうちの２つは、亜鉛により媒介される二量体を形成し、第３の複合体は、ｂ因子の増大および密度の低下を呈示する。ＦａｂからＥｐｏへの相互作用は、ＮＶＳ３の重鎖および軽鎖の両方に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）ループにより媒介された。１ＥＥＲと比較した場合の、Ｅｐｏのコンフォメーショナル変化は、Ｆａｂ結合性エピトープから遠位にあるループに限定され、配列決定された１４４のアミノ酸の全てについて、ＲＭＳＤは０．５Åであった。Ｆａｂ ＮＶＳ３の重鎖および軽鎖は、ドメインに典型的な免疫グロブリン様フォールドを示す。
Ｅｐｏ：ＮＶＳ３の結晶構造を使用して、ＮＶＳ３の断片抗原結合のＥｐｏエピトープを同定した。Ｅｐｏ上の相互作用表面は、主に残基Ｓｅｒ９、Ｇｌｕ１３、残基Ｔｈｒ４４〜Ａｒｇ５３、および残基Ａｓｎ１４７〜Ａｒｇ１６２を含む残基により形成された。これらは、α−ヘリックスＡ、ループβＡ〜αＢ、およびα−ヘリックスＤとして表示されるＥｐｏの二次構造エレメントに対応する。これらの残基は、ＮＶＳ３により認識される三次元表面を形成した。相互作用は、骨格相互作用、溶媒により媒介される相互作用、および直接的な側鎖相互作用を含んだ。
ＮＶＳ３と接触する原子を含有するＥｐｏ残基を、表９に列挙する。接触は、水を介する潜在的な相互作用の原因となるように、ＮＶＳ３から５Å以内にあると規定される。
ＮＶＳ２と接触する原子を含有するＥｐｏ残基を列挙する。接触は、水を介する潜在的な相互作用の原因となるように、タンパク質パートナーから５Å以内にあると規定される。
実施例５：ｉｎ ｖｉｖｏモデル
実施例５ａ：眼浮腫のマウスモデル
Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯ−ｅＧＦＰ（ＤＲ００５）およびｓｓＡＡＶ２−ＥＧＦＰ（ＴＭ００３）（対照）を網膜下注射した。注射の３週間（２１日間）後にマウスを屠殺した。網膜をフラットマウント化し、血管径を測定した。
方法：
ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯ−ｅＧＦＰおよびｓｓＡＡＶ２−ｅＧＦＰの網膜下注射
８週齢のＣ５７／Ｂｌ６マウスを、２つの群（１群当たり１０匹ずつのマウス；２０の眼）に分け、２×１０９ＤＲＰ／μｌで、１μｌのｓｓＡＡＶ２を網膜下注射した。第１群（対照群）には、網膜下ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯ（ＴＭ００３）を施し、第２群（被験群）には、ｓｓＡＡＶ２−ｅＧＦＰ（ＤＲ００５）を施した。網膜血管変化に対するマウスＥｐｏの効果は、注射の２１日後に、網膜フラットマウント内で検討した。
被験ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）は、ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯ−ｅＧＦＰ［Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌによる（ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｍＥＰＯ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ）：ロット番号ＡＶ３７８２］、およびｓｓＡＡＶ２−ＧＦＰ［Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌによる（ＡＡＶ２−ｅＧＦＰ）：ロット番号ＡＶ３７２５］であった。
手順：
ＡＡＶベクターは、被験マウスの両方の眼に対する網膜下注射を介して送達した。記載される全ての手順は、滅菌試薬、滅菌シリンジ、および適切なＰＰＥを使用して、無菌条件下で実施した。
１．マウスを固定し、シクロペントレート（１％）の滴下によりそれらの瞳孔を開いた後で、２．５％のフェニレフリンを滴下した。
２．次に、動物に、腹腔内Ａｖｅｒｔｉｎ（２５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔をかけた。０．５％のプロパラカインの滴下により、角膜に局所麻酔をかけた。
３．動物を手術用顕微鏡下に置いた後で、マイクロスカルペルを使用して、角膜縁の後方に０．５ｍｍの鼻腔内切除を施した。
４．１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジへと取り付けたブラントニードルを、強膜切除を介して、耳側網膜へと接線方向に挿入した。注射針は、抵抗感があるまで推し進めた。
５．１μｌのｓｓＡＡＶ２ベクター（両方とも送達を視覚化するための、１：５０に希釈されたフルオレセインを含有する、ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯ−ｅＧＦＰまたはｓｓＡＡＶ２−ＧＦＰのいずれか）を、網膜下腔へとゆっくり注射した。
６．手術用顕微鏡下で眼を観察した。網膜下注射の成功は、フルオレセインを含有する網膜剥離を視覚化することにより確認した。
７．注射は、網膜損傷（出血サイズにより視覚化される）および水晶体への損傷の程度に応じて評定した。
８．動物を逆側に向け、手順を反復した。
９．抗生剤軟膏を、注射後における両方の眼へと適用した。
網膜フラットマウント上の網膜切除、造影、および定量化：
１．安楽死（ＣＯ２）の１〜５分前に、０．１ｍｌのＣｏｎｃａｖａｌｉｎ−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）を注射した（尾静脈における静脈内注射）。
２．眼を摘出し、パラホルムアルデヒド（４％のＰＢＳ中の）中で、２時間にわたり固定した。その後、切除するまで、眼を、ＰＢＳ緩衝液中、４℃で、１〜３日間にわたり維持した。
３．角膜および水晶体を除去し、網膜を、後眼部の杯状構造（網膜色素上皮／脈絡膜）から切除した。
４．網膜へと４つの放射状切開を施し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウンティング培地により、光受容体層を下向きにしてフラットマウントした。
５．マウントしたら、フラットマウントを中心網膜中心とし（視神経頭を基準として使用して）、Ｚｅｉｓｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）を使用して、Ｃｏｎ−Ａで標識された網膜血管を、２０倍で捕捉した。
６．ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを使用して、視神経頭から２００μｍ離れた中心網膜血管の直径を測定した。
７．得られたデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより解析した。
結果および結論：
