ES2864326T3 - Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a EPO - Google Patents

Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a EPO Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a eritropoyetina (Epo) humana, que comprende secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera de Fab NVS1 representadas por SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente; de Fab NVS2 representadas por SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente; de Fab NVS3 representadas por SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente; o de Fab NVS4 representadas por SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos para anticuerpos dirigidos a EPO
Antecedentes de la invención
La retinopatía diabética (RD) es la complicación más común en pacientes con diabetes. El edema macular diabético (EMD) puede producirse en cualquier estadio de RD y es la causa principal de pérdida de visión en pacientes con RD. Se ha informado de que la incidencia de EMD después de 10 años de seguimiento es de un 20,1 % en diabetes de tipo 1, un 25,4 % en diabetes insulinodependiente de tipo 2 y un 13,9 % en diabetes no insulinodependiente de tipo 2 (Klein et al. (1995) Ophthalmology 102, 7-16). El ensayo ETDRS ((1985) Photocoagulation for Diabetic Macular Edema - Early Treatment Diabetic- Retinopathy Study Report. 1. Archives of Ophthalmology 103, 1796-1806), un estudio pionero en RD, demostró que, aunque el tratamiento de fotocoagulación por láser reduce el riesgo de pérdida de visión moderada en ojos con EMD en ~50 % a los 3 años, solamente unos pocos ojos obtienen aumento de la visión y algunos ojos siguen experimentando pérdida de visión incluso después de tratamiento intensivo. En los últimos años, los avances en farmacoterapia y suministro de fármacos oculares se han mostrado prometedores en el tratamiento de EMD. El estudio RESTORE, uno de dos ensayos en fase III central en EMD (Mitchell et al. (2011) Ophthalmology 118, 615-625) demostró que Lucentis® era superior a la monoterapia con láser. El cambio principal en la agudeza visual mejor corregida (BCVA), que fue el criterio de valoración clínico principal, se mejoró significativamente en el grupo de Lucentis® (+6,1 letras para el grupo de Lucentis® frente a 0,8 letras para el grupo de láser; p <0,0001). Se han demostrado efectos beneficiosos similares con VEGF Trap-Eye (Regeneron Inc. NY, EE. UU.) y Ozurdex® (implante intravítreo de dexametasona; Allergan Inc., CA, EE. UU.) (Do et al. (2011) Ophthalmology 118, 1819-1826; Haller et al. (2010) Archives of Ophthalmology 128, 289-296). Sin embargo, un 16 % de los ojos tratados con Ozurdex desarrolló presión intraocular aumentada, un riesgo para glaucoma.
Yanagihara et al. (J Immunoassay Immunochem 29:181-96, 2008) describe la producción de anticuerpos monoclonales antieritropoyetina (EPO) humana recombinante y proporciona cinco anticuerpos monoclonales murinos que reaccionaron específicamente con EPO humana. El anticuerpo de Yanagihara et al. con la afinidad más fuerte por EPO tenía una Kd de 516 pM.
A pesar de estas nuevas opciones de tratamiento para EMD, sigue habiendo una necesidad médica insatisfecha sustancial. En los ensayos centrales de Lucentis® ~25 % de los ojos no obtuvieron ningún aumento en la agudeza visual después de 12 meses de tratamiento y ~50 % de los ojos quedaron con una agudeza visual de 20/40 o peor. Estudios de asociación genómica indicaron que los diabéticos que son homocigóticos para un polimorfismo (T) del promotor de eritropoyetina (Epo) tienen un riesgo 2,17 veces mayor de desarrollar RD proliferativa (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A l05, 6998-7003). De forma interesante, las personas con el alelo T del promotor para Epo tienen aproximadamente una concentración vítrea 7,5 veces mayor de Epo en comparación con personas con el alelo G (Tong et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 6998-7003).
Sigue habiendo una necesidad de desarrollar un tratamiento eficaz para retinopatía diabética, particularmente EMD para remplazar o complementar los tratamientos actuales.
Sumario de la invención
La invención se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno, como se describe en este documento que se unen a Epo y/o Darbepoyetina.
Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera de Fab NVS1 (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente), NVS2 (SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente), NVS3 (Se Q ID NO: 53 y 54, respectivamente) o Nv S4 (SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente).
Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno, descritos en este documento se unen a Epo y/o Darbepoyetina, con una Kd de menos de o igual a 100 pM. Por ejemplo, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse a Epo humana y/o Darbepoyetina con una Kd de menos de o igual a 50 pM, menos de o igual a 40 pM, menos de o igual a 35 pM, menos de o igual a 30 pM, menos de o igual a 25 pM, menos de o igual a 20 pM, menos de o igual a 15 pM, menos de o igual a 14 pM, menos de o igual a 13 pM, menos de o igual a 12 pM, menos de o igual a 11 pM, menos de o igual a 10 pM. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo humana con una Kd de menos de o igual a 35 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 6 pM, medida por valoración en equilibrio en solución (SET - Solution Equilibrium Titration). Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Darbepoyetina con una Kd de menos de o igual a 24 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 4 pM, medida por SET.
El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en este documento se une a Epo humana, de macaco, de ratón y/o de rata. También se describen en este documento anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo conformacional que comprende aminoácidos seleccionados de la hélice D y bucle A-B de Epo. También se describen en este documento anticuerpos aislados , o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo conformacional que comprende aminoácidos seleccionados de la hélice D, bucle A-B y hélice A de Epo. Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden unirse al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88). En otros aspectos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse al dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89). En otros aspectos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse al dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89) y hélice A (aminoácidos 4-26 de Epo humana; SEQ ID NO: 86). Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88) y el dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89). Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88) y hélice A (aminoácidos 4-26 de Epo humana; SEQ ID NO: 86). Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden unirse al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88), el dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; Se Q ID NO: 89) y hélice A (aminoácidos 4-26 de Epo humana; SEQ ID NO: 86).
También se describen en este documento anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo conformacional en Epo que comprende los residuos aminoacídicos Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 y Arg162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81). Se describen además anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo conformacional en Epo que comprende los residuos aminoacídicos Ser9, Gln13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159 y Arg162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81). También se describen en este documento anticuerpos aislados, o fragmento de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo conformacional en Epo que comprende los residuos aminoacídicos Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 y Arg162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81).
La presente solicitud también describe anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a Epo y compiten además por la unión con un anticuerpos como se describe en la tabla 1. La presente solicitud también describe anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo como se describe en la tabla 1.
Se describe además en este documento un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Epo y tiene un punto isoeléctrico (pI) mayor de 8,2, mayor de 8,3, mayor de 8,4, mayor de 8,5 o mayor de 9,0.
Los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo de macaco, Epo de ratón y/o Epo de rata con una Kd de menos de o igual a 100 pM, menos de o igual a 80 pM, menos de o igual a 70 pM, menos de o igual a 60 pM, menos de o igual a 50 pM, menos de o igual a 40 pM, menos de o igual a 35 pM, menos de o igual a 30 pM, menos de o igual a 25 pM, menos de o igual a 20 pM, menos de o igual a 15 pM, menos de o igual a 10 pM, menos de o igual a 5 pM, menos de o igual a 4 pM, menos de o igual a 3 pM, menos de o igual a 2 pM, menos de o igual a 1 pM. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo de macaco, Epo de ratón y/o Epo de rata con una Kd de menos de o igual a 80 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 40 pM, medida por SET. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo de macaco con una Kd de menos de o igual a 80 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 8 pM, medida por SET. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo de ratón con una Kd de menos de o igual a 45 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 37 pM, medida por SET. Más específicamente, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento también pueden unirse a Epo de rata con una Kd de menos de o igual a 57 pM, medida por Biacore, o menos de o igual a 13 pM, medida por SET.
La afinidad de unión de anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento puede determinarse por SET. Los métodos para SET son conocidos en la técnica y se describen en mayor detalle a continuación. Como alternativa, la afinidad de unión de los anticuerpos aislados, o fragmentos, descritos en este documento puede determinarse por ensayo Biacore. Los métodos para ensayos cinéticos Biacore son conocidos en la técnica y se describen en mayor detalle a continuación.
Los anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden usarse para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo con una CI50 de menos de o igual a 350 pM, menos de o igual a 300 pM, menos de o igual a 250 pM, menos de o igual a 200 pM, menos de o igual a 190 pM, menos de o igual a 180 pM, menos de o igual a 175 pM, menos de o igual a 170 pM, menos de o igual a 160 pM, menos de o igual a 150 pM, menos de o igual a 125 pM, menos de o igual a 115 pM, menos de o igual a 110 pM, menos de o igual a 100 pM, menos de o igual a 90 pM o menos de o igual a 80 pM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento puede inhibir la proliferación celular dependiente de Epo medida por un ensayo de proliferación de células Ba/F3-EpoR in vitrn con una CI50 de menos de o igual a 338 pM, menos de o igual a 183 pM, menos de o igual a 175 pM, menos de o igual a 174 pM, menos de o igual a 145 pM, menos de o igual a 112 pM, menos de o igual a 89 pM o menos de o igual a 74 pM.
Los anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden usarse para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo en linfocitos B. Más específicamente, los anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden usarse para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo en linfocitos B de ratón. Por ejemplo, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inhibir la proliferación celular dependiente de Epo medida por un ensayo de proliferación de células Ba/F3-EpoR in vitro con una CI50 de menos de o igual a 350 pM, menos de o igual a 300 pM, menos de o igual a 250 pM, menos de o igual a 200 pM, menos de o igual a 175 pM, menos de o igual a 150 pM, menos de o igual a 125 pM, menos de o igual a 115 pM, menos de o igual a 110 pM, menos de o igual a 100 pM, menos de o igual a 90 pM o menos de o igual a 80 pM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento puede inhibir la proliferación celular dependiente de Epo medida por un ensayo de proliferación de células Ba/F3-EpoR in vitro con una CI50 de menos de o igual a 338 pM, menos de o igual a 174 pM, menos de o igual a 112 pM o menos de o igual a 74 pM.
Los anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento pueden usarse para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo de linfocitos B humanos. Por ejemplo, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede inhibir la proliferación celular dependiente de Epo, medida por un ensayo de proliferación de células F36E in vitro, con una CI50 de menos de o igual a 200 pM, menos de o igual a 190 pM, menos de o igual a 180 pM, menos de o igual a 170 pM, menos de o igual a 160 pM, menos de o igual a 150 pM, menos de o igual a 125 pM, menos de o igual a 100 pM o menos de o igual a 90 pM. Más específicamente, un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento puede inhibir la proliferación celular dependiente de Epo medida por un ensayo de proliferación de células F36E in vitro con una CI50 de menos de o igual a 183 pM, menos de o igual a 175 pM, menos de o igual a 145 pM o menos de o igual a 89 pM.
Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, también pueden bloquear la unión de Epo al receptor de Epo y/o evitar la unión de Epo a una superficie celular.
Se describen además en este documento anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Epo humana, de macaco, de ratón y/o de rata. En un aspecto adicional, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno, compite por la unión con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, descrito en la tabla 1.
Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se describen en este documento, pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos o humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos F(ab')2 o fragmentos scFv y/o isotipos de IgG.
Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos, como se describen en este documento, también pueden incluir una región flanqueante en que un aminoácido se ha sustituido en la región flanqueante del anticuerpo con respecto a las secuencias respectivas de la línea germinal de VH o VL humana.
El anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo pueden tener las secuencias completas de la cadena pesada y ligera de Fab descritos en la tabla 1. Más específicamente, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener las secuencias de la cadena pesada y ligera de Fab NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4.
Un aspecto adicional de la invención incluye un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene las secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera de Fab NVS1 (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente), NVS2 (SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente), NVS3 (SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente) o NVS4 (SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente).
En un aspecto de la invención, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo incluye una secuencia del dominio variable de la cadena pesada (VH) seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 33, 53 y 73. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno puede comprender además una secuencia del dominio variable de la cadena ligera (VL), en el que el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera se combinan para formar un sitio de unión a antígeno para Epo. En particular, la secuencia del dominio variable de la cadena ligera puede seleccionarse de SEQ ID NO: 14, 34, 54 y 74, en la que dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a Epo.
La invención también se refiere a un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que incluye una secuencia del dominio variable de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 34, 54 y 74, en el que dicho anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a Epo humana. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno puede comprender además una secuencia del dominio variable de la cadena pesada, en el que el dominio variable de la cadena ligera y el dominio variable de la cadena pesada se combinan para formar un sitio de unión a antígeno para Epo.
En particular, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a Epo, puede tener dominios variables de la cadena pesada y ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 13 y 14; 33 y 34; 53 y 54; o 73 y 74, respectivamente.
En otro aspecto de la invención, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Epo tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden las secuencias de SEQ ID NO: 15 y 16; 35 y 36; 55 y 56; o 75 y 76, respectivamente.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en este documento. Así como composiciones de anticuerpo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Específicamente, la invención incluye además composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en la tabla 1, tal como, por ejemplo anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de dos o más de los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención descritos en la tabla 1.
La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada variable que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 13, 33, 53 y 73. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia con al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 17, 37, 57 y 77. En un aspecto adicional de la invención, la secuencia es SEQ ID NO: 17, 37, 57 o 77.
La invención también se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera variable que tiene una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 14, 34, 54 y 74. En particular, el ácido nucleico tiene una secuencia con al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 38, 58 y 78. En un aspecto adicional de la invención, la secuencia es SEQ ID NO: 18, 38, 58 o 78.
La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que incluye un dominio variable de la cadena ligera que tiene al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 38, 58 y 78.
La invención también se refiere a un vector que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención descritas en este documento.
La invención también se refiere a una célula hospedadora aislada que incluye una o más de las moléculas de ácido nucleico o vectores de la invención descritos en este documento. La invención también se refiere a una célula hospedadora aislada que incluye una secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena pesada del anticuerpo de la invención descrito anteriormente, y una segunda secuencia de ADN recombinante que codifica una cadena ligera del anticuerpo de la invención descrito anteriormente, en la que dichas secuencias de ADN están unidas de forma funcional a un promotor y pueden expresarse en la célula hospedadora. Se contempla que el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal humano. También se contempla que la célula hospedadora es una célula de mamífero no humano, por ejemplo, una célula CHO.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la proliferación celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo (por ejemplo, poner contacto Epo en un sujeto) con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula que comprende Epo) con una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo en un sujeto. Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la señalización celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento para evitar la interacción de Epo con un receptor en una superficie celular. En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula que comprende Epo con una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso para inhibir la señalización celular dependiente de Epo en un sujeto. Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la proliferación o señalización celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento de la invención para evitar la interacción de Epo con un receptor en una superficie celular. Se contempla que la célula es un linfocito B. Se contempla que la célula es una célula humana.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la unión de Epo al receptor de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo (por ejemplo, poner contacto Epo en un sujeto) con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para su uso para inhibir la unión de Epo al receptor de Epo en una célula de un sujeto; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La invención se refiere además también a un método de inhibición de la unión de Epo a una célula, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo (por ejemplo, en un sujeto) con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula que comprende Epo) con una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento. La invención se refiere además también a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso para inhibir la unión de Epo a una célula en un sujeto. En un aspecto, se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de tratamiento de edema macular en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para tratar el edema macular en un sujeto. En un aspecto, el edema macular está asociado con vasculopatía retiniana. Se contempla que la vasculopatía retiniana asociada con el edema macular puede incluir retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía diabética no proliferativa, degeneración macular senil, oclusión de la vena retiniana, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. También se contempla que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de tratamiento de una afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para tratar una afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana en un sujeto. En un aspecto, se contempla que la afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana es retinopatía diabética. En otro aspecto, se contempla que la afección o trastorno es degeneración macular senil. Se contempla además también que la afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana puede ser oclusión de la vena retiniana, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. También se contempla que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de tratamiento de una afección o trastorno asociado con retinopatía diabética en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para tratar una afección o trastorno asociado con retinopatía diabética en un sujeto. Se contempla que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de tratamiento de una afección o trastorno asociado con edema macular en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en este documento, para tratar una afección o trastorno asociado con edema macular en un sujeto. Se contempla además que la afección o trastorno asociado con edema macular es edema macular diabético. Se contempla además que el sujeto es humano.
La invención también se refiere a un método de tratamiento de retinopatía diabética proliferativa en un sujeto, en el que el método incluye la etapa de administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para tratar la retinopatía diabética proliferativa en un sujeto. Se contempla además que la composición se administra al ojo del sujeto, en el que la composición disminuye la dilatación de la vena retiniana, disminuye la filtración vascular y/o aumento el flujo de sangre en el ojo. Se contempla además que el sujeto es humano.
Cualquiera de los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos anteriores puede ser un anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Definiciones
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los comprendidos normalmente por los expertos en la materia a la pertenece esta invención.
El término "anticuerpo", como se usa en este documento, significa un anticuerpo completo y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "parte de unión a antígeno") o cadena individual del mismo. Un anticuerpo completo es una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en este documento como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (abreviada en este documento como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amínico hasta el extremo carboxílico en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.
La expresión "parte de unión a antígeno" o "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, como se usa en este documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo intacto que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno dado (por ejemplo, eritropoyetina: Epo). Las funciones de unión a antígeno de un anticuerpo pueden realizarlas fragmentos de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro de la expresión parte de unión a antígeno o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab)2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de un solo dominio (dAb) (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH o un dominio VL; y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.
Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por un conector peptídico artificial que posibilita prepararlos como una sola cadena proteínica en que las regiones Vl y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Dichos anticuerpos monocatenarios incluyen una o más partes o fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos se seleccionan en función de su utilidad de la misma manera que para los anticuerpos intactos.
Los fragmentos de unión a antígeno también pueden incorporarse en anticuerpos de un solo dominio, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Las partes de unión a antígeno de anticuerpos pueden injertarse en estructuras basadas en polipéptidos tales como fibronectina de tipo III (Fn3) (véase la patente de Estados Unidos n.° 6703199, que describe monocuerpos del polipéptido fibronectina).
Los fragmentos de unión a antígeno pueden incorporarse en moléculas monocatenarias que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con los polipéptidos de la cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10):1057-1062; y patentes de Estados Unidos n.° 5641870).
Como se usa en este documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos individuales. Dentro de cada sitio antigénico, la región variable del "brazo" de anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte será la afinidad. Como se usa en este documento, la expresión "alta afinidad" para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (por ejemplo: un fragmento Fab) en general se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que tiene una KD de 10-9M o menos.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y sintéticos, así como análogos aminoacídicos e imitadores aminoacídicos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos aminoacídicos se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono alfa que se une a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Imitadores aminoacídicos se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido de origen natural.
La expresión "especificidad de unión", como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de un anticuerpo individual que se combina con un sitio para reaccionar con solamente un determinante antigénico.
La expresión "se une específicamente (o selectivamente)" a un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de unión a Epo) se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de un antígeno afín (por ejemplo, una Epo humana o Epo de macaco) en una población heterogénea de proteínas y otras sustancias biológicas. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente en este documento con la expresión "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".
La expresión "afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana" se refiere a afecciones, trastornos o enfermedades en que la retina se degenera o se vuelve disfuncional. Esto incluye retinopatía diabética (RD), edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética proliferativa (RDP), retinopatía diabética no proliferativa (RDNP), degeneración macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. Las características anatómicas de la vasculopatía retiniana que pueden tratarse mediante inhibición de Epo incluyen edema macular, dilatación venosa, tortuosidad de los vasos, filtración vascular medida por angiografía con fluoresceína, hemorragia retiniana y anomalías microvasculares (por ejemplo, microaneurisma, exudados algodonosos, AMIR), prolapso de los capilares, adhesión leucocitaria, isquemia retiniana, neovascularización de la papila óptica, neovascularización del polo posterior, neovascularización del iris, hemorragia intrarretiniana, hemorragia vítrea, cicatriz macular, fibrosis subretiniana y fibrosis retiniana.
La expresión "afección o trastorno asociado con retinopatía diabética" se refiere a afecciones en que la retina se degenera o se vuelve disfuncional, como consecuencia de efectos de la diabetes mellitus (de tipo 1 o tipo 2) sobre la vasculatura de la retina, el metabolismo de la retina, el epitelio pigmentario de la retina, la barrera hematorretiniana o los niveles oculares de productos finales de glucación avanzada (AGE), actividad aldosa reductasa, hemoglobina glucosilada y proteína cinasa C. La pérdida visual en pacientes con retinopatía diabética puede ser un resultado de isquemia retiniana, edema macular, filtración vascular, hemorragia vítrea o efectos directos de niveles elevados de glucosa en las neuronas de la retina. Las características anatómicas de la retinopatía diabética que pueden tratarse mediante inhibición de Epo incluyen microaneurisma, exudados algodonosos, dilatación venosa, edema macular, anomalías microvasculares intrarretinianas (AMIR), hemorragia intrarretiniana, proliferación vascular, neovascularización de la papila, rubeosis e isquemia retiniana. El "edema macular diabético" se produce en un sujeto con retinopatía diabética y puede producirse en cualquier estadio de la enfermedad.
La expresión "afección o trastorno asociado con edema macular" se refiere a afecciones o trastornos en que se produce hinchamiento o engrasamiento de la mácula como resultado de la filtración de líquidos de los vasos sanguíneos de la retina, "edema macular". El edema macular se produce en, y a menudo es una complicación de, vasculopatía retiniana. Afecciones o trastornos específicos asociados con edema macular incluyen retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía diabética no proliferativa, degeneración macular senil, oclusión de la vena retiniana, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope o retinopatía del prematuro. El tratamiento del edema macular mediante la inhibición de Epo puede determinarse mediante examen oftalmoscópico, tomografía de coherencia óptica y agudeza visual mejorada.
