DE69525084T2 - DNA-Mutagenese durch Zufallsfragmentierung und Wiederaufbau - Google Patents
DNA-Mutagenese durch Zufallsfragmentierung und WiederaufbauInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Polynucleotiden, die einen gewünschten Phänotyp verleihen und/oder ein Protein mit einer vorteilhaften festgelegten Eigenschaft codieren, die selektiert werden kann. In einem Aspekt wird das Verfahren eingesetzt, um Nucleinsäurefragmente, die mutierte Proteine codieren, zu erzeugen und zu selektieren,.
- Die Komplexität einer aktiven Sequenz eines biologischen Makromoleküls, z. B. von Proteinen, DNA usw., wurde als sein Informationsgehalt bezeichnet ("IC"; 5 bis 9). Der Informationsgehalt eines Proteins wurde als die Widerstandsfähigkeit des aktiven Proteins gegenüber einer Veränderung der Aminosäuresequenz definiert, die aus der Mindestzahl der unveränderlichen Aminosäuren (Bits) errechnet wird, die erforderlich sind, um eine Familie von verwandten Sequenzen mit der gleichen Funktion zu beschreiben (9, 10). Proteine, die empfindlich gegen eine Zufallsmutagenese sind, haben einen hohen Informationsgehalt. Im Jahr 1974, als diese Definition geprägt wurde, gab es die Proteindiversität nur als taxonomische Diversität.
- Die Entwicklungen der Molekularbiologie, wie Molekularbanken, machten es möglich, eine viel größere Zahl von variablen Basen zu identifizieren und sogar funktionelle Sequenzen aus Zufallsbanken zu selektieren. Die meisten Reste können verändert werden, jedoch typischerweise nicht alle zur gleichen Zeit, dies hängig davon ab, wie die Veränderungen im Zusammenhang kompensiert werden. Somit kann ein aus 100 Aminosäuren bestehendes Protein nur 2000 verschiedene Mutationen, jedoch 20¹&sup0;&sup0; mögliche Kombinationen von Mutationen enthalten.
- Die Informationsdichte ist der Informationsgehalt/Einheit-Länge einer Sequenz. Aktive Regionen von Enzymen tendieren dazu, eine hohe Informationsdichte aufzuweisen. Im Gegensatz dazu haben flexible Linker in Enzymen eine niedrige Informationsdichte (8).
- Herkömmliche Verfahren, die häufig zum Herstellen mutierter Proteine im Format einer Bank angewendet werden, sind die Error-prone- (fehlerauslösende) Polymerasekettenreaktion (11, 12, 19) und die Kassetten-Mutagenese (8, 20, 21, 22, 40, 41, 42), wobei die spezifische Region, die optimiert werden soll, durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonucleotid ersetzt wird. In beiden Fällen wird in der ursprünglichen Sequenz um bestimmte Stellen herum eine "Mutanten-Wolke" (4) erzeugt.
- Bei einer Error-prone-PCR werden für die Polymerisation Bedingungen mit niedriger Übereinstimmung verwendet, um eine kleine Anzahl von Punktmutationen nach dem Zufall in eine lange Sequenz einzuführen. Eine Error-prone-PCR kann eingesetzt werden, um ein Gemisch aus Fragmenten mit unbekannter Sequenz zu mutagenisieren. Jedoch legten Computersimulationen nahe, dass eine Punktmutagenese alleine häufig zu graduell sein kann, um die Block-Veränderungen möglich zu machen, die für eine fortlaufende Sequenzevolution erforderlich sind. Anhand der veröffentlichten Protokolle der Error-prone-PCR können DNA-Fragmente, die größer als 0,5 bis 1,0 kb sind, nicht amplifiziert werden, wodurch die praktische Anwendbarkeit dieses Verfahrens eingeschränkt wird. Außerdem führen wiederholte Zyklen einer Error-prone-PCR zu einem Akkumulieren neutraler Mutationen, die ein Protein z. B. immunogen machen können.
- Bei der Oligonucleotid-gesteuerten Mutagenese wird eine kurze Sequenz durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonucleotid ersetzt. Mit dieser Vorgehensweise können keine entfernten Mutationen kombiniert werden, weshalb sie nicht kombinatorisch ist. Die eingeschränkte Größe der Bank im Vergleich zu der riesigen Länge der Sequenz bedeutet, dass zum Optimieren des Proteins viele Selektionsrunden unvermeidlich sind. Für eine Mutagenese mit synthetischen Oligonucleotiden ist es erforderlich, dass die einzelnen Klone nach jeder Selektionsrunde sequenziert werden, anschließend werden sie in Familien gruppiert, eine einzelne Familie willkürlich ausgewählt und auf ein Konsensus-Motiv reduziert, das resynthetisiert und wieder in ein einzelnes Gen eingeführt wird, worauf eine weitere Selektion folgt. Durch dieses Verfahren entsteht ein statistischer Engpass, es ist arbeitsintensiv und es eignet sich in der Praxis nicht für viele Mutageneserunden.
- Die Error-prone-PCR und die Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese können somit für einzelne Zyklen zum Feineinstellen einer Sequenz eingesetzt werden, sie stoßen jedoch rasch an ihre Grenzen, wenn sie für mehrere Zyklen verwendet werden.
- Die Error-prone-PCR kann eingesetzt werden, um ein Gemisch aus Fragmenten mit unbekannter Sequenz zu mutagenisieren (11, 12). Ein Nachteil der veröffentlichten Protokolle der Error-prone-PCR (11, 12) ist jedoch die geringe Prozessivität der Polymerase. Aus diesem Grund kann mit diesem Verfahren keine Zufallsmutagenese eines Gens durchschnittlicher Größe erhalten werden. Diese Unfähigkeit schränkt die praktische Anwendbarkeit der Error-prone-PCR ein.
- Eine weitere deutliche Einschränkung der Error-prone-PCR besteht darin, dass die Rate von Abwärts-Mutationen mit dem Informationsgehalt der Sequenz zunimmt.
- Bei einem bestimmten Informationsgehalt, einer bestimmten Bankgröße und einer bestimmten Mutageneserate verhindert das Gleichgewicht von Abwärts-Mutationen zu Aufwärts-Mutationen statistisch, dass weitere Verbesserungen selektiert werden können (statistische Höchstgrenze).
- Schließlich führen wiederholte Zyklen der Error-prone-PCR zu einem Akkumulieren neutraler Mutationen, die z. B. die Immunogenität, nicht jedoch die Bindungsaffinität beeinträchtigen können.
- Aus diesem Grund wurde gefunden, dass die Error-prone-PCR zu graduell ist, um Block-Veränderungen zuzulassen, die für eine fortlaufende Sequenzevolution erforderlich sind (1, 2).
- Bei der Kassetten-Mutagenese wird ein Sequenzblock einer einzelnen Matrize typischerweise durch eine (partiell) randomisierte Sequenz ersetzt. Deshalb ist der maximale Informationsgehalt, der erhalten werden kann, durch die Zahl der Zufallssequenzen statistisch begrenzt (d. h. die Größe der Bank). Hierdurch entsteht ein statistischer Engpass, durch den andere Sequenzfamilien ausgeschlossen werden, die im Moment zwar nicht die besten sind, die aber möglicherweise langfristig ein größeres Potential haben.
- Ferner ist es bei der Mutagenese mit synthetischen Oligonucleotiden erforderlich, die einzelnen Klone nach jeder Selektionsrunde zu sequenzieren (20). Aus diesem Grund ist diese Vorgehensweise langwierig und für viele Mutageneserunden in der Praxis nicht geeignet.
- Die Error-prone-PCR und die Kassetten-Mutagenese sind somit am besten zum Feineinstellen von Bereichen von vergleichsweise niedrigem Informationsgehalt geeignet und wurden dafür häufig eingesetzt. Eine offensichtliche Ausnahme stellt die Selektion eines RNA-Ligase-Ribozyms aus einer Zufallsbank dar, wobei viele Amplifikationsrunden mit der Error-prone-PCR und Selektion angewendet wurden (13).
- Es zeigt sich immer deutlicher, dass die Verfahren zum Gestalten rekombinanter linearer biologischer Sequenzen, wie Proteine, RNA und DNA, nicht so wirkungsvoll sind wie die von der Natur entwickelten Verfahren. Dass immer bessere Mutanten gefunden werden, hängt davon ab, dass immer größere Sequenzen innerhalb immer größerer Banken gescreent werden, wobei immer mehr Zyklen der mutagenen Amplifikation und Selektion erforderlich sind. Die vorliegenden Mutageneseverfahren, die verbreitet verwendet werden, unterliegen jedoch deutlichen Beschränkungen, wenn sie für wiederholte Zyklen eingesetzt werden sollen, wie vorstehend diskutiert.
- Die Evolution der meisten Organismen erfolgt durch die natürliche Selektion und die sexuelle Fortpflanzung. Durch die sexuelle Fortpflanzung wird das Shuffling und das Kombinieren der Gene der Nachkommenschaft der ausgewählten Individuen sichergestellt. Während der Meiose lagern sich die homologen Chromosomen aus den Eltern aneinander und führen mit einem bestimmten Teil von ihnen ein Crossover durch, wodurch genetisches Material ausgetauscht wird. Durch dieses Austauschen oder Shuffling der DNA wird es möglich, dass sich die Organismen schneller entwickeln (1, 2). Da die eingefügten Sequenzen sich in einer homologen Umgebung als nützlich erwiesen haben, besteht bei der sexuellen Rekombination eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass die eingefügten Sequenzen auch noch einen wesentlichen Informationsgehalt haben, sobald sie in eine neue Sequenz eingefügt sind.
- Marton et al. (27) beschreiben die Verwendung von PCR, um in vitro die Rekombination in einem Plasmid zu überwachen, das direkt wiederholte Sequenzen aufweist. Marton et al. stellen fest, dass während der PCR infolge von Bruch oder Nicking der DNA eine Rekombination stattfindet. Hierdurch entstehen rekombinante Moleküle. Auch Meyerhans et al. (23) beschreiben das Auftreten einer DNA-Rekombination während der in vitro-PCR.
- Der Begriff Angewandte Molekulare Evolution (Applied Molecular Evolution, DAME") bedeutet, dass ein Algorithmus zum evolutionären Gestalten an einem spezifischen geeigneten Ziel angewendet wird. Obwohl viele unterschiedliche Bankformate für AME beschrieben wurden, nämlich für Polynucleotide (3, 11-14), Peptide und Proteine (Phagen (15-17), lacI (18) und Polysomen), wurde jedoch in keinem dieser Formate eine Rekombination durch zufällige Crossover eingesetzt, um gezielt eine kombinatorische Bank herzustellen.
- Theoretisch gibt es bei einem aus 100 Aminosäuren bestehenden Protein 2000 verschiedene Einzelmutanten. Ein Protein mit 100 Aminosäuren hat 20¹&sup0;&sup0; mögliche Kombinationen von Mutationen, diese Zahl ist jedoch zu groß, um durch herkömmliche Verfahren vollständig erforscht werden zu können. Deshalb wäre es vorteilhaft, ein System zu entwickeln, mit dem alle diese möglichen Kombinationsmutationen erzeugt und gescreent werden könnten.
- Winter und Mitarbeiter. (43, 44) haben ein stellenspezifisches in vivo- Rekombinationssystem eingesetzt, um Gene der leichten Antikörperkette mit Genen der schweren Antikörperkette für die Expression in einem Phagensystem zu kombinieren. Ihr System ist jedoch auf spezifische Rekombinationsstellen angewiesen und dadurch eingeschränkt. Hayashi et al. (48) beschreiben eine gleichzeitige Mutagenese von Antikörper-CDR-Regionen in einzelkettigen Antikörpern (scFv) durch überlappende Ausdehnung und PCR.
- Caren et al. (45) beschreiben ein Verfahren zum Erzeugen einer großen Population von Mehrfachmutanten unter Verwendung einer zufälligen in vivo-Rekombination. Für ihr Verfahren ist jedoch die Rekombination Von zwei unterschiedlichen Plasmidbanken erforderlich, von denen jede Bank einen anderen selektierbaren Marker aufweist. Deshalb ist dieses Verfahren auf eine begrenzte Anzahl von Rekombinationen beschränkt, die der Zahl der vorliegenden selektierbaren Markern entspricht, und führt gleichzeitig zu einer linearen Zunahme der Anzahl von Markergenen, die mit der (den) selektierten Sequenz(en) verbunden sind.
- Calogero et al. (46) und Galizzi et al.. (47) berichten, dass durch eine in vivo- Rekombination zwischen zwei homologen, jedoch verkürzten Insektentoxin-Genen auf einem Plasmid ein Hybridgen erzeugt werden kann. Radman et al. (49) beschreiben eine in vivo-Rekombination von im wesentlichen fehlgepaarten DNA-Sequenzen in einer Wirtszelle, die defekte Fehlpaarungs-Reparatur-Enzyme aufweist, wodurch ein Hybridmolekül gebildet wird.
- Demgemäß wäre es vorteilhaft, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem große Banken mutierter DNA, RNA oder Proteine hergestellt und bestimmte Mutanten für einen gewünschten Zweck selektiert werden können. Die hier beschriebene Erfindung betrifft die Verwendung von wiederholten Zyklen der Mutagenese, in vivo-Rekombination und Selektion, wodurch eine gezielte molekulare Evolution von hochkomplexen linearen Sequenzen, wie DNA, RNA oder Proteinen, in vivo durch Rekombination erfolgen kann.
- Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der Erfindung mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen verdeutlicht.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen einer ausgewählten Polynucleotidsequenz oder einer Population von ausgewählten Polynucleotidsequenzