BRPI0710217A2 - polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polinucleotìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo - Google Patents

polipeptìdeo, polinucleotìdeo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, para produzir um mutante a partir de uma célula precursora, para produzir uma proteìna, para produzir um polinucleotìdeo, para degradar ou converter um material celulósico, para produzir uma substáncia e para inibir a expressão de um polinucleotìdeo em uma célula, célula mutante, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e, molécula de rna de filamento duplo Download PDF

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Abstract

POLIPEPTIDEO, POLINUCLEOTìDEO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSãO RECOMBINANTE, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MéTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTIDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE A PARTIR DE UMA CéLULA PRECURSORA, PARA PRODUZIR UMA PROTEINA, PARA PRODUZIR UM POLINUCLEOTIDEO, PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULOSICO, PARA PRODUZIR UMA SUBSTáNCIA E PARA IMBIR A EXPRESSãO DE UM POLIPEPTIDEO EM UMA CéLULA, CéLULA MUTANTE, PLANTA TRANSGêNICA, PARTE DE PLANTA OU CéLULA DE PLANTA, E, MOLéCULA DE RNA DE FILAMENTO DUPLO A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDONUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULAHOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR OPOLIPEPTÍDEO, PARA PRODUZIR UM MUTANTE A PARTIR DE UMACÉLULA PRECURSORA, PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA, PARAPRODUZIR UM POLINUCLEOTÍDEO, PARA DEGRADAR OUCONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, PARA PRODUZIR UMASUBSTÂNCIA E PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE UM POLIPEPTÍDEOEM UMA CÉLULA, CÉLULA MUTANTE, PLANTA TRANS GÊNICA,PARTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA, E, MOLÉCULA DERNA DE FILAMENTO DUPLO"
Referência a uma Listagem de Seqüência
Este pedido contém uma Listagem de Seqüência na formalegível em computador. A forma legível em computador é aqui incorporadaspor referência.
Referência a um Depósito de Material Biológico
Este pedido contém uma referência aos depósitos de materialbiológico que foi fabricado no Northern Regional Research Center (NRRL)sob o Tratado de Budapeste e designados os números de acesso NRRL B-30896 e NRRL B-30897 e NRRL B-30899, depósitos microbianos estes quesão aqui incorporados por referência.
Fundamentos da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglucanase e polinucleotídeos isolados que codificamos polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácidonucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeosassim como métodos para produzir e usar os polipeptídeos.Descrição da Técnica RelacionadaA celulose é um polímero do açúcar simples glicosecovalentemente ligado pelas ligações beta-1,4. Muitos microorganismosproduzem enzimas que hidrolisam glucanos ligados em beta. Estas enzimasincluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glucosidases. Asendoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-o ao ataque pelas celobioidrolases. As celobioidrolases seqüencialmenteliberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. Acelobioidrolase I é uma atividade de 1,4-beta-D-glucano celobioidrolase (E.C.3.2.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas emcelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo celulose ligada em beta-1,4, liberando celobiose das extremidades redutoras da cadeia. Acelobioidrolase II é uma atividade de 1,4-beta-D-glucano celobioidrolase(E.C. 32.1.91) que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas emcelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo celulose ligada em beta-1,4, liberando celobiose das extremidades não redutoras da cadeia. Acelobiose é um dímero ligado em beta-14 solúvel em água de glicose. Asbeta-glucosidases hidrolisam celobiose em glicose.
A conversão de estoques de alimentação celulósicos em etanoltem a vantagens da disponibilidade fácil de grandes quantidades de estoque dealimentação, o desejo de evitar queimar ou aterrar os materiais e a limpeza docombustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, safras herbáceas eresíduos sólidos municipais foram considerados como estoques dealimentação para a produção de etanol. Estes materiais primariamenteconsistem de celulose, hemicelulose e lignina. Uma vez que a celulose éconvertida para glicose, a glicose é facilmente fermentada pela levedura emetanol.
Kvesitadaze et al, 1995, Applied Biochemistry andBiotechnology 50: 137-143, descreve a isolação e propriedades de umaendoglucanase termoestável de uma cepa mutante termofílica de Thielaviaterrestris. Gilbert et al., 1992. Bioresource Technology 39: 147-154,descrevem a caracterização das enzimas presentes no sistema de celulose deThielavia terrestris 255B Breuil et al., 1986, Biotechnology Letters 8: 673-676, descreve a produção e localização de celulases e beta-glucosidases dascepas C464 e NRRL 8126 de Thielavia terrestris. Kumar et al., 2000,Bioresource Technology 75: 95-97, divulgam a produção de endo-l,4-beta-glucanase por uma Cladorrhinum foecundissimum.
Seria uma vantagem na técnica identificar novasendoglucanases tendo propriedades melhoradas, tais como taxa de hidrólisemelhorada, melhor estabilidade térmica, absorção reduzida para a lignina ecapacidade para hidrolisar componentes não celulósicos de biomassa, taiscomo hemicelulose, além de hidrolisar a celulose. As endoglucanases comuma ampla faixa de atividades colaterais na hemicelulose podem serespecialmente benéficas para melhorar o rendimento global da hidrólise desubstratos de biomassa ricos em hemicelulose complexos.
É um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeostendo atividade de endoglucanase melhorada e polinucleotídeos quecodifiquem os polipeptídeos.
Sumário da Invenção
A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglucanase selecionados do grupo que consiste de:
(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 2, ou pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 4, ou pelo menos 85 % de identidade com opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6;
(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições de pelo menos alta estringência com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 5, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5 ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii) ou sob condições de pelo menosestringência média-alta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômico quecompreende a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);
(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1, pelo menos 70 % de identidade com a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou pelo menos 85 % de identidadecom a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5; e
(d) uma variante que compreende uma substituição, deleçãoe/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID
NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou se 6.
A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase,selecionados do grupo que consiste de:
(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 80 % deidentidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, pelo menos 70 %de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 85% de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6;
(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de pelomenos alta estringência com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5, (ii) a seqüência de cDNAcontida na seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ. ID NO: 1ou SEQ ID NO: 5 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) ou sobcondições de pelo menos estringência média-alta com (i) a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNAgenômico que compreende a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii);
(c) um polinucleotídeo que compreende uma seqüência denucleotídeo tendo pelo menos 80 % de identidade com a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, pelo menos 70 % deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3 ou pelo menos 85 % de identidade com a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5; e
(d) um polinucleotídeo que codifica uma variante quecompreende uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou maisaminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ouSEQ ID NO: 6.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem osaminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2, Em um outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4. Emum outro aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 19 a 440 da SEQ ID NO: 6. Em um outro aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido,a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 5.
A presente invenção também diz respeito a construções deácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeirasrecombinantes que compreendem os polinucleotídeos e métodos de produzirum polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase.A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, que compreendem administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo(dsRNA), em que a dsRNA compreende uma subseqüência de umpolinucleotídeo da presente invenção. A presente também diz respeito a umatal molécula de RNA inibitória de filamento duplo (dsRNA), em queopcionalmente a dsRNA é uma siRNA ou uma molécula miRNA.
A presente invenção também diz respeito a métodos de usar ospolipeptídeos tendo atividade de endoglucanase na conversão de celulose paraglicose e várias substâncias.
A presente invenção também diz respeito a plantas quecompreendem um polinucleotídeo isolado que codifica um tal polipeptídeotendo atividade de endoglucanase.
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um tal polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase, quecompreendem: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de plantaque compreendam um polinucleotídeo que codifica um tal polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção diz respeito ainda às construções de ácidonucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em que ogene está operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codificaum peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a22 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4, ou osaminoácidos de 1 a 18 da SEQ ID NO: 6, em que o gene é estranho para aseqüência de nucleotídeo, em que o gene é estranho para a seqüência de nucleotídeo.
Descrição Resumida das Figuras
A Figura 1 mostra um mapa de restrição de pPH32.A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pPH37.
A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pPH50.
A Figura 4 mostra um mapa de restrição de pPH38.
As Figuras 5A e 5B mostram a seqüência de DNA genômico ea seqüência de aminoácido deduzida de uma CELlC endoglucanase deThielavia terrestris NRRL 8126 (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).
As Figuras 6A e 6B mostram a seqüência genômica e aseqüência de aminoácido deduzida de uma Thielavia terrestris NRRL 8126CEL7E (SEQ ID NOs: 3 e 4, respectivamente).
A Figura 7 mostra um mapa de restrição de pAlLo1.
A Figura 8 mostra um mapa de restrição de pBANe1O.
A Figura 9 mostra um mapa de restrição de pA1Lo2.
A Figura 10 mostra um mapa de restrição de pEJG109.
A Figura 11 mostra um mapa de restrição de pA1Lo25,
A Figura 12 mostra um mapa de restrição de pPH46.
As Figuras 13A e 13B mostram a seqüência de cDNA e aseqüência de aminoácido deduzida de uma CEL7A endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 (SEQ ID NOs: 5 e 6,respectivamente).
A Figura 14 mostra o curso de tempo de hidrólise de váriossubstratos (5 mg/ml) pela CEL7C endoglucanase de T. terrestris (5 mg deproteína por g de sólidos) no pH 5,0 e 50 °C.
A Figura 15 mostra a conversão relativa de beta-glucano (1 %p/v) depois de 2 horas da hidrólise no pH 5,5 e 60 0C.
A Figura 16 mostra a conversão relativa de beta-glucano (1 %p/v) depois de 24 horas de hidrólise no pH 5,5 e 60 0C.Definições
Atividade de endoglucanase: O termo "atividade deendoglucanase" é aqui definido como uma endo-l,4-beta-D-glucano 4-glucanoidrolase (E.C. No. 32.1.4) que catalisa a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, derivados de celulose (tais comocarboximetil celulose e hidroxietil celulose), lignocelulose, derivados delignocelulose, lichenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanos misturados tais como beta-D-glucanos ou xiloglucanos de cereal e outro material vegetalcontendo componentes celulósicos. Para os propósitos da presente invenção, aatividade de endoglucanase é determinada usando a hidrólise da carboximetilcelulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure andAppl. Chem, 59: 257-268. Uma unidade de atividade de endoglucanase é definida como 1,0 μηιοί de açúcares redutores produzidos por minuto a 50 °C,pH 5,0.
Em um aspecto preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para um ou mais substratos selecionados do grupo que consiste dexilano, xiloglucano, arabinoxilano, 1,4-beta-D-manana e galactomanana. Aatividade dos polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase sobre estessubstratos de polissacarídeo é determinada como porcentagem do substratohidrolisado para reduzir açúcares depois de incubar o substrato (5 mg por ml)com um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presente invenção (5 mg de proteína por g de substrato) por 24 horas com agitação intermitenteno pH 5,0 (50 mM de acetato de sódio) e 50 °C. Os açúcares redutores emmisturas de hidrólise são determinados pelo ensaio da hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH).
Em um aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para o xilano. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeosda presente invenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade deenzima voltada para o xiloglucano. Em um outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase têmainda atividade de enzima voltada para o arabinoxilano. Em um outro aspectomais preferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividade deendoglucanase têm ainda atividade de enzima voltada para a 1,4-beta-D-manana. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglucanase têm ainda atividade de enzimavoltada para a galactomanana. Em um outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglucanase têmainda atividade de enzima voltada para o xilano, xiloglucano, arabinoxilano,1,4-beta-D-manana e/ou galactomanana.
Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20 %,preferivelmente pelo menos 40 %, mais preferivelmente pelo menos 50 %,mais preferivelmente pelo menos 60 %, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80 %, ainda mais preferivelmente pelomenos 90 %, o mais preferivelmente pelo menos 95 % e ainda maispreferivelmente pelo menos 100 % da atividade de endoglucanase dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.
Família da glicosídeo hidrolase 7 ou Família GH7: Os termos"Família da glicosídeo hidrolase 7" ou "Família GH7" são aqui definidoscomo um polipeptídeo que cai na Família 6 da glicosídeo hidrolase de acordocom Henrissat B., 1991, A classification of glycosyl hydrolases based onamino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B. eBairoch A., 1996, Updating the sequence-based classification of glycosylhydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.
Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comoaqui usado refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20 % puro,preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, o maispreferivelmente pelo menos 90 % puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95 % puro, como determinado pela SDS-PAGE.Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeosubstancialmente puro" denota aqui uma preparação de polipeptídeo quecontém no máximo 10 %, preferivelmente no máximo 8 %, maispreferivelmente no máximo 6 %, mais preferivelmente no máximo 5 %, maispreferivelmente no máximo 4 %, mais preferivelmente no máximo 3 %, aindamais preferivelmente no máximo 2 %, o mais preferivelmente no máximo 1% e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 % em peso de outro materialde polipeptídeo com que o mesmo está nativa ou recombinantementeassociado. E, por tanto, preferido que o polipeptídeo substancialmente puroseja pelo menos 92 % puro, preferivelmente pelo menos 94 % puro, maispreferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 96 % puro, mais preferivelmentepelo menos 97 % puro, mais preferivelmente pelo menos 98 % puro, aindamais preferivelmente pelo menos 99 %, o mais preferivelmente pelo menos99,5 % puro e ainda mais preferivelmente 100 % puro em peso do material depolipeptídeo total presente na preparação.
Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmenteem uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que ospolipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polipeptídeo esteja essencialmente livre de outro material depolipeptídeo com que esteja nativa ou recombinantemente associado. Istopode ser realizado, por exemplo, preparando-se o polipeptídeo por meio demétodos recombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificaçãoclássicos.
Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" ésinônimo com os termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na formaisolada."
Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" é aquidefinido como um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase que está nasua forma final a seguir da tradução e quaisquer modificações póstraducionais, tais como o processamento de terminal N, truncagem determinal C5 glicosilação, etc.
Seqüência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência codificadora de polipeptídeo maduro" é aqui definido como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.
Identidade: A relacionabilidade entre duas seqüências deaminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro"identidade".
Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de aminoácido é determinado usando o algoritmo deNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol, Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle da EMBOSS com penalidade deabertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e amatriz EBLOSUM62. A saída da "identidade mais longa" rotulada porNeedle é usada como a identidade percentual e é calculada como segue:(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento -Número de Intervalos no Alinhamento)
Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de nucleotídeo é determinado usando o algoritmo deNeedleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade deabertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5 e amatriz EDNAFULL. A saída de "identidade mais longa" rotulada por Needleé usada como a identidade percentual e é calculada como segue:
(Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento de Alinhamento -Número de Intervalos no Alinhamento)
Seqüência homóloga: O termo "seqüência homóloga" é aquidefinido como uma proteína prognosticada que dá um valor E (ou contagemde probabilidade) de menos do que 0,001 em uma pesquisa fasta (Pearson, W.R„ 1999, em Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A.Krawetz, ed., pp. 185-219) com a CEL7C ou CEL7E endoglucanase deThielavia terrestris (SEQ ID NO: 2 ou SEQ ED NO: 4, respectivamente) ou aCEL7A endoglucanase de Cladorrhinum foecundissimum (SEQ ID NO: 6)como a seqüência a examinar.
Fragmento de Polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é aqui definido como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 ou umaseqüência homóloga destas, em que o fragmento tem atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um fragmento contém pelo menos380 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 400 resíduosde aminoácido e o mais preferivelmente pelo menos 420 resíduos deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 ou uma seqüênciahomóloga desta. Em um outro aspecto preferido, um fragmento contém pelomenos 340 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 360resíduos de aminoácido e o mais preferivelmente pelo menos 380 resíduos deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4 ou uma seqüênciahomóloga desta. Em um outro aspecto preferido, um fragmento contém pelomenos 360 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 380resíduos de aminoácido e o mais preferivelmente pelo menos 400 resíduos deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6 ou uma seqüênciahomóloga desta.
Subseqüência: O termo "subseqüência" é aqui definido comouma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados dasextremidades 5' e/ou 3' da seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5: ou uma seqüênciahomóloga desta; em que a subseqüência codifica um fragmento depolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido,uma subseqüência contém pelo menos 1140 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1200 nucleotídeos e o mais preferivelmente pelomenos 1260 nucleotídeos da seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1 ou um seqüência homóloga desta. Em um outro aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 1020 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1080 nucleotídeos e o mais preferivelmente pelomenos 1140 nucleotídeos da seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou uma seqüência homóloga desta. Em um outro aspectopreferido, uma subseqüência contém pelo menos 1080 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 1140 nucleotídeos e o mais preferivelmente pelomenos 1200 nucleotídeos da seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 5 ou uma seqüência homóloga desta.
Variante alélica: O termo "variante alélica" denota aquiqualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa omesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através damutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. Asmutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeocodificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidoalteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeocodificado por uma variante alélica de um gene.
Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado"como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é pelo menos 20 % puro,preferivelmente pelo menos 40 % puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % puro, o maispreferivelmente pelo menos 90 % puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95 % puro, como determinado pela eletroforese em agarose.
Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo"polinucleotídeo substancialmente puro" como aqui usado refere-se a umapreparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou nãodesejados e em uma forma adequada para o uso dentro de sistemas deprodução de proteína geneticamente engendradas. Assim, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém no máximo 10 %, preferivelmente no máximo8 %, mais preferivelmente no máximo 6 %, mais preferivelmente no máximo5 %, mais preferivelmente no máximo 4 %, mais preferivelmente no máximo3 %, ainda mais preferivelmente no máximo 2 %, o mais preferivelmente nomáximo 1 % e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5 % em peso deoutro material de polinucleotídeo com o qual o mesmo está nativa ourecombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro,entretanto, pode incluir regiões não traduzidas 5' e 3' que ocorremnaturalmente, tais como promotores e terminadores. E preferido que opolinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90 % puro,preferivelmente pelo menos 92 % puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95 % puro, mais preferivelmentepelo menos 96 % puro, mais preferivelmente pelo menos 97 % puro, aindamais preferivelmente pelo menos 98 % puro, o mais preferivelmente pelomenos 99 % e ainda mais preferivelmente pelo menos 99,5 % puro em peso.Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferivelmente em umaforma substancialmente pura. Em particular, é preferido que ospolinucleotídeos aqui divulgados estejam na "forma essencialmente pura",isto é, que a preparação de polinucleotídeo seja essencialmente livre de outromaterial de polinucleotídeo com o qual o mesmo esteja nativa ourecombinantemente associado. Aqui, o termo "polinucleotídeosubstancialmente puro" é sinônimo com os termos "polinucleotídeo isolado" e"polinucleotídeo na forma isolada." Os polinucleotídeos podem ser de origemgenômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética ou quaisquer combinaçõesdestes.Seqüência codificadora: Quando aqui usado o termo"seqüência codificadora" significa uma seqüência de nucleotídeo, quediretamente especifica a seqüência de aminoácido do seu produto de proteína.
Os limites da seqüência codificadora são no geral determinada por uma matrizde leitura aberta, que usualmente começa com o códon de partida ATG oucódons de partida alternativos tais como GTG e TTG e extremidades com umcódon de parada tal como TAA, TAG e TGA. A seqüência codificadora podeser um DNA, cDNA ou seqüência de nucleotídeo recombinante.
Seqüência codificadora de polipeptídeo maduro: O termo"seqüência codificadora de polipeptídeo maduro" é aqui definido como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglucanase.
cDNA: O termo "cDNA" é aqui definido como uma moléculade DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa a partir de umamolécula de mRNA madura, combinada, obtida de uma célula eucariótica. OcDNA carece de seqüências de íntron que estão usualmente presentes noDNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é umprecursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas antesde aparecer como mRNA maduro combinado. Estas etapas incluem aremoção de seqüências de íntron por um processo chamado combinação. OcDNA derivado de mRNA carece, portanto, de qualquer seqüência de íntron.
Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucleico, defilamento único ou duplo, que é isolada de um gene que ocorre naturalmenteou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos em umamaneira que de outro modo não existiria na natureza. O termo construção deácido nucleico é sinônimo com o termo "cassete de expressão" quando aconstrução de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridaspara a expressão de uma seqüência codificadora da presente invenção.Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" éaqui definido para incluir todos os componentes, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode sernativa ou estranha à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ounativa ou estranha entre si. Tais seqüências de controle incluem, mas não sãolimitadas a, um líder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo,promotor, seqüência de peptídeo de sinal e terminador de transcrição. Em ummínimo, as seqüências de controle incluem um promotor e sinais de paradatranscricional e traducional. As seqüências de controle podem ser fornecidascom ligadores com o propósito de introduzir sítios de restrição específicosque facilitem a ligação das seqüências de controle com a região codificadorada seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo.
Operavelmente ligado: O termo "operavelmente ligado"denota aqui uma configuração em que uma seqüência de controle é colocadaem uma posição apropriada em relação à seqüência codificadora da seqüênciade polinucleotídeo tal que a seqüência de controle direcione a expressão daseqüência codificadora de um polipeptídeo.
Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapaenvolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a,transcrição, modificação pós transcricional, tradução, modificação póstraducional e secreção.
Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é aquidefinido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção e que éoperavelmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem a suaexpressão.
Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como aquiusado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação,transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ouvetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.
Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquermodificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6; ou uma seqüênciahomóloga destas; assim como manipulação genética do DNA que codifica umtal polipeptídeo. A modificação pode ser substituições, deleções e/ouinserções de um ou mais aminoácidos assim como substituições de uma oumais cadeias laterais de aminoácido.
Variante artificial: Quando aqui usado, o termo "varianteartificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanaseproduzido por um organismo que expressa uma seqüência de nucleotídeomodificada do polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência homóloga destas. Aseqüência de nucleotídeo modificada é obtida através da intervenção humanapela modificação da seqüência de nucleotídeo divulgada na SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5; ou uma seqüência homóloga destas.
Descrição Detalhada da InvençãoPolipeptídeos Tendo Atividade de Endoglucanase
Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados compreendendo uma seqüência de aminoácido quetenha um grau de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 de pelo menos 60%, preferivelmente pelomenos 65%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmentepelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% e ainda mais preferivelmentepelo menos 96%, 97%, 98 % ou 99% que tenha atividade de endoglucanase(a seguir "polipeptídeos homólogos"). Em um aspecto preferido, ospolipeptídeos homólogos têm uma seqüência de aminoácido que difere emdez aminoácidos, preferivelmente em cinco aminoácidos, maispreferivelmente em quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente em trêsaminoácidos, o mais preferivelmente em dois aminoácidos e ainda maispreferivelmente em um aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ED NO: 2 ou uma variantealélica desta; ou um fragmento desta que tenha atividade de endoglucanase.Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aminoácidos 23 a 464da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento desta quetenha atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende os aminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2. Emum outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência doaminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmentodesta que tem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido,um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Emum outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consistedos aminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta;ou um fragmento desta que tem atividade de endoglucanase. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste dos aminoácidos de 23 a 464 daSEQ ID NO: 2.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou uma variantealélica desta; ou um fragmento desta que tenham atividade de endoglucanase.Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos de 20 a423 da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento destaque tem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ED NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácidoda SEQ ID NO: 4 ou um variante alélica desta; ou um fragmento desta quetem atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dosaminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4 ou uma variante alélica desta; ouum fragmento desta que tenham atividade de endoglucanase. Em um outroaspecto preferido, um polipeptídeo consiste de aminoácidos de 20 a 423 daSEQ ID NO: 4.
Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentetambém compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou umavariante alélica desta; ou um fragmento desta que tenha atividade deendoglucanase. Em um aspecto preferido, um polipeptídeo compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6. Em um outro aspecto preferido,um polipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6. Emum outro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos de19 a 440 da SEQ ID NO: 6, ou uma variante alélica desta: ou um fragmentodesta que tenha atividade de endoglucanase. Em um outro aspecto preferido,um polipeptídeo compreende os aminoácidos de 19 a 440 da SEQ ID NO: 6.Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 6 ou uma variante alélica desta; ou um fragmentodesta que tenha uma atividade de endoglucanase. Em um outro aspectopreferido, um polipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido da SEQ IDNO: 6. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO 6. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dos aminoácidos de 19 a 440 da SEQ ID NO: 6 ou umavariante alélica desta; ou um fragmento desta que tenha atividade deendoglucanase. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dosaminoácidos de 19 a 440 da SEQ ID NO: 6.
Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito aospolipeptídeos isolados tendo atividade de endoglucanase que são codificadospelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muitobaixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmentecondições de estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média-alta, ainda mais preferivelmente condições de estringência alta e o mais preferivelmente condições de estringência muito alta com (i) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3 ou SEQ ID NO: 5, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5 oua seqüência de DNA genômico compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii);ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook, E. F.Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2aedição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Uma subseqüência da seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos oupreferivelmente pelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, asubseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tenhaatividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 79 a 1461 daSEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ ID NO: 3. Emum outro aspecto preferido, a seqüência codificadora do polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 5. Em um outro aspectopreferido, o filamento complementar é o filamento complementar de tamanhonatural da seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.
A seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3ou SEQ ID NO: 5 ou uma subseqüência destas, assim como a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 ou umfragmento destas, podem ser usadas para planejar uma sonda de ácidonucleico para identificar e clonar polipeptídeos que codificam DNA tendoatividade de endoglucanase a partir de cepas de gêneros ou espécies diferentesde acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, taissondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou cDNAdo gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos de Southernblotting padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente nisto.Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüênciainteira, mas devem ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, maispreferivelmente pelo menos 35 e o mais preferivelmente pelo menos 70nucleotídeos no comprimento. Entretanto, é preferido que a sonda de ácidonucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento. Por exemplo, asonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos,preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelomenos 400 nucleotídeos ou mais preferivelmente pelo menos 500nucleotídeos. Sondas ainda mais longas podem ser usadas, por exemplo,sondas de ácido nucleico que tenham pelo menos 600 nucleotídeos, pelomenos preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, mais preferivelmentepelo menos 800 nucleotídeos ou o mais preferivelmente pelo menos 900nucleotídeos no comprimento. As sondas tanto de DNA quanto de RNApodem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o genecorrespondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Taissondas são abrangidas pela presente invenção.
Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada apartir de tais outras cepas, portanto, pode ser tríada quanto ao DNA quehibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase. O DNA genômico ou outro DNA de tais outrascepas pode ser separado pela eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamidaou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separadopodem ser transferido para e imobilizados em nitrocelulose ou outro materialcarregador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que sejahomólogo com a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 ou umasubseqüência destas, o material carregador é preferivelmente usado em umSouthern blot.
Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indicaque a seqüência de nucleotídeo hibridiza com uma sonda de ácido nucleicorotulada correspondente à seqüência codificadora do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5, a seqüência de cDNAcontida na seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1ou SEQ ID NO: 5 ou a seqüência de DNA genômico que compreende aseqüência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, seufilamento complementar ou uma subseqüência destas, sob condições deestringência muito baixa a muito alta. As moléculas com as quais a sonda deácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando porexemplo, película de raio X.
Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência codificadora de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 79 a1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ LD NO: 2 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida noplasmídeo pPH50 que está contido na E. coli NRRL B-30899, em que aseqüência de polinucleotídeo desta codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a região que codifica o polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pPH50que está contido na E. coli NRRL B-30899.
Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 74 a1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ ID NO; 4 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida noplasmídeo pPH38 que está contida na E. coli NRRL B-30896, em que aseqüência de polinucleotídeo desta codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a região que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pPH38que está contido na E. coli NRRL B-30896.
Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 107a 1372 da SEQ ID NO: 5. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ ID NO; 6 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ED NO: 5. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência de polinucleotídeo contida noplasmídeo pPH46 que está contida na E. coli NRRL B-30897, em que aseqüência de polinucleotídeo desta codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a região que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pPH46que está contido na E. coli NRRL B-30897.
Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, condições de estringência muito baixa a muito alta sãodefinidas como pré hibridização e hibridização a 42 °C em 5X SSPE, 0,3 %de SDS, 200 μg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e25 % de formamida para as estringências muito baixas e baixas, 35 % deformamida para as estringências médias e médias-altas ou 50 % de formamidapara as estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos deSouthern blotting padrão por 12 a 24 horas de modo ideal.
Para as sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada por15 minutos usando 2X SSC, 0,2 % de SDS preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50 °C(estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55 °C (estringênciamédia), mais preferivelmente pelo menos a 60 °C (estringência média-alta),ainda mais preferivelmente pelo menos a 65 °C (estringência alta) e o maispreferivelmente pelo menos a 70 °C (estringência muito alta).
Para sondas curtas que são de cerca de 15 nucleotídeos a cercade 70 nucleotídeos no comprimento, as condições de estringência sãodefinidas como pré hibridização, hibridização e lavagem pós hibridização decerca de 5 °C a cerca de 10 °C abaixo da Tm calculada usando o cálculo deacordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academyof Sciences USA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM depirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATPe 0,2 mg de RNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southernblotting padrão por 12 a 24 horas de modo ideal.
Para sondas curtas que são de cerca de 15 nucleotídeos a cercade 70 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é lavado uma vezem 6X SCC mais 0,1 % de SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15minutos usando 6X SSC de 5 0C a 10 0C abaixo da Tm calculada.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados codificados pelos polinucleotídeos que compreendemou que consistem de seqüências de nucleotídeo que tenham um grau deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 de pelo menos 60 %,preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %,mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % e o mais preferivelmentepelo menos 97 % de identidade, que codifica um polipeptídeo ativo. Em umaspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido,a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ IDNO: 5. Ver a seção polinucleotídeo aqui.
Em um quarto aspecto, a presente invenção diz respeito avariantes artificiais que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserçãode um ou mais (ou de vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6; ou uma seqüência homólogadestas. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma naturezamenor, isto é substituições ou inserções de aminoácido conservativas que nãoafetam significantemente a dobra e/ou atividade da proteína; deleçõespequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões determinal amino ou carboxila pequenas, tais como um resíduo de metionina determinal amino; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20 a 25resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação pela mudança dacarga líquida ou uma outra função, tal como um trecho de poli-histidina, umepítopo antigênico ou um domínio de ligação.
Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina easparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições deaminoácido que no geral não alteram a atividade específica são conhecidas natécnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill5 1979, Em,The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. A mudanças que ocorrem maishabitualmente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr,Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile,Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
Além dos 20 aminoácidos padrão, os aminoácidos não padrão(tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico,isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos no lugar dos resíduos deaminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado deaminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelocódigo genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugardos resíduos de aminoácido. Os "aminoácidos não naturais" forammodificados depois da síntese da proteína e/ou têm uma estrutura químicana(s) sua(s) cadeia(s) lateral(is) diferente daquela dos aminoácidos padrão. Osaminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados epreferivelmente, são comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico,ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.
Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de umanatureza tal que as propriedades físico químicas dos polipeptídeos sãoalteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar aestabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato,mudar o pH ideal e outros.
Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podemser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, taiscomo a mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese de varredura dealanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na últimatécnica, as mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo namolécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividadebiológica (isto é, a atividade de endoglucanase) para identificar resíduos deaminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hiltonet al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outrainteração biológica também podem ser determinados pela análise física daestrutura, como determinada por técnicas tais como ressonância magnéticanuclear, cristalografia, difração de elétron ou rotulação de fotoafinidade, emconjunção com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver,por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J.Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett 309: 59-64. Asidentidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas daanálise de identidades com polipeptídeos que estejam relacionados com umpolipeptídeo de acordo com a invenção.
As substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidoúnicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos demutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguido por umprocedimento de triagem relevante, tal como aqueles divulgados porReidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625.Outros métodos que podem ser usados incluem a PCR propensa a erro,demonstração de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; Patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204) e mutagênesedirecionada à região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988,DNA 7: 127).
Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem sercombinados com métodos de triagem de alto rendimento, automatizados paradetectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutagenizados expressadospelas células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeosativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamenteseqüenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem adeterminação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuaisem um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados aos polipeptídeos deestrutura desconhecida.
O número total de substituições, deleções e/ou inserções deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ouSEQ ID NO: 6, tais como os aminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2, osaminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4 ou os aminoácidos de 19 a 440 daSEQ ID NO: 6, é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, maispreferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, o maispreferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglucanase
Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presenteinvenção, o termo "obtido a partir de" como aqui usado em conexão com umadada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüênciade nucleotídeo é produzida pela fonte ou por uma cepa em que a seqüência denucleotídeo da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeoobtido a partir de uma dada fonte é extracelularmente secretado.
Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeopode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeode Bacillus, Streptococcus, Streptomyees, Staphylocoeeus, Enteroeoceus,Laetobaeillus, Lactoeoceus, Clostridium, Geobacillus ou Oceanobacillustendo atividade de endoglucanase ou um polipeptídeo bacteriano Gramnegativo tal como um polipeptídeo de E. eoli, Pseudomonas, Salmonella,Campylobaeter, Helicobaeter, Flavobaeterium, Fusobaeterium, Ilyobaeter,Neisseria ou Ureaplasma tendo atividade de endoglucanase.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deBacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaeiens, Baeillus brevis, Bacilluseireulars, Baeillus elaush, Bacillus eoagulans, Bacillus finnus, Bacilluslautus, Bacillus lentus, Bacillus lieheniformis, Bacillus megaterium, Bacilluspumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillusthuringiensis tendo atividade de endoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptoeoceus equisimilis, Streptoeoceus pyogenes,Streptoeoceus uberis ou Streptoeoceus equi subsp. Zooepidemicus tendoatividade de endoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Streptomyees aehromagenes, Streptomyees avermitilis,Streptomyees eoelieolor, Streptomyees griseus ou Streptomyees lividans tendoatividade de endoglucanase.Um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção também pode ser um polipeptídeo fungico e mais preferivelmenteum polipeptídeo de levedura tal como um polipeptídeo de Candida,Klityveromyces, Pichiai Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowiatendo atividade de endoglucanase; ou mais preferivelmente um polipeptídeofungico filamentoso tal como um Aeremanium, Aspergillus, Aureobasidium,Chrysospofium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humieola,Magnaporthe, Mueor, Myeeilophthota, Neoeallimastix, Neurospora,Paeeilomyees, Penieilliurn, Piromyees, Sehizophillurn, Talarornyees,Thermoascus, Thielavia, Tolypociadiurn ou Triehoderma tendo atividade deendoglucanase.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaccharomyees earlsbergensis, Saccharomyces eerevisiae, Saccharomyeesdiastatieus, Saccharomyees douglasii. Saccharomyees kluyveri,Saccharomyces norbensis ou Saccharomyees oviformis tendo atividade deendoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Aspergillus aeuleatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfurnigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidufans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum,Chrysosporium lueknowense, Chrysosporiwn tropieum, Chrysosporiummerdarium, Chrysosporium mops, Chrysosporium pannicoia, Chrysosporiumqueenslandieum, Chrysosporium zonatum, Fusarium baetridioides, Fusariumeerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium eultnorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium retieulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambueinum, Fusarium sareoehroum. Fusarium sporotriehioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichotheeioides,Fusarium venenatum, Humieola insolens, Humieola lanuginosa, Mueormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilliumbrasilianum, Penicillium eamembertii, Penicillium eapsulatum, Penieilliumehrysogenum, Penieillium eitreonigrum, Penieillium eitrinum, Penieilliumelaviforme, Penicillium eorylophitum, Penicillium erustosum, Penicillium digitatum, Penieillium expansum, Penicillium funieulosum. Penicilliumgiabrum, Penicillium granulatum, griseofulvum. Penicillium islandieum,Penicillium italieum, Penieiltium janthinellum, Penicillium lividum,Penicillium megasporum, Penicillium melinii, Penicillium notatum,Penieillium oxalieum, Penicillium puberulum, Penieillium purpureseens, Penicillium purpurogenum, Penicillium roquefortii, Penicillium rugulosum,Penicillium spinulosum, Penicillium waksmanii, Triehoderma harzianum,Triehoderma koningii, Triehoderma longibrachiatum. Triehoderma reesei ouTriehoderma viride tendo atividade de endoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thielavia achromatiea, Thielavia albomyees, Thielaviaalbopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thieiavia mierospota,Thielavia ovispora, Thielavia peniviana, Thielavia spededonium, Thielaviasetosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Thielavia terricola,Thielavia thermophila, Thielavia variospora ou Thielavia wareingii tendo atividade de endoglucanase.
Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thielavia terrestris e o mais preferivelmente um polipeptídeode Thielavia terrestris NRRL 8126, por exemplo, o polipeptídeo da SEQ IDNO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou o polipeptídeo maduro destas. Em um outro aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Cladorrhinum foeeundissimum, e o mais preferivelmente umpolipeptídeo de Cladorrhinum foeeundissimum ATCC 62373, por exemplo, opolipeptídeo da SEQ ID NO: 6 ou o polipeptídeo maduro desta.
Será entendido que para as espécies anteriormentemencionadas, a invenção abrange os estados tanto perfeitos quantoimperfeitos e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos,independente do nome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Aqueleshabilitados na técnica facilmente reconhecerão a identidade de equivalentesapropriados.
As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao públicoem várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional ResearchCenter (NRRL).
Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados eobtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos isolados danatureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondasmencionadas acima. As técnicas para isolar microorganismos de habitatsnaturais são bem conhecidas na técnica. O polinucleotídeo pode ser depoisobtido triando-se similarmente uma biblioteca genômica ou de cDNA de umtal microorganismo. Uma vez que uma seqüência de polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo tenha sido detectada com a(s) sonda(s), opolinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que sãobem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Os polipeptídeos da presente invenção também incluempolipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão clivados em que um outropolipeptídeo é fundido no término N ou no término C do polipeptídeo oufragmento deste. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo-se umaseqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) que codifica um outropolipeptídeo a uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) dapresente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão sãoconhecidas na técnica e incluem ligar as seqüências codificadoras quecodificam os polipeptídeos de modo que eles estejam na matriz e que aexpressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle dos mesmospromotor(es) e terminador.
Um polipeptídeo de fusão pode compreender ainda um sítio declivagem. Na secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando opolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da proteína de fusão.
Os exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não sãolimitados a, um sítio Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnot 3: 568-76; Svetina et al, 2000, J.Biotechnol 76: 245-251: Rasmussen-Wilson et al, 1997, App. Environ,Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; eContreras et al, 1991, Biotechnology 9: 378-381), um sítio Ile-(Glu ou Asp)-Gly-Arg, que é clivado por uma protease de Fator Xa depois do resíduo dearginina (Eaton et al, 1966, Biochem. 25: 505-512); um sítio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enteroquinase depois da lisina (Collins-Racieet al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um sítio His-Tyr-Glu ou sítio His-Tyr-Asp, que é clivado pela Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins:Structure, Function and Genetics 6: 240-248); um sítio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado pela trombina depois do Arg (Stevens, 2003, DrugDiscovery World 4: 3548); um sítio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que éclivado pela TEV protease depois do Gln (Stevens, 2003, supra); e um sítioLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma formageneticamente engendrada de rinovírus 3C humano protease depois do Gln(Stevens, 2003, supra).
Polinucleotídeos
A presente invenção também diz respeito a um polinucleotídeoisolado que compreende ou consiste de uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção tendo atividade deendoglucanase.
Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ED NO: 1. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pPH50 que está contido na E. coli NRRL 8-30899. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste da região que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ED NO: 1. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião que codifica o polipeptídeo maduro contido no plasmídeo pPH50 queestá contido na E. coli NRRL 8-30899. A presente invenção também abrangeas seqüências de nucleotídeo que codificam os polipeptídeos quecompreendem ou que consistem da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:2 ou o polipeptídeo maduro desta, que difere da SEQ ID NO: 1 ou a seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro desta em virtude da degenerescência docódigo genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüênciasda SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 2 que têmatividade de endoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pPH38 que está contido na E coli NRRL B-30896. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste do polipeptídeo maduro que codifica a região da SEQ ID NO: 3. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião codificadora do polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pPH38 queestá contido na E. coli NRRL B-30896. A presente invenção também abrangeseqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que compreendem ouque consistem da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 4 ou opolipeptídeo maduro desta, que difere da SEQ ID NO: 3 ou a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro desta em virtude da degenerescência docódigo genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüênciasda SEQ ID NO: 3 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 4 que têmatividade de endoglucanase.
Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ID NO: 5. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pPH46 que está contido na E coli NRRL B-30897. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste do polipeptídeo maduro que codifica a região da SEQ ID NO: 5. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 5. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião codificadora do polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pPH46 queestá contido na E. coli NRRL B-30897. A presente invenção também abrangeseqüências de nucleotídeo que codificam polipeptídeos que compreendem ouque consistem da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 ou opolipeptídeo maduro desta, que difere da SEQ ID NO: 5 ou a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro desta em virtude da degenerescência docódigo genético. A presente invenção também diz respeito às subseqüênciasda SEQ ID NO: 5 que codificam fragmentos da SEQ ID NO: 6 que têmatividade de endoglucanase.
A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosmutantes que compreendem ou consistem de pelo menos uma mutação naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3 ou SEQ ID NO: 5, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 23 a464 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo madurotem os aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ED NO: 4. Em um outro aspectopreferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 19 a 440 da SEQ IDNO: 6.
As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeoque codifica um polipeptídeo são conhecidas no ramo e incluem a isolação deDNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destes. Aclonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir de tal DNAgenômico pode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação da cadeia dapolimerase (PCR) bem conhecida ou triagem de anticorpo de bibliotecas deexpressão para detectar fragmentos de DNA clonado com característicasestruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: AGuide to Methods and Applications, Academic Press, Nova Iorque. Outrosprocedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como a reação dacadeia de ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação combase na seqüência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Ospolinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Myceliophthoratermomophila CBS 117.65, basidiomiceto CBS 494.95 ou basidiomiceto CBS495.95 ou um outro organismo ou organismo relacionado e assim, porexemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie variante da região quecodifica o polipeptídeo da seqüência de nucleotídeo.
A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeosque compreendem ou consistem das seqüências de nucleotídeo que têm umgrau de identidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5 de pelo menos 60 %,preferivelmente pelo menos 65 %, mais preferivelmente pelo menos 70 %,mais preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos90 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % e o mais preferivelmentepelo menos 97 % de identidade, que codifica um polipeptídeo ativo. Em umaspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferidoa seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ IDNO: 5.
A modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo"substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se às formas que não ocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir emalgum modo engendrado a partir do polipeptídeo isolado da sua fonte nativa,por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica,termoestabilidade, pH ótimo ou semelhante. A seqüência variante pode serconstruída com base na seqüência de nucleotídeo apresentada como a regiãoque codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO:5, por exemplo, uma subseqüência destas e/ou pela introdução desubstituições de nucleotídeo que não dão origem a uma outra seqüência deaminoácido do polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeo, masque corresponde ao uso de códon do organismo hospedeiro intencionado paraa produção da enzima ou pela introdução de substituições de nucleotídeo quepodem dar origem a uma seqüência de aminoácido diferentes. Para umadescrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al.,1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Estará evidente àqueles habilitados na técnica que taissubstituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função damolécula e ainda resulta em um polipeptídeo ativo. Os resíduos deaminoácido essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo isolado da invenção e portanto preferivelmente não submetidoà substituição, pode ser identificado de acordo com procedimentos conhecidosna técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese devarredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, supra).Na última técnica, as mutações são introduzidas em cada resíduopositivamente carregado na molécula e as moléculas mutantes resultantes sãotestadas quanto a atividade de endoglucanase para identificar resíduos deaminoácido que são críticos para a atividade da molécula. Os sítios deinteração de substrato-enzima também podem ser determinados pela análiseda estrutura tridimensional como determinado por técnicas tais como a análisede ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação de fotoafinidade(ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra; Smith et al., 1992, supra;Wlodaver et al., 1992, supra).
A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizamsob condições muito baixa, preferivelmente condições de estringência baixa,mais preferivelmente condições de estringência média, mais preferivelmentecondições de estringência média-alta, ainda mais preferivelmente condiçõesde estringência alta e o mais preferivelmente condições de estringência muitoalta com sob pelo menos condições de estringência alta com (i) a seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQID NO: 5, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou a SEQ ID NO: 5, ou a seqüência deDNA genômico que compreende a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 3, (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); ouvariantes alélicas destas (Sambrook et al., 1989, supra), como aqui definido.Em um aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspectopreferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido,a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 107 a1372 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspecto preferido, o filamentocomplementar é o filamento complementar de tamanho natural da seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ED NO: 3 ou SEQID NO: 5.
A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados obtidos pela (a) hibridização de uma população de DNA sobcondições de estringência muito baixa, baixa, média, média-alta, alta ou muitoalta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5, (ii) a seqüência de cDNA contida naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou o aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica umpolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase. Em um aspecto preferido, aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 79 a1461 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ IDNO: 3. Em um outro aspecto preferido, a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 3.Emum outro aspecto preferido, o filamento complementar é o filamentocomplementar de tamanho natural da seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.
Construções de Acido Nucleico
A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo isolado da presenteinvenção operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle quedirecionam a expressão da seqüência codificadora em uma célula hospedeiraadequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.
Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo dapresente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos parafornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência dopolinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ounecessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar asseqüências de polinucleotídeo utilizando métodos de DNA recombinante sãobem conhecidos na técnica.
A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotoraapropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüênciasde controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. Opromotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que mostre atividadetranscricional na célula hospedeira de escolha incluindo os promotoresmutantes, trancados e híbridos e pode ser obtido a partir de genes quecodificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ouheterólogos para a célula hospedeira.
Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção,especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotoresobtidos do operon Iac de E. coli, do gene da agarase de Streptomycescoelicolor (dagA), do gene da levansacarase de Bacillus subtilis (sacB), dogene da alfa-amilase de Bacillus lieheniformis (amil), do gene da amilasemaltogênica de Baeillus stearothermophilus (amyM), do gene da alfa-amilasede Bacillus amiloliquefaeiens (amyQ), do gene da penicilinase de Bacilluslicheniformis (penP), genes da xylA e xylB de Bacillus subtilis e do gene dabeta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotortae (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 80: 2125). Outros promotores são descritos em "Useful proteins fromrecombinant bactéria" no Scientific American, 1980, 242: 74-94; e emSambrook et al., 1989, supra.
Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em umacélula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos a partir dosgenes para a amilase TAKA de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica deRhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilaseestável em ácido de Aspergillus niger, glicoamilase de Aspergillus niger ouAspergillus awamori (glaA), lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalinade Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae,acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglucosidase de Fusariumvenenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900),Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), protease equivalente atripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glucosidase deTrichoderma reesei, celobioidrolase I de Triehoderma reesei, celobioidrolaseII de Triehoderma reesei, endoglucanase I de Triehoderma reesei,endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Triehodermareesei, endoglucanase IV de Triehoderma reesei, endoglucanase V deTrichoderma reesei, xilanase I de Triehoderma reesei, xilanase II deTriehoderma reesei, beta-xilosidase de Triehoderma reesei, assim como opromotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para a alfa-amilaseneutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae);e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.
Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis sãoobtidos dos genes para a enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1),galactoquinase de Saccharomyees eerevisiae (GAL1), álcooldesidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyceseerevisiae (ADH1,ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyeeseerevisiae (TPI), metalotionina de Saccharomyees eerevisiae (CUPl) e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces eerevisiae. Outros promotores úteispara as células hospedeiras de levedura são descritas por Romanos et ai.,1992, Yeast 8: 423-488.
A seqüência de controle também pode ser uma seqüênciaterminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora estáoperavelmente ligada ao término 3' da seqüência de nucleotídeo que codificao polipeptídeo. Qualquer terminado que seja funcional na célula hospedeirade escolha pode ser usado na presente invenção.
Os terminadores preferidos para as células hospedeirasfüngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes para a amilase TAKA deAspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase deAspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger e proteaseequivalente a tripsina de Fusarium oxysporum.
Os terminadores preferidos para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyeeseerevisiae, citocromo C de Saccharomyces eerevisiae (CYCl) egliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyees eerevisiae. Outrosterminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritos porRomanos et al., 1992, supra.
A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que seja importante para atradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operavelmente ligada aotérmino 5' da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquerseqüência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode serusada na presente invenção.
Os líderes preferidos para as células hospedeiras de fungofilamentoso são obtidos a partir dos genes para a amilase TAKA deAspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
Os líderes adequados para células hospedeiras de levedura sãoobtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomyces eerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyees eerevisiae, fator alfa deSaccharomyees eerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase de Saccharomyees eerevisiae (ADH2/GAP).
A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência operavelmente ligada ao término 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célulahospedeira como um sinal para a adição de resíduos de poliadenosina aomRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que seja funcional nacélula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.
As seqüências de poliadenilação preferidas para as célulashospedeiras fungicas filamentosas são obtidas a partir dos genes para aamilase TAKA de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger,antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease equivalente a tripsina deFusarium oxysporum e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.
As seqüências de poliadenilação úteis para as célulashospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, MolecularCellularBiology 15: 5983-5990.
A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidoligada ao término amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeocodificado dentro do caminho secretor da célula. A extremidade 5' daseqüência codificadora da seqüência de nucleotídeo pode inerentementeconter uma região codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligada namatriz de leitura de tradução com o segmento da região codificadora quecodifica o polipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' daseqüência codificadora pode conter uma região codificadora de peptídeo desinal que seja estranha para a seqüência codificadora. A região codificadorade peptídeo de sinal estranha pode ser requerida onde a seqüênciacodificadora não contém naturalmente uma região codificadora de peptídeode sinal. Alternativamente, a região codificadora de peptídeo de sinal estranhapode simplesmente substituir a região codificadora de peptídeo de sinalnatural de modo a realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquerregião codificadora de peptídeo de sinal que direcione o polipeptídeoexpressado dentro do caminho secretor de uma célula hospedeira de escolha,isto é secretado em um meio de cultura, pode ser usada na presente invenção.
As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras bacterianas são as regiões codificadoras de peptídeo desinal obtidas a partir dos genes para a amilase maltogênica NCIB 11837 deBacillus, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacilluslicheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis.Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993,Microbiological Reviews 57: 109-137.
As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras fungicas filamentosas são as regiões codificadoras depeptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para amilase TAKA deAspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase deAspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase deHumicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens e lipase deHumicola lanuginosa.
Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para o fator alfa de Saccharomyceseerevisiae e invertase de Saccharomyees eerevisiae. Outras regiõescodificadoras de peptídeo de sinal úteis são descritos por Romanos et ai.,1992, supra.
Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal tem osaminoácidos de 1 a 22 da SEQ LD NO: 2. Em um outro aspecto preferido, aregião codificadora de polipeptídeo de sinal tem os nucleotídeos de 13 a 79 daSEQ ID NO: 1.
Em um outro aspecto preferido, o peptídeo de sinal tem osaminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4. Em um outro aspecto preferido, aregião codificadora de polipeptídeo de sinal tem os nucleotídeos de 17 a 73 daSEQ ID NO: 3.
Em um outro aspecto preferido, o peptídeo de sinal tem osaminoácidos de 1 a 18 da SEQ ID NO: 6. Em um outro aspecto preferido, aregião codificadora de polipeptídeo de sinal tem os nucleotídeos de 53 a 106da SEQ ID NO: 5.
A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de pró-peptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidoposicionada no término amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma pró enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogeno emalguns casos). Um pró-polipeptídeo é no geral inativo e pode ser convertido aum polipeptídeo ativo maduro pela clivagem catalítica ou auto-catalítica dopró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A região codificadora de pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes para a protease alcalina deBacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfade Saccharomyees eerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomueor miehei elacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Onde as regiões tanto de peptídeo de sinal quanto de pró-peptídeo estão presentes no término amino de um polipeptídeo, a região depró-peptídeo é posicionada a seguir do terminal amino de um polipeptídeo e aregião de peptídeo de sinal é posicionada a seguir do terminal amino da regiãode pró-peptídeo.
Também pode ser desejável adicionar seqüências reguladorasque permitam a regulagem da expressão do polipeptídeo em relação aocrescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas reguladores sãoaqueles que fazem com que a expressão do gene seja ativada ou desativadaem resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de umcomposto regulador. Os sistemas reguladores em sistemas procarióticosincluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2ou sistema GALl podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor daalfa-amilase TAKA, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger e opromotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae pode ser usado comoseqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras sãoaqueles que permitem quanto a amplificação de gene. Em sistemaseucarióticos, estes incluem o gene da diidrofoliato redutase que é amplificadona presença dos genes de metotrexato e de metalotioneína que sãoamplificados com metais pesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo seria operavelmente ligado com a seqüênciareguladora.
Vetores de Expressão
A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presenteinvenção, um promotor e sinais de parada transcricional e traducional. Osvários ácidos nucleicos e seqüências de controle aqui descritos podem serunidos entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que podeincluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ousubstituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em taissítios. Alternativamente, uma seqüência de polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser expressada inserindo-se a seqüência de nucleotídeo ou umaconstrução de ácido nucleico que compreenda a seqüência em um vetorapropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüênciacodificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadoraseja operavelmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para aexpressão.
O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor(por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientementesubmetido aos procedimentos de DNA recombinante e possa realizar aexpressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamentedependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual ovetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser lineares ou plasmídeoscirculares fechados.
O vetor pode ser um vetor que replique autonomamente, isto é,um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, a replicação doqual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, umplasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma ou umcromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir aauto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quandointroduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado juntocom o(s) cromossoma(s) no(s) qual(is) o mesmo foi integrado. Além disso,um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos quejuntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeiraou um transposon podem ser usados.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de célulastransformadas, transfectadas, transduzidas ou células semelhantes. Ummarcador selecionável é um gene o produto do qual fornece resistência abiocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia para auxótrofos eoutras.
Os exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são osgenes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores queconferem resistência a antibiótico tal como resistência à ampicilina,canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores adequados para ascélulas hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3. LEU2, LYS2, MET3,TRPl e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célulahospedeira filamentosa fungica incluem, mas não são limitados a, amdS(acetamidase), argB (ornitina carbamoil-transferase), bar (fosfinotricinaacetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase),pyrG (orotidina-5-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) etrpC (antranilato sintase), assim como equivalentes destes. Preferidos para ouso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillusnidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyees hygroscopicus.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umelemento ou elementos que permitem a integração do vetor no genoma dacélula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independentedo genoma.
Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode contar com a seqüência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeoou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pelarecombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração pelarecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local oulocais exatos no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidade deintegração em um local exato, os elementos integracionais devempreferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como100 a 10.000 pares de base, preferivelmente de 400 a 10.000 pares de base e omais preferivelmente de 800 a 10.000 pares de base, que tenham um alto graude identidade com a seqüência alvo correspondente para realçar aprobabilidade de recombinação homóloga, Os elementos integracionaispodem ser qualquer seqüência que seja homóloga com a seqüência alvo nogenoma da célula hospedeira. Além disso, Os elementos integracionais podemser seqüências de nucleotídeo não codificadoras ou codificadoras. Por outrolado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira pelarecombinação não homóloga.
Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender aindauma origem de replicação que permita que o vetor replique autonomamentena célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquerplasmídeo replicador que medeie a replicação autônoma que funcione em umacélula. O termo "origem de replicação" ou "plasmídeo replicador" é aquidefinido como uma seqüência de nucleotídeo que permite que um plasmídeoou vetor replique in vivo.
Os exemplos de origens bacterianas de replicação são asorigens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 epACYC184 que permitem a replicação na E. coli e pUBllO, pE194,pTA1060 e ρΑΜβΙ que permitem a replicação em Bacillus.
Os exemplos de origens de replicação para o uso em umacélula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícrons de replicação, ARS1,ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.
Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célulafungica filamentosa são AMAI e ANSl (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67;Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883).A isolação do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores quecompreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodosdivulgados na WO 00/24883.
Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar aprodução do produto de gene. Um aumento no número de cópia dopolinucleotídeo pode ser obtido integrando-se pelo menos uma cópiaadicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou incluindo-se umgene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde ascélulas contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e destemodo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadascultivando-se as células na presença do agente selecionável apropriado.
Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para construir os vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).Células Hospedeiras
A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produçãorecombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, umprocariota ou um eucariota.
A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactériaGram positiva ou uma bactéria Gram negativa. As bactérias Gram positivasincluem, mas não são limitadas a, Bacíllus, Streptococcus. Streptomyees,Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactoeoceus, Clostridium,Geobacillus e Oceanobacillus. As bactérias Gram negativas incluem, mas nãosão limitadas a, E. eoli, Pseudomonas Salmonella, Campylobaeter,Helieobaeter, Flavobaeterium, Fusobaeterium, llyobaeter, Neisseria eUreaplasma.
A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula deBacillus. As células de Bacíllus úteis na prática da presente invenção incluem,mas não são limitadas a, células de Bacíllus alkalophilus, Bacillusamiloliquefaciens. Bacillus brevis, Bacíllus circulans, Bacíllus clausii,Bacíllus coagulans, Bacíllus firmus, Bacíllus lautus, Bacíllus lentus, Bacílluslicheniformis, Bacíllus megaterium, Bacíllus pumilus, Bacíllusstearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Bacillus amiloliquefaeiens, Bacillus lentus, Bacillus lieheniformis,Bacillus stearothermophilus ou Bacillus subtilis. Em um aspecto maispreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillusamiloliquefaeiens. em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus elausii. Em um outro aspecto maispreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacilluslieheniformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.
A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquercélula de Streptoeoceus. As células de Streptoeoeeus úteis na prática dapresente invenção incluem, mas não são limitadas a, Streptoeoeeusequisimilis, Streptoeoeeus pyogenes, Streptoeoeeus uberis e Streptoeoeeusegui subsp. Zooepidemicus.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptoeoeeus equisimilis. Em um outro aspecto preferido, a célulahospedeira bacteriana é uma célula de Streptoeoeeus pyogenes. Em um outroaspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptoeoeeus uberis. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptoeoeeus equi subsp. Zooepidemicus.