血管直径の定量化は、ｓｓＡＡＶ２−ＥＰＯが、ｓｓＡＡＶ２−ＧＦＰによる眼およびナイーブの眼（６つの眼）と比較して有意な（＊ｐ＜０．００１）、中心網膜における血管拡張を誘導することを明らかにした（図１）。ｓｓＡＡＶ２−ＧＦＰ群をナイーブ群と対比して比較したところ、有意差は見出されなかった。試料は、ダネットの事後検定を伴う一元ＡＮＯＶＡを使用して解析した（Ｃ）各群の代表的なフラットマウント。ＡＡＶ２−Ｅｐｏ−ｅＧＦＰによる長時間にわたるＥｐｏの送達は、ヒトにおける糖尿病性黄斑浮腫の鍵となる顕徴である、静脈径の統計学的に有意な増大を結果としてもたらした（図１）。したがって、一態様では、本発明は、本明細書で記載される抗ＥＰＯ抗体を、対象へと、治療有効量で投与することにより、眼内の静脈径を減少させる方法に関する。
実施例５ｂ：抗Ｅｐｏ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける有効性
本明細書で記載される抗Ｅｐｏ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性および治療有効性は、上記で記載したマウス眼浮腫モデルにおいて評価することができる。
ｉｎ ｖｉｖｏのマウスモデルにおけるチャレンジ
８週齢のＣ５７Ｂ６マウスに、以下のうちの１つを網膜下注射した。
群：
群１：２×１０９ＤＲＰの力価のＡＡＶ２−ｅＧＦＰ、眼１つ当たり１ｕｌ、マウス１０匹の眼のｎ＝２０
群２：２×１０９ＤＲＰの力価のＡＡＶ２−Ｅｐｏ−ｅＧＦＰ、眼１つ当たり１ｕｌ、マウス１０匹の眼のｎ＝２０
群３：２×１０９の力価のＡＡＶ２−Ｅｐｏ−ｅＧＦＰ、眼１つ当たり１ｕｌ、＋抗Ｅｐｏ Ｆａｂ、眼１つ当たり１００ｕｇ、毎週１回、マウス１０匹の眼のｎ＝２０
注射の２週間後に、血管直径を測定することにより、適切に投与された抗Ｅｐｏ抗体の効果を、マウスモデルにおいて検討する。
ＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ２−ｅＧＦＰ）およびＡＡＶ２−Ｅｐｏ−ｅＧＦＰ（ＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｍＥｐｏ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ）は、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌによる。
抗Ｅｐｏ抗体の眼内注射は、網膜血管拡張を阻害して、抗Ｅｐｏ抗体の、網膜内の血流の減少および低酸素状態に対する効果を改善するであろう。したがって、抗Ｅｐｏ抗体は、湿潤型ＡＭＤおよび糖尿病性網膜症などの網膜血管疾患を伴う患者においてもまた見られる網膜病態を軽減することが予測される。
実施例６：ｉｎ ｖｉｖｏにおける遊離ＥＰＯの中和
実施例６ａ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗Ｅｐｏ Ｆａｂを使用する遊離ＥＰＯの中和
抗ＥＰＯ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性および治療有効性を、ウサギの眼において以下の通りに評価した。ウサギに、抗ＥＰＯ ＦａｂのＮＶＳ２（眼１つ当たり１ｍｇ）を硝子体内投与し、４日間後でＥＰＯの硝子体内投与（眼１つ当たり３ｕｇ）でチャレンジした。動物を屠殺し、硝子体液を含む眼組織を抽出した。硝子体液中の遊離ＥＰＯおよび総ＥＰＯ量は、下記で記載する通りに決定した。
総ＥＰＯレベル／遊離ＥＰＯレベル：
アッセイは、コーティング緩衝液（ＰＢＳ）およびインキュベーション緩衝液（２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ａ４５０３）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０および０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを伴うＰＢＳ）を使用する、標準的なＭＳＤ結合プレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３８４ウェル：ＭＳＤ型番Ｌ２１ＸＡ）を使用して実施した。
捕捉抗体をＰＢＳ（２５μｌ）中１μｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ）中で３回にわたり洗浄し、２５μｌのインキュベーション緩衝液により、室温で２時間にわたりブロッキングした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。インキュベーション緩衝液中の硝子体液希釈液（vitreous dilutions）をプレートへと添加し（２５μｌ）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。ヒト組換えダルベポエチンを、基準物質として使用した（Ａ０００１２３；２μｇ／ｍｌで開始する）。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。２５μｌの一次抗体を添加し（インキュベーション緩衝液中に１μｇ／ｍｌ）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。２５μｌの抗種二次Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ抗体を添加し（インキュベーション緩衝液中に１：１０００）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄し、１倍濃度のＭＳＤ Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤；ＭＳＤ型番Ｒ９２ＴＣ−１を伴う）２５μｌを添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００上で読み取った。
結果および結論：
予測される通り、抗ＥＰＯまたは媒体を注射された動物の硝子体液中で測定された総ＥＰＯレベルは類似した（図２）。これに対し、抗ＥＰＯ Ｆａｂを注射されたウサギの硝子体液中では、遊離ＥＰＯが測定されなかったが、媒体を注射されたウサギの硝子体液中では、平均で約１００ｎｇ／ｍｌの遊離ＥＰＯが測定された。予測される通り、硝子体内投与された抗ＥＰＯ Ｆａｂは、遊離ＥＰＯレベルを完全に中和した。
実施例６ｂ：ｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗Ｅｐｏ Ｆａｂを使用する遊離ＥＰＯの中和
抗ＥＰＯ抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける活性および治療有効性を、ウサギの眼において以下の通りに評価した。ウサギに、抗ＥＰＯ ＦａｂのＮＶＳ２（眼１つ当たり１ｍｇ）とＥＰＯ（眼１つ当たり３ｕｇ）とをあらかじめ混合した溶液を、硝子体内投与した。動物を屠殺し、硝子体液を含む眼組織を抽出した。硝子体液中の遊離ＥＰＯおよび総ＥＰＯ量は、下記で記載する通りに決定した。注：一部の眼には、抗ＥＰＯ ＦａｂとＥＰＯとＶＥＧＦとをあらかじめ混合した溶液を施した。
総ＥＰＯレベル／遊離ＥＰＯレベル：
アッセイは、コーティング緩衝液（ＰＢＳ）およびインキュベーション緩衝液（２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ型番Ａ４５０３）および０．１％のＴｗｅｅｎ２０および０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを伴うＰＢＳ）を使用する、標準的なＭＳＤ結合プレート（Ｍｅｓｏ−Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、３８４ウェル：ＭＳＤ型番Ｌ２１ＸＡ）を使用して実施した。
捕捉抗体をＰＢＳ（２５μｌ）中１μｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ）中で３回にわたり洗浄し、２５μｌのインキュベーション緩衝液により、室温で２時間にわたりブロッキングした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。インキュベーション緩衝液中の硝子体液希釈液をプレートへと添加し（２５μｌ）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。ヒト組換えダルベポエチンを、基準物質として使用した（Ａ０００１２３；２μｇ／ｍｌで開始する）。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。２５μｌの一次抗体を添加し（インキュベーション緩衝液中に１μｇ／ｍｌ）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄した。２５μｌの抗種二次Ｓｕｌｆｏ−ＴＡＧ抗体を添加し（インキュベーション緩衝液中に１：１０００）、室温で６０分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で３回にわたり洗浄し、１倍濃度のＭＳＤ Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（界面活性剤；ＭＳＤ型番Ｒ９２ＴＣ−１を伴う）２５μｌを添加した。プレートを、ＭＳＤ Ｓｐｅｃｔｏｒ Ｉｍａｇｅｒ ６０００上で読み取った。
結果および結論：
予測される通り、抗ＥＰＯまたは媒体を注射された動物の硝子体液中で測定された総Ｅ
ＰＯレベルは類似した（図３）。これに対し、抗ＥＰＯ Ｆａｂを注射されたウサギの硝
子体液中では、遊離ＥＰＯが測定されなかったが、媒体を注射されたウサギの硝子体液中
では、平均で約２００ｎｇ／ｍｌの遊離ＥＰＯが測定された（図３）。ＶＥＧＦの存在は
、測定される遊離ＥＰＯレベルまたは総ＥＰＯレベルに対して影響を及ぼさないと考えら
れた。予測される通り、硝子体内投与された抗ＥＰＯ Ｆａｂは、遊離ＥＰＯレベルを完
全に中和した。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
Ｅｐｏに、５０ｐＭ以下のＫ Ｄ で結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［２］
ＥｐｏのヘリックスＤドメインに結合する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合
性断片。
［３］
ＥｐｏのループＡ〜Ｂドメインにさらに結合する、請求項１または請求項２に記載の単
離抗体または抗原結合性断片。
［４］
ＥｐｏのヘリックスＡドメインにさらに結合する、請求項２または請求項３のいずれか
に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［６］
前記抗体が、ヒトＥｐｏに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗
原結合性断片。
［７］
ＥｐｏヘリックスＤおよびループＡ〜Ｂ内のアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピ
トープに結合する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［８］
ＥｐｏヘリックスＡ内のアミノ酸をさらに含むコンフォメーショナルエピトープに結合
する、請求項７に記載の抗体または抗原結合性断片。
［９］
配列番号８１の４４〜５０、５２、５３、１４７、１５０、１５１、１５４、１５５、
１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合
する、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１０］
配列番号８１の９、１３、４４〜５３、１４７、１５０、１５１、１５４、１５５、１
５８、１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープ
に結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１１］
配列番号８１の２３、４３〜５０、５２、５３、１３１、１４３、１４７、１５０、１
５１、１５４、１５５、１５９、および１６２位におけるアミノ酸を含むコンフォメーシ
ョナルエピトープに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性
断片。
［１２］
カニクイザル、マウス、またはラットＥｐｏにも結合する、前記請求項のいずれかに記
載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１３］
ＥＰＯ依存性の細胞増殖を、３５０ｐＭ以下のＥＣ ５０ でさらに阻害する、前記請求項
のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１４］
ＥＰＯ受容体を発現しているＢ細胞におけるＥＰＯ依存性の細胞増殖を阻害する、前記
請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１５］
表１に記載されている抗体と同じエピトープに結合するか、または表１に記載されてい
る抗体と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
［１６］
ＥＰＯに結合し、
ａ）配列番号１、２、および３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ
２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ示された軽鎖可変
領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
ｂ）配列番号２１、２２、および２３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、Ｈ
ＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、２５、および２６にそれぞれ示さ
れた軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
ｃ）配列番号４１、４２、および４３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、Ｈ
ＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４４、４５、および４６にそれぞれ示さ
れた軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、または
ｄ）配列番号６１、６２、および６３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、Ｈ
ＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号６４、６５、および６６にそれぞれ示さ
れた軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３
を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１７］
配列番号１３および１４、配列番号３３および３４、配列番号５３および５４、または
配列番号７３および７４とそれぞれ少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する重鎖お
よび軽鎖可変領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片
。
［１８］
アミノ酸配列が、配列番号１５および１６、３５および３６、５５および５６、または
７５および７６と少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖および軽鎖を含むＥｐｏに
結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
［１９］
前記抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ
’、Ｆ（ａｂ’） ２ 、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、前記請求項のいずれかに記載の抗体
または抗原結合性断片。
［２０］
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプである、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗
原結合性断片。
［２１］
前記請求項のいずれかに記載の抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含む単
離核酸分子。
［２２］
前記核酸が、重鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号１７、
３７、５７、および７７から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項２１に記載の核酸分子。
［２３］
前記核酸が、軽鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号１８、
３８、５８、および７８から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、
請求項２１に記載の核酸分子。
［２４］
請求項２１から２３のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
［２５］
請求項２１から２３のいずれかに記載の核酸または請求項２４に記載のベクターを含む
単離宿主細胞。
［２６］
請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片と、薬学的に許容され
る希釈剤または担体とを含む組成物。
［２７］
対象における網膜血管疾患を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項
１から２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステッ
プを含む方法。
［２８］
対象における網膜血管疾患が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網
膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視
性脈絡膜血管新生、および未熟児網膜症から選択される疾患または状態と関連する、請求
項２７に記載の方法。
［２９］
対象における黄斑浮腫を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項１か
ら２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを
含む方法。
［３０］
対象における糖尿病性網膜症を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求
項１から２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステ
ップを含む方法。
［３１］
対象における糖尿病性黄斑浮腫を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請
求項１から２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するス
テップを含む方法。
［３２］
増殖性糖尿病性網膜症を処置する方法であって、ＥＰＯを、請求項１から２０のいずれ
かに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
［３３］
ＥＰＯ依存性の細胞増殖を阻害する方法であって、ＥＰＯを、請求項１から２０のいず
れかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
［３４］
Ｅｐｏ受容体を発現している細胞におけるＥＰＯ依存性の細胞増殖を阻害する方法であ
って、前記細胞を、請求項１から２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含
む組成物と接触させるステップを含む方法。
［３５］
細胞が、Ｂ細胞である、請求項３４に記載の方法。
［３６］
糖尿病性黄斑浮腫を阻害する方法であって、対象の眼へと、請求項１から２０のいずれ
かに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成
物の投与が、網膜静脈拡張を低下させ、血管漏出を低下させ、かつ／または眼内の血流を
増大させる方法。
［３７］
ＥＰＯと細胞上のＥＰＯ受容体の結合を阻害する方法であって、ＥＰＯを、請求項１か
ら２０のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップ
を含む方法。
［３８］
細胞が、対象中にある、請求項３７に記載の方法。

Claims (21)

  1. ＥＰＯに結合し、
    ａ）配列番号１、２、および３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号２１、２２、および２３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、２５、および２６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
    ｃ）配列番号４１、４２、および４３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４４、４５、および４６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、または
    ｄ）配列番号６１、６２、および６３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号６４、６５、および６６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３
    を含む、単離抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 配列番号１３および１４、配列番号３３および３４、配列番号５３および５４、または配列番号７３および７４とそれぞれ少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  3. 配列番号１５および１６、配列番号３５および３６、配列番号５５および５６、または配列番号７５および７６とそれぞれ少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項１または２に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  4. 前記単離抗体または抗原結合性断片が、ヒト抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖである、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  5. 前記単離抗体または抗原結合性断片が、ＩｇＧアイソタイプである、請求項１〜４のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
  6. ＥＰＯに結合し、
    ａ）配列番号１、２、および３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４、５、および６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
    ｂ）配列番号２１、２２、および２３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、２５、および２６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、
    ｃ）配列番号４１、４２、および４３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号４４、４５、および４６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３、または
    ｄ）配列番号６１、６２、および６３にそれぞれ示された重鎖可変領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号６４、６５、および６６にそれぞれ示された軽鎖可変領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３
    を含む単離抗体またはその抗原結合性断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
  7. 前記核酸分子が、重鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号１７、３７、５７、および７７から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載の核酸分子。
  8. 前記核酸分子が、軽鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号１８、３８、５８、および７８から選択される配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項６に記載の核酸分子。
  9. 請求項６から８のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項６から８のいずれかに記載の核酸または請求項９に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
  11. 請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む組成物。
  12. 網膜血管疾患を処置するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  13. 網膜血管疾患が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および未熟児網膜症から選択される疾患または状態と関連する、請求項１２に記載の組成物。
  14. 黄斑浮腫を処置するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  15. 糖尿病性網膜症を処置するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  16. 糖尿病性黄斑浮腫を処置するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  17. 増殖性糖尿病性網膜症を処置するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  18. ＥＰＯ依存性の細胞増殖を阻害するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  19. ＥＰＯ受容体を発現している細胞におけるＥＰＯ依存性の細胞増殖を阻害するための、請求項１から５のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
  20. 細胞が、Ｂ細胞である、請求項１９に記載の組成物。
  21. 網膜静脈拡張を低下させ、血管漏出を低下させ、かつ／または眼内の血流を増大させる、請求項１６に記載の組成物。
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