JP7250852B2 - Epoを標的とする抗体のための組成物および方法 - Google Patents
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Description
糖尿病性網膜症(DR)は、糖尿病を伴う患者において最も一般的な合併症である。糖
尿病性黄斑浮腫(DME)は、DRの任意の段階で生じることが可能であり、DRを伴う
患者における視力喪失の主要な原因である。追跡の10年後におけるDMEの発症率は、
1型糖尿病において20.1%であり、2型のインスリン依存性糖尿病において25.4
%であり、および2型の非インスリン依存性糖尿病において13.9%であることが報告
されている(Kleinら(1995)Ophthalmology 102、7~16)。DRにおける先駆的研究で
あるETDRS試験((1985)、Photocoagulation for Diabetic Macular Edema - Earl
y Treatment Diabetic- Retinopathy Study Report. 1. Archives of Ophthalmology 103
、1796~1806)では、レーザー光凝固療法は、3歳時において、DMEを伴う眼における
中程度の視力喪失の危険性を約50%低減するが、視力が上昇するのは少数の眼に限られ
、一部の眼は、集中的な処置の後でもなお、視力喪失したままであることが裏付けられた
。近年、薬物療法および眼内薬物送達の進歩は、DMEの処置に明るい見通しを示してい
る。DMEにおける2つの枢要なフェーズIII試験のうちの1つであるRESTORE
研究(Mitchellら(2011)Ophthalmology 118、615~625)により、Lucentis(
登録商標)は、レーザー単独療法より良好であることが裏付けられた。臨床主要評価項目
である最高矯正視力(BCVA)の平均変化は、Lucentis(登録商標)群におい
て著明に改善された(レーザー群の+0.8文字と対比したLucentis(登録商標
)群の+6.1文字;p<0.0001)。VEGF Trap-Eye(Regene
ron Inc.、NY、USA)およびOzurdex(登録商標)(デキサメタゾン
の硝子体内インプラント;Allergan Inc.、CA、USA)(Doら(2011)
Ophthalmology 118、1819~1826; Hallerら(2010) Archives of Ophthalmology 128、2
89~296)でも、同様の有益な効果が裏付けられている。しかし、Ozurdexで処置
された眼のうちの16%が、緑内障の危険性がある、眼内圧の増大を発症した。
に満たされていない。Lucentis(登録商標)枢要試験における眼のうちの約25
%では、12カ月間にわたる処置の後でも、いかなる視力の上昇も見られず、眼のうちの
約50%は、20/40以下の視力のままであった。ゲノム規模の関連研究は、エリスロ
ポエチン(Epo:erythropoietin)プロモーター多型(T)についてホモ付着性の糖尿
病患者は、増殖性DRを発症する危険性が2.17倍であることを指し示した(Tongら(
2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105、6998~7003)。興味深いことに、Epo
についてTプロモーター対立遺伝子を伴う者は、硝子体中のEpo濃度が、G対立遺伝子
を伴う者と比較して約7.5倍である(Tongら(2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A 105、6998~7003)。
は補充する処置を開発する必要が依然として存在する。
体または抗原結合性断片に関する。
ポエチンに、100pM以下のKDで結合する。例えば、本明細書で記載される単離抗体
または抗原結合性断片は、ヒトEpoおよび/またはダルベポエチンに、50pM以下、
40pM以下、35pM以下、30pM以下、25pM以下、20pM以下、15pM以
下、14pM以下、13pM以下、12pM以下、11pM以下、10pM以下のKDで
結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はま
た、ヒトEpoにも、Biacoreにより測定される35pM以下のKDで、または溶
液平衡滴定(SET)により測定される6pM以下のKDで結合しうる。より具体的には
、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ダルベポエチンにも、B
iacoreにより測定される24pM以下のKDで、またはSETにより測定される4
pM以下のKDで結合しうる。
体またはその抗原結合性断片に関する。本発明はまた、ヒトEpoヘリックスDおよびル
ープA~Bから選択されるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する単
離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はさらに、ヒトEpoヘリックスD
、ループA~B、およびヘリックスAから選択されるアミノ酸を含むコンフォメーショナ
ルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明の特定の
態様では、単離抗体またはそれらの抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(
ヒトEpoのアミノ酸138~162;配列番号88)に結合しうる。他の態様では、本
明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片は、ループA~Bドメイン(ヒトEp
oのアミノ酸27~55;配列番号89)に結合しうる。他の態様では、本明細書で記載
される単離抗体または抗原結合性断片は、ループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ酸
27~55;配列番号89)、およびヘリックスA(ヒトEpoのアミノ酸4~26;配
列番号86)に結合しうる。本発明のさらなる態様では、本明細書で記載される単離抗体
または抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(ヒトEpoのアミノ酸138
~162;配列番号88)、およびループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ酸27~
55;配列番号89)に結合しうる。本発明のなおさらなる態様では、本明細書で記載さ
れる単離抗体または抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(ヒトEpoのア
ミノ酸138~162;配列番号88)、およびヘリックスA(ヒトEpoのアミノ酸4
~26;配列番号86)に結合しうる。本発明のなおさらなる態様では、本明細書で記載
される単離抗体または抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(ヒトEpoの
アミノ酸138~162;配列番号88)、ループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ
酸27~55;配列番号89)、およびヘリックスA(ヒトEpoのアミノ酸4~26;
配列番号86)に結合しうる。
Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg5
3、Asn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu
159、およびArg162を含むEpo上のコンフォメーショナルエピトープに結合す
る単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はさらに、ヒトEpo(配列番
号81)のアミノ酸残基Ser9、Gln13、Thr44、Lys45、Val46、
Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn1
47、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Gly158、Gl
u159、およびArg162を含むEpo上のコンフォメーショナルエピトープに結合
する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はなおさらに、ヒトEpo(
配列番号81)のアミノ酸残基Glu23、Asp43、Thr44、Lys45、Va
l46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、
Arg131、Arg143、Asn147、Arg150、Gly151、Lys15
4、Leu155、Glu159、およびArg162を含むEpo上のコンフォメーシ
ョナルエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
合する、単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。本発明はまた、表1に記載され
ている抗体と同じエピトープに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にもさらに関
する。
るか、8.4を超えるか、8.5を超えるか、または9.0を超える、単離抗体またはそ
の抗原結合性断片にも関する。
ウスEpo、および/またはラットEpoにも、100pM以下、80pM以下、70p
M以下、60pM以下、50pM以下、40pM以下、35pM以下、30pM以下、2
5pM以下、20pM以下、15pM以下、10pM以下、5pM以下、4pM以下、3
pM以下、2pM以下、1pM以下のKDで結合しうる。より具体的には、本明細書で記
載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、カニクイザルEpo、マウスEpo、お
よび/またはラットEpoにも、Biacoreにより測定される80pM以下のKDで
、またはSETにより測定される40pM以下のKDで結合しうる。より具体的には、本
明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、カニクイザルEpoにも、B
iacoreにより測定される80pM以下のKDで、またはSETにより測定される8
pM以下のKDで結合しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体または抗
原結合性断片はまた、マウスEpoにも、Biacoreにより測定される45pM以下
のKDで、またはSETにより測定される37pM以下のKDで結合しうる。より具体的
には、本明細書で記載される単離抗体または抗原結合性断片はまた、ラットEpoにも、
Biacoreにより測定される57pM以下のKDで、またはSETにより測定される
13pM以下のKDで結合しうる。
により決定することができる。当技術分野では、SET法が知られており、以下でさらに
詳細に記載される。代替的に、本明細書で記載される単離抗体または断片の結合アフィニ
ティーは、Biacoreアッセイにより決定することもできる。当技術分野では、Bi
acore反応速度アッセイ法が知られており、以下でさらに詳細に記載される。
増殖を、350pM以下、300pM以下、250pM以下、200pM以下、190p
M以下、180pM以下、175pM以下、170pM以下、160pM以下、150p
M以下、125pM以下、115pM以下、110pM以下、100pM以下、90pM
以下、または80pM以下のIC50で阻害することができる。より具体的には、本明細
書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、in vitro Ba/F3-
EpoR細胞増殖アッセイにより測定されるEpo依存性の細胞増殖を、338pM以下
、183pM以下、175pM以下、174pM以下、145pM以下、112pM以下
、89pM以下、または74pM以下のIC50で阻害しうる。
o依存性の細胞増殖を阻害することができる。より具体的には、本明細書で記載される単
離抗体および抗原結合性断片を使用して、マウスB細胞におけるEpo依存性の細胞増殖
を阻害することができる。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片は、in vit
ro Ba/F3-EpoR細胞増殖アッセイにより測定されるEpo依存性の細胞増殖
を、350pM以下、300pM以下、250pM以下、200pM以下、175pM以
下、150pM以下、125pM以下、115pM以下、110pM以下、100pM以
下、90pM以下、または80pM以下のIC50で阻害しうる。より具体的には、本明
細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、in vitro Ba/F3
-EpoR細胞増殖アッセイにより測定されるEpo依存性の細胞増殖を、338pM以
下、174pM以下、112pM以下、または74pM以下のIC50で阻害しうる。
依存性の細胞増殖を阻害することができる。例えば、単離抗体またはその抗原結合性断片
は、in vitro F36E細胞増殖アッセイにより測定されるEpo依存性の細胞
増殖を、200pM以下、190pM以下、180pM以下、170pM以下、160p
M以下、150pM以下、125pM以下、100pM以下、または90pM以下のIC
50で阻害しうる。より具体的には、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合
性断片は、in vitro F36E細胞増殖アッセイにより測定されるEpo依存性
の細胞増殖を、183pM以下、175pM以下、145pM以下、または89pM以下
のIC50で阻害しうる。
ることも可能であり、かつ/またはEpoと細胞表面の結合を防止することも可能である
。
的に結合する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。さらなる態様では、単離抗体ま
たは抗原結合性断片は、表1に記載されている抗体または抗原結合性断片との結合につい
て競合する。
、ヒト抗体またはヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、Fv断片、F(ab
’)2断片、またはScFv断片、および/またはIgGアイソタイプでありうる。
トVH生殖細胞系列配列またはヒトVL生殖細胞系列配列のそれぞれに由来する抗体フレ
ームワークへと置換されたフレームワークも含みうる。
単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体またはその抗原結
合性断片は、FabのNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4の重鎖および軽鎖
配列を有しうる。
配列を有する単離抗体またはその抗原結合性断片を含む。より具体的には、単離抗体また
はその抗原結合性断片は、FabのNVS1(それぞれ、配列番号13および14)、N
VS2(それぞれ、配列番号33および34)、NVS3(それぞれ、配列番号53およ
び54)、またはNVS4(それぞれ、配列番号73および74)の重鎖および軽鎖可変
ドメイン配列を有しうる。
DR1、配列番号2、22、42、および62からなる群から選択される重鎖CDR2、
ならびに配列番号3、23、43、および63からなる群から選択される重鎖CDR3を
含み、ヒトEpoに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。別の態様で
は、このような単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号4、24、44、および
64からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号5、25、45、および65から
なる群から選択される軽鎖CDR2、ならびに配列番号6、26、46、および66から
なる群から選択される軽鎖CDR3をさらに含む。
DR1、配列番号5、25、45、および65からなる群から選択される軽鎖CDR2、
ならびに配列番号6、26、46、および66からなる群から選択される軽鎖CDR3を
含み、ヒトEpoに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
R1、HCDR2、HCDR3、およびLCDR1、LCDR2、LCDR3を有し、H
CDR1、HCDR2、HCDR3が、配列番号1、2、3を含み、LCDR1、LCD
R2、LCDR3が、配列番号4、5、6を含むか、またはHCDR1、HCDR2、H
CDR3が、配列番号21、22、23を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が
、配列番号24、25、26を含むか、またはHCDR1、HCDR2、HCDR3が、
配列番号41、42、43を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号4
4、45、46を含むか、またはHCDR1、HCDR2、HCDR3が、配列番号61
、62、63を含み、LCDR1、LCDR2、LCDR3が、配列番号64、65、6
6を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関する。
73の可変重鎖のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号14、
34、54、または74の可変軽鎖のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有す
る抗体または抗原結合性断片にも関する。本発明の別の態様では、抗体または抗原結合性
断片は、Kabatにより規定される、配列番号13、33、53、または73の重鎖可
変ドメイン配列のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号14、
34、54、または74の軽鎖可変ドメイン配列のLCDR1、LCDR2、およびLC
DR3を有しうる。
3、および73からなる群から選択される重鎖可変ドメイン(VH)配列を含む。単離抗
体または抗原結合性断片は、軽鎖可変ドメイン(VL)配列をさらに含むことが可能であ
り、この場合、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとは、組み合わさって、Epoに対
する抗原結合性部位を形成する。特に、軽鎖可変ドメイン配列は、配列番号14、34、
54、および74から選択することができ、この場合、前記単離抗体またはその抗原結合
性断片は、Epoに結合する。
可変ドメイン配列を含み、ヒトEpoに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片にも
関する。単離抗体または抗原結合性断片は、重鎖可変ドメイン配列をさらに含むことが可
能であり、この場合、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとは、組み合わさって、Ep
oに対する抗原結合性部位を形成する。
4;33および34;53および54;または73および74の配列をそれぞれ含む、重
鎖および軽鎖可変ドメインを有しうる。
列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99
%の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも
関し、この場合、前記抗体は、Epoに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原
結合性断片はまた、配列番号14、34、54、および74からなる群から選択される配
列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99
%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインも含む。本発明のさらなる態様では、単離抗体
または抗原結合性断片は、Kabatにより規定され、表1に記載されている、HCDR
1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を有する。ま
た、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3
が、Chothiaにより規定され、表1に記載されうることも企図される。
と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%
の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する単離抗体またはその抗原結合性断片にも
関し、この場合、前記抗体は、Epoに結合する。
番号15、35、55、または75の配列を含む重鎖を有しうる。単離抗体はまた、重鎖
と組み合わさって、ヒトEpoに対する抗原結合性部位を形成しうる軽鎖も含みうる。特
に、軽鎖は、配列番号16、36、56、または76を含む配列を有しうる。特に、Ep
oに結合する単離抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号15および16;35およ
び36;55および56;または75および76のそれぞれの配列を含む重鎖および軽鎖
を有しうる。
る配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または
99%の配列同一性を有する重鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、こ
の場合、前記抗体は、Epoに結合する。一態様では、単離抗体またはその抗原結合性断
片はまた、配列番号16、36、56、および76からなる群から選択される配列と少な
くとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列
同一性を有する軽鎖も含む。
る配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または
99%の配列同一性を有する軽鎖を含む単離抗体またはその抗原結合性断片にも関し、こ
の場合、前記抗体は、Epoに結合する。
にも関する。本発明は同様に、薬学的に許容される担体と組み合わせた抗体組成物にも関
する。とりわけ、本発明は、例えば、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNV
S4など、表1の抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物をさらに含む。本発明
はまた、表1の単離抗体またはそれらの抗原結合性断片のうちの2つ以上の組合せを含む
医薬組成物にも関する。
変重鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号17、37、57
、および77からなる群から選択される配列と少なくとも80%、85%、90%、95
%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する。本発明のさらなる態
様では、配列は、配列番号17、37、57、または77である。
変軽鎖をコードする単離核酸配列にも関する。特に、核酸は、配列番号18、38、58
、および78からなる群から選択される配列と少なくとも80%、85%、90%、95
%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する。本発明のさらなる態
様では、配列は、配列番号18、38、58、または78である。
と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%
の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする配列を含む単離
核酸にも関する。
にも関する。
を含む単離宿主細胞にも関する。本発明はまた、上記で記載した抗体の重鎖をコードする
組換えDNA配列と、上記で記載した抗体の軽鎖をコードする第2の組換えDNA配列と
を含む単離宿主細胞にも関し、この場合、前記DNA配列は、プロモーターに作動可能に
連結され、宿主細胞内で発現することが可能である。抗体は、ヒトモノクローナル抗体で
ありうることが企図される。また、宿主細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、CHO細
胞であることも企図される。
、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるス
テップ(例えば、対象におけるEpoを接触させるステップ)を含む方法にも関し、特に
、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。一態様
では、方法は、細胞(例えば、Epoを含む細胞)を、本明細書で記載される単離抗体ま
たはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、対象
におけるEpo依存性の細胞増殖を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される
単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞であるこ
とが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の
眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触
させて、Epoが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方
法にも関する。一態様では、方法は、Epoを含む細胞を、本明細書で記載される単離抗
体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、
対象におけるEpo依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに使用するための、本明細書
で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト
細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細
胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図
される。
Epoを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組
成物と接触させて、Epoが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステッ
プを含む方法にも関する。細胞は、B細胞であることが企図される。細胞は、ヒト細胞で
あることが企図される。
量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させ
るステップ(例えば、対象におけるEpoを接触させるステップ)を含む方法にも関し、
特に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。本
発明はまた、Epoと、対象の細胞上のEpo受容体の結合を阻害するのに使用するため
の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関し、特
に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。細胞
は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。
また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさ
らに企図される。
対象における)を、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片
を含む組成物と接触させるステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS
1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。一態様では、方法は、細胞(例え
ば、Epoを含む細胞)を、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を
含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はなおさらに、Epoと、対象内の細胞
の結合を阻害するのに使用するための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結
合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、細胞は、ヒト細胞であることが企図され
る。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にある
ことも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図される。
本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを
含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNV
S4を含みうる。本発明はまた、対象における黄斑浮腫を処置するための、本明細書で記
載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、黄斑浮腫
は、網膜血管疾患と関連する。黄斑浮腫と関連する網膜血管疾患は、糖尿病性網膜症、糖
尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜
静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含みうるこ
とが企図される。また、対象は、ヒトであることも企図される。
あって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含
む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS1、N
VS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。本発明はまた、対象における網膜血管疾
患と関連する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗
原結合性断片を含む組成物にも関する。一態様では、網膜血管疾患と関連する状態または
障害は、糖尿病性網膜症であることが企図される。別の態様では、状態または障害は、加
齢黄斑変性であることが企図される。網膜血管疾患と関連する状態または障害は、網膜静
脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症でありうること
がなおさらに企図される。また、対象は、ヒトであることも企図される。
であって、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を
含む組成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS1、
NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。本発明はまた、対象における糖尿病性
網膜症と関連する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはそ
の抗原結合性断片を含む組成物にも関する。対象は、ヒトであることが企図される。
て、対象へと、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組
成物を投与するステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS1、NVS
2、NVS3、またはNVS4を含みうる。本発明はまた、対象における黄斑浮腫と関連
する状態または障害を処置するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性
断片を含む組成物にも関する。黄斑浮腫と関連する状態または障害は、糖尿病性黄斑浮腫
であることがさらに企図される。対象は、ヒトであることがさらに企図される。
、有効量の、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物を投与す
るステップを含む方法にも関し、特に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3
、またはNVS4を含みうる。本発明はまた、対象における増殖性糖尿病性網膜症を処置
するための、本明細書で記載される抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関す
る。網膜静脈拡張を低下させ、血管漏出を低下させ、かつ/または眼内の血流を増大させ
る組成物を、対象の眼へと投与することがさらに企図される。対象は、ヒトであることが
さらに企図される。
またはその抗原結合性断片でありうる。
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本
発明が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
なわち、「抗原結合性部分」)またはそれらの単鎖体を意味する。全抗体は、ジスルフィ
ド結合により相互接続される少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む
糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、VHと略記する)および
重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインであるCH1、CH2、およびC
H3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、VLと略記する)および軽鎖定常
領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインであるCLを含む。VH領域およびVL領
域は、フレームワーク領域(FR)と称するより保存的な領域を散在させた、相補性決定
領域(CDR)と称する超可変性の領域へとさらに細分することができる。各VHおよび
各VLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、以下の順序で配置される3つのCDRお
よび4つのFR:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4から
なる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合性ドメインを含有する。抗
体の定常領域は、免疫グロブリンの、宿主組織または免疫系の多様な細胞(例えば、エフ
ェクター細胞)および古典的補体系の第1の成分(Clq)を含む因子への結合を媒介し
うる。
語は、所与の抗原(例えば、エリスロポエチン:Epo)に特異的に結合する能力を保持
する、インタクトな抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、イン
タクトな抗体の断片により果たされうる。抗体の抗原結合性部分または抗原結合性断片と
いう用語内に包含される結合性断片の例は、Fab断片、VLドメイン、VHドメイン、
CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片;ヒンジ領域においてジスルフィ
ド架橋により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab)2断片;VH
ドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片;抗体の単一のアームのVLドメインお
よびVHドメインからなるFv断片;VHドメインまたはVLドメインからなる単一ドメ
イン抗体(dAb)断片(Wardら、1989 Nature 341:544~546);ならびに単離相補性決
定領域(CDR)を含む。
遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して、それらを単一のタンパク質鎖として
作製することを可能とする人工のペプチドリンカーにより付着することができ、この場合
、VL領域およびVH領域は、対合して一価分子(単鎖Fv(scFv)として公知であ
り、例えば、Birdら、1988 Science 242:423~426;およびHustonら、1988 Proc. Natl.
Acad. Sci. 85:5879~5883を参照されたい)を形成する。このような単鎖抗体は、抗体の
1つまたは複数の抗原結合性部分または抗原結合性断片を含む。これらの抗体断片は、当
業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片も、インタクトな抗体と同じ形で有用性
についてスクリーニングされる。
ィ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NAR、およびbis-scFv
(例えば、HollingerおよびHudson、2005、Nature Biotechnology、23、9、1126~1136を
参照されたい)へと組み込むこともできる。抗体の抗原結合性部分は、III型フィブロ
ネクチン(Fn3)などのポリペプチド(フィブロネクチンポリペプチドモノボディにつ
いて記載する米国特許第6,703,199号を参照されたい)に基づく足場へとグラフ
トすることができる。
、タンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)の対を含む単鎖分子へと組み
込むことができる(Zapataら、1995 Protein Eng. 8(10):1057~1062;および米国特許
第5,641,870号)。
体と抗原との間の相互作用の強度を指す。各抗原性部位内では、抗体「アーム」の可変領
域は、多数の部位において、弱い非共有結合的力を介して抗原と相互作用し、相互作用が
大きいほど、アフィニティーは強くなる。抗体またはその抗原結合性断片(例えば、Fa
b断片)について本明細書で使用される「高アフィニティー」という用語は一般に、KD
が10-9M以下の抗体または抗原結合性断片を指す。
のアミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体も指す。自然発生
のアミノ酸とは、遺伝子コードによりコードされるアミノ酸のほか、後で修飾されたアミ
ノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセ
リンでもある。アミノ酸類似体とは、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわ
ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン
、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合したアルファ炭素を有
する化合物を指す。このような類似体は、修飾R基(例えば、ノルロイシン)または修飾
ペプチド骨格を有するが、自然発生のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ
酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、自然発生のアミノ
酸と同様の形で機能する化学化合物を指す。
個別の抗原結合部位の能力を指す。
語句は、タンパク質および他の生体物質の異質な集団内のコグネイト抗原(例えば、ヒト
EpoまたはカニクイザルEpo)の存在を決定する結合反応を指す。本明細書では、「
抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句が、「抗原に特異的に結
合する抗体」という用語と互換的に使用される。
能不全となる状態、障害、または疾患を指す。これは、糖尿病性網膜症(DR)、糖尿病
性黄斑浮腫(DME)、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、非増殖性糖尿病性網膜症(N
PDR)、加齢黄斑変性(AMD)、網膜静脈閉塞(RVO)、多病巣性脈絡膜炎、近視
性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含む。Epoを阻害することにより処置しうる
網膜血管疾患の解剖学的特徴は、黄斑浮腫、静脈拡張、血管蛇行、フルオレセイン血管造
影により測定される血管漏出、網膜出血、および細小血管異常(例えば、毛細血管瘤、綿
花状白斑、IRMA)、毛細血管脱落、白血球接着、網膜虚血症、視神経乳頭の血管新生
、後極の血管新生、虹彩血管新生、網膜内出血、硝子体内出血、黄斑部瘢痕、網膜下線維
症、および網膜線維症を含む。
)の、網膜血管系、網膜代謝、網膜色素上皮、血液網膜関門、または終末糖化産物(AG
E)の眼内レベル、アルドースレダクターゼ活性、グリコシル化ヘモグロビン、およびタ
ンパク質キナーゼCに対する影響の帰結として、網膜が変性するかまたは機能不全となる
状態を指す。糖尿病性網膜症を伴う患者における視力喪失は、網膜虚血症、黄斑浮腫、血
管漏出、硝子体内出血の結果、または網膜ニューロンにおけるグルコースレベルの上昇の
直接的影響でありうる。Epoを阻害することにより処置しうる糖尿病性網膜症の解剖学
的特徴は、毛細血管瘤、綿花状白斑、静脈拡張、黄斑浮腫、網膜内細小血管異常(IRM
A)、網膜内出血、血管増殖、乳頭の血管新生、ルベオーシス、および網膜虚血症を含む
。「糖尿病性黄斑浮腫」は、糖尿病性網膜症を伴う対象において生じ、糖尿病性網膜症の
任意の病期において生じうる。
斑浮腫」の結果として、黄斑の腫脹または肥厚が生じる状態または障害を指す。黄斑浮腫
は、網膜血管疾患において生じ、網膜血管疾患の合併症であることが多い。黄斑浮腫と関
連する具体的な状態または障害は、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性
網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近
視性脈絡膜血管新生、または未熟児網膜症を含む。Epoの阻害による黄斑浮腫の処置は
、眼底検査、光干渉断層法、および視力の改善により決定することができる。
クター機能、および/もしくは種が異なるか、またはクラス、エフェクター機能、および
/もしくは種を改変された定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異
なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などへと連結するように、定
常領域またはその一部を、改変するか、置きかえるか、または交換した抗体分子;あるい
は(b)可変領域またはその一部を、抗原特異性が異なるか、または抗原特異性を改変さ
れた可変領域により改変するか、置きかえるか、またはこれと交換した抗体分子を指す。
例えば、マウス抗体は、その定常領域を、ヒト免疫グロブリンに由来する定常領域で置き
かえることにより修飾することができる。ヒト定常領域による置きかえに起因して、キメ
ラ抗体は、ヒトにおける抗原性を、元のマウス抗体と比較して低減しながら、抗原の認識
におけるその特異性を保持しうる。
用語は、互換的に使用され、異なる種におけるエリスロポエチンタンパク質を指す。例え
ば、ヒトEpoは、表1:配列番号81に示される配列を有する。他の種に由来するEp
oタンパク質の例は、表1、配列番号82、83、84、または85に提示する。ヒト、
カニクイザル、マウス、ラットおよびウサギEpoのタンパク質配列は、公表されており
、表1に記載する。ヒトEpoはまた、高グリコシル化することもできる。当技術分野で
は、高グリコシル化されたEpoはまた、「ダルベポエチン」としても公知であり、LE
K Pharmacueticalsを含む多様な販売元から得ることができる。
も適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体とは、同一なアミノ
酸配列もしくは本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配
列をコードしない場合は、本質的に同一な配列を指す。遺伝子コードの縮重性のために、
多数の機能的に同一な核酸が、所与の任意のタンパク質をコードする。例えば、コドンで
あるGCA、GCC、GCG、およびGCUのいずれも、アミノ酸であるアラニンをコー
ドする。したがって、アラニンがコドンにより指定されるあらゆる位置で、コードされる
ポリペプチドを改変せずに、コドンを、記載された対応するコドンのうちのいずれかへと
改変することができる。このような核酸変異は、保存的に修飾された変異のうちの1種で
ある「サイレント変異」である。ポリペプチドをコードする、本明細書のあらゆる核酸配
列はまた、核酸のあらゆる可能なサイレント変異についても記載する。当業者は、核酸内
の各コドン(通常メチオニンだけのコドンであるAUG、および通常トリプトファンだけ
のコドンであるTGGを除く)を修飾して、機能的に同一な分子をもたらしうることを認
識するであろう。したがって、記載される各配列内では、ポリペプチドをコードする核酸
の各サイレント変異が含意されている。
するアミノ酸による置換を結果としてもたらす、ポリペプチド配列への個別の置換、欠失
、または付加を含む。当技術分野では、機能的に類似するアミノ酸を提示する保存的置換
表が周知である。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間相
同体、および対立遺伝子に追加されるものであり、これらを除外するものではない。以下
の8つの群:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタ
ミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リ
シン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V
);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン
(S)、トレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)は、互いに
対して保存的置換であるアミノ酸を含有する(例えば、Creighton、Proteins(1984)を
参照されたい)。いくつかの実施形態では、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸
配列を含有する抗体の結合特徴にそれほど大きな影響を及ぼしたりこれを改変したりしな
いアミノ酸修飾を指すのに使用する。
する。エピトープは通例、アミノ酸または糖側鎖など、化学的に活性な表面分子群からな
り、通例、特異的な三次元構造特徴のほか、特異的な電荷特徴も有する。コンフォメーシ
ョナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープとは、前者への結合は、変性溶媒
の存在下で失われるが、後者への結合は失われないという点で区別される。
域のいずれもが、ヒト由来の配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する
。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もまた、このようなヒト配列、例え
ば、ヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列配列の突然変異させたバージョンに由
来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、i
n vitroにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発により導
入された突然変異、またはin vivoにおける体細胞突然変異により導入された突然
変異)を含みうる。
、フレームワーク領域およびCDR領域のいずれもが、ヒト配列に由来する可変領域を有
する抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、(i)ヒト重鎖トランス
遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物
、例えば、トランスジェニックマウスから得られるB細胞を含むハイブリドーマ、(ii
)不死化細胞へと融合させたハイブリドーマにより作製する。
る抗体である。これは、例えば、非ヒトCDR領域を保持し、抗体の残りの部分を、それ
らのヒト対応物(すなわち、可変領域の定常領域ならびにフレームワーク部分)で置きか
えることにより達成することができる。例えば、Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、81:6851~6855、1984; MorrisonおよびOi、Adv. Immunol.、44:65~92、1988; Verho
eyenら、Science、239:1534~1536、1988; Padlan、Molec. Immun.、28:489~498、1991
;およびPadlan、Molec. Immun.、31:169~217、1994を参照されたい。ヒト操作技術の他
の例は、US5,766,886において開示されているXoma技術を含むがこれらに
限定されない。
の「同一性」パーセントという用語は、2つ以上の配列または部分配列が同じであること
を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの1つを使用して、または手作業のアライメ
ントおよび目視により測定される比較域または指定領域にわたり、最大の対応性について
比較され、配列決定された場合の、2つの配列の、指定された百分率のアミノ酸残基また
はヌクレオチドが同じであれば(すなわち、指定される領域にわたる、または、指定され
ない場合は、配列全体にわたる、60%の同一性、任意選択で、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性を有すれば)、2つの配列は
「実質的に同一」である。任意選択で、同一性は、少なくとも約50ヌクレオチド(また
は10アミノ酸)の長さの領域にわたり、またはより好ましくは、100~500、また
は1000ヌクレオチド以上(または20、50、または200アミノ酸以上)の長さの
領域にわたり存在する。
ことが典型的である。配列比較アルゴリズムを使用する場合、被験配列および基準配列を
コンピュータへと入力し、必要な場合は、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプロ
グラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することもでき
、代替的なパラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムにより、
プログラムパラメータに基づき、被験配列について、基準配列と比べた配列同一性パーセ
ントを計算する。
同じ数の連続的な位置による基準配列と比較しうる、20~600、通例約50~約20
0、より通例では、約100~約150からなる群から選択される連続的な位置の数のう
ちのいずれか1つによるセグメントに対する言及を含む。当技術分野では、比較のための
配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、Sm
ithおよびWaterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cによる局所相同性アルゴリズムに
より行うこともでき、NeedlemanおよびWunsch、J. Mol. Biol. 48:443、1970による相同
性アライメントアルゴリズムにより行うこともでき、PearsonおよびLipman、Proc. Nat'l
. Acad. Sci. USA 85:2444、1988による類似性検索法により行うこともでき、これらアル
ゴリズムのコンピュータ化された実装(Wisconsin Genetics Sof
tware Package、Genetics Computer Group、57
5 Science Dr.、Madison、WIにおけるGAP、BESTFIT、
FASTA、およびTFASTA)により行うこともでき、手作業のアライメントおよび
目視(例えば、Brentら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons
, Inc.(Ringbou編、2003)を参照されたい)により行うこともできる。
の2つの例は、それぞれ、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389~3402、1977;およびA
ltschulら、J. Mol. Biol. 215:403~410、1990において記載されている、BLASTア
ルゴリズムおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を実施するた
めのソフトウェアは、National Center for Biotechnol
ogy Informationにより公表されている。このアルゴリズムは、データベ
ース配列内の同じ長さのワードで配列決定したときに、ある正の値の閾値スコアTにマッ
チするかまたはこれを満たす、クエリー配列内の短いワード長Wを同定することにより、
高スコア配列対(HSP)をまず同定することを伴う。Tを、隣接ワードスコア閾値(Al
tschulら、前出)と称する。これらの初期の隣接ワードヒットが、これらを含有するより
長いHSPを見出す検索を開始するためのシードとして働く。累積アライメントスコアが
増大しうる限りにおいて、ワードヒットを、各配列に沿っていずれの方向にも拡張する。
累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメータM(マッチする残基の対についてのリ
ウォードスコア;常に>0)およびN(ミスマッチ残基についてのペナルティースコア;
常に<0)を使用して計算する。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを使用し
て、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアが、達成されたその最大値から量X
だけ低下した場合;1つまたは複数の負スコア残基のアライメントの累積のために、累積
スコアが、ゼロ以下に低下した場合;または配列のいずれかの末端に達した場合は、各方
向へのワードヒットの拡張を停止させる。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、
T、およびXにより、アライメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログ
ラム(ヌクレオチド配列の場合)では、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M
=5、N=-4をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列のため
のBLASTPプログラムでは、3のワード長、および10の期待値(E)、および50
のBLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:10915、1989を参照されたい)アライメント(B)、10の期待値(
E)、M=5、N=-4をデフォルトとして使用し、両方の鎖の比較を行う。
えば、KarlinおよびAltschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873~5787、1993を参照
されたい)も実施する。BLASTアルゴリズムにより提供される類似性の1つの尺度は
、2つのヌクレオチド配列間またはアミノ酸配列間のマッチングが偶然に生じる確率の指
標をもたらす最小合計確率(P(N))である。例えば、被験核酸を基準核酸に照らして
比較したときの最小合計確率が約0.2未満であり、より好ましくは、約0.01未満で
あり、最も好ましくは、約0.001未満であれば、核酸は基準配列と類似すると考えら
れる。
2のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用するALIGNプ
ログラム(バージョン2.0)へと組み込まれた、E. MeyersおよびW. Miller(Comput.
Appl. Biosci.、4:11~17、1988)によるアルゴリズムを使用しても決定することができ
る。加えて、2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、Blossom 62マト
リックスまたはPAM250マトリックス、および16、14、12、10、8、6、ま
たは4のギャップ重みづけ、および1、2、3、4、5、または6の長さ重みづけを使用
する、GCGソフトウェアパッケージ(インターネット上のgcg.comで入手可能である)
内のGAPプログラムへと組み込まれた、NeedlemanおよびWunsch(J. Mol, Biol. 48:44
4~453、1970)によるアルゴリズムを使用しても決定することができる。
に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り、第1の核酸によりコードされる
ポリペプチドが、第2の核酸によりコードされるポリペプチドに対する抗体と免疫学的に
交差反応性であることである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換だけに
よって異なる場合、ポリペプチドは、第2のポリペプチドと実質的に同一なことが典型的
である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、下記で記載される通り
、2つの分子またはそれらの相補体が、厳密な条件下で、互いとハイブリダイズすること
である。2つの核酸配列が実質的に同一であることのさらに別の指標は、同じプライマー
を使用して配列を増幅しうることである。
は誘導された細胞の活性化(例えば、細胞シグナル伝達)、複製、および/または増殖に
干渉する抗Epo抗体の能力を指す。とりわけ、「~を阻害する」とは、本明細書で記載
される抗Epo抗体またはその断片と接触させた後の対象における、Epo依存性の細胞
増殖または他のパラメータ(例えば、Epo依存性の細胞シグナル伝達、血管新生)の、
対照と比べて統計学的に有意な(すなわち、p<0.05)低下を指す。本明細書で使用
される「Epo依存性の細胞増殖を阻害する」とはまた、下記で記載される網膜血管疾患
と関連する状態または障害を伴うと診断された患者における、本明細書で記載される抗E
po抗体による処置の後における視覚機能または網膜の解剖学的特徴の、臨床的に関与性
の改善も指す場合がある。
より刺激または誘導された細胞内シグナル伝達経路の活性化の、統計学的に有意な(すな
わち、p<0.05)低下をもたらす、本明細書で記載される抗Epo抗体の能力を指す
。
体を指す(例えば、Epoに特異的に結合する単離抗体は、Epo以外の抗原に特異的に
結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、Epoに特異的に結合する単離抗体は、他
の抗原に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞内物質および/ま
たは化学物質を実質的に含まない場合もある。
例えば、IgM、IgE、IgG1またはIgG4などのIgG)を指す。アイソタイプ
はまた、これらのクラスのうちの1つの修飾バージョンも含み、その修飾は、Fc機能を
改変する、例えば、エフェクター機能またはFc受容体への結合を増強または低減するよ
うに施されている。アイソタイプとはまた、軽鎖定常領域によりもたらされる抗体クラス
(例えば、カッパ、ラムダ)も指す。
原間相互作用の会合速度を指すことを意図するのに対し、本明細書で使用される「Kdi
s」または「Kd」という用語は、特定の抗体-抗原間相互作用の解離速度を指すことを
意図する。本明細書で使用される「KD」という用語は、KdのKaに対する比(すなわ
ち、Kd/Ka)から得られる解離定数を指すことを意図し、モル濃度(M)として表す
。抗体のKD値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる
。抗体のKDを決定するための方法は、Biacore(登録商標)システムなどのバイ
オセンサーシステムを使用して表面プラズモン共鳴を測定するか、または溶液平衡滴定(
SET)により溶液中のアフィニティーを測定するステップを含む。
いう用語は、単一の分子組成による抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物
は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性およびアフィニティーを提示する。
用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖形態ま
たは二本鎖形態におけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、公知のヌクレオチド類
似体または修飾骨格残基もしくは修飾連結を含有する核酸であって、合成の核酸、自然発
生の核酸、および非自然発生の核酸であり、基準核酸と同様の結合特性を有し、基準ヌク
レオチドと同様の形で代謝される核酸を包含する。このような類似体の例は、限定なしに
述べると、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチ
ルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)を含む。
変異体(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列も暗示的に包含するほか、明示的に
指し示される配列も包含する。とりわけ、下記で詳述される通り、縮重コドン置換は、1
つまたは複数の選択された(または全ての)コドンの第3の位置が、混合塩基および/ま
たはデオキシイノシン残基で置換された配列を作り出すことにより達成することができる
(Batzerら、Nucleic Acid Res. 19:5081、1991; Ohtsukaら、J. Biol. Chem. 260:2605
~2608、1985;およびRossoliniら、Mol. Cell. Probes 8:91~98、1994)。
A)セグメントの間の機能的関係を指す。「作動可能に連結された」という用語は、転写
調節配列の、転写される配列に対する機能的関係を指すことが典型的である。例えば、プ
ロモーター配列またはエンハンサー配列は、それが、適切な宿主細胞内または他の発現系
内のコード配列の転写を刺激またはモジュレートするとき、コード配列に作動可能に連結
されている。一般に、転写される配列に作動可能に連結されたプロモーター転写調節配列
は、転写される配列と物理的に隣接する、すなわち、シス作用型である。しかし、エンハ
ンサーなど、一部の転写調節配列は、その転写をそれらが増強するコード配列に物理的に
隣接する必要も、近接して配置される必要もない。
または産生生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア(Pichia)属細胞、チャイニーズハ
ムスター卵巣細胞(CHO)、またはヒト細胞において好ましいコドンを使用してアミノ
酸配列をコードするように改変していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列
は、「親」配列としてもまた公知の出発ヌクレオチド配列により本来コードされるアミノ
酸配列を、完全に、または可能な限り多く保持するように操作する。本明細書の最適化さ
れた配列は、哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている。しか
し、本明細書ではまた、他の真核細胞または原核細胞におけるこれらの配列の最適化され
た発現も企図される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列も
また、最適化されていると称する。
ポリマーを指すように互換的に使用される。「ポリペプチド」および「タンパク質」とい
う用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する自然発生のアミノ酸の人工の化学
的模倣体であるアミノ酸ポリマーのほか、自然発生のアミノ酸ポリマーおよび非自然発生
のアミノ酸ポリマーにも適用される。別段に指し示されない限りにおいて、特定のポリペ
プチド配列はまた、保存的に修飾されたその変異体も暗示的に包含する。
ついてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)
またはこれにより調製されるハイブリドーマから単離される抗体、ヒト抗体を発現させる
ように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離される抗体、組
換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体、およびヒト免疫グロ
ブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のDNA配列へのスプライシングを伴う、他の
任意の手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される抗体な
ど、組換え手段により調製されるか、発現させるか、創出されるか、または単離される、
全てのヒト抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域およびCDR
領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかし、
ある種の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、in vitroの突然変異誘発
(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックである動物を使用する場合は、in
vivoの体細胞突然変異誘発)にかけることができ、したがって、組換え抗体のVH
領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH配列およびVL配列に由
来し、これらに関連するが、in vivoのヒト抗体の生殖細胞系列レパートリー内で
天然には存在しない可能性がある配列である。
ターを導入した細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけを指すことを意図す
るものではなく、このような細胞の子孫細胞も指すことを意図するものであることを理解
されたい。後続する世代では、突然変異または環境的影響に起因して、ある種の修飾が生
じうるため、このような子孫細胞は、実のところ、親細胞と同一ではない可能性もあるが
、やはり本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
(例えば、カニクイザル)、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、および爬虫類など
、全ての脊椎動物(例えば、哺乳動物および非哺乳動物)を含む。特記される場合を除き
、本明細書では、「患者」または「対象」という用語が互換的に使用される。本明細書で
使用される「カニクイザル(cyno)」または「カニクイザル(cynomolgus)」という用語
は、カニクイザル(cynomolgus monkey)(カニクイザル(Macaca fascicularis))を指
す。
患、糖尿病性網膜症、黄斑浮腫)「~を処置すること」またはこれらの「処置」という用
語は、疾患または障害を改善すること(すなわち、疾患またはその臨床症状のうちの少な
くとも1つの発症を緩徐化するか、停止させるか、または軽減すること)を指す。別の実
施形態では、「~を処置すること」または「処置」とは、患者により識別可能でない可能
性があるパラメータを含む少なくとも1つの物理的パラメータを緩和または改善すること
を指す。さらに別の実施形態では、「~を処置すること」または「処置」とは、疾患また
は障害を、物理的にモジュレートする(例えば、識別可能な症状の安定化)か、生理学的
にモジュレートする(例えば、物理的パラメータの安定化)か、または物理的かつ生理学
的にモジュレートすることを指す。さらに別の実施形態では、「~を処置すること」また
は「処置」とは、疾患または障害の発生または発症または進行を防止するかまたは遅延さ
せることを指す。網膜血管疾患と関連する状態もしくは障害、糖尿病性網膜症と関連する
状態もしくは障害、および/または黄斑浮腫と関連する状態もしくは障害を含む、本明細
書で記載される適応に関する場合の「防止」とは、下記で記載される、視覚機能、網膜の
解剖学的特徴、網膜血管疾患のパラメータ、糖尿病性網膜症の疾患パラメータ、および/
または黄斑浮腫の疾患パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある患者において防止す
るかまたは緩徐化する任意の作用を意味する。より具体的には、網膜血管疾患と関連する
状態もしくは障害、糖尿病性網膜症と関連する状態もしくは障害、および/または黄斑浮
腫と関連する状態もしくは障害の「処置」とは、視覚機能および/または網膜の解剖学的
特徴の改善または保存を結果としてもたらすか、またはこれを結果としてもたらすことが
企図される任意の作用を意味する。当技術分野では、疾患の処置および/または防止を評
価する方法が知られており、本明細書の下記で記載する。
可能なポリヌクレオチド分子を指すことを意図する。ベクターのうちの1つの種類は、さ
らなるDNAセグメントをライゲーションしうる、環状の二本鎖DNAループを指す「プ
ラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるDNAセグメントを、ウイルスゲノ
ムへとライゲーションしうる、アデノ随伴ウイルスベクター(AAVまたはAAV2)な
どのウイルスベクターである。ある種のベクター(例えば、細菌の複製起点を有する細菌
ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター)は、それらが導入された宿主細胞におけ
る自己複製が可能である。他のベクター(例えば、非哺乳動物のエピソームベクター)は
、宿主細胞へと導入すると、宿主細胞のゲノムへと組み込むことができ、これにより、宿
主ゲノムと共に複製する。さらに、ある種のベクターは、それらが作動的に連結された遺
伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組
換え発現ベクター」(または簡単に、「発現ベクター」)と称する。一般に、組換えDN
A法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは
ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本明細書では、「プラスミド」と「
ベクター」とを互換的に使用することができる。しかし、本発明は、同等な機能をもたら
すウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ
随伴ウイルス)など、発現ベクターの他の形態も含むことを意図する。
全IgGフォーマットの抗体、ならびにFab断片(例えば、抗体のNVS1、NVS2
、NVS3、およびNVS4を参照されたい)など、それらの抗原結合性断片の両方に関
する。
po、およびマウスEpo)に特異的に結合する抗体、医薬組成物、このような抗体およ
び組成物の作製法および使用法を提供する。
本発明は、Epoに特異的に結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本発
明は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスEpoのほか、高グリコシル化
ヒトEpo(ダルベポエチン)にも特異的に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、
実施例で記載される通りに単離されたヒトモノクローナル抗体およびFabを含むがこれ
らに限定されない。
ウスEpo)に特異的に結合する抗体であって、配列番号13、33、53、または73
のアミノ酸配列を有するVHドメインを含む抗体を提供する。本発明はまた、Epoタン
パク質に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVH CDRのうちの
いずれか1つのアミノ酸配列を有するVH CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明
は、Epoタンパク質(例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスEp
o)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVH CDRのうちのい
ずれかのアミノ酸配列を有する、1つ、2つ、3つ以上のVH CDRを含む(または、
代替的に、これらからなる)抗体を提供する。
54、または74のアミノ酸配列を有するVLドメインを含む抗体を提供する。本発明は
また、Epoタンパク質(例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスE
po)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVL CDRのうちの
いずれか1つのアミノ酸配列を有するVL CDRを含む抗体も提供する。特に、本発明
は、Epoタンパク質(例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスEp
o)に特異的に結合する抗体であって、以下の表1に列挙されるVL CDRのうちのい
ずれかのアミノ酸配列を有する、1つ、2つ、3つ以上のVL CDRを含む(または、
代替的に、これらからなる)抗体を提供する。
ている配列内で描示されるCDR領域と、少なくとも80、85、90、95、96、9
7、98、または99パーセントの同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態
では、本発明の他の抗体は、CDR領域内で、表1に記載されている配列内で描示される
CDR領域と比較して、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下のアミノ酸を突然変異
させた、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
はマウスEpo)に特異的に結合する抗体のVH、VL、全長重鎖、および全長軽鎖をコ
ードする核酸配列も提供する。このような核酸配列は、哺乳動物細胞における発現につい
て最適化することができる(例えば、表1は、本発明の抗体の重鎖および軽鎖に最適化さ
れた核酸配列を示す)。
が、表1に記載されている配列となお少なくとも60、65、70、75、80、85、
90、または95パーセントの同一性を有する抗体を含む。いくつかの実施形態は、可変
領域内で、実質的に同じ抗原結合活性を保持しながら、表1に記載されている配列内で描
示された可変領域と比較した場合に、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下のアミノ
酸を突然変異させている、突然変異体のアミノ酸配列を含む。
、および全長重鎖配列(アミノ酸配列と、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と
)を「混合し、マッチさせて」、本発明の他のEpo結合性抗体を創出することができる
。このような「混合し、マッチさせた」Epo結合性抗体は、当技術分野で公知の結合ア
ッセイ(例えば、ELISAおよび実施例節で記載される他のアッセイ)を使用して調べ
ることができる。これらの鎖を混合し、マッチさせる場合、特定のVH/VL対合に由来
するVH配列を、構造的に類似するVH配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全
長重鎖/全長軽鎖対合に由来する全長重鎖配列を、構造的に類似する全長重鎖配列で置き
かえるものとする。同様に、特定のVH/VL対合に由来するVL配列を、構造的に類似
するVL配列で置きかえるものとする。同様に、特定の全長重鎖/全長軽鎖対合に由来す
る全長軽鎖配列を、構造的に類似する全長軽鎖配列で置きかえるものとする。したがって
、一態様では、本発明は、配列番号13、33、53、および73からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号14、34、54、および
74からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを有する単離抗体ま
たはその抗原結合性領域を提供し、この場合、抗体は、Epo(例えば、ヒト、カニクイ
ザル、ラットおよび/またはマウスEpo)に特異的に結合する。より具体的に、ある種
の態様では、本発明は、配列番号13および14のそれぞれから選択されるアミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合
性領域を提供する。他の具体的な態様では、本発明は、配列番号33および34のそれぞ
れから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する
、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列
番号53および54のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよ
び軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他
の態様では、本発明は、配列番号73および74のそれぞれから選択されるアミノ酸配列
を含む重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、単離抗体またはその抗原結合
性領域を提供する。
ノ酸配列であって、配列番号15、35、55、および75からなる群から選択されるア
ミノ酸配列を含む全長重鎖、ならびに哺乳動物細胞における発現について最適化されたア
ミノ酸配列であって、配列番号16、36、56、および76からなる群から選択される
アミノ酸配列を含む全長軽鎖を有する単離抗体、または(ii)その抗原結合性部分を含
む機能的タンパク質を提供する。より具体的に、ある種の態様では、本発明は、配列番号
15および16のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する単
離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。他の具体的な態様では、本発明は、配列番
号35および36のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する
単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番
号55および56のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する
単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。さらに他の態様では、本発明は、配列番
号75および76のそれぞれから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する
単離抗体またはその抗原結合性領域を提供する。
および抗原結合アフィニティーを付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の配列を指す。一
般に、各重鎖可変領域(HCDR1、HCDR2、HCDR3)内には、3つのCDRが
あり、各軽鎖可変領域(LCDR1、LCDR2、LCDR3)内には、3つのCDRが
ある。
eins of Immunological Interest」、5版、Public Health Service、National Institute
s of Health、Bethesda、MD(「Kabat」番号付けスキーム)、Al-Lazikaniら、(19
97)JMB 273、927~948(「Chothia」番号付けスキーム)により記載されている
スキームを含む、周知の多数のスキームのうちのいずれかを使用して、たやすく決定する
ことができる。
31~35(HCDR1)、50~65(HCDR2)、および95~102(HCDR
3)と番号付けされており、軽鎖可変ドメイン(VL)内のCDRアミノ酸残基は、24
~34(LCDR1)、50~56(LCDR2)、および89~97(LCDR3)と
番号付けされている。Chothiaによれば、VH内のCDRアミノ酸は、26~32
(HCDR1)、52~56(HCDR2)、および95~102(HCDR3)と番号
付けされており、VL内のアミノ酸残基は、26~32(LCDR1)、50~52(L
CDR2)、および91~96(LCDR3)と番号付けされている。Kabatおよび
Chothia両方のCDR定義を組み合わせることにより、CDRは、ヒトVH内のア
ミノ酸残基26~35(HCDR1)、50~65(HCDR2)、および95~102
(HCDR3)、ならびにヒトVL内のアミノ酸残基24~34(LCDR1)、50~
56(LCDR2)、および89~97(LCDR3)からなる。
、およびCDR3、またはこれらの組合せを含むEpo結合性抗体を提供する。抗体のV
H CDR1のアミノ酸配列は、配列番号1、21、41、または61に示されている。
抗体のVH CDR2のアミノ酸配列は、配列番号2、22、42、または62に示され
ている。抗体のVH CDR3のアミノ酸配列は、配列番号3、23、43、または63
に示されている。抗体のVL CDR1のアミノ酸配列は、配列番号4、24、44、ま
たは64に示されている。抗体のVL CDR2のアミノ酸配列は、配列番号5、25、
45、または65に示されている。抗体のVL CDR3のアミノ酸配列は、配列番号6
、26、46、または66に示されている。これらのCDR領域は、Kabatシステム
を使用して表される。
を使用して規定される通り、抗体のVH CDR1のアミノ酸配列は、配列番号7、27
、47、または67に示されている。抗体のVH CDR2のアミノ酸配列は、配列番号
8、28、48、または68に示されている。抗体のVH CDR3のアミノ酸配列は、
配列番号9、29、49、または69に示されている。抗体のVL CDR1のアミノ酸
配列は、配列番号10、30、50、または70に示されている。抗体のVL CDR2
のアミノ酸配列は、配列番号11、31、51、または71に示されている。抗体のVL
CDR3のアミノ酸配列は、配列番号12、32、52、または72に示されている。
CDR1領域、CDR2領域、およびCDR3領域によりもたらされることを踏まえれば
、各抗体は、本発明の他のEpo結合性分子を創出するのに、VH CDR1、VH C
DR2、およびVH CDR3、ならびにVL CDR1、VL CDR2、およびVL
CDR3を含有することが好ましいが、VH CDR1配列、VH CDR2配列、お
よびVH CDR3配列、ならびにVL CDR1配列、VL CDR2配列、およびV
L CDR3配列を、「混合し、マッチさせる」ことができる(すなわち、異なる抗体に
由来するCDRを、混合し、マッチさせることができる)。このような「混合し、マッチ
させた」Epo結合性抗体は、当技術分野で公知の結合アッセイおよび実施例で記載され
る結合アッセイ(例えば、ELISA、SET、Biacore)を使用して調べること
ができる。VH CDR配列を混合し、マッチさせる場合は、特定のVH配列に由来する
CDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列を、構造的に類似するCDR
配列で置きかえるものとする。同様に、VL CDR配列を混合し、マッチさせる場合は
、特定のVL配列に由来するCDR1配列、CDR2配列、および/またはCDR3配列
を、構造的に類似するCDR配列で置きかえるものとする。当業者には、新規のVH配列
およびVL配列を、1つまたは複数のVH CDR領域配列および/またはVL CDR
領域配列を、本発明のモノクローナル抗体のための、本明細書で示されるCDR配列に由
来する、構造的に類似する配列で置換することにより創出しうることがたやすく明らかで
あろう。前出に加えて、一実施形態では、本明細書で記載される抗体の抗原結合性断片は
、VH CDR1、VH CDR2、およびVH CDR3、またはVL CDR1、V
L CDR2、およびVL CDR3を含むことが可能であり、この場合、断片は、Ep
oに、単一の可変ドメインとして結合する。
れているFabの重鎖および軽鎖配列を有しうる。より具体的には、抗体またはその抗原
結合性断片は、FabのNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4の重鎖および軽
鎖配列を有しうる。
Kabatにより規定され、表1に記載されている、重鎖可変領域のCDR1、重鎖可変
領域のCDR2、重鎖可変領域のCDR3、軽鎖可変領域のCDR1、軽鎖可変領域のC
DR2、および軽鎖可変領域のCDR3を含む。本発明のさらに他の実施形態では、Ep
oに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、Chothiaにより規定され、表
1に記載されている、重鎖可変領域のCDR1、重鎖可変領域のCDR2、重鎖可変領域
のCDR3、軽鎖可変領域のCDR1、軽鎖可変領域のCDR2、および軽鎖可変領域の
CDR3を含む。
1の重鎖可変領域のCDR1、配列番号2の重鎖可変領域のCDR2、配列番号3の重鎖
可変領域のCDR3、配列番号4の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号5の軽鎖可変領域
のCDR2、および配列番号6の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。別の具体的
な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって、配列番号21の重
鎖可変領域のCDR1、配列番号22の重鎖可変領域のCDR2、配列番号23の重鎖可
変領域のCDR3、配列番号24の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号25の軽鎖可変領
域のCDR2、および配列番号26の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。別の具
体的な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって、配列番号41
の重鎖可変領域のCDR1、配列番号42の重鎖可変領域のCDR2、配列番号43の重
鎖可変領域のCDR3、配列番号44の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号45の軽鎖可
変領域のCDR2、および配列番号46の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。別
の具体的な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって、配列番号
61の重鎖可変領域のCDR1、配列番号62の重鎖可変領域のCDR2、配列番号63
の重鎖可変領域のCDR3、配列番号64の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号65の軽
鎖可変領域のCDR2、および配列番号66の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む
。
番号7の重鎖可変領域のCDR1、配列番号8の重鎖可変領域のCDR2、配列番号9の
重鎖可変領域のCDR3、配列番号10の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号11の軽鎖
可変領域のCDR2、および配列番号12の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含む。
別の具体的な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって、配列番
号27の重鎖可変領域のCDR1、配列番号28の重鎖可変領域のCDR2、配列番号2
9の重鎖可変領域のCDR3、配列番号30の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号31の
軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号32の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体を含
む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって、配
列番号47の重鎖可変領域のCDR1、配列番号48の重鎖可変領域のCDR2、配列番
号49の重鎖可変領域のCDR3、配列番号50の軽鎖可変領域のCDR1、配列番号5
1の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号52の軽鎖可変領域のCDR3を含む抗体
を含む。別の具体的な実施形態では、本発明は、Epoに特異的に結合する抗体であって
、配列番号67の重鎖可変領域のCDR1、配列番号68の重鎖可変領域のCDR2、配
列番号69の重鎖可変領域のCDR3、配列番号70の軽鎖可変領域のCDR1、配列番
号71の軽鎖可変領域のCDR2、および配列番号72の軽鎖可変領域のCDR3を含む
抗体を含む。
抗体または抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、Epoに結合する抗体または
抗原結合性断片は、FabのNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4である。
系から得られる場合、本明細書で使用されるヒト抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産
物」であるかまたはこれ「に由来する」、重鎖もしくは軽鎖可変領域または全長重鎖もし
くは軽鎖を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニ
ックマウスを、対象の抗原で免疫化するか、または対象の抗原を伴うファージ上で提示さ
れるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖
細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由来する」ヒト抗体は
、ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し
、配列がヒト抗体の配列と最も近似する(すなわち、同一性%が最大である)ヒト生殖細
胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、それ自体として同定することができ
る。特定のヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはこれ「に由
来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生の体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意
図的な導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較したアミノ酸の差異を含有しうる。しか
し、VHフレームワーク領域またはVLフレームワーク領域では、選択されたヒト抗体は
、アミノ酸配列が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ
酸配列と少なくとも90%の同一であり、ヒト抗体を、他の種の生殖細胞系列免疫グロブ
リンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖細胞系列配列)と比較した場合に、ヒトとして同
定するアミノ酸残基を含有することが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、ア
ミノ酸配列が、生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と
、少なくとも60%、70%、80%、90%、または少なくとも95%、なおまたは、
少なくとも96%、97%、98%、または99%同一でありうる。組換えヒト抗体は、
VHフレームワーク領域内またはVLフレームワーク領域内のヒト生殖細胞系列の免疫グ
ロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、10アミノ酸以下の差異を提示す
ることが典型的である。ある種の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系列の免疫グロブリン
遺伝子によりコードされるアミノ酸配列との、5アミノ酸以下、なおまたは、4、3、2
、または1アミノ酸以下の差異を提示しうる。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子
の例は、下記で記載される生殖細胞系列の可変ドメイン断片のほか、DP47およびDP
K9も含むがこれらに限定されない。
さらに別の実施形態では、本発明は、表1に記載されている配列と相同なアミノ酸配列
を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供するが、抗体は、Epoタンパク質(例え
ば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスEpo)に結合し、表1に記載さ
れている抗体の所望の機能的特性を保持する。
その機能的抗原結合性断片を提供し、この場合、重鎖可変ドメインは、配列番号13、3
3、53、および73からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85
%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なアミノ酸配列を含み
;軽鎖可変ドメインは、配列番号 14、34、54、および74からなる群から選択さ
れるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%、または99%同一なアミノ酸配列を含み;抗体は、Epo(例えば、ヒト、カニクイ
ザル、ラットおよび/またはマウスEpo)に特異的に結合する。本発明のある種の態様
では、重鎖および軽鎖配列は、Kabatにより規定される、HCDR1配列、HCDR
2配列、HCDR3配列、LCDR1配列、LCDR2配列、およびLCDR3配列、例
えば、それぞれ、配列番号1、2、3、4、5、および6;それぞれ、配列番号21、2
2、23、24、25、および26;それぞれ、配列番号41、42、43、44、45
、および46;または、それぞれ、配列番号61、62、63、64、65、および66
をさらに含む。本発明のある種の他の態様では、重鎖および軽鎖配列は、Chothia
により規定される、HCDR1配列、HCDR2配列、HCDR3配列、LCDR1配列
、LCDR2配列、およびLCDR3配列、例えば、それぞれ、配列番号7、8、9、1
0、11、および12;それぞれ、配列番号27、28、29、30、31、および32
;それぞれ、配列番号47、48、49、50、51、および52;またはそれぞれ、配
列番号67、68、69、70、71、および72をさらに含む。
れる配列と、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%
同一でありうる。他の実施形態では、VHアミノ酸配列および/またはVLアミノ酸配列
は、1、2、3、4、または5カ所以下のアミノ酸位置におけるアミノ酸置換を除き同一
でありうる。表1に記載されている抗体のVH領域およびVL領域と大きな(すなわち、
80%以上の)同一性を有するVH領域およびVL領域を有する抗体は、配列番号13、
33、53、または73、および配列番号14、34、54、または74のそれぞれをコ
ードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突
然変異誘発)の後、本明細書で記載される機能アッセイを使用して、コードされる改変抗
体を、機能の保持について調べることにより得ることができる。
1に示される配列と、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、また
は99%同一でありうる。配列番号15、35、55、または75のうちのいずれかの全
長重鎖、および配列番号16、36、56、または76のうちのいずれかの全長軽鎖と大
きな(すなわち、80%以上の)同一性を有する全長重鎖および全長軽鎖を有する抗体は
、このようなポリペプチドをコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的突
然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発)の後、本明細書で記載される機能アッセイを
使用して、コードされる改変抗体を、機能の保持について調べることにより得ることがで
きる。
列は、表1に示される配列と、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98
%、または99%同一でありうる。
クレオチド配列は、表1に示される配列と、80%、85%、90%、95%、96%、
97%、98%、または99%同一でありうる。
アライメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮
する配列により共有される、同一な位置の数の関数(すなわち、同一性%=同一な位置の
数/位置の総数×100)である。2つの配列の間の配列の比較および同一性パーセント
の決定は、下記の非限定的な例で記載されている、数学的アルゴリズムを使用して達成す
ることができる。
して検索を実施する、例えば、関連の配列を同定するための「クエリー配列」としてさら
に使用することもできる。例えば、このような検索は、Altschulら、1990 J. Mol. Biol.
215:403~10によるBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実施すること
ができる。
ある種の実施形態では、本発明の抗体は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR
3配列を含む重鎖可変領域、ならびにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列
を含む軽鎖可変領域を有し、この場合、これらのCDR配列のうちの1つまたは複数は、
本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列を
有し、抗体は、本発明のEpo結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって、
本発明は、CDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む重鎖可変領域、なら
びにCDR1配列、CDR2配列、およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗
体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域のCDR1アミノ酸配列が、配列番
号1、21、41、および61、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、
重鎖可変領域のCDR2アミノ酸配列が、配列番号2、22、42、および62、ならび
にそれらの保存的修飾からなる群から選択され、重鎖可変領域のCDR3アミノ酸配列が
、配列番号3、23、43、および63、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選
択され、軽鎖可変領域のCDR1アミノ酸配列が、配列番号4、24、44、および64
、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、軽鎖可変領域のCDR2アミノ
酸配列が、配列番号5、25、45、および65、ならびにそれらの保存的修飾からなる
群から選択され、軽鎖可変領域のCDR3アミノ酸配列が、配列番号6、26、46、お
よび66、ならびにそれらの保存的修飾からなる群から選択され、Epoに特異的に結合
する、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
おり、全長重鎖配列および全長軽鎖配列を有し、これらの配列のうちの1つまたは複数は
、本明細書で記載される抗体またはそれらの保存的修飾に基づき指定されたアミノ酸配列
を有し、抗体は、本発明のEpo結合性抗体の所望の機能的特性を保持する。したがって
、本発明は、全長重鎖および全長軽鎖からなる、哺乳動物細胞における発現について最適
化された単離抗体であって、全長重鎖が、配列番号15、35、55、および75、なら
びにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ酸配列を有し、全長軽鎖が、配列番号
16、36、56、および76、ならびにそれらの保存的修飾の群から選択されるアミノ
酸配列を有し、Epo(例えば、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/またはマウスEp
o)に特異的に結合する抗体を提供する。
本発明は、表1に記載されているEpo結合性抗体と同じエピトープに結合する抗体を
提供する。したがって、Epo結合アッセイ(実施例で記載されるEpo結合アッセイな
ど)において、本発明の他の抗体と競合する(例えば、本発明の他の抗体の結合を、統計
学的に有意な形で競合的に阻害する)それらの能力に基づき、さらなる抗体を同定するこ
とができる。本発明の抗体の、Epoタンパク質への結合を阻害する被験抗体の能力によ
り、被験抗体が、その抗体と、Epoへの結合について競合することが可能であり、この
ような抗体は、非限定的な理論によれば、Epoタンパク質上の、それが競合する抗体と
同じであるかまたは関連の(例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接した)エ
ピトープに結合しうることが裏付けられる。ある種の実施形態では、本発明の抗体と同じ
Epo上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒ
トモノクローナル抗体は、本明細書で記載される通りに、調製および単離することができ
る。本明細書で使用される通り、等モル濃度の競合抗体の存在下で、競合抗体が、本発明
の抗体または抗原結合性断片のEpoとの結合を、50%を超えて阻害するとき、抗体は
、結合について「競合する」。
イン(Epoタンパク質のアミノ酸138~162;配列番号88)に結合する。他の実
施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ヘリックスA(Epoタンパク質の
アミノ酸4~26;配列番号86)およびEpoのループA~B(Epoタンパク質のア
ミノ酸27~55;配列番号89)に結合する。
イン(ヒトEpoのアミノ酸138~162;配列番号88)に結合する。他の実施形態
では、単離抗体または抗原結合性断片は、ループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ酸
27~55;配列番号89)に結合する。他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性
断片は、ループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ酸27~55;配列番号89)、お
よびヘリックスA(ヒトEpoのアミノ酸4~26;配列番号86)に結合する。さらに
他の実施形態では、単離抗体または抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(
ヒトEpoのアミノ酸138~162;配列番号88)、およびループA~Bドメイン(
ヒトEpoのアミノ酸27~55;配列番号89)に結合する。他の実施形態では、単離
抗体または抗原結合性断片は、EpoのDヘリックスドメイン(ヒトEpoのアミノ酸1
38~162;配列番号88)、ループA~Bドメイン(ヒトEpoのアミノ酸27~5
5;配列番号89)、およびヘリックスA(ヒトEpoのアミノ酸4~26;配列番号8
6)に結合する。
)の44~50、52、53、147、150、151、154、155、159、およ
び162位におけるアミノ酸を含むエピトープに結合する。本発明の他の態様では、単離
抗体または抗原結合性断片は、ヒトEpo(配列番号81)の9、13、44~53、1
47、150、151、154、155、158、159、および162位におけるアミ
ノ酸を含むエピトープに結合する。本発明の他の態様では、単離抗体または抗原結合性断
片は、ヒトEpo(配列番号81)の23、43~50、52、53、131、143、
147、150、151、154、155、159、および162位におけるアミノ酸を
含むエピトープに結合する。本発明の特定の態様では、単離抗体または抗原結合性断片は
、ヒトEpo(配列番号81)のアミノ酸Thr-Lys-Val-Asn-Phe-T
yr-Ala(44~50位における)、Lys-Arg(52~53位における)、A
sn(147位における)、Arg-Gly(150~151位における)、Lys-L
eu(154~155位における)、Glu(159位における)、およびArg(16
2位における)を含むエピトープに結合する。本発明の他の特定の態様では、単離抗体ま
たは抗原結合性断片は、ヒトEpo(配列番号81)のアミノ酸Ser(9位における)
、Glu(13位における)、Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Al
a(44~50位における)、Lys-Arg(52~53位における)、Asn(14
7位における)、Arg-Gly(150~151位における)、Lys-Leu(15
4~155位における)、Gly(158位における)、Glu(159位における)、
およびArg(162位における)を含むエピトープに結合する。本発明のなおさらなる
態様では、単離抗体または抗原結合性断片は、ヒトEpo(配列番号81)のアミノ酸G
lu(23位における)、Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-
Ala(43~50位における)、Lys-Arg(52~53位における)、Arg(
131位における)、Arg(143位における)、Asn(147位における)、Ar
g-Gly(150~151位における)、Lys-Leu(154~155位における
)、Glu(159位における)、およびArg(162位における)を含むエピトープ
に結合する。
基Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、Tyr49、Ala
50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gly151、Lys1
54、Leu155、Glu159、およびArg162を含むエピトープも含み、この
場合、エピトープに結合する抗体は、EpoとEpo受容体の結合を阻害するであろう。
また、本発明のエピトープに結合する抗体は、Epo依存性の細胞増殖をさらに阻害する
ことも企図される。
er9、Glu13、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48、
Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Asn147、Arg150、Gl
y151、Lys154、Leu155、Gly158、Glu159、およびArg1
62を含むエピトープをさらに含み、この場合、エピトープに結合する抗体は、Epoと
Epo受容体の結合を阻害するであろう。また、本発明のエピトープに結合する抗体は、
Epo依存性の細胞増殖をさらに阻害することも企図される。
lu23、Asp43、Thr44、Lys45、Val46、Asn47、Phe48
、Tyr49、Ala50、Lys52、Arg53、Arg131、Arg143、A
sn147、Arg150、Gly151、Lys154、Leu155、Glu159
、およびArg162を含むエピトープをなおさらに含み、この場合、エピトープに結合
する抗体は、EpoとEpo受容体の結合を阻害するであろう。また、本発明のエピトー
プに結合する抗体は、Epo依存性の細胞増殖をさらに阻害することも企図される。
出発抗体から特性を改変した修飾抗体を操作する出発材料として、本明細書で示される
VH配列および/またはVL配列のうちの1つまたは複数を有する抗体を使用して、本発
明の抗体をさらに調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域(すなわち
、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つもしくは複数のCDR領域内、および/ま
たは1つもしくは複数のフレームワーク領域内の1つまたは複数の残基を修飾することに
より操作することができる。加えて、または代替的に、抗体は、定常領域内の残基を修飾
して、例えば、抗体のエフェクター機能を改変することによっても操作することができる
。
、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)内に位置するアミノ酸残基を介し
て、標的抗原と相互作用する。この理由で、CDR内のアミノ酸配列は、個別の抗体の間
の多様性が、CDRの外部の配列より大きい。CDR配列は、大半の抗体-抗原間相互作
用の一因となるため、異なる特性を伴う異なる抗体に由来するフレームワーク配列へとグ
ラフトされた特異的自然発生抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築するこ
とにより、特異的自然発生抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能であ
る(例えば、Riechmann, L.ら、1998 Nature 332:323~327; Jones, P.ら、1986 Nature
321:522~525; Queen, C.ら、1989 Proc. Natl. Acad. U.S.A. 86:10029~10033;Win
terによる米国特許第5,225,539号、ならびにQueenらによる米国特許第
5,530,101号;同第5,585,089号;同第5,693,762号;および
同第6,180,370号を参照されたい)。
群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号2、22、42、および
62からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、配列番号3、23、
43、および63からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3配列のそれぞ
れを含む重鎖可変領域と、配列番号4、24、44、および64からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号5、25、45、および65からなる群
から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、ならびに配列番号6、26、46、
および66からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR3配列のそれぞれを有
する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって、こ
のような抗体は、モノクローナル抗体のVH CDR配列およびVL CDR配列を含有
するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
から選択されるアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号8、28、48、および6
8からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、配列番号9、29、4
9、および69からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR3配列のそれぞれ
を含む重鎖可変領域と、配列番号10、30、50、および70からなる群から選択され
るアミノ酸配列を有するCDR1配列、配列番号11、31、51、および71からなる
群から選択されるアミノ酸配列を有するCDR2配列、ならびに配列番号12、32、5
2、および72からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるCDR3配列のそれぞれ
を有する軽鎖可変領域とを含む単離抗体またはその抗原結合性断片に関する。したがって
、このような抗体は、モノクローナル抗体のVH CDR配列およびVL CDR配列を
含有するが、これらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有しうる。
NAデータベースまたは公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖お
よび軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA配列は、ヒト生殖細胞系列の配列データベ
ースである「VBase」(インターネットのmrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能であ
る)のほか、それらの各々の内容が、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Kaba
t, E. A.ら、1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、U.S. Depa
rtment of Health and Human Services、NIH Publication第91-3242号; Tomlinson, I. M
.ら、1992 J. Mol. Biol. 227:776~798;およびCox, J. P. L.ら、1994 Eur. J Immunol
. 24:827~836においても見出すことができる。
体により使用されるフレームワーク配列、例えば、本発明のモノクローナル抗体により使
用されるコンセンサス配列および/またはフレームワーク配列と構造的に類似するフレー
ムワーク配列である。VH CDR1配列、VH CDR2配列、およびVH CDR3
配列、ならびにVL CDR1配列、VL CDR2配列、およびVL CDR3配列は
、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配
列と同一の配列を有するフレームワーク領域へとグラフトすることもでき、CDR配列は
、生殖細胞系列配列と比較して、1つまたは複数の突然変異を含有するフレームワーク領
域へとグラフトすることもできる。例えば、ある種の場合には、フレームワーク領域内の
残基を突然変異させて、抗体の抗原結合能力を維持または増強することが有益であると見
出されている(例えば、Queenらによる米国特許第5,530,101号;同第5,
585,089号;同第5,693,762号;および同第6,180,370号を参照
されたい)。本明細書で記載される抗体および抗原結合性断片をその上に構築する足場と
して活用されうるフレームワークは、VH1A、VH1B、VH3、Vk1、Vl2、お
よびVk2を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、さらなるフレームワークが
知られており、例えば、インターネットのvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_pos
ition=1:1上のvBaseデータベースにおいて見出すことができる。
から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に1、2、
3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有する
アミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号14、34、54、および74からな
る群から選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列のフレームワーク領域内に1、
2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有
するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む、単離Epo結合性抗体またはそれ
らの抗原結合性断片に関する。
域内、VH CDR2領域内、および/もしくはVH CDR3領域内、ならびに/また
はVL CDR1領域内、VL CDR2領域内、および/もしくはVL CDR3領域
内のアミノ酸残基を突然変異させて、これにより、対象の抗体の1つまたは複数の結合特
性(例えば、アフィニティー)を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはP
CR媒介突然変異誘発を実施して、突然変異を導入することができ、本明細書で記載され
、実施例でも提示される、in vitroアッセイまたはin vivoアッセイにお
いて、抗体結合性または他の対象の機能的特性に対する効果を査定することができる。保
存的修飾(上記で論じた)を導入することができる。突然変異は、アミノ酸の置換の場合
もあり、付加の場合もあり、欠失の場合もある。さらに、CDR領域内の、典型的には1
つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基も改変する。
なる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号1、21、41、もしくは61と比
較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミ
ノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR1領域、配列番号2、22、42、
および62からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号2、22、42、も
しくは62と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失
、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR2領域、配列番号3
、23、43、および63からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号3、
23、43、もしくは63と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換
、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR3領
域、配列番号4、24、44、および64からなる群から選択されるアミノ酸配列、また
は配列番号4、24、44、もしくは64と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所
のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するV
L CDR1領域、配列番号5、25、45、および65からなる群から選択されるアミ
ノ酸配列、または配列番号5、25、45、もしくは65と比較して、1、2、3、4、
もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸
配列を有するVL CDR2領域、ならびに配列番号6、26、46、および66からな
る群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号6、26、46、もしくは66と比較
して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ
酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR3領域を有する重鎖可変領域からなる
単離Epo結合性抗体またはそれらの抗原結合性断片を提供する。
なる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号7、27、47、もしくは67と比
較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミ
ノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR1領域、配列番号8、28、48、
および68からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号8、28、48、も
しくは68と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失
、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH CDR2領域、ならびに配
列番号9、29、49、および69からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列
番号 9、29、49、もしくは69と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のア
ミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVH
CDR3領域を有する重鎖可変領域と、配列番号10、30、50、および70からなる
群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号10、30 50、もしくは70と比較
して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ
酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR1領域、配列番号11、31、51、
および71からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号11、31、51、
もしくは71と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所のアミノ酸置換、アミノ酸欠
失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するVL CDR2領域、ならびに
配列番号12、32、52、および72からなる群から選択されるアミノ酸配列、または
配列番号12、32、52、もしくは72と比較して、1、2、3、4、もしくは5カ所
のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、もしくはアミノ酸付加を有するアミノ酸配列を有するV
L CDR3領域を有する軽鎖可変領域とからなる単離Epo結合性抗体またはそれらの
抗原結合性断片を提供する。
結果として得られるポリペプチドが、Epoに特異的に結合する少なくとも1つの結合
性領域を含む限りにおいて、多種多様な抗体/免疫グロブリンのフレームワークまたは足
場を援用することができる。このようなフレームワークまたは足場は、ヒト免疫グロブリ
ンまたはそれらの断片の5つの主要なイディオタイプを含み、好ましくはヒト化側面を有
する他の動物種の免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科動物において同定される単
一重鎖抗体などの単一重鎖抗体は、特に対象である。当業者により、新規のフレームワー
ク、足場、および断片が、発見および開発され続けている。
して、非免疫グロブリンベースの抗体を作り出すことに関する。それらが、標的のEpo
タンパク質に特異的な結合性領域を含む限りにおいて、公知または将来の非免疫グロブリ
ンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場を援用することができる。公知の非免疫グ
ロブリンフレームワークおよび非免疫グロブリン足場は、フィブロネクチン(Compo
und Therapeutics,Inc.、Waltham、MA)、アンキリン(
Molecular Partners AG、Zurich、Switzerland
)、ドメイン抗体(Domantis,Ltd.、Cambridge、MA;およびA
blynx nv、Zwijnaarde、Belgium)、リポカリン(Pieri
s Proteolab AG、Freising、Germany)、低分子モジュラ
ー免疫医薬(Trubion Pharmaceuticals Inc.、Seatt
le、WA)、マキシボディ(Avidia,Inc.、Mountain View、
CA)、プロテインA(Affibody AG、Sweden)、およびアフィリン(
ガンマ-クリスタリンまたはユビキチン)(Scil Proteins GmbH、H
alle、Germany)を含むがこれらに限定されない。
ブロネクチンの第10モジュール(10 Fn3ドメイン))に基づく。III型フィブ
ロネクチンドメインは、それら自体が互いに対してパックされてタンパク質のコアを形成
し、ベータ鎖を互いへと接続し、溶媒へと露出されるループもさらに含有する(CDRと
類似する)、2つのベータシートの間に分配された、7つまたは8つのベータ鎖を有する
。ベータシートサンドイッチの各エッジには、少なくとも3つのこのようなループがあり
、エッジは、ベータ鎖の方向に対して垂直なタンパク質の境界である(US6,818,
418を参照されたい)。全体的なフォールドは、ラクダおよびラマIgG内の抗原認識
単位全体を含む最小の機能的抗体断片である重鎖可変領域のフォールドと密接に関連する
が、これらのフィブロネクチンベースの足場は、免疫グロブリンではない。この構造のた
めに、非免疫グロブリン抗体は、性質およびアフィニティーが抗体の性質およびアフィニ
ティーと類似する抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、in vivoにおける抗
体のアフィニティー成熟の工程と類似する、in vitroにおけるループのランダム
化戦略およびシャフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチ
ンベースの分子は、標準的なクローニング法を使用して、分子のループ領域を本発明のC
DRで置きかえうる、足場として使用することができる。
なる標的への結合に使用しうる可変領域を保有する足場として使用することに基づく。ア
ンキリンリピートモジュールとは、2つのアンチパラレルのα-ヘリックスおよびβ-タ
ーンからなる、33アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディ
スプレイを使用することにより大部分が最適化される。
ドメインは、本来、タンパク質間相互作用に使用され、ヒトでは、250を超えるタンパ
ク質が、構造的にAドメインに基づく。アビマーは、アミノ酸リンカーを介して連結され
た多数の(2つ~10の)異なる「Aドメイン」単量体からなる。標的抗原に結合しうる
アビマーは、例えば、米国特許出願公開第20040175756号;同第200500
53973号;同第20050048512号;および同第20060008844号に
おいて記載されている方法を使用して創出することができる。
ンのうちの1つの足場に基づく3ヘリックスバンドルからなる、低分子の単純なタンパク
質である。プロテインAとは、細菌である黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)に
由来する表面タンパク質である。この足場ドメインは、それらのうちの13が、多数のリ
ガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを作り出す、ランダム化されている58ア
ミノ酸からなる(例えば、US5,831,012を参照されたい)。アフィボディ分子
は、抗体を模倣し、150kDaである抗体の分子量と比較して、分子量が6kDaであ
る。その小サイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は、抗体の結合部位と同
様である。
物である。アンチカリンは、通例、化学的に感受性の化合物または不溶性の化合物の生理
学的輸送または貯蔵に関与する、広範にわたる低分子の頑健なタンパク質群であるリポカ
リンに由来する。いくつかの天然リポカリンは、ヒト組織内またはヒト体液中で生じる。
タンパク質のアーキテクチャーは、リジッドフレームワークの上部の超可変ループを伴う
免疫グロブリンを連想させる。しかし、抗体またはそれらの組換え断片とは対照的に、リ
ポカリンは、単一の免疫グロブリンドメインよりかろうじて大きい、160~180アミ
ノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖からなる。結合性ポケットを構成する4つのループ
のセットは、顕著な構造可塑性を示し、様々な側鎖を許容する。したがって、異なる形状
の規定の標的分子を、高度なアフィニティーおよび特異性で認識するために、結合性部位
を独自の工程で再形成することができる。4つのループのセットを突然変異誘発すること
によりアンチカリンを開発するのには、リポカリンファミリーの1つのタンパク質である
、オオモンシロチョウ(Pieris brassicae)のビリン結合性タンパク質(BBP)が使用
されている。アンチカリンについて記載する特許出願の1つの例は、PCT公開第WO1
999/16873号にある。
にデザインされた低分子非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、
それらの各々が、異なるヒト由来の足場タンパク質に基づく2つのライブラリーから非常
に迅速に選択することができる。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質に対する
いかなる構造相同性も示さない。現在、2つのアフィリン足場が援用されており、それら
のうちの一方は、ヒト水晶体の構造タンパク質であるガンマクリスタリンであり、他方は
、「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。いずれのヒト足場も非常に小型
で、高度な熱安定性を示し、pH変化および変性剤に対してほぼ耐性である。この高度な
安定性は主に、タンパク質のベータシート構造の展開に起因する。ガンマクリスタリンに
由来するタンパク質の例は、WO2001/04144において記載されており、「ユビ
キチン様」タンパク質の例は、WO2004/106368において記載されている。
二次構造である、タンパク質のベータ-ヘアピン二次構造を模倣する、中程度のサイズの
環状ペプチド様分子(分子量:1~2kDa)である。
またはヒト化抗体と比較して、本発明のヒトEpo結合性抗体は、ヒト対象へと投与され
た場合の抗原性がさらに低減されている。
ラマ種(アルパカ(Lama pacos)、ラマ(Lama glama)、およびビクーニャ(Lama vic
ugna))などの新世界メンバー含む、ラクダおよびヒトコブラクダ(dromedary)(フタ
コブラクダ(Camelus bactrianus)およびヒトコブラクダ(Camelus dromaderius))フ
ァミリーのメンバーから得られる抗体タンパク質は、サイズ、構造的複雑性、およびヒト
対象に対する抗原性に関して特徴付けられている。天然で見出されるこのファミリーの哺
乳動物に由来するある種のIgG抗体は、軽鎖を欠き、したがって、他の動物に由来する
抗体の場合の、2つの重鎖および2つの軽鎖を有する、典型的な4つの鎖の四次構造とは
構造的に異なっている。PCT/EP93/02214(1994年3月3日に公表され
たWO94/04678)を参照されたい。
、標的に対して高いアフィニティーを有する低分子タンパク質をもたらすことから、「ラ
クダ科動物ナノボディ」として公知の低分子量抗体由来タンパク質を結果としてもたらす
遺伝子操作により得ることができる。1998年6月2日に取得された米国特許第5,7
59,808号を参照されたい。また、Stijlemans, B.ら、2004 J Biol Chem 279:1256
~1261; Dumoulin, M.ら、2003 Nature 424:783~788; Pleschberger, M.ら、2003 Bioco
njugate Chem 14:440~448; Cortez-Retamozo, V.ら、2002 Int J Cancer 89:456~62;
およびLauwereys, M.ら、1998 EMBO J 17:3512~3520も参照されたい。ラクダ科動物抗体
および抗体断片の操作ライブラリーは、例えば、Ablynx、Ghent、Belgi
umから市販されている。非ヒト由来の他の抗体と同様に、ラクダ科動物抗体のアミノ酸
配列は、ヒト配列により酷似する配列を得るように、組換えにより改変することができる
、すなわち、ナノボディは、「ヒト化」することができる。したがって、ヒトに対するラ
クダ科動物抗体の天然の小さな抗原性を、さらに低減することができる。
パク質の物理的直径は、数ナノメートルに過ぎない。サイズが小さいことの1つの帰結は
、大型の抗体タンパク質には機能的に不可視である抗原性部位に結合するラクダ科動物ナ
ノボディの能力である、すなわち、ラクダ科動物ナノボディは、古典的な免疫学的技法を
使用するこれ以外の形では隠蔽されたままの抗原を検出する試薬として有用であり、可能
な治療剤として有用である。したがって、サイズが小さいことのさらに別の帰結は、ラク
ダ科動物ナノボディが、標的タンパク質のグルーブ内または狭小なクレフト内の特異的部
位に結合することの結果として、標的タンパク質を阻害することが可能であり、よって、
古典的な抗体の機能よりも、古典的な低分子量の薬物の機能により酷似する能力において
用いられうることである。
よびタンパク質分解性消化に対して安定的であり、抗原性が小さいラクダ科動物ナノボデ
ィを結果としてもたらす。別の帰結は、ラクダ科動物ナノボディが、循環系から組織へと
たやすく移動し、血液脳関門もなお越え、神経組織に影響を及ぼす障害も処置しうること
である。ナノボディはさらに、血液脳関門を越える薬物輸送も容易としうる。2004年
8月19日に公表された米国特許出願第20040161738号を参照されたい。これ
らの特色を、ヒトに対する抗原性が小さいことと組み合わせることにより、大きな治療的
可能性が指し示される。さらに、これらの分子は、大腸菌(E. coli)などの原核細胞内
で完全に発現させることができ、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現させ
、機能的である。
物抗体またはラクダ科動物ナノボディである。本明細書のある種の実施形態では、ラクダ
科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディは、天然ではラクダ科動物において産生される
、すなわち、他の抗体について本明細書で記載される技法を使用する、Epoまたはその
ペプチド断片による免疫化の後で、ラクダ科動物により産生される。代替的に、Epo結
合性ラクダ科動物ナノボディは、操作もされる、すなわち、例えば、本明細書の実施例に
おいて記載されている、標的としてのEpoを伴うパニング手順を使用する、適切に突然
変異誘発されたラクダ科動物ナノボディタンパク質を提示するファージライブラリーから
の選択によっても作製される。操作されたナノボディはさらに、遺伝子操作により、レシ
ピエント対象における半減期が、45分間~2週間となるようにカスタマイズすることも
できる。具体的な実施形態では、ラクダ科動物抗体またはラクダ科動物ナノボディを、例
えば、WO1994/004678において記載されている通り、本発明のヒト抗体の重
鎖または軽鎖のCDR配列を、ナノボディまたは単一ドメイン抗体フレームワーク配列へ
とグラフトすることにより得る。
別の態様では、本発明は、本発明のEpo結合性抗体またはその断片を含む二特異性分
子または多特異性分子を特色とする。本発明の抗体またはその抗原結合性領域は、少なく
とも2つの異なる結合性部位または標的分子に結合する二特異性分子を作り出すように誘
導体化することもでき、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質(例え
ば、受容体に対する別の抗体またはリガンド)へと連結することもできる。本発明の抗体
は実際、3つ以上の異なる結合性部位および/または標的分子に結合する多特異性分子を
作り出すように誘導体化することもでき、他の2つ以上の機能的分子へと連結することも
でき、このような多特異性分子はまた、本明細書で使用される「二特異性分子」という用
語により包含されることも意図される。本発明の二特異性分子を創出するには、本発明の
抗体を、二特異性分子が結果として得られるように、別の抗体、抗体断片、ペプチド、ま
たは結合性模倣体など、1つまたは複数の他の結合性分子へと機能的に連結する(例えば
、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合により、またはこれら以外の形で
)ことができる。
の標的エピトープに対する第2の結合特異性を含む二特異性分子を含む。例えば、第2の
標的エピトープは、第1の標的エピトープと異なる、Epoの別のエピトープである。
よび第2の標的エピトープに加えて、第3の結合特異性もさらに含みうる。
b’、F(ab’)2、Fv、または単鎖Fvを含む、少なくとも1つの抗体またはその
抗体断片を含む。抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはLadnerら、米国
特許第4,946,778号において記載されている、Fvもしくは単鎖構築物など、そ
の任意の最小断片でありうる。
ンカーにより接続されたVHドメインおよびVLドメインを単一のポリペプチド鎖上で発
現させた、二価の二特異性分子である。VHドメインおよびVLドメインは、別の鎖の相
補的なドメインと対合し、これにより、2つの抗原結合性部位を創出する(例えば、Holl
igerら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444~6448; Poljakら、1994 Structure
2:1121~1123を参照されたい)。ダイアボディは、VHA-VLBおよびVHB-VLA
構造(VH-VL立体配置)、またはVLA-VHBおよびVLB-VHA構造(VL-
VH立体配置)を伴う2つのポリペプチド鎖を、同じ細胞内で発現させることにより作製
することができる。ダイアボディの大半は、細菌内の可溶性形態で発現させることができ
る。単鎖ダイアボディ(scDb)は、2つのダイアボディ形成ポリペプチド鎖を、約1
5アミノ酸残基のリンカーで接続することにより作製する(HolligerおよびWinter、1997
Cancer Immunol. Immunother.、45(3~4):128~30; Wuら、1996 Immunotechnology、2
(1):21~36を参照されたい)。scDbは、細菌内の可溶性で活性の単量体形態で発現
させることができる(HolligerおよびWinter、1997 Cancer Immunol. Immunother.、45(
34):128~30; Wuら、1996 Immunotechnology、2(1):21~36; PluckthunおよびPack、1
997 Immunotechnology、3(2):83~105; Ridgwayら、1996 Protein Eng.、9(7):617~
21を参照されたい)。ダイアボディをFcへと融合させて、「ジダイアボディ」を作り出
すことができる(Luら、2004 J. Biol. Chem.、279(4):2856~65を参照されたい)。
モノクローナル抗体、およびヒト化モノクローナル抗体である。
ンジュゲートさせることにより調製することができる。例えば、二特異性分子の各結合特
異性は、個別に作り出し、次いで、互いとコンジュゲートさせることができる。結合特異
性がタンパク質またはペプチドである場合は、様々なカップリング剤または架橋剤を、共
有結合的コンジュゲーションに使用することができる。架橋剤の例は、プロテインA、カ
ルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5
,5’-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド
(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(S
PDP)、およびスルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン
-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)を含む(例えば、Karpovskyら、1984 J. E
xp. Med. 160:1686; Liu, MAら、1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照され
たい)。他の方法は、Paulus、1985 Behring Ins. Mitt. 78号、118~132; Brennanら、1
985 Science 229:81~83;およびGlennieら、1987 J. Immunol. 139:2367~2375において
記載されている方法を含む。コンジュゲート剤は、SATAおよびスルホ-SMCCであ
り、いずれも、Pierce Chemical Co.(Rockford、IL)か
ら入手可能である。
ドリル結合させることによりコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、
コンジュゲーションの前に、奇数のスルフヒドリル残基、例えば、1つのスルフヒドリル
残基を含有するように、ヒンジ領域を修飾する。
現およびアセンブルさせることができる。この方法は、二特異性分子が、mAb×mAb
融合タンパク質、mAb×Fab融合タンパク質、Fab×F(ab’)2融合タンパク
質、またはリガンド×Fab融合タンパク質である場合に、特に有用である。本発明の二
特異性分子は、1つの単鎖抗体および結合決定基を含む単鎖分子の場合もあり、2つの結
合決定基を含む単鎖二特異性分子の場合もある。二特異性分子は、少なくとも2つの単鎖
分子を含みうる。二特異性分子を調製する方法については、例えば、米国特許第5,26
0,203号;米国特許第5,455,030号;米国特許第4,881,175号;米
国特許第5,132,405号;米国特許第5,091,513号;米国特許第5,47
6,786号;米国特許第5,013,653号;米国特許第5,258,498号;お
よび米国特許第5,482,858号において記載されている。
(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(REA)、FACS解析、バイオアッセイ(例
えば、成長阻害アッセイ)、またはウェスタンブロットアッセイにより確認することがで
きる。これらのアッセイの各々では一般に、対象の複合体に特異的な、標識された試薬(
例えば、抗体)を援用することにより、特に対象となるタンパク質-抗体間複合体の存在
が検出される。
あるかまたは異なる抗原結合性部分を含む、多価化合物を提供する。抗原結合性部分は、
タンパク質の融合または共有結合的連結もしくは非共有結合的連結を介して、併せて連結
することができる。代替的に、二特異性分子のための連結法も記載されている。四価化合
物は、例えば、本発明の抗体を、本発明の抗体の定常領域に結合する抗体、例えば、Fc
領域またはヒンジ領域と架橋することにより得ることができる。
80B1において記載されている。五量体化モジュールについては、例えば、WO199
8/018943において記載されている。
本発明は、in vivoにおける半減期を延長した、Epoタンパク質に特異的に結
合する抗体を提供する。
)による分解、および免疫原性応答(例えば、抗体によるタンパク質の中和およびマクロ
ファージおよび樹状細胞による取込み)など、多くの因子が、in vivoにおけるタ
ンパク質の半減期に影響を及ぼしうる。様々な戦略を使用して、本発明の抗体の半減期を
延長することができる。例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、reCODE P
EG、抗体足場、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、アル
ブミン結合性リガンド、および炭水化物シールドとの化学的連結により、アルブミン、I
gG、FcRn、およびトランスフェリンなどの血清タンパク質に結合するタンパク質と
の遺伝子融合により、ナノボディ、Fab、DARPin、アビマー、アフィボディ、お
よびアンチカリンなど、血清タンパク質に結合する他の結合部分とカップリングする(遺
伝子的または化学的に)ことにより、rPEG、アルブミン、アルブミンのドメイン、ア
ルブミン結合性タンパク質、およびFcとの遺伝子融合により、またはナノ担体、徐放製
剤、もしくは医療デバイスへの組込みにより、本発明の抗体の半減期を延長することがで
きる。
リコール(PEG)など、不活性のポリマー分子を、PEGの、抗体のN末端もしくはC
末端への部位特異的コンジュゲーションを介して、またはリシン残基上に存在するイプシ
ロン-アミノ基を介して、多官能性リンカーを伴うかまたは多官能性リンカーを伴わない
、抗体またはそれらの断片へと付着することができる。抗体をPEG化するには、抗体ま
たはその断片を、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのPEGと、1つ
または複数のPEG基が抗体または抗体断片に付着する条件下で反応させることが典型的
である。PEG化は、反応性PEG分子(または類似する反応性の水溶性ポリマー)との
アシル化反応またはアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用される
「ポリエチレングリコール」および「PEG」という用語は、モノ(C1~C10)アル
コキシ-ポリエチレングリコールもしくはアリールオキシ-ポリエチレングリコールまた
はポリエチレングリコール-マレイミドなど、他のタンパク質を誘導体化するのに使用さ
れているPEGの形態のうちのいずれかを包含することを意図するものである。ある種の
実施形態では、PEG化される抗体は、脱グリコシル化抗体である。直鎖状ポリマーまた
は分枝状ポリマーの誘導体化であって、生物学的活性の喪失を結果として最小とする誘導
体化が、使用されるであろう。コンジュゲーションの程度を、SDS-PAGEおよび質
量分析により緊密にモニタリングして、PEG分子の抗体への適正なコンジュゲーション
を確認することができる。反応しなかったPEGは、サイズ除外クロマトグラフィーまた
はイオン交換クロマトグラフィーにより、抗体-PEGコンジュゲートから分離すること
ができる。PEG誘導体化抗体は、当業者に周知の方法を使用して、例えば、本明細書で
記載されるイムノアッセイにより、結合活性ならびにin vivoにおける有効性につ
いて調べることができる。当技術分野では、タンパク質をPEG化する方法が知られてお
り、本発明の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるEP0
154316およびIshikawaらによるEP0401384を参照されたい。
を介して、化学的に特定された側鎖を、生合成タンパク質へと組み込む、再構成化学的直
交性直接操作技術(reconstituting chemically orthogonal directed engineering tech
nology)(ReCODE PEG)を含む。この技術は、30を超える新たなアミノ酸の
、大腸菌(E. coli)細胞内、酵母細胞内、および哺乳動物細胞内の生合成タンパク質へ
の組込みを可能とする。tRNAは、非天然アミノ酸を、アンバーコドンが配置される任
意の位置へと組み込み、終止アンバーコドンから、化学的に特定されたアミノ酸の組込み
シグナルを伝達するコドンへと転換する。
。この技術は、300~600アミノ酸の非構造化タンパク質テールを、既存の医薬用タ
ンパク質へと遺伝子融合させることを伴う。このような非構造化タンパク質鎖の見かけの
分子量は、その実際の分子量の約15倍であるため、タンパク質の血清半減期は、大きく
増大する。化学的コンジュゲーションおよび再精製を要求する従来のPEG化とは対照的
に、製造工程は大きく簡略化され、生成物は、均質である。
命を延長し、治療用ペプチドおよび治療用タンパク質の安定性を改善する、別の技術であ
る。PSAとは、シアル酸(糖)のポリマーである。タンパク質および治療用ペプチドの
薬物送達に使用される場合、コンジュゲーション時に、ポリシアル酸は、保護的微小環境
をもたらす。これは、循環内の治療用タンパク質の活性寿命を延長し、それが免疫系によ
り認識されることを防止する。PSAポリマーは、天然では、ヒト体内で見出される。P
SAは、数百万年にわたり、それらの壁をPSAでコーティングするように進化したある
種の細菌により採用された。次いで、これらの天然でポリシアリル化した細菌は、分子的
模倣により、体内の防御系を失効化することが可能となった。自然の究極のステルス技術
であるPSAは、このような細菌から、大量に、かつ、所定の物理的特徴を伴って、容易
に作製することができる。細菌PSAは、ヒト体内ではPSAと化学的に同一であるので
、タンパク質へとカップリングさせた場合でもなお、完全に非免疫原性である。
を含む。HESとは、蝋状トウモロコシデンプンに由来する、修飾された天然ポリマーで
あり、体内の酵素により代謝されうる。HES溶液は通例、血液量不足を補い、血液のレ
オロジー特性を改善するために投与される。抗体のHES化は、分子の安定性を増大させ
ることのほか、腎クリアランスを低減することによっても、循環半減期の延長を可能とし
、生物学的活性の増大を結果としてもたらす。HESの分子量など、異なるパラメータを
改変することにより、広範にわたるHES抗体コンジュゲートをカスタマイズすることが
できる。
(すなわち、置換、挿入、または欠失)を、IgG定常ドメインまたはそのFcRn結合
性断片(好ましくはFcドメイン断片またはヒンジFcドメイン断片)へと導入しても作
り出すことができる。例えば、国際特許公開第WO98/23289号、国際特許公開第
WO97/34631号;および米国特許第6,277,375号を参照されたい。
in vivoにおける半減期を延長するために、抗体を、アルブミン(例えば、ヒト血
清アルブミン;HSA)へとコンジュゲートさせることもできる。当技術分野では、技法
が周知であり、例えば、国際特許公開第WO93/15199号、同第WO93/152
00号、および同WO01/77137号;ならびに欧州特許第EP0413622号を
参照されたい。加えて、上記で記載した二特異性抗体の文脈では、抗体の特異性は、抗体
の1つの結合性ドメインが、Epoに結合するのに対し、抗体の第2の結合性ドメインは
、血清アルブミン、好ましくは、HSAに結合するようにデザインすることもできる。
ナノボディ、フィブロネクチンベースの結合剤、および他の抗体またはタンパク質におい
てとりわけ有用である。
本発明は、融合タンパク質を作り出すように、異種タンパク質または異種ポリペプチド
へと(またはその断片、好ましくは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30
、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80
、少なくとも90、または少なくとも100アミノ酸のポリペプチドへと)、組換えによ
り融合させるかまたは化学的にコンジュゲートさせた(共有結合的コンジュゲーションお
よび非共有結合的コンジュゲーションの両方を含む)、Epoタンパク質に特異的に結合
する抗体またはそれらの断片を提供する。特に、本発明は、本明細書で記載される抗体の
抗原結合性断片(例えば、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、VHド
メイン、VH CDR、VLドメイン、またはVL CDR)と、異種タンパク質、異種
ポリペプチド、または異種ペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。当技術分野では
、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを、抗体または抗体断片と融合またはコン
ジュゲートさせる方法が知られている。例えば、米国特許第5,336,603号、同第
5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5
,447,851号、および同第5,112,946号;欧州特許第EP0307434
および同第EP0367166号;国際特許公開第WO96/04388号および同第W
O91/06570号;Ashkenaziら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535~10
539; Zhengら、1995、J. Immunol. 154:5590~5600;およびVilら、1992、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 89:11337~11341を参照されたい。
ャフリング、および/またはコドンシャフリング(まとめて、「DNAシャフリング」と
称する)の技法を介して作り出すことができる。DNAシャフリングを援用して、本発明
の抗体またはそれらの断片の活性を改変する(例えば、アフィニティーが大きく、解離速
度が小さい抗体またはそれらの断片)ことができる。一般に、米国特許第5,605,7
93号、同第5,811,238号、同第5,830,721号、同第5,834,25
2号、および同第5,837,458号;Pattenら、1997、Curr. Opinion Biotechnol.
8:724~33; Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16(2):76~82; Hanssonら、1999、J
. Mol. Biol. 287:265~76;ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、Biotechniques 24(2
):308~313(これらの特許および刊行物の各々は、参照によりそれらの全体において本
明細書に組み込まれる)を参照されたい。抗体もしくはそれらの断片、またはコードされ
る抗体もしくはそれらの断片は、組換えの前に、エラープローンPCRによるランダム突
然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法にかけることにより改変するこ
とができる。Epoタンパク質に特異的に結合する抗体またはその断片をコードするポリ
ヌクレオチドは、1つまたは複数の異種分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、区間、
一部、ドメイン、断片などで組み換えることができる。
と融合させることもできる。好ましい実施形態では、マーカーのアミノ酸配列は、それら
のうちの多くが市販されている中でとりわけ、pQEベクター(QIAGEN,Inc.
、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)にお
いて提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。Gentzら、1989、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86:821~824において記載されている通り、例えば、ヘキサヒス
チジンは、融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグは、
インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ(Wilsonら、1984、Cell
37:767)に対応するヘマグルチニン(「HA」)タグ、および「フラッグ」タグを含む
がこれらに限定されない。
とコンジュゲートさせる。このような抗体は、疾患または障害の発生、発症、進行、およ
び/または重症度を、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床検査手順の一部とし
てモニタリングまたは予後診断するのに有用でありうる。このような診断および検出は、
抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダ
ーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどであるがこれらに限定されない多様な酵素
;ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなどであるがこれらに限定さ
れない補欠分子族;ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイ
ン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、また
はフィコエリトリンなどであるがこれらに限定されない蛍光材料;ルミノールなどである
がこれらに限定されない発光材料;ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンな
どであるがこれらに限定されない生物発光材料;ヨウ素(131I、125I、123I
、および121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウ
ム(115In、113In、112In、および111In)、テクネシウム(99T
c)、タリウム(201Tl)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103
Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153
Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、9
0Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68G
e、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54
Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどであるがこれらに限定されない放
射性材料;ならびに多様なポジトロン断層法を使用するポジトロン放出金属および非放射
性の常磁性金属イオンを含むがこれらに限定されない検出可能な物質へとカップリングす
ることにより達成することができる。
に包含する。抗体またはその断片は、細胞毒素、例えば、細胞増殖抑制剤または殺細胞剤
、治療剤または放射性金属イオン、例えば、アルファ放射体などの治療用部分へとコンジ
ュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害剤は、細胞に有害な任意の薬剤を
含む。
部分へとコンジュゲートさせることもできる。治療用部分または薬物部分は、古典的化学
的治療剤に限定されるとは見なされないものとする。例えば、薬物部分は、所望の生物学
的活性を保有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドでありうる。このようなタ
ンパク質は、例えば、アブリン、リシンA、シュードモナス属外毒素、コレラ毒素、また
はジフテリア毒素などの毒素;腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェ
ロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトー
シス剤、抗血管新生剤;または例えば、リンホカインなどの生体応答修飾剤などのタンパ
ク質を含みうる。
n、131LU、131Y、131Ho、131Smを含むがこれらに限定されない放射
性金属イオンを、ポリペプチドへとコンジュゲートするのに有用な大環状キレート化剤な
どの治療用部分へとコンジュゲートさせることもできる。ある種の実施形態では、大環状
キレート化剤は、リンカー分子を介して抗体へと付着させうる、1,4,7,10-テト
ラアザシクロドデカン-N,N’,N’’,N’’’-テトラ酢酸(DOTA)である。
当技術分野では、このようなリンカー分子が一般に公知であり、各々が参照によりそれら
の全体において組み込まれる、Denardoら、1998、Clin Cancer Res. 4(10):2483~90;
Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10(4):553~7;およびZimmermanら、1999、Nucl
. Med. Biol. 26(8):943~50において記載されている。
nら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、M
onoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、243~56頁(Alan R. Li
ss, Inc. 1985); Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug
Delivery(2版)、Robinsonら(編)、623~53頁(Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe
、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclo
nal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、475~
506頁(1985); 「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Us
e Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer
Detection And Therapy、Baldwinら(編)、303~16頁(Academic Press 1985);およ
びThorpeら、1982、Immunol. Rev. 62:119~58を参照されたい。
させることもできる。このような固体支持体は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミ
ド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンを含むがこれらに
限定されない。
抗体をコードする核酸
本発明は、上記で記載したEpo結合性抗体鎖のセグメントまたはドメインを含むポリ
ペプチドをコードする、実質的に精製された核酸分子を提供する。本発明の核酸のいくつ
かは、配列番号13、33、53、もしくは73に示される重鎖可変領域をコードするヌ
クレオチド配列、および/または配列番号14、34、54、もしくは74に示される軽
鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、核酸分子は、
表1において同定される核酸分子である。本発明の他のいくつかの核酸分子は、表1にお
いて同定される核酸分子のヌクレオチド配列と実質的に(例えば、少なくとも65、80
%、95%、または99%)同一なヌクレオチド配列を含む。適切な発現ベクターから発
現させるとき、これらのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、Epo抗
原結合能を呈示することが可能である。
も1つのCDR領域、および、通例3つ全てのCDR領域をコードするポリヌクレオチド
も提供される。他のいくつかのポリヌクレオチドは、上記で示したEpo結合性抗体の重
鎖および/または軽鎖の可変領域配列の全てまたは実質的に全てをコードする。コードの
縮重性のために、様々な核酸配列は、免疫グロブリンアミノ酸配列の各々をコードするで
あろう。
核酸配列のうちのいくつかは、配列番号15、35、55、または75に示される成熟重
鎖配列と実質的に(例えば、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97
%、98%、または99%)同一な成熟重鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。他の
いくつかの核酸配列は、配列番号16、36、56、または76に示される成熟軽鎖配列
と実質的に(例えば、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、9
8%、または99%)同一な成熟軽鎖配列をコードするヌクレオチドを含む。
の結合性断片をコードする既存の配列(例えば、下記の実施例で記載される配列)に対す
るPCRによる突然変異誘発により作製することができる。核酸の直接的な化学合成は、
Narangら、1979、Meth. Enzymol. 68:90によるホスホトリエステル法;Brownら、Meth. E
nzymol. 68:109、1979によるホスホジエステル法;Beaucageら、Tetra. Lett., 22:1859
、1981によるジエチルホスホルアミダイト法;および米国特許第4,458,066号に
よる固体支持体法など、当技術分野で公知の方法により達成することができる。PCRに
よる、突然変異の、ポリヌクレオチド配列への導入は、例えば、PCR Technology: Princi
ples and Applications for DNA Amplification、H.A. Erlich(編)、Freeman Press、N
Y、NY、1992;PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Innisら(編)、
Academic Press、San Diego、CA、1990; Mattilaら、Nucleic Acids Res. 19:967、1991
;およびEckertら、PCR Methods and Applications 1:17、1991において記載されている
通りに実施することができる。
び宿主細胞も提供される。多様な発現ベクターを、援用して、Epo結合性抗体鎖または
結合性断片をコードするポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスベースの
発現ベクターおよび非ウイルス発現ベクターのいずれを使用しても、哺乳動物宿主細胞内
で抗体を作製することができる。非ウイルスベクターおよび非ウイルス系は、プラスミド
、典型的に、タンパク質またはRNAを発現させるための発現カセットを伴うエピソーム
ベクター、およびヒト人工染色体を含む(例えば、Harringtonら、Nat Genet 15:345、19
97を参照されたい)。例えば、哺乳動物(例えば、ヒト)細胞内のEpo結合性ポリヌク
レオチドおよびEpo結合性ポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターは、pTh
ioHis A、pThioHis B、およびpThioHis C、pcDNA3.
1/His、pEBVHis A、pEBVHis B、およびpEBVHis C(I
nvitrogen、San Diego、CA)、MPSVベクター、ならびに他のタ
ンパク質を発現させるための、当技術分野で公知の他の多数のベクターを含む。有用なウ
イルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ
イルスに基づくベクター、SV40に基づくベクター、パピローマウイルス、HBPエプ
スタインバーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林熱ウイルス(
SFV)を含む。Brentら、前出; Smith、Annu. Rev. Microbiol. 49:807、1995;および
Rosenfeldら、Cell 68:143、1992を参照されたい。
る。発現ベクターは、Epo結合性抗体鎖または断片をコードするポリヌクレオチドに作
動可能に連結されたプロモーターおよび他の調節配列(例えば、エンハンサー)を含有す
ることが典型的である。いくつかの実施形態では、誘導条件下を除き、挿入された配列の
発現を防止するのに、誘導的プロモーターを援用する。誘導的プロモーターは、例えば、
アラビノース、lacZ、メタロチオネインプロモーター、または熱ショックプロモータ
ーを含む。形質転換された生物の培養物は、それらの発現産物が宿主細胞により良好に許
容されるコード配列の集団にバイアスをかけずに、非誘導条件下で増殖させることができ
る。プロモーターに加えて、他の調節的エレメントもまた、Epo結合性抗体鎖または断
片の効率的な発現に要求または所望される可能性がある。これらのエレメントは、ATG
開始コドンおよび隣接のリボソーム結合性部位または他の配列を典型的に含む。加えて、
発現の効率は、使用される細胞系に適するエンハンサーを組み入れることにより増強する
こともできる(例えば、Scharfら、Results Probl. Cell Differ. 20:125、1994;および
Bittnerら、Meth. Enzymol., 153:516、1987を参照されたい)。例えば、SV40エンハ
ンサーまたはCMVエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させるこ
とができる。
ドとの融合タンパク質を形成するように、分泌シグナル配列の位置ももたらしうる。挿入
されたEpo結合性抗体配列は、ベクター内に組み入れる前に、シグナル配列へと連結す
ることが多い。Epo結合性抗体の軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインをコードす
る配列を受容するのに使用されるベクターは、場合によってまた、定常領域またはそれら
の一部もコードする。このようなベクターは、定常領域との融合タンパク質としての可変
領域の発現を可能とし、これにより、インタクトな抗体またはそれらの断片の作製をもた
らす。このような定常領域は、ヒト定常領域であることが典型的である。
あり、真核細胞の場合もある。大腸菌(E. coli)は、本発明のポリヌクレオチドをクロ
ーニングし、発現させるのに有用な1つの原核生物宿主である。使用に適する他の微生物
宿主は、枯草菌(Bacillus subtilis)などの桿菌、およびサルモネラ(Salmonella)属
種、セラチア(Serratia)属種、および多様なシュードモナス(Pseudomonas)属種など
、他の腸内細菌科を含む。これらの原核生物宿主内ではまた、典型的に、宿主細胞と適合
性の発現制御配列(例えば、複製起点)を含有する発現ベクターも作製することができる
。加えて、ラクトースプロモーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、ベー
タ-ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダに由来するプロモーター系など
、任意の数の、様々な周知のプロモーターも存在する。プロモーターは、任意選択で、オ
ペレーター配列により発現を制御することが典型的であるが、転写および翻訳を開始して
終結させるためのリボソーム結合性部位配列なども有する。本発明のEpo結合性ポリペ
プチドを発現させるのに、酵母など、他の微生物もまた援用することができる。また、バ
キュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞も使用することができる。
製するのに、哺乳動物宿主細胞を使用する。例えば、哺乳動物宿主細胞は、内因性免疫グ
ロブリン遺伝子を発現させるハイブリドーマ細胞系(例えば、実施例で記載される、1D
6.C9骨髄腫ハイブリドーマクローン)の場合もあり、外因性発現ベクターを保有する
哺乳動物細胞系(例えば、下記で例示されるSP2/0骨髄腫細胞)の場合もある。哺乳
動物宿主細胞は、任意の正常非不死化動物細胞または正常不死化動物細胞もしくは非正常
不死化動物細胞またはヒト細胞を含む。例えば、CHO細胞系、多様なCos細胞系、H
eLa細胞、骨髄腫細胞系、形質転換B細胞、およびハイブリドーマを含む、インタクト
な免疫グロブリンを分泌することが可能な多数の適切な宿主細胞系が開発されている。ポ
リペプチドを発現させるための、哺乳動物組織細胞培養物の使用については、例えば、Wi
nnacker、FROM GENES TO CLONES、VCH Publishers、N.Y.、N.Y.、1987において一般に論
じられている。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、お
よびエンハンサーなどの発現制御配列(例えば、Queenら、Immunol. Rev. 89:49~68、19
86を参照されたい)、ならびにリボソーム結合性部位、RNAスプライス部位、ポリアデ
ニル化部位、および転写ターミネーター配列などの、必要なプロセシング情報部位を含み
うる。これらの発現ベクターは通例、哺乳動物遺伝子に由来するプロモーターまたは哺乳
動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的プロモ
ーター、細胞型特異的プロモーター、段階特異的プロモーター、および/またはモジュレ
ート可能プロモーターもしくは調節可能プロモーターでありうる。有用なプロモーターは
、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサ
メタゾン誘導性MMTVプロモーター、SV40プロモーター、MRP polIIIプ
ロモーター、構成的MPSVプロモーター、テトラサイクリン誘導性CMVプロモーター
(ヒト即初期CMVプロモーターなど)、構成的CMVプロモーター、および当技術分野
で公知のプロモーター-エンハンサーの組合せを含むがこれらに限定されない。
類に応じて変化する。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に原核細胞に
活用されるのに対し、リン酸カルシウム処理または電気穿孔は、他の細胞宿主に使用する
ことができる(一般に、Sambrookら、前出を参照されたい)。他の方法は、例えば、電気
穿孔、リン酸カルシウム処理、リポソーム媒介型形質転換、注射およびマイクロインジェ
クション、遺伝子銃法、ウィロソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン:核酸コンジュ
ゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、ヘルペスウイルス構造タンパク質であるVP
22との融合体(ElliotおよびO'Hare、Cell 88:223、1997)、DNAの薬剤増強型取込
み、およびex vivoにおける形質導入を含む。組換えタンパク質の長期にわたる高
収率作製のためには、安定的発現が所望されることが多い。例えば、Epo結合性抗体鎖
または結合性断片を安定的に発現させる細胞系は、ウイルス複製起点または内因性発現エ
レメント、および選択マーカー遺伝子を含有する、本発明の発現ベクターを使用して調製
することができる。ベクターを導入した後、細胞は、強化培地中で1~2日間にわたり成
長させてから、選択培地へと切り替えることができる。選択マーカーの目的は、選択に対
する耐性を付与し、その存在により細胞の成長を可能とし、これにより、導入された配列
を選択培地中で発現させることに成功することである。耐性で安定的にトランスフェクト
された細胞は、細胞型に適する組織培養法を使用して増殖させることができる。
モノクローナル抗体(mAb)は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Kohlerおよ
びMilstein、1975 Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含
む様々な技法により作製することができる。例えば、Bリンパ球のウイルス性形質転換ま
たは発がん性形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技法を援用する
ことができる。
む。マウスにおけるハイブリドーマの作製は、十分に確立された手順である。当技術分野
では、融合体のための免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコールおよび
免疫化法が知られている。融合パートナー(例えば、マウス骨髄腫細胞)および融合手順
もまた公知である。
クローナル抗体の配列に基づき調製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンを
コードするDNAは、対象のマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学の技法を
使用して、非マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含有するように操作すること
ができる。例えば、キメラ抗体を創出するには、当技術分野で公知の方法(例えば、Ca
billyらによる米国特許第4,816,567号を参照されたい)を使用して、マウ
ス可変領域を、ヒト定常領域へと連結することができる。ヒト化抗体を創出するには、当
技術分野で公知の方法を使用して、マウスCDR領域を、ヒトフレームワークへと挿入す
ることができる。例えば、Winterによる米国特許第5225539号;ならびにQ
ueenらによる米国特許第5530101号;同第5585089号;同第56937
62号;および同第6180370号を参照されたい。
向するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウスの系ではなく、ヒト免疫系の一部を
保有する、トランスジェニックマウスまたはトランスクロモソームマウスを使用して作り
出すことができる。これらのトランスジェニックマウスおよびトランスクロモソームマウ
スは、本明細書で、それぞれ、HuMAbマウスおよびKMマウスと称するマウスを含み
、本明細書ではまとめて、「ヒトIgマウス」と称する。
および内因性κ鎖遺伝子座を不活化する標的化突然変異と併せて、再配列されていないヒ
ト重(μおよびγ)鎖免疫グロブリン配列およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードする
ヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する(例えば、Lonbergら、1994 Nature
368(6474): 856~859を参照されたい)。したがって、マウスは、マウスIgMまたは
κの発現の低減を呈示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖トランス遺
伝子は、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を経て、高アフィニティーのヒトIg
Gκモノクローナル抗体を作り出す(Lonberg, N.ら、1994 前出; Lonberg, N.、1994 Ha
ndbook of Experimental Pharmacology 113:49~101において総説される; Lonberg, N.お
よびHuszar, D.、1995 Intern. Rev. Immunol. 13: 65~93;ならびにHarding, F.および
Lonberg, N.、1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536~546)。HuMAbマウスの調製お
よび使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノムの修飾は、それらの全ての
内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に具体的に組み込まれる、Taylor, L.
ら、1992 Nucleic Acids Research 20:6287~6295; Chen, J.ら、1993 International Im
munology 5: 647~656; Tuaillonら、1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720~3724;
Choiら、1993 Nature Genetics 4:117~123; Chen, J.ら、1993 EMBO J. 12: 821~830;
Tuaillonら、1994 J. Immunol. 152:2912~2920; Taylor, L.ら、1994 International I
mmunology 579~591;ならびにFishwild, D.ら、1996 Nature Biotechnology 14: 845~8
51においてさらに記載されている。さらに、全てがLonbergおよびKayによる、
米国特許第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126
号;同第5,633,425号;同第5,789,650号;同第5,877,397号
;同第5,661,016号;同第5,814,318号;同第5,874,299号;
および同第5,770,429号;Suraniらによる、米国特許第5,545,807号;
全てがLonbergおよびKayによる、PCT公開第WO92103918号、同第
WO93/12227号、同第WO94/25585号、同第WO97113852号、
同第WO98/24884号、および同第WO99/45962号;ならびにKorma
nらによるPCT公開第WO01/14424号も参照されたい。
ンスクロモソームを保有するマウスなど、トランス遺伝子上およびトランスクロモソーム
上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを使用してもたらすことができる。本明細
書で「KMマウス」と称するこのようなマウスは、IshidaらによるPCT公開第W
O02/43478号において詳細に記載されている。
ジェニック動物系も入手可能であり、本発明のEpo結合性抗体をもたらすのに使用する
ことができる。例えば、Xenomouse(Abgenix,Inc.)と称する代替
的なトランスジェニック系を使用することができる。このようなマウスは、例えば、Ku
cherlapatiらによる米国特許第5,939,598号;同第6,075,18
1号;同第6,114,598号;同第6,150,584号;および同第6,162,
963号において記載されている。
モソーム動物系も入手可能であり、本発明のEpo結合性抗体をもたらすのに使用するこ
とができる。例えば、「TCマウス」と称する、ヒト重鎖トランスクロモソームおよびヒ
ト軽鎖トランスクロモソームの両方を保有するマウスを使用することができるが、このよ
うなマウスは、Tomizukaら、2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722~727において記
載されている。当技術分野ではさらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモソームを保有
するウシも記載されており(Kuroiwaら、2002 Nature Biotechnology 20:889~894)、本
発明のEpo結合性抗体をもたらすのに使用することができる。
スクリーニングするためのファージディスプレイ法を使用して調製することもできる。当
技術分野では、ヒト抗体を単離するためのこのようなファージディスプレイ法が確立され
ているか、または下記の実施例で記載する。例えば、Ladnerらによる米国特許第5
,223,409号;同第5,403,484号;および同第5,571,698号;D
owerらによる米国特許第5,427,908号;および同第5,580,717号;
McCaffertyらによる米国特許第5,969,108号;および同第6,172
,197号;ならびにGriffithsらによる米国特許第5,885,793号;同
第6,521,404号;同第6,544,731号;同第6,555,313号;同第
6,582,915号;および同第6,593,081号を参照されたい。
うにヒト免疫細胞を再構成した、SCIDマウスを使用して調製することもできる。この
ようなマウスは、例えば、Wilsonらによる米国特許第5,476,996号;およ
び同第5,698,767号において記載されている。
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、VHおよび/またはVL
内のフレームワーク残基へと修飾を施した操作抗体を含む。このようなフレームワーク修
飾は、抗体の免疫原性を低下させるように施すことが典型的である。例えば、1つの手法
は、1つまたは複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列へと「復帰突然
変異させる」ことである。より具体的には、体細胞突然変異を経た抗体は、抗体が由来す
る生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含有しうる。このような残基は、抗体
フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することにより同定する
ことができる。フレームワーク領域配列を、それらの生殖細胞系列の立体配置へと戻すに
は、例えば、部位特異的突然変異誘発により、体細胞突然変異を、生殖細胞系列配列へと
「復帰突然変異させる」ことができる。このような「復帰突然変異させた」抗体もまた、
本発明により包含されることを意図する。
なおまたは、1つもしくは複数のCDR領域内の残基を突然変異させて、T細胞エピトー
プを除去して、これにより、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。この手法は
また、「脱免疫化」とも称し、Carrらによる米国特許公開第20030153043
号においてさらに詳細に記載されている。
、本発明の抗体は、Fc領域内の修飾を含んで、典型的に、血清半減期、補体の結合、F
c受容体の結合、および/または抗原依存性細胞性細胞傷害など、抗体の1つまたは複数
の機能的特性を改変するように操作することもできる。さらに、本発明の抗体は、化学的
に修飾することもでき(例えば、1つまたは複数の化学的部分を抗体に付着することがで
きる)、そのグリコシル化を改変して、ここでもまた、抗体の1つまたは複数の機能的特
性を改変するように修飾することもできる。これらの実施形態の各々については、下記で
さらに詳細に記載する。Fc領域内の残基の番号付けは、KabatによるEUインデッ
クスである。
減少させるように、CH1のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Bodmerらによる
米国特許第5,677,425号においてさらに記載されている。CH1のヒンジ領域内
のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリーを容易とするか、また
は抗体の安定性を増大もしくは低下させるように改変する。
短縮する。より具体的には、抗体のブドウ球菌属プロテインA(SpA)への結合が、天
然Fc-ヒンジドメインのSpAへの結合と比べて損なわれるように、1つまたは複数の
アミノ酸突然変異を、Fc-ヒンジ断片のCH2ドメイン-CH3ドメイン間界面領域へ
と導入する。この手法は、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさ
らに詳細に記載されている。
法が可能である。例えば、以下の突然変異:Wardによる米国特許第6,277,37
5号において記載されている、T252L、T254S、T256Fのうちの1つまたは
複数を導入することができる。代替的に、生物学的半減期を延長するために、抗体を、P
restaらによる米国特許第5,869,046号;および同第6,121,022号
において記載されている、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから採取さ
れたサルベージ受容体結合性エピトープを含有するように、CH1領域内またはCL領域
内で改変することもできる。
を改変する異なるアミノ酸残基で置きかえることにより、Fc領域を改変する。例えば、
抗体が、エフェクターリガンドに対するアフィニティーを改変しているが、親抗体の抗原
結合能は保持するように、1つまたは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえ
ることができる。それに対するアフィニティーを改変するエフェクターリガンドは、例え
ば、Fc受容体または補体のC1成分でありうる。この手法は、両方ともWinterら
による米国特許第5,624,821号;および同第5,648,260号においてさら
に詳細に記載されている。
害作用(CDC)を低減もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される1つま
たは複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基で置きかえることができる。この手法は、I
dusogieらによる米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載され
ている。
合する抗体の能力を改変する。この手法は、BodmerらによるPCT公開第WO94
/29351号においてさらに記載されている。
性細胞性細胞傷害(ADCC)を媒介する抗体の能力を増大させ、かつ/またはFcγ受
容体に対する抗体のアフィニティーを増大させるように、Fc領域を修飾する。この手法
は、PrestaによるPCT公開第WO00/42072号においてさらに記載されて
いる。さらに、ヒトIgG1上の、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、および
FcRnに対する結合性部位もマップされており、結合を改善させた変異体も記載されて
いる(Shields, R.L.ら、2001 J. Biol. Chen. 276:6591~6604を参照されたい)。
体(すなわち、抗体は、グリコシル化を欠く)を作製することができる。グリコシル化は
、例えば、「抗原」に対する抗体のアフィニティーを増大させるように改変することがで
きる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化
部位を改変することにより達成することができる。例えば、1つまたは複数の可変領域フ
レームワークグリコシル化部位の消失を結果としてもたらす、1つまたは複数のアミノ酸
置換を作製して、これにより、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる
。このような脱グリコシル化により、抗原に対する抗体のアフィニティーを増大させるこ
とができる。このような手法は、Coらによる米国特許第5,714,350号;および
同第6,350,861号においてさらに詳細に記載されている。
型GlcNac構造を増大させた抗体など、グリコシル化の種類を改変した抗体を作製す
ることもできる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のADCC能を増大さ
せることが裏付けられている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構を
改変した宿主細胞内で抗体を発現させることにより達成することができる。当技術分野で
は、グリコシル化機構を改変した細胞が記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ
、これにより、グリコシル化を改変した抗体を産生するための宿主細胞として使用するこ
とができる。例えば、HangらによるEP1,176,195は、このような細胞系内
で発現させた抗体が、低フコシル化を呈示するように、フコシルトランスフェラーゼをコ
ードするFUT8遺伝子を機能的に破壊した細胞系について記載している。Presta
によるPCT公開第WO03/035835号は、フコースをAsn(297)連結され
た炭水化物へと付着する能力を低減し、また、その宿主細胞内で発現させた抗体の低フコ
シル化も結果としてもたらす、変異体のCHO細胞系である、Lecl3細胞について記
載している(また、Shields, R.L.ら、2002 J. Biol. Chem. 277:26733~26740も参照さ
れたい)。UmanaらによるPCT公開第WO99/54342号は、操作細胞系内で
発現させた抗体が、抗体のADCC活性の増大を結果としてもたらす二分枝型GlcNa
c構造の増大を呈示するように、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ
(例えば、ベータ(1,4)-NアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(G
nTIII))を発現させるように操作された細胞系について記載している(また、Uman
aら、1999 Nat. Biotech. 17:176~180も参照されたい)。
上記で論じた通り、本明細書で示されるVH配列およびVL配列または全長重鎖および
全長軽鎖配列を有するEpo結合性抗体は、全長重鎖配列および/もしくは全長軽鎖配列
、VH配列および/もしくはVL配列、またはこれらへと付着された定常領域を修飾する
ことにより、新たなEpo結合性抗体を創出するのに使用することができる。したがって
、本発明の別の態様では、本発明のEpo結合性抗体の構造特色を使用して、ヒトEpo
に結合し、また、Epoの1つまたは複数の機能的特性も阻害すること(例えば、Epo
とEpo受容体の結合を阻害する、Epo依存性の細胞増殖を阻害する)など、本発明の
抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する、構造的に関連するEpo結合性抗体を創
出する。
えにより、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組み合わせて、組換え
により操作された、上記で論じた、本発明の、さらなるEpo結合性抗体を創出すること
ができる。他の種類の修飾は、前出の節で記載した修飾を含む。操作法のための出発材料
は、本明細書で提示されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数
、またはそれらの1つもしくは複数のCDR領域である。操作抗体を創出するのに、本明
細書で提示されるVH配列および/もしくはVL配列のうちの1つもしくは複数、または
それらの1つもしくは複数のCDR領域を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タン
パク質として発現させる)ことは必要ではない。そうではなくて、配列内に含有される情
報を、元の配列に由来する「第2世代の」配列を創出するための出発材料として使用し、
次いで、「第2世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
法であって、a)配列番号1、21、41、および61からなる群から選択されるCDR
1配列、配列番号2、22、42、および62からなる群から選択されるCDR2配列、
ならびに/または配列番号3、23、43、および63からなる群から選択されるCDR
3配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号4、24、44、および64からな
る群から選択されるCDR1配列、配列番号5、25、45、および65からなる群から
選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号6、26、46、および66からな
る群から選択されるCDR3配列を有する軽鎖可変領域の抗体配列とを含むEpo結合性
抗体を作製するステップと、b)重鎖可変領域の抗体配列および/または軽鎖可変領域の
抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも1つの改変抗体配列
を創出するステップと、c)改変抗体配列を、タンパク質として発現させるステップとを
含む方法を提供する。
なる群から選択されるCDR1配列、配列番号8、28、48、および68からなる群か
ら選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号9、29、49、および69から
なる群から選択されるCDR3配列を有する重鎖可変領域の抗体配列と、配列番号10、
30、50、および70からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号11、31、
51、および71からなる群から選択されるCDR2配列、ならびに/または配列番号1
2、32、52、および72からなる群から選択されるCDR3配列を有する軽鎖可変領
域の抗体配列とからなるEpo結合性抗体を調製し、重鎖可変領域の抗体配列および/ま
たは軽鎖可変領域の抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも
1つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現させるための方法
を提供する。
されたEpo結合性抗体であって、配列番号15、35、55、および75の群から選択
される配列を有する全長重鎖抗体配列と、配列番号16、36、56、および76の群か
ら選択される配列を有する全長軽鎖抗体配列とからなるEpo結合性抗体を調製し、全長
重鎖抗体配列および/または全長軽鎖抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を改変
して、少なくとも1つの改変抗体配列を創出し、改変抗体配列を、タンパク質として発現
させるための方法を提供する。一実施形態では、重鎖または軽鎖の改変は、重鎖または軽
鎖のフレームワーク領域内である。
されている、最小限の不可欠な結合決定基を固定し、CDR1配列およびCDR2配列に
は多様性を持たせた抗体ライブラリーをスクリーニングすることによっても調製すること
ができる。スクリーニングは、ファージディスプレイ技術など、抗体を、抗体ライブラリ
ーからスクリーニングするのに適切な任意のスクリーニング技術に従い実施することがで
きる。
る。改変抗体配列によりコードされる抗体は、ヒト、カニクイザル、ラットおよび/また
はマウスEpoに特異的に結合すること;ならびに抗体が、F36E細胞増殖アッセイお
よび/またはBa/F3-EpoR細胞増殖アッセイにおいて、Epo依存性の細胞増殖
を阻害することを含むがこれらに限定されない、本明細書で記載されるEpo結合性抗体
の機能的特性のうちの1つ、一部、または全部を保持する抗体である。
全部または一部に沿って、ランダムに、または選択的に、突然変異を導入することができ
、結果として得られる修飾Epo結合性抗体を、本明細書で記載される結合活性および/
または他の機能的特性についてスクリーニングすることができる。当技術分野では、突然
変異法が記載されている。例えば、ShortによるPCT公開第WO02/09278
0号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、またはこれらの組合せを
使用して、抗体の突然変異を創出し、スクリーニングするための方法について記載してい
る。代替的に、LazarらによるPCT公開第WO03/074679号は、コンピュ
ータによるスクリーニング法を使用して、抗体の生理化学的特性を最適化する方法につい
て記載している。
いる。脱アミド化は、ペプチド内またはタンパク質内の構造的変化および機能的変化を引
き起こすことが公知である。脱アミドは、生体活性の低下のほか、タンパク質医薬品の薬
物動態および抗原性の改変も結果としてもたらしうる(Anal Chem. 2005年3月1日;77(5
):1432~9)。
するように操作されている。タンパク質のpIは、分子の全体的な生物物理的特性の鍵と
なる決定因子である。pIが小さな抗体は、可溶性が小さく、安定性が小さく、凝集しや
すいことが公知である。さらに、pIが小さな抗体の精製は、とりわけ、臨床における使
用のためのスケールアップにおいて、困難であり、問題を生じる可能性がある。本発明の
抗Epo抗体またはFabのpIを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、
抗体を高濃度(>100mg/ml)で製剤化することが可能となった。抗体を高濃度(
例えば、>100mg/ml)で製剤化することにより、高用量の抗体を、患者の眼へと
、硝子体内注射を介して投与することが可能な利点がもたらされ、これにより、網膜血管
疾患を含む慢性疾患を処置するための著明な利点である、投与頻度の低減を可能とするこ
とができる。pIの増大はまた、抗体のIgGバージョンのFcRnを媒介するリサイク
リングも増大させ、これにより、薬物が長時間にわたり体内にとどまり、要求される注射
の回数を少なくすることも可能としうる。最後に、pIの増大に起因して、抗体の全体的
な安定性が著明に改善され、その結果として、保管寿命およびin vivoにおける生
体活性の延長がもたらされる。pIは、8.2以上であることが好ましい。
ど、当技術分野において利用可能であり、かつ/または本明細書で記載される標準的なア
ッセイを使用して評価することができる。
本明細書で記載されるEpoに結合する抗体は、それを必要とする対象へと、有効量の
、本発明の抗体または抗原結合性断片を投与することにより、Epoレベルの上昇および
/またはEpo活性の増大と関連する疾患または障害を処置するのに治療的に有用な濃度
で使用することができる。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗
体を投与することにより、網膜血管疾患と関連する状態または障害を処置する方法を提供
する。本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することに
より、糖尿病性網膜症(DR)と関連する状態または障害を処置する方法を提供する。本
発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、黄
斑浮腫と関連する状態または障害を処置する方法を提供する。本発明はまた、それを必要
とする対象へと、有効量の、本発明の抗体を投与することにより、糖尿病性黄斑浮腫(D
ME)を処置する方法も提供する。本発明はさらに、それを必要とする対象へと、有効量
の、本発明の抗体を投与することにより、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)を処置する方
法も提供する。なおさらに、本発明は、それを必要とする対象へと、有効量の、本発明の
抗体を投与することにより、加齢黄斑浮腫(AMD)、網膜静脈閉塞(RVO)、血管浮
腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および/または未熟児網膜症を処置する
ための方法も提供する。本発明はまた、ベータサラセミアおよび/またはがんを処置する
方法も提供する。
たは障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結
合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、網膜血管疾患と関連する状態または
障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性
断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、糖尿病性網膜症(DR)と関連する状態
または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原
結合性断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫(D
ME)、および/または増殖性糖尿病性網膜症(PDR)と関連する状態または障害の処
置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含
む組成物にも関する。本発明はなおさらに、加齢黄斑浮腫(AMD)、網膜静脈閉塞(R
VO)、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および/または未熟児網
膜症の処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性
断片を含む組成物にも関する。本発明はさらに、ベータサラセミアおよび/またはがんの
処置における使用のための、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を
含む組成物にも関する。より具体的には、Epoレベルの上昇および/またはEpo活性
の増大と関連する疾患または障害の処置における使用のための、本明細書で記載される単
離抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片の
うちのいずれか1つに加えて、表1に記載されている抗体または抗原結合性断片でもあり
うる。なおさらに、網膜血管疾患と関連する状態または障害の処置における使用のための
、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書で記載される抗
体または抗原結合性断片のうちのいずれか1つに加えて、表1に記載されている抗体また
は抗原結合性断片でもありうる。本発明の抗体は、とりわけ、網膜血管疾患と関連する状
態または障害(例えば、DR、DME、NPDR、PDR、加齢黄斑変性(AMD)、網
膜静脈閉塞(RVO)、血管浮腫、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および/
または未熟児網膜症)の進行を防止し、網膜血管疾患と関連する黄斑浮腫を処置または防
止し、Lucentis(登録商標)(RTM)注射の頻度を低減し、網膜血管疾患の進
行に起因する視力喪失を改善するのに使用することができる。本発明の抗体はまた、網膜
血管疾患を伴う患者を処置するための抗VEGF療法と組み合わせても使用することがで
きる。
有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触
させるステップ(例えば、対象におけるEpoを接触させるステップ)を含み、特に、組
成物が、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる方法に関する
。一態様では、方法は、細胞(例えば、Epoを含む細胞)を、本明細書で記載される単
離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はま
た、対象におけるEpo依存性の細胞増殖を阻害するのに使用するための、本明細書で記
載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト細胞
であることが企図される。細胞は、B細胞でありうるであろう。細胞は、対象中にあるこ
とがさらに企図される。また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、
ヒトであることがなおさらに企図される。
ルオレセイン血管造影により測定することができる(Hengら、Diabet. Med. 2013年6月、
30(6):640~50)。加えて、本明細書で記載される抗体または抗原結合性断片の、Ep
o依存性の細胞増殖を阻害する能力は、下記で記載されるF36E細胞増殖アッセイまた
はBa/F3-EpoR細胞増殖アッセイなどのアッセイを使用して測定することもでき
る。
有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触
させて、Epoが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステップを含む方
法にも関する。一態様では、方法は、Epoを含む細胞を、本明細書で記載される単離抗
体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む。本発明はまた、
対象におけるEpo依存性の細胞シグナル伝達を阻害するのに使用するための、本明細書
で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関する。細胞は、ヒト
細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。また、細
胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさらに企図
される。
K)/Akt、MAPキナーゼ、STAT5、およびタンパク質キナーゼCを含む下流の
シグナル伝達経路の活性化をもたらす、JAK2キナーゼを介するシグナル伝達を誘導す
る(Jelkmann、2007; Jelkmann、2004)。EpoまたはEpo受容体(EpoR)は、内
皮細胞、平滑筋細胞、およびCNS細胞などの異なる細胞型により内因的に産生されるこ
とが報告されている(OgunsholaおよびBogdanova、2013)。Epoが結合してEpoRが
活性化すると、カルシウムの輸送(Korbelら、2004)、細胞の生存(Vellyら、2010)、
神経保護(Grimmら、2002)、および血管新生(Ribatti、2010; Ribattiら、2003)など
の異なる活性をもたらす、下流のシグナル伝達経路が誘発されうる。したがって、Epo
依存性の細胞シグナル伝達の阻害は、これらのシグナル伝達経路のうちの1つまたは複数
の活性を測定することにより決定することができる。例えば、Epo依存性の細胞シグナ
ル伝達の阻害は、JAK2キナーゼ、PI-3K/Akt、MAPキナーゼ、STAT5
、またはタンパク質キナーゼCを測定することにより決定することができる。当技術分野
では、これらのシグナル伝達経路を測定する方法が知られており、このような経路の活性
を測定するためのキットも市販されている。加えて、Epo依存性の細胞シグナル伝達の
阻害は、上記で記載した細胞増殖を測定することにより決定することもできる。細胞増殖
は、対象(例えば、血管新生)における細胞増殖の場合もあり、下記で記載されるF36
E細胞増殖アッセイまたはBa/F3-EpoR細胞増殖アッセイなどのアッセイを使用
して測定される場合もある。一態様では、Epo依存性の細胞シグナル伝達は、本明細書
で記載される抗体の存在下で、対照と比べて統計学的に有意に(p<0.05)低下する
。
Epoを、有効量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組
成物と接触させて、Epoが、細胞表面上の受容体と相互作用することを防止するステッ
プを含む方法にも関する。細胞は、B細胞であることが企図される。細胞は、ヒト細胞で
あることが企図される。
量の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物と接触させ
るステップ(例えば、対象におけるEpoを接触させるステップ)を含む方法にも関し、
特に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。本
発明はまた、Epoと、対象の細胞上のEpo受容体の結合を阻害するのに使用するため
の、本明細書で記載される単離抗体またはその抗原結合性断片を含む組成物にも関し、特
に、組成物は、抗体のNVS1、NVS2、NVS3、またはNVS4を含みうる。細胞
は、ヒト細胞であることが企図される。細胞は、対象中にあることがさらに企図される。
また、細胞は、対象の眼の中にあることも企図される。対象は、ヒトであることがなおさ
らに企図される。EpoとEpo受容体の結合の阻害は、Khankinら、PLoS ONE、2010 5:
e9246により記載されている通りに測定することができる。
科医または医療ケア従事者が、視覚機能および/または網膜の解剖学的特徴についての臨
床的に関与性の測定を使用して決定することができる。網膜血管疾患と関連する状態また
は障害の処置とは、視覚機能および/または網膜の解剖学的特徴の改善または保存を結果
としてもたらすか、または結果としてもたらすことが企図される、任意の作用(例えば、
本明細書で記載される抗Epo抗体の投与)を意味する。加えて、網膜血管疾患と関連す
る状態または障害に関する場合の防止とは、本明細書で規定される、視覚機能、網膜の解
剖学的特徴、および/または網膜血管疾患パラメータの悪化を、前記悪化の危険性がある
患者において防止するかまたは緩徐化する、任意の作用(例えば、本明細書で記載される
抗Epo抗体の投与)を意味する。
スト感度、暗順応、フォトストレスリカバリー、色彩弁別、読取り速度、支援デバイス(
例えば、大型活字、拡大デバイス、望遠鏡)への依存性、顔認識、自動車運転時の習熟度
、1つまたは複数の日常生活活動を実施する能力、および/または患者により報告された
、視覚機能と関連する満足度を含みうる。
グリッド、ゴールドマン視野、ハンフリー視野、マイクロ視野測定、ペリー-ロブソンチ
ャート、スキルカード、石原カラープレート、ファーンズワースD15色覚検査またはフ
ァーンズワースD100色覚検査、標準的な網膜電図、多焦点網膜電図、妥当性の確認さ
れた読取り速度検査、顔認識、運転シミュレーション、および患者により報告された満足
度を含む。したがって、ETDRSスケール上の視力が、2行(または10文字)以上向
上するか、またはこれに2行(または10文字)以上の低下が見られなければ、血管疾患
および/または黄斑浮腫の処置が達成されたということができる。加えて、対象の読取り
速度(1分間当たりのワード数)が、少なくとも10%増大するか、またはこれに10%
の減少が見られない場合も、血管疾患および/または黄斑浮腫の処置がなされたというこ
とができる。加えて、対象の石原検査において正確に同定されたプレートまたはファーン
ズワース検査において正確に配列されたディスクの比率が、少なくとも20%増大するか
、またはこれに20%の低下が見られない場合も、血管疾患および/または黄斑浮腫の処
置がなされたということができる。さらに、例えば、対象による、あらかじめ指定された
程度の暗順応までの時間が、少なくとも10%短縮されるか、またはこれに10%以上の
延長が見られない場合も、網膜血管疾患および/または黄斑浮腫の処置がなされたという
ことができる。加えて、例えば、対象において、有資格の医療ケア従事者(すなわち、眼
科医)により決定される視角として表される視覚暗点の総面積が少なくとも10%低減さ
れるか、またはこれに10%以上の増大が見られない場合も、網膜血管疾患および/また
は黄斑浮腫の処置がなされたということができる。
瘤、黄斑浮腫、綿花状白斑、網膜内細小血管異常(IRMA)、毛細血管脱落、白血球接
着、網膜虚血症、視神経乳頭の血管新生、後極の血管新生、虹彩血管新生、網膜内出血、
硝子体内出血、黄斑部瘢痕、網膜下線維症、および網膜線維症、静脈拡張、血管蛇行、血
管漏出を含む。したがって、例えば、黄斑浮腫の処置は、光干渉断層法により測定される
、中心網膜サブフィールド厚の20%以上の低減により決定することができる。
血管造影、インドシアニングリーン血管造影、光干渉断層法(OCT)、スペクトラルド
メイン光干渉断層法、走査レーザー検眼鏡、共焦点顕微鏡、補償光学、眼底自己蛍光、生
検、剖検、および免疫組織化学を含む。したがって、フルオレセイン血管造影により決定
される漏出面積が10%低減されれば、対象における血管疾患および/または黄斑浮腫が
処置されたということができる。
、糖尿病と関連する状態を処置する公知の方法を伴う他の治療剤も投与することができる
。
視性脈絡膜血管新生、および/または未熟児網膜症などの眼疾患の処置および/または防
止は、眼科医または医療ケア従事者が、上記で記載した尺度のうちのいずれかにより、視
覚機能および/または網膜の解剖学的特徴についての臨床的に関与性の測定を使用して決
定することができる。本明細書で記載される尺度が、本明細書の各眼疾患およびあらゆる
眼疾患に適用されるわけではないが、当業者は、所与の眼疾患を処置するのに使用されう
る、視覚機能および/または網膜の解剖学的特徴についての臨床的に関与性の測定を認識
するであろう。
次的に投与することもでき、同時に投与することもできる。いくつかの態様では、本発明
の抗体は、第2の薬剤(例えば、Lucentis(登録商標))による治療もまた施さ
れる対象へと投与する。他の態様では、結合性分子は、外科処置と共に投与する。
度の2つの薬剤を組み合わせた使用について予測される軽減を超える軽減)をもたらす場
合もある。いくつかの実施形態では、本発明は、網膜血管疾患および黄斑浮腫、とりわけ
、上記で記載したDMEおよび/またはPDRを含む糖尿病性網膜症を防止および/また
は処置するための組合せ治療であって、本発明のEpo結合性抗体および抗VEGF剤な
どの抗血管新生剤を伴う組合せ治療を提供する。
本発明は、薬学的に許容される担体と併せて製剤化されたEpo結合性抗体(インタク
トなまたは結合性断片)を含む医薬組成物を提供する。組成物は加えて、例えば、糖尿病
性網膜症の処置または防止に適する1つまたは複数の他の治療剤も含有しうる。薬学的に
許容される担体は、組成物を増強するかもしくは安定化させるか、または、組成物の調製
を容易とするのに使用することもできる。薬学的に許容される担体は、生理学的に適合性
の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを
含む。
投与経路および/または投与方式は、所望される結果に応じて変化する。投与は、硝子体
内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、もしくは皮下投与であるか、または標的部
位に近接して投与することが好ましい。薬学的に許容される担体は、硝子体内投与、静脈
内投与、筋内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与(例えば、注射ま
たは注入による)に適するものとする。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、二特
異性分子および多特異性分子である抗体は、化合物を、化合物を不活化しうる酸および他
の天然の状態の作用から保護する材料でコーティングすることができる。
チンなどのコーティングを使用することにより維持することができ、分散液の場合には、
要求される粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより維持することができる
。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトールなどの
多価アルコール、および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長時間吸
収は、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまた
はゼラチンを組み入れることによりもたらすことができる。
に従い調製することができる。例えば、Remington:The Science and Practice of Pharm
acy、Mack Publishing Co.、20版、2000;およびSustained and Controlled Release Dru
g Delivery Systems、J.R. Robinson編、Marcel Dekker, Inc.、New York、1978を参照さ
れたい。医薬組成物は、GMP条件下で製造することが好ましい。本発明の医薬組成物中
では、Epo結合性抗体の治療的に有効な用量または治療的に効果的な用量を援用するこ
とが典型的である。Epo結合性抗体は、当業者に公知の従来の方法により、薬学的に許
容される剤形へと製剤化する。投与レジメンは、所望される最適応答(例えば、治療的応
答)をもたらすように調整する。例えば、単一のボーラスを投与することもでき、複数に
分割された用量をある期間にわたり投与することもでき、治療状況の要件により指し示さ
れるのに応じて、用量を比例的に低減するかまたは増大させることもできる。投与の容易
さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を、投与量単位形態で製剤化することが
とりわけ有利である。本明細書で使用される投与量単位形態とは、処置される対象のため
の単位投与量として適する、物理的に個別の単位を指す。各単位は、要求される医薬担体
との関連で、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定量の活性化合物を含有す
る。
定の患者、組成物、および投与方式に所望される治療的応答を達成するのに有効な量の有
効成分を得るように変化させることができる。選択される投与量レベルは、援用される本
発明の特定の組成物、またはそれらのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、
投与時期、援用される特定の化合物の排出速度、処置の持続期間、援用される特定の組成
物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および/または材料、処置される患者の
年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および医療既往歴などの因子を含む様々な薬物動
態因子に依存する。
果を達成するのに要求されるレベル未満のレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで
、投与量を漸増させることができる。一般に、本明細書で記載される網膜血管疾患を処置
するのに有効な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、
患者がヒトであるのか動物であるのか、投与される他の薬物、および処置が予防的である
のか治療的であるのかを含む、多くの異なる因子に応じて変化する。処置投与量は、安全
性および有効性を最適化するように滴定することが必要である。抗体の全身投与では、投
与量は、宿主の体重1kg当たり約0.0001~100mgの範囲であり、より通例で
は、宿主の体重1kg当たり0.01~15mgの範囲である。抗体の硝子体内投与では
、投与量は、眼1つ当たり0.1mg~眼1つ当たり10mgの範囲でありうる。より具
体的には、用量は、眼1つ当たり1mg~眼1つ当たり9mg、眼1つ当たり2mg~眼
1つ当たり8mg、眼1つ当たり3mg~眼1つ当たり7mg、眼1つ当たり4mg~眼
1つ当たり6mg、または眼1つ当たり4.5mg~眼1つ当たり5.5mgの範囲であ
りうる。ある種の場合には、用量は、眼1つ当たり0.1mg、眼1つ当たり0.2mg
、眼1つ当たり0.3mg、眼1つ当たり0.4mg、眼1つ当たり0.5mg、眼1つ
当たり0.6mg、眼1つ当たり0.7mg、眼1つ当たり0.8mg、眼1つ当たり0
.9mg、眼1つ当たり1mg、眼1つ当たり2mg、眼1つ当たり3mg、眼1つ当た
り4mg、眼1つ当たり5mg、眼1つ当たり6mg、眼1つ当たり7mg、眼1つ当た
り8mg、眼1つ当たり9mg、または眼1つ当たり10mgでありうる。例示的な処置
レジメは、2週間ごとに1回、または毎月1回、または3~6カ月ごとに1回の全身投与
を伴う。例示的な処置レジメは、2週間ごとに1回、または毎月1回、または3~6カ月
ごとに1回の全身投与、または必要に応じた(PRN)全身投与を伴う。
りうる。間隔はまた、患者におけるEpo結合性抗体の血中レベルを測定することにより
指し示される通り、不規則でもありうる。加えて、医師が代替的な投与間隔を決定する場
合もあり、毎月または効果的であるのに必要な間隔で投与する。有効性は、病変の成長、
Lucentis(登録商標)のレスキュー速度、光干渉断層法(OCT)により決定さ
れる網膜厚、および視力に基づく。全身投与のいくつかの方法では、投与量は、抗体の血
漿中濃度1~1000μg/mlを達成するように調整し、いくつかの方法では、25~
500μg/mlを達成するように調整する。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投
与することもでき、この場合は、低頻度の投与が要求される。投与量および頻度は、患者
における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト化抗体は、キメラ抗体および非ヒ
ト抗体の半減期より長い半減期を示す。投与量および投与頻度は、処置が予防的であるの
か治療的であるのかに応じて変化しうる。予防的適用では、比較的低投与量を、比較的低
頻度の間隔で、長期にわたり投与する。一部の患者には、彼らの余生にわたり処置を施し
続ける。治療的適用では場合によって、比較的高投与量が、疾患の進行が軽減されるか終
結するまで、比較的短い間隔で要求され、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的また
は完全な改善を示すまで要求される。その後、患者には、予防的レジメを投与することが
できる。
定するために提示されるものではない。当業者には、本発明の他の変形がたやすく明らか
であろうし、付属の特許請求の範囲によっても包含される。
完全ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して、本明細書で記載されるEpo
結合性抗体を作り出した。
よびカニクイザルEpoを使用した。標準的パニングならびにRapMAT法(Prassler
ら、(2009)Immunotherapy 1(4):571~583)を実施した。二次スクリーニングおよび
RapMATパニングの後、クローンを、配列解析のために選択し、8つの抗体のセット
を、FabCysフォーマットへの転換、生殖細胞系列化、pIの最適化、および脱アミ
ド化部位の除去について選択した。FabCysの作製は、特許権のあるRapCLON
E(登録商標)法により達成した。RapCLONE(登録商標)は、大量のFabクロ
ーンを、IgGおよびFabCysフォーマットへと簡便かつ効率的に転換するための2
ステップ法として実施した。第1のクローニングステップにおいて、BsiWI/Mfe
I消化(κプールのための)またはHpaI/MfeI消化(λプールのための)および
その後のライゲーションを介して、真核発現カセットを、発現ベクターであるpMORP
H(登録商標)x11(HuCAL PLATINUM(登録商標)のための)へと導入
した。これに続き、EcoRV/BlpI(κプールおよびλプール)を使用して発現カ
セットを含有するFabプールを消化する、第2のクローニングステップを行い、その後
、哺乳動物細胞における発現のために、pMorph(登録商標)4_IgG1fアクセ
プターベクターまたはpMorph(登録商標)4_h_FabCysアクセプターベク
ターへとクローニングした。この研究計画では、固有の、配列決定され、特徴付けられた
FabだけにRapCLONE(登録商標)を適用した。したがって、RapCLONE
(登録商標)の後では、全てのクローンが回収された。
連する。8つの最終候補(HCDR3に固有のクローン)を、生殖細胞系列化、pIの最
適化、および脱アミド化部位の除去について選択し、合計12の生殖細胞系列化変異体を
もたらした。12のVL遺伝子(11317、11324、11331、および1134
5については2つずつ)および1つのVH(11324)を合成した。おそらく、PTM
を伴う候補の早期の除外に起因して、11317(VL)、11332(VL)、および
11380(VH)だけが、生殖細胞系列化により除去される脱アミド化部位を含有した
。生殖細胞系列化は一般に、最も近縁の生殖細胞系列へ施した。pIを増大させるため、
候補のうちの6つのために、最も近縁の生殖細胞系列である3rの代わりに、またはこれ
に加えて、ラムダ生殖細胞系列である3hを選択した。加えて、3つの候補のために、ラ
ムダ3j変異体を構築して、危険性を最小化した(11317、11331および113
45)。
決定因子である。ファージディスプレイライブラリーから同定された抗Epo Fabの
pIは、8.2未満であった。製造特性を改善するために、抗体を、それらのpIを増大
させ、それらの薬物様特性を改善するように、特異的に操作した。抗Epo Fabのp
Iを増大させることにより、それらの可溶性が改善され、Fabを高濃度(>100mg
/ml)で製剤化することが可能となった。Fabを高濃度(例えば、>100mg/m
l)で製剤化することにより、高用量のFabを、患者の眼へと、硝子体内注射を介して
投与することを可能とする利点がもたらされ、これにより、湿潤型AMDおよび糖尿病性
網膜症を含むがこれらに限定されない、慢性眼疾患を処置するための著明な利点である、
投与頻度の低減を可能とすることができる。
1に示す。
以下の実施例は、抗体アフィニティーを測定するのに使用しうる方法について記載する
。当技術分野では、結合アフィニティーを測定するこれらの方法および他の方法が知られ
ている。
Epoに対する抗体のアフィニティーは、Biacore(登録商標)T200(Bi
acore)を使用する表面プラズモン共鳴(SPR)および溶液平衡滴定(SET)に
より測定した。Epo結合のための各技術および対応する平均結果についての説明を下記
に記載する。モデル化仮説は、系内のEpoの濃度、Epo生合成の反応速度および半減
期のほか、所望の投与スケジュールを考慮に入れるが、これは、Epoに対するアフィニ
ティーが50pM未満のFabは、遊離Epoのレベルを低下させるのに十分であること
を示唆している。
相互作用の反応速度、すなわち、複合体の形成速度(ka)および解離速度(kd)は
、センサーグラム内の情報から決定することができる。試料が、調製されたセンサー表面
上を通過するときに、結合が生じれば、センサーグラム内の応答が増大する。平衡に達す
れば、定常シグナルが見られるであろう。試料を緩衝液で置きかえると、結合した分子は
解離し、応答は低下する。Biacore査定ソフトウェアは、データを、相互作用モデ
ルへと当てはめることにより、ka値およびkd値を得る。
ell 1)は、Epo Fabを捕捉せず、Epoの抗体でコーティングされたチップ表面
への非特異的な結合を評価する基準として用いられた。いずれの捕捉ステップおよび結合
ステップも、フローセル2~4上で実行した。
捉レベルは、約50RLであった。1ug/ulの濃度の抗hu Fabに、10μl/
分の流速で、Fc2~4上を流動させた。
Fab:Rmax=RL×(MWanalyte/MWligand)×化学量論値20
=RL×(21.4/50)×1=50RL
連を伴う8つの1:2希釈を含んだ。解析物は、60μl/分の流速で、240秒間にわ
たりランさせた。解離時間は、4000秒間および600秒間に設定した。解離時間は、
NVS2およびNVS4の10nM、2.5nM、および0.3125nMの解析物濃度
について、4000秒間に設定した。試料を注射した後、再生緩衝液による洗浄ステップ
を施した。
めの再生条件は、60ul/分で100秒間にわたる、10%の水酸化ナトリウムを伴う
1%のリン酸とした。
番BR-1006-69)中で実行した。結果として得られるシグナルは、二重基準化に
より、すなわち、屈折率値を、基準フローセルから減じるステップと、解析物を伴わない
結合ステップとにより調整した。データは、10Hzで収集し、Biacore(登録商
標)T100 Evaluation Software Version 1.1(G
E Healthcare)を使用して解析した。このプログラムでは、各相互作用につ
いての速度およびアフィニティー定数を決定するのに、グローバルフィッティング解析法
が使用される。
書で記載される抗体は、40pM以下であることが典型的なKD値で、ヒトEpoへの高
アフィニティーの結合を呈示した。
SPRなど、センサー表面を使用する反応速度アッセイとは対照的に、SETとは、溶
液中のアフィニティーを決定する方法である。SETは、反応速度データを与えることの
ない、平衡における測定である。
ートする。平衡化溶液中の遊離抗体の濃度は、溶液を、抗原でコーティングされたMSD
(商標)プレート(Meso Scale Discovery(商標))上に適用した
後で、ECL標識された二次抗体を伴うインキュベーションおよびシグナル強度の測定を
行うことにより決定する。抗原濃度が低ければ、強いシグナルが達成される(プレート上
の抗原に高濃度の遊離抗体が結合する)のに対し、抗原濃度が高ければ、抗体は、抗原に
完全に捕捉され、弱いシグナルを結果としてもたらす。マッチング範囲内で十分な濃度の
抗原がマッチング可能であれば、適切な当てはめモデルを使用する滴定曲線により、アフ
ィニティーの妥当な決定が可能となる。完全な滴定のためには、予測されるKDの少なく
とも10倍の抗原濃度を適用しなければならない。アッセイ内で適用される抗体の定常濃
度は、KDの範囲内にあるか、またはKDを下回るものとする(表3)。
解析された単量体含量のうちの少なくとも90%;それぞれ、FabのためのSuper
dex75(Amersham Pharmacia)、またはIgGのためのToso
h G3000SWXL(TOSOH BIOSCIENCE))を使用した。
されている通りに実施した。SET法の感度および精度を改善するために、SETを、古
典的ELISAに基づく技術から、ECLに基づく技術へと移行させた(Haenelら、2005
)。
)および1%のTween20および1%のTriton-X(Sigma型番2347
29)を伴うPBS)中の一定濃度まで希釈し、インキュベーション緩衝液中のEpoの
系列希釈液(1:5)へと添加した。
ヒト、Hu-ダルベポエチン、カニクイザル、マウス、ラット=10nM
ウサギ=100nM
Fabの最終濃度:
NVS2:ウサギ=30pMを除き、2pM
NVS3:ウサギ=5pMを除き、2pM
NVS4:ウサギ=10nMを除き、2pM
NVS1:2pM
e Discovery;384ウェル:MSD型番L11SA)を、25μlのインキ
ュベーション緩衝液で、室温で1時間にわたりブロッキングした。プレートを、TBST
緩衝液(0.05%のTween20を伴う25mMのTBS)中で、3回にわたり洗浄
した。0.1μg/mlのビオチニル化Epoを、25μlのインキュベーション緩衝液
中に添加し、室温で1時間にわたりインキュベートした。プレートを、TBST緩衝液中
で、3回にわたり洗浄した。Fabを含有する試料およびEpo滴定物を、プレート(2
5μl)へと添加し、室温で15分間にわたりインキュベートした。プレートを、TBS
T緩衝液中で、3回にわたり洗浄した。25μlの検出抗体を添加し(抗ヒト(ヤギ)S
ulfo-TAG;インキュベーション緩衝液中に1:1000;MSD型番R32AJ
-1)、室温で60分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で3回
にわたり洗浄し、1倍濃度のMSD Read buffer T(界面活性剤;MSD
型番R92TC-1を伴う)50μlを添加した。プレートを、MSD Spector
Imager 6000上で読み取った。
らバックグラウンド(ウェルの平均がFabを含有しない)を減じた。X軸値(溶液中の
Epo濃度)を、log10xへと変換した。
Y=(Top-((Top/(2×Fab))×((((10x)+Fab)+KD)-
((((((10x)+Fab)+KD)×(((10x)+Fab)+KD))-((
4×(10x))×Fab))0.5))))
[式中、
Top=抗原濃度=0のときのシグナル
x=溶液中のEpo濃度
Fab=Fab濃度に対する制約は、1pMに設定した]
から当てはめた。
られるKD値([pM]濃度)を、表3にまとめる。NVS2は、ヒトEpo、ヒトダル
ベポエチン、およびカニクイザルEpoに、10pM未満のKDで結合した。NVS2は
また、マウスEpoにも、50pM未満のKDで結合し、ラットEpoにも、20pM未
満のKDで結合した。NVS3は、ヒトEpo、ヒトダルベポエチン、カニクイザルEp
o、マウスEpo、およびラットEpoに、5pM未満のKDで結合した。NVS4は、
ヒトEpo、ヒトダルベポエチン、カニクイザルEpo、マウスEpo、およびラットE
poに、10pM未満のKDで結合した。
成長および生存のためにエリスロポエチンに依存する細胞を活用して、Epo依存性の
増殖阻害による抗Epo治療剤の効力を測定することができる(Chibaら、1991)。
このアッセイでは、Epo受容体を発現しているマウスBa/F3細胞(Ba/F3-
EpoR細胞)におけるEpo誘導性細胞増殖を阻害するEpo抗体の能力が裏付けられ
る。Ba/F3細胞とは、IL-3依存性の成長および生存のための細胞であり、多様な
発がん性チロシンキナーゼで形質転換されると、IL-3に依存しない形で成長すること
が示されている。EpoRで安定的にトランスフェクトすると、Ba/F3-EpoR細
胞は、IL-3非依存性となる。製造元の指示書に従い、Nucleofectorデバ
イス(Amaxa;Nucleofactor(商標)II)を使用する、Amaxaヌ
クレオフェクションシステム(型番VCA-1003、Amaxa GmbH)を使用し
て、ヒトEpoRを保有する哺乳動物の発現プラスミドであるpcDNA3.1を、Ba
/F3細胞へとトランスフェクトした。
成長培地:RPMI1640/10%のFBS/1%のPen-Strep/100μg
/mlのハイグロマイシンB/1U/mlのEpo
アッセイ培地:RPMI1640/10%のFBS/1%のPen-Strep/100
μg/mlのハイグロマイシンB
Pen-Strep/100μg/mlのハイグロマイシンB/1U/mlのEpo)中
で維持した。1ml当たり約1×106個の細胞の細胞は、1ml当たり0.4~0.6
×105個の細胞へと分裂した(3~4日ごとに)。
1.実験の前日、Ba/F3-EpoR細胞を、遠心分離により調製して、成長培地を除
去し、その後、細胞を、Epoを含有しないアッセイ培地(RPMI1640/10%の
FBS/1%のPen-Strep/100μg/mLのハイグロマイシンB)中に再懸
濁させた。
2.実験日において、細胞を、アッセイ培地中で2~3回にわたり洗浄し(1000rp
mで5分間にわたり遠心分離し)、1ml当たり1.25×105個の細胞でアッセイ培
地中に再懸濁させた。
3.2500個の細胞を、384ウェル黒色プレート(底部透明で、TC処置されている
)内の各アッセイウェルへと添加した。
4.最終Epo濃度が、所望の最終濃度の2倍となるように、Epoを、384ウェルマ
イクロプレート内で、アッセイ培地により系列希釈した。
5.(3連で)系列希釈されたEpo 20μlを、384ウェル黒色プレートの、Ba
/F3-EpoR細胞を含有する試料ウェルへと、3連で添加した。
6.プレートを、遠心分離機により、1000rpmで30~60秒間にわたりスピンし
、37℃、5%のCO2で48時間にわたりインキュベートした。
7.終点の4時間前に、8μlのCell Titer Blueを、全てのウェルへと
添加し、37℃、5%のCO2で再インキュベートした。
8.4時間後に、プレートを、Paradigm MultimodeSWを伴うBec
kman Coulter Paradigmまたは同等なスキャナー上で読み取った。
9.Epoは、ベースラインの4倍のBa/F3-EpoR細胞の増殖を刺激した。Ep
oは、Ba/F3-EpoRを、11.2pMの平均および10pM~26pMの範囲の
EC50で刺激した。
10.抗Epo抗体を、アッセイ培地中に4ng/mlのEpoを含有する384ウェル
マイクロプレート内、3連で系列希釈し、室温で30分間にわたりインキュベートした。
11.ウェル1つ当たり20μlの、上記のEpo/抗Epo抗体混合物を、ウェル当た
り2500個のBaF3/EpoR細胞をあらかじめ播種された、黒色に壁面処理された
384ウェルプレートへと添加した。
12.インキュベーション後、上記のステップ7~9で概括した通りにプレートを加工し
た。
48時間後、Epo抗体は、1ng/mlのEpoの存在下で、Ba/F3-EpoR
細胞の増殖を阻害した。抗体は、Ba/F3-EpoR細胞の増殖を、350pM以下の
IC50で阻害した。
F36E細胞は、増殖のために、Epoに高度に依存する。上記で記載した方法を使用
する、Epoによる刺激は典型的に、ベースラインの6倍超のシグナルを結果としてもた
らす。この曲線のEC50は、7pMである。
抗Epo治療用抗体をスクリーニングし、開発のための候補を選択するのに、骨髄親細
胞系に由来するEpo依存性リンパ球様不死化細胞系であるF36E細胞系を使用する増
殖アッセイを使用した。
組換え高グリコシル化ヒトEpoであるダルベポエチンを、細胞の維持および本明細書
で記載される細胞増殖アッセイに使用した。ダルベポエチンは、F36E細胞内の増殖を
、組換えヒトEpo(63.2pg/mlのダルベポエチンおよび81.25pg/ml
のエリスロポエチン;LU-15432、44頁を参照されたい)と同等なEC50で刺
激する。F36E細胞は、成長培地(RPMI1640/5%のFBS/1%のPen-
Strep/5.2U/mlのdEpo)中、1ml当たりの細胞0.25×106個の
最小密度~1ml当たりの細胞1.0×106個の最大密度で、継代10代まで維持した
。
1.Epoを、アッセイ培地(RPMI1640/5%のFBS/1%のPen-Str
ep)中で、所望の最終濃度の4倍である4ng/mlまで希釈した。
2.抗Epo抗体を、アッセイ培地中で、最終濃度の4倍である200nMまで希釈した
。この濃度を、アッセイ培地中6つの点にわたり系列希釈した。陽性基準抗体(例えば、
Epo26)および陰性基準抗体(例えば、抗ニワトリリゾチームモノクローナル抗体)
について希釈を反復した。
3.7.5ulの希釈dEpoおよび7.5ulの抗Epo抗体系列希釈液を、384ウ
ェルポリプロピレンマイクロプレート内、3連で混合し、室温で30分間にわたりインキ
ュベートした。
4.F36E細胞(384ウェルプレート1枚当たり2×106個)をペレット化し、成
長培地を吸引し、細胞をアッセイ培地中で1回洗浄し(1200rpmで5分間にわたり
遠心分離し)、次いで、アッセイ培地中に1ml当たりの細胞3.33×105個まで再
懸濁させた。
5.ウェル1つ当たりの細胞15μl(ウェル1つ当たりの細胞5,000個)を、38
4ウェルポリスチレン細胞培養プレート内の全てのウェルへと添加した。
6.15ulの抗体-Epo混合物を、細胞へと添加した。
7.37℃、5%のCO2で68時間にわたりインキュベートした。
8.ウェル1つ当たり8μlのCell Titer Blueを添加し、37℃、5%
のCO2で4時間にわたりインキュベートした。
9.Fluoroskan Ascent Microplate Fluoromet
erまたは同等なスキャナー上、560(20)Ex/590(10)Emで蛍光を測定
した。
10.平均RFU+/-標準偏差を、抗体nMと対比してプロットし、Graph Pa
d Prizmソフトウェアで非線形回帰曲線へと当てはめることにより、IC50を決
定した。
抗Epo抗体は、F36E細胞増殖を、200pM以下のIC50で阻害した。
合成ペプチドおよびペプチド切断研究
ヒトEpo(hEpo)の構造ドメインに対応する合成ペプチドである、hEpoのド
メイン切断、またはhEpoおよびヒトトロンボポエチン(TPO)の部分を含有するキ
メラ分子を、合成するかまたは組換えにより発現させた。合成ペプチドへの陽性結合は、
Epoのそのドメイン内に含有される残基が、抗Epo抗体への結合に関与することを指
し示した。切断されたタンパク質では、結合の喪失により、切断された部分の抗Epo抗
体への結合への関与が指し示された。しかし、結合の喪失は、切断が、抗Epo抗体への
結合に影響を及ぼすように、残りのタンパク質の構造を著明に改変する可能性を除外しな
かった。ヒトEpo-ヒトTPOキメラは、構造の維持を可能としながら、なおエピトー
プマッピングも許容した。hTPOの一部分を含有する変異体への結合の喪失は、hEp
o内の相同領域が、抗Epo抗体への結合に重要であることを指し示した。
エリスロポエチンのヘリックスに対応する以下の6つのペプチド(表6)を合成した。
1.384ウェルMSD standardプレート(Mesoscale Disco
very;型番L21XA-4)上で、PBS中25ulのペプチド(5ug/ml)を
一晩にわたりコーティングした。
2.プレートを、90ulのPBS+5%のBSA/0.1%のTween-20/0.
1%のTritonX-100で、4時間にわたりブロッキングした。
3.PBS+2%のBSA/0.1%のTween-20/0.1%のTritonX-
100による希釈液中500nMのMorphosys Epo Fabを、プレートへ
と添加し、1時間にわたりインキュベートした。
4.プレートを洗浄し、Epo Fabまたは基準タンパク質/抗体に適切な種に対する
、Sulfo-Tag抗ヒトIgG(Meso Scale Discovery;型番
R32AJ-1)と共にインキュベートした(1時間)。
5.プレートを洗浄し、MSD Read Solution(Meso Scale
Discovery;型番R92TC-1)を添加した。
6.プレートを読み取る。
ピング
Epo変異体1:ヘリックスA
Epo変異体2:ヘリックスA、ループA~B
Epo変異体3:ヘリックスA、ループA~B、ヘリックスB
Epo変異体4:ヘリックスA、ループA~B、ヘリックスB、ループB~C、ヘリック
スC
Epo変異体5:全長エリスロポエチン
1.標準的なストレプトアビジン384ウェルプレート(Mesoscale Disc
overy;型番L21SA-1)を、HEK293により発現させたビオチニル化Ep
o変異体で、4℃で一晩にわたりコーティングした。
2.プレートを、90ulのPBS+5%のBSA/0.1%のTween-20/0.
1%のTritonX-100で、4時間にわたりブロッキングした。
3.プレートを洗浄し、500nMのMorphosys Epo Fabを、プレート
へと添加し、1時間にわたりインキュベートした。
4.プレートを洗浄し、Epo Fabまたは基準タンパク質/抗体に適切な種に対する
、Sulfo-Tag抗ヒトIgG(Meso Scale Discovery;型番
R32AJ-1)と共にインキュベートした(1時間)。
5.プレートを洗浄し、MSD Read Solution(Meso Scale
Discovery;型番R92TC-1)を添加した。
6.プレートを読み取る。
による、抗エリスロポエチン抗体についてのエピトープマッピング
Epo/Tpoキメラ体
Epo/Tpo変異体1:TpoヘリックスAを伴うヒトEpo
Epo/Tpo変異体2:TpoループA~Bを伴うヒトEpo
Epo/Tpo変異体3:TpoヘリックスBを伴うヒトEpo
Epo/Tpo変異体4:TpoヘリックスCを伴うヒトEpo
Epo/Tpo変異体5:TpoヘリックスDを伴うヒトEpo
Rb/Hu Epo変異体1:ヒトヘリックスAを伴うウサギEpo
Rb/Hu Epo変異体2:ヒトループA~Bを伴うウサギEpo
Rb/Hu Epo変異体3:ヒトヘリックスBを伴うウサギEpo
Rb/Hu Epo変異体4:ヒトループB~CおよびヘリックスCを伴うウサギEpo
Rb/Hu Epo変異体5:ヒトループC~Dを伴うウサギEpo
Rb/Hu Epo変異体6:ヒトヘリックスDを伴うウサギEpo
1.384ウェルMSD standardプレート(Mesoscale Disco
very;型番L21XA-4)上で、PBS中25ulのEpoキメラ体(2ug/m
l)を、4℃で一晩にわたりコーティングした。
2.プレートを、90ulのPBS+5%のBSA/0.1%のTween-20/0.
1%のTritonX-100で、4時間にわたりブロッキングした。
3.PBS+2%のBSA/0.1%のTween-20/0.1%のTritonX-
100による希釈液中500nMのMorphosys Epo Fabを、プレートへ
と添加し、1時間にわたりインキュベートした。
4.プレートを洗浄し、Epo Fabまたは基準タンパク質/抗体に適切な種に対する
、Sulfo-Tag抗ヒトIgG(Meso Scale Discovery;型番
R32AJ-1)と共にインキュベートした(1時間)。
5.プレートを洗浄し、MSD Read Solution(Meso Scale
Discovery;型番R92TC-1)を添加した。
6.プレートを読み取る。
標準的な捕捉用384ウェルMSDプレート(Meso Scale Discove
ry)上で、ペプチド(PBS中5ug/ml;New England Peptid
e LLC)またはEpoキメラ体(PBS中2ug/ml)をコーティングし、4℃で
一晩にわたりインキュベートした。標準的なストレプトアビジン捕捉用384ウェルMS
Dプレートを、ビオチニル化切断Epo変異体(PBS中に2ug/ml)で一晩にわた
りコーティングした。プレートをTBST(Thermo Scientific;型番
28360)で1回洗浄した後で、プレートを、希釈液(PBS、5%のBSA、0.1
%のTween-20、0.1%のTritonX-100)中、室温で4時間にわたり
ブロッキングした。プレートを、TBST中で3回にわたり洗浄した。500ナノモルの
抗エリスロポエチンfabを、ペプチド/Epo変異体であらかじめコーティングしたM
SDプレートへと1時間にわたり添加した。プレートを、TBST中で3回にわたり洗浄
し、抗ヒトIgG-Sulfotag(1ug/ml、Meso Scale Disc
overy;型番R32AJ-1)を添加し、60分間にわたりインキュベートした。プ
レートを、TBST中で3回にわたり洗浄し、1倍濃度のRead Buffer T(
Meso Scale Discovery;型番R92TC-1)を添加した。プレー
トを、MSD Spector Imager 6000上で読み取り、データは、Gr
aphPad Prismソフトウェアv4を使用して解析した。
結果は、抗体の以下のドメイン(表7)への結合は、最小限であることを指し示した。
ヘリックスCに結合する抗体は見られなかった。
グリコシル化組換えヒトエリスロポエチン(Epo)は、LEK Pharmaceu
ticals,Incから受領した。
ngland Biolabs;型番P6039S)を使用して脱グリコシル化させた。
30mgのhEpoを、1mlのProtein Deglycosylation M
ixと組み合わせ、37℃で1時間にわたりインキュベートしたが、SDS-PAGEに
より決定される通り、この時点における脱グリコシル化は不完全であった。次いで、さら
なる0.5mlのProtein De-glycosylation Mixを、Ep
oへと添加し、37℃で1時間にわたりさらにインキュベートした。ゲル解析は、Epo
のほぼ完全な脱グリコシル化を示した。次いで、25mMのHEPES pH7.5、1
50mMのNaCl中で平衡化させた、120mlのSuperdex75カラム(GE
Healthcare;型番28-9893-33)を使用して、このタンパク質をさ
らに精製した。hEpoの最高レベルの脱グリコシル化を含有する溶出画分をプールした
。5mgの脱グリコシル化させたEpoを、7mgのNVS3と組み合わせた後、氷上で
1時間にわたるインキュベーションにより、タンパク質複合体を形成した。次いで、タン
パク質複合体ミックスを濃縮し、25mMのHEPES pH7.5、150mMのNa
Cl中で平衡化させた、120mlのSuperdex 75へと適用した。SDS-ゲ
ルで査定した化学量論比のEpo:NVS3を含有する画分をプールし、19mg/ml
(LCUVにより推定される濃度)(PRONOVA;型番27SN)まで濃縮した。結
晶化スクリーンは、この濃縮されたEpo:NVS3複合体を使用して準備した。結晶は
、等容量のタンパク質およびレザバー溶液を含有する液滴を伴う、シッティングドロップ
蒸気拡散法により成長させた。結晶は、以下のレザバー条件:0.1MのHepes p
H7.0、12%のPEG3350、50mMの酢酸亜鉛二水和物により、4℃で形成さ
れた。結晶は、以下の低温保護溶液:0.1MのHepes pH7.0、15%のPE
G3350、50mMの酢酸亜鉛二水和物、22%のグリセロールを使用して凍結させた
。
urce(Argonne National Laboratory、USA)のビー
ムライン17-IDで収集した。autoPROC(Global Phasing,L
TD)を使用して、空間群C2内でデータを加工し、細胞の寸法を、a=125.57Å
、b=150.15Å、c=163.84Å、アルファ=90°、ベータ=110.81
°、ガンマ=90°として、2.6Åでスケーリングした。Epo:NVS3構造は、P
haserを使用する分子置換(McCoyら、(2007) J. Appl. Cryst. 40:658~674)に
より解いた。PDBデータベース内の3HOT構造(Berman 2000)に由来するFabを
、可変ドメインと定常ドメインとにスプリットさせ、ヒトエリスロポエチン構造(Syedら
、Nature. 1998年10月1日、395(6701):511~6;PDBコード:1EER)を検索モデ
ルとして使用した。
、COOT(Emsley & Cowtan(2004) Acta Cryst. 60:2126~2132)により構築し、P
HENIXを使用して、それぞれ、23.0%および26.7%のR値およびRfree
値まで精緻化したところ、結合長および結合角のそれぞれについてのrmsdは、0.0
10Åおよび1.34°であった(Adamsら、Acta Cryst. D66、213~221(2010))。
つのEpoタンパク質に結合した1つのFabからなる、3つのEpo:NVS2タンパ
ク質複合体からなる非対称ユニットが明らかになった。これらの複合体のうちの2つは、
亜鉛により媒介される二量体を形成し、第3の複合体は、b因子の増大および密度の低下
を呈示する。FabからEpoへの相互作用は、NVS3の重鎖および軽鎖の両方に由来
する相補性決定領域(CDR)ループにより媒介された。1EERと比較した場合の、E
poのコンフォメーショナル変化は、Fab結合性エピトープから遠位にあるループに限
定され、配列決定された144のアミノ酸の全てについて、RMSDは0.5Åであった
。Fab NVS3の重鎖および軽鎖は、ドメインに典型的な免疫グロブリン様フォール
ドを示す。
を同定した。Epo上の相互作用表面は、主に残基Ser9、Glu13、残基Thr4
4~Arg53、および残基Asn147~Arg162を含む残基により形成された。
これらは、α-ヘリックスA、ループβA~αB、およびα-ヘリックスDとして表示さ
れるEpoの二次構造エレメントに対応する。これらの残基は、NVS3により認識され
る三次元表面を形成した。相互作用は、骨格相互作用、溶媒により媒介される相互作用、
および直接的な側鎖相互作用を含んだ。
る潜在的な相互作用の原因となるように、NVS3から5Å以内にあると規定される。
な相互作用の原因となるように、タンパク質パートナーから5Å以内にあると規定される
。
実施例5a:眼浮腫のマウスモデル
C57/Bl6マウス(Taconic)に、ssAAV2-EPO-eGFP(DR
005)およびssAAV2-EGFP(TM003)(対照)を網膜下注射した。注射
の3週間(21日間)後にマウスを屠殺した。網膜をフラットマウント化し、血管径を測
定した。
ssAAV2-EPO-eGFPおよびssAAV2-eGFPの網膜下注射
8週齢のC57/Bl6マウスを、2つの群(1群当たり10匹ずつのマウス;20の
眼)に分け、2×109DRP/μlで、1μlのssAAV2を網膜下注射した。第1
群(対照群)には、網膜下ssAAV2-EPO(TM003)を施し、第2群(被験群
)には、ssAAV2-eGFP(DR005)を施した。網膜血管変化に対するマウス
Epoの効果は、注射の21日後に、網膜フラットマウント内で検討した。
Therapy Center Virus Vector Core Facilit
y、The University of North Carolina at Ch
apel Hillによる(AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP):ロッ
ト番号AV3782]、およびssAAV2-GFP[Gene Therapy Ce
nter Virus Vector Core Facility、The Univ
ersity of North Carolina at Chapel Hillに
よる(AAV2-eGFP):ロット番号AV3725]であった。
AAVベクターは、被験マウスの両方の眼に対する網膜下注射を介して送達した。記載
される全ての手順は、滅菌試薬、滅菌シリンジ、および適切なPPEを使用して、無菌条
件下で実施した。
1.マウスを固定し、シクロペントレート(1%)の滴下によりそれらの瞳孔を開いた後
で、2.5%のフェニレフリンを滴下した。
2.次に、動物に、腹腔内Avertin(250mg/kg)で麻酔をかけた。0.5
%のプロパラカインの滴下により、角膜に局所麻酔をかけた。
3.動物を手術用顕微鏡下に置いた後で、マイクロスカルペルを使用して、角膜縁の後方
に0.5mmの鼻腔内切除を施した。
4.10μlのHamiltonシリンジへと取り付けたブラントニードルを、強膜切除
を介して、耳側網膜へと接線方向に挿入した。注射針は、抵抗感があるまで推し進めた。
5.1μlのssAAV2ベクター(両方とも送達を視覚化するための、1:50に希釈
されたフルオレセインを含有する、ssAAV2-EPO-eGFPまたはssAAV2
-GFPのいずれか)を、網膜下腔へとゆっくり注射した。
6.手術用顕微鏡下で眼を観察した。網膜下注射の成功は、フルオレセインを含有する網
膜剥離を視覚化することにより確認した。
7.注射は、網膜損傷(出血サイズにより視覚化される)および水晶体への損傷の程度に
応じて評定した。
8.動物を逆側に向け、手順を反復した。
9.抗生剤軟膏を、注射後における両方の眼へと適用した。
1.安楽死(CO2)の1~5分前に、0.1mlのConcavalin-A(Con
-A)を注射した(尾静脈における静脈内注射)。
2.眼を摘出し、パラホルムアルデヒド(4%のPBS中の)中で、2時間にわたり固定
した。その後、切除するまで、眼を、PBS緩衝液中、4℃で、1~3日間にわたり維持
した。
3.角膜および水晶体を除去し、網膜を、後眼部の杯状構造(網膜色素上皮/脈絡膜)か
ら切除した。
4.網膜へと4つの放射状切開を施し、Vectashieldマウンティング培地によ
り、光受容体層を下向きにしてフラットマウントした。
5.マウントしたら、フラットマウントを中心網膜中心とし(視神経頭を基準として使用
して)、Zeiss Imaging System(AxioVision)を使用し
て、Con-Aで標識された網膜血管を、20倍で捕捉した。
6.AxioVisionソフトウェアを使用して、視神経頭から200μm離れた中心
網膜血管の直径を測定した。
7.得られたデータは、GraphPad Prismにより解析した。
血管直径の定量化は、ssAAV2-EPOが、ssAAV2-GFPによる眼および
ナイーブの眼(6つの眼)と比較して有意な(*p<0.001)、中心網膜における血
管拡張を誘導することを明らかにした(図1)。ssAAV2-GFP群をナイーブ群と
対比して比較したところ、有意差は見出されなかった。試料は、ダネットの事後検定を伴
う一元ANOVAを使用して解析した(C)各群の代表的なフラットマウント。AAV2
-Epo-eGFPによる長時間にわたるEpoの送達は、ヒトにおける糖尿病性黄斑浮
腫の鍵となる顕徴である、静脈径の統計学的に有意な増大を結果としてもたらした(図1
)。したがって、一態様では、本発明は、本明細書で記載される抗EPO抗体を、対象へ
と、治療有効量で投与することにより、眼内の静脈径を減少させる方法に関する。
本明細書で記載される抗Epo抗体のin vivoにおける活性および治療有効性は
、上記で記載したマウス眼浮腫モデルにおいて評価することができる。
8週齢のC57B6マウスに、以下のうちの1つを網膜下注射した。
群:
群1:2×109DRPの力価のAAV2-eGFP、眼1つ当たり1ul、マウス10
匹の眼のn=20
群2:2×109DRPの力価のAAV2-Epo-eGFP、眼1つ当たり1ul、マ
ウス10匹の眼のn=20
群3:2×109の力価のAAV2-Epo-eGFP、眼1つ当たり1ul、+抗Ep
o Fab、眼1つ当たり100ug、毎週1回、マウス10匹の眼のn=20
効果を、マウスモデルにおいて検討する。
-CMV-mEpo-IRES-eGFP)は、Gene Therapy Cente
r Virus Vector Core Facility、The Univers
ity of North Carolina at Chapel Hillによる。
の減少および低酸素状態に対する効果を改善するであろう。したがって、抗Epo抗体は
、湿潤型AMDおよび糖尿病性網膜症などの網膜血管疾患を伴う患者においてもまた見ら
れる網膜病態を軽減することが予測される。
実施例6a:in vivoにおける、抗Epo Fabを使用する遊離EPOの中和
抗EPO抗体のin vivoにおける活性および治療有効性を、ウサギの眼において
以下の通りに評価した。ウサギに、抗EPO FabのNVS2(眼1つ当たり1mg)
を硝子体内投与し、4日間後でEPOの硝子体内投与(眼1つ当たり3ug)でチャレン
ジした。動物を屠殺し、硝子体液を含む眼組織を抽出した。硝子体液中の遊離EPOおよ
び総EPO量は、下記で記載する通りに決定した。
アッセイは、コーティング緩衝液(PBS)およびインキュベーション緩衝液(2%の
BSA(Sigma型番A4503)および0.1%のTween20および0.1%の
Triton-Xを伴うPBS)を使用する、標準的なMSD結合プレート(Meso-
Scale Discovery、384ウェル:MSD型番L21XA)を使用して実
施した。
インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液(0.05%のTween20を伴うPB
S)中で3回にわたり洗浄し、25μlのインキュベーション緩衝液により、室温で2時
間にわたりブロッキングした。プレートを、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄した。イン
キュベーション緩衝液中の硝子体液希釈液(vitreous dilutions)をプレートへと添加し
(25μl)、室温で60分間にわたりインキュベートした。ヒト組換えダルベポエチン
を、基準物質として使用した(A000123;2μg/mlで開始する)。プレートを
、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄した。25μlの一次抗体を添加し(インキュベーシ
ョン緩衝液中に1μg/ml)、室温で60分間にわたりインキュベートした。プレート
を、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄した。25μlの抗種二次Sulfo-TAG抗体
を添加し(インキュベーション緩衝液中に1:1000)、室温で60分間にわたりイン
キュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄し、1倍濃度のMSD
Read buffer T(界面活性剤;MSD型番R92TC-1を伴う)25μl
を添加した。プレートを、MSD Spector Imager 6000上で読み取
った。
予測される通り、抗EPOまたは媒体を注射された動物の硝子体液中で測定された総E
POレベルは類似した(図2)。これに対し、抗EPO Fabを注射されたウサギの硝
子体液中では、遊離EPOが測定されなかったが、媒体を注射されたウサギの硝子体液中
では、平均で約100ng/mlの遊離EPOが測定された。予測される通り、硝子体内
投与された抗EPO Fabは、遊離EPOレベルを完全に中和した。
抗EPO抗体のin vivoにおける活性および治療有効性を、ウサギの眼において
以下の通りに評価した。ウサギに、抗EPO FabのNVS2(眼1つ当たり1mg)
とEPO(眼1つ当たり3ug)とをあらかじめ混合した溶液を、硝子体内投与した。動
物を屠殺し、硝子体液を含む眼組織を抽出した。硝子体液中の遊離EPOおよび総EPO
量は、下記で記載する通りに決定した。注:一部の眼には、抗EPO FabとEPOと
VEGFとをあらかじめ混合した溶液を施した。
アッセイは、コーティング緩衝液(PBS)およびインキュベーション緩衝液(2%の
BSA(Sigma型番A4503)および0.1%のTween20および0.1%の
Triton-Xを伴うPBS)を使用する、標準的なMSD結合プレート(Meso-
Scale Discovery、384ウェル:MSD型番L21XA)を使用して実
施した。
インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液(0.05%のTween20を伴うPB
S)中で3回にわたり洗浄し、25μlのインキュベーション緩衝液により、室温で2時
間にわたりブロッキングした。プレートを、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄した。イン
キュベーション緩衝液中の硝子体液希釈液をプレートへと添加し(25μl)、室温で6
0分間にわたりインキュベートした。ヒト組換えダルベポエチンを、基準物質として使用
した(A000123;2μg/mlで開始する)。プレートを、洗浄緩衝液中で3回に
わたり洗浄した。25μlの一次抗体を添加し(インキュベーション緩衝液中に1μg/
ml)、室温で60分間にわたりインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液中で3回
にわたり洗浄した。25μlの抗種二次Sulfo-TAG抗体を添加し(インキュベー
ション緩衝液中に1:1000)、室温で60分間にわたりインキュベートした。プレー
トを、洗浄緩衝液中で3回にわたり洗浄し、1倍濃度のMSD Read buffer
T(界面活性剤;MSD型番R92TC-1を伴う)25μlを添加した。プレートを
、MSD Spector Imager 6000上で読み取った。
予測される通り、抗EPOまたは媒体を注射された動物の硝子体液中で測定された総EPOレベルは類似した(図3)。これに対し、抗EPO Fabを注射されたウサギの硝子体液中では、遊離EPOが測定されなかったが、媒体を注射されたウサギの硝子体液中では、平均で約200ng/mlの遊離EPOが測定された(図3)。VEGFの存在は、測定される遊離EPOレベルまたは総EPOレベルに対して影響を及ぼさないと考えられた。予測される通り、硝子体内投与された抗EPO Fabは、遊離EPOレベルを完全に中和した。
本発明は以下の態様を含み得る。
[1]
Epoに、50pM以下のK D で結合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
[2]
EpoのヘリックスDドメインに結合する、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[3]
EpoのループA~Bドメインにさらに結合する、請求項1または請求項2に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[4]
EpoのヘリックスAドメインにさらに結合する、請求項2または請求項3のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[6]
前記抗体が、ヒトEpoに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[7]
EpoヘリックスDおよびループA~B内のアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[8]
EpoヘリックスA内のアミノ酸をさらに含むコンフォメーショナルエピトープに結合する、請求項7に記載の抗体または抗原結合性断片。
[9]
配列番号81の44~50、52、53、147、150、151、154、155、159、および162位におけるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する、請求項1に記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[10]
配列番号81の9、13、44~53、147、150、151、154、155、158、159、および162位におけるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[11]
配列番号81の23、43~50、52、53、131、143、147、150、151、154、155、159、および162位におけるアミノ酸を含むコンフォメーショナルエピトープに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[12]
カニクイザル、マウス、またはラットEpoにも結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[13]
EPO依存性の細胞増殖を、350pM以下のEC 50 でさらに阻害する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[14]
EPO受容体を発現しているB細胞におけるEPO依存性の細胞増殖を阻害する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[15]
表1に記載されている抗体と同じエピトープに結合するか、または表1に記載されている抗体と競合する、単離抗体またはその抗原結合性断片。
[16]
EPOに結合し、
a)配列番号1、2、および3にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号4、5、および6にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、
b)配列番号21、22、および23にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号24、25、および26にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、
c)配列番号41、42、および43にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号44、45、および46にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、または
d)配列番号61、62、および63にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号64、65、および66にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3
を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[17]
配列番号13および14、配列番号33および34、配列番号53および54、または配列番号73および74とそれぞれ少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖可変領域を含む、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[18]
アミノ酸配列が、配列番号15および16、35および36、55および56、または75および76と少なくとも90%の配列同一性を有する重鎖および軽鎖を含むEpoに結合する、前記請求項のいずれかに記載の単離抗体または抗原結合性断片。
[19]
前記抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、Fab、Fab’、F(ab’) 2 、Fv、またはscFvである、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
[20]
前記抗体が、IgGアイソタイプである、前記請求項のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
[21]
前記請求項のいずれかに記載の抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
[22]
前記核酸が、重鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号17、37、57、および77から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項21に記載の核酸分子。
[23]
前記核酸が、軽鎖可変ドメインをコードする配列を含み、前記配列が、配列番号18、38、58、および78から選択される配列と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項21に記載の核酸分子。
[24]
請求項21から23のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
[25]
請求項21から23のいずれかに記載の核酸または請求項24に記載のベクターを含む単離宿主細胞。
[26]
請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片と、薬学的に許容される希釈剤または担体とを含む組成物。
[27]
対象における網膜血管疾患を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法。
[28]
対象における網膜血管疾患が、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、非増殖性糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞、多病巣性脈絡膜炎、近視性脈絡膜血管新生、および未熟児網膜症から選択される疾患または状態と関連する、請求項27に記載の方法。
[29]
対象における黄斑浮腫を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法。
[30]
対象における糖尿病性網膜症を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法。
[31]
対象における糖尿病性黄斑浮腫を処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含む方法。
[32]
増殖性糖尿病性網膜症を処置する方法であって、EPOを、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
[33]
EPO依存性の細胞増殖を阻害する方法であって、EPOを、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。[34]
Epo受容体を発現している細胞におけるEPO依存性の細胞増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
[35]
細胞が、B細胞である、請求項34に記載の方法。
[36]
糖尿病性黄斑浮腫を阻害する方法であって、対象の眼へと、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物を投与するステップを含み、前記組成物の投与が、網膜静脈拡張を低下させ、血管漏出を低下させ、かつ/または眼内の血流を増大させる方法。
[37]
EPOと細胞上のEPO受容体の結合を阻害する方法であって、EPOを、請求項1から20のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片を含む組成物と接触させるステップを含む方法。
[38]
細胞が、対象中にある、請求項37に記載の方法。
Claims (19)
- エリスロポエチン(EPO)に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む、網膜血管疾患を処置するための医薬組成物であって、前記抗体またはその抗原結合性断片が、血管内皮増殖因子(VEGF)拮抗剤と組み合わせて投与され、前記抗体またはその抗原結合性断片が、
a)配列番号1、2、および3にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号4、5、および6にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、
b)配列番号21、22、および23にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号24、25、および26にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、
c)配列番号41、42、および43にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号44、45、および46にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3、または
d)配列番号61、62、および63にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号64、65、および66にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3
を含む、医薬組成物。 - 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号1、2、および3にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号4、5、および6にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号13および14とそれぞれ少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号15および16にそれぞれ示されたアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号21、22、および23にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号24、25、および26にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号33および34とそれぞれ少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号35および36にそれぞれ示されたアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号41、42、および43にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号44、45、および46にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号53および54とそれぞれ少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号55および56にそれぞれ示されたアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項6に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号61、62、および63にそれぞれ示された重鎖可変領域HCDR1、HCDR2、およびHCDR3、ならびに配列番号64、65、および66にそれぞれ示された軽鎖可変領域LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含み、かつ、前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号73および74とそれぞれ少なくとも90%同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号75および76にそれぞれ示されたアミノ酸配列を有する重鎖および軽鎖を含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、Fabである、請求項1~9のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗体またはその抗原結合性断片が、ウイルスベクターにて発現される、請求項1~10のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記AAVベクターが、AAV2である、請求項12に記載の医薬組成物。
- 前記網膜血管疾患が、糖尿病性黄斑浮腫である、請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記網膜血管疾患が、増殖性糖尿病性網膜症、黄斑浮腫、加齢黄斑変性または網膜静脈閉塞である、請求項1~13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記VEGF拮抗剤が、抗VEGF抗体、抗VEGF受容体抗体またはVEGF阻害剤である、請求項1~15のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記抗VEGF抗体が、ラニビズマブである、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記抗VEGF抗体が、ベバシズマブである、請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記VEGF阻害剤が、アフリベルセプトである、請求項16に記載の医薬組成物。
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