A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquercélula de Streptomyees. As células de Streptomyees útil na prática da presenteinvenção incluem, mas não são limitadas a, Streptomyees aehromogenes,Streptomyees avermitilis, Streptomyees eoelieolor, Streptomyees griseus eStreptomyees lividans.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é umacélula de Streptomyees aehromogenes. Em um outro aspecto preferido acélula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyees avermitilis. Em umoutro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula deStreptomyces coelicolor. Em um outro aspecto preferido, a célula hospedeirabacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em um outro aspectopreferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyceslividans.
A introdução de DNA em uma célula de Bacillus, porexemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver, porexemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115),pelo uso de células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961,Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971,Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por eletroporação (ver, porexemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6, 742-751) ou pelaconjugação (ver, por exemplo, Koehler e Theme, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E.eoli, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto (ver,por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol, Biol. 166: 557-580) ou eletroporação(ver, por exemplo, Dower et ai., 1988. Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptomyces, por exemplo, pode serefetuada pela transformação de protoplasto e eletroporação (ver, por exemplo,Gong et al., 2004, Folie Microbial. (Praha) 49: 399-405), pela conjugação(ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585) oupela transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas,por exemplo, pode ser efetuada pela eletroporação (ver, por exemplo, Choi etal., 2006, J. Microbial. Methods 64: 391-397) ou pela conjugação (ver, porexemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). Aintrodução de DNA em uma célula de Streptococcus, por exemplo, pode serefetuada pela competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu,1981, Infect. Immun, 32: 1295-1297), pela transformação de protoplasto (ver,por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-2070, pelaeletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al,. 1999, Appl. Environ,Microbiol. 65: 3800-3804) ou pela conjugação (ver, por exemplo, Clewell,1981, Microbial. Rev. 45: 409-436), Entretanto, qualquer método conhecidona para a introdução de DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.
A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal comouma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célulafungica. "Fungos" como aqui usado inclui os filos Ascomycota,Basidiomy cota, Chytridiomycota e Zygomycota (como definido porHawksworth et al., Em, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8aedição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assimcomo o Oomyeota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. "Levedura" como aqui usado inclui leveduraascosporogênea (Endomyeetales), levedura basidiosporogênea e levedurapertencente ao Fungi Imperfeeti (Blastomycetes). Visto que a classificação delevedura pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, leveduradeve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner,EA., Passmore, S. M. e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacterial.Symposium Series No. 9, 1980).
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Piehia,Saccharomyees, Schizosaccharomyces ou Yarrowia,
Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de leveduraé uma célula de Saccharomyces earlsbergensis, Saceharomyces eerevisiae,Saccharomyees diastatieus, Saceharomyces douglasii, Saceharomyceskluyveri, Saccharomyees norbensis ou Saccharomyees oviformis. Em umoutro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula deKluyveromyces lactis. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolitica.
Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica é uma célula fungica filamentosa. "Fungos Filamentosos" incluemtodas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomyeota (comodefinido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são nogeral caracterizados por uma parede de micélios composta de quitina,celulose, glucano, quitosano, manana e outros polissacarídeos complexos. Ocrescimento vegetativo é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono éobrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelasleveduras tais como Saccharomyees eerevisiae é pelo brotamento de um talounicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Aeremonium. Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus,Coriolus, Cryptocoeeus, Filibasidium, Fusatium, Humieola, Magnaporthe,Mueor, Myeeliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyees,Penieillium, Phaneroehaete, Phlebia, Piromyees, Pieurotus, Schtzophilium,Talammyees, Thermoaseus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes: ouTriehoderma.
Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungicafilamentosa é uma célula de Aspergillus awatroti, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonieus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae, Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Fusarium baetridioides.Fusarium eerealis, Fusarium erookwellense, Fusarium eulmorum, Fusariumgraminearum- Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxisporum, Fusarium retieulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum- Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ouFusarium venenatum. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fungica filamentosa é uma célula de Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa,Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporiumkeratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum,Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola,Chrysosporium queensiandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,Mycellophthora thermophila, Neurospora Grasse, Penicillium brasilianum,Penicillium purpurogenum. Phaneroehaete chrysosporium, Phlebia radiate,Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor,Triehoderma harzianum, Triehoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, 'Triehoderma taesel ou Trichoderma viride.
As células fungicas podem ser transformadas por um processoenvolvendo a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos eregeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Osprocedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras deAspergillus e Triehoderma são descritas na EP 238 023 e Yelton et al., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81 1470-1474. Osmétodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritas porMalardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. A levedura podeser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente,Em Abelson, J. N. e Simon, Μ, I , editores, Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187,Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy ofSciences USA 75: 1920.
Métodos de Produção
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem produz o polipeptídeo, sobcondições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar opolipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Thielavia. Emum outro aspecto preferido, a célula é do gênero Cladorrhinum. Em umaspecto mais preferido a célula é de Thielavia terrestris. Em um outro aspectomais preferido, a célula é do gênero Cladorrhinum foecundissimum. Em umaspecto mais preferido a célula é de Thielavia terrestris NRRL 8126. Em umoutro aspecto mais preferido, a célula é de Cladorrhinum foecundissimumATCC 62373.
A presente invenção também diz respeito a métodos para produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem (a) cultivaruma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência denucleotídeo mutante tendo pelo menos uma mutação na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ouSEQ ID NO: 5, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codifica umpolipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6 e (b) recuperar o polipeptídeo.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem osaminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4. Emum outro aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 19a 440 da SEQ ED NO: 6. Em um outro aspecto preferido, a seqüência quecodifica o polipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ IDNO: 1. Em um outro aspecto preferido, a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ ID NO: 3. Emum outro aspecto preferido, a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQID NO: 5.
Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeousando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode sercultivada pelo cultivo em frasco agitado e fermentação em pequena escala ougrande escala (incluindo as fermentações contínuas, batelada, lote alimentadoou estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizadasem um meio adequado e sob condições que possibilitem que o polipeptídeoseja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutrienteadequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos,usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados sãodisponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordocom composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American TypeCulture Collection). Se o polipeptídeo é secretado no meio nutriente, opolipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo nãoé secretado no meio, o mesmo pode ser recuperado de lisados de célula.
Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodosconhecidos na técnica que sejam específicos para os polipeptídeos. Estesmétodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formaçãode um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Porexemplo, um ensaio enzimático pode ser usado para determinar a atividade dopolipeptídeo como aqui descrito.
O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodosconhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado domeio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas nãolimitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização,evaporação ou precipitação.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, masnão limitado a, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade,hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentoseletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidadediferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGEou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e LarsRyden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para se obterpolipeptídeos substancialmente puros.
Plantas
A presente invenção também diz respeito a plantas, porexemplo, uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta,compreendendo um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase da presente invenção de modo a expressar eproduzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode serrecuperado da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parteda planta contendo o polipeptídeo recombinante podem ser usadas como taispara melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar ovalor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir umfator antinutritivo.
A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) oumonocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot sãogramas, tais como a grama dos prados (grama azul, Poa), grama forrageira talcomo Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis e cereais, porexemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (milho).Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais comotremoço, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja e plantas crucíferas(família Brassicaceaé), tais como couve-flor, colza e o organismo modelointimamente relacionado Arabidopsis thaliana.
Os exemplos de partes de planta são haste, calo, folhas, raiz,frutas, sementes e tubérculos assim como os tecidos individuais quecompreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima,tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos de célula de plantaespecíficos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos,peroxissomas e citoplasma também são considerados ser uma parte da planta.Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, éconsiderada ser uma parte da planta. Do mesmo modo, partes da planta taiscomo tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização dainvenção também são consideradas partes da planta, por exemplo, embriões,endospermas, aleurona e revestimentos de sementes.
Também incluídos dentro do escopo da presente invenção sãoa progênie de tais plantas, partes da planta e células de planta.
A planta ou célula de planta transgênicas que expressam umpolipeptídeo da presente invenção podem ser construídas de acordo commétodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta sãoconstruídas pela incorporação de uma ou mais construções de expressão quecodifica um polipeptídeo da presente invenção no genoma do hospedeirovegetal ou genoma de cloroplasto e propagando a planta ou célula de plantamodificadas resultantes em uma planta ou célula de planta transgênicas.
A construção de expressão é convenientemente umaconstrução de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado comseqüências reguladoras apropriadas requeridas para a expressão da seqüênciade nucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além disso, aconstrução de expressão pode compreender um marcador selecionável útilpara identificar as células hospedeiras nas quais a construção de expressão foiintegrada e seqüências de DNA necessárias para a introdução da construçãona planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA aser usado).
A escolha de seqüências reguladoras, tais como seqüênciaspromotoras e terminadoras e opcionalmente seqüências de sinal ou trânsito édeterminada, por exemplo, com base em quando, onde e como o polipeptídeoé desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene que codifica umpolipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível ou podeser específica de desenvolvimento, estágio ou tecido e o produto de gene podeser alvejado a um tecido ou parte da planta específicos tais como sementes oufolhas. As seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague etal., 1988, PlantPhysiology 86: 506.
Para a expressão constitutiva, os promotores 3 5 S-CaMV, daubiquitina 1 do milho e da actina 1 do arroz podem ser usados (Franck et al.,1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicosde órgão podem ser, por exemplo, um promotor dos tecidos de depósito dearmazenagem tais como sementes, tubérculos da batata e frutas (Edwards &Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de depósitometabólico tais como meristemas (Ito et al, 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor da glutelina,prolamina, globulina ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant and CellPhysiology 39: 885-889), um promotor da Vicia faba da legumina B4 e ogene da proteína de semente desconhecido da Vicia faba (Conrad et al., 1998,Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína decorpo oleoso de semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39:935-941), o promotor napA da proteína de armazenagem de Brassica napusou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, porexemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, o promotor pode serum promotor específico de folha tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do geneda adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, PlantMolecular Biology 26: 85-93) ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagayaet al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) ou um promotorindutível por ferimento tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993,Plant Molecular Biology 22: 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode serindutível pelos tratamentos abióticos tais como temperatura, seca oualterações na salinidade ou induzido pelas substâncias exogenamenteaplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios,hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico emetais pesados.
Um elemento realçador de promotor também pode ser usadopara se obter a expressão mais alta de um polipeptídeo da presente invençãona planta. Por exemplo, o elemento realçador de promotor pode ser um íntronque é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al, 1993, supra,divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para realçar aexpressão.
O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes daconstrução de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis natécnica.
A construção de ácido nucleico é incorporada no genomavegetal de acordo com técnicas convencionais conhecidas no ramo, incluindoa transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada porvírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística eeletroporação (Gasser et al, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990,Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et ai, 1989, Nature 338: 274).
Presentemente, a transferência de gene mediada pelaAgrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotstransgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, PlantMolecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usada para transformarmonocots, embora outros métodos de transformação sejam freqüentementeusados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerarmonocots transgênicas é o bombardeamento de partícula (partículas de ouroou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA transformador) de calosembrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162;Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo paraa transformação de monocots está fundamentado na transformação deprotoplasto como descrito por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology21:415-428.
Seguindo a transformação, os transformantes tendoincorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados emplantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.Freqüentemente o procedimento de transformação é planejado para aeliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nasgerações seguintes usando-se, por exemplo, a co-transformação com duasconstruções de T-DNA separadas ou a excisão específica de sítio do gene deseleção por uma recombinase específica.
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção que compreendem (a) cultivarum planta transgênica ou uma célula de planta que compreendem umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase da presente invenção sob condições condutivas para aprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.Remoção ou Redução da Atividade de Endoglucanase
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um mutante de uma célula precursora, que compreende romper oudeletar uma seqüência de polinucleotídeo ou uma porção desta, quecodifiquem um polipeptídeo da presente invenção, que resulte na célulamutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula precursora quandocultivada sob as mesmas condições.
A célula mutante pode ser construída pela redução oueliminação da expressão de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos natécnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições ou deleções. Emum aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo é inativada. A seqüência denucleotídeo a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a regiãocodificadora ou uma parte desta essencial para a atividade ou um elementoregulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo deuma tal seqüência reguladora ou de controle pode ser uma seqüênciapromotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficientepara afetar a expressão da seqüência de nucleotídeo. Outras seqüências decontrole para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, umalíder, seqüência de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, seqüência depeptídeo de sinal, terminador de transcrição e ativador transcricional.
A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada submetendo-se a célula precursora à mutagênese e selecionandoquanto a células mutantes em que a expressão da seqüência de nucleotídeo foireduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica ou aleatória,pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagenizante físicoou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado ousubmetendo-se a seqüência de DNA à mutagênese gerada pela PCR. Alémdisso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinaçãodestes agentes mutagenizantes.
Os exemplos de um agente mutagenizante físico ou químicoadequado para o presente propósito incluem irradiação ultravioleta (UV),hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, metano sulfonato de etila (EMS), bissulfito desódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.
Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamenterealizada pela incubação da célula precursora a ser mutagenizada na presençado agente mutagenizante de escolha sob condições e triagem adequadas e/ouselecionando quanto a células mutantes que exibem expressão reduzida ounenhuma do gene.
A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada pela introdução, substituição ou remoção de um ou maisnucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a suatranscrição ou tradução. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ouremovidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, aremoção do códon de parada ou uma mudança na matriz de leitura aberta. Talmodificação ou inativação pode ser realizada pela mutagênese direcionada aosítio ou mutagênese gerada pela PCR de acordo com métodos conhecidos natécnica. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo, i.e.,diretamente na célula para expressar a seqüência de nucleotídeo a sermodificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro comoexemplificado abaixo.
Um exemplo de um modo conveniente para eliminar oureduzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeo por um célula estáfundamentado em técnicas de substituição de gene, deleção de gene ourompimento de gene. Por exemplo, no método de rompimento de gene, umaseqüência de ácido nucleico que corresponde à seqüência de nucleotídeoendógena é mutagenizada in vitro para produzir uma seqüência de ácidonucleico defeituosa que é depois transformada na célula precursora paraproduzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a seqüência deácido nucleico defeituosa substitui a seqüência de nucleotídeo endógena. Podeser desejável que a seqüência de nucleotídeo defeituosa também codifique ummarcador que pode ser usado para a seleção de transformantes em que aseqüência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspectoparticularmente preferido, a seqüência de nucleotídeo é rompida com ummarcador selecionável tal como aqueles aqui descritos.
Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência denucleotídeo pode ser realizada pelas técnicas de anti-sentido ou RNAiestabelecidas usando uma seqüência complementar à seqüência denucleotídeo. Mais especificamente, a expressão da seqüência de nucleotídeopor uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de umaseqüência complementar à seqüência de nucleotídeo do gene que pode sertranscrita na célula e é capaz de hibridizar ao mRNA produzido na célula. Sobcondições que permitam que a seqüência de nucleotídeo de anti-sentidocomplementar hibridize com o mRNA, a quantidade de proteína traduzida éassim reduzida ou eliminada.
A presente invenção diz respeito ainda a uma célula mutantede uma célula precursora que compreende um rompimento ou deleção de umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma seqüência decontrole desta, que resulta na célula mutante produzindo menos dopolipeptídeo ou nenhum polipeptídeo comparada com a célula precursora.
As células mutantes deficientes em polipeptídeo assim criadassão particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão depolipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção dizrespeito ainda a métodos para produzir um polipeptídeo homólogo ouheterólogo que compreendem: (a) cultivar a célula mutante sob condiçõescondutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Otermo "polipeptídeos heterólogos" é aqui definido como polipeptídeos quenão são nativos para a célula hospedeira, uma proteína nativa em quemodificações foram feitas para alterar a seqüência nativa ou uma proteínanativa cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de umamanipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinantes.
Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase pela fermentação de uma célula que produz tantoum polipeptídeo da presente invenção assim como o produto de proteína de interesse pela adição de uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir aatividade de endoglucanase para o caldo de fermentação antes, durante oudepois que a fermentação tem sido completada, recuperar o produto deinteresse do caldo de fermentação e opcionalmente submeter o produtorecuperado a outra purificação.
Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglucanase cultivando-se a célula sob condições quepermitam a expressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante aum tratamento de pH e temperatura combinados de modo a reduzir a atividadede endoglucanase substancialmente e recuperar o produto do caldo de cultura.Alternativamente, o tratamento de pH e temperatura combinados pode serrealizado em uma preparação de enzima recuperada do caldo de cultura. Otratamento de pH e temperatura combinados pode ser opcionalmente usadoem combinação com um tratamento com um inibidor de endoglucanase.
De acordo com este aspecto da invenção, é possível removerpelo menos 60 %, preferivelmente pelo menos 75 %, mais preferivelmentepelo menos 85 %, ainda mais preferivelmente pelo menos 95 % e o maispreferivelmente pelo menos 99 % da atividade de endoglucanase. A remoçãocompleta da atividade de endoglucanase pode ser obtida pelo uso destemétodo.
O tratamento de pH e temperatura combinados épreferivelmente realizado em um pH na faixa de 2 a 3 ou 10 a 11 e umatemperatura na faixa de pelo menos 75 a 85 0C por um período suficiente detempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, de 1 a 3 horas ésuficiente.
Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto deinteresse podem ser realizados pelos métodos conhecidos na técnica.
Os métodos da presente invenção para produzir um produtoessencialmente isento de endoglucanase é de interesse particular na produçãode polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fungicas tais comoenzimas. A enzima pode ser selecionada, por exemplo, de uma enzimaamilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulítica,oxidorredutase ou enzima que degrada a parede de célula de planta. Osexemplos de tais enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase,amiloglucosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase,cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase,galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, glicose oxidase, glucosidase,haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lactase, ligase, lipase,liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase,fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase,transglutaminase ou xilanase. As células deficientes em endoglucanasetambém podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interessefarmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores eoutros,
Deve ser entendido que o termo "polipeptídeos eucarióticos"inclui não apenas polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos,por exemplo, enzimas, que foram modificados pelas substituições, deleçõesou adições de aminoácido ou outra de tais modificações para realçar aatividade, termoestabilidade, tolerância ao pH e outras.
Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a umproduto de proteína essencialmente livre da atividade de endoglucanase que éproduzido por um método da presente invenção.
Métodos de Inibir a Expressão de um Polipeptídeo
A presente invenção também diz respeito a métodos de inibir aexpressão de um polipeptídeo em uma célula, que compreendem administrar àcélula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo(dsRNA), em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNAtem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24; 25 ou mais nucleotídeosduplex no comprimento. Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo tematividade de endoglucanase.
O dsRNA é preferivelmente um RNA interferente pequeno (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA éRNA interferente pequeno (siRNAs) para inibir a transcrição. Em um outroaspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibir a tradução.
A presente invenção também diz respeito a tais moléculas deRNA de filamento duplo (dsRNA) para inibir a expressão de um polipeptídeo em uma célula, em que o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção deum polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6. Embora a presente invenção não sejalimitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar emuma célula e causar a degradação de um RNA de filamento simples (ssRNA) de seqüências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quandouma célula é exposta ao dsRNA, o mRNA do gene homólogo é seletivamentedegradado por um processo chamado de interferência de RNA (RNAi).
Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados emprodutos terapêuticos de silenciamento de gene. Em um aspecto, a invençãofornece métodos para degradar seletivamente RNA usando os dsRNAis dapresente invenção. O processo pode ser praticado in vitro, ex vivo ou in vivo.Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar umamutação de perda de função em uma célula, um órgão ou um animal. Osmétodos para fabricar e usar moléculas de dsRNA para degradarseletivamente RNA são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, aPatente U.S. 6.506.559, Patente U.S. 6.511.824; Patente U.S. 6.515.109; ePatente U.S. 6.489.127.
Composições
A presente invenção também diz respeito às composições quecompreendem um polipeptídeo da presente invenção, Preferivelmente, ascomposições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo "enriquecido"indica que a atividade de endoglucanase da composição foi aumentada, porexemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.
A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o componente enzimático principal, por exemplo, umacomposição de mono-componente. Alternativamente, a composição podecompreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como umaaminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase.quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease,esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase,manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase,fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminaseou xilanase. A(s) enzima(s) adicional(is) pode(m) ser produzida(s), porexemplo, por um microorganismo pertencente ao gênero Aspergillus,preferivelmente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusariumbactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusariumreticulatum, Fusarium toseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sulphureum. Fusarium toruloseum, Fusariumtrichothecioides ou Fusarium venenatum, Humicola, preferivelmenteHumicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma,preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatumi Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.
As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de umacomposição líquida ou uma seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeopode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeoa ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodosconhecidos na técnica.
Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos dascomposições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição depolipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição éusada pode ser determinada com base em métodos conhecidos na técnica.
Usos
A presente invenção também diz respeito a métodos paradegradar ou converter um material celulósico, que compreendem tratar omaterial celulósico com uma composição que compreenda uma quantidadeeficaz de um polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção. Em um aspecto preferido, o método compreende ainda recuperar omaterial celulósico degradado ou convertido.
Os polipeptídeos e células hospedeiras da presente invençãopodem ser usados na produção de monossacarídeos, dissacarídeos epolissacarídeos como estoques de alimentação química ou fermentação debiomassa celulósica para a produção de etanol, plásticos, outros produtos ouintermediários. A composição que compreende o polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase pode estar na forma de um caldo de fermentação bruto comou sem as células removidas ou na forma de uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada.
Alternativamente, a composição pode compreender uma célulahospedeira da presente invenção como uma fonte do polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase em um processo de fermentação com a biomassa.A célula hospedeira também pode conter genes nativo ou heterólogos quecodificam outras proteínas e enzimas, mencionadas acima, úteis noprocessamento de biomassa. Em particular, os polipeptídeos e célulashospedeiras da presente invenção podem ser usadas para aumentar o valor deresíduos de processamento (grãos de destiladores secos, grãos gastos dafabricação de cerveja, bagaço de cana de açúcar, etc.) pela degradação parcialou completa de celulose ou hemicelulose. As composições também podemcompreender outras proteínas e enzimas úteis no processamento de biomassa,por exemplo, celobioidrolase, beta-glucosidase, enzimas hemicelulolítica,realçadores (WO 2005/074647, WO 2005/074656), etc.
Nos métodos da presente invenção, qualquer materialcelulósico, tal como biomassa, pode ser usado. É aqui entendido que o termo"material celulósico" abrange lignocelulose. A biomassa pode incluir, masnão é limitado a, recursos lenhoso, resíduos sólidos municipais, papel usado,safras e resíduos de safra (ver, por exemplo, Wiselogel et ai., 1995, emHandbook on Bioetanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor &Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16;Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719:Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, emAdvances in Biochemical Engineering/Biotechnology T. Scheper, editorgeral, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque).O polissacarídeo predominante na parede de célula primária debiomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemi-celulose e oterceiro é a pectina. A parede de célula secundária, produzida depois que acélula parou de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada pelalignina polimérica covalentemente reticulada a hemicelulose. A celulose é umhomopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D-glucano linear,enquanto que as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, taiscomo xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos e mananas em estruturasramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora no geralpolimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal primariamente comouma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glucano paralelas. Ashemiceluloses usualmente ligam-se por hidrogênio à celulose, assim como aoutras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz de parede celular.
Três classes principais de enzimas são usadas para romper abiomassa celulósica:
(1) As "endo-l,4-beta-glucanases" ou 1,4-beta-D-glucano-4-glucanoidrolases (EC 3.2.1.4), que atuam aleatoriamente em substratos de1,4-beta-glucano solúveis e insolúveis.
(2) As "exo-l,4-beta-D-glucanases" incluindo tanto as 1,4-beta-D-glucano glicoidrolases (EC 3.2.1.74), que liberam D-glicose a partirde 1,4-beta-D-glucanos e hidrolisam D-celobiose lentamente ecelobioidrolases (1,4-beta-D-glucano celobioidrolases. EC 3.2.1.91), queliberam D-celobiose de 1,4-beta-glucanos.
(3) As "beta-D-glucosidases" ou beta-D-glicosídeoglicoidrolases (EC 3.2.1.21), que atuam para liberar unidades de D-glicose decelobiose e celodextrinas solúveis, assim como uma série de glicosídeos.Os polipeptídeos tendo atividade de endoglucanase da presenteinvenção são preferivelmente usados em conjunção com outras proteínascelulolíticas, por exemplo, exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases,para degradar o componente de celulose do substrato de biomassa, (ver, porexemplo. Brigham et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E.Wyman, editor), pp, 119-141 Taylor & Francis, Washington DC.: Lee, 1997,Journal of Biotechnology 56: 1-24). O termo "proteínas celulolíticas" é aquidefinido como aquelas proteínas ou misturas de proteínas mostradas comosendo capazes de hidrolisar ou converter ou degradar a celulose sob ascondições testadas.
As exo-l,4-beta-D-glucanases e beta-D-glucosidases podemser produzidas por qualquer método conhecidos na técnica (ver, por exemplo,Bennett, J. W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi,Academic Press, CA, 1991).
As quantidades ótimas de um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase e outras proteínas celulolíticas depende de diversos fatoresincluindo, mas não são limitados à mistura de proteínas celulolíticascomponentes, o substrato celulósico, a concentração de substrato celulósico,o(s) pré tratamento(s) do substrato celulósico, temperatura, tempo, pH einclusão de organismo de fermentação (por exemplo, levedura para aSacarificação e Fermentação Simultâneas).
Em um aspecto preferido, a quantidade de polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase por g de material celulósico é de cerca de 0,5 acerca de 50 mg, preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente decerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 15 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e omais preferivelmente de cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de materialcelulósico.
Em um outro aspecto preferido, a quantidade de proteínascelulolíticas por g de material celulósico é de cerca de 0,5 a cerca de 50 mg,preferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente decerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cercade 20 mg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda maispreferivelmente de cerca de 0,5 a cerca de 10 mg e o mais preferivelmente decerca de 2,5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.
Nos métodos da presente invenção, a composição pode sersuplementada por uma ou mais atividades de enzima adicionais para melhorara degradação do material celulósico. As enzimas adicionais preferidas sãohemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipases e/ou cutinases),proteases, lacases, peroxidases ou misturas destes.
Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s)adicional(is) pode(m) ser adicionadas antes ou durante a fermentação,incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) defermentação.
As enzimas podem ser derivadas ou obtidas a partir de qualquer origem adequada, incluindo, origem bacteriana, fungica, de leveduraou mamífera. O termo "obtida" significa aqui que a enzima pode ter sidoisolada de um organismo que naturalmente produz a enzima como umaenzima nativa. O termo "obtida" também significa aqui que a enzima pode tersido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, em que a enzima recombinantemente produzida é nativa ou estranha para o organismohospedeiro ou tem uma seqüência de aminoácido modificada, por exemplo,tendo um ou mais aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos,isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou umfragmento de uma seqüência de aminoácido nativa ou uma enzima produzidapelos processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica.Abrangidos dentro do significado de uma enzima nativa estão as variantesnaturais e dentro do significado de uma enzima estranha estão variantesobtidas recombinantemente, tais como pela mutagênese direcionada ao sítioou embaralhamento.As enzimas também podem ser purificadas. O termo"purificada" como aqui usado abrange enzimas livres de outros componentesdo organismo a partir do qual a mesma é derivada. O termo "purificada"também abrange enzimas livres de componentes do organismo nativo a partirdo qual a mesma é obtida. As enzimas podem ser purificadas, apenas comquantidades menores de outras proteínas estando presentes. A expressão"outras proteínas" diz respeito em particular a outras enzimas. O termo"purificada" como aqui usado também refere-se à remoção de outroscomponentes, particularmente outras proteínas e mais particularmente outrasenzimas presentes na célula de origem da enzima da invenção, A enzima podeser "substancialmente pura," isto é, livre de outros componentes do organismono qual a mesma é produzida, isto é, por exemplo, um organismo hospedeiropara as enzimas recombinantemente produzidas. Em um aspecto preferido, asenzimas são pelo menos 75 % (p/p), preferivelmente pelo menos 80 %, maispreferivelmente pelo menos 85 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %,mais preferivelmente pelo menos 95 %, mais preferivelmente pelo menos 96%, mais preferivelmente pelo menos 97 %, ainda mais preferivelmente pelomenos 98 % ou o mais preferivelmente pelo menos 99 % puras. Em um outroaspecto preferido, a enzima é 100 % pura.
As enzimas usadas na presente invenção pode estar emqualquer forma adequada para o uso nos processos aqui descritos, tais como,por exemplo, um caldo de fermentação bruto com ou sem células, um pó ougranulado secos, um granulado não pulverulento, um líquido, um líquidoestabilizado ou uma enzima protegida. Os granulados podem ser produzidos,por exemplo, como divulgado nas Patentes U.S. 4.106.991 e 4.661.452 epodem ser opcionalmente revestidos por processos conhecidos na técnica. Aspreparações de enzima líquidas, por exemplo, podem ser estabilizadas pelaadição de estabilizadores tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou umoutro poliol e/ou ácido láctico ou um outro ácido orgânico de acordo comprocesso estabelecido. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordocom o processo divulgado na EP 238.216.
Os métodos da presente invenção podem ser usados paraprocessar um material celulósico em muitos produtos orgânicos, produtosquímicos e combustíveis úteis, Além de etanol, algumas mercadorias eprodutos químicos especiais que podem ser produzidos a partir de celuloseincluem xilose, acetona, acetato, glicina, lisina, ácidos orgânicos (porexemplo, ácido láctico), 1,3-propanodiol, butanodiol, glicerol, etileno glicol,furfural, poliidroxialcanoatos, eis, ácido cis-mucônico e ração de animal(Lynd, L. R., Wyman, C. E e Gerngross, T. U., 1999. BiocommodityEngineering, Biotechnol. Prog., 15: 777-793; Philippidis, G. P.. 1996,Cellulose bioconversion technology, no Handbook on Bioethanol Productionand Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212: e Ryu. D. D. Y. e Mandeis, M., 1980, Cellulases: biosynthesis andapplications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102), os benefícios de co-produçãopotenciais estendem-se além da síntese de produtos orgânicos múltiplos apartir de carboidrato fermentáveis. Os resíduos ricos em lignina quepermanecem depois do processamento biológico podem ser convertidos paraprodutos químicos derivados de lignina ou usados para energizar a produção.
Os métodos convencionais usados para processar o materialcelulósico de acordo com os métodos da presente invenção são bementendidos por aqueles habilitados na técnica. Os métodos da presenteinvenção podem ser implementados usando qualquer aparelho que processebiomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.
Um tal aparelho pode incluir um reator de lote agitado, umreator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, um reator de coluna detampão de fluxo contínuo (Gusakov, Α. V. e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics ofthe enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batchreactor process, Enz. Microb. Technol, 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu,S. Κ. e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attritionbioreactor, Biotechnot. Bioeng, 25: 53-65) ou um reator com agitaçãointensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, Α. V., Sinitsyn,A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement ofenzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensivestirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56:141-153).
Os métodos convencionais incluem, mas não são limitados a,sacarificação, fermentação, hidrólise e fermentação separadas (SHF),sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), sacarificação e cofermentaçãosimultâneas (SSCF), hidrólise e fermentação híbridas (HHF) e conversãomicrobiana direta (DMC).
A SHF usa etapas de processo separadas para primeirohidrolisar enzimaticamente a celulose para glicose e depois fermentar aglicose para etanol, Na SSF, a hidrólise enzimática de celulose e afermentação de glicose para etanol são combinadas em uma etapa(Philippidis, G. P, 1996, Cellulose bioconversion technology, no Handbookon Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor &Francis, Washington, DC, 179-212). A SSCF inclui a cofermentação deaçúcares múltiplos (Sheehan, J. e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy andthe environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy'sresearch and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827). A HHF inclui duas etapas separadas realizadas no mesmo reator mas emtemperaturas diferentes, i.e., sacarificação enzimática de alta temperaturaseguida por SSF em uma temperatura mais baixa que a cepa de fermentaçãopossa tolerar. DMC combina todos os três processos (produção de celulose,hidrólise da celulose e fermentação) em uma etapa (Lynd, L R., Weimer. P. J.,van Zil, W. H. e Pretorius, S., 2002, Microbial cellulose utilization:Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577).
"Fermentação" ou "processo de fermentação" referem-se aqualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreenda umaetapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, sem limitação,processos de fermentação usados para produzir produtos de fermentaçãoincluindo álcoois (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol,1,3-propanodiol, sorbitol e xilitol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácidoacético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido2,5-diceto-D-glicônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácidoglicônico. ácido glicurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácidoitacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácidopropiônico, ácido succínico e ácido xilônico); cetonas (por exemplo, acetona);aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina,serina e treonina); gases (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido decarbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)). Os processos de fermentaçãotambém incluem processos de fermentação usados na indústria de álcoolconsumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínio (porexemplo, produtos de laticínio fermentado), indústria do couro e indústria dotabaco.
A presente invenção diz respeito ainda a métodos de produziruma substância, que compreendem: (a) sacarificar um material celulósico comuma composição que compreenda uma quantidade eficaz de um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase; (b) fermentar o material celulósicosacarificado da etapa (a) com um ou mais microorganismos de fermentação: e(c) recuperar a substância da fermentação. A composição que compreende opolipeptídeo tendo atividade de endoglucanase pode estar na forma de umcaldo de fermentação bruto com ou sem as células removidas ou na forma deuma preparação de enzima semi-purificada ou purificada ou a composiçãopode compreender uma célula hospedeira da presente invenção como umafonte do polipeptídeo tendo atividade de endoglucanase em um processo defermentação com a biomassa.
A substância pode ser qualquer substância derivada dafermentação. Em uma forma de realização preferida, a substância é um álcool.Deve ser entendido que o termo "álcool" abrange uma substância que contémuma ou mais porções de hidroxila. Em uma forma de realização maispreferida, o álcool é arabinitol. Em uma outra forma de realização maispreferida, o álcool é butanol. Em uma outra forma de realização maispreferida, o álcool é etanol. Em uma outra forma de realização mais preferida,o álcool é glicerol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcoolé metanol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é 1,3-propanodiol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool ésorbitol. Em uma outra forma de realização mais preferida, o álcool é xilitol.Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J. e Tsao, G. T., 1999, EthanolProduction from renewable resources. em Advances in BiochemicalEngineering/ Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag BerlinHeidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira, Μ. M. e Jonas, R.: 2002: Thebiotechnological production of sorbitol, App. Microbiol, Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production ofxilitol - a sugar substitute, Process Biochemistiy 30 (2): 117-124; Ezeji, T.C., Qureshi, N. e Blaschek. H. P., 2003, Production of acetone, butanal andethanol by Clostridium beijerinckii BAlOl and in situ recovery by gasstripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.
Em uma outra forma de realização preferida, a substância é umácido orgânico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é ácido acético. Em uma outra forma de realização mais preferida, oácido orgânico é o ácido acetônico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido adípico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido ascórbico. Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido cítrico. Emuma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido 2,5-diceto-D-glicônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido fórmico, Em uma outra forma de realização mais preferida,o ácido orgânico é o ácido fumárico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido glucárico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicônico. Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido glicurônico.Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácidoglutárico. Em uma outra forma de realização preferida, o ácido orgânico é oácido 3-hidroxipropiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida,o ácido orgânico é o ácido itacônico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido láctico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido málico, Em uma outraforma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácido malônico. Emuma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico é o ácidooxálico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácido orgânico éo ácido propiônico. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido succínico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o ácido orgânico é o ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen, R. eLee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acidproduction from celulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.
Em uma outra forma de realização preferida, a substância éuma cetona. Deve ser entendido que o termo "cetona" abrange uma substânciaque contém uma ou mais porções de cetona. Em uma outra forma derealização mais preferida, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi eBlaschek, 2003, supra.
Em uma outra forma de realização preferida, a substância é umaminoácido. Em uma outra forma de realização mais preferida, o ácidoorgânico é o ácido aspártico. Em uma outra forma de realização maispreferida, o aminoácido é o ácido glutâmico. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é glicina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é lisina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é serina. Em uma outra forma derealização mais preferida, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo,Richard, A. e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentationkinetics for poli(glutamic acid) production and other microbial biopolymers,Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.
Em uma outra forma de realização preferida; a substância é umgás. Em uma outra forma de realização mais preferida, o gás é metano. Emuma outra forma de realização mais preferida, o gás é H2. Em uma outraforma de realização mais preferida, o gás é CO2. Em uma outra forma derealização mais preferida, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A.Miya e K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuousculture system of hydrogen-producting anaerobic bactéria, Water Science andTechnology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V. N. em Biomass and Bioenergy,Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for metaneproduction: A review.
A produção de uma substância a partir de material celulósicotipicamente requer quatro etapas principal. Estas quatro etapas são prétratamento, hidrólise enzimática, fermentação e recuperação. É exemplificadoabaixo um processo para produzir etanol, mas deve ser entendido queprocessos similares podem ser usados para produzir outras substâncias, porexemplo, as substâncias descritas acima.
Pré tratamento. Na etapa de pré tratamento ou pré-hidrólise, omaterial celulósico é aquecido para quebrar a lignina e a estrutura decarboidrato, solubilizar a maior parte da hemicelulose e tornar a fração decelulose acessível às enzimas celulolíticas. O aquecimento é realizadodiretamente com vapor ou em pasta fluída onde um catalisador também podeser adicionado ao material para acelerar as reações. Os catalisadores incluemácidos fortes, tais como ácido sulfürico e SO2. ou álcali, tal como hidróxidode sódio. O propósito do estágio de pré-tratamento é facilitar a penetração dasenzimas e microorganismos. A biomassa celulósica também pode sersubmetida a um pré tratamento de explosão de vapor hidrotérmica (Ver aPatente U.S. Pedido N2 20020154730).
Sacarificação. Na etapa de hidrólise enzimática, tambémconhecida como sacarificação, as enzimas como aqui descritas sãoadicionadas ao material pré tratado para converter a fração de celulose paraglicose e/ou outros açúcares. A sacarificação é no geral realizada em reatoresou fermentadores de tanque agitado sob condições de pH, temperatura emistura controladas. Uma etapa de sacarificação pode durar até 200 horas, Asacarificação pode ser realizada em temperaturas de cerca de 30 0C a cerca de65 °C, em particular em torno de 50 0C e em um pH na faixa entre cerca de 4e cerca de 5, especialmente em torno do pH 4,5. Para produzir glicose quepode ser metabolizada pela levedura, a hidrólise é tipicamente realizada napresença de uma beta-glucosidase,
Fermentação. Na etapa de fermentação, os açúcares, liberadosdo material celulósico como um resultado das etapas de pré tratamento ehidrólise enzimática, são fermentados até etanol por um organismo defermentação, tal como levedura. A fermentação também pode ser realizadasimultaneamente com a hidrólise enzimática no mesmo vaso, mais uma vezsob condições de pH, temperatura e mistura controladas. Quando asacarificação e fermentação são realizadas simultaneamente no mesmo vaso,o processo é no geral chamado de sacarificação e fermentação simultâneas ouSSF.
Qualquer substrato celulósico ou matéria prima adequadospode ser usado em um processo de fermentação da presente invenção. Osubstrato é no geral selecionado com base no produto de fermentaçãodesejado, isto é, a substância a ser obtida a partir da fermentação e noprocesso utilizado, como é bem conhecido na técnica. Os exemplos desubstratos adequados para o uso nos métodos da presente invenção incluemmateriais contendo celulose, tais como madeira ou resíduos vegetais ouaçúcares de peso molecular baixo DP1-3 obtido a partir de material celulósicoprocessado que podem ser metabolizados pelo microorganismo defermentação e que podem ser fornecidos pela adição direta ao meio defermentação.
O termo "meio de fermentação" será entendido referir-se a ummeio antes que o(s) microorganismo(s) de fermentação seja(sejam)adicionado(s), tal como, um meio que resulta de um processo desacarificação, assim como um meio usado em um processo de sacarificação efermentação simultâneas (SSF).
"Microorganismo de fermentação" refere-se a qualquermicroorganismo adequado para o uso em um processo de fermentaçãodesejado. Os microorganismos de fermentação adequados de acordo com ainvenção são capazes de fermentar isto é, converter, açúcares, tais comoglicose, xilose, arabinose, manose, galactose ou oligossacarídeos direta ouindiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos demicroorganismos de fermentação incluem organismos fungicos, tais comolevedura. A levedura preferida inclui cepas da Saccharomyces spp. e emparticular, Saccharomyces eerevisiae. A levedura comercialmente disponívelinclui, por exemplo, Red Star®/Lesaffre Ethanol Red (disponível da RedStar/Lesaffre, USA) FALI (disponível da Fleischmann's Yeast, uma divisãoda Burns Philp Food Inc., USA), SUPERSTART (disponível da Alltech),GERT STRAND (disponível da Gert. Strand AB, Suécia) e FERMIOL(disponível da DSM Specialties).Em um forma de realização preferida, a levedura é umaSaccharomyces spp. Em uma forma de realização mais preferida, a levedura éSaeehammyees eerevisiae. Em uma outra forma de realização mais preferida,a levedura é Saccharomyees distatieus. Em uma outra forma de realizaçãomais preferida, a levedura é Sacchammyces uvarum. Em uma outra forma derealização preferida, a levedura é uma Kluyveromyces. Em uma outra formade realização mais preferida, a levedura é Klvyveromyces marxianus. Em umaoutra forma de realização mais preferida, a levedura é Kluyveromyces fragilis.
Em uma outra forma de realização preferida, a levedura é uma Candida, Emuma outra forma de realização mais preferida, a levedura é Candidapseudotropiealis. Em uma outra forma de realização mais preferida, alevedura é Candida brassieae. Em uma outra forma de realização preferida, alevedura é uma Clavispora. Em uma outra forma de realização mais preferida,a levedura é Clavispora lusitaniae. Em uma outra forma de realização maispreferida, a levedura é Clavispora opuntiae. Em uma outra forma derealização preferida, a levedura é uma Paehysolen. Em uma outra forma derealização mais preferida, a levedura é Paehysolen tannophilus. Em uma outraforma de realização preferida, a levedura é uma Bretannomyees. Em umaoutra forma de realização mais preferida, a levedura é Bretannomyeeselausenii (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, emHandbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed.,Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).
As bactérias que podem fermentar eficientemente glicose paraetanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridiumthermoeellum (Philippidis, 1996, supra).
É bem conhecido na técnica que os organismos descritosacima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como aquidescrito.
A clonagem de genes heterólogos em Saccharomyeescerevisiae (Chen, Z., Ho, N. W. Y., 1993, Cloning and improving theexpressão of Pichia stipitis xilose redutase gene in Saccharomyces cerevisiae,Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho, N. W. Y., Chen, Z.Brainard, A. P., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capableof effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64:1852-1859) ou em bactérias tais como Escherichia coli (Beall, D. S., Ohta,K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol production from xyloseand other sugars by recombinant Escherichia coli, Bioteeh. Bioeng. 38: 296-303); Klebsiella oxitoca (Ingram, L. O., Comes, P. F., Lai, X.,Moniruzzaman, M., Wood, B. E., Yomano, L. P., York, S. W., 1998,Metabolic engineering of bactéria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng,58: 204-214) e Zymomonas mobilis (Zhang. M. Eddy, C., Deanda, K.,Finkelstein, M. e Picataggio, S., 1995, Metabolic engineering of a pentosemetabolism pathway in etanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M., Eddy, C.: e Picataggio, S., 1996, Developmentof a arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathwayengineering, Appl. Environ. Microbial. 62: 4465-4470) tem levado àconstrução de organismos capazes de converter hexoses e pentoses paraetanol (co-fermentação).
Levedura ou um outro microorganismo tipicamente éadicionado à celulose degradada ou hidrolisado e a fermentação é continuadapor cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal como de cerca de 35 a cerca de 60horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26 0C a cerca de 40 °C,em particular em cerca de 32 0C e de cerca do pH 3 a cerca do pH 6, emparticular em torno do pH 4-5.
Em um forma de realização preferida, levedura ou um outromicroorganismo é aplicado à celulose degradada ou hidrolisado e afermentação é continuada por cerca de 24 a cerca de 96 horas, tal comotipicamente 35 a 60 horas, Em uma forma de realização preferida, atemperatura está no geral entre cerca de 26 a cerca de 40 °C, em particular decerca de 32°C e o pH é no geral de cerca de pH 3 a cerca de pH 6,preferivelmente em torno do pH 4-5. Levedura ou um outro microorganismosão preferivelmente aplicados em quantidades de aproximadamente 10 a 10 ,preferivelmente de aproximadamente 10 a 10 , de modo especial deaproximadamente 5 χ IO7 contagens viáveis por ml de caldo de fermentação.Durante uma fase de produção de etanol a contagem de célula de leveduradeve estar preferivelmente na faixa de aproximadamente 10 a 10 ,especialmente em torno de aproximadamente 2 χ 10 . Orientação adicionalcom respeito ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrado, porexemplo, em "The Alcohol Textbook (Editores K. Jacques, Τ. P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é por meiodeste incorporada por referência.
O processo mais amplamente usado na técnica é o processo desacarificação e fermentação simultâneas (SSF) onde não há estágio decontenção para a sacarificação, significado que a levedura e a enzima sãoadicionadas juntas.
Para a produção de etanol, a seguir da fermentação a massa édestilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com o processo dainvenção pode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível; etanol debeber, isto é, bebida alcoólica neutra potável ou etanol industrial.
Um estimulador de fermentação pode ser usado emcombinação com qualquer um dos processos enzimáticos aqui descritos paramelhorar ainda mais o processo de fermentação e em particular, odesempenho do microorganismo de fermentação, tal como, realce da taxa erendimento de etanol. Um "estimulador de fermentação" refere-se aosestimuladores para o cultivo do microorganismos de fermentação, emparticular, levedura. Os estimuladores de fermentação para cultivo incluemvitaminas e minerais. Os exemplos de vitaminas incluem multivitaminas,biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina,ácido para-aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B5 C, D eE. Ver, por exemplo, Alfenore et al., improving ethanol production andviability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy duringfed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é por meio deste incorporadapor referência. Os exemplos de minerais incluem minerais e sais mineraisque possam fornecer nutrientes que compreendam Ρ, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn,Mn e Cu
Recuperação. O álcool é separado do material celulósicofermentado e purificado pelos métodos convencionais de destilação. Etanolcom uma pureza de até cerca de 96 % em vol. de etanol pode ser obtido, quepode ser usado como, por exemplo, etanol de combustível, etanol de beber,isto é, bebidas alcoólicas neutras potáveis ou etanol industrial.
Para outras substâncias, qualquer método conhecido na técnicapode ser usado incluindo, mas não são limitados a, cromatografia (porexemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização eexclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo,focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo,precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, destilação ou extração.
Nos métodos da presente invenção, o polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase e outra(s) proteína(s) celulolítica(s) pode(m) sersuplementada(s) por uma ou mais atividades de enzima adicionais paramelhorar a degradação do material celulósico. As enzimas adicionaispreferidas são hemicelulases, esterases (por exemplo, lipases, fosfolipasese/ou cutinases), proteases, lacases, peroxidases ou misturas destas.
Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s)adicional(is) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação,incluindo durante ou depois da propagação do(s) microorganismo(s) defermentação.Peptídeos de Sinal
A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em queo gene é operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codificaum peptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a22 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 6 ouaminoácidos de 1 a 18 da SEQ ID NO: 8, em que o gene é estranho para aseqüência de nucleotídeo.
Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste dos nucleotídeos de 13 a 79 da SEQ ID NO: 1. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 17 a 73 da SEQ ID NO: 3. Em um outro aspectopreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste dosnucleotídeos de 53 a 106 da SEQID NO: 5.
A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes quecompreendem tais construções de ácido nucleico.
A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma proteína que compreende (a) cultivar uma tal célula hospedeirarecombinante sob condições adequadas para a produção da proteína: e (b)recuperar a proteína.
A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célulahospedeira. O termo "proteína" não é aqui intencionado a se referir a umcomprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos,oligopeptídeos e proteínas. O termo "proteína" também abrange dois ou maispolipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínastambém incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinaçãode seqüências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas a partir de pelomenos duas proteínas diferentes em que uma ou mais podem ser heterólogasou nativas para a célula hospedeira. As proteínas incluem ainda variaçõesalélicas que ocorrem naturalmente e variações engendradas das proteínasmencionadas acima e proteínas híbridas.
Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste,enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste ou repórter. Emum aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidorredutase, transferase,hidrolase, liase, isomerase ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, aproteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase,catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina, glicosiltransferase,desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase,glicoamilase, alfa-glucosidase, beta-glucosidase, invertase, lacase, uma outralipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase,fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminaseou xilanase.
O gene pode ser obtido a partir de qualquer procariótico,eucariótico ou outra fonte.
A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.
Exemplos
Materiais
Os produtos químicos usados como tampões e substratosforam produtos comerciais de pelo menos grau reagente.
Cepas
Thielavia terrestris NRRL 8126 e Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 foram usadas como a fonte dos polipeptídeosda Família 7 da glicosil hidrolase (CEL7) tendo atividade de endoglucanase.A cepa JaL250 de Aspergillus oryzae (WO 99/61651) foi usada para aexpressão dos polipeptídeos CEL7 de Thielavia terrestris, e a cepa HowB 104de Aspergillus oryzae (alfa-amilase negativa) foi usada para a expressão dospolipeptídeos CEL7 de Cladorrhinum foecundissimum.Meios
O meio YES foi composto de 0,5 % de extrato de levedura e 2% de glicose.
O meio de dextrose de batata foi composto por litro de 39gramas de dextrose de batata (Difco).
As placas de PDA foram compostas por litro de 39 gramas dedextrose de batata ágar.
O meio M400 foi composto por litro de 50 g de maltodextrina,2 g de MgS04-7H20, 2 g de KH2PO4, 4 g de ácido cítrico, 8 g de extrato delevedura, 2 g de uréia, 0,5 ml de solução de metais traço AMG, e 0,5 g decloreto de cálcio.
O meio MDU2BP foi composto por litro de 45 g de maltose, 1g de MgS04.7H20, 1 g de NaCl, 2 g de K2SO4, 12 g de KHSO4, 7 g de extratode levedura, 2 g de uréia, e 0,5 ml de solução de metais traço AMG, pHajustado a 5,0.
A solução de metais traço AMG foi composta por litro de 14,3g de ZnS04-7H20, 2,5 g de CuS04.5H20, 0,5 g de NiCl2.6H20, 13,8 g deFeSO4JH2O, 8,5 g de MnSO4-H2O e 3 g de ácido cítrico.
O meio NNCYPmod foi composto por litro de 1,0 g de NaCl,5,0 g de NH4NO3, 0,2 g de MgSO4JH2O, 0,2 g de CaCl2, 2,0 g de ácidocítrico, 1,0 g de Bacto Peptona, 5,0 g de extrato de levedura, solução demetais traço COVE, e K2HPO4 suficiente para obter um pH final deaproximadamente 5,4.
A solução de metais traço COVE foi composta por litro de0,04 g de Na2B4O7-IOH2O, 0,4 g de CuS04.5H20, 1,2 g de FeS04.7H20, 0,7 gde MnSO4-H2O, 0,8 g de Na2Mo02.2H20, e 10 g de ZnSO4JH2O.
O meio LB foi composto por litro de 10 g de triptona, 5 g deextrato de levedura, e 5 g de cloreto de sódio.As placas de LB foram compostas por litro de 10 g de triptona,5 g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 15 g de Bacto Agar.
O meio SOC foi composto de 2 % de triptona, 0,5 % de extratode levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 10 mM deMgSC>4, e glicose esterilizada em filtro a 20 mM, adicionada depois daautoclavagem.
O meio de congelamento foi composto de 60 % de meio SOCe 40 % de glicerol.
O meio 2X YT foi composto por litro de 16 g de triptona, IOgde extrato de levedura, 5 g de NaCl, e 15 g de Bacto ágar.
O meio PD com celulose foi composto por litro de 24 gramasde dextrose de batata (Difco) e 30 gramas de Solcafloc (Diacel disponível daDicalie-Europe-Nord, Gent, Bélgica).
SC-ágar foi composto por litro de meio SC-URA (com glicoseou galactose como indicado) e 20 g de ágar.
As placas de 0,1 % AZCL HE celulose SC ágar com galactoseforam compostas por litro de meio SC-URA com galactose, 20 g de ágar, e0,1 % de AZCL HE celulose (Megazyme, Wicklow, Irlanda).Exemplo 1: Identificação de CEL7C endoglucanase de Thielavia terresírisNRRL 8126
Um tampão de agarose de uma placa fresca de Thielaviaterresíris NRRL 8126 cultivada em meio NNCYPmod suplementado com 1% de Sigmacell (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) foi inoculado em50 ml de meio NNCYPmod suplementado com 1 % de glicose e incubado a45 °C e 200 rpm por 25 horas. Dois ml desta cultura foram usados parainocular 15 χ 100 ml (frasco de 500 ml) e 2 χ 50 ml (frasco de 250 ml) demeio NNCYPmod suplementado com 2 % de Sigmacell-20 e foi incubado a45 °C, 200 rpm por 4 dias. As culturas foram reunidas e centrifugadas a 3000χ g por 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado através de um pré filtro defibra de vidro Nalgene 281-5000 (Naige Nunc Intl. Rochester, NY5 USA). Ofiltrado foi esfriado a 4 0C para a armazenagem.
O filtrado foi depois filtrado de novo (membrana GP Express,polietersulfona, 0,22 μm, Millipore, Bedford, MA, USA), o tampão trocadocom 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 (Pall Filtron. North Borough, MA,membrana de polietersulfona de 10 kDa, aproximadamente 10 a 20 psi (69 a138 kPa)), e concentrado usando um dispositivo de ultrafiltração Amicon(Millipore, Bedford, MA, membrana de 10 kDa, 40 psi (276 kPa), 4 °C). Aamostra concentrada foi dessalinizada e trocada de tampão pela passagem emuma coluna 10DG EconoPAC (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) equilibrada econduzida com 20 mM de Tris-HCl pH 8,2. As concentrações de proteínaforam determinadas usando um Kit de Ensaio de proteína BCA (Pierce,Rockford, IL, USA) em que a albumina sérica bovina foi usada como umpadrão de proteína. As frações que contiveram proteína foram carregadas emuma coluna de Fluxo Rápido de 5 ml Hi Trap Q Sepharose® (AmershamPharmacia, Uppsala Suécia) equilibrada com 20 mM de Tris-HCl5 pH 8,2 emum AKTA FPLC System (Amersham Pharmacia, Uppsala Suécia) conduzidoa uma taxa de fluxo de 2 ml por minuto. Antes da elução a coluna foi lavadacom cinco volumes de coluna de tampão de partida. O material ligado foieluído com um gradiente linear de 0 a 1,0 M de NaCl (20 volumes de coluna;frações de 2 ml) em 20 mM de Tris-HCl pH 8,2. Com base no perfil de UV a280 nm, as frações individuais foram reunidas para análise mais adiante. Asfrações reunidas eluindo entre aproximadamente 10 e 210 mM de NaCl foramconcentradas usando um aparelho Amicon, como descrito acima. Umaalíquota deste material foi submetida à eletroforese em um gel de SDS-PAGEcom 8 a 16 % de Tris-Glicina (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) esubmetida à eletroforese a 200 V por 1 hora. Os padrões de peso molecularPrecision (BioRad, Hercules, CA, USA) foram incluídos e usados para adeterminação de peso molecular. Os géis foram tingidos para proteína usandoBiosafe Coomassie Stain (BioRad, Hercules, CA, USA) de acordo com oprotocolo sugerido pelo fabricante.
Uma faixa migrando em aproximadamente 61 kDa foiexcisada do gel e submetida às digestão em gel e de novo seqüenciamentousando a espectrometria de massa em tandem.