La expresión "anticuerpo quimérico" es una molécula de anticuerpo en que (a) la región constante, o una parte de la misma, está alterada, remplazada o intercambiada, de modo que el sitio de unión a antígeno (región variable) esté unido a una región constante de una clase, función efectora y/o especie diferente o alterada, o una molécula completamente diferente que confiera nuevas propiedades al anticuerpo quimérico, por ejemplo, una enzima, toxina, hormona, factor de crecimiento, fármaco, etc.; o (b) la región variable, o una parte de la misma, está alterada, remplazada o intercambiada con una región variable que tenga una especificidad de antígeno diferente o alterada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede modificarse remplazando su región constante con la región constante de una inmunoglobulina humana. Debido al remplazo con una región constante humana, el anticuerpo quimérico puede conservar su especificidad en el reconocimiento del antígeno mientras tiene antigenicidad reducida en seres humanos en comparación con el anticuerpo de ratón original.
Las expresiones "proteína Epo" o "antígeno de Epo" o "EPO" o "Epo" se usan indistintamente y se refieren a la proteína eritropoyetina en diferentes especies. Por ejemplo, la Epo humana tiene la secuencia como se expone en la tabla 1: SEQ ID NO: 81. Ejemplos de proteínas Epo de otras especies se proporcionan en la tabla 1, SEQ ID NO: 82, 83, 84 o 85. Las secuencias proteínicas para Epo humana, de macaco, de ratón, de rata y de conejo están disponibles al público y se describen en la tabla 1. La Epo humana también puede estar hiperglucosilada. La Epo hiperglucosilada también se conoce en la técnica como "darbepoyetina" y puede obtenerse de diversas fuentes, incluyendo LEK Pharmacueticals.
La expresión "variante modificada conservativamente" se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácido nucleico. Con respecto a secuencias de ácido nucleico particulares, variantes modificadas conservativamente se refiere a esos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición donde se especifique alanina por un codón, el codón puede alterarse en cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones sinónimas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. Cada secuencia de ácido nucleico en este documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación sinónima del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es normalmente el único codón para metionina, y TGG, que es normalmente el único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación sinónima de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
Para secuencia polipeptídicas, las "variantes modificadas conservativamente" incluyen sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales a una secuencia polipeptídica que provocan la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas conservativamente son adicionales a y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos entre especies y aleles de la invención. Los siguiente ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí: 1) alanina (A), glicina (G); 2) ácido aspártico (D), ácido glutámico (E); 3) asparagina (N), glutamina (Q); 4) arginina (R), lisina (K); 5) isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V); 6) fenilalanina (F), tirosina (Y), triptófano (W); 7) serina (S), treonina (T); y 8) cisteína (C), metionina (M) (véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). En algunas realizaciones, la expresión "modificaciones de secuencia conservativas" se usa para hacer referencia a modificaciones aminoacídicas que no afecten significativamente o alteren las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos.
El término "epítopo" significa un determinante proteínico que puede unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos habitualmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales glucídicas y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión de los primeros, pero no de los últimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Se pretende que la expresión "anticuerpo humano", como se usa en este documento, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones flanqueantes como las CDR derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de dichas secuencias humanas, por ejemplo, secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoacídicos no codificados por secuencias humanas (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitrn o por mutación somática in vivo).
La expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión, que tienen regiones variables en las que tanto las regiones flanqueantes como CDR derivan de secuencias humanas. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante hibridomas que incluyen (i) un linfocito B obtenido de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera (ii) fusionado a una célula inmortalizada.
Un anticuerpo "humanizado" es un anticuerpo que conserva la reactividad de un anticuerpo no humano a la vez que es menos inmunógeno en seres humanos. Esto puede conseguirse, por ejemplo, conservando las regiones CDR no humanas y remplazando las partes restantes del anticuerpo con sus equivalentes humanos (es decir, la región constante, así como las partes flanqueantes de la región variable). Véase, por ejemplo, Morrison et al,, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855, 1984; Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65-92, 1988; Verhoeyen et al,, Science, 239:1534-1536, 1988; Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991; y Padlan, Molec. Immun., 31:169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnología de genomanipulación humana incluyen, aunque sin limitación, la tecnología Xoma divulgada en el documento US 5766886.
Las expresiones "idéntico" o "identidad" de secuencia del 100 %, en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Dos secuencias son "sustancialmente idénticas" si dos secuencias tienen un porcentaje especificado de residuos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (es decir, identidad de un 60 %, opcionalmente identidad de un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % sobre una región especificada o, cuando no se especifica, sobre la secuencia completa), cuando se comparan y alinean para la máxima correspondencia sobre una ventana de comparación, o región designada, que se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, existe identidad sobre una región que es de al menos aproximadamente 50 nucleótidos (o 10 aminoácidos) de longitud, o más preferiblemente sobre una región que es de 100 a 500 o de 1000 o más nucleótidos (o 20, 50, 200 o más aminoácidos) de longitud.
Para la comparación de secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se indican las coordenadas de subsecuencia, si fuera necesario, y se indican los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Pueden usarse parámetros predeterminados del programa, o pueden indicarse parámetros alternativos. El algoritmo de comparación de secuencias entonces calcula los porcentajes de identidad de secuencia para las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.
Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, incluye referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en 20 a 600, habitualmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de alinear óptimamente las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988, mediante implementaciones informáticas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineación manual e inspección visual (véase, por ejemplo, Brent et al,, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (Ringbou ed., 2003)).
Dos ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul et al,, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977; y Altschul et al,, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990, respectivamente. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo implica identificar, en primer lugar, las parejas de secuencias con alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina al umbral de puntuación de palabra cercana (Altschul et al,, supra). Estos aciertos iniciales de palabra cercana actúan como puntos de inicio para iniciar búsquedas para hallar HSP más largas que los contengan. Los aciertos de palabra se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en todo lo que pueda aumentar la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0 ) y N (puntuación de penalización para residuos desemparejados; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineación descienden en la cantidad X desde su valor máximo conseguido; la puntuación acumulada llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de alguna secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa de forma predeterminada una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación para ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa de forma predeterminada una longitud de palabra de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que se produciría una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es de menos de aproximadamente 0,2, más preferiblemente de menos de aproximadamente 0,01 y mucho más preferiblemente de menos de aproximadamente 0,001.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos ponderados PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de programas g Cg (disponible en Internet en gcg.com), usando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y una ponderación de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
A diferencia del porcentaje de identidad de secuencia indicado anteriormente, otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son sustancialmente idénticos es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico inmunorreacione de forma cruzada con los anticuerpos generados contra el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe a continuación. Por tanto, un polipéptido típicamente es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solamente por sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas o sus complementos hibriden entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación. Otra indicación más de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que puedan usarse los mismos cebadores para amplificar la secuencia.
La expresión "inhibir (o inhibe) la proliferación celular dependiente de Epo" se refiere a la capacidad de un anticuerpo anti-Epo de impedir la activación (por ejemplo, la señalización celular), replicación y/o proliferación celular estimulada y/o inducida por Epo. Específicamente, "inhibir" se refiere a una disminución estadísticamente significativa (es decir, p<0,05) en la proliferación celular dependiente de Epo, u otro parámetro (por ejemplo, la señalización celular dependiente de Epo, la angiogénesis), en un sujeto después del contacto con un anticuerpo anti-Epo o fragmento del mismo como se describe en este documento con respecto a un control. Como se usa en este documento, "inhibir (o inhibe) la proliferación celular dependiente de Epo" también puede referirse a una mejora clínicamente pertinente en la función visual o la anatomía de la retina después de tratamiento con un anticuerpo anti-Epo descrito en este documento en un paciente diagnosticado con una afección o trastorno asociado con vasculopatía retiniana como se describe a continuación.
Como se usa en este documento, "inhibir (o inhibe) la señalización celular dependiente de Epo" se refiere a la capacidad de un anticuerpo anti-Epo descrito en este documento de producir una disminución estadísticamente significativa (es decir, p<0,05) en la activación de las rutas de señalización intracelular estimuladas o inducidas por Epo.
La expresión "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que no contiene sustancialmente otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a Epo no contiene sustancialmente anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de Epo). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a Epo puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo aislado puede no contener sustancialmente otros materiales celulares y/o productos químicos.
El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgE, IgG tal como IgG1 o IgG4) proporcionada por los genes de la región constante de la cadena pesada. El isotipo también incluye versiones modificadas de una de estas clases, donde las modificaciones se han hecho para alterar la función de Fc, por ejemplo, para potenciar o reducir las funciones efectoras o la unión a receptores de Fc. El isotipo también se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, kappa, lambda) proporcionada por las regiones contantes de la cadena ligera.
El término "Kasoc" o "Ka", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a la velocidad de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término "Kdis" o "Kd," como se usa en este documento, pretende hacer referencia a la velocidad de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "Kd", como se usa en este documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación, que se obtiene del cociente de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de Kd para los anticuerpos se pueden determinar usando métodos muy consolidados en el técnica. Los métodos para determinar la Kd de un anticuerpo incluyen medir la resonancia de plasmones superficiales usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®, o midiendo la afinidad en solución por valoración en equilibrio en solución (SET).
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en este documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal tiene una sola especificidad y afinidad de unión por un epítopo particular.
La expresión "ácido nucleico" se usa en este documento indistintamente con el término "polinucleótido" y se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. La expresión engloba ácidos nucleicos que contienen análogos nucleotídicos conocidos o residuos de la cadena principal o enlaces modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia, y que se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metil fosfonatos, metil fosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (APN).
Salvo que se indique de otro modo, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca de forma implícita variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, como se detalla a continuación, las sustituciones de codones degenerados pueden conseguirse generando secuencias en que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con residuos de base mixta y/o de desoxiinosina (Batzer et al,, Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al,, J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; y Rossolini et al,, Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
La expresión "unidos de forma funcional" se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos polinucleotídicos (por ejemplo, ADN). Típicamente, la expresión se refiere a la relación funcional de una secuencia reguladora de la transcripción con respecto a una secuencia transcrita. Por ejemplo, una secuencia promotora o potenciadora está unida de forma funcional a una secuencia codificante si estimula o modula la transcripción de la secuencia codificante en una célula hospedadora apropiada u otro sistema de expresión. En general, las secuencias reguladoras de la transcripción promotoras que están unidas de forma funcional a una secuencia transcrita están físicamente contiguas a la secuencia transcrita, es decir, son de acción en c/s. Sin embargo, algunas secuencias reguladoras de la transcripción, tales como potenciadores, no tienen que estar físicamente contiguas o ubicadas en cercana proximidad a las secuencias codificantes cuya transcripción potencian.
Como se usa en este documento, el término "optimizada" significa que una secuencia de nucleótidos se ha alterado para que codifique una secuencia de aminoácidos usando codones que son preferidos en la célula u organismo de producción, en general una célula eucariota, por ejemplo, una célula de P/ch/a, una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula humana. La secuencia de nucleótidos optimizada se genomanipula para que retenga por completo o en la mayor medida posible la secuencia de aminoácidos originalmente codificada por la secuencia de nucleótidos de partida, que también se conoce como la secuencia "precursora". Las secuencias optimizadas en este documento se han genomanipulado para que tengan codones que son preferidos en células de mamífero. Sin embargo, la expresión optimizada de estas secuencias en otras células eucariotas o células procariotas también se prevé en este documento. Las secuencias de aminoácidos codificadas por secuencias de nucleótidos optimizadas también se denominan optimizadas.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente en este documento para hacer referencia a un polímero de residuos aminoacídicos. Las expresiones se aplican a polímeros de aminoácidos en que uno o más residuos aminoacídicos son un imitador químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Salvo que se indique de otro modo, una secuencia polipeptídica particular también engloba de forma implícita variantes modificadas conservativamente de la misma.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en este documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados a partir de una célula hospedadora transformada para que exprese el anticuerpo humano, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una colección combinatoria recombinante de anticuerpos humanos y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de la totalidad o una parte de un gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones flanqueantes y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinadas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se pueden someter a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de las secuencias de VH y VL de la línea germinal humana y están relacionadas con ellas, puede que no existan de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora") se refiere a una célula en que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que se pretende que dichas expresiones se refieran no solamente a la célula en cuestión particular, sino también la descendencia de dicha célula. Como pueden producirse determinadas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha descendencia puede no ser, de hecho, idéntica a la célula progenitora, pero aún se incluye dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora" como se usa en este documento.
El término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados (por ejemplo: mamíferos y no mamíferos) tales como primates no humanos (por ejemplo: macacos cangrejeros), ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios y reptiles. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se usan en este documento indistintamente. Como se usa en este documento, el término "mac." o "macaco" se refiere al macaco cangrejero (Macaca fascicularis).
Como se usa en este documento, el término "tratar" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno (por ejemplo, vasculopatía retiniana, retinopatía diabética, edema macular) se refiere, en una realización, a mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización, "tratar" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico, incluyendo aquellos que pueden no ser discernibles por el paciente. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, físicamente (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico), o ambos. En otra realización más, "tratar" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retardar la aparición o desarrollo o progresión de la enfermedad o trastorno. "Prevención", referida a indicaciones descritas en este documento incluyendo afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana, afecciones o trastornos asociados con retinopatía diabética y/o afecciones o trastornos asociados con edema macular, significa cualquier acción que evite o ralentice un empeoramiento en la función visual, la anatomía de la retina, parámetro de vasculopatía retiniana, parámetro de retinopatía diabética y/o parámetro de edema macular, como se describe a continuación, en un paciente en riesgo de dicho empeoramiento. Más específicamente, "tratamiento" de afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana, afecciones o trastornos asociados con retinopatía diabética y/o afecciones o trastornos asociados con edema macular significa cualquier acción que provoque, o esté contemplado que provoque, la mejora o conservación de la función visual y/o anatomía de la retina. Los métodos para evaluar el tratamiento y/o prevención de enfermedades son conocidos en la técnica y se describen en este documento a continuación.
Se pretende que el término "vector" se refiere a una molécula polinucleotídica que puede transportar otro polinucleótido al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, tal como un vector vírico adenoasociado (AAV o AAV2), en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores puede replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de la célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están unidos de forma funcional Dichos vectores se denominan en este documento "vectores de expresión recombinante" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma más habitualmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir otras de estas formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Muestra que EPO induce la dilatación de los vasos en la retina central.
Figura 2. Muestra que un Fab anti-EPO neutraliza la EPO en ojos de conejo.
Figura 3. Muestra que un Fab anti-EPO neutraliza la EPO en ojos de conejo.
Descripción detallada
La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de moléculas de anticuerpo que se unen específicamente a Epo. La invención se refiere tanto a anticuerpos en formato IgG completos, así como a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como fragmentos Fab (por ejemplo, véanse los anticuerpos NVS1, NVS2, NVS3 y NVS4).
Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a Epo (por ejemplo, Epo humana, Epo de macaco, Epo de rata y Epo de ratón), composiciones farmacéuticas, métodos de producción y métodos de uso de dichos anticuerpos y composiciones.
Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno contra Epo
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a Epo. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón, así como Epo humana hiperglucosilada (darbepoyetina). Los anticuerpos de la invención incluyen, aunque sin limitación, los anticuerpos monoclonal humanos y Fab aislados como se describe en los ejemplos.
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o ratón), en los que los anticuerpos comprenden un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 33, 53 o 73. La presente solicitud también describe anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo, en los que los anticuerpos comprenden una CDR de VH que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR VH enumeradas en la tabla 1, infra. En particular, la presente solicitud describe anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón), en los que los anticuerpos comprenden (o como alternativa, consisten en) una, dos, tres o más CDR de VH que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VH enumeradas en la tabla 1, infra.
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo, comprendiendo dichos anticuerpos un dominio v L que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, 34, 54 o 74. La presente solicitud también describe anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón), comprendiendo dichos anticuerpos una CDR de VL que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las CDR de VL enumeradas en la tabla 1, infra. En particular, la presente solicitud describe anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón), comprendiendo dichos anticuerpos (o como alternativa, consistiendo en) una, dos, tres o más CDR de VL que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las CDR de VL enumeradas en la tabla 1, infra.
La presente invención también proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican VH, VL, la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa de los anticuerpos que se unen específicamente a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón). Dichas secuencias de ácido nucleico pueden optimizarse para su expresión en células de mamífero (por ejemplo, la tabla 1 muestra las secuencias de ácido nucleico optimizadas para la cadena pesada y la cadena ligera de anticuerpos de la invención).
Tabla 1 Ejemplos de anticuerpos contra Epo, Fab y proteínas Epo
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Como cada uno de estos anticuerpos puede unirse a Epo, las secuencias de VH, VL, cadena ligera de longitud completa y cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) pueden "mezclarse y acoplarse" para crear otros anticuerpos de unión a Epo de la invención. Dichos anticuerpos "mezclados y acoplados" de unión a Epo pueden ensayarse usando los ensayos de unión conocidos en la técnica (por ejemplo, ELISA y otros ensayos descritos en la sección de ejemplo). Cuando estas cadenas se mezclan y acoplan, una secuencia de VH de un emparejamiento VH/VL particular debe remplazarse con una secuencia de VH estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena pesada de longitud completa de un emparejamiento de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa particular debe remplazarse con una secuencia de la cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de VL de un emparejamiento VH/VL particular debe remplazarse con una secuencia de VL estructuralmente similar. Asimismo, una secuencia de la cadena ligera de longitud completa de un emparejamiento de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa particular debe remplazarse con una secuencia de la cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar. Por consiguiente, también se describe un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene: un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 33, 53 y 73, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 34, 54 y 74, en el que el anticuerpo se une específicamente a Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón).
En determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente. En otros aspectos específicos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente. En otros aspectos más, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente. En otros aspectos más, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente.
En otro aspecto, la invención proporciona (i) un anticuerpo aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para su expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15, 35, 55 y 75, y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha optimizado para su expresión en una célula de mamífero seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 16, 36, 56 y 76; o (ii) una proteína funcional que comprende una parte de unión a antígeno del mismo. Más específicamente, en determinados aspectos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente. En otros aspectos específicos, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente. En otros aspectos más, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 55 y 56, respectivamente. En otros aspectos más, la invención proporciona un anticuerpo aislado o región de unión a antígeno del mismo que tiene una cadena pesada y una cadena ligera que comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas de SEQ ID NO: 75 y 76, respectivamente.
Las expresiones "región determinante de la complementariedad" y "CDR", como se usan en este documento, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo que confieren especificidad y afinidad de unión por el antígeno. En general, hay tres CDR en cada región variable de la cadena pesada (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres CDR en cada región variable de la cadena ligera (LCDR1, LCDR2, LCDR3).
Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse fácilmente usando cualquiera de varios esquemas bien conocidos, incluyendo los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5.a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (esquema de numeración de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (esquema de numeración de "Chothia").
Por ejemplo, según Kabat, los residuos aminoacídicos de CDR en el dominio variable de la cadena pesada (VH) están numerados 31-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos aminoacídicos de Cd R en el dominio variable de la cadena ligera (VL) están numerados 24-34 (LCDR1), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3). Según Chothia, los aminoácidos de las CDR en la Vh están numerados 26-32 (HCDR1), 52-56 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3); y los residuos aminoacídicos en la VL están numerados 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) y 91-96 (LCDR3). Combinando las definiciones de CDR tanto de Kabat como de Chothia, las CDR consisten en los residuos aminoacídicos 26-35 (HCDR1), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3) en VH humana y los residuos aminoacídicos 24-34 (LCDR1), 50-56 (Lc DR2) y 89-97 (LCDR3) en VL humana.
La presente solicitud describe anticuerpos de unión a Epo que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y ligera como se describe en la tabla 1, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 1, 21, 41 o 61. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 2, 22, 42 o 62. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 3, 23, 43 o 63. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 4, 24, 44 o 64. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 5, 25, 45 o 65. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 6, 26, 46 o 66. Estas regiones CDR se delimitan usando el sistema de Kabat.
Como alternativa, como se define usando el sistema de Chothia (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948) las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 7, 27, 47 o 67. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 8, 28, 48 o 68. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 9, 29, 49 o 69. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 10, 30, 50 o 70. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 11, 31, 51 o 71. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VL de los anticuerpos se muestran en SEQ ID NO: 12, 32, 52 o 72.
Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a Epo y que la especificidad de unión a antígeno se proporciona principalmente por las regiones CDR1, 2 y 3, las secuencias de CDR1, 2 y 3 de VH y las secuencias de CDR1, 2 y 3 de VL pueden "mezclarse y acoplarse" (es decir, pueden mezclarse y acoplarse CDR de diferentes anticuerpos, aunque cada anticuerpo contiene preferiblemente una CDR1,2 y 3 de VH y una CDR1,2 y 3 de VL para crear otras moléculas de unión a Epo de la divulgación). Dichos anticuerpos "mezclados y acoplados" de unión a Epo pueden ensayarse usando los ensayos de unión conocidos en la técnica y los descritos en los ejemplos (por ejemplo, ELISA, SET, Biacore). Cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y acoplan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular debe remplazarse con una o más secuencias de CDR estructuralmente similares. Asimismo, cuando las secuencias de CDR de VL se mezclan y acoplan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VL particular debe remplazarse con una o más secuencias de CDR estructuralmente similares. Será muy evidente para los expertos en la materia que pueden crearse secuencias de VH y VL novedosas sustituyendo una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR mostradas en este documento para anticuerpos monoclonales de la presente invención. Además de lo anterior, en una realización, los fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos descritos en este documento pueden comprender una CDR1,2 y 3 de VH, o una CDR 1, 2 y 3 de VL, en los que el fragmento se une a Epo como un solo dominio variable.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos pueden tener las secuencias de la cadena pesada y ligera de los Fab descritos en la tabla 1. Más específicamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede tener la secuencia pesada y ligera de Fab NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a Epo comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada, una CDR2 de la región variable de la cadena pesada, una CDR3 de la región variable de la cadena pesada, una CDR1 de la región variable de la cadena ligera, una CDR2 de la región variable de la cadena ligera y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera como se define por Kabat y se describe en la tabla 1. En otras realizaciones más de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a Epo comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada, una CDR2 de la región variable de la cadena pesada, una CDR3 de la región variable de la cadena pesada, una CDR1 de la región variable de la cadena ligera, una CDR2 de la región variable de la cadena ligera y una c DR3 de la región variable de la cadena ligera como se define por Chothia y se describe en la tabla 1.
La presente solicitud también describe un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 1; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 2; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 3; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 4; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 5; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 6. También se describen anticuerpos que se unen específicamente a Epo, que comprenden una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 21; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 22; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 23; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 24; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 25; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 26. Se describe además un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 41; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 42; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 43; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 44; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 45; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 46. La presente solicitud también describe un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 61; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 62; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 63; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 64; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 65; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 66.
En otra realización específica, la presente solicitud también describe un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 7; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 8; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 9; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 10; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 11; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 12. La presente solicitud también describe un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 27; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 28; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 29; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 30; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 31; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 32. La presente solicitud describe además un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 47; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 48; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 49; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 50; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 51; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 52. La presente solicitud también describe un anticuerpo que se une específicamente a Epo, que comprende una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 67; una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 68; una CDR3 de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 69; una CDR1 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 70; una CDR2 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 71; y una CDR3 de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO: 72.
En determinadas realizaciones, la invención incluye anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a Epo como se describe en SEQ ID NO: 13 a 16; 33 a 36; 53 a 56 y 73 a 76 de la tabla 1. En una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que se une a Epo es Fab NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4,
Como se usa en este documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada y ligera o cadenas pesadas y ligeras de longitud completa que son "el producto de" o "derivan de" una secuencia de la línea germinal particular si las regiones variables o cadenas de longitud completa del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o cribar una genoteca de inmunoglobulinas humanas expresadas en fagos con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que está más cercana en secuencia (es decir, el % de identidad más alto) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la línea germinal debido a, por ejemplo, mutaciones somáticas de origen natural o introducción intencionada de mutaciones dirigidas al sitio. Sin embargo, en las regiones flanqueantes VH o VL, un anticuerpo humano seleccionado típicamente es al menos un 90 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos aminoacídicos que identifican el anticuerpo humano como humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murina). En determinados casos, un anticuerpo humano puede ser al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o al menos un 95 %, o incluso al menos un 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano recombinantes presentará no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana en las regiones flanqueantes VH o VL. En determinados casos, el anticuerpo humano puede presentar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Ejemplos de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana incluyen, aunque sin limitación, los fragmentos de la línea germinal del dominio variable descritos a continuación, así como DP47 y DPK9.
Anticuerpos homólogos
En otra realización más, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, puede comprender secuencias de aminoácidos que son homólogas a las secuencias descritas en la tabla 1, y el anticuerpo se une a una proteína Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o ratón), y conserva las propiedades funcionales deseadas de aquellos anticuerpos descritos en la tabla 1.
La presente solicitud describe un anticuerpo aislado, o un fragmento funcional de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de la cadena pesada y un dominio variable de la cadena ligera, en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 33, 53 y 73; el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 34, 54, y 74; y el anticuerpo se une específicamente a Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón). En determinados aspectos, las secuencias de la cadena pesada y ligera comprenden además secuencias HCDR1, Hc DR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se definen por Kabat, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, respectivamente; SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25 y 26, respectivamente; SEQ ID NO: 41, 42, 43, 44, 45 y 46, respectivamente; o SEQ ID NO: 61, 62, 63, 64, 65 y 66, respectivamente. En otros determinados aspectos, las secuencias de la cadena pesada y ligera comprenden además secuencias HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3 como se definen por Chothia, por ejemplo, SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11 y 12, respectivamente; SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31 y 32, respectivamente; SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51 y 52, respectivamente; o SEQ ID NO: 67, 68, 69, 70, 71 y 72, respectivamente.
En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL puede ser un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la tabla 1. En otras realizaciones, las secuencias de aminoácidos de VH y/o VL pueden ser idénticas excepto por la sustitución aminoacídica en no más de 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones aminoacídicas. Un anticuerpo que tenga regiones VH y VL que tenga alta (es decir, de un 80 % o mayor) identidad con las regiones VH y VL de los descritas en la tabla 1 puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NO: 13, 33, 53 o 73 y SEQ ID NO: 14, 34, 54 o 74, respectivamente, seguido de ensayo del anticuerpo alterado codificado para la función conservada usando los ensayos funcionales descritos en este documento.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención puede tener secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de longitud completa y/o la cadena ligera de longitud completa que son un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la tabla 1. Un anticuerpo que tenga una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa que tenga alta (es decir, de un 80 % o mayor) identidad con las cadenas pesadas de longitud completa de SEQ ID NO: 15, 35, 55 o 75, y las cadenas ligeras de longitud completa de cualquiera de SEQ ID NO: 16, 36, 56 o 76, puede obtenerse por mutagénesis (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, seguido de ensayo del anticuerpo alterado codificado para la función conservada usando los ensayos funcionales descritos en este documento.
En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada de longitud completa y/o la cadena ligera de longitud completa pueden ser un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la tabla 1.
En otras realizaciones, las secuencias de nucleótidos de las regiones variables de la cadena pesada y/o las regiones variables de la cadena ligera pueden ser un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a las secuencias expuestas en la tabla 1.
Como se usa en este documento, el porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, el % de identidad es igual al número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que tienen que introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede conseguir usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes a continuación.
Además, o como alternativa, las secuencias proteínicas de la presente invención pueden usarse también como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Por ejemplo, dichas búsquedas pueden realizarse usando el programa BLASt (versión 2.0) de Altschul, et al, 1990 J.Mol. Biol. 215:403-10.
Anticuerpos con modificaciones conservativas
En otras realizaciones, el anticuerpo de la invención se optimiza para su expresión en una célula de mamífero y tiene una secuencia de la cadena pesada de longitud completa y una secuencia de la cadena ligera de longitud completa, en el que una o más de estas secuencias tienen secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos descritos en este documento o modificaciones conservativas de las mismas, y en el que los anticuerpos conservan las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos de unión a Epo de la invención. Por consiguiente, se describe un anticuerpo aislado que se optimiza para su expresión en una célula de mamífero que consiste en una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa, en el que la cadena pesada de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de s Eq ID NO: 15, 35, 55 y 75, y modificaciones conservativas de las mismas; y la cadena ligera de longitud completa tiene secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo de SEQ ID NO: 16, 36, 56 y 76, y modificaciones conservativas de las mismas; y el anticuerpo se une específicamente a Epo (por ejemplo, Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón).
Anticuerpos que se unen al mismo epítopo
La presente solicitud también describe anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos de unión a Epo descritos en la tabla 1. Por lo tanto, pueden identificarse anticuerpos adicionales basándose en su capacidad de competir (por ejemplo, de inhibir competitivamente la unión, de una manera estadísticamente significativa) con otros anticuerpos de la invención en ensayos de unión a Epo (tal como los descritos en los ejemplos). La capacidad de un anticuerpo de ensayo de inhibir la unión de anticuerpos de la presente invención a una proteína Epo demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con ese anticuerpo por la unión a Epo; dicho anticuerpo puede unirse, de acuerdo con la teoría no limitante, al mismo epítopo o una relacionado (por ejemplo, uno estructuralmente similar o espacialmente próximo) en la proteína Epo que el anticuerpo con el que compite. En una determinada realización, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en Epo que los anticuerpos de la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en este documento. Como se usa en este documento, un anticuerpo "compite" por la unión cuando el anticuerpo inhibe la unión a Epo de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención en más de un 50 %, en presencia de una concentración equimolar de anticuerpo competidor.
En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de la proteína Epo; SEQ ID NO: 88). En otras realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a la hélice A (aminoácidos 4-26 de la proteína Epo; SEQ ID NO: 86) y bucle A-B de Epo (aminoácidos 27-55 de la proteína Epo; SEQ ID NO: 89).
En otras realizaciones, los anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88). En otras realizaciones, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno se unen al dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89). En otras realizaciones, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno se unen al dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89) y hélice A (aminoácidos 4-26 de Epo humana; SEQ ID NO: 86). En otras realizaciones más, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno se unen a la región de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88) y el dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; SEQ ID NO: 89). En otras realizaciones, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno se unen al dominio de hélice D de Epo (aminoácidos 138-162 de Epo humana; SEQ ID NO: 88), el dominio de bucle A-B (aminoácidos 27-55 de Epo humana; Se Q ID NO: 89) y hélice A (aminoácidos 4-26 de Epo humana; SEQ ID NO: 86).
En otros aspectos, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos en las posiciones 44-50, 52, 53, 147, 150, 151, 154, 155, 159 y 162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81). En otros aspectos, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos en las posiciones 9, 13, 44-53, 147, 150, 151, 154, 155, 158, 159 y 162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81). En otros aspectos, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos en las posiciones 23, 43-50, 52, 53, 131, 143, 147, 150, 151, 154, 155, 159 y 162 de Epo humana (SEQ ID NO: 81). En aspectos particulares, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (en las posiciones 44-50), Lys-Arg (en las posiciones 52-53), Asn (en la posición 147), Arg-Gly (en las posiciones 150-151), Lys-Leu (en las posiciones 154-155), Glu (en la posición 159) y Arg (en la posición 162) de Epo humana (SEQ ID NO: 81). En otros aspectos particulares, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos Ser (en la posición 9), Glu (en la posición 13), Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (en las posiciones 44-50), Lys-Arg (en las posiciones 52-53), Asn (en la posición 147), Arg-Gly (en las posiciones 150­ 151), Lys-Leu (en las posiciones 154-155), Gly (en la posición 158), Glu (en la posición 159) y Arg (en la posición 162) de Epo humana (SEQ ID NO: 81). En otros aspectos más, los anticuerpos aislados o fragmentos de unión a antígeno de la invención se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos Glu (en la posición 23), Asp-Thr-Lys-Val-Asn-Phe-Tyr-Ala (en las posiciones 43-50), Lys-Arg (en las posiciones 52-53), Arg (en la posición 131), Arg (en la posición 143), Asn (en la posición 147), Arg-Gly (en las posiciones 150-151), Lys-Leu (en las posiciones 154-155), Glu (en la posición 159) y Arg (en la posición 162) de Epo humana (SEQ ID NO: 81).
También se describe en este documento un epítopo conformacional en Epo humana, comprendiendo el epítopo los residuos aminoacídicos Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 y Arg162, en el que un anticuerpo que se une al epítopo inhibirá la unión de Epo al receptor de Epo. También se contempla que un anticuerpo que se une al epítopo de la invención inhibirá además la proliferación celular dependiente de Epo.
También se describe en este documento un epítopo conformacional en Epo humana, comprendiendo el epítopo los residuos aminoacídicos Ser9, Glu13, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Gly158, Glu159 y Arg162, en el que un anticuerpo que se une al epítopo inhibirá la unión de Epo al receptor de Epo. También se contempla que un anticuerpo que se une al epítopo de la invención inhibirá además la proliferación celular dependiente de Epo.
También se describe en este documento un epítopo conformacional en Epo humana, comprendiendo el epítopo los residuos aminoacídicos Glu23, Asp43, Thr44, Lys45, Val46, Asn47, Phe48, Tyr49, Ala50, Lys52, Arg53, Arg131, Arg143, Asn147, Arg150, Gly151, Lys154, Leu155, Glu159 y Arg162, en el que un anticuerpo que se une al epítopo inhibirá la unión de Epo al receptor de Epo. También se contempla que un anticuerpo que se une al epítopo de la invención inhibirá además la proliferación celular dependiente de Epo.
Anticuerpos genomanipulados y modificados
Un anticuerpo de la invención puede prepararse además usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o VL mostradas en este documento como material de partida para genomanipular un anticuerpo modificado, que es un anticuerpo modificado que puede tener propiedades alteradas con respecto al anticuerpo de partida. Un anticuerpo se puede genomanipular modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones flanqueantes. Adicionalmente o como alternativa, un anticuerpo se puede genomanipular modificando residuos dentro de la región o regiones constantes, por ejemplo, para alterar la función o funciones efectoras del anticuerpo.
Un tipo de genomanipulación de la región variable que puede realizarse es injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos diana predominantemente a través de residuos aminoacídicos que están ubicados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Como las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos de origen natural específicos construyendo vectores de expresión que incluyan secuencias de CDR del anticuerpo de origen natural específico injertadas en secuencias flanqueantes de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al,, 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al,, 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al,, 1989 Proc. Natl. Acad., U.S.A. 86:10029-10033; patente de Estados Unidos n.° 5225539 de Winter, y patentes de Estados Unidos n.° 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 de Queen et al.)
Dichas secuencias flanqueantes se pueden obtener de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de la línea germinal para genes de la región variable de la cadena pesada y ligera humana pueden encontrarse en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., et al,, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, publicación NIH n.° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al,, 1992 J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al, 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836.
Un ejemplo de secuencias flanqueantes para su uso en los anticuerpos de la invención son las que son estructuralmente similares a las secuencias flanqueantes usadas por anticuerpos seleccionados de la invención, por ejemplo, secuencias consenso y/o secuencias flanqueantes usadas por anticuerpos monoclonales de la invención. Las secuencias de CDR1, 2 y 3 de VH, y las secuencias de CDR1,2 y 3 de VL, pueden injertarse en regiones flanqueantes que tienen la secuencia idéntica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal del que deriva la secuencia flanqueante, o las secuencias de CDR pueden injertarse en regiones flanqueantes que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en determinados casos, es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones flanqueantes para mantener o potenciar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 de Queen et al). Las regiones flanqueantes que pueden utilizarse como estructuras sobre las que construir los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento incluyen, aunque sin limitación VH1A, VH1B, VH3, Vk1, Vl2 y Vk2. Se conocen regiones flanqueantes adicionales en la técnica y pueden encontrarse, por ejemplo, en la base de datos vBase en Internet en vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php?&MMN_position=1:1.
Por consiguiente, la presente solicitud también describe anticuerpos de unión a Epo aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13, 33, 53 y 73, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en la región flanqueante de dichas secuencias, y que comprende además una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, 34, 54 y 74, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos en la región flanqueante de dichas secuencias.
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos aminoacídicos dentro de las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL para mejorar de ese modo una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés, conocido como "maduración de la afinidad". Se puede realizar mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la mutación o mutaciones, y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, se puede evaluar en ensayos in vitrn o in vivo como se describe en este documento y se proporciona en los ejemplos. Se pueden introducir modificaciones conservativas (como se analiza anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Además, típicamente no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR.
Injerto de dominios de unión a antígeno en regiones flanqueantes o estructuras alternativas
Puede emplearse una amplia diversidad de regiones flanqueantes o estructuras de anticuerpo/inmunoglobulina siempre que el polipéptido resultante incluya al menos una región de unión que se una específicamente a Epo. Dichas regiones flanqueantes o estructuras incluyen los 5 idiotipos principales de inmunoglobulinas humanas, o fragmentos de las mismas, e incluyen inmunoglobulinas de otras especies animales, preferiblemente que tienen aspectos humanizados. Los anticuerpos de una sola cadena pesada, tales como los identificados en camélidos, son de particular interés a este respecto. Los expertos en la materia siguen descubriendo y desarrollando nuevas regiones flanqueantes, estructuras y fragmentos.
En un aspecto, la invención se refiere a la generación de anticuerpos no basados en inmunoglobulina usando estructuras que no son de inmunoglobulina en que se pueden injertar CDR de la invención. Pueden emplearse regiones flanqueantes y estructuras que no son de inmunoglobulina conocidas o futuras, siempre que comprendan una región de unión específica para la proteína Epo diana: Las regiones flanqueantes o estructuras que no son de inmunoglobulina conocidas incluyen, aunque sin limitación, fibronectina (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurich, Suiza), anticuerpos de dominio (Domantis, Ltd., Cambridge, MA y Ablynx nv, Zwijnaarde, Bélgica), lipocalina (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemania), inmunofármacos modulares pequeños (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicuerpos (Avidia, Inc., Mountain View, CA), Proteína A (Affibody AG, Suecia) y afilina (cristalina gamma o ubicuitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemania).
Las estructuras de fibronectina se basan en el dominio de fibronectina de tipo III (por ejemplo, el décimo módulo de la fibronectina de tipo III (dominio Fn3 10)). El dominio de fibronectina de tipo III tiene 7 u 8 cadenas beta que están distribuidas entre dos láminas beta, que se empaquetan entre sí para formar el núcleo de la proteína, y además contienen bucles (análogos a las CDR) que conectan las cadenas beta entre sí y están expuestos a los disolventes. Hay al menos tres de dichos bucles en cada borde del emparedado de láminas beta, donde el borde es el límite de la proteína perpendicular a la dirección de las cadenas beta (véase el documento US 6818418). Estas estructuras basadas en fibronectina no son una inmunoglobulina, aunque el plegamiento general está estrechamente relacionado con el del fragmento de anticuerpo funcional más pequeño, la región variable de la cadena pesada, que comprende la unidad de reconocimiento del antígeno completa en IgG de camello y llama. Debido a esta estructura, el anticuerpo que no es de inmunoglobulina imita propiedades de unión al antígeno que son similares en naturaleza y afinidad a las de los anticuerpos. Estas estructuras pueden usarse en una estrategia de aleatorización y reordenamiento de bucles in vitrn que es similar al proceso de maduración de la afinidad de los anticuerpos in vivo. Estas moléculas basadas en fibronectina pueden usarse como estructuras donde las regiones de bucle de la molécula pueden remplazarse con CDR de la invención usando técnicas de clonación convencionales.
La tecnología de anquirina se basa en el uso de proteínas con módulos de repetición derivados anquirina como estructuras para que porten regiones variables que puedan usarse para la unión a diferentes dianas. El módulo de repetición de anquirina es un polipéptido de 33 aminoácidos que consiste en dos hélices a antiparalelas y un giro p. La unión de las regiones variables se optimiza principalmente mediante el uso de expresión en ribosomas.
Los avímeros derivan de proteína natural que contiene dominio A tal como LRP-1. Estos dominios se usan por su naturaleza para las interacciones de proteína-proteína y en seres humanos más de 250 proteínas se basan estructuralmente en dominios A. Los avímeros consisten en varios monómeros diferentes de "dominio A" (2-10) unidos mediante conectores de aminoácidos. Pueden crearse avímeros que puedan unirse al antígeno diana usando la metodología descrita en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20040175756; 20050053973; 20050048512; y 20060008844.
Los ligandos de afinidad Affibody son proteínas simples y pequeñas compuestas de un haz de tres hélices basado en la estructura de uno de los dominios de unión a IgG de Proteína A. La Proteína A es una proteína superficial de la bacteria Staphylococcus aureus. Este dominio de estructura consiste en 58 aminoácidos, de los que 13 se aleatorizan para generar colecciones de Affibody con un gran número de variantes de ligando (véase, por ejemplo, el documento US 5831012). Las moléculas Affibody imitan a los anticuerpos, tienen un peso molecular de 6 kDa, en comparación con el peso molecular de los anticuerpos, que es de 150 kDa. A pesar de su pequeño tamaño, el sitio de unión de las moléculas Affibody es similar al de un anticuerpo.
Las anticalinas son productos desarrollados por la empresa Pieris ProteoLab AG. Derivan de las lipocalinas, un grupo extenso de proteínas pequeñas y robustas que habitualmente están implicadas en el transporte o almacenamiento fisiológico de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Varias lipocalinas naturales se encuentran en tejidos humanos o líquidos corporales. La arquitectura de la proteína recuerda a las inmunoglobulinas, con bucles hipervariables en la parte superior de una estructura rígida. Sin embargo, a diferencia de los anticuerpos o sus fragmentos recombinantes, las lipocalinas están compuestas de una sola cadena polipeptídica con 160 a 180 residuos aminoacídicos, que son ligeramente más grandes que un solo dominio de inmunoglobulina. El conjunto de cuatro bucles, que constituye el bolsillo de unión, muestra una plasticidad estructural pronunciada y tolera una diversidad de cadenas laterales. Por tanto, el sitio de unión se puede remodelar en un proceso patentado para que reconozca moléculas diana indicadas de diferente forma, con alta afinidad y especificidad. Se ha usado una proteína de la familia de las lipocalinas, la proteína de unión a bilina (BBP) de Pieris brassicae, para desarrollar anticalinas por mutagénesis del conjunto de cuatro bucles. Un ejemplo de una solicitud de patente que describe anticalinas es la publicación PCT n.° WO 1999/16873.