Digestão em gel de polipeptídeos para o seqüenciamento depeptídeo. Um MultiPROBE® Liquid Handling Robot (PerkinElmer Life andAnalytical Sciences, Boston, MA, USA) foi usado para realizar as digestõesem gel. Duas manchas de gel dimensionais contendo os polipeptídeos deinteresse foram reduzidas com 50 μΐ de ditiotreitol (DTT) a 10 mM em 100mM de bicarbonato de amônio pH 8,0 por 30 minutos na temperaturaambiente. A seguir da redução, os pedaços de gel foram alquilados com 50 μΐde iodoacetamida a 55 mM em 100 mM de bicarbonato de amônio pH 8,0 porminutos. Os pedaços de gel secados foram deixados intumescer em uma15 solução de digestão de tripsina (6 ng/μΐ de tripsina grau de seqüenciamento(Promega, Madison, WI, USA) em 50 mM de bicarbonato de amônio pH 8)por 30 minutos na temperatura ambiente, seguido por uma digestão de 8 horasa 40 °C. Cada uma das etapas de reação descritas foi seguida por numerosaslavagens e pré-lavagens com as soluções apropriadas seguindo o protocolopadrão do fabricante. Cinqüenta μΐ de acetonitrila foram usados paradesidratar o gel entre as reações e os pedaços de gel foram secados ao ar entreas etapas. Os peptídeos foram extraídos duas vezes com 1 % de ácidofórmico/2 % de acetonitrila em água de grau HPLC por 30 minutos. Assoluções de extração de peptídeo foram transferidas para uma placa tipo PCRde 96 reservatórios limitadas (ABGene, Rochester5 NY, USA) que foramesfriadas de 10 a 15 0C e cobertas com uma tampa de placa de 96reservatórios (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Boston, MA, USA)para impedir a evaporação. As placas foram ainda armazenadas a 4 0C até quea espectrometria de massa pudesse ser realizada.Seqüenciamento de peptídeo pela espectrometria de massa emtandem. Para o seqüenciamento de peptídeo pela espectrometria de massa emtandem, um espectrômetro de massa de tempo de vôo Q-Tof micro®quadripolar ortogonal híbrido (Waters Micromass® MS Technologies,Milford. MA, USA) foi usada para a análise de LC-MS/MS. O espectrômetrode massa Q-Tof micro® foi adaptado com um capilar Ultimate® e sistema deHPLC de nano-fluxo (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) que foi ligado com ummicro autoamostrador FAMOS (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) e umdispositivo de interrupção de coluna Switchos 11 (Dionex, Sunnyvale, CA,USA) para concentrar e dessalinizar as amostras. Seis μΐ da solução depeptídeo recuperada da digestão em gel foram carregados em uma colunaguarda (300 μηι ID χ 5 cm, Cl 8 PepMap®) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)adaptado na alça de injeção e lavada com 0,1 % de ácido fórmico em água a40 μl/minuto por 2 minutos usando uma bomba Switchos II (Dionex,Sunnyvale, CA, USA). Os peptídeos foram separados em uma coluna capilarfundida de nanofluxo de 75 μηι ID χ 15 cm, C18, 3 μηι, IOOA PepMap®(Dionex. Sunnyvale. CA, USA) a uma taxa de fluxo de 175 nl/minuto de umfluxo dividido de 175 μΐ/minuto usando um calibrador NAN-75 (Dionex,Sunnyvale, CA, USA). O gradiente de elução linear foi de 5 % a 60 % deacetonitrila em 0,1 % de ácido fórmico aplicado em um período de 45minutos. O eluente de coluna foi monitorado a 215 nm e introduzido noespectrômetro de massa Q-Tof micro® através de uma fonte de íon deeletropulverização adaptada com a interface de nanopulverização. Oespectrômetro de massa Q-Tof micro® foi totalmente controlado pelomicroprocessador usando o software MassLynx® versão 3.5 (WatersMicromass® MS Technologies, Milford, MA, USA). Os dados foramadquiridos no modo de escaner de inspeção e a partir de uma faixa de massade 50 a 2000 m/z com critérios de interrupção de MS para MS/MS paraincluir uma intensidade iônica maior do que 10,0 contagens/segundo e estadosde carga de +2, +3 e +4. Os espectros de análise de até 4 espécies co-eluindocom um tempo de varredura de 1,9 segundos e tempo de inter-varredura de0,1 segundo puderam ser obtidos. Uma voltagem de cone de 65 volts foitipicamente usada e a energia de colisão foi programada para ser variada de acordo com a massa e o estado da carga do peptídeo eluindo e na faixa de 10a 60 volts. Os espectros adquiridos foram combinado, aplainados, ecentralizados em uma maneira automatizada e uma lista de pico gerada. Alista de pico gerada foi pesquisada contra bases de dados selecionadas usandoo software ProteinLynx® Global Server 1.1 (Waters Micromass® MS Technologies, Milford, MA, USA). Os resultados das pesquisas comProteinLynx® foram avaliadas e as proteínas não identificadas foramanalisadas mais uma vez avaliando-se os espectros de MS/MS de cada íon deinteresse e a seqüência de novo determinada pela identificação da série de íony e b e emparelhando as diferenças de massa com o aminoácido apropriado. As seqüências de peptídeo da Thielavia terrestris CEL7Cendoglucanase do seqüenciamento de novo pela espectrometria de massaforam obtidas a partir de diversos íons multiplamente carregados para a faixade gel de polipeptídeo de aproximadamente 61 kDa. Um íon de peptídeotrípitico duplamente carregado de 933,49 m/z foi determinado ser Phe-[lie ou Leu]-Thr-Asp-Asp-Gly-Thr-Thr-S er-Gly-Thr- [Ile-Leu] -Asn- [Gln-Ly s] - [Ile-Leu]-[Gln-Lys]-Arg (aminoácidos de 256 a 272 da SEQ ID NO: 2). Umsegundo íon de peptídeo tríptico duplamente carregado de 1108,58 tambémfoi seqüenciado de novo e uma seqüência parcial foi determinada ser Tyr-Gly-Pro-Gly-[Ile-Leu]-Thr-Val-Asp-Thr-Ser-[Lys-Gln] (aminoácidos de 238 a 248 da SEQ ID NO: 2).
Exemplo 2: Extração de DNA genômico de Thielavia terrestris NRRL8126
Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 25 ml demeio YEG a 37ºC e 250 rpm por 24 horas. Micélios foram depois coletadospela filtração através Miracloth® (CalBiochem, La Jolla, CA3 USA) e lavadouma vez com 25 ml de tampão de 10 mM de Tris-I mM de EDTA (TE). Otampão em excesso foi drenado da preparação de micélios, que foisubseqüentemente congelada em nitrogênio líquido. A preparação de micélioscongelados foi triturada a um pó fino em um moedor de café elétrico e o pófoi adicionado a um tubo de centrífuga plástico descartável contendo 20 ml detampão de TE e 5 ml de 20 % p/v de dodecil sulfato de sódio (SDS). Amistura foi suavemente invertida várias vezes para garantir a mistura eextraída duas vezes com um volume igual de fenol:clorofórmio:álcoolisoamílico (25:24:1 v/v/v). Acetato de sódio (solução 3 M) foi adicionada àamostra extraída a uma concentração final de 0,3 M seguida por 2,5 volumesde etanol gelado para precipitar o DNA. O tubo foi centrifugado a 15.000 χ gpor 30 minutos para pelotizar o DNA. A pelota de DNA foi deixada secar aoar por 30 minutos antes da recolocação em suspensão em 0,5 ml de tampãoTE. A ribonuclease A isenta de Dnase foi adicionada à pelota de DNArecolocada em suspensão a uma concentração de 100 μg por ml e a misturafoi depois incubada a 37°C por 30 minutos. A proteinase K (200 μg/ml) foiadicionada e o tubo foi incubado um adicional de uma hora a 37°C.Finalmente, a amostra foi centrifugada por 15 minutos a 12.000 χ g e osobrenadante foi aplicado a um tubo de distribuição Qiaprep® 8 (QIAGENInc., Valencia, CA, USA). As colunas foram lavadas duas vezes com 1 ml dePB (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) e 1 ml de PE (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA) sob vácuo. O DNA isolado foi eluído com 100 μl detampão de TE, precipitado com etanol, lavado com 70 % de etanol, secadosob vácuo, recolocado em suspensão em tampão TE e armazenado a 4 °C.
Para gerar o DNA genômico para a amplificação pela PCR,Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 50 ml de meio NNCYPsuplementado com 1 % de glicose em um frasco agitado com defletor a 42°Ce 200 rpm por 24 horas. Os micélios foram colhidos pela filtração, lavadosduas vezes em tampão de TE e congelados sob nitrogênio líquido. Um pedaçodo tamanho de uma ervilha de micélios congelados foi colocado emsuspensão em 0,7 ml de dodecil sulfato de lítio a 1 % em tampão TE erompidos pela agitação com um volume igual de pérolas de zircônia/sílica de0,1 mm (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK, USA) por 45 segundos emum FastPrep FP120 (ThermoSavant, Holbrook. NY, USA). Os escombrosforam removidos pela centrifugação a 13.000 χ g por 10 minutos e osobrenadante depurado foi levado a 2,5 M de acetato de amônio e incubadosem gelo por 20 minutos. Depois do período de incubação, os ácidos nucleicosforam precipitados pela adição de 2 volumes de etanol. Depois dacentrifugação por 15 minutos em uma microcentrífuga a 4 °C, a pelota foilavada em 70 % de etanol e secada ao ar. O DNA foi recolocado emsuspensão em 120 μΐ de 0,1 X TE e incubados com 1 μΐ de RNase A isento deDNase a 37 0C por 20 minutos. Acetato de amônio foi adicionado a 2,5 M e oDNA foi precipitado com 2 volumes de etanol. A pelota foi lavada em etanola 70 %, secada ao ar e recolocada em suspensão em tampão TE.Exemplo 3: Clonagem de um gene que codifica uma CEL7Cendoglucanase de Thielavia terrestris NRRL 8126
A espectrometria de massa, como descrita no Exemplo 1,revelou uma seqüência parcial de um peptídeo duplamente carregado demassa 933,49 como sendo TDDGTTSGT[I/L]NQ[I/L]QR (aminoácidos de258 a 272 da SEQ ID NO: 2). Um iniciador de filamento de oligonucleotídeode anti-sentido CODEHOP (Rose et al,. 1998, Nucleic Acids Res. 26: 1628-35) foi designado para a porção da seqüência mostrada acima em negrito(aminoácidos 259 a 267 da SEQ ID NO: 2). A seqüência iniciadora émostrada abaixo.
5'-AGGGTGCCGCTGGTNGTNCCRTCRTC-3' (SEQ ID NO: 7)
Um segundo iniciador de filamento de sentido CODEHOP foidesignado com base nas seqüências conservadas presentes em muitas glicosilhidrolases da Família 7, especificamente AGAKYGTGYCD (aminoácidos de164 a 173 da SEQ ID NO: 2; os resíduos mostrados em negrito foramdescobertos serem conservados em CEL7C). A seqüência iniciadora émostrada abaixo.
5 '-AGCTGGTGCTA, WATGGTACTGGNTAYTGYGA-3' (SEQ IDNO: 8)
A amplificação pela PCR foi realizada em um volume de 30 μΐcontendo tampão IX AmpliTaq (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA,USA), 1,5 unidades de AmpliTaq DNA polimerase (Applied Biosystems,Inc., Foster City, CA, USA), 1 μΜ de cada um dos iniciadores de sentido eanti-sentido, e aproximadamente 1 μ§ de DNA genômico de Thielaviaterrestris NRRL 8126. A amplificação foi realizada em um RoboCycler®(Stratagene, La Jolla, CA, USA) programado para 1 ciclo a 96 °C por 3minutos e a 72 °C por 3 minutos (durante o que a DNA polimerase foiadicionada); e 35 ciclos cada um a 94 °C por 45 segundos, 52 °C, 55 °C ou 58°C por 45 segundos, e 72 °C por 1 minuto, seguido por uma extensão final de7 minutos a 72 °C.
Os produtos de reação foram fracionados pela eletroforese emgel de agarose a 3 % usando 40 mM de tampão Tris base-20 mM de acetatode sódio-1 mM de EDTA dissódico (TAE) e uma faixa de aproximadamente300 pares de base foi excisada, purificada usando um Kit de Extração em GelQIAEXO II (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), e subclonada usando umKit TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O plasmídeo de umtransformante da E. coli foi seqüenciado e descoberto conter um inserto de315 pares de base que codifica uma proteína da Família 7 de glicosil hidrolaseprognosticada (CEL7C). Este plasmídeo foi designado pPH32 (Figura 1).Exemplo 4: Identificação de CEL7E endoglucanase de Thielavia terrestrisNRRL 8126
Um tampão de agarose de uma placa fresca de Thielaviaterrestris NRRL 8126 cultivada em meio NNCYPmod suplementado com 1% de Sigmacell foi inoculada em 25 ml de meio NNCYPmod suplementadocom 2 % de Sigmacell e incubado a 42 °C e 150 rpm por 3 dias. O caldo foifiltrado através de um pré filtro de fibra de vidro Nalgene 281-5000. Ofiltrado foi esfriado a 4 °C para a armazenagem.
Eletroforese em gel de poliacrilamida bi-dimensional. Três mlde filtrado das culturas reunidas descritas no Exemplo 1 foram precipitadospela adição de 30 μΐ de beta-mercaptoetanol e 300 μl de ácido tricloroacéticosaturado (solução saturada em água a 4 °C), e incubando por 10 minutos emgelo seguido pela adição de 30 ml de acetona gelada e incubação adicional emgelo por 30 minutos. A solução precipitada foi centrifugada a 10.000 χ g por10 minutos a 4 °C, o sobrenadante decantado, e a pelota enxaguada duasvezes com acetona gelada e secada ao ar. A pelota seca foi dissolvida em 0,2ml de tampão de amostra de focalização isoelétrica (IEF) (9,0 M de uréia, 3,0% (p/v) 3-[(3-colamidopropil) dimetil-amônio]-l-propanossulfonato(CHAPS, Pierce Chemical Co. Rockford, IL, USA), 1 % (v/v pH 4 a 7anfólitos, 1 % de beta-mercaptoetanol: e 0,005 % de azul de bromofenol emágua destilada). A solução de estoque de uréia foi deionizada usando resina deleite misto AG 501-X8 (D), malha 20-5, da BioRad Laboratories (Hercules,CA, USA). A solução deionizada foi armazenada a -20 °C. A misturaresultante foi deixada solubilizar por várias horas com mistura suave em umAgitador LabQuake® (Lab Industries, Berkeley, CA, USA). A mistura detampão-proteína de amostra foi aplicada a uma tira de 11 cm de IPG (BioRadLaboratories, Hercules, CA, USA) em uma bandeja de reidratação de IPG(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Uma alíquota de 750 μΐ defluido de cobertura de tira seca (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ,USA) foi depositada em camada sobre as tiras de IPG para impedir aevaporação e deixada re-hidratar por 12 horas enquanto se aplica 30 voltsusando uma Unidade de Focalização Isoelétrica IPGPhor (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ5 USA) a 20 °C. A Unidade EPGPhor foiprogramada para voltagem constante mas com uma corrente máxima de 50μΑ por tira. Depois de 12 horas de re-hidratação, as condições de focalizaçãoisoelétrica foram como segue: 1 hora a 200 volts, 1 hora a 500 volts, e 1 horaa 1000 volts. Depois um gradiente foi aplicado de 1000 volts a 8000 volts por30 minutos e a focalização isoelétrica foi programada para funcionar a 8000volts e foi completa quando >30.000 volt hora foi obtido, as tiras de gel deIPG foram reduzidas e alquiladas antes da análise de segunda dimensãoreduzindo-se primeiro por 15 minutos em 100 mg de ditiotreitol por 10 ml detampão de equilíbrio de SDS (50 rnM de Tris HCl pH 8,8, 6,0 M de uréia, 2% (p/v) de dodecilsulfato de sódio (SDS), 30 % de glicerol, e 0,002 % (p/v)azul de bromofenol) seguido por 15 minutos de alquilação em 250 mg deiodoacetamida por 10 ml de tampão de equilíbrio no escuro. As tiras de IPGforam rapidamente enxaguadas em tampão de condução de SDS-PAGE(lnvitrogen/Novex, Carlsbad, CA, USA) e colocadas em um gel de SDS-PAGE de 11 cm, 1 reservatório 8 a 16 % de Tris-Glicina (BioRadLaboratories, Hercules, CA, USA) e submetidas à eletroforese usando umaunidade de eletroforese Criterion (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)a 50 volts até que a amostra entrasse no gel e depois a voltagem foiaumentada para 200 volts e deixada funcionar até que o corante de azul debromofenol atingisse o fundo do gel.
Detecção de Polipeptídeo. O gel bi-dimensional foi tingidocom um SYPRO Orange Protein Stain fluorescente (Molecular Probes,Eugene, OR, USA). Os métodos de fingimento fluorescente foram otimizadose adaptados a partir de Malone et ai., 2001, Electrophoresis, 22, 919-932. Osgéis de SDS-PAGE foram fixados em 40 % de etanol, 2 % de ácido acético, e0,0005 % de SDS em um oscilador de plataforma por 1 hora até durante anoite. A solução fixadora foi removida e substituída com três etapas delavagem repetidas consistindo de 2 % de ácido acético e 0,0005 % de SDSpor 30 minutos cada. Os géis foram tingidos por 1,5 hora até durante a noiteno escuro com 2 % de ácido acético, 0,0005 % de SDS, e 0,02 % de SYPROOrange Protein Stain. O tingimento e destingimento foram ainda otimizadospara melhorar a reprodutibilidade e automação em uma Hoefer Processor PlusStaining Unit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). As imagensdos géis de SDS-PAGE tingidos fluorescentes foram obtidas varrendo-se emum Molecular Dynamics STORM 860 Imaging System (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ, USA) usando fluorescência azul e tamanhos depixel de 200 μm e um ganho de tubo fotomultiplicador de 800 V. As imagensforam visualizadas e ajustadas usando o software ImageQuant versão 5.0(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). Os géis foram visualizadosainda em um transiluminador Dark Reader Blue com um filtro laranja (ClareChemical Co, Denver, CO, USA), as manchas de gel de proteína observadasforam excisadas usando um Punção de Biópsia Acu-Punch de 2 mm(Acuderm Inc., Ft. Lauderdale, FL, USA) e armazenadas em placas denoventa e seis reservatórios que foram pré-lavadas com 0,1 % de ácidotrifluoroacético (TFA) em 60 % de acetonitrila seguido por duas lavagensadicionais com água grau HPLC. As manchas de gel bi-dimensional tingidaforam armazenadas em 25-50 μΐ de água nas placas pré lavadas a -20 0C atédigeridas.
Uma mancha de gel 2D que corresponde a um peso molecularaproximado de 50 kDa e um ponto isoelétrico aproximado de 5,0 foi digeridono gel com tripsina e submetida ao seqüenciamento de novo como descrito noExemplo 1. Um íon de peptídeo trípitico duplamente carregado de 1114,516m/z foi determinado ser Ser-Pro-Leu-Asn-Pro-Ala-Gly-Ala-Thr-Tyr-Gly-Thr-Gly-Tyr-Cam-Asp-Ala-Gln-Cam-Pro-Lys (aminoácidos de 156 a 176da SEQ ID NO: 5 onde Cam é carboxiamidometilcisteína).
Um iniciador de oligonucleotídeo de filamento de sentidoCODEHOP foi designado a uma porção da seqüência mostrada em negritoacima (168 a 176 da SEQ ID NO: 4). A seqüência iniciadora é mostradaabaixo.
5'-GGCTACTGCGACGCCCARTGYCNAA-3' (SEQID NO: 9)
Um segundo iniciador de filamento de anti-sentido CODEHOPfoi designado com base nas seqüências conservadas presentes em muitasglicosil hidrolases da Família 7, especificamente CCNEMDIWEAN (todos osaminoácidos foram subseqüentemente descobertos serem conservados emCEL7E de 193 a 203 da SEQ ID NO: 4). A seqüência iniciadora foi:
5'-CCTCCCAGATRTCCATYTCGTTRCARCA-3' (SEQ ID NO: 10)
A PCR foi realizada em um volume de 30 μl contendo tampão1x AmpliTaq, 1,5 unidades de Tag DNA polimerase (New England Biolabs,Ipswich, MA, USA), 1 μΜ de cada um dos iniciadores de sentido e anti-sentido, e aproximadamente 1 μg de DNA genômico de Thielavia terrestrisNRRL 8126 (preparado como descrito no Exemplo 2). A amplificação foirealizada em um Stratagene Robociclor® programado para 1 ciclo a 96 °C por3 minutos e 72 °C por 3 minutos (durante o que a DNA polimerase foi15 adicionada), 35 ciclos cada um a 94 °C por 45 segundos, 53 °C. 56 °C, ou 59°C por 45 segundos, e 72 °C por 1 minuto, seguido por uma extensão final de7 minutos a 72 °C.
Os produtos de reação foram fracionados em um gel a 3 % deagarose usando tampão TAE e uma faixa de aproximadamente 180 pares debase foi excisada, purificada usando um Kit de Extração de Gel QIAEX® II(QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA), e subclonado usando um Kit TOPO TA(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). O plasmídeo de um transformante E. colifoi seqüenciado e descoberto conter um inserto de 169 pares de base quecodifica uma proteína da Família 7 da glicosil hidrolase prognosticada(CEL7E). Este plasmídeo foi designado pPH37 (Figura 2).
Exemplo 5: Construção de biblioteca de DNA Genômico de Thielaviaterrestris NRRL 8126As bibliotecas de DNA Genômico foram construídas usando ovetor de clonagem de bacteriofago AZipLox (Life Technologies,Gaithersburg, MD, USA) com células Y1090ZL de E. coli (LifeTechnologies, Gaithersburg, MD, USA) como um hospedeiro paraplaqueamento e purificação de bacteriofago recombinante e DHlOBzip de E.coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) para a excisão de clonespZLl individuais contendo o gene GH61B.
O DNA genômico de Thielavia terrestris NRRL 8126,preparado como descrito no Exemplo 2 foi parcialmente digerido com Tsp5091 e fracionados por tamanho em 1 % de géis de agarose usando tampãoTAE. Os fragmentos de DNA que migram na faixa de tamanho de 3 a 7 kbforam excisados e eluídos do gel usando reagentes Prep-a-Gene (BioRadLaboratories, Hercules, CA, USA).
Os fragmentos de DNA eluídos foram ligados com ramos dovetor AZipLox clivado com Eco RI e desfosforilado (Life Technologies,Gaithersburg, MD, USA), e as misturas de ligação foram empacotadas usandoextratos de empacotamento comerciais (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Asbibliotecas de DNA empacotadas foram plaqueadas e amplificadas nas célulasda E. coli Y1090ZL. A biblioteca de DNA genômico não amplificada conteve3,1 X 106 pfu/ml (títulos de fundo sem nenhum DNA foram 2,0 X 104 pfii/ml.
Exemplo 6: Identificação de clones cel7c e cel7e de Thielevia terrestrisNRRL 8126
Fragmentos de sonda de gene cel7c e cel7e de Thielaviaterrestris foram amplificados a partir de pPH32 e pPH37, respectivamente,usando iniciadores homólogos ao vetor TOPO e Herculase® DNA Polimerase(Stratagene, La Jolla, CA, USA), como mostrado abaixo.
5 '-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTA-3' (SEQ ED NO: 11)5'-ATAGGGCGAATTGGGCCCTCTAGAT-3' (SEQ ID NO: 12)
Cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores foram usadosem uma reação de PCR contendo 10 ng de pPH32 ou pPH37, Tampão deAmplificação IX Herculase® (Stratagene, La Jolla, CA, USA), 1 μΐ demistura a 10 mM de dATP, dTTP, dGTP e dCTP, e 2,5 unidades deHerculase® DNA Polimerase em um volume final de 50 μΐ. A amplificaçãofoi realizada em um Stratagene Robociclor® programado para 1 ciclo a 94 0Cpor 1 minuto; e 20 ciclos cada um a 94 0C por 30 segundos, 55 0C por 30segundos, e 72 0C por 1 minuto. O bloco de aquecimento depois foi a umciclo de embebimento a 4 °C. Os produtos de reação foram isolados em umgel de agarose a 1,0 % usando tampão TAE onde três faixas de produto de <400 pares de base foram excisadas do gel e purificadas usando um Kit deExtração em Gel QIAquick® (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordocom as instruções do fabricante. Vinte e cinco ng de cada fragmento foramradiorrotulados com P usando um Kit Prime-It® II (Stratagene, La Jolla,CA, USA).
Aproximadamente 90.000 placas da biblioteca descrita noExemplo 5 foram tríadas pela hibridização de placa usando os doisfragmentos de PCR rotulados como as sondas. O DNA foi reticulado sobremembranas (Hybond N+, Amersham, Arlington Heights, IL, USA) usandoum UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Cada fragmento de generadiorrotulado com P foi desnaturado pela adição de hidróxido de sódio auma concentração final de 0,1 M, e adicionado a uma solução de hibridizaçãocontendo 6X SSPE, 7 % de SDS a uma atividade de aproximadamente 1 χ IO6cpm por ml de solução de hibridização. Cada uma das misturas foi incubadadurante a noite a 55 0C em um banho de água sob agitação. A seguir daincubação, as membranas foram lavadas 3 vezes por 15 minutos em 0,2X SSCcom 0,1 % de SDS a 65 °C. As membranas foram secadas em mata borrão por15 minutos, enroladas em SaranWrap®, e expostas à película de raio Xdurante a noite a 70 0C com telas intensificadoras (Kodak, Rochester, NY,USA).Com base na produção de sinais de hibridização fortes com assondas descritas acima, diversas placas foram escolhidas para outro estudo.As placas foram purificadas duas vezes em células de E. coli Y1090ZL e osgenes inseridos e o plasmídeo pZLl foram subseqüentemente excisados dovetor AZipLox como derivados de pZLl (D'Alessio et al, 1992, Focus® 14:76) usando a excisão in vivo pela infecção de células de E. coli DHl OBZL(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). As colônias foram inoculadasem três ml de meio LB suplementado com 50 μg de ampicilina por ml ecultivadas durante a noite a 37 °C. O DNA Miniprep foi preparado a partir decada uma destas culturas usando um BioRobot 9600 (QIAGEN Inc.,Valencia, CA, USA). Um clone designado pPH50 (Figura 3) foi mostradopelo seqüenciamento de DNA conter o gene genômico de tamanho naturalpara cel7c e um clone designado pPH38 (Figura 4) foi mostrado peloseqüenciamento de DNA conter o gene de tamanho natural para cel7e.
PaHa50 da E. coli contendo plasmídeo pPH50 (Figura 3) ePaHa38 da E. coli contendo plasmídeo pPH38 (Figura 4) foram depositadoscom a Agricultural Research Service Patent Culture Collection, NorthernRegional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604,como NRRL B-30899 e NRRL B-30896, respectivamente, com uma data dedepósito de 23 de fevereiro de 2006.
Exemplo 7: Caracterização das seqüências genômica de Thielaviaterrestris que codificam endoglucanases CEL7C e CEL7E
O seqüenciamento de DNA dos clones genômicos cel7c ecel7e de Thielavia terrestris foi realizada com um Seqüenciador de DNAAutomatizado Modelo 3700 da Applied Biosystems usando a química determinador BigDye® versão 3.1 e a química de dGTP (Applied Biosystems,Inc., Foster City, CA. USA) e a estratégia caminhante de iniciador. Os dadosde seqüência de nucleotídeo foram escrutinizados quanto a qualidade e todasas seqüências foram comparadas entre si com assistência do softwarePHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA5 USA).
Os modelos de gene para as seqüências de DNA genômico decel7c e cel7e de Thielavia terrestris foram construídos com base nasimilaridade aos genes homólogos de Trichoderma reesei (número de acessoQ5BMS5) e Fusarium oxysporum (número de acesso P46237).
A seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) do gene cel7C de Thielavia terrestrissão mostradas nas Figuras 5A e 5B. A seqüência codificadora tem 1452 paresde base incluindo o códon de parada e é interrompido por um íntron de 57pares de base. A proteína prognosticada codificada tem 464 aminoácidos. A% G+C da seqüência codificadora do gene é de 63,7 % e a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro tem 63,8 %. Usando o programa SignalP(Nielsen et ai., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 22resíduos foi prognosticado. A proteína madura prognosticada contém 442aminoácidos com uma massa molecular de 46,5 kDa. A análise da seqüênciade aminoácido deduzida do gene cel7c com o programa InterProScan(Zdobnov e Apweiler, 2001, Bioinformatics 17: 847-848) mostrou que opolipeptídeo CEL7C conteve a assinatura de domínio da Família 7 daglicosídeo hidrolase (número de acesso InterPro IPR001722) deaproximadamente 2 a 376 aminoácidos do polipeptídeo maduro. CEL7Ctambém conteve a assinatura de seqüência do domínio de ligação da celulosefüngica. Esta assinatura de seqüência conhecida como Prosite pattemP500562 (Sigrist et al., 2002, BriefBioinform. 3: 265-274) foi descoberta apartir de aproximadamente aminoácidos 414 a 441 do polipeptídeo maduro.
Um alinhamento global aos pares comparativo de seqüênciasde aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol, Biol. 48: 443-453) como implementadono programa Needle de EMBOSS com penalidades de abertura de intervalode 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene daThielavia terrestris que codifica o polipeptídeo maduro CEL7C tendoatividade de endoglucanase compartilha 76 % e 70 % de identidade(excluindo intervalos) com as seqüências de aminoácido deduzidas de duasproteínas da Família 7 da glicosil hidrolase de Aspergillus fumigatus eTrichoderma reesei, respectivamente (números de acesso Q4WCM9 eP07981, respectivamente).
A seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 3) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 4) do gene cel7e de Thielavia terrestrissão mostradas nas Figuras 6A e 6B. A seqüência codificadora tem 1336 paresde base incluindo o códon de parada e é interrompido por um íntron de 64pares de base, A proteína prognosticada codificada tem 423 aminoácidos. A% G+C da seqüência codificadora do gene é de 66,6 % e a seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro tem 66,5 %. Usando o programa SignalP(Nielsen et al., 1997, supra), um peptídeo de sinal de 19 resíduos foiprognosticado. A proteína madura prognosticada contém 404 aminoácidoscom uma massa molecular de 43,4 kDa. A análise da seqüência deaminoácido deduzida do gene cel7e com o programa InterProScan (Zdobnove Apweiler, 2001 supra) mostrou que o polipeptídeo CEL7E conteve aassinatura de domínio da Família 7 de glicosídeo hidrolase (número de acessoInterPro IPROO1722) de aproximadamente aminoácidos 2 a 400 dopolipeptídeo maduro.
Um alinhamento global aos pares comparativo das seqüênciasde aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programaNeedle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10,penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do gene daThielavia terrestris que codifica o polipeptídeo maduro CEL7E tendoatividade de endoglucanase compartilha 65 %, 63 %, e 59 % de identidade(excluindo os intervalos) com as seqüências de aminoácido deduzidas de trêsproteínas da Família 7 da glicosil hidrolase de Neurospora crassa,Talaromyces emersonii e Aspergillus oryzae, respectivamente (números deacesso Q7RXC7, CAC94521,1 e 013455, respectivamente).
Exemplo 8: Construção de vetor de expressão pAlLo2
O vetor de expressão pAlLol foi construído modificando-sepBANe6 (Patente U.S. 6.461.837), que compreende um híbrido dospromotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi), Aspergillusniger seqüência terminadora de amiloglucosidase (terminador AMG), e ogene da acetamidase de Aspergillus nidulans (amdS). Todas as etapas demutagênese foram verificadas pelo seqüenciamento usando a química determinador Big-Dye® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA). A modificação de pBANe6 foi realizada eliminando-se primeiro três sítios derestrição Nco I nas posições de 2051, 2722 e 3397 pares de base a partir domarcador de seleção amdS pela mutagênese direcionada ao sítio. Todas asmudanças foram designadas como sendo 'silenciosas' deixando a seqüênciade proteína real do produto de gene amdS inalterada. A remoção destes três sítios foi realizada simultaneamente com um Kit Mutagênese direcionada aosítio in vitro GeneEditor® (Promega, Madison, WI, USA) de acordo com asinstruções do fabricante usando os seguintes iniciadores (o nucleotídeosublinhado representa a base mudada):
AMDS3NcoMut (2050):
5 '-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (SEQ ID NO: 13)AMDS2NcoMut (2721):
5 '-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3' (SEQ ID NO: 14)AMDSlNcoMut (3396):
5'-GGAGGCC ATG AAGTGGACC AACGG-3' (SEQ ID NO: 15)Um plasmídeo compreendendo todas as três mudanças deseqüência esperada foi depois submetido à mutagênese direcionada ao sítio,usando um Kit de Mutagênese direcionada ao sítio QuickChange®(Stratagene, La Jolla5 CA, USA), para eliminar o sítio de restrição Nco I nofinal do terminador AMG na posição 1643. Os seguintes iniciadores (onucleotídeo sublinhado representa a base mudada) foram usados para amutagênese:
Iniciador Superior para mutagenizar a seqüência terminadoraAMG:
5' -C ACCGTGAAAGCC ATGÇTCTTICCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (SEQ ID NO: 16)
Iniciador Inferior para mutagenizar a seqüência terminadoraAMG:
5' -CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTC ACGGTGTCTG-3' (SEQ ID NO: 17)
A última etapa na modificação de pBANeó foi a adição de umnovo sítio de restrição Nco no começo do poliligador usando um Kit deMutagênese direcionada ao sítio QuickChange® e os seguintes iniciadores (osnucleotídeos sublinhados representam as bases mudadas) para produzirρAlLol (Figura 7).
Iniciador Superior para mutagenizar o promotor NA2-tpi:5'-CTATATACACAACTGGATTTAÇÇATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3' (SEQ ID NO: 18)
Iniciador Inferior para mutagenizar o promotor NA2-tpi:5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCC ATGGT AAATCC AGTTGTGT ATATAG-3' (SEQ ID NO: 19)
O gene amdS de pAlLol foi trocado com o gene pyrG deAspergillus nidulans. O plasmídeo pBANelO (Figura 8) foi usado como umafonte para o gene pyrG como um marcador de seleção. A análise da seqüênciade pBANelO mostrou que o marcador pyrG foi contido dentro de umfragmento de restrição Nsi I e não contém Nco I ou Pac I sítios de restrição.Visto que o amdS também é flanqueado pelos sítios de restrição Nsi I aestratégia para trocar o marcador de seleção foi uma troca simples defragmentos de restrição Nsi I. O DNA plasmídico de pAlLol e pBANelOforam digeridos com a enzima de restrição Nsi I e os produtos purificadospela eletroforese em gel de agarose. O fragmento Nsi I de pBANelO contendoo gene pyrG foi ligado à cadeia principal de ρ AlLol para substituir ofragmento de DNA de Nsi I original contendo o gene amdS. Os clonesrecombinantes foram analisados pela digestão com enzima de restrição paradeterminar que eles tiveram o inserto correto e também a sua orientação. Umclone com o gene pyrG transcrito na direção anti-horária foi selecionado. Onovo plasmídeo foi designado pAlLo2 (Figura 9).
Exemplo 9: Construção de vetores de expressão de Aspergillus oryzaepara os genes cel7c e cel7e de Thielavia terrestris NRRL 8126
Dois iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos mostradosabaixo foram designados para amplificar pela PCR o gene cel7c de Thielaviaterrestris NRRL 8126 do clone genômico. Um Kit de Clonagem InFusion(BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) foi usado para clonar o fragmentodiretamente no vetor de expressão pAlLo2 sem a necessidade quanto adigestões de restrição e ligação.
Iniciador direto:
5'- ACTGGATTACCATGGGCCAGAAGACGCTG-3' (SEQ ID NO:20)
Iniciador Reverso:5 '-AGTCACCTCTAGTTAGAGGCACTGGTAGTAC-3' (SEQ IDNO: 21)
As letras em negrito representam a seqüência codificadora. Aseqüência remanescente é homóloga aos sítios de inserção de pAlLo2.Cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores acima foramusados em uma reação de PCR contendo 100 ng de DNA genômico deThielavia terrestris (preparado como descrito no Exemplo 2), Tampão deAmplificação IX Pfií, 1,5 μΐ de mistura 10 mM de dATP, dTTP, dGTP edCTP, 2,5 unidades de Platinum Pfic DNA Polimerase (Invitrogen, Carlsbad,CA, USA), 1 μΐ de MgSO4 50 mM e 5 μΐ de Solução Realçadora IOX pCRx(Invitrogen, Carlsbad, CA; USA) em um volume final de 50 μΐ. Aamplificação foi realizada em um Stratagene Robocycler® programado para 1ciclo a 94 0C por 2 minutos: e 30 ciclos cada um a 94 0C por 15 segundos. 55 0C por 30 segundos, e 68 0C por 3 minutos. O bloco de aquecimento depoisfoi para um ciclo de embebeção a 4 °C.
Os produtos de reação foram isolados em um gel de agarose a1,0 % usando tampão TAE onde uma faixa de produto de aproximadamente 3kb foi excisada do gel e purificada usando um Kit de Extração em GelQIAquick de acordo com as instruções do fabricante.
O fragmento foi depois clonado em pAlLo2 usando um Kit deClonagem InFusion. O vetor foi digerido com Nco e Pac I (usando ascondições especificadas pelo fabricante). O fragmento foi purificado pelaeletroforese em gel de agarose a 1 % usando tampão TAE e um KJt dePurificação em Gel QIAquick. O fragmento de gene e o vetor digerido foramligados juntos em uma reação que resulta no plasmídeo de expressãopEJG109 (Figura 10) em que a transcrição do gene cel7c estava sob ocontrole do promotor NA2-tpi. A reação de ligação (20 μΐ) foi composto deTampão IX InFusion (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA), IX BSA (BDBiosciences, Palo Alto, CA, USA), 1 μΐ de enzima InFusion (diluída 1:10)(BD Biosciences, Palo Alto, CA), 100 ng de pAlLo2 digerido com Neo I ePae I5 e 100 ng do produto de PCR purificado cel7c de Thielavia terrestris. Areação foi incubada na temperatura ambiente por 30 minutos. Um μΐ dareação foi usada para transformar células E. eoli XLlO Solopac Gold(Stratagene, La Jolla, CA5 USA). Um transformante de E. coli contendopEJG109 (gene cel7c) foi detectado pela digestão em enzima de restrição comXho Ieo DNA plasmídico foi preparado usando um QIAGEN BioRobot9600.
Uma construção de expressão para o gene cel7e de Thielaviaterrestris foi gerado na mesma maneira como descrita acima usando osseguintes iniciadores.
Iniciador direto In-Fusion:-ACTGG ATTACCATGGCGCCCAAGTCTACAGTTCTGG-3'(SEQ ID NO: 22)
Iniciador Reverso In-Fusion:-TCACCTCTAGTTAATTAACTAGTGGCTGCACTCGCTCT-3'(SEQ ID NO: 23)
As letras em negrito representam a seqüência codificadora. Aseqüência remanescente é homóloga aos sítios de inserção de pAlLo2.
Um produto de reação de PCR 1,3 kb foi isolado em um gel deGTG-agarose a 0,8 % (Cambrex Bioproducts One Meadowlands Plaza EastRutherford, New Jersey 07073) usando tampão TAE e 0,1 μg de brometo deetídio por ml. A faixa de DNA foi visualizada com a ajuda de um DarkReader® (Clare Chemical Research, Dolores, CO) para evitar as mutaçõesinduzidas por UV. A faixa de DNA de 1,3 kb foi excisada com uma lâmina debarbear descartável e purificada com um copo giratório Ultrafree-DA(Millipore, Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Aclonagem do fragmento de PCR purificado no vetor pAlLo2 linearizado epurificado foi realizada como descrito acima com um Kit de Clonagem In-Fusion (BD Biosciences, Palo Alto. CA) para gerar pAlLo25 (Figura 11).
Os transformantes de E. coli contendo pAlLo25 foramidentificados pela análise de digestão com enzima de restrição e o DNAplasmídico foi preparado usando um QIAGEN BioRobot 9600.Exemplo 10: Expressão de genes de Thielavia terrestris NRRL 8126 quecodificam endoglucanases CEL7C e CEL7E em Aspergillus oryzaeJaL250
Os protoplastos de Aspergillus oryzae JaL250 forampreparados de acordo com o método de Christensen et ai., 1988,Bio/technology 6. 1419-1422. Cinco μg de pEJG109 (assim como pAlLo2como um controle de vetor) foi usado para transformar Aspergillus oryzaeJaL250 (WO 99/61651).
A transformação de Aspergillus oryzae JaL250 com pEJG109(gene cel7c) produziu cerca de 100 transformantes. Dez transformantes foramisolados em placas PDA individuais.
As placas PDA confluentes de 5 transformantes foram lavadascom 5 ml de Tween 80 a 0,01 % e inoculadas separadamente em 25 ml demeio MDU2BP em 125 ml de frascos agitados de vidro e incubados a 34 °C,200 rpm. Cinco dias depois da incubação uma amostra de 5 μΐ de amostra desobrenadante de cada cultura foram analisados usando 8 a 16 % de géis deSDS-PAGE de Tris-Glicina (Invitrogen: Carlsbad, CA, USA) de acordo comas instruções do fabricante. Os perfis de SDS-PAGE dos sobrenadantes decultura mostraram que 5 dos 5 transformantes tiveram uma nova faixaprincipal de aproximadamente 74 kDa.
Uma placa confluente de 10 transformantes (cultivada emPDA) foi lavada com 10 ml de Tween 20 a 0,01 % e inoculada em umFernbach de 2 litros contendo 500 ml de meio MDU2BP para gerar caldo paraa caracterização da enzima. O frasco foi colhido no dia 5 e filtrado usandouma Membrana GP Express plus de 0,22 μπι (Millipore, Bedford, MA, USA).
Os plasmídeos pAlLo25 (gene cel7e) foram expressados emAspergillus oryzae JaL250 usando o mesmo protocolo descrito acima. Atransformação de Aspergillus oryzae Ja1250 produziu cerca de 35transformantes. Oito transformantes foram isolados em placas PDAindividuais e incubados por cinco dias a 34 °C. Os perfis de SDS-PAGE dossobrenadantes de cultura mostraram que oito dos oito transformantespAlLo25 tiveram uma nova faixa de proteína difusa de aproximadamente 55kDa. O Transformante #4 foi selecionado para outros estudos e designadoAspergillus oryzae JaL250 pAlLo25.
Exemplo 11: Clonagem e expressão do cDNA de Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 que codifica uma CEL7A endoglucanase
Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 foi cultivado em200 ml de meio PD com celulose a 30 0C por cinco dias a 200 rpm. Osmicélios da cultura em frasco agitado foram colhidos pela filtração dosconteúdos através de um funil revestido com Miracloth®. Os micélios foramdepois intercalados entre dois pedaços de Miracloth® e secados com toalhasde papel absorvente. A massa micelial foi depois transferida para tubos decentrífuga plásticos Falcon® 1059 (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) econgelados em nitrogênio líquido. Os micélios congelados foramarmazenados em um congelador a -80 0C até o uso.
A extração de RNA total foi realizada com tiocianato deguanidínio seguida pela ultracentrifugação através de uma almofada de CsCl a5,7 M, e isolação do Poli(A)+RNA foi realizada pela cromatografia deafinidade de oligo(dT)-celulose, usando os procedimentos descritos na WO94/14953.
O cDNA de filamento duplo foi sintetizado a partir de 5 μg depoli(A)+ RNA pelo método de RNase H (Gubler e Hoffinan, 1983, Gene 25:263-269, Sambrook et ai., 1989, Molecular cloning: A laboratory manual,Cold Spring Harbor lab,: Cold Spring Harbor, NY). O poli(A)+ RNA (5 μg em5 μl de água tratada com DEPC (01 % de dietilpirocarbonato)) foi aquecido a70 0C por 8 minutos em um tubo Eppendorf®, pré-siliconizado, isento deRnase, extinto em gelo, e combinado em um volume final de 50 μl comtampão de transcriptase reversa composto de 50 mM de Tris-HCl, pH 8,3, 75mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol (DTT) (BethesdaResearch Laboratories, Bethesda, MD, USA), 1 mM de dATP, dGTP e dTTP,e 0,5 mM de 5-metil-dCTP (Pharmacia, Uppsala, Suécia), 40 unidades deinibidor da ribonuclease placentária humana (RNasin, Promega, Madison, WI,USA), 1,45 μg de iniciador oligo(dT)18-JVoí I (Pharmacia, Uppsala, Suécia), e1000 unidades de transcriptase reversa SuperScript® II RNase H (BethesdaResearch Laboratories, Bethesda, MD, USA). O cDNA do primeiro filamentofoi sintetizado incubando-se a mistura de reação a 45 0C por 1 hora. Depoisda síntese, a mistura híbrida de mRNAxDNA foi filtrada em gel através deuma coluna giratória MicroSpin S-400 HR (Pharmacia, Uppsala, Suécia) deacordo com as instruções do fabricante.
Depois da filtração em gel, os híbridos foram diluídos em 250μl de tampão do segundo filamento (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 90 mM deKCl, 4,6 mM de MgCl), 10 mM de (NH4)2SO4, 0,16 mM de NAD) contendo200 μΜ de cada dNTP, 60 unidades de DNA polimerase I da E. coli(Pharmacia, Uppsala, Suécia), 5,25 unidades de RNase H (Promega, Madison,WI, USA), e 15 unidades de DNA ligase da E. coli (Boehringer Mannheim,Manheim, Alemanha). A síntese de cDNA do segundo filamento foi realizadaincubando-se o tubo de reação a 16 0C por 2 horas e um adicional de 15minutos a 25 °C. A reação foi interrompida pela adição de EDTA a umaconcentração final de 20 mM seguido pelas extrações com fenol eclorofórmio.
O cDNA de filamento duplo foi precipitado a -20 0C por 12horas pela adição de 2 volumes de etanol a 96 % e 0,2 volume de acetato deamônio a 10 M, recuperado pela centrifugação a 13.000 χ g, lavado em 70 %de etanol, secado, e recolocado em suspensão em 30 μl de tampão de nucleasede feijão Mung (30 mM de acetato de sódio pH 4,6, 300 mM de NaCl, 1 mMde ZnSO4, 0,35 mM de DTT, 2 % de glicerol) contendo 25 unidades denuclease de feijão Mung (Pharmacia, Uppsala, Suécia). O DNA de grampo decabelo de filamento único foi aparado incubando-se a reação a 30 °C por 30minutos, seguido pela adição de 70 μl de Tris 10 mM-HCl-1 mM de EDTApH 7,5, a extração com fenol, e a precipitação com 2 volumes de etanol a 96% e 0,1 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 em gelo por 30 minutos.
Os cDNAs de filamento duplo foram recuperados pelacentrifugação a 13.000 χ g e terminados abruptamente em 30 μl de tampão deT4 DNA polimerase (20 mM de Tris-acetato, pH 7,9, 10 mM de acetato demagnésio, 50 mM de acetato de potássio, 1 mM de DTT) contendo 0,5 mMde cada dNTP e 5 unidades de T4 DNA polimerase (New England Biolabs,Ipswich, MA, USA) incubando-se a mistura de reação a 16 °C por 1 hora. Areação foi interrompida pela adição de EDTA a uma concentração final de 20mM, seguida pelas extrações com fenol e clorofórmio e precipitação por 12horas a -20 °C pela adição de 2 volumes de etanol a 96 % e 0,1 volume deacetato de sódio 3 M, pH 5,2.
Depois da reação de enchimento, os cDNAs foramrecuperados pela centrifugação a 13.000 χ g, lavados em etanol a 70 %, esecados. A pelota de cDNA foi recolocada em suspensão em 25 μl de tampãode ligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT,0,5 mM de ATP) contendo 2,5 μg de adaptadores não palindrômicos Bst XI(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), mostrados abaixo, e 30 unidades de T4ligase (Promega, Madison, WI, USA), e depois incubados a 16 °C por 12horas. A reação foi interrompida aquecendo-se a 65 0C por 20 minutos edepois esfriada em gelo por 5 minutos.
5 '-CTTTCCAGCACA-3' (SEQ ID NO: 24)
3 '-GAAAGGTC-5'
O cDNA adaptado foi digerido com Not I, seguido porincubação por 2,5 horas a 37 °C. A reação foi interrompida aquecendo-se a 65°C por 10 minutos. Os cDNAs foram fracionados pelo tamanho pelaeletroforese em gel em um gel de agarose de temperatura de fusão baixaSeaPlaque® GTG a 0,8 % (Cambrex Corporation, East Rutherford, NJ. USA)em 44 mM de Tris Base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão EDTA(TBE) para separar adaptadores não ligados e cDNAs pequenos. O cDNA foiselecionado por tamanho com um corte a 0,7 kb e recuperado do gel pelo usode beta-agarase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA Biolabs) deacordo com as instruções do fabricante e precipitado por 12 horas a -20 0Cpela adição de dois volumes de etanol a 96 % e 0,1 volume de acetato desódio 3 MpH 5,2.
O cDNA direcional, selecionado por tamanho foi recuperadopela centrifugação a 13.000 χ g, lavado em 70 % de etanol, secado, e depoisrecolocado em suspensão em 30 μΐ de Tris 10 mM-HCl-1 mM de EDTA pH7,5. Os cDNAs foram dessalinizados pela filtração em gel através de umacoluna giratória MicroSpin S300 HR de acordo com as instruções dofabricante. Três ligações de teste foram realizadas em 10 μΐ de tampão deligação (30 mM de Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de MgCl2, 10 mM de DTT, 0,5mM de ATP) contendo 5 μΐ de cDNA de filamento duplo (tubos de reação #1e #2), 15 unidades de T4 ligase, e 30 ng (tubo #1), 40 ng (tubo #2), e 40 ng(tubo #3, o controle de fundo do vetor) do vetor pYES2.0 clivado por Bst XI-Not I (Invitrogen, Carlsbad. CA, USA). As reações de ligação foramrealizadas pela incubação a 16 0C por 12 horas, depois aquecendo a 70 0C por20 minutos, e finalmente adicionando 10 μΐ de água a cada tubo. Um μΐ decada mistura de ligação foi submetido à eletroporação em 40 μΐ de célulasDH10B da E. coli eletrocompetentes (Bethesda Research Laboratories,Bethesda, MD, USA) como descrito por Sambrook et al., 1989, supra.
A biblioteca de cDNA de Cladorrhinum foecundissimumATCC 62373 foi estabelecida como reuniões em DH10B da E. coli. Cadareunião foi feita espalhando-se a E. coli transformada em placas de LBsuplementadas com 100 μg de ampicilina por ml, produzindo 15.000 a 30.000colônias/placa depois da incubação a 37 0C por 24 horas. Vinte ml de meioLB suplementado com 100 μ§ de ampicilina por ml foram adicionados àplaca e as células foram colocadas em suspensão nesta. A suspensão de célulafoi agitada a 100 rpm em um tubo de 50 ml por 1 hora a 37 °C.
A biblioteca de cDNA de Cladorrhinum foecundissimumATCC 62373 resultante consistiu de aproximadamente 10 clones individuais,com um fundo de vetor de 1 %. O DNA plasmídico de algumas das reuniõesde biblioteca foi isolado usando um Kit Plasmid Midi (QIAGEN inc.,Valencia, CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante, earmazenadas a -20 °C.
Alíquotas de um ml de DNA plasmídico purificado (100ng/ml) de algumas das reuniões da biblioteca (Exemplo 1) foramtransformadas em Saccharomyces eerevisiae W3124 pela eletroporação(Becker e Guarante, 1991, Methods Enzymol. 194: 182-187) e ostransformantes foram plaqueados em SC ágar contendo 2 % de glicose eincubados a 30 °C. No total, 50 a 100 placas contendo 250 a 400 colônias delevedura foram obtidas de cada reunião.
Depois de 3 a 5 dias de incubação, as placas de SC ágar foramplaqueadas em réplica em um conjunto de placas de AZCL HE celulose SCURA ágar a 0,1 % com galactose. As placas foram incubadas por 2 a 4 dias a30 0C e as colônias positivas em endoglucanase foram identificadas comocolônias circundadas por um halo azul.
As colônias de levedura que expressam endoglucanase foraminoculadas em 20 ml de meio YPD em tubos de teste de vidro de 50 ml. Ostubos foram agitados a 200 rpm por 2 dias a 30 °C. As células foram colhidaspela centrifiigação por 10 minutos a 3000 rpm em uma centrífuga HeraeusMegafuge 1,0R com um rotor 75002252 (Hanau, Alemanha).
O DNA foi isolado de acordo com a WO 94/14953 edissolvido em 50 μΐ de água deionizada. O DNA foi transformado em célulasDH10B da E. eoli pelos procedimentos padrão de acordo com Sambrook etal., 1989, supra. Um transformante da E. coli subseqüentemente mostrouconter o gene cel7a de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373, e oplasmídeo nesta cepa foi designado pCIC521.
Exemplo 12: Expressão de gene cer7a de Cladorrhinum foecundissimumATCC 62373 em Aspergillus oryzae
O gene cel7a de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373foi excisado de pCIC521 usando Bam HI e Xba I, e ligado no vetor deexpressão de Aspergillus pHD464 (Daiboge e Heldt-Hansen, 1994, Molecularand General Genetics 243: 253- 260) usando métodos padrão (Sambrook etal., 1989, supra). O plasmídeo resultante foi designado pA2CIC521.
Os protoplastos de Aspergillus oryzae HowB 104 forampreparados como descrito na WO 95/02043. Cem microlitros de suspensão deprotoplasto foram misturados com 5 a 25 μg do vetor de expressão deAspergillus pA2CIC521 em 10 μΐ de composto STC de 1,2 M de sorbitol, 10mM de Tris-HCl, pH 75, 10 mM de CaCl2) e misturado ainda mais com 5 a25 μg de p3SR, um gene amdS de Aspergillus nidulans que carrega plasmídeo(Christensen et al, 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422). A mistura foideixada na temperatura ambiente por 25 minutos. Duzentos microlitros dePEG 4000 a 60 % (BDH, Poole. Inglaterra) (polietileno glicol. peso molecular4.000), 10 mM de CaCl2 e 10 mM de Tris-HCl pH 7,5 foram adicionados esuavemente misturados e finalmente 0,85 ml da mesma solução foiadicionado e suavemente misturado. A mistura foi deixada na temperaturaambiente por 25 minutos, centrifugada a 2.500 χ g por 15 minutos, e a pelotafoi recolocada em suspensão em 2 ml de sorbitol a 1,2 M. Este processo desedimentação foi repetido, e os protoplastos foram espalhados em placasCOVE. Depois da incubação por 4 a 7 dias a 37 0C os esporos foramescolhidos e espalhados de modo a isolar colônias únicas. Este procedimentofoi repetido e os esporos de uma colônia única depois da segunda reisolaçãoforam armazenados.Cada um dos transformantes foi inoculado em 10 ml de meioYPM, Depois de 2 a 5 dias de incubação a 30 °C, 200 rpm, o sobrenadante foiremovido. A atividade de endoglucanase foi identificada aplicando-se 20 μΐde caldo de cultura a furos de 4 mm de diâmetro perfurados em uma placa deAZCL HE celulose SC-ágar a 0,1 % e incubação durante a noite a 30 °C. Apresença de atividade de endoglucanase produziu um halo azul em torno deuma colônia. Diversos caldos de transformante tiveram atividade deendoglucanase que foi significantemente maior do que a do caldo de umcontrole de fundo de Aspergillus oryzae não transformado, que demonstrouexpressão eficiente da CEL7A endoglucanase de Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 em Aspergillus oryzae. Um transformante deAspergillus oryzae foi designado A2.110521 4/3.
Exemplo 13: Extração de DNA genômico de A2.11C521 4/3 de Aspergillusoryzae
A cepa A2.110521 4/3 de Aspergillus oryzae que expressa aproteína CEL7A de Cladorrhinum foecundissimum foi cultivada em meioM400, em volume de cultura de 300 ml, usando frascos de agitação comdefletores por 7 dias, 34 °C, a 200 rpm. A biomassa foi congelada emnitrogênio líquido e triturada a um pó com um almofariz e pistilo. O pó foicolocado em suspensão em 15 ml de CAPS 0,1 M-NaOH pH 11,0, 1 mM deEDTA, 0,5 % de dodecil sulfato de lítio e incubado por 60 minutos a 60 0Ccom mistura periódica pela inversão. Um volume igual de fenol neutralizadofoi adicionado e o tubo foi agitado suavemente por 1 hora a 37 °C. Cinco mlde clorofórmio foram adicionados e o tubo foi agitado vigorosamente por 1minuto. Depois da centrifugação a 1300 χ g por 10 minutos, a fase aquosa detopo foi re-extraída com um volume igual de fenol:clorofórmio (1:1) pelaagitação por 5 minutos. A centrifugação foi repetida e a fase aquosa foi levadaa 2,5 M de acetato de amônio e armazenada a -20°C por 20 minutos. Depoisda centrifugação a 17.000 χ g por 20 minutos a 4 °C, os ácidos nucleicossobrenadantes no sobrenadante foram precipitados pela adição de 0,7 volumede isopropanol. Depois da centrifugação a 17.000 χ g por 10 minutos, osobrenadante foi decantado e a pelota foi enxaguada com 70 % de etanol esecada ao ar. A pelota foi dissolvida em 950 μΐ de água deionizada seguidapela adição de 50 μΐ de Solução de Recolocação em Suspensão de CélulaPromega (Promega Corporation, Madison WI, USA) e incubação por 5minutos na temperatura ambiente. Acetato de amônio foi adicionado a 1,0 Me os ácidos nucleicos precipitaram pela adição de 2 volumes de etanol. Depoisda centrifugação a 13.000 χ g por 10 minutos, a pelota foi dissolvida em 300μl de 1 mM de Tris-HCl, 0,1 mM de EDTA, pH 8,0, e armazenada a -20 °C.
Exemplo 14: Amplificação pela PCR do cDNA de cel7a de Cladorrhinumfoecundissimum a partir de DNA genômico da cepa de expressãoA2.110521 4/3 de Aspergillus oryzae
Para os propósitos de depósito de seqüenciamento e clone, ocDNA de cel7a foi amplificado a partir do DNA genômico da cepaA2.110521 4/3 de Aspergillus oryzae. Dois iniciadores de oligonucleotídeosintético homólogos ao vetor de expressão pHD464 foram designados paraamplificar pela PCR o gene cel7a do DNA genômico da cepa A2.110521 4/3de Aspergillus oryzae.
Iniciador direto:5'-CCACACTTCTCTTCCTTCCTC-3" (SEQ ID NO: 25)
Iniciador Reverso:5 '-CCCCATCCTTTAACTATAGCG-3' (SEQ ID NO: 26)
Dezessete picomoles de cada um dos iniciadores acima foramusados em uma reação de PCR contendo 100 ng de DNA genômico deAspergillus oryzae A2.110521 4/3 (preparado como descrito no Exemplo 13),Tampão de Amplificação IX Pfic (Invitrogen, Carlsbad CA, USA), 1,7 μl deuma mistura de 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, e dCTP, 2,5 unidades dePlatinum Pfx DNA Polimerase, e 1 μΐ de MgS04 a 50 mM em um volumefinal de 50 µl. A amplificação foi realizada em um Robociclor® da Stratageneprogramado para 1 ciclo a 96 °C por 3 minutos e 72 °C por 3 minutos(durante o que a DNA polimerase foi adicionada); e 35 ciclos cada um a 94°C por 50 segundos, 5 °C por 50 segundos, e 68 °C por 2 minutos, seguidopor uma extensão final a 68 °C por 7 minutos.
Os produtos de reação foram isolados em um gel de agarose a1,0 % usando tampão TAE onde uma faixa de produto de aproximadamente1,7 kb foi excisada do gel e purificada usando um Kit de Extração em GelQIAEX® II de acordo com as instruções do fabricante.
O fragmento de 1,7 kb foi clonado no vetor pCR-Blunt II-TOPO usando um Kit de Clonagem Zero Blunt TOPO PCR e transformadoem células TOPlO da E. coli de acordo com as instruções do fabricante(Invitrogen, Carlsbad CA, USA). O DNA plasmídico de diversostransformantes foi preparado usando um QIAGEN BioRobot 9600. Oplasmídeo de dois transformantes foi seqüenciado e descoberto ser idêntico econter o cDNA de cel7a. Um plasmídeo foi designado pPH46 (Figura 12).
O plasmídeo pPH46 contendo PaHa46 da E. coli (Figura 12)foi depositado com a Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois,61604, como NRRL B-30897, com uma data de depósito de 23 de fevereirode 2006.
Exemplo 15: Caracterização da seqüência de cDNA de Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 que codifica a CEL7A endoglucanase
O seqüenciamento de DNA do cDNA de cel7a deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 no plasmídeo pPH46 foirealizado com um Sequenciador de DNA Automatizado Modelo 3700 daApplied Biosystems usando a química do terminador BigDye® versão 3.1 e aquímica de dGTP e a estratégia caminhante de iniciador. Os dados daseqüência de nucleotídeo foram escrutinizados quanto a qualidade e todas asseqüências foram comparadas entre si com a assistência do softwarePHRED/PHRAP (University of Washington. Seattle, WA, USA).
A seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO.5) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 6) do cDNA de cel7a de Cladorrhinumfoecurtdissimum são mostradas nas Figuras 13A e 13B. A seqüênciacodificadora tem 1323 pares de base incluindo o códon de parada. A proteínaprognosticada codificada tem 440 aminoácidos. A % G + C da seqüênciacodificadora do gene é de 59,2% e a seqüência codificadora do polipeptídeomaduro tem 59,0%. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra),um peptídeo de sinal de 18 resíduos foi prognosticado. A proteína maduraprognosticada contém 422 aminoácidos com uma massa molecular de 45,7kDa. A análise da seqüência de aminoácido deduzida do gene cel7a com oprograma InterProScan (Zdobnov e Apweiler, 2001, supra) mostrou que opolipeptídeo CEL7A conteve a assinatura de domínio da Família 7 daglicosídeo hidrolase (número de acesso InterPro 1PR001722)aproximadamente dos aminoácidos 2 a 405 do polipeptídeo maduro.
Um alinhamento global aos pares comparativo de seqüênciasde aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch(Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programaNeedle de EMBOSS com penalidade de abertura de intervalo de 10,penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do cDNA deCladorrhinum foecundissimum que codifica o polipeptídeo maduro CEL7Atendo atividade de endoglucanase compartilha 79% e 55% de identidade(excluindo os intervalos) com as seqüências de aminoácido deduzidas de duasproteínas da Família 7 da glicosil hidrolase de Neurospora crassa (número deacesso Q7RXC7) e Talaromyces emersonii (número de acesso CAC94521.1).Esta também compartilha 64% e 57% de identidade com os polipeptídeosmaduros CEL7E e CEL7C de Thielavia terrestris, respectivamente.O caldo contendo a Família 7 A de Cladorrhinumfoecundissimum foi separada por 10 a 20 % de Tris-Glicina SDS-PAGE comodescrito no Exemplo 1. Uma faixa de gel de aproximadamente 50 kDa foisubmetida à digestão em gel e seqüenciado de novo usando espectrometria demassa em tandem como descrito no Exemplo 1.
Uma seqüência parcial de uma de seqüência de íon peptídicotríptico duplamente carregado de 701,85 m/z foi determinada ser Gly-Thr-Val-Val-Pro-Glu-Ser-His-Pro-Lys, que corresponde à seqüênciaGTWPESHPK (aminoácidos de 22 a 31 da SEQ ID NO: 6). Uma seqüênciaparcial de um segundo íon peptídico tríptico duplamente carregado de 739,35foi determinada ser Gly-Glu-Ala-Asn-[lie ou Leu]-Asp-[Gln ou Lys)-Lys emque Xaa é qualquer aminoácido, que corresponde à seqüência GEANIDQK(aminoácidos de 202 a 209 da SEQ ID NO: 6). Um terceiro íon peptídicotríptico duplamente carregado de 919,83 foi determinado ser[CAM(carboxiamidometilcisteína) ou Phej-Glu-Gly-Glu-Asp-Glu[Cam ouPhe]-Gly-[Gln ou Ly s]-Pro-Val-Gly-Val-[Cam ou Phe]-Asp-Lys, quecorresponde à seqüência CEGEDECGQPVGVCDK (aminoácidos de 242 a257 da SEQ ID NO: 6). Um quarto íon peptídico tríptico duplamentecarregado de 970,45 uma seqüência parcial foi determinada ser Pro-Ser-Thr-Pro-Cam-Val-Val-Gly-Gly-Pro-[Ile ou Leu]-Cam-Pro-Asp-Ala-Ly s, quecorresponde à seqüência PSTPCWGGPLCPDAK (aminoácidos de 65 a 80da SEQ ID NO: 6).
Exemplo 16: Preparação de endoglucanases recombinantes a partir deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 e Thielavia terrestris NRRL8126
A endoglucanase CEL7 de Cladorrhinum foecundissimumproduzida recombinantemente em Aspergillus oryzae, como descrito noExemplo 12, foi purificada até a homogeneidade usando um protocoloessencialmente como descrito por Otzen et al., 1999, Protein Sei, 8: 1878-87.As endoglucanases CEL7C de Thielavia terrestris e CEL7E deThielavia terrestris recombinantemente produzidas em Aspergillus oryzae,como descrito no Exemplo 10, foram testadas na forma de caldo de cultura apartir do hospedeiro de expressão Aspergillus oryzae. O caldo foi concentradoe trocado para 50 mM de tampão de acetato de sódio pH 5,0 usando o filtrocentrífugo Centricon Plus-20 com membrana de polietersulfona Biomax-5(5000 NMWL) (Millipore, Bedford, MA, USA).
A concentração de proteína nas preparações de enzima foideterminada usando o ensaio de microplaca de Acido Bicinconínico (BCA) deacordo com as instruções do fabricante para um Kit de Reagente de Ensaio deProteína BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA).
As diluições de enzima foram preparadas frescas antes de cadaexperimento a partir de soluções de enzima de estoque, que foramarmazenadas a -20 °C.
Exemplo 17: Preparação de substratos
Forragem de milho pré tratada (PCS) foi preparada pelo U.S.Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL,Golden, CO. USA) usando ácido sulfurico diluído. As seguintes condiçõesforam usadas para o pré tratamento: 1,4 % em peso de ácido sulfurico a 165°C e 10 psi (69 kPa) por 8 minutos. A análise composicional foi realizada naNREL. A celulose e a hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise emácido sulfurico de estágio duplo com análise subseqüente de açúcares pelacromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) usando NREL StandardAnalytical Procedure #002. A lignina foi determinada gravimetricamentedepois da hidrolisação das frações de celulose e hemicelulose com ácidosulfurico (NREL Standard Analytical Procedure #003). Os sólidos insolúveisem água na forragem de milho pré tratada (PCS) foram determinados ser 56,5% de celulose, 4,6 % de hemicelulose e 28,4 % de lignina.
A PCS foi lavada com grande volume de água deionizada emum funil Kimax com um filtro de vidro de porosidade grossa (FisherScientific, Pittsburg, PA, USA), a PCS lavada com água foi moída em ummoedor de café e adicionalmente lavada com água deionizada em um FiltroMillipore de 22 μιη com uma Membrana 6P Express (Millipore, Bedford,MA, USA), O peso seco da PCS moída foi de 32,4 %.
Uma suspensão de estoque de 10 mg/ml de celuloseintumescida em ácido fosfórico (PASC) em água deionizada foi preparadausando o seguinte procedimento. Cento e cinqüenta ml de ácido o-fosfórico a85 % gelado foram adicionados a 5 g de Avicel PHlOl (FMC Corp.,Filadélfia, PA, USA) umedecida com água. A suspensão foi lentamenteagitada em um banho de gelo por uma hora, e 100 ml de acetona gelada foiadicionada à suspensão com agitação constante. A pasta fluida foi transferidaa um funil Kimax com um filtro de vidro de porosidade grossa, lavada trêsvezes com 100 ml de acetona gelada, e drenada tão completamente quantopossível depois de cada lavagem. Finalmente, a pasta fluida foi lavada duasvezes com 500 ml de água, e mais uma vez drenada tão completamentequanto possível depois de cada lavagem. A PASC foi misturada com água aum volume total de 500 ml. Azida de sódio foi adicionada a umaconcentração final de 0,02 % para prevenir o crescimento microbiano. A pastafluida foi homogeneizada usando um misturador e armazenado a 4 0C por atéum mês.
Carboximetilcelulose (CMC, sal de sódio, tipo 7L2) com umgrau médio de substituição (DS) de 0,7 foi obtida da Aqualon Division ofHercules Inc,, Wilmington, DE, USA. Uma solução de 6,25 mg/ml de CMCem 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 foi preparada adicionando-selentamente CMC ao tampão vigorosamente agitado. A pasta fluida foiaquecida até aproximadamente 60 0C sob agitação contínua até que a CMCfosse completamente dissolvida.
O p-Nitrofenil-beta-D-celobiosídeo (PNPC) e p-nitrofenil-beta-D-lactosídeo (PNPL) foram obtidos da Sigma, St, Louis, MO, USA.
A celulose bacteriana (BC) foi preparada a partir de Nata deCoco, uma celulose comercial de grau alimentício (Fujicco Co., Kobe, Japão),como descrito em Boisset et ai., 1999, Biochemical Journal, 340: 829-835.
Uma suspensão de 1 mg/ml de celulose bacteriana em água deionizada com0,01 % (p/v) de azida de sódio foi armazenada a 4 °C.
Avicel PHlOl foi obtido da FMC Corporation, Filadélfia, PA,USA.
Xilano de vidoeiro foi obtido da Sigma, St. Louis, MO.Xiloglucano de semente de Tamarindo (amilóide, lote 00401), arabinoxilanodo trigo (viscosidade média, 27 cSt, lote 90601), 1,4-beta-D-manana(reduzida com boroidreto, ManrGal = 97:3, grau de polimerização DP ~ 15,lote 90302), e galactomanana de alfarroba (viscosidade baixa, reduzida comboroidreto, lote 90301) foram obtidas da Megazyme, Bray. Irlanda.Exemplo 18: Ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico para adeterminação de açúcares redutores
Os açúcares redutores (RS) foram determinados por um ensaiode hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) (Lever, 1972. Anal.Biochem, 47, 273-279), que foi adaptado a um formato de ensaio demicroplaca de 96 reservatórios.
Uma alíquota de 90 μΐ da amostra diluída foi colocada emcada reservatório de uma microplaca de fundo cônico de 96 reservatórios(Costar, policarbonato claro, Corning Inc., Acton, MA). O ensaio foi iniciadopela adição de 60 μl de PHBAH a 1,25 % em hidróxido de sódio a 2 % a cadareservatório. A placa não coberta foi aquecida em um bloco de aquecimentofeito de encomenda por 10 minutos a 95 °C. A seguir do aquecimento, amicroplaca foi esfriada até a temperatura ambiente, e 35 μl de águadeionizada foram adicionados a cada reservatório. Uma alíquota de 100 μl foiremovida de cada reservatório e transferida para uma placa de 96reservatórios de fundo chato (Costar, poliestireno de ligação média, CorningInc., Acton, MA). A absorbância a 410 nm (A4I0) foi medida usando umaLeitora de Microplaca SpectraMAX (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ovalor de A4J0 foi traduzido em equivalentes de glicose usando uma curvapadrão.
A curva padrão foi obtida com seis padrões de glicose (0,005,0,010, 0,025, 0,050, 0,075, e 0,100 mg/ml), que foram tratados similarmenteàs amostras. Os padrões de glicose foram preparados diluindo-se 10 mg/ml desolução de glicose de estoque com água deionizada.
Para todos os substratos exceto para xilano e arabinoxilano, ograu de conversão (%) foi calculado usando a seguinte equação:
Conversão (»/o) = RS (mg/mi) χ 100 χ 162 / (concentração de substratoinicial (mg/mi) x 180) = RS (mg/mi) x 100 / (concentração desubstrato inicial (mg/mi) χ 1,111)
Para xilano e arabinoxilano, a porcentagem de substratohidrolisado para RS foi calculada usando a seguinte equação:
Conversão (%) = RS (mg/m]) χ 100 χ 132 / (concentração de substratoinicial (mg/mi) x 150) = RS (mg/mi) χ 100 / (concentração desubstrato inicial (mg/mi) x 1,136)
Nestas equações, RS é a concentração de açúcares redutoresem solução medida em equivalentes de glicose (mg/ml), e os fatores 1,111 e1,136 refletem o ganho de peso na conversão aos polissacarídeoscorrespondentes para açúcares de hexose (PM 180) ou pentose (PM 150).
Exemplo 19: Atividade relativa de CEL7A endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 em vários substratos
A atividade relativa de CEL7A endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 voltada para quatro substratos émostrada na Tabela 1. A atividade relativa é mostrada como umaporcentagem da atividade de CEL7A endoglucanase de Cladorrhinumfoecundissimum em carboximetilcelulose (CMC). A atividade foi determinadamedindo-se a taxa inicial de hidrólise na faixa de aumento linear daconcentração de produto com o tempo. A CEL7A endoglucanaseCladorrhinum foecundissimum foi diluído de modo a dar uma relação linearentre a concentração de enzima e a atividade medida.
A atividade de Cladorrhinum foecundissimum CEL7Aendoglucanase voltada para o sal de sódio solúvel de carboximetilcelulose(CMC) foi determinada medindo-se a concentração de açúcares redutores(RS) produzidos a partir da CMC (5 mg/ml) depois de 30 minutos dehidrólise em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 a 50 °C. A hidrólise foirealizada sem agitação na presença de 0,5 mg/ml de albumina sérica bovina(BSA). Os açúcares redutores foram determinados usando o ensaio dahidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) descrito no Exemplo 18.
A atividade de CEL7A endoglucanase de Cladorrhinumfoecundissimum na celulose intumescida por ácido fosfórico (PASC) foideterminada medindo-se a concentração de açúcares redutores (RS) liberadosdurante a hidrólise inicial de PASO (2 mg/ml) em 50 mM de acetato de sódiopH 5,0 a 50 °C. A hidrólise foi realizada sem agitação na presença de 0,5mg/ml de BSA. As enzimas foram diluídas de modo que a concentração deRS aumentaria linearmente durante os 30 a 90 minutos iniciais de hidrólise, eo grau de conversão de PASC não excederia 2 % durante este tempo. Osaçúcares redutores foram determinados usando o ensaio da hidrazida do ácidop-hidroxibenzóico (PHBAH) descrito no Exemplo 18.
A atividade de endoglucanases sobre os substratoscromogênicos, p-nitrofenil-beta-D-celobiosídeo (PlSIPC) e p-nitrofenil-beta-D-lactosídeo (PNPL), foi determinada usando o método de Deshpande et al.,(Deshpande et al., 1984, Anal. Biochem. 138, 481-487) modificado para umformato de microplaca de 96 reservatórios, p-Nitrofenol (PNP) foideterminado depois de hidrólise por 30 minutos de PNPC (2,5 mM) ou PNPL(2,5 mM) em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0 a 40 °C por uma mediçãoespectrofotométrica a 405 nm. Antes da hidrólise, as enzimas foram diluídasem acetato de sódio a 50 mM pH 5,0 para dar menos do que 8 % de conversãode ambos os substratos nas condições especificadas.
Tabela 1. Atividade Relativa de CEL7A celulase de Cladorrhinumfoecundissimum no pH 5,0 e 50 °C
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Exemplo 20: Estabilidade térmica da CEL7A endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373
A estabilidade térmica da CEL7 endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum purificada foi determinada incubando-se assoluções de enzima em cinco temperaturas (40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 0C e 80°C), e medindo a atividade residual sobre a carboximetilcelulose (CMC).
A enzima foi diluída em acetato de sódio a 50 mM pH 5,0, queconteve 3,0 mg/ml de BSA, e incubada por 3 horas em MicrotubosImmunoWare de 1,1 ml dispostos em um formato de microplaca de 8 χ 12(Pierce, Rockford, IL). BSA foi adicionado de modo a prevenir a absorção daenzima possível sobre as paredes plásticas dos microtubos. A concentração deproteína nas misturas de incubação foi escolhida de modo que menos do que 1% de conversão de CMC fosse obtido no ensaio subseqüente quanto aatividade de CMCase.
Depois de uma incubação de 3 horas, alíquotas de 15 μl foramremovidas usando um pipetador de 8 canais, e adicionadas a 75 μl de soluçãode CMC (6 mg/ml em 50 mM de acetato de sódio pH 5,0) em uma micro-placa de fundo cônico de 96 reservatórios (Costar, policarbonato claro,Corning Inc., Acton, MA). A atividade de CMCase residual foi depois medidacomo descrito no Exemplo 19, e expressada como uma porcentagem daatividade de CMCase inicial (Tabela 2).
Depois de uma incubação de 3 horas, a CEL7A endoglucanasede Cladorrhinum foecundissimum reteve mais de 90 % da atividade deCMCase inicial a 40ºC e 50 °C, cerca de um terço da atividade de CMCase inicial a 60 °C, e 0 % da atividade de CMC-ase inicial a 70ºC e 80°C.
Tabela 2. Atividade de CMCase Residual de CEL7 endoglucanase deCladorrhinum foecundissimum depois de incubação por três horas no pH 5,0
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Exemplo 21: Caracterização de endoglucanases de Cladorrhinum
foecundissimum ATCC 62373 e Thielavia íerrestris NRRL 8126 em váriossubstratos de polissacarídeo
As endoglucanases CEL7 de Cladorrhinum foecundissimumATCC 62373 e CEL7C de Thielavia íerrestris NRR 8126 foram avaliadas nahidrólise de vários polissacarídeos no pH 5,0 (50 mM de tampão de acetato de sódio) e 50 °C. Os resultados foram comparados com aqueles para aendoglucanase de CEL7B de Trichoderma reesei (EGI) recombinante. Aendoglucanase de CEL7B de Trichoderma reesei (EGI) recombinante podeser preparada de acordo com (incluem as referências aqui).
Os polissacarídeos incluíram forragem de milho pré tratada (PCS), celulose intumescida com ácido fosfórico (PASC),carboximetilcelulose (CMC), celulose bacteriana (BC), Avicel, xilano,xiloglucano, arabinoxilano, manana e galactomanana. Todos os substratosforam usados a 5 mg/ml, com a exceção da celulose bacteriana, que foi usadaa 0,9 mg/ml.
As reações com um volume inicial de 1 ml foram realizadaspor 24 horas com agitação intermitente em Placas de 96 ReservatóriosProfundos Eppendorf® (1,2 ml, VWR Scientifíc, West Chester, PA, USA)tampadas com Mantas de 96 Reservatórios Profundos Eppendorf® (VWRScientifíc. West Chester, PA, USA). A menos que de outro modoespecificado, as enzimas foram carregadas a 5 mg de proteína por g desólidos.
Depois de 24 horas, alíquotas de 20 μΐ foram removidas dasreações de hidrólise usando um pipetador de 8 canais, e adicionado a 180 μΐde Na2CO3 102 mM - NaHCO 58 mM) em uma placa de filtração de 96reservatórios MultiScreen HV (Millipore, Bedford, MA, USA) para terminara hidrólise. As amostras foram filtradas a vácuo em uma microplaca de fundochato. Depois da diluição apropriada, os filtrados foram analisados quanto aaçúcares redutores usando o ensaio da hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico(PHBAH) como descrito no Exemplo 18.
A Tabela 3 mostra a conversão relativa de váriospolissacarídeos pelas endoglucanases depois de 24 horas de incubação. Aconversão relativa foi calculada como uma porcentagem de conversãoobtida depois da hidrólise de 24 horas de celulose intumescida pelo ácidofosfórico (PASC) pela CEL7C endoglucanase de Thielavia terrestris. Osresultados na Tabela 3 mostram que todas as três endoglucanasestiveram atividade relativamente alta sobre xilano, xiloglucano earabinoxilano, mas atividade baixa sobre manana e galactomanana. Asendoglucanases mostraram melhor hidrólise de PASO (celulose amorfanão substituída insolúvel) do que CMC (derivado de celulose substituídasolúvel). As endoglucanases tiveram atividade baixa nos substratosinsolúveis com um alto grau de cristalinidade: celulose bacteriana, AvicelePCS.
Tabela 3. Conversão relativa de vários substratos de polissacarídeo (5 mg/ml)pelas endoglucanases (5 mg de proteína por g de sólidos); pH 5,0, 50 °C, 24horas<table>table see original document page 134</column></row><table>
* A concentração inicial de celulose bacteriana foi de 0,9 mg/ml
** CEL7A de Cladorrhinum foecundissimum foi usado a 0,25 mg de proteína por g desólidos para a hidrólise de PASO e CMC
*** CEL7C de Thielavia terrestris foi usada a 25 mg de proteína por g de sólidos para ahidrólise da celulose bacteriana
Exemplo 22: Hidrólise de vários polissacarídeos por CELlC de Thielaviaterrestris NRRL 8126 a 50 0C
O Exemplo 21 foi repetido exceto que a hidrólise foiconduzida por 71 horas e as alíquotas das reações foram tomadas em pontosde tempo diferentes para seguir o curso de tempo da hidrólise. Aendoglucanase CEL7C de Thielavia terrestris NRRL 8126 foi testada comoito polissacarídeos. O grau relativo de conversão dos polissacarídeos comouma função do tempo de hidrólise é mostrado na Figura 14. A conversãorelativa é mostrada como uma porcentagem de conversão obtida depois de 71horas de hidrólise de celulose intumescida pelo ácido fosfórico (PASO). Aconcentração de substrato em todas as reações foi de 5 mg/ml, e a carga deenzima foi de 5 mg de proteína por g de sólidos.
A endoglucanase de CEL7C de Thielavia terrestris mostroualta atividade em PASO, xilano, xiloglucano e arabinoxilano, mas atividadebaixa em manana e galactomanana. A endoglucanase de CEL7C de Thielaviaterrestris teve atividade muito mais baixa na celulose substituída solúvel(CMC) do que na celulose não substituída insolúvel (PASO). A atividade nacelulose microcristalina (Avicel) foi significantemente mais baixa do que aatividade na celulose amorfa (PASC).
Exemplo 23: Hidrólise de beta-glucano solúvel da cevada pelasendoglucanases de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 Thielaviaterrestris NRRL 8126
A atividade das endoglucanases CEL7C e CEL7E deCladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e Thielavia terrestrisNRRL 8126 sobre beta-glucano solúvel da cevada (viscosidade média, 230kDa, Megazyme International Irlanda Ltd., Bray, Irlanda) foi determinada nopH 5,5 (50 mM de acetato de sódio com 0,02 % de azida de sódio) e 60 0C.Os resultados foram comparados com aqueles para endoglucanase CEL7B(EGI) de Trichoderma reesei. A endoglucanase CEL7B (EGI) deTrichoderma reesei recombinante pode ser preparada como descrito noExemplo 21.
A concentração inicial de beta-glucano sobre as reações dehidrólise foi 1,0 % (p/v). As reações de um ml foram conduzidas sem agitaçãoem Placas de 96 Reservatório Profundos Eppendorf® (1,2 ml, VWRScientific, West Chester, PA). As enzimas foram usadas em três cargas deproteína, 0,05, 0,1 e 0,2 mg por g de glucano. Em reações de controle, asendoglucanases foram substituídas com 50 mM de acetato de sódio pH 5,5contendo 0,02 % de azida de sódio (controle de tampão) ou com caldo deAspergillus oryzae Jal250 concentrado e tampão trocado não contendonenhuma enzima recombinantemente expressada (controle de Aspergillusoryzae Jal250).
As alíquotas foram removidas das reações de hidrólise em 2horas e 24 horas, diluídas com água deionizada, e analisadas quanto aosaçúcares redutores usando o ensaio da hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico(PHBAH) como descrito no Exemplo 18. A conversão relativa de beta-glucano como uma função da carga de proteína nos dois tempos de incubação,2 horas e 24 horas, é mostrada nas Figuras 15 e 16, respectivamente. Aconversão relativa é mostrada como uma porcentagem de conversão obtidadepois de hidrólise de 24 horas de beta-glucano pela endoglucanase CEL7Ade Cladorrhinumfoecundissimum (0,2 mg de proteína por g de glucano).
A endoglucanase CEL7B de Triehoderma reesei mostrouconversão mais baixa de beta-glucano do que as outras endoglucanases, equase não produziram nenhum aumento adicional na concentração de açúcarredutor depois de 2 horas de hidrólise. Ao contrário, as endoglucanasesCEL7A de Cladorrhinum foeeundissimum, CEL7C de Thielavia terrestris, eCEL7E de Thielavia terrestris continuaram a produzir novos grupos finaisredutores além das 2 horas de tempo de incubação. A endoglucanase CEL7Ade Cladorrhinum foeeundissimum mostrou melhor desempenho nahidrolisação de beta-glucano do que as endoglucanases CEL7C de Thielaviaterrestris e CEL7E de Thielavia terrestris.
Depósito de Material Biológico
O seguinte material biológico foi depositado sob os termos doTratado de Budapest com o Agricultural Research Service Patent CultureCollection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street,Peoria, Illinois, 61604 e dados os seguintes números de acesso:
Depósito Número de Acesso Data de Depósito
E. coli PaHa50 NRRL B-30899 23 de Fevereiro de 2006
E. coli PaHa38 NRRL B-30896 23 de Fevereiro de 2006
E. coli PaHa46 NRRL B-30897 23 de Fevereiro de 2006
As cepas foram depositadas sob condições que garantem que oacesso às culturas estarão disponíveis durante a pendência deste pedido depatente a uma pessoa determinada pelo Comissário de Patentes e Marcas a serdesignado para este sob 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S.C. §122. Os depósitosrepresentam culturas substancialmente puras das cepas depositadas. Osdepósitos estão disponíveis como requerido pelas leis de patentes estrangeirasem países em que as contrapartes do pedido objeto ou a sua progênie sãodepositadas. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de umdepósito não constitui uma licença para a prática da invenção objeto emdetrimento dos direitos de patente outorgados por ação governamental.
A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitadano escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, visto que estes aspectossão intencionados como ilustrações de diversos aspectos da invenção.Quaisquer aspectos equivalentes são intencionados a estar dentro do escopodesta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelasmostradas e aqui descritas tornar-se-ão evidentes para aqueles de habilidadena técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também sãointencionadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso deconflito, a presente divulgação incluindo as definições controlarão.
Várias referências são aqui citadas, as divulgações das quaissão incorporadas por referência em suas totalidades.LISTAGEM DE SEQÜENCIAS
<11Q> Novozymes, Inc.
Novozymes A/S
Harris, Paul
Vlasenko, Elena
Teter, Sarah
Kauppinnen, Marcus S
Zaretsky, Elizabeth
Brown, Kimberly
<120> POLIPEPTÍDEOS TENDO ATIVIDADE DE ENDOGLICANASE E POLINÜCLEOTÍDEOS QDECODIFICAM OS MESMOS
<130> 10892.204-WO
<1S0> 60/788 , 389
<151> 2006-03-30
<160> 26
<170> Patent In versão 3.4
<2Í0> 1
<2I1> 1501
<212> DNA
<213> Tbielavia terrestris
<400> 1
gocgttgtca agatgggoca gaag&cgctg caoggattcg ccgccacggc tttçgccgfct 60
ctcccctttg tgaaggctca gcagcccgge aacttcacgc eggaggtgca cccgcaactg 120
ccaacgtgga agtgcscgac cgc.cggcggc tgcgttcagc aggacacttc ggtggtgctc 180
gactggaact accgttggat ccacaatgcc g&cggcaccg cctcgtgcac gacgtccagc 240
ggggtcqact acacgctgtg tccagatgag gcgacctqcq cgaagaactg cttcgtggaa 300
ggcgfccaact acacgagcag eggtgtcacc ae&tccggca gttcgctgac gatgaggcag 360
tatttcaagg ggagcaacgg gcagaccsac agcgtttcgc; ctcgtctcta cc;tgc;t:cggc 420
tcggafcggaa actacgtaat gctcaagctg ctcggccagg agctçagcfct cgatgtcgat 480
ctefcccacgc tcccctgcgg cgagaacggc gcgctgtacc tgtccgagat ggscgcgacc 540
ggcggcagga accagtaeaa caccçgcggt gccaactacg gctcgggcta ctgtgacgcc 600
c;agtgkcccg tçcagacgtg gafgaacggc acgctgaaca ccaacgggca ggçetactgc 650
tgcaacgaga tggacstcct cgaggccaac tcccgcgcca acgcgstgac acctcacccc 720
tgcgccaacg gcagctgcga caagagcggg rgcggactc.a acccctacçc cçagggefcac 780
csagagctact acggaccggg cctcacggtt gacaçgtcga agecçttcac catcattacc 840
cgcttcatca ccgacgacgg cacgaccagc ggcaccctca accagatcca gcggatctat 900
gtgcagaaug gcsagacggt cgcgfccggct gcgtccggag gcgacateat cscggcatcc 960ggccgcacctççcatggtgcagcggcãacatac;c;cggacacaggtctcçgacctcçãcc.aggcgçaatcgcctacgcagt.
ccctggtacr.ç
cççcccaggctçaccttcagacggcccg tgcccacgnggtçaggcggcaacgaccaccacgggtacgtcaggsctggaccaccagtgcct
grtcggcoggeatctgç&accagc&çcacccttctccaaccggcçgctcgcaccgccccgaccacctcctgaccg tctgcctasaqtatt
ccggceascaçacgctgggggagggcaacc8:.ccgctgggaccarxaccascgçccactggcattctgttgaatcgccgí:çcaçtgasgc
tgggcçcggc«ctacatgaacgtccaacatgagacaiicggcçtcgac;c;acccacgcactçgaggaagttaacgcatgcaacatactccgt
gcttgçacgçctggctcgaccctçgccaacctcgacggfcc;cacgct.gaggggçacaatgcactaacgíggggagctgaacgctcggcatg
10201080114C12001260132013S014401.5001501
<2i0> 2<211> 464<212 > PRT<213 > Thi'
MeS Gly C-In Lys Thr !,eis His Gl.y Fbe= Ala Ala Thr Ala I-eu Ala Val.1 ~ 5 1.0 25
Leu Pro Fhe Vai Lys Ala Gin G.In Bro Gly Asn Phe Thr Pro Giu Vai£0 25 30
His Pxo SI» I>eu ?ro Thr Trp Lys Cys Thr Thr Ala Giy Gly Cys Val
Λ Λ X ι
OD -J vj -
Gin Gla Asp Thr Ser Val Val .T.-eu Asp Trp Asis Tyr Arg T50 55 60
:p Ile His
As Ala Asp Gly Thr Ala Ser Cys Thr Thi- Ser Ser Giy vai Asp His65 70 75 SO
Thr Leu Cys Pxo Asp Glu Aia Thr Cys Ala Lys Asn Cys Phe Val Glu85 90 SS
Jiy Val Asn Tyr xh.r Ser Ser Gly Vs 1 Thr Thr Ser Giy Ser Ser Lei100 105 110
Thr Het Arg Gln Tyr Phe Lys Gly Ser Asn Giy Gln Thr AsnXJvS 12 υ X ii 5
Ser vaiSer Pro Arg Leu ~yr Leu Leu G-Iy Sei Asp Gly Asn Tyr Vai Met Ieu130 * 135 " 140
Lys Leu Leu Gly Gln Cilu Leu Ser Khs Asp Val Asp Lea Ser Thr Leu145 ISO 155 ISO
rro Cys Gly Glu Asis Gly Ala Le;; Tyr .Leu Ser Glu Me·; Asp Ala Thr165 " 1"'C 175 -
Ly Gly Arg Asn Gln Tyr Asn Thr Gly Gly Ala Asn Tyr Gly Ser Gly180 ISS 180
ryr Cys Asp Ala Gln Cys Prc Val Gln Thr ;i!rp Met Asn Gly Thr Xeu195 200 £05
Asn Thr Asn Gly Gln Gly -Tyr Cys cys Asn Giu Met Asp χIe Len Glu210 " 215 SSC
Ala Asn Ser Arg Ala Asn Ala Met Thr ç*© His Pro Cys Ala Asn Gly525 £30 235 240
Ser Cys Asp Lys Ser Gly Cys Gly Lexs Asn Pro Tyr Ala Glu Gly Tyr245 ~ " 250 255
^ys S<sz Xyr Tyr Oly Ero Gly Leu -rbr Val Asp Thr Ser tys Pro Phs2 60 265 270
Jhr Xle Xls Thr Arg Phe Xls Thr Asp Asp Sly Thr Thr Ser Gly Thr275 260 2S5
Asn Glrs Ile Glss Arg Xle Tyr Val GIr. Asxs Gly Lys Thr Val Ala290 295 .300
Ser Ala Ala Ser -Sly Gly Asp Ile Xle Thr Ala Ser Gly Cys Thr Ser305 310 315 320
AIa Gln Ala Phe Giy Gly Leu Ala Asn Met Gly Ala Aia Leu Gly Arg325 33ΰ 335
Gly Met VaX Lan Tht Phe Ser Xls Trp Asr Asp Ala Giy Gly Tyr Mst340 345 350
Asn Trp Len Asp Ser Gly Asn Asn Gly Pro Cys Ser Ser Thr Slu Gly355 3 60 365Asn Pro Ser Asn Xls Leu Ala Asn Tyr Pro Asp Thr His Vai Val Piie370 375 330
Ser Asrs Ile Arq Trp Slv Asp Ils Gly Ser Thr Yal Sla Val Ser Gly365 390 395 400
Giy Gly Asn Gly Gly Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr Tbr Thr Lew Arg 405 410 415
Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Sro Thr Ala Thr Ala Thr His420 425 430
Trp Gly GIn Cys Gly Gly Tle Gly Trp Thr GIy Pro Thr Vai Cys Glu435 440 445
Ssr Pro Tyr Ala Cys Lys Giu Leu Asn Pro xrp Tyr Tyr GXn Cys Leu450 455 4 60
<210> 3<211> 136S<212> DKA<213> Thieiavia terxestris
<400> 3
accgatccgc. tcgaagatgg cgcccaagtc tacaçttctg gccqcctggc tgctctcctc éO
gcírggccgcg gcccagcsga tcggcaaagc cgtgcccgag gtccacccca aactgacaac 120
gcagaagtgc. actctccgcç gcgggfcgcaa gcctgtccge acctcggtcg tgctcgactc 180
gtccgcgcgc; acgctgcaca agytegggga ccccaacscc agctgc&geg tcggcggcga 240
cctçtgctcg gacgcgaagt cgrgcggcaa gaactgcgcg etcgaçggcg tcgactacgc 300
ggcccacggc; gtggcgacca agggcgacgc cctcacgctg caccagtggc tcsagggggc 350
cgacggcacc tracaggaccg tctcgccgcg cgtatacctc ctgggc.gagg acgggaagaa 4S0
ctaegaggac ttcaagctgc tc-ascgccga getcagcttc çacgtcgacg tgtcccagct 480
cgLctgcggc atçaaeggcg eeetgtactt ctccgagatg gagatggaeg geggecgcag 540
cccgctgaac ecggcgggcg ecaegtacyg cscgggctae tccgacgcge agtgccccaa £-00
grt;ggacttt atcaacggcg aggtatttct tcrctcttct gtfcttter.tt tccatcgctt 660
íttctgaccg gaatccgccc tcttagctca. «caccaac.ca cacgtscggg gcgt.gctgea 720
acgsçatgça catctgggag gccaacgcgc rggcgcaggc gctescgccg cac.ccgtgea 780
aegccacgcg ggtgtac-aag tgcgaeacgg cggacgagtg cgggcagccç gtgggcgtgt 840
gcg&cgaafcg ggggtgctcg tacsacccgf ccaacttcyg ggteaaggae t a c; Lacgggc SOOgcaacctgsc gotggacacg aaccgcaagt tcacggtgac çacgcagttc gtg&cçtcca SSC
acgggcgggc çg&cggcgag ctgaccçaga tccgçcggct çtacgtgcag g&cggcgtgg 1020
tgacccagaa ccacgcggtc acggcgçgcg gggcgacgta cgscaqcatc acçgacçgct 1080
r,c;tgcaacgc gacggcoaoc tgçacgcagc agcggggcgg gctcgr.gcgc atçgçcçagg 1140
c;c;a-;cggccg cggcatggtg ctcatcttca. goc;t:çtgggt tgacsacggc ggcttcafcgs 1200
actggctcça cagcggcaac gcc.gggccct gcaacgccac cgagggcgac ccggcccígs 12é0
tcctgcagca gcacccggac gccagcgtca ccttctcc.aa carccgstgy ggcgagatcg 1320
gcaçcacgta cssgagcgag tgcsgccact açaçtagaçjc ttgtaatt 1368
<210> 4
Leu Gly -Siti Asp Gly Lys Asn Tyt: Glu Asp Phs Lys Leu Leu Asn Ala
Mst Ala Pro Lys Ser Tiii- Val leu Ala Ala -Trp Leu Set Ser leu1 δ 1 ν; I-
Ala Ala Ala Glnl Glrs Xle Gly Lys Ala Val Pro Gl-i Vsl His Pro Lys20 25 30
Leu Thr Thr Gln Lys Cys Thr Leu Arg Gly Gly Cys Lys l?ro VaX Arg35 40 45
Shr Ser Val Val Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Leu His Lys Val Gly
50 S5 "60
Asp Pro Asis Thr Ser Cys Ser Val Gly Gly Asp Lsu Cys Ssr Asp Ala65" ?0 7 5 SO
Lys Ser Cys Gly Lys Asn Cys Ala Lsti Glu Gly Val Asp Tyr Ala Ala8S 90 SS
His Gly VaI Ala Thr Lys Gly Asp Aia Leu Thr Leu His Gln Trp LeaGlu Leu Ser Phe Asp Vai Asp Val Ssr Glk Leu Val Cys Gly Met Asn145 150 155 160
Gly Ala Leu Tyr Phe Ser Glu Met Glu Met Asp Gly Gly Arg Ser Pro1δ5 170 175
Leu Asn Pro Ala Gly Ala Thr Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala Gln,180 1S5 190
Cys pro Lys Leu Asp Phe Xle Asn Giy Glu Lsti Asn Thr Asn His Thr195 200 205
Tyr Gly Aia Cys Cys Asn Giu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ala Ieu210 215 250
Ala Gln Aia leu Thr Pro His Bso Cys Asn Aia Thr Ara Val Iys225 230 235 240
:ys Asp Thr Ala Asp Slu Cys Gly -SIn Ero Vsl Gly Val Cys Asp Glu245 250 255
Trp Glv Cvs Ser Tyr Asn Pro Ser Asrs Phe Gly Vai Lys Asp Tvr Tyr260 265 270
Gly Arg Asn Leu -Thr Val Asp Thr Ask A,rg Iys Phe yhr Val Thr Thr275 280 285
Gln Phe Vsl Thr Ser Asn Gly Arg AIa Asp Gly Slu Leu Thr Glu Ile250 295 300
Arg Arg Ley Tyr Val Gln Asp Gly Val Vai Tie Gln Asa Kis Ala Val305 310 315 320
Thr Ald Gly Gly Ala Thr Tyr Asp ser Ile Thr Asp GIy Phe Cys Asa325 330 335
Ala Thr Ala Thr Trp Thr Glr. Gln Artj Giy Gly Aia Arg Met Gly340 345 350
Glu Ala Xle Gly Arg Gly M«st Vai Leu Tle Phe Ser Leu Trp Val Asp355 360 365
Asn Gly Gly Phe Met Asn Txp Leu Asp Ser Gly Asn AIa Gly Fro Cys370 375 380Asn Ala Thr Glu SIy Asp Jro Ala Lsu Ile Leu Gln Gin Hts Pro Asp385 390 395 400
Aia Ser Val Tiir Phs Ser Asn lie Axg Txp Gly Glii Xle Sly Ser Thr405 410 415
Tyr Lys Ser Glu Cys Ser His420
<210> 5
<2i2> 1480
<2X2> DNA
<213> Cladorxhífitur. íoecuridissíiftuia
<400> 5
gatccgaatt cctcctctcg ttctttagtc acagaccaga catctgccca cgatggttca 60
caagttcacc ctcctcaccg gcctcgccgc ctccctcgca tctgcccagc agatcggcac 120
cgtcgtcccc gagtctcacc ccaagcttcc caccaagcgc tgcactctcg ccggtçgctg 180
ccagaccgtc gacacctcca tcgtcatcga cgccttccag cgtcccctcc acaagatcgg 240
cgacccttcc actccttgcg tcgtcggcgg ccctctctgc cccgacgcca agtcctgagc 300
tgagaactgc gcgctcgagg gtgtcgacta tgcctcctgg ggcatcaaga ccgagggcga 360
cgccctaact ctcaaccagt ggatgcccga cccggcgaac cctggccagt tgaagctcct 420
tactccccgt acttaccttg ttgctgagga cggcaagaac tacgaggatg tgaagctcct 480
ggctaaggag atctcgtttg atgccgatgt cagcaacctt ccctgcggca tgaacggtgc 540
tttctacttg tctgagatgt tgatggatgg tggacgtggc gacctcaacc ctgctggtgc 600
cgagtatggt accggttact gtgatgcgca gtgcttcaag ttggatttca tcaacggcga 660
ggccaacatc gaccaaaagc acggcgcctg ctgcaacgaa atggacattt tcgaatccaa 720
ctcgcgcgcc aagaccttcg tcccccaccc ctcgcaacat acgcaggtct acaagtgcga 780
aggcgaagac gagtgcggcc agcccgtcgg cgtgtgcgac aagtgggggt gcggcttcaa 840
cgagtacaaa tggggcgtcg agtccttcta cggccggggc tcgcagttcg ccatcgactc 9OO
ctccaagaag ttcaccgtca ccacgcagtt cctgaccgac aacggcaag aggacggcgt 950
cctcgtcgag atccgccgct tgtggcacca ggatggcaag ctgatcaaga acaccgctat 1020
ccaggttgag gagaactaca gcacggactc ggtgagcacc gagttctgcg agaagactgc 1080
ttctttcacc atgcagcgcg gtggtctcaa ggcgatgggc gaggctatcg gtcgtggtat 1140
ggtgctggtt fctcagcatct gggcgg&tgã ttcççgtttc atgaactggt tggatgcgga 1200
gggtaatggc ccttgcagcg cgactgaggg cgatccgaag gagattgtca agaataagcc 1260gçafcgctaçg gttacgtfcct easaeattag çafctggtgag çttggtagca cgtatçctcc 1320
çggtgggasg tçcggfcgtta agsgcaççgt tgc.tsggggg cttactgctt cttaaççggg 1380
gfcgfcgaagag açgaggaggt; gttçttgggg gttggagatç ataaxtgggc gag&tggtgt 1440
agagcgggtt gçtfcggaíat gaatacgttg sat.tggatçt 1480
<210> S <211> 440 <212> WRT <213> Ciad 0£ Xh inuis íoecund issis ÀvliáTl <400> 6 Met VaI His Lya ?he Ala Leu Leu Thr Gly 10 Leu Ala Ala Sar Leu 15 AlaSar Ala Gln Gln 0 0 Xle Gly Thr Val Vs* 25 Pro r *: v» Ser Kis Pro 30 Lys LevsPro Thr Lys 35 Arg Cys Thr Leu Ala 40 Gly Gly Cys GliJ Thr 45 Vâl Asp ThrSer Xle VaI 50 Xle Ala ?h-s 5 5 Gln Arg Pro Leu His SO Lys Xle G.i.y AspPro Ser Xhr <6 5 Pro Cys Vív χ 70 Val Gly Gly Pro Leu 7 S Cys VtQ Asp * 1 - Lys % 0Ser Cys Ala Sl v« Asn Cys *! M Leu Ví Vi Gly 90 Val Asp Tyr Ala Ser §5 τ,τρGly Xle Lys Thr 100 Glu Gly Asp Al a Leu 105 Tnx Leu Aan Gln Trp 110 Me í; ProAsp Prc Ala 115 i* Pro Gly Gln Tyr 120 Lys Thr Thr Thr Ero 125 Arg Thr TyrLeu Vai Ala 1.30 Gla Asp Gly Lys 135 As £1 Tyr Glu Asp Val 140 Lys Leu Leu AlaLyss Glis Xls 145 Ser Asp 150 Ala Asp Vs 1 Ser Asn 155 Leu Pro Cys Gly Mst 160A.sn Gly Ala Phe 165 teu Ser Glu Met Leu 170 Hst ASp GIy C-Iy ν 175 GlyAsp Ieu Assi Pro AIa Gly Ala Glu Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ala130 185 190
Glis Cys £he Iys Lesu Asp íhe Ile As» Sly GIu Ala Asa Xle Asp Gln135 2O0 205
Lys His Gly Ala Cys Cys Assi Glu Me· Asp IIe Phe Giu Ser As» Ser210 215 220
Arg Ala Lys Thr Phe Val Pro His Pro Cys Asrs Ile -Thr Gln Val Tyr225 230 235 240
Lys Cys Gixs Gly Glu Asp Giu Cys Gly Gln ¥ro Val Gly Val Cys Asp245 250 255
Jiys Trp Giy Cys Gly Phs Asn Glu Tyr Lys Trp Gly VaX Glu Ser Phe260 265 270
Tyr Gly Arg Gly Ssr Gln Fhe Ala Xls Asp Ser Ser Lys Lys Phe Thr275 230 285
Val Thr Thr GIn. Fhe Lexs Thr Asp Asis Gly Lys Glu Asp Gly VaX Leu250 295 300
Vai Glu Ils Arg Arg X-eu Trp His Glu Asp Gly Lys Leis Tle Lys Asn305 310 315 320
Thr AIa Ils Glri Val Glu Giu Asrs Tyr Ser. Thr Asp Ser Val Ser Thr325 330 335
Glu Phe Cys Glu Lys Thr Aia Ser Ph-a Thr Me?; Gln Arg Gly Giy .Leu
Lys Ala J-Jet Gly Siu Ala Ile Gly Axg Gly Ket Val Lsv. Vai Phe Ser355 360 365
Trp Ala Asp Asp Ser Gly Phe Met Asn Trp Leu Asp Ala Glu Gly370 375 380
Asn Gly Pro Cys Ser Ala Thr Glu Gly Asp Pro Lys Giu Ile VaX Lys385 390 3Ô5 400
Asn Lys Pro Asp Ala Arg VaX Thr Phe Ser Asii Ile Arg Ile Gly Glu105 410 4.15Val Gly Ser Thr Tyr Ala Pro Gly Gly Lys Cys Gly Val Lys Ser Arg420 425 430
Val Ala Arg Gly Lea Thr Ala Ser435 440
<210> 7<211> 26<212> DNA<213> Thielavia tsrrestris
<220><221> misc_feature<222> (15)..(15)<223> N-A,C,G, OU T
<220><221> misc_feature<222> (18)..(18)<223> N-A,C,G, OU T
<220><221> misc_feature<222> (21)..(21)<223> R=A OU G
<220><221> misc_feature<222> (21)..(21)<223> R=A OU G
<400> 7agggtgccgc tggtngtscc rtcrtc
<210> 8<211> 33<212> DNA<213> Thielavia tsrrestris
<220><221> misc_feature<222> (28)..(28)<223> Y=T OU C
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<210> 20<211> 29<212> DNA<213> Aspergillus oryzae
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<210> 21<211> 31<212> DNA<213> Aspergillus oryzae
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<210> 22<211> 36<212> DNA<213> Thielavia terrestris
<400> 22ctgçattac. catggcgccc aaçtctacag ttctçg
<210> 23<211> 38<212 > DNA<213> Thielavia terrestris
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<210> 24<211> 12<212> DNA<213> Claòorrhinu-r: foscu ndi s sir,;u;uctttccages ca
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Cladcrrhinum foectmciissinsum
<400> 25
ccacacttct cttccttcct c 21
<210> 26
<2X1> 21
<212 > DNA
<213> CIsdorrhinutn foecundis
ccccôtcctt. t&actsta.çtc 9 Zx

Claims (53)

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tematividade de endoglucanase, selecionado do grupo que consiste de:(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido tendo pelo menos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 2, pelo menos 70 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 4 ou pelo menos 85 % de identidade com opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 6;(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob condições de estringência pelo menos alta com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ IDNO: 5, (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5 ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii) ou sob condições de estringência pelomenos média-alta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreende aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii);(c) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque compreende uma seqüência de nucleotídeo tendo pelo menos 80 % deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1, pelo menos 70 % de identidade com a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 ou pelo menos 85 % de identidadecom a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 5; e(d) uma variante que compreende uma substituição, deleçãoe/ou inserção de um ou mais aminoácidos do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido tendopreferivelmente pelo menos 80% de identidade, mais preferivelmente pelomenos 85% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2; uma seqüência de aminoácido tendopreferivelmente pelo menos 70% de identidade, mais preferivelmente pelomenos 75% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% deidentidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 85% de identidade, omais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade, e ainda o maispreferivelmente pelo menos 95% de identidade com o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 4; ou uma seqüência de aminoácido tendo preferivelmentepelo menos 85% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 90% deidentidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade com opolipeptídeo maduro da SEQID NO: 6.
3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste da seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6: ou um fragmento desta tendoatividade de endoglucanase.
4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste da seqüência de aminoácido da SEQID NO. 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.
5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6.
6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sobcondições de estringência pelo menos alta com (i) a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5, (ii) a seqüência decDNA contida na seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou SEQ ID NO: 5 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) oupreferivelmente sob condições de estringência pelo menos média-alta e maispreferivelmente condições de estringência pelo menos alta com (i) aseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3. ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii).
7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende umaseqüência de nucleotídeo tendo preferivelmente pelo menos 80 % deidentidade, mais preferivelmente pelo menos 85 % de identidade, ainda maispreferivelmente pelo menos 90 % de identidade, e o mais preferivelmentepelo menos 95 % de identidade com a seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, uma seqüência de aminoácido tendopreferivelmente pelo menos 70 % de identidade, mais preferivelmente pelomenos 75 % de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 80 % deidentidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 85 % de identidade, omais preferivelmente pelo menos 90 % de identidade, e ainda o maispreferivelmente pelo menos 95 % de identidade com a seqüência que codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3: ou uma seqüência de aminoácidotendo preferivelmente pelo menos 85 % de identidade, mais preferivelmentepelo menos 90 % de identidade, e o mais preferivelmente pelo menos 95 % deidentidade com a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 5.
8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou queconsiste da SEQ ED NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5: ou umasubseqüência destas que codifica um fragmento de polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase.
9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo que compreende ou queconsiste da SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.
10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quecompreende ou que consiste da seqüência que codifica o polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5.
11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante que compreendeuma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQID NO: 6.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é codificado pelo polinucleotídeo contido noplasmídeo pPH50 que está contido na E. coli NRRL B-30899, pPH38 que estácontido na E. coli NRRL B-30896 ou pPH46 que está contido na E. coliNRRL B-30897.
13. Polipeptídeo de acordo com as reivindicações 1, 2, 5 ou 11,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo maduro tem aminoácidos de 23a 464 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4 ouaminoácidos de 19 a 440 da SEQ ID NO: 6.
14. Polipeptídeo de acordo com as reivindicações 1, 6, 7 ou 10,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1, nucleotídeos de 74 a1349 da SEQ ID NO: 3 ou nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQID NO: 5.
15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que tem ainda atividadeenzimática voltada para um ou mais substratos selecionados do grupo queconsiste de xilano, xiloglucano, arabinoxilano, 1,4-beta-D-manana egalactomanana.
16. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.
17. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação naseqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 3 ou SEQ ID NO: 5, em que a seqüência de nucleotídeo mutante codificao polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6,respectivamente.
18. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1, nucleotídeos de 74 a-1349 da SEQ ID NO: 3 ou nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 5 e opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 23 a 464 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4 ou aminoácidos de 19 a 440 daSEQ ID NO: 6.
19. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 16 a 18 operavelmente ligado a uma ou mais seqüências decontrole que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro deexpressão.
20. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definido nareivindicação 19.
21. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 19.
22. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagemproduz o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
23. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreende umaconstrução de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
24. Método para produzir um mutante a partir de uma célulaprecursora, caracterizado pelo fato de que compreende romper ou deletar umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, que resulta no mutante que produzmenos do polipeptídeo do que a célula precursora.
25. Célula mutante, caracterizada pelo fato de que é produzidapelo método como definido na reivindicação 24.
26. Célula mutante de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que compreende ainda um gene que codifica umaproteína nativa ou heteróloga.
27. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula mutante como definida nareivindicação 26, sob condições condutivas para a produção da proteína: e (b)recuperar a proteína.
28. Polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 18, caracterizado pelo fato de que é obtido pela (a)hibridização de uma população de DNA sob condições de estringência pelomenos alta com (i) a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5. (ii) a seqüência de cDNA contida na seqüênciaque codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5 ou(iii) um filamento complementar de (i) ou (ii) ou preferivelmente sobcondições de estringência pelo menos média-alta e mais preferivelmentecondições de estringência pelo menos alta com (i) a seqüência que codifica opolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3, (ii) a seqüência de DNA genômicoque compreende a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 3 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii): e (b) isolar opolinucleotídeo hibridizante, que codifica um polipeptídeo tendo atividade deendoglucanase.
29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1, nucleotídeos de 74 a 1349 da SEQ ID NO: 3 ou nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQID NO: 5.
30. Método para produzir um polinucleotídeo que compreendeuma seqüência de nucleotídeo mutante que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase, caracterizado pelo fato de que compreende: (a)introduzir pelo menos uma mutação na seqüência que codifica o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 5, em que aseqüência de nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 6: e(b) recuperar o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeomutante.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a seqüência que codifica o polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 79 a 1461 da SEQ ID NO: 1. nucleotídeos de 74 a 1349 daSEQ ID NO: 3 ou nucleotídeos de 107 a 1372 da SEQ ID NO: 5 e opolipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 23 a 464 da SEQ LD NO: 2,aminoácidos de 20 a 423 da SEQ ID NO: 4 ou aminoácidos de 19 a 440 daSEQID NO: 6.
32. Polinucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de que éproduzido pelo método como definido nas reivindicações 30 ou 31.
33. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar uma célula que compreenda opolinucleotídeo mutante como definido na reivindicação 32 que codifica opolipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b)recuperar o polipeptídeo.
34. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada auma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal quecompreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 22 da SEQ ID NO: 2,aminoácidos de 1 a 19 da SEQ ID NO: 4, aminoácidos de 1 a 18 da SEQ IDNO: 6, em que o gene é estranho à seqüência de nucleotídeo.
35. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 34.
36. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato de\que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 34.
37. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante comodefinida na reivindicação 36 sob condições condutivas para a produção daproteína; e (b) recuperar a proteína.
38. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou um célula de planta quecompreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo tendo atividadede endoglucanase sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo;e (b) recuperar o polipeptídeo.
39. Planta transgênica, parte de planta ou célula de planta,caracterizadas pelo fato de que foram transformadas com um polinucleotídeoque codifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15.
40. Método para degradar ou converter um material celulósico,caracterizado pelo fato de que compreende: tratar o material celulósico comuma composição que compreende uma quantidade eficaz de um polipeptídeotendo atividade de endoglucanase como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15 ou da célula hospedeira como definida nareivindicação 20.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que a composição compreende ainda uma quantidade eficaz deuma endo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase e/ou beta-D-glucosidase.
42. Método de acordo com as reivindicações 40 ou 41,caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo queconsiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase e peroxidase.
43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-40 a 42, caracterizado pelo fato de que o método é um processo de prétratamento; uma etapa em um processo de sacarificação e fermentaçãosimultâneo (SSF); ou uma etapa em um processo de hidrólise e fermentaçãohíbrido (HHF).
44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-40 a 43, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recuperar o materialcelulósico degradado ou convertido.
45. Método para produzir uma substância, caracterizado pelofato de que compreende: (a) sacarificar um material celulósico com umacomposição que compreende uma quantidade eficaz de um polipeptídeo tendoatividade de endoglucanase como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 15 ou a célula hospedeira como definida nareivindicação 20, (b) fermentar o material celulósico sacarificado da etapa (a)com um ou mais microorganismos de fermentação; e (c) recuperar asubstância da fermentação.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que a composição compreende ainda uma quantidade eficaz deendo-l,4-beta-glucanase, exo-l,4-beta-D-glucanase e/ou beta-D-glucosidase.
47. Método de acordo com as reivindicações 45 ou 46,caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda umaquantidade eficaz de uma ou mais enzimas selecionadas do grupo queconsiste de uma hemicelulase, esterase, protease, lacase e peroxidase.
48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-45 a 47, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) são realizadassimultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.
49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de-45 a 48, caracterizado pelo fato de que a substância é um álcool, ácidoorgânico, cetona, aminoácido ou gás.
50. Método para inibir a expressão de um polipeptídeo em umacélula, caracterizado pelo fato de que compreende administrar à célula ouexpressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA); emque o dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de umpolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQID NO: 4 ou SEQID NO: 6.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que o dsRNA tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. 22, 23, 24,-25 ou mais nucleotídeos duplex no comprimento.
52. Molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) para inibira expressão de um polipeptídeo em uma célula, caracterizada pelo fato de quea dsRNA compreende uma subseqüência ou porção de um polinucleotídeoque codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, SEQID NO: 4 ou SEQID NO: 6.
53. Molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA) de acordocom a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que tem cerca de 15, 16,-17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24. 25 ou mais nucleotídeos duplex nocomprimento.
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