Las moléculas Affilin son proteínas pequeñas que no son inmunoglobulinas que se diseñan para afinidades específicas hacia proteínas y moléculas pequeñas. Las nuevas moléculas Affilin pueden seleccionarse muy rápidamente de dos colecciones, cada una de ellas basada en una proteína de estructura diferente derivada de seres humanos. Las moléculas Affilin no muestran ninguna homología estructural con las proteínas de inmunoglobulina. Actualmente, se emplean dos estructuras Affilin, una de ellas es cristalina gamma, una proteína estructural del cristalino humano y la otra es de proteínas de la superfamilia de la "ubicuitina". Ambas estructuras humanas son muy pequeñas, muestran estabilidad a altas temperaturas y son casi resistentes a los cambios de pH y agentes desnaturalizantes. Esta alta estabilidad se debe principalmente a la estructura de lámina beta expandida de las proteínas. Ejemplos de proteínas derivadas de cristalina gamma se describen en el documento WO 2001/04144 y ejemplos de proteínas "de tipo ubicuitina" se describen en el documento WO 2004/106368.
Los imitadores de epítopos proteínicos (PEM - protein epitope mimetics) son moléculas de tipo peptídico cíclicas de tamaño medio (PM 1-2 kDa) que imitan las estructuras secuencias de horquilla beta de proteínas, la estructura secundaria principal implicada en las interacciones entre proteínas.
La presente invención proporciona anticuerpos humanos que se unen específicamente a una proteína Epo. En comparación con los anticuerpos quiméricos o humanizados, los anticuerpos de unión a Epo humana de la invención tienen antigenicidad más reducida cuando se administran a sujetos humanos.
Anticuerpos de camélidos
Las proteínas de anticuerpo obtenidas de miembros de la familia de los camellos y dromedarios (Camelus bactrianus y Calelus dromaderius), incluyendo miembros del Nuevo Mundo tales como especies de llamas (Lama pacos, Lama glama y Lama vicugna) se han caracterizado con respecto al tamaño, la complejidad estructural y la antigenicidad para sujetos humanos. Determinados anticuerpos IgG de esta familia de mamíferos que se encuentran en la naturaleza carecen de cadenas ligeras y, por tanto, son estructuralmente distintos de la estructura cuaternaria típica de cuatro cadenas que tiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, para anticuerpos de otros animales. Véase el documento PCT/EP93/02214 (documento W o 94/04678 publicado el 3 de marzo de 1994).
Una región del anticuerpo de camélidos que es el dominio variable único pequeño identificado como VHH puede obtenerse por genomanipulación para producir una proteína pequeña que tenga alta afinidad por una diana, produciendo una proteína derivada de anticuerpo de bajo peso molecular conocida como "nanocuerpo de camélido". Véase la patente de Estados Unidos número 5759808 presentada el 2 de junio de 1998; véase también Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440­ 448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; y Lauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512-3520. Hay colecciones de anticuerpos de camélidos genomanipulados y fragmentos de anticuerpo disponibles en el mercado, por ejemplo, en Ablynx, Gante, Bélgica. Como con otros anticuerpos de origen no humano, una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de camélidos puede alterarse de forma recombinante para obtener una secuencia que se parezca más a una secuencia humana, es decir, el nanocuerpo puede "humanizarse". Por tanto, la baja antigenicidad natural de los anticuerpos de camélidos para seres humanos se puede reducir aún más.
El nanocuerpo de camélido tiene un peso molecular de aproximadamente una décima parte de una molécula de IgG humana y la proteína tiene un diámetro físico de únicamente unos pocos nanómetros. Una consecuencia del pequeño tamaño es la capacidad de los nanocuerpos de camélido de unirse a sitios antigénicos que sean funcionalmente invisibles a proteínas de anticuerpo más grandes, es decir, los nanocuerpos de camélido son útiles como reactivos para detectar antígenos que de lo contrario serían crípticos usando técnicas inmunológicas clásicas, y como posibles agentes terapéuticos. Por tanto, otra consecuencia más del pequeño tamaño es que un nanocuerpo de camélido puede inhibir como resultado de la unión a un sitio específico en un surco o hendidura estrecha de una proteína diana y, por tanto, puede ejercer una habilidad que se asemeja más a la función de un fármaco clásico de bajo peso molecular que a la de un anticuerpo clásico.
El bajo peso molecular y el tamaño compacto provocan además que los nanocuerpos de camélido sean extremadamente termoestables, estables a pH extremo y a digestión proteolítica, y poco antigénicos. Otra consecuencia es que los nanocuerpos de camélido se mueven fácilmente desde el sistema circulatorio a los tejidos e incluso cruzan la barrera hematoencefálica y pueden tratar trastornos que afectan al tejido nervioso. Los nanocuerpos pueden facilitar aún más el transporte de fármacos a través de la barrera hematoencefálica. Véase la solicitud de patente de Estados Unidos 20040161738 publicada el 19 de agosto de 2004. Estas características combinadas con la baja antigenicidad para los seres humanos indican un gran potencial terapéutico. Además, estas moléculas pueden expresarse completamente en células procariotas tales como E. co liy se expresan como proteínas de fusión con bacteriófagos y son funcionales.
Por consiguiente, una característica de la presente invención es un anticuerpo o nanocuerpo de camélido que tiene alta afinidad por Epo. En determinadas realizaciones de este documento, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se produce de forma natural en el animal camélido, es decir, se produce por el camélido después de inmunización con Epo o un fragmento peptídico de la misma, usando técnicas descritas en este documento para otros anticuerpos. Como alternativa, el nanocuerpo de camélido de unión a Epo se genomanipula, es decir, se produce por selección, por ejemplo, de una colección de proteínas de nanocuerpo de camélido apropiadamente mutagenizadas de presentación en fagos usando procedimientos de separación con Epo como diana como se describe en los ejemplos en este documento. Los nanocuerpos genomanipulados pueden adaptarse adicionalmente por genomanipulación para obtener una semivida en un sujeto destinatario de 45 minutos a dos semanas. En una realización específica, el anticuerpo o nanocuerpo de camélido se obtiene injertando las secuencias de las CDR de la cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanos de la invención en secuencias flanqueantes del nanocuerpo o anticuerpo de un solo dominio, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 1994/004678.
Moléculas biespecíficas y anticuerpos multivalentes
En otro aspecto, la presente invención destaca moléculas biespecíficas o multiespecíficas que comprenden un anticuerpo de unión a Epo, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o regiones de unión a antígeno del mismo, pueden derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se una a al menos dos sitios de unión o moléculas diana diferentes. El anticuerpo de la invención, de hecho, puede derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unan a más de dos sitios de unión y/o moléculas diana diferentes; se pretende que dichas moléculas multiespecíficas también estén englobadas por la expresión "molécula biespecífica" como se usa en este documento. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o más moléculas de unión diferentes, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o imitador de unión, de modo que se produzca una molécula biespecífica.
Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión por Epo y una segunda especificidad de unión por un segundo epítopo diana. Por ejemplo, el segundo epítopo diana es otro epítopo de Epo diferente del primer epítopo diana.
Además, para la invención en que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión, además del primer y segundo epítopo diana.
En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en Ladner et al. patente de Estados Unidos n.° 4946778.
Los diacuerpos son moléculas biespecíficas bivalentes en que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, conectados mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Los dominios VH y VL se emparejan con dominios complementarios de otra cadena, creando de ese modo dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2:1121-1123). Los diacuerpos pueden producirse expresando dos cadenas polipeptídicas con la estructura VHA-VLB y VHB-VLA (configuración v H-VL), o VLA-VHB y VLB-VhA (configuración VL-VH) dentro de la misma célula. La mayoría de ellos puede expresarse en forma soluble en bacterias. Los diacuerpos monocatenarios (scDb) se producen conectando las dos cadenas polipeptídicas que forman el diacuerpo con un conector de aproximadamente 15 residuos aminoacídicos (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). El scDb puede expresarse en bacterias en forma monomérica activa soluble (véase Holliger y Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36; Pluckthun y Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21). Un diacuerpo puede fusionarse a Fc para generar un "didiacuerpo" (véase Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).
Otro anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecíficas pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una diversidad de agentes de acoplamiento o reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(Nmaleimidometil)cidohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky et al. 1984, J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos en Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. n.° 78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83) y Glennie et al., 1987 J. Immunol.
139: 2367-2375). Los agentes de conjugación son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones de bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particular, la región de bisagra se modifica para que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, por ejemplo, uno, antes de la conjugación.
Como alternativa, ambas especificidades de unión pueden estar codificadas en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula hospedadora. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión de mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula monocatenaria que comprenda un anticuerpo monocatenario y un determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 5260203; la patente de Estados Unidos n.° 5455030; la patente de Estados Unidos n.° 4881175; la patente de Estados Unidos n.° 5132405; la patente de Estados Unidos n.° 5091513; la patente de Estados Unidos n.° 5476786; la patente de Estados Unidos n.° 5013653; la patente de Estados Unidos n.° 5258498; y la patente de Estados Unidos n.° 5482858.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse, por ejemplo, por ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (REA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia de Western. Cada uno de estos ensayos en general detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de particular interés empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés.
En otro aspecto, la presente invención proporciona compuestos multivalentes que comprenden al menos dos partes de unión a antígeno idénticas o diferentes de los anticuerpos de la invención que se unen a Epo. Las partes de unión a antígeno pueden unirse mediante fusión de proteínas o enlace covalente o no covalente. Como alternativa, se han descrito métodos de enlace para las moléculas biespecíficas. Pueden obtenerse compuestos tetravalentes, por ejemplo, reticulando anticuerpos de los anticuerpos de la invención con un anticuerpo que se una a las regiones constantes de los anticuerpos de la invención, por ejemplo, la región Fc o de bisagra.
Se describen dominios de trimerización, por ejemplo, en la patente de Borean EP 1012280B1. Se describen módulos de pentamerización, por ejemplo, en el documento WO 1998/018943.
Anticuerpos con semivida prolongada
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a la proteína Epo, que tienen una semivida prolongada in vivo.
Muchos factores pueden afectar a la semivida de una proteína in vivo, por ejemplo, la filtración renal, el metabolismo en el hígado, la degradación por enzimas proteolíticas (proteasas) y respuestas inmunogénicas (por ejemplo, neutralización de proteínas por anticuerpos y captación por macrófagos y células dendríticas). Puede usarse una diversidad de estrategias para prolongar la semivida de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, por enlace químico a polietilenglicol (p Eg ), reCODE PEG, estructura de anticuerpo, poli(ácido siálico) (PSA), hidroxietil almidón (HES), ligandos de unión a albúmina y blindajes glucídicos; por fusión genética a proteínas que se unen a proteínas séricas, tales como albúmina, IgG, FcRn, y transferencia; por acoplamiento (genética o químicamente) a otros restos de unión que se unen a proteínas séricas, tales como nanocuerpos, Fab, DARPin, avímeros, affibodies y anticalinas; por fusión genética a rPEG, albúmina, dominio de albúmina, proteínas de unión a albúmina y Fc; o por incorporación en nanovehículos, formulaciones de liberación lenta o dispositivos médicos.
Para prolongar la circulación en suero de anticuerpos in vivo, pueden fijarse moléculas poliméricas inertes tales como polietilenglicol (PEG) de alto peso molecular a los anticuerpos o un fragmento de los mismos con o sin un conector multifuncional a través de conjugación específica de sitio del PEG al extremo N o C de los anticuerpos o mediante grupos épsilon-amino presentes en residuos de lisina. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar típicamente con PEG, tal como un éster reactivo o un derivado de aldehído del PEG, en condiciones en que uno o más grupos PEG quedan fijados al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La pegilación se puede realizar mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula reactiva de PEG (o un polímero hidrosoluble reactivo análogo). Como se usan en este documento, se pretende que los términos "polietilenglicol" y "PEG" engloben cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tal como monoalcoxi(C1-C10)- o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglucosilado. Se usará derivatización de polímero lineal o ramificado que provoque pérdida mínima de actividad biológica.
El grado de conjugación puede controlarse estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación apropiada de moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar puede separarse de los conjugados de anticuerpo-PEG por exclusión por tamaño o por cromatografía de intercambio iónico. Los anticuerpos derivatizados con PEG pueden ensayarse para la actividad de unión, así como para la eficacia in vivo usando métodos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, por inmunoensayos descritos en este documento. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en el técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401384 de Ishikawa et al.
Otras tecnologías de pegilación modificadas incluyen la tecnología de genomanipulación dirigida ortogonal químicamente reconstituyente (ReCODE PEG), que incorpora cadenas laterales químicamente especificadas en proteínas biosintéticas mediante un sistema reconstituido que incluye ARNt sintetasa y ARNt. Esta tecnología posibilita la incorporación de más de 30 nuevos aminoácidos en proteínas biosintéticas en E. coli, levadura y células de mamífero. El ARNt incorpora un aminoácido no natural en cualquier lugar en que haya un codón ámbar ubicado, convirtiendo el codón de parada ámbar en uno que señalice la incorporación del aminoácido químicamente especificado.
También puede usarse tecnología de pegilación recombinante (rPEG) para la prolongación de la semivida en suero. Esta tecnología implica fusionar genéticamente una cola proteínica no estructurada de 300-600 aminoácidos a una proteína farmacéutica existente. Como el peso molecular aparente de dicha cadena proteínica no estructurada es aproximadamente 15 veces más grande que su peso molecular real, la semivida en suero de la proteína se aumenta enormemente. En contraste con la PEGilación tradicional, que requiere conjugación química y repurificación, el proceso de fabricación se simplifica enormemente y el producto es homogéneo.
La polisialilación es otra tecnología, que usa el polímero natural poli(ácido siálico) (PSA) para prolongar la vida activa y mejorar la estabilidad de péptidos terapéuticos y proteínas. El PSA es un polímero de ácido siálico (un glúcido). Cuando se usa para el suministro de proteína y fármaco peptídico terapéutico, el poli(ácido siálico) proporciona un microentorno protector en la conjugación. Esto aumenta la vida activa de la proteína terapéutica en la circulación y evita que la reconozca el sistema inmunitario. El polímero de PSA se encuentra de forma natural en el cuerpo humano. Lo adoptaron determinadas bacterias que evolucionaron durante millones de años para recubrir sus paredes con el mismo. Estas bacterias polisialiladas de forma natural entonces podían, debido al mimetismo molecular, frustrar el sistema de defensa del cuerpo. El PSA, la tecnología encubierta definitiva de la naturaleza, puede producirse fácilmente a partir de dichas bacterias en grandes cantidades y con características físicas predeterminadas. El PSA bacteriano es completamente no inmunógeno, incluso cuando se acopla a proteínas, ya que es químicamente idéntico al PSA en el cuerpo humano.
Otra tecnología incluye el uso de derivados de hidroxietil almidón ("HES") unidos a anticuerpos. E1HES es un polímero natural modificado derivado de almidón de maíz ceroso y puede metabolizarse por las enzimas del cuerpo. Habitualmente se administran soluciones de HES para sustituir un volumen de sangre insuficiente y para mejorar las propiedades reológicas de la sangre. La hesilación de un anticuerpo posibilita la prolongación de la semivida en circulación aumentando la estabilidad de la molécula, así como reduciendo la eliminación renal, provocando una actividad biológica aumentada. Variando diferentes parámetros, tales como el peso molecular de HES, puede personalizarse una amplia gama de conjugados de HES y anticuerpo.
También pueden generarse anticuerpos que tienen una semivida aumentada in vivo introduciendo una o más modificaciones aminoacídicas (es decir, sustituciones, inserciones o eliminaciones) en un dominio constante de IgG, o fragmento de unión a FcRn del mismo (preferiblemente un fragmento de dominio Fc o Fc de bisagra). Véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 98/23289; la publicación internacional n.° WO 97/34631; y la patente de Estados Unidos n.° 6277375.
Además, los anticuerpos pueden conjugarse con albúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana; HSA) para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o tenga una semivida más larga in vivo. Las técnicas son bien conocidas en la técnica, véanse, por ejemplo, las publicaciones internacionales n.° WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea n.° EP0413622. Además, en el contexto de un anticuerpo biespecífico como se describe anteriormente, las especificidades del anticuerpo pueden diseñarse de modo que un dominio de unión del anticuerpo se una a Epo mientras que un segundo dominio de unión del anticuerpo se una a seroalbúmina, preferiblemente HSA.
Las estrategias para aumentar la semivida son especialmente útiles en nanocuerpos, agentes de unión basados en fibronectina y otros anticuerpos o proteínas para las que se desea semivida in vivo aumentada.
Conjugados de anticuerpo
La presente invención proporciona anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a una proteína Epo, fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o polipéptido heterólogo (o fragmento del mismo, preferiblemente a un polipéptido de al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos) para generar proteínas de fusión. En particular, la invención proporciona proteínas de fusión que comprenden un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo descrito en este documento (por ejemplo, un fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, un dominio VH, una CDR de VH, un dominio de VL o una CDR de VL) y una proteína, polipéptido o péptido heterólogo. Los métodos para fusionar o conjugar proteínas, polipéptidos o péptidos a un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, 5447851 y 5112946; las patentes europeas n.° EP 0307434 y EP 0367166; las publicaciones internacionales n.° WO 96/04388 y W o 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng et al., 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; y Vil et a l, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341.
Pueden generarse proteínas de fusión adicionales a través de las técnicas de reordenamiento de genes, reordenamiento de motivos, reordenamiento de exones y/o reordenamiento de codones (denominado colectivamente "reordenamiento de ADN"). El reordenamiento de ADN puede emplearse para alterar las actividades de anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos (por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos con mayores afinidades y menores velocidades de disociación). Véanse, en general, las patentes de Estados Unidos n.° 5605793, 5811238, 5830721, 5834252 y 5837458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol.
16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; y Lorenzo y Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos, o los anticuerpos codificados o fragmentos de los mismos, pueden alterarse sometiéndolos a mutagénesis aleatoria mediante PCR propensa a errores, inserción de nucleótidos aleatorios u otros métodos antes de la recombinación. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína Epo puede recombinarse con uno o más componentes, motivos, secciones, partes, dominios, fragmentos, etc. de una o más moléculas heterólogas.
Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden fusionarse a secuencias marcadoras, tales como un péptido para facilitar la purificación. En realizaciones preferidas, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, tal como la marca proporcionada en un vector pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre otros, de los que muchos están disponibles en el mercado. Como se describe en Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, por ejemplo, la hexahistidina proporciona purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras marcas peptídicas útiles para la purificación incluyen, aunque sin limitación, la marca de hemaglutinina ("HA"), que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37:767) y la marca "flag".
En otras realizaciones, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos se conjugan con un agente de diagnóstico o detectable. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para controlar o pronosticar la aparición, desarrollo, progresión y/o gravedad de una enfermedad o trastorno como parte de un procedimiento de ensayo clínico, tal como determinar la eficacia de un tratamiento particular. Dicho diagnóstico y detección pueden realizarse acoplando el anticuerpo a sustancias detectables incluyendo, aunque sin limitación, diversas enzimas tales como, aunque sin limitación, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos tales como, aunque sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, aunque sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriacinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, aunque sin limitación, luminol; materiales bioluminiscentes tales como, aunque sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radioactivos tales como, aunque sin limitación, yodo (131I, 125I, 123I y 121I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In y 111In), tecnecio (99Tc), talio (201 Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn y 117Tin; y metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos.
La presente invención abarca además usos de anticuerpos o fragmentos de los mismos conjugados a un resto terapéutico. Un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico tal como una citotoxina, por ejemplo, un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un ion metálico radioactivo, por ejemplo, emisores alfa. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células.
Además, un anticuerpo o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto terapéutico o resto de fármaco que modifique una respuesta biológica dada. Los restos terapéuticos o restos de fármaco no deben interpretarse limitados a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto de fármaco puede ser una proteína, péptido o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, un agente antiangiogénico; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina.
Además, un anticuerpo puede conjugarse con restos terapéuticos tales como un ion metálico radioactivo, tales como emisores alfa tales como 213Bi o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos incluyendo, aunque sin limitación, 131In, 131Lu, 131Y, 131Ho, 131Sm, con polipéptidos. En determinadas realizaciones, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazacidododecano-N,N',N",N"'-tetraacético (DOTA) que puede fijarse al anticuerpo mediante una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras son normalmente conocidas en la técnica y se describen en Denardo et al,, 1998, Clin Cancer Res. 4(10):2483-90; Peterson et al,, 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; y Zimmerman et al,, 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50.
Las técnicas para conjugar restos terapéuticos con anticuerpos son bien conocidos, véase, por ejemplo, Arnon et al,, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al, (eds.), pág. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al,, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2.a Ed.), Robinson et al, (eds.), pág. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al, (eds.), pág. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al, (eds.), pág. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al,, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.
Los anticuerpos también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos o purificación del antígeno diana. Dichos soportes sólidos incluyen, aunque sin limitación, vidrio, celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno.
Métodos para producir anticuerpos de la invención
Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos
La invención proporciona moléculas de ácido nucleico sustancialmente purificadas que codifican polipéptidos que comprenden segmentos o dominios de las cadenas de anticuerpo de unión a Epo de la invención descrito anteriormente. Algunos de los ácidos nucleicos de la invención comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 13, 33, 53 o 73, y/o la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 14, 34, 54 o 74. En una realización específica, las moléculas de ácido nucleico son las identificadas en la tabla 1. Algunas otras moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos un 95 %, o un 99 %) a las secuencias de nucleótidos de las identificadas en la tabla 1. Cuando se expresan a partir de vectores de expresión apropiados, los polipéptidos codificados por estos polinucleótidos pueden mostrar capacidad de unión a antígeno de Epo.
En este documento se describen polinucleótidos que codifican al menos una región CDR y habitualmente las tres regiones CDR de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de unión a Epo expuesto anteriormente. Algunos otros polinucleótidos codifican toda o sustancialmente toda la secuencia de la región variable de la cadena pesada y/o la cadena ligera del anticuerpo de unión a Epo expuesto anteriormente. Debido a la degeneración del código, una diversidad de secuencias de ácido nucleico codificará cada una de las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención puede codificar tanto una región variable como una región constante del anticuerpo. Algunas secuencias de ácido nucleico de la invención comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la cadena pesada madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) a la secuencia de la cadena pesada madura expuesta en SEQ ID NO: 15, 35, 55 o 75. Algunas otras secuencias de ácido nucleico que comprenden nucleótidos que codifican una secuencia de la cadena ligera madura que es sustancialmente idéntica (por ejemplo, al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) a la secuencia de la cadena ligera madura expuesta en SEQ ID NO: 16, 36, 56 o 76.
Las secuencias polinucleotídicas pueden producirse por síntesis de ADN de novo en fase sólida o por mutagénesis por PCR de una secuencia existente (por ejemplo, secuencias como se describen en los ejemplos a continuación) que codifica un anticuerpo de unión a Epo o su fragmento de unión. Puede realizarse síntesis química directa de ácidos nucleicos por métodos conocidos en la técnica, tal como el método de fosfotriéster de Narang et al,, 1979, Meth. Enzymol. 68:90; el método de fosfodiéster de Brown et al,, Meth. Enzymol. 68:109, 1979; el método de dietilfosforamidita de Beaucage et al,, Tetra. Lett., 22:1859, 1981; y el método en soporte sólido de la patente de Estados Unidos n.° 4458066. Introducir mutaciones a una secuencia polinucleotídica por PCR puede realizarse como se describe en, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al, (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al,, Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al,, PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
También se proporcionan en la invención vectores de expresión y células hospedadoras para producir los anticuerpos de unión a Epo de la invención descritos anteriormente. Pueden emplearse diversos vectores de expresión para expresar los polinucleótidos que codifican las cadenas del anticuerpo de unión a Epo o fragmentos de unión. Pueden usarse vectores de expresión tanto víricos como no víricos para producir los anticuerpos en una célula hospedadora de mamífero. Los vectores y sistemas no víricos incluyen plásmidos, vectores episómicos, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, por ejemplo, Harrington et al,, Nat Genet 15:345, 1997). Por ejemplo, los vectores no víricos útiles para la expresión de los polinucleótidos y polipéptidos de unión a Epo en células de mamífero (por ejemplo, humanas) incluyen pThioHis A, B y C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A, B y C (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y otros numerosos vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Los vectores víricos útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, vectores basados en SV40, papilomavirus, virus de Epstein Barr HBP, vectores del virus variolovacunal y virus del bosque Semliki (SFV). Véase, Brent et al,, supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al,, Cell 68:143, 1992.
La elección de vector de expresión depende de las células hospedadoras pretendidas en que tiene que expresarse el vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (por ejemplo, potenciadores) que se unen de forma funcional a los polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo de unión a Epo. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para evitar la expresión de secuencias insertadas, excepto en condiciones de inducción. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, promotor de arabinosa, lacZ, metalotioneína o un promotor de choque térmico. Los cultivos de organismos transformados pueden expandirse en condiciones no inductoras sin desviar la población para secuencias codificantes cuyos productos de expresión los toleran mejor las células hospedadoras. Además de promotores, también pueden requerirse o desearse otros elementos reguladores para la expresión eficaz de una cadena o fragmento de anticuerpo de unión a Epo. Estos elementos típicamente incluyen un codón de inicio ATG y sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, por ejemplo, Scharf et al,, Results Probl. Cell Differ. 20:125, 1994; y Bittner et al,, Meth. Enzymol., 153:516, 1987). Por ejemplo, el potenciador de SV40 o potenciador de CMV puede usarse para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.
Los vectores de expresión también pueden proporcionar una posición en la secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias insertadas del anticuerpo de unión a Epo. Más a menudo, las secuencias insertadas del anticuerpo de unión a Epo se unen a secuencias señal antes de su inclusión en el vector. Los vectores a usar para recibir secuencias que codifiquen los dominios variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo de unión a Epo a veces codifican también regiones constantes o partes de las mismas. Dichos vectores permiten la expresión de las regiones variables como proteínas de fusión con las regiones constantes, dando lugar de ese modo a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, dichas regiones constantes son humanas.
Las células hospedadoras para portar y expresar las cadenas del anticuerpo de unión a Epo pueden ser procariotas o eucariotas. E, coli es un hospedadora procariota para clonar y expresar los polinucleótidos de la presente invención. Otros hospedadores microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos hospedadores procariotas, también se pueden preparar vectores de expresión, que típicamente contienen secuencias de control de la expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estarán presentes incontables de una diversidad de promotores bien conocidos, tal como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores típicamente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. Otros microbios, tales como levadura, también pueden emplearse para expresar polipéptidos de unión a Epo de la invención. También pueden usarse células de insecto en combinación con vectores baculovíricos.
En algunas realizaciones preferidas, se usan células hospedadoras de mamífero para expresar y producir los polipéptidos de unión a Epo de la presente invención. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que expresa genes de inmunoglobulina endógenos (por ejemplo, el clon de hibridoma de mieloma 1D6.C9 como se describe en los ejemplos) o una línea celular de mamífero que porta un vector de expresión exógeno (por ejemplo, las células de mieloma SP2/0 ejemplificadas a continuación). Estas incluyen cualquier célula animal o humana mortal normal o inmortal normal o anómala. Por ejemplo, se han desarrollado varias líneas celulares hospedadoras que pueden secretar inmunoglobulinas intactas, que incluyen las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, linfocitos B transformados e hibridomas. El uso de cultivo celular de tejido de mamífero para expresar polipéptidos se analiza en general en, por ejemplo, Winnacker, FROM GENES TO c Lo NES, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Los vectores de expresión para células hospedadoras de mamífero pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, por ejemplo, Queen, et al,, Immunol. Rev. 89:49-68, 1986) y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Estos vectores de expresión habitualmente contienen promotores derivados de genes de mamífero o de virus de mamífero. Los promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos de tipo celular, específicos de estado y/o modulables o regulables. Los promotores útiles incluyen, aunque sin limitación, el promotor de la metalotioneína, el promotor tardío principal constitutivo de adenovirus, el promotor inducible por dexametasona de MMTV, el promotor de SV40, el promotor de polIM de MRP, el promotor constitutivo de MPSV, el promotor inducible por tetraciclina de CMV (tal como el promotor temprano inmediato del CMV humano), el promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.
Los métodos para introducir vectores de expresión que contengan las secuencias polinucleotídicas de interés varían dependiendo del tipo de hospedador celular. Por ejemplo, se utiliza normalmente transfección con cloruro de calcio para células procariotas, mientras que puede usarse tratamiento con fosfato de calcio o electroporación para otros hospedadores celulares. (Véase en general Sambrook, et al,, supra). Otros métodos incluyen, por ejemplo, electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, Cell 88:223, 1997), captación potenciada por agente de ADN y transducción ex vivo. Para producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, a menudo se deseará expresión estable. Por ejemplo, pueden prepararse líneas celulares que expresan de forma estable cadenas de anticuerpo de unión a Epo o fragmentos de unión usando vectores de expresión de la invención que contienen orígenes de replicación víricos o elementos de expresión endógenos y un gen marcador de selección. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarlas a medio selectivo. El propósito del marcador de selección es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas en medio selectivo. Las células resistentes, transfectadas de forma estable pueden hacerse proliferar usando técnicas de histocultivo apropiadas para el tipo celular.
Generación de anticuerpos monoclonales de la invención
Pueden producirse anticuerpos monoclonales (mAb) mediante una diversidad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, 1975 Nature 256: 495. Pueden emplearse muchas técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación vírica u oncógena de linfocitos B.
Los sistemas animales para preparar hibridomas incluyen los sistemas murino, de rata y de conejo. La producción de hibridoma en ratones es un procedimiento bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Los compañeros de fusión (por ejemplo, células murinas de mieloma) y procedimientos de fusión también son conocidos.
Pueden prepararse anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describe anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma murino de interés y genomanipularse para que contenga secuencias de inmunoglobulina no murina (por ejemplo, humana) usando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden unirse a regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4816567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, se pueden insertar regiones CDR murinas en una región flanqueante humana usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 5225539 de Winter, y las patentes de Estados Unidos n.° 5530101; 5585089; 5693762 y 6180370 de Queen et al.
En una determinada realización, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra Epo pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en este documento ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se denominan colectivamente en este documento "ratones de Ig humana".
El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene minilocus de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (|j y y) y ligera k humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los locus de la cadena j y k endógenos (véase, por ejemplo, Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones muestran expresión reducida de IgM de ratón o k, y en respuesta a inmunización, los transgenes introducidos de la cadena pesada y ligera humana experimentan cambios de clase y mutación somática para generar IgGK monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al., 1994 supra; revisado en Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 y Harding, F. y Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMAb, y las modificaciones genómicas portadas por dichos ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et at. 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al,, 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et a l, 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et a l, 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al,, 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al,, 1994 International Immunology 579-591; y Fishwild, D. et al,, 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse además, las patentes de Estados Unidos n.° 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299; y 5770429; todas de Lonberg y Kay; la patente de Estados Unidos n.° 5545807 de Surani et al.; las publicaciones PCT n.° WO 92103918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97113852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publicación PCT n.° WO 01/14424 de Korman et al.
En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención pueden generarse usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en este documento "ratones KM", se describen en detalle en la publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.
Es más, están disponibles en la técnica sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para generar anticuerpos de unión a Epo de la invención. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgénico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.). Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 y 6162963 de Kucherlapati et al.
Además, están disponibles en la técnica sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para generar anticuerpos de unión a Epo de la invención. Por ejemplo, pueden usarse ratones que portan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; dichos ratones se describen en Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas de la cadena pesada y ligera humana (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) y pueden usarse para generar anticuerpos de unión a Epo de la invención.
También pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos de la invención usando métodos de presentación en fagos para cribar colecciones de genes de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica o se describen en los ejemplos a continuación. Véanse, por ejemplo: las patentes de Estados Unidos n.° 5223409; 5403484; y 5571698 de Ladner et al.; las patentes de Estados Unidos n.° 5427908 y 5580717 de Dower et al.; las patentes de Estados Unidos n.° 5969108 y 6172197 de McCafferty et al.; y las patentes de Estados Unidos n.° 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 y 6593081 de Griffiths et al.
Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse usando ratones SCID en que se han reconstituido inmunocitos humanos de modo que pueda generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunización. Dichos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5476996 y 5698767 de Wilson et al.
Genomanipulación de la región flanqueante o de Fc
Los anticuerpos genomanipulados incluyen aquellos en que se han hecho modificaciones a residuos flanqueantes dentro de VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, dichas modificaciones de la región flanqueante se realizan para disminuir la inmunogenia del anticuerpo. Por ejemplo, una estrategia es "retromutar" uno o más residuos flanqueantes a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener residuos flanqueantes que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo. Dichos residuos se pueden identificar comparando las secuencias flanqueantes del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las que deriva el anticuerpo. Para devolver las secuencias de la región flanqueante a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retromutarse" a la secuencia de la línea germinal por, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. También se pretende que dichos anticuerpos "retromutados" estén englobados por la invención.
Otro tipo de modificación en la región flanqueante implica mutar uno o más residuos dentro de la región flanqueante, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para eliminar los epítopos de linfocitos T para reducir de ese modo la posible inmunogenia del anticuerpo. Esta estrategia también se denomina "desinmunización" y se describe en mayor detalle en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 20030153043 de Carr et al.
Además o como alternativa a las modificaciones hechas dentro de las regiones flanqueantes o CDR, los anticuerpos de la invención pueden genomanipularse para que incluyan modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, pueden fijarse uno o más restos químicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glucosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mayor detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.
En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de modo que el número de residuos de cisteína en la región de bisagra se altere, por ejemplo, se aumente o disminuya. Esta estrategia se describe adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.° 5677425 de Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región de bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones aminoacídicas en la región de contacto del dominio CH2-CH3 del fragmento de Fc-bisagra de modo que el anticuerpo tenga una unión alterada a la proteína A estafilocócica (SpA) con respecto a la unión de SpA al dominio de Fc-bisagra natural. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6165745 de Ward et al.
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles diversas estrategias. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6277375 de Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para que contenga un epítopo de unión a receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de Estados Unidos n.° 5869046 y 6121022 de Presta et al.
En otras realizaciones más, la región Fc se altera remplazando al menos un residuo aminoacídico con un residuo aminoacídico diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. Por ejemplo, se puede remplazar uno o más aminoácidos con un residuo aminoacídico diferente de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Esta estrategia se describe en mayor detalle en las patentes de Estados Unidos n.° 5624821 y 5648260, ambas de Winter et al.
En otra realización, puede remplazarse uno o más aminoácidos seleccionados de residuos aminoacídicos con un residuo aminoacídico diferente de modo que el anticuerpo tenga unión alterada a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Esta estrategia se describe en mayor detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6194551 de Idusogie et at.
En otra realización, se altera uno o más residuos aminoacídicos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et at.
En otra realización más, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy modificando uno o más aminoácidos. Esta estrategia se describe adicionalmente en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, los sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn se han cartografiado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604).
En otra realización más, la glucosilación de un anticuerpo se modifica. Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Dichas modificaciones glucídicas se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones aminoacídicas que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región flanqueante de la región variable para eliminar de ese modo la glucosilación en ese sitio. Dicha aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dicha estrategia se describe en mayor detalle en las patentes de Estados Unidos n.° 5714350 y 6350861 de Co et al.
Adicionalmente o como alternativa, puede prepararse un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga un aumento en las estructuras de GlcNac bisecantes. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones glucídicas se pueden conseguir, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glucosilación alterada. Se han descrito en el técnica células con maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras en las que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de ese modo un anticuerpo con glucosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1176195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular muestran hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida de fijar fucosa a glúcidos ligados a Asn(297), lo que también provoca hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula hospedadora (véase también Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares genomanipuladas para que expresen glucosil transferasas modificadoras de glucoproteína (por ejemplo, beta(1,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares genomanipuladas muestran aumento de estructuras de GlcNac bisecantes, lo que provoca actividad de ADCC aumentada de los anticuerpos (véase también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).
Métodos de genomanipulación de anticuerpos alterados
Como se analiza anteriormente, los anticuerpos de unión a Epo que tienen secuencias de VH y VL o secuencias de la cadena pesada y ligera de longitud completa mostrados en este documento pueden usarse para crear nuevos anticuerpos de unión a Epo modificando las secuencias de la cadena pesada y/o la cadena ligera de longitud completa, las secuencias VH y/o VL o la una o más regiones constantes fijadas a las mismas. Por tanto, las características estructurales de un anticuerpo de unión a Epo de la invención pueden usarse para crear anticuerpos de unión a Epo estructuralmente relacionados que conservan al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como unión a Epo humana y que también inhiben una o más propiedades funcionales de Epo (por ejemplo, inhiben la unión de Epo al receptor de Epo, inhiben la proliferación celular dependiente de Epo).
Por ejemplo, puede combinarse una o más regiones CDR de los anticuerpos de la presente invención, o mutaciones de las mismas, de forma recombinante con regiones flanqueantes conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos de unión a Epo genomanipulados de forma recombinante adicionales, como se analiza anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las descritas en la sección previa. El material de partida para el método de genomanipulación es una o más de las secuencias de VH y/o VL proporcionadas en este documento, o una o más regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo genomanipulado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína) un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias de VH y/o VL proporcionadas en este documento, o una o más regiones CDR de las mismas. En su lugar, la información contenida en la una o más secuencias se usa como material de partida para crear una o más secuencias de "segunda generación" derivadas de la una o más secuencias originales y luego se prepara la una o más secuencias de "segunda generación" y se expresan como una proteína.
Por consiguiente, aquí también se describe un método para preparar un anticuerpo de unión a Epo modificado, que comprende las etapas de: a) producir un anticuerpo de unión a Epo que comprende una secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de c DR1 seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 1, 21, 41 y 61, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2, 22, 42 y 62, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3, 23, 43 y 63; y una secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, 24, 44 y 64, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5, 25, 45 y 65, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, 26, 46 y 66; b) alterar al menos un residuo aminoacídico dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.
Por consiguiente, también se describe en este documento un método para preparar un anticuerpo de unión a Epo que consiste en una secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 27, 47 y 67, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 28, 48 y 68, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 9, 29, 49 y 69; y una secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, 30, 50 y 70, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, 31, 51 y 71, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, 32, 52, y 72; alterar al menos un residuo aminoacídico dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de la cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.
Por consiguiente, en otra realización, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo de unión a Epo optimizado para su expresión en una célula de mamífero, que consiste en: una secuencia de anticuerpo de la cadena pesada de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 15, 35, 55 y 75; y una secuencia de anticuerpo de la cadena ligera de longitud completa que tiene una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 16, 36, 56 y 76; alterar al menos un residuo aminoacídico dentro de la secuencia de anticuerpo de la cadena pesada de longitud completa y/o la secuencia de anticuerpo de la cadena ligera de longitud completa para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. En una realización, la alteración de la cadena pesada o ligera está en la región flanqueante de la cadena pesada o ligera.
La secuencia de anticuerpo alterada también puede prepararse cribando colecciones de anticuerpos que tienen secuencias de CDR3 fijas o determinantes de unión esenciales mínimos como se describe en el documento US20050255552 y diversidad en secuencias de CDR1 y CDR2. El cribado se puede realizar de acuerdo con cualquier tecnología de cribado apropiada para cribar anticuerpos de colecciones de anticuerpos, tal como la tecnología de expresión en fagos.
Pueden usarse técnicas convencionales de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada. El anticuerpo codificado por la una o más secuencias de anticuerpo alteradas es uno que conserva una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos de unión a Epo descritos en este documento, que son propiedades funcionales que incluyen, aunque sin limitación, unión específica a Epo humana, de macaco, de rata y/o de ratón; y el anticuerpo inhibe la proliferación celular dependiente de Epo en un ensayo de proliferación celular de F36E y/o Ba/F3-EpoR.
En determinadas realizaciones de los métodos de genomanipulación de anticuerpos de la invención, pueden introducirse mutaciones de forma aleatoria o selectiva a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de anticuerpo de unión a Epo y los anticuerpos de unión a Epo modificados resultantes pueden cribarse por su actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe en este documento. Se han descrito en el técnica métodos de mutación. Por ejemplo, la publicación PCT WO 02/092780 de Short describe métodos para crear y cribar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamblaje por ligamiento sintético o una combinación de los mismos. Como alternativa, la publicación PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describe métodos de uso de métodos de cribado informatizados para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos se han genomanipulado para eliminar sitios de desamidación. Se sabe que la desamidación provoca cambios estructurales y funcional en un péptido o proteína. La desamidación puede provocar bioactividad disminuida, así como alteraciones en la farmacocinética y antigenicidad del producto farmacéutico proteínico. (Anal Chem. 1 de marzo de 2005; 77(5):1432-9).
En determinadas realizaciones de la invención, los anticuerpos se han genomanipulado para aumentar el pI y mejorar sus propiedades de tipo fármaco. El pI de una proteína es un determinante clave de las propiedades biofísicas globales de una molécula. Los anticuerpos que tienen bajos pI se ha sabido que son menos solubles, menos estables y propensos a agregación. Además, la purificación de anticuerpos con bajo pI es difícil y puede ser problemática especialmente durante el aumento de escala para uso clínico. Aumentar el pI de los anticuerpos anti-Epo, o Fab, de la invención mejoró su solubilidad, lo que posibilita que los anticuerpos se formulen a mayores concentraciones (>100 mg/ml). La formulación de los anticuerpos a altas concentraciones (por ejemplo, >100 mg/ml) ofrece la ventaja de poder administrar mayores dosis de los anticuerpos en ojos de pacientes mediante inyecciones intravítreas, lo que, a su vez, puede posibilitar una frecuencia de dosificación reducida, una ventaja significativa para el tratamiento de enfermedades crónicas, incluyendo vasculopatías retinianas. Mayores pI también pueden aumentar el reciclado mediado por FcRn de la versión de IgG del anticuerpo posibilitando, por tanto, que el fármaco persista en el organismo durante un tiempo más largo, lo que requiere menos inyecciones. Finalmente, la estabilidad global de los anticuerpos se mejora significativamente debido al mayor pI, que provoca una semivida más larga y bioactividad in vivo. Preferiblemente, el pI es mayor de o igual a 8,2.
Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse usando ensayos convencionales disponibles en la técnica y/o descritos en este documento, tales como los expuestos en los ejemplos (por ejemplo, ELISA).
Usos profilácticos y terapéuticos
Los anticuerpos que se unen a Epo, como se describe en este documento, pueden usarse a una concentración terapéuticamente útil para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con niveles y/o actividad aumentados de Epo administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención. La presente invención proporciona un método de tratamiento de afecciones o trastorno asociados con vasculopatía retiniana administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La presente invención proporciona un método de tratamiento de afecciones o trastorno asociados con retinopatía diabética (RD) administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La presente invención proporciona un método de tratamiento de afecciones o trastorno asociados con edema macular administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La invención también proporciona un método de tratamiento de edema macular diabético (EMD) administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La presente invención proporciona además un método de tratamiento de retinopatía diabética proliferativa (RDP) administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. Es más, la presente invención proporciona métodos para tratar el edema macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), angioedema, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope y/o retinopatía del prematuro, administrando a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de los anticuerpos de la invención. La invención también proporciona métodos de tratamiento de talasemia beta y/o cáncer.
La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con niveles y/o actividad aumentados de Epo. La invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana. La invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con retinopatía diabética (RD). La invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con edema macular, edema macular diabético (EMD) y/o retinopatía diabética proliferativa (RDP). La invención se refiere además también a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en edema macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), angioedema, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope y/o retinopatía del prematuro. La invención se refiere además a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de talasemia beta y/o cáncer. Más específicamente, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con niveles y/o actividad aumentados de Epo, puede ser uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento, además de los descritos en la tabla 1. Es más, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana, puede ser uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento, además de los descritos en la tabla 1. Los anticuerpos de la invención pueden usarse, entre otras cosas, para evitar la progresión de afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana (por ejemplo, RD, EMD, RDNP, RDP, degeneración macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), angioedema, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope y/o retinopatía del prematuro), para tratar o prevenir el edema macular asociado con vasculopatía retiniana, para reducir la frecuencia de inyección de Lucentis® (RTM), y para mejorar la pérdida de visión debida a la progresión de la vasculopatía retiniana. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse en combinación con tratamientos anti-VEGF para el tratamiento de pacientes con vasculopatía retiniana.
En un aspecto, la invención se refiere a un método de inhibición de la proliferación celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo (por ejemplo, poner contacto Epo en un sujeto) con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula (por ejemplo, una célula que comprende Epo) con una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso para inhibir la proliferación celular dependiente de Epo en un sujeto. Se contempla que la célula es una célula humana. La célula podría ser un linfocito B. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La proliferación celular puede medirse por, por ejemplo, biomicroscopia con lámpara de hendidura, tomografía de coherencia óptica, fotografía del fondo en color y angiografía con fluoresceína (Heng et al. Diabet. Med. junio de 2013; 30(6):640-50). Además, la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en este documento de inhibir la proliferación celular dependiente de Epo puede medirse usando un ensayo tal como el ensayo de proliferación celular de F36E, o Ba/F3-EpoR descrito a continuación.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la señalización celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento para evitar la interacción de Epo con un receptor en una superficie celular. En un aspecto, el método comprende poner en contacto una célula que comprende Epo con una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento para su uso para inhibir la señalización celular dependiente de Epo en un sujeto. Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano.
La unión de Epo al EpoR induce la señalización mediante JAK2 cinasas, que da lugar a la activación de rutas de señalización posteriores que incluyen fosfatidil-inositol 3-cinasa (PI-3K)/Akt, MAP cinasa, STAT5 y proteína cinasa C (Jelkmann, 2007; Jelkmann, 2004). Se ha informado de que Epo o el receptor de Epo (EpoR) se producen de forma endógena por diferentes tipos celulares tales como células endoteliales, células de músculo liso y células del SNC (Ogunshola y Bogdanova, 2013). La activación de EpoR tras la unión de Epo puede activar rutas de señalización posteriores que dan lugar a diferentes actividades tales como transporte de calcio (Korbel et al., 2004), supervivencia celular (Velly et al., 2010), neuroprotección (Grimm et al., 2002) y angiogénesis (Ribatti, 2010; Ribatti et al., 2003). Por consiguiente, la inhibición de la señalización celular dependiente de Epo puede determinarse midiendo la actividad de una o más de estas rutas de señalización. Por ejemplo, la inhibición de la señalización celular dependiente de Epo puede determinarse midiendo la JAK2 cinasa, PI-3K/Akt, MAP cinasa, STAT5 o proteína cinasa C. Los métodos para medir estas rutas de señalización son conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado kits para medir la actividad de dichas rutas. Además, la inhibición de la señalización celular dependiente de Epo puede determinarse midiendo la proliferación celular como se describe anteriormente. La proliferación celular puede estar en un sujeto (por ejemplo, angiogénesis), o puede medirse usando un ensayo yal como el ensayo de proliferación celular de F36e o Ba/F3-EpoR descrito a continuación. En un aspecto, la señalización celular dependiente de Epo se disminuye de manera estadísticamente significativa (p<0,05) en presencia de un anticuerpo descrito en este documento, con respecto al control.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la proliferación o señalización celular dependiente de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento para evitar la interacción de Epo con un receptor en una superficie celular. Se contempla que la célula es un linfocito B. Se contempla que la célula es una célula humana.
La invención también se refiere a un método de inhibición de la unión de Epo al receptor de Epo, en el que el método incluye la etapa de poner en contacto Epo (por ejemplo, poner contacto Epo en un sujeto) con una cantidad eficaz de una composición que comprende el anticuerpo aislado o fragmentos de unión a antígeno del mismo de la invención descrito en este documento; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. La invención también se refiere a una composición que comprende un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención como se describe en este documento, para su uso para inhibir la unión de Epo al receptor de Epo en una célula de un sujeto; en particular, la composición puede comprender el anticuerpo NVS1, NVS2, NVS3 o NVS4. Se contempla que la célula es una célula humana. Se contempla además que la célula está en un sujeto. También se contempla que la célula está en el ojo del sujeto. Se contempla además también que el sujeto es humano. La inhibición de la unión de Epo al receptor de Epo puede medirse como se describe por Khankin et al. PLoS ONE, 20105:e9246
El tratamiento y/o prevención de vasculopatía retiniana y edema macular asociado con vasculopatía retiniana puede determinarse por un oftalmólogo o profesional sanitario usando mediciones clínicamente pertinentes de función visual y/o anatomía de la retina. El tratamiento de afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana significa cualquier acción (por ejemplo, administración de un anticuerpo anti-Epo descrito en este documento) que provoca, o se contempla que provoque, la mejora o conservación de la función visual y/o anatomía de la retina. Además, la prevención que se refiere a afecciones o trastornos asociados con vasculopatía retiniana significa cualquier acción (por ejemplo, administración de un anticuerpo anti-Epo descrito en este documento) que evita o ralentiza un empeoramiento en la función visual, la anatomía de la retina y/o un parámetro de vasculopatía retiniana, como se define en este documento, en un paciente en riesgo de dicho empeoramiento.
La función visual puede incluir, por ejemplo, agudeza visual, agudeza visual con baja iluminación, campo visual, campo visual central, visión periférica, sensibilidad al contraste, adaptación a la oscuridad, recuperación de fotoagresión, discriminación de colores, velocidad de lectura, dependencia de dispositivos auxiliares (por ejemplo, tipo de letra grande, dispositivos de aumento, sistemas ópticos), reconocimiento facial, competencia en manejar un vehículo a motor, capacidad de realizar una o más actividades de la vida cotidiana, y/o satisfacción informada por el paciente con relación a la función visual.
Medidas ejemplares de función visual incluyen agudeza visual de Snellen, agudeza visual de ETDRS, agudeza visual en baja luminosidad, rejilla de Amsler, campo visual de Goldmann, campo visual de Humphrey, microperimetría, diagramas de Pelli-Robson, tarjeta SKILL, placas de color de Ishihara, ensayo de color de Farnsworth D15 o D100, electrorretinografía convencional, electrorretinografía multifocal, ensayos validados para la velocidad de lectura, reconocimiento facial, simulaciones de conducción y satisfacción informada por el paciente. Por tanto, el tratamiento de vasculopatía y/o edema macular puede decirse que se consigue tras un aumento de o ausencia de pérdida de 2 o más líneas (o 10 letras) de visión en una escala de ETDRS. Además, el tratamiento de vasculopatía y/o edema macular puede decirse que se produce cuando un sujeto muestra al menos un 10 % de aumento o ausencia de un 10 % de disminución en la velocidad de lectura (palabras por minuto). Además, el tratamiento de vasculopatía y/o edema macular puede decirse que se produce cuando un sujeto muestra al menos un 20 % de aumento o ausencia de un 20 % de disminución en la proporción de placas identificadas correctamente en un ensayo de Ishihara o discos secuenciados correctamente en un ensayo de Farnsworth. Además, el tratamiento de vasculopatía retiniana y/o edema macular, puede decirse que se produce si un sujeto tiene, por ejemplo, al menos un 10 % de disminución o ausencia de un 10 % o más de aumento en el tiempo para un grado preespecificado de adaptación a la oscuridad. Además, el tratamiento de vasculopatía retiniana y/o edema macular puede decirse que se produce cuando un sujeto muestra, por ejemplo, al menos un 10 % de reducción o ausencia de un 10 % o más de aumento en el área total de escotoma visual expresada como un ángulo visual determinado por un profesional sanitario cualificado (es decir, oftalmólogo).
Aspectos indeseables de la anatomía de la retina que pueden tratarse o prevenirse incluyen, por ejemplo, microaneurisma, edema macular, exudado algodonoso, anomalía microvascular intrarretiniana (AMIR), prolapso de los capilares, adhesión leucocitaria, isquemia retiniana, neovascularización de la papila óptica, neovascularización del polo posterior, neovascularización del iris, hemorragia intrarretiniana, hemorragia vítrea, cicatriz macular, fibrosis subretiniana y fibrosis retiniana, dilatación venosa, tortuosidad vascular, filtración vascular. Por tanto, el tratamiento de, por ejemplo, edema macular puede determinarse por un 20 % o más de reducción en el grosor del subcampo retiniano central medido por tomografía de coherencia óptica.
Medios ejemplares de evaluación de la anatomía de la retina incluyen oftalmoscopia, fotografía del fondo, angiografía con fluoresceína, angiografía con verde de indocianina, tomografía de coherencia óptica (OCT), tomografía de coherencia óptica de dominio espectral, oftalmoscopia por barrido con láser, microscopia confocal, óptica adaptativa, autofluorescencia del fondo, biopsia, necropsia e inmunohistoquímica. Por tanto, puede decirse que se trata la vasculopatía y/o edema macular en un sujeto tras un 10 % de reducción en el área de filtración determinada por angiografía con fluoresceína.
A los sujetos a tratar con agentes terapéuticos de la presente invención también se les puede administrar otros agentes terapéuticos con métodos conocidos de tratamiento de afecciones asociadas con diabetes mellitus, tales como todas las formas de medicación con insulina y antihipertensivos.
El tratamiento y/o prevención de enfermedad ocular tal como degeneración macular senil (DMS), oclusión de la vena retiniana (OVR), angioedema, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope y/o retinopatía del prematuro puede determinarse por un oftalmólogo o profesional sanitario usando mediciones clínicamente pertinentes de función visual y/o anatomía de la retina por cualquiera de las medidas descritas anteriormente. Aunque las medidas descritas en este documento no tienen aplicación a todas las enfermedades oculares de este documento, un experto en la materia reconocería le medición clínicamente pertinente de función visual y/o anatomía de la retina que podría usarse para tratar la enfermedad ocular dada.
Cuando los agentes terapéuticos de la presente invención se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse secuencialmente en cualquier orden o simultáneamente. En algunos aspectos, un anticuerpo de la presente invención se administra a un sujeto que también está recibiendo tratamiento con un segundo agente (por ejemplo, Lucentis®). En otros aspectos, la molécula de unión se administra junto con tratamientos quirúrgicos.
Los agentes adecuados para politerapia con anticuerpos de unión a Epo incluyen agentes conocidos en la técnica que pueden modular las actividades de VEGF, receptores de VEGF, otros inhibidores de tirosina cinasa receptora, u otras entidades que modulan rutas mediadas por HIF-1. Se ha informado de que otros agentes que inhiben estas rutas incluyen ranibizumab, bevicizumab, pegaptanib, aflibercept, pazopanib, sorafinib, sunitinib y rapamicina. También podrían ser beneficiosas politerapias con agentes antinflamatorios tales como corticoesteroides, AINE e inhibidores de TNF-a en el tratamiento de vasculopatía retiniana y edema macular, por ejemplo, retinopatía diabética y EMD.
Una pauta de politerapia puede ser aditiva, o puede producir resultados sinérgicos (por ejemplo, reducciones en la gravedad de la retinopatía más de las esperadas para el uso combinado de los dos agentes). En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una politerapia para prevenir y/o tratar vasculopatías retinianas y edema macular, específicamente, retinopatía diabética, incluyendo EMD y/o RDP como se describe anteriormente con un anticuerpo de unión a Epo de la invención y un agente antiangiogénico, tal como anti-VEGF.
Composiciones farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprende los anticuerpos de unión a Epo (intactos o fragmentos de unión) de la invención formulados junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden contener adicionalmente uno o más agentes terapéuticos diferentes que sean adecuados para tratar o prevenir, por ejemplo, la retinopatía diabética. Los vehículos farmacéuticamente aceptables potencian o estabilizan la composición, o pueden usarse para facilitar la preparación de la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Se prefiere que la administración sea intravítrea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, o se administre proximal al sitio de la diana. El vehículo farmacéuticamente aceptable debe ser adecuado para administración intravítrea, intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, la molécula biespecífica y multiespecífica de anticuerpo, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
La composición debe ser estéril y fluida. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse de acuerdo con métodos bien conocidos y puestos en práctica de forma rutinaria en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20.a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente en condiciones GMP. Típicamente, se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o dosis eficaz del anticuerpo de unión a Epo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los anticuerpos de unión a Epo se formulan en formas galénicas farmacéuticamente aceptables mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una única inyección intravenosa rápida, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o incrementar de forma proporcional la dosis según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Resulta especialmente favorable formular composiciones parenterales en una forma galénica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma galénica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin que sean tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado depende de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares.
Un médico o veterinario puede comenzar con dosis de los anticuerpos de la invención empleados en la composición farmacéutica a niveles menores de los necesarios para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar la dosis gradualmente hasta que se consiga el efecto deseado. En general, las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de una vasculopatía retiniana descrita en este documento varían dependiendo de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Las dosificaciones de tratamiento tienen que valorarse para optimizar la seguridad y la eficacia. Para administración sistémica con un anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 15 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Para administración intravítrea con un anticuerpo, la dosificación puede variar de 0,1 mg/ojo a 10 mg/ojo. Más específicamente, la dosis puede variar de 1 mg/ojo a 9 mg/ojo, de 2 mg/ojo a 8 mg/ojo, de 3 mg/ojo a 7 mg/ojo, de 4 mg/ojo a 6 mg/ojo o de 4,5 mg/ojo a 5,5 mg/ojo. En determinados casos, la dosis puede ser de 0,1 mg/ojo, 0,2 mg/ojo, 0,3 mg/ojo, 0,4 mg/ojo, 0,5 mg/ojo, 0,6 mg/ojo, 0,7 mg/ojo, 0,8 mg/ojo, 0,9 mg/ojo, 1 mg/ojo, 2 mg/ojo, 3 mg/ojo, 4 mg/ojo, 5 mg/ojo, 6 mg/ojo, 7 mg/ojo, 8 mg/ojo, 9 mg/ojo o 10 mg/ojo. Una pauta de tratamiento ejemplar implica administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses. Una pauta de tratamiento ejemplar implica administración sistémica una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses, o según los necesario (PRN).
El anticuerpo habitualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según se indique al medir los niveles en sangre del anticuerpo de unión a Epo en el paciente. Además, un médico puede determinar intervalos de dosificación alternativos y administrarlos mensualmente o según lo necesario para que sean eficaces. La eficacia se basa en el crecimiento de la lesión, la tasa de recuperación de Lucentis®, el grosor de la retina determinado por tomografía de coherencia óptica (OCT) y agudeza visual. En algunos métodos de administración sistémica, la dosificación se ajusta para conseguir una concentración de anticuerpo en plasma de 1-1000 |jg/ml y, en algunos métodos, de 25-500 |jg/ml. Como alternativa, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación mantenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanizados muestran semivida más larga que los anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja con intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo largo. Algunos pacientes siguen recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, en ocasiones se requiere una dosificación relativamente elevada a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduzca o termine, y preferiblemente hasta que el paciente muestre una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de ello, se puede administrar al paciente una pauta profiláctica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente la invención, pero no para limitar su alcance.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos contra Epo de afinidad madurada
Se usó una colección de presentación en fagos completamente humana para generar anticuerpos de unión a Epo descritos en este documento.
Se usó Epo humana y de macaco biotinilada y no biotinilada en separaciones en solución y en fase sólida. Se realizó separación convencional, así como estrategias RapMAT (Prassler et al,, (2009) Immunotherapy 1(4):571-583). Después del cribado secundario y separación RapMAT, se seleccionado clones para el análisis de secuencia y se seleccionó un conjunto de 8 anticuerpos para su conversión a un formato FabCys, conversión a la línea germinal, optimización del pI y eliminación de sitios de desamidación. La generación de FabCys se consiguió con un método RapCLONE® patentado. Se realizó RapCLONE® como un método de dos etapas para la conversión oportuna y eficaz de una gran cantidad de clones de Fab en el formato IgG y FabCys. En una primera etapa de clonación, se introdujo un casete de expresión eucariota en los vectores de expresión pMORPH®x11 (para HuCAL PLATINUM®) mediante digestión conBsiWI/Mfel (para combinaciones k) o Hpal/Mfel (para combinaciones A) y posterior ligamiento. Esto estuvo seguido de una segunda etapa de clonación, en que las combinaciones de Fab que contenían el casete de expresión se digirieron usando EcoRV/Blpl (combinaciones k y A) y posteriormente se clonaron en el vector aceptador pMorph®4_IgG1f o pMorph®4_h_FabCys para su expresión en células de mamífero. Para este proyecto, se aplicó RapCLONE® solamente sobre Fab únicos, secuenciados y caracterizados. Por lo tanto, todos los clones se recuperaron después de RapCLONE®.
Bajos pI (<8,2) en general están asociados con malas propiedades biofísicas, incluyendo estabilidad y agregación. Se seleccionador 8 candidatos finales (clones únicos de h Cd R3) para conversión a la línea germinal, optimización de pI y eliminación de sitios de desamidación, que da lugar a un total de 12 variantes convertidas a la línea germinal. Se sintetizaron 12 genes de VL (dos para 11317, 11324, 11331 y 11345) y uno de VH (11324). Posiblemente debido a la deselección inicial de candidatos con PTM, solamente 11317 (VL), 11332 (VL) y 11380 (VH) contenían sitios de desamidación que se eliminaron con la conversión a la línea germinal. La conversión a la línea germinal en general se hizo a la línea germinal más cercana. Para aumentar el pI, se eligió la línea germinal de lambda 3h para 6 de los candidatos en lugar de o además de la línea germinal más cercana 3r. Además se construyeron variantes de lambda 3j para tres candidatos para minimizar el riesgo (11317, 11331 y 11345).
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NA, no aplicable
* Todas las modificaciones con PTM se produjeron en VL, **las modificaciones de pI se produjeron en VH
Como se menciona anteriormente, el pI de una proteína es un determinante clave de las propiedades biofísicas globales de una molécula. Los Fab anti-Epo identificados a partir de la colección de presentación en fagos tenían pI menores de 8,2. Para mejorar las propiedades de fabricación, los anticuerpos se genomanipularon específicamente para aumentar su pI y mejorar sus propiedades de tipo fármaco. Aumentar el pI de los Fab anti-Epo mejoró su solubilidad, posibilitando que los Fab se formularan a concentraciones mayores (>100 mg/ml). La formulación de los Fab a altas concentraciones (por ejemplo, >100 mg/ml) ofrece la ventaja de poder administrar mayores dosis de los Fab en ojos de pacientes mediante inyecciones intravítreas, lo que, a su vez, puede posibilitar una frecuencia de dosificación reducida, una ventaja significativa para el tratamiento de enfermedades oculares crónicas incluyendo, aunque sin limitación DMS húmeda y retinopatía diabética.
Los Fab resultantes se muestran en la tabla 1 (NVS1, NVS2, NVS3 y NVS4).
Ejemplo 2: Caracterización de anticuerpos optimizados
El siguiente ejemplo describe métodos que pueden usarse para medir la afinidad de anticuerpos. Estos y otros métodos de medición de la afinidad de unión son conocidos en la técnica.
Determinación de la afinidad
La afinidad de los anticuerpos por Epo se midió por resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un Biacore® T200 (Biacore) y valoración en equilibrio en solución (SET). Las explicaciones de cada tecnología y la media de los resultados correspondientes para la unión a Epo se describen a continuación. Las suposiciones de modelado tienen en cuenta las concentraciones de Epo en el sistema, la cinética de biosíntesis y la semivida de Epo, así como la pauta de dosificación deseada, y sugieren que un Fab con una afinidad de menos de 50 pM para Epo es suficiente para niveles inferiores de Epo libre.
Determinación por Biacore
La cinética de una interacción, es decir, las velocidades de formación (ka ) y disociación (kd ) de complejos, pueden determinarse a partir de la información de un sensograma. Se produce unión según pasa una muestra sobre una superficie detectara preparada, aumenta la respuesta en el sensograma. So se alcanza el equilibrio, se observará una señal constante. Remplazar una muestra con tampón provoca que las moléculas unidad se disocien y disminuya la respuesta. El programa de evaluación de Biacore genera los valores de ka y kd ajustando los datos a modelos de interacción. Se utilizaron tres cubetas de lectura para el método ejecutado. La cubeta de medición 1 (fc1) sirvió como referencia, donde no se capturó Fab contra Epo, para evaluar la unión no específica de la Epo a la superficie del chip recubierta con anticuerpo. Se realizaron etapas tanto de captura como de unión en las cubetas de medición 2-4.
Etapa de captura: Para conseguir una Rmáx de 20, el nivel de captura de Fab anti-hu en fc2-4 fue de aproximadamente 50 RL. El Fab anti-hu a una concentración de 1 ug/ul, fluyó sobre Fc2-4 a un caudal de 10 |jl/min.
Los cálculos para la Rmáx relativa son los siguientes:
Fab: Rm á x = RL*(MWa n a lito / MWl ig a n d o )*estequiometría 20 = RL*(21,4/50)*1 = 50 RL
El analito comenzó a concentraciones de 20 nM e incluyó 8 diluciones 1:2 con un duplicado a 2,5 nM para la disociación larga y corta. El analito se procesó a un caudal de 60 jl/m in durante 240 segundos. Los tiempos de disociación se establecieron a 4000 segundos y 600 segundos. El tiempo de disociación se estableció a 4000 segundos para concentraciones de analito de 10 nM, 2,5 nM y 0,3125 nM para NVS2 y NVS4. Después de la inyección de la muestra, hubo una etapa de lavado con el tampón de regeneración.
La regeneración se realizó al final de cada ciclo en todas las cubetas de medición. La condición de regeneración para este método fue ácido fosfórico al 1 % con hidróxido de sodio al 10 % a 60 ul/min durante 100 segundos.
Todas las demás condiciones de procesamiento se realizaron a 25 °C en tampón HBS-EP+ 1x (Biacore n.° cat. BR-1006-69). Las señales resultantes se ajustaron por doble referencia, restando, por tanto, los valores del índice de refracción de la cubeta de medición de referencia y la etapa de unión sin analito. Los datos se recogieron a 10 Hz y se analizaron usando el programa de evaluación de Biacore® T100 versión 1.1 (GE Healthcare). Este programa usa un método de análisis de ajuste global para la determinación de la velocidad y las constantes de afinidad para cada interacción.
Los resultados de la determinación de la cinética de unión por Biacore se muestran en la tabla 2. Como se muestra, los anticuerpos descritos en este documento mostraron unión de alta afinidad a Epo humana, con valores de Kd típicamente de menos de o iguales a 40 pM.
Tabla 2: Unión de afinidad de anticuer os contra E o Biacore
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ND: no determinada
*Los datos mostrados para NVS1 son un solo dato puntual
Determinación por SET
En contraste con los ensayos cinéticos usando superficies detectoras, tales como SPR, SET es un método que determina afinidades en solución. Es una medición en equilibrio que no aporta datos cinéticos.
En SET, se incuba una cantidad constante de anticuerpo con diferentes concentraciones de antígeno hasta que se alcanza el equilibrio. La concentración de anticuerpo libre en la solución equilibrada se determina aplicando la solución sobre una placa MSD™ (Meso Scale Discovery™) recubierta con antígeno seguido de incubación con una anticuerpo secundario marcado con ECL y medición de la intensidad de la señal. A bajas concentraciones de antígeno, se consigue una señal fuerte (alta concentración de anticuerpo libre que se une al antígeno en la placa), mientras que para alta concentración de antígeno, el anticuerpo se captura completamente en el antígeno, lo que produce una señal baja. Si hay un número suficiente de concentraciones de antígeno en un intervalo coincidente disponible, la curva de valoración permite una determinación razonable de la afinidad, usando el modelo de ajuste apropiado. Para una valoración completa, tienen que aplicarse concentraciones de antígeno al menos 10 veces mayores que la Kd prevista. La concentración constante de anticuerpo aplicada en el ensayo debe estar en el intervalo de, o por debajo de, la Kd (tabla 3).
Para la determinación de la Kd por SET, se usaron fracciones de monómero de la proteína de anticuerpo (al menos un 90 % de contenido de monómero, analizado por SEC analítica; Superdex75 (Amersham Pharmacia) para Fab, o Tosoh G3000SWXL (TOSOH BIOSCIENCE) para IgG, respectivamente).
La determinación de la afinidad en solución se realizó básicamente como se describe en la bibliografía (Friguet et al. 305­ 19). Para mejorar la sensibilidad y exactitud del método SET, se transfirió de ELISA clásico a tecnología basada en ECL (Haenel et al., 2005).
Los anticuerpos contra Epo se diluyeron a una concentración fija en tapón de incubación (PBS con BSA al 2 % (Sigma n.° cat. A4503) y Tween20 al 1 % y Triton-X al 1 % (Sigma n.° cat. 234729)) y se añadieron a una dilución seriada (1:5) de Epo en tampón de incubación.
Concentración final más alta de Epo:
Humana, hu-darbapoyetina, macaco, ratón, rata = 10 nM
conejo = 100 nM
Concentraciones finales de Fab:
NVS2: 2 pM, excepto conejo = 30 pM
NVS3: 2 pM, excepto conejo = 5 pM
NVS4: 2 pM, excepto conejo = 10 nM
NVS1: 2 pM
Se permitió que las muestras alcanzaran el equilibrio por incubación a TA durante una noche.
Las placas MSD convencionales recubiertas con estreptavidina (Meso-Scale Discovery, 384 pocillos: MSD n.° cat. L11SA) se bloquearon con 25 |jl de tampón de incubación a TA durante 1 h. Las placas se lavaron 3x en tampón TBST (TBS 25 mM con Tween20 al 0,05 %) y se añadió 0,1 jg/m l de Epo biotinilada en 25 j l de tampón de incubación y se incubaron a TA durante 1 h. Las placas se lavaron 3x en tampón TBST. Las muestras que contenían Fab y valoración de Epo se añadieron a la placa (25 j l) y se incubaron a TA durante 15 min. Las placas se lavaron 3x en tampón TBST. Se añadieron 25 j l de anticuerpo de detección (anti-humano (cabra) sulfomarcado, 1:1000 en tampón de incubación, MSD n.° cat. R32AJ-1) y se incubaron a TA durante 60 min. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado y se añadieron 50 j l de tampón MSD Read T 1x (con tensioactivo, MSD n.° cat. R92TC-1). Las placas se leyeron en un MSD Spector Imager 6000.
Se realizaron tres experimentos días separados, cada dato puntual por triplicado.
Los datos se analizaron usando el programa informático GraphPad Prism v4, con el fondo (un promedio de pocillos que no contienen Fab) restado de cada valor. Los valores del eje de abscisas (concentración de Epo en solución) se transformaron en log10x.
Los valores de KD (KD) se ajustaron a partir del siguiente modelo:
Y=(super¡or-((super¡or/(2xFab))x((((10Ax)+Fab)+KD)-((((((10Ax)+Fab)+KD)x(((10Ax)+Fab)+KD))-((4x(10Ax))xFab))A0,5))))
Superior = señal a concentración de antígeno = 0
x = concentración de Epo en solución
Fab = la restricción para la concentración de Fab se estableció a 1 pM
Las afinidades de Fab contra Epo se determinaron usando el ensayo SET y los valores de Kd resultantes (concentraciones [pM]) se resumen en la tabla 3. NVS2 se unió a Epo humana, humana-darbepoyetina y de macaco con una Kd de menos de 10 pM. NVS2 también se unió a Epo de ratón con una Kd de menos de 50 pM y Epo de rata con una Kd de menos de 20 pM. NVS3 se unió a Epo humana, humana-darbepoyetina, de macaco, de ratón y de rata con una Kd de menos de 5 pM. NVS4 se unió a Epo humana, humana-darbepoyetina, de macaco, de ratón y de rata con una Kd de menos de 10 pM.
Tabla 3: Unión de afinidad de anticuerpos contra Epo (SET)
Figure imgf000048_0001
ND: no determinada
*Los datos mostrados para NVS1 son un solo dato puntual
Ejemplo 3: Inhibición de la proliferación celular inducida por Epo
Las células que dependen de la eritropoyetina para el crecimiento y la supervivencia pueden utilizarse para medir la potencia de agentes terapéuticos anti-Epo por medio de inhibición de la proliferación dependiente de Epo (Chiba et al., 1991).
Ejemplo 3a: Ensayo de proliferación celular de Ba/F3-EpoR
Este ensayo demuestra la capacidad de anticuerpos contra Epo de inhibir la proliferación celular inducida por Epo en células Ba/F3 de ratón que expresan el receptor de Epo (células Ba/F3-EpoR). Las células Ba/F3 son dependientes de IL-3 para el crecimiento y la supervivencia y se ha demostrado que crecen de una manera independiente de IL-3 tras la transformación con diversas tirosina cinasas oncógenas. Tras la transfección estable con EpoR, las células Ba/F3-EpoR se vuelven independientes de IL-3. El plásmido de expresión de mamífero pcDNA3.1 que porta EpoR humano se transfectó en células Ba/F3 usando el sistema de nucleofección Amaxa (número de catálogo v CA-1003, Amaxa GmbH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando el dispositivo Nucleofector (Amaxa, Nucleofactor™ II).
Materiales
Materiales Descripción Fuente N.° catálogo
placa de 384 pocillos microplaca de 384 pocillos ThermoScientific 50823639
Matrix
placa de 384 pocillos placa uClear negra, 384 pocillos Greiner Bio-One 7881091
TC con tapa
RPMI 1640 Invitrogen 11875
FBS Hyclone SH30071,03
Pen/estrep Invitrogen 15140
Higromicina B Invitrogen 10687010
Epo Genway 10-663-45072
Darbepoyetina Sandoz CAS n.°:
209810-58-2
células Ba/F3-EpoR Descritas en este
documento
Cell Titer Blue Promega G8081
Mantenimiento de las células
Medio de cultivo: RPMI1640/FBS al 10 %/pen-estrep al 1 %/100 |jg/ml de higromicina B/1 U/ml de Epo
Medio de ensayo: RPMI1640/FBS al 10 %/pen-estrep al 1 %/100 |jg/ml de higromicina B
Las células Ba/F3-EpoR se mantuvieron en medio de cultivo (RPMI1640/FBS al 10 %/pen-estrep al 1 %/100 jg/ml de higromicina B/1 U/ml de Epo). Las células se dividieron a ~1e6 células/ml (cada 3-4 días) hasta 0,4-0,6e5 células/ml. Ensayo de proliferación celular inducida por Epo
1. Un día antes del experimento, las células Ba/F3-EpoR se prepararon por centrifugación para eliminar el medio de cultivo, después de lo que las células se resuspendieron en medio de ensayo (RPMI1640/FBS al 10 %/pen-estrep al 1 %/100 jg/m l de higromicina B) que no contiene Epo.
2. En el día del experimento, las células se lavaron 2-3 veces en medio de ensayo (centrifugadora a 1000 rpm, 5 min) y se resuspendieron en medio de ensayo a 1,25 x 105 células/ml.
3. Se añadieron 2500 células a cada pocillos de ensayo en una placa negra de 384 pocillos (fondo transparente, tratada con TC).
4. Se diluyó en serie Epo en una microplaca de 384 pocillos con medio de ensayo de modo que la concentración final de Epo fuera dos veces mayor que la concentración final deseada.
5. Se añadieron 20 j l de Epo diluida en serie (por triplicado) por triplicado a pocillos de muestra que contenían células Ba/F3-EpoR de la placa negra de 384 pocillos.
6. La placa se centrifugó en una centrifugadora a 1000 rpm durante 30-60 segundos y se incubó durante 48 h a 37 °C, 5 % de CO2.
7. Cuatro horas antes del punto final, se añadieron 8 j l de Cell Titer Blue a todos los pocillos y se volvieron a incubar a 37 °C, 5 % de CO2.
8. Cuatro horas después, la placa se leyó en un Beckman Coulter Paradigm con Paradigm Multimode SW, o analizador comparable.
9. La Epo estimuló la proliferación de células Ba/F3-EpoR 4 veces por encima del valor basal. La Epo estimuló Ba/F3-EpoR con una CE50 promedio de 11,2 pM e intervalo de 10 pM y 26 pM.
10. Los anticuerpos anti-Epo se diluyeron en serie por triplicado en una microplaca de 384 pocillos que contenía 4 ng/ml de Epo en medio de ensayo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.
11. Se añadieron 20 jl/pocillo de la mezcla anterior de Epo/anticuerpo anti-Epo a la placa de paredes negras de 384 pocillos previamente inoculada con 2500 células BaF3/EpoR por pocillo.
12. Las placas después de la incubación se procesaron como se resume en las etapas 7-9 anteriores
Resultados
Los anticuerpos contra Epo inhibieron la proliferación celular de Ba/F3-EpoR en presencia de 1 ng/ml de Epo después de 48 h. Los anticuerpo inhibieron la proliferación celular de Ba/F3-EpoR con una CI50 de menos de o igual a 350 pM. Tabla 4:
Figure imgf000049_0001
Ejemplo 3b: Ensayo de proliferación celular de F36E
Las células F36E son muy dependientes de Epo para la proliferación. La estimulación con Epo usando los métodos descritos anteriormente típicamente producen una señal mayor de 6 veces sobre el valor basal. La CE50 de esta curva es de 7 pM.
Protocolo para la neutralización del ensayo de proliferación celular de F36E inducida por Epo
Se usó un ensayo de proliferación usando la línea celular F36E, una línea celular inmortalizada de tipo linfocítica dependiente de Epo derivada de una línea celular de médula ósea precursora, para cribar anticuerpos terapéuticos anti-Epo y para seleccionar candidatos para el desarrollo.
Materiales
Materiales/reactivos Fuente N.° catálogo
microplacas de cultivo celular de poliestireno de 384 Greiner Bio One 781091
pocillos, negras
microplaca de polipropileno de 384 pocillos sin tapa Greiner Bio One 781280
RPMI 1640 Invitrogen 11875
FBS Hyclon SH30071,03
Pen/estrep Invitrogen 15140
Darbepoyetina Sandoz CAS #:
209810-58-2
células F36E Riken Cell Bank RCD0776
Cell Titer Blue Promega G8081
anticuerpo monoclonal Epo26 anti-Epo humana Stem Cell Tech 01350
Mantenimiento de las células
Se usó darbepoyetina, una Epo humana hiperglucosilada recombinante, para el mantenimiento de las células y los ensayos de proliferación descritos en este documento. La darbepoyetina estimula la proliferación en células F36E con una CE50 comparable a Epo humana recombinante (63,2 pg/ml de darbepoyetina y 81,25 pg/ml de eritropoyetina; véase LU-15432, pág. 44). Las células F36E se mantuvieron en medio de cultivo (RPMI1640/FBS al 5 %/pen-estrep al 1 %/5,2 U/ml de dEpo) a densidad mínima de 0,25e6 células por ml hasta densidad máxima de 1,0e6 células por ml hasta 10 pases.
Protocolo de ensayo de proliferación celular inducida por Epo
1. Se diluyó Epo en medio de ensayo (RPMI1640/FBS al 5 %/pen-estrep al 1 %) a 4 ng/ml, concentración final deseada 4x.
2. El anticuerpo anti-Epo se diluyó en medio de ensayo a 200 nM, concentración final 4x y esta concentración se diluyó en serie en medio de ensayo para seis puntos. Se repitió la dilución para un anticuerpo de referencia positiva (por ejemplo: Epo26) y un anticuerpo de referencia negativa (por ejemplo: anticuerpo monoclonal antilisozima de pollo).
Se mezclaron 7,5 ul de dEpo diluida y 7,5 ul de diluciones en serie de anticuerpo anti-Epo en microplaca de polipropileno de 384 pocillos, por triplicado, y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos.
4. Se sedimentaron células F36E (2e6 por placa de 384 pocillos), se aspiró el medio de cultivo y las células se lavaron una vez en medio de ensayo (centrifugadora a 1200 rpm, 5 min), después se resuspendieron en medio de ensayo hasta 3,33e5 células/ml.5678
5. Se añadieron 15 |jl/pocillo de células (5000 células/pocillo) a todos los pocillos en placa de cultivo celular de poliestireno de 384 pocillos.
6. Se añadieron 15 ul de mezcla de anticuerpo-Epo a las células.
7. Se incubaron 68 h a 37 °C, 5 % de CO2.
8. Se añadieron 8 j l de Cell Titer Blue por pocillo y se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 durante 4 horas.
9. La fluorescencia se midió a 560(20)Ex/590(10)Em en un fluorímetro de microplacas Fluoroskan Ascent o analizador comparable.
10. El promedio de URF /- desviación típica frente a nM de anticuerpo se representó y se determinó la CI50 por ajuste de curva de regresión no lineal en el programa informático Graph Pad Prizm.
Resultados
Los anticuerpos anti-Epo inhibieron la proliferación celular de F36E con una CI50 de menos de o igual a 200 pM.
Tabla 5:
Figure imgf000051_0001
Ejemplo 4: Unión de epítopo
Péptido sintético y estudios de truncamiento peptídico
Se sintetizaron péptidos sintéticos correspondientes a dominios estructurales de Epo humana (hEpo), truncamientos de dominio de hEpo o moléculas quiméricas que contienen partes de hEpo y trombopoyetina (TPO) humana o se expresaron de forma recombinante. La unión positiva a los péptidos sintéticos indicó que los residuos contenidos en este dominio de Epo estaban implicados en la unión al anticuerpo anti-Epo. Para las proteínas truncadas, la pérdida de unión indicaba la implicación de la parte truncada en la unión al anticuerpo anti-Epo. Sin embargo, la pérdida de unión no excluyó la posibilidad de que el truncamiento alterara la estructura del resto de la proteína significativamente, para que afectara a la unión a los anticuerpos anti-Epo. Las quimeras de Epo humana-TPO humana posibilitaban el mantenimiento de la estructura mientras aún permitían el cartografiado de epítopos. La pérdida de unión a una variante que contenía una parte de hTPO indicó que la región homóloga en hEpo era importante para la unión al anticuerpo anti-Epo.
Cartografiado de epítopos peptídicos de anticuerpos antieritropoyetina
Se sintetizaron los siguientes seis péptidos (tabla 6), correspondientes a las hélices de eritropoyetina.
Tabla 6:
Figure imgf000051_0002
Configuración del ensayo
1. Se recubrieron 25 ul de péptido en PBS (5 ug/ml) sobre una placa convencional MSD de 384 pocilios (Mesoscale Discovery, n.° cat. L21XA-4) durante una noche.
2. La placa se bloqueó con 90 ul de PBS+BSA al 5 %/Tween-20 al 0,1 %/TritonX-100 al 0,1 % durante 4 horas.
3. Se añadió Fab Morphosys contra Epo 500 nM en diluyentes de PBS+BSA al 2 %/Tween-20 al 0,1 %/TritonX-100 al 0. 1.% a la placa y se incubó durante 1 hora.
4. La placa se lavó y se incubó con anticuerpo anti-IgG humana sulfomarcado (Meso Scale Discovery, n.° cat. R32AJ-1) para Fab contra Epo o la especie apropiada para proteínas/anticuerpos de referencia (1 h)
5. La placa se lavó y se añadió solución MSD Read (Meso Scale Discovery, cat. R92TC-1).
6. Leer la placa
Cartografiado de epítopos de anticuerpos antieritropoyetina con variantes truncadas de eritropoyetina Variante 1 de Epo: Hélice A
Variante 2 de Epo: Hélice A, bucle A-B
Variante 3 de Epo: Hélice A, bucle A-B, hélice B
Variante 4 de Epo: Hélice A, bucle A-B, hélice B, bucle B-C, hélice C
Variante 5 de Epo: Eritropoyetina de longitud completa
Configuración del ensayo
1. La placa se recubrió con variantes de Epo biotiniladas expresadas en HEK293 en placa convencional de 384 pocillos de estreptavidina (Mesoscale Discovery, n.° cat. L21SA-1) durante una noche a 4 °C.
2. La placa se bloqueó con 90 ul de PBS+BSA al 5 %/Tween-20 al 0,1 %/TritonX-100 al 0,1 % durante 4 horas.
3. La placa se lavó y se añadió Fab Morphosys contra Epo 500 nM a la placa y se incubó durante 1 hora
4. La placa se lavó y se incubó con anticuerpo anti-IgG humana sulfomarcado (Meso Scale Discovery, n.° cat. R32AJ-1) para Fab contra Epo o la especie apropiada para proteínas/anticuerpos de referencia (1 h)
5. La placa se lavó y se añadió solución MSD Read (Meso Scale Discovery, cat. R92TC-1).
6. Leer la placa
Cartografiado de epítopos de anticuerpos antieritropoyetina con Epo/trombopoyetina (Tpo) y quiméricos de Epo de conejo/humana
Quiméricos de Epo/Tpo
Variante 1 de Epo/Tpo: Epo humana con hélice A de Tpo
Variante 2 de Epo/Tpo: Epo humana con bucle A-B de Tpo
Variante 3 de Epo/Tpo: Epo humana con hélice B de Tpo
Variante 4 de Epo/Tpo: Epo humana con hélice C de Tpo
Variante 5 de Epo/Tpo: Epo humana con hélice D de Tpo
Quiméricos de Epo de conejo/humana
Variante 1 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con hélice A humana
Variante 2 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con bucle A-B humano
Variante 3 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con hélice B humana
Variante 4 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con bucle B-C y hélice C humanos
Variante 5 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con bucle C-D humano
Variante 6 de Epo Rb/Hu: Epo de conejo con hélice D humana
Configuración del ensayo
1. Se recubrieron 25 ul de quiméricos de Epo en PBS (2 ug/ml) sobre una placa convencional MSD de 384 pocillos (Mesoscale Discovery, n.° cat. L21XA-4) durante una noche a 4 °C.
2. La placa se bloqueó con 90 ul de PBS+BSA al 5 %/Tween-20 al 0,1 %/TritonX-100 al 0,1 % durante 4 horas.
3. Se añadió Fab Morphosys contra Epo 500 nM en diluyentes de PBS+BSA al 2 %/Tween-20 al 0,1 %/TritonX-100 al 0,1 % a la placa y se incubó durante 1 hora.
4. La placa se lavó y se incubó con anticuerpo anti-IgG humana sulfomarcado (Meso Scale Discovery, n.° cat. R32AJ-1) para Fab contra Epo o la especie apropiada para proteínas/anticuerpos de referencia (1 h)
5. La placa se lavó y se añadió solución MSD Read (Meso Scale Discovery, cat. R92TC-1).
6. Leer la placa
Protocolo general
Se recubrieron placas convencionales de captura MSD de 384 pocillos (Meso Scale Discovery) con péptido (5 ug/ml en PBS, New England Peptide LLC) o quiméricos de Epo (2 ug/ml en PBS) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Se recubrieron variantes de Epo truncadas biotiniladas (2 ug/ml en PBS) sobre placas convencionales de captura de estreptavidina MSD de 384 pocillos durante una noche. Después de lavar las placas 1X con TBST (Thermo Scientific, n.° cat. 28360), las placas se bloquearon en diluyente (PBS, b Sa al 5 %, Tween-20 al 0,1 %, TritonX-100 al 0,1 %) durante 4 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3X en TBST. Se añadieron quinientos nanomolar de Fab antieritropoyetina a las placas MSD prerrecubiertas con péptido/variantes de Epo durante 1 hora. Las placas se lavaron 3X en TBST y se añadió anticuerpo anti-IgG humana sulfomarcado (1 ug/ml, Meso Scale Discovery, n.° cat. R32AJ-1) y se incubaron durante 60 minutos. Las placas se lavaron 3X en TBST y se añadió tampón Read T 1X (Meso Scale Discovery, n.° cat. R92TC-1). Las placas se leyeron en un MSD Spector Imager 6000 y los datos se analizaron usando el programa informático GraphPad Prism v4.
Resultados:
Los resultados indicaron que los anticuerpos se unían mínimamente a los siguientes dominios (tabla 7). Ningún anticuerpo se unión a hélice C.
Tabla 7 :
Figure imgf000053_0001
(++) Epítopo dominante; (+) unión observada
Estructura cristalina de anticuerpos en complejo con Epo
La eritropoyetina humana recombinante glucosilada (Epo) se recibió de LEK Pharmaceuticals, Inc.
La Epo se desglucosiló usando mezcla de desglucosilación de proteínas (New England Biolabs, n.° cat. P6039S). Se combinaron 30 mg de hEpo con 1 ml de mezcla de desglucosilación de proteínas y se incubaron a 37 °C durante 1 hora, punto en que la desglucosilación estaba incompleta determinada por SDS-PAGE. Después se añadieron 0,5 ml adicionales de mezcla de desglucosilación de proteínas a Epo y se incubaron durante 1 hora más a 37 °C. El análisis en gel mostró desglucosilación casi completa de Epo. Esta proteína se purificó entonces adicionalmente usando una columna de 120 ml Superdex75 (GE Healthcare, n.° cat. 28-9893-33) equilibrada en HEPES 25 mM pH 7,5, NaCI 150 mM. Las fracciones de elución que contenían el nivel más alto de desglucosilación de hEpo se combinaron. Se formaron complejos proteínicos combinando 5 mg de Epo desglucosilada con 7 mg de NVS3, seguido de incubación en hielo durante 1 hora. La mezcla de complejo proteínico entonces se concentró y se aplicó a una columna de 120 ml Superdex 75, equilibrada en HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM. Las fracciones que contenían relaciones estequiométricas evaluadas en gel de SDS de Epo:NVS3 se combinaron y se concentraron a 19 mg/ml (concentración estimada por LCUV) (PRONOVA n.° 27SN). Los cribados de cristalización se configuraron usando este complejo de Epo:NVS3 concentrado. Los cristales se hicieron crecer por la técnica de difusión de vapor en gotas posadas, conteniendo las gotas volúmenes iguales de proteína y solución de depósito. Se formaron cristales a 4 °C con la siguiente condición de depósito: Hepes 0,1 M pH 7,0, PEG3350 al 12 %, acetato de cinc deshidratado 50 mM. Los cristales se congelaron usando la siguiente solución de crioprotección: : Hepes 0,1 M pH 7,0, PEG3350 15 %, acetato de cinc deshidratado 50 mM, glicerol al 22 %.
Los datos de difracción de los cristales del complejo de Epo:NVS3 se recogieron en la línea de luz 17-ID en la fuente de fotones avanzada (Argonne National Laboratory, EE. UU.). Los datos se procesaron y se cambiaron a escala de 2,6 A usando autoPROC (Global Phasing, LTD) en el grupo espacial C2 con dimensiones de celda a = 125,57 A, b = 150,15 A, c = 163,84 A, alfa = 90°, beta = 110,81°, gamma = 90°. La estructura de Epo:NVS3 se resolvió por remplazo molecular usando Phaser (McCoy et al., (2007) J. Appl. Cryst. 40:658-674). El Fab de la estructura 3H0T en la base de datos PDB (Berman 2000) se dividió en dominios variables y constantes, y la estructura de eritropoyetina humana de Syed et. al., Nature. 1 de octubre de 1998; 395(6701):511-6, código PDB 1EER, se usaron como modelos de búsqueda.
El modelo final, que contiene 3 moléculas del complejo de Epo:NVS3 por unidad asimétrica, se construyó en COOT (Emsley y Cowtan (2004) Acta Cryst. 60:2126-2132) y se refinó a valores de R y Rlibre de un 23,0 % y un 26,7 %, respectivamente, con un rmsd de 0,010 A y 1,34° para las longitudes de enlace y ángulos de enlace, respectivamente, usando PHENIX (Adams et al., Acta Cryst. D66, 213-221 (2010)).
La estructura cristalina de Epo:NVS3 se resolvió y refinó a 2,6 A. Reveló una unidad asimétrica compuesta de tres complejos proteínicos de Epo:NVS2, cada uno compuesto de un Fab unido a una proteína Epo. Dos de estos complejos forman un dímero mediado por cinc y el tercero muestra mayores factores b y densidad más débil. Las interacciones del Fab con Epo estaban mediadas por los bucles de la región determinante de la complementariedad (CDR) tanto de la cadena pesada como de la ligera de NVS3. Los cambios conformaciones de Epo en comparación con 1EER estaban limitados a los bucles distales del epítopo al que se une el Fab, con un RMSD de 0,5 A para los 144 aminoácidos alineados. Las cadenas pesada y ligera de Fab NVS3 muestran plegamientos de tipo inmunoglobulina típicos para los dominios.
La estructura de los cristales de Epo:NVS3 se usó para identificar el epítopo de Epo del fragmento antigénico de unión de NVS3. La superficie de interacción en Epo estaba formada principalmente por residuos que comprenden el residuo Ser9, Glu13, los residuos Thr44 a Arg53 y los residuos Asn147 a Arg162. Estos corresponden a los elementos de estructura secundaria de Epo indicados como hélice a A, bucle pA-aB y hélice a D. Tres residuos formaban la superficie tridimensional que se reconoce por NVS3. Las interacciones incluían interacciones de la cadena principal, interacciones mediadas por disolvente e interacciones de cadenas laterales directas.
Tabla 8: Residuos de interacción con E o ara NVS3
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Los residuos de Epo que contienen átomos en contacto NVS3 se enumeran en la tabla 9. El contacto se define dentro de 5 A de NVS3 para considerar las posibles interacciones mediadas por agua.
Tabla 9:
Figure imgf000055_0002
*Posición en la secuencia con respecto a SEQ ID NO: 81
Los residuos de Epo que contienen átomos en contacto NVS2 se enumeran. El contacto se define dentro de 5 A del compañero proteínico para considerar las posibles interacciones mediadas por agua.
Tabla 10:
Figure imgf000055_0003
Figure imgf000056_0001
*Posición en la secuencia con respecto a SEQ ID NO: 81
Ejemplo 5: Modelo in vivo
Ejemplo 5a: Modelo de ratón de edema ocular
A ratones C57/Bl6 (Taconic) se les inyectó por vía subretiniana ssAAV2-EPO-eGFP (DR005) y ssAAV2-EGFP (TM003) (control). Los ratones se sacrificaron tres semanas (21 días) después de la inyección. Las retinas se montaron en plano y se midió el calibre del vaso.
Métodos:
Inyección subretiniana de ssAA V2-EPO-eGFP y ssAA V2-eGFP
Se dividieron ratones C57/Bl6 de 8 semanas de edad en dos grupos (10 ratones cada uno, 20 ojos/grupo) y se les inyectó por vía subretiniana 1 |jl de ssAAV2 a 2 x 10789 DRP/jl. El primer grupo (control) recibió ssAAV2-EPO subretiniana (TM003), y el segundo (experimental) ssAAV2-eGFP (DR005). Se examinó el efecto de Epo de ratón sobre los cambios vasculares de la retina en preparaciones montadas en plano de retina a los 21 días después de la inyección.
Los AAV (virus adenoasociado) ensayados fueron: ssAAV2-EPO-eGFP [(AAV2-CMV-mEPO-IRES-eGFP) de Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina en Chape1Hill, lote n.° AV3782] y ssAAV2-GFP [(AAV2-eGFP) de Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina en Chape1Hill: lote n.° AV3725].
Procedimiento:
Los vectores AAV se suministraron mediante inyección subretiniana en ambos ojos de los ratones ensayados. Todos los procedimientos descritos se realizaron en condiciones asépticas, usando reactivos estériles, jeringas y PPE apropiado.
1. Los ratones se inmovilizaron, y se dilataron sus pupilas con una gota de ciclopentolato (1 %), seguido de una gota de fenilefrina al 2,5 %.
2. Después, el animal se anestesió con Avertin (250 mg/kg) i.p. Se anestesió tópicamente la córnea con una gota de proparacaína al 0,5 %.
3. Después de coloca al animal bajo un microscopio quirúrgico, se usó microbisturí para hacer una incisión nasal de 0,5 mm, posterior al limbo.
4. Una aguja roma fijada a una jeringa Hamilton de 10 j l se insertó tangencialmente a través de la incisión escleral hacia la retina temporal. La aguja se hizo avanzar hasta que se sintió resistencia.
5. Se inyectó lentamente 1 j l de vector ssAAV2 (ssAAV2-EPO-eGFP o ssAAV2-GFP, que contienen ambos fluoresceína diluida 1:50 para visualizar el suministro) en el espacio subretiniano.
6. Se examinó el ojo bajo el microscopio quirúrgico. Se confirmó una inyección subretiniana satisfactoria por visualización de un desprendimiento de la retina que contiene fluoresceína.
7. La inyección se puntuó dependiendo del grado de daño en la retina (visualizado por el tamaño de la hemorragia) y el daño al cristalino.
8. El animal se giró al otro lado y se repitió el procedimiento.
9. Se aplicó pomada antibiótica a ambos ojos después de la inyección.
Disección de la retina, toma de imágenes y cuantificación de la preparación montada en plano de la retina:
Se inyectó 0,1 ml de concavalina-A (Con-A) (i.v., vena de la cola) de 1 a 5 minutos antes de la eutanasia (CO2 ) 2. Se enuclearon los ojos y se fijaron en paraformaldehído (al 4 % en PBS) durante dos horas. Posteriormente se mantuvieron a 4 °C en tampón PBS durante 1-3 días hasta la disección
3. Se retiraron la córnea y el cristalino, y se diseccionó la retina del lavaojos posterior (epitelio pigmentado de la retina/coroides)
4. Se hicieron cuatro incisiones radiales en la retina y se montó en plano en medio de preparación Vectashield con la capa fotorreceptora hacia abajo.
5. Una vez montadas, las preparaciones montadas en plano se centraron en la retina central (usando la papila óptica como referencia) y se capturaron los vasos retinianos marcados con Con-A a 20X usando el sistema de imágenes Zeiss (AxioVision)
6. Se usó el programa informático AxioVision para medir el diámetro de los vasos retinianos centrales que están a 200 |jm de la papila óptica.
7. Los datos obtenidos se analizaron con GraphPad Prism.
Resultados y conclusión:
La cuantificación del diámetro del vaso reveló que ssAAV2-EPO inducía dilatación significativa (* p<0,001) del vaso en la retina central en comparación con ssAAV2-GFp y ojos sin tratamiento previo (6 ojos) (figura 1). No se encontró diferencia significativa al comparar ssAAV2-GFP frente al grupo sin tratamiento previo. Las muestras se analizaron usando un ANOVA unidireccional con ensayo a posteriori de Dunnet (C) Preparaciones montadas en plano representativas para cada grupo. El suministro a largo plazo de Epo mediante AAV2-Epo-eGFP produjo un aumento estadísticamente significativo en el calibre venoso (figura 1), un rasgo distintivo clave de edema macular diabético en seres humanos. Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a un método de disminución del calibre venoso en el ojo administrando un anticuerpo anti-EPO descrito en este documento a un sujeto en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Ejemplo 5b: Eficacia in vivo de anticuerpos anti-Epo
La actividad in vivo y la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-Epo descritos en este documento pueden evaluarse en el modelo de ratón de edema ocular descrito anteriormente.
Exposición in vivo en el modelo de ratón
A ratones C57B6 con 8 semanas de edad se les inyectó por vía subretiniana uno de los siguientes.
Grupos:
Grupo 1: AAV2-eGFP a valor cuantitativo de 2 x 109 DRP a valor cuantitativo, 1 ul/ojo, n = 20 ojos de 10 ratones Grupo 2: AAV2-Epo-eGFP a valor cuantitativo de 2 x 109 DRP, 1 ul/ojo, n = 20 ojos de 10 ratones
Grupo 3: AAV2-Epo-eGFP a valor cuantitativo de 2 x 109, 1 ul/ojo, Fab anti-Epo, 100 ug/ojo, 1 vez a la semana, n = 20 ojos de 10 ratones
Se examina el efecto de los anticuerpos anti-Epo dosificados apropiadamente en el modelo de ratón midiendo el diámetro del vaso 2 semanas después de la inyección.
AAV-GFP (AAV2-eGFP) y AAV2-Epo-eGFP (AAV2-CMV-mEpo-IRES-eGFP) de Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility, The University of North Carolina en Chapel Hill.
La inyección intraocular de los anticuerpos anti-Epo inhibirá la dilatación del vaso retiniano. Los anticuerpos anti-Epo mejoran los efectos de Epo sobre el flujo sanguíneo disminuido y las condiciones hipóxicas en la retina. Por tanto, se espera que los anticuerpos anti-Epo reduzcan la patología retiniana que también se observa en pacientes con vasculopatías retinianas tales como DMS húmeda y retinopatía diabética.
Ejemplo 6: Neutralización in vivo de EPO libre
Ejemplo 6a: Neutralización in vivo de EPO libre usando un Fab anti-Epo
La actividad in vivo y la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-EPO se evaluaron en ojos de conejo como sigue. Se dosificó a los conejos por vía intravítrea un Fab anti-EPO, NVS2 (1 mg/ojo) y se expusieron a una dosis intravítrea de EPO (3 ug/ojo) cuatro días después. Los animales se sacrificaron y se extrajeron los tejidos ocular incluyendo el humor vítreo. Se determinó la cantidad de EPO libre y EPO total en el humor vítreo como se describe a continuación.
Figure imgf000058_0001
Niveles de EPO total/libre:
Los ensayos se realizaron usando placas convencionales MSD de unión (Meso-Scale Discovery, 384 pocilios: MSD n.° cat. L21XA), usando tampón de recubrimiento (PBS) y tampón de incubación (PBS con BSA al 2 % (Sigma n.° cat. A4503) y Tween20 al 0,1 % y Triton-X al 0,1 %).
Los anticuerpos de captura se recubrieron a 1 |jg/ml en PBS (25 |jl), y se incubaron durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado (PBS con Tween20 al 0,05 %), y se bloquearon con 25 j l de tampón de incubación a TA durante 2 h. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron diluciones de humor vitreo en tampón de incubación a la placa (25 jl), y se incubaron durante 60 min a TA. Se usó darbepoyetina recombinante humana como patrón (A000123, empezando en 2 jg/ml). Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron 25 j l de anticuerpo primario (1 jg/m l en tampón de incubación) y se incubaron a TA durante 60 min. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron 25 j l de anticuerpos secundarios antiespecie sufomarcados (1:1000 en tampón de incubación) y se incubaron a TA durante 60 min. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado y se añadieron 25 j l de tampón MSD Read T 1x (con tensioactivo, MSD n.° cat. R92TC-1). Las placas se leyeron en un MSD Spector Imager 6000.
Figure imgf000058_0002
Resultados y conclusión:
Los niveles de EPO total medidos en el humor vitreo de animales a los que se les inyectó anti-EPO o vehículo fueron similares a lo esperado (figura 2). Por el contrario, no se midió EPO libre en el humor vitreo de conejos a los que se les inyectó Fab anti-EPO, pero se midió un promedio ~100 ng/ml de EPO libre en el humor vitreo de conejos a los que se les inyectó vehículo. El Fab anti-EPO administrado por vía intravítrea neutralizó completamente los niveles de EPO libre como se esperaba.
Ejemplo 6b: Neutralización in vivo de EPO libre usando un Fab anti-Epo
La actividad in vivo y la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-EPO se evaluaron en ojos de conejo como sigue. Se dosificó a los conejos por vía intravítrea una solución premezclada de un Fab anti-EPO, NVS2 (1 mg/ojo) y EPO (3 ug/ojo). Los animales se sacrificaron y se extrajeron los tejidos ocular incluyendo el humor vítreo. Se determinó la cantidad de EPO libre y EPO total en el humor vítreo como se describe a continuación. Nota: Algunos ojos recibieron una solución de premezcla de un Fab anti-EPO, EPO y VEGF.
Grupo | [Fab Anti-EPOI
Figure imgf000059_0001
Niveles de EPO total/libre:
Los ensayos se realizaron usando placas convencionales MSD de unión (Meso-Scale Discovery, 384 pocilios: MSD n.° cat. L21XA), usando tampón de recubrimiento (PBS) y tampón de incubación (PBS con BSA al 2 % (Sigma n.° cat. A4503) y Tween20 al 0,1 % y Triton-X al 0,1 %).
Los anticuerpos de captura se recubrieron a 1 |jg/ml en PBS (25 |jl), y se incubaron durante una noche a 4 °C. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado (PBS con Tween20 al 0,05 %), y se bloquearon con 25 j l de tampón de incubación a TA durante 2 h. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron diluciones de humor vitreo en tampón de incubación a la placa (25 jl), y se incubaron durante 60 min a TA. Se usó darbepoyetina recombinante humana como patrón (A000123, empezando en 2 jg/ml). Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron 25 j l de anticuerpo primario (1 jg/m l en tampón de incubación) y se incubaron a TA durante 60 min. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado. Se añadieron 25 j l de anticuerpos secundarios antiespecie sufomarcados (1:1000 en tampón de incubación) y se incubaron a TA durante 60 min. Las placas se lavaron 3x en tampón de lavado y se añadieron 25 j l de tampón MSD Read T 1x (con tensioactivo, MSD n.° cat. R92TC-1). Las placas se leyeron en un MSD Spector Imager 6000.
Figure imgf000059_0002
Resultados y conclusión:
Los niveles de EPO total medidos en el humor vitreo de animales a los que se les inyectó anti-EPO o vehículo fueron similares a lo esperado (figura 3). Por el contrario, no se midió EPO libre en el humor vitreo de conejos a los que se les inyectó un Fab anti-EPO, mientras que se midió de promedio ~200 ng/ml de EPO libre en el humor vitreo de conejos a los que se les inyectó vehículo (figura 3). No pareció que la presencia de VEGF tuviera algún efecto sobre los niveles de EPO libre o total medidos. El Fab anti-EPO administrado por vía intravítrea neutralizó completamente los niveles de EPO libre como se esperaba.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a eritropoyetina (Epo) humana, que comprende secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera de Fab NVS1 representadas por SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente; de Fab NVS2 representadas por SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente; de Fab NVS3 representadas por SEQ ID NO: 53 y 54, respectivamente; o de Fab NVS4 representadas por SEQ ID NO: 73 y 74, respectivamente.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende secuencias del dominio variable de la cadena pesada y ligera de Fab NVS2 representadas por SEQ ID NO: 33 y 34, respectivamente.
3. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente; SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente; SEQ ID NO: 55 y 56, respectivamente; o SEQ ID NO: 75 y 76, respectivamente.
4. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende secuencias de la cadena pesada y la cadena ligera de SEQ ID NO: 35 y 36, respectivamente.
5. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena pesada y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 17, 37, 57 y 77.
7. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena pesada y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de la secuencia de SEQ ID NO: 37.
8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una cadena pesada y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de la secuencia de SEQ ID NO: 39.
9. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena ligera y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 18, 38, 58 y 78.
10. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica un dominio variable de la cadena ligera y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 38.
11. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una cadena ligera y dicha secuencia tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 40.
12. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11.
13. Una célula hospedadora aislada que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11 o el vector de la reivindicación 12.
14. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para su uso en la inhibición de la proliferación celular dependiente de EPO en un sujeto.
16. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de vasculopatía retiniana en un sujeto.
17. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la vasculopatía retiniana en el sujeto está asociada con una enfermedad o afección seleccionada de: retinopatía diabética, edema macular diabético, retinopatía diabética proliferativa, retinopatía diabética no proliferativa, degeneración macular senil, oclusión de la vena retiniana, coroiditis multifocal, neovascularización coroidea miope y retinopatía del prematuro.
18. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de edema macular.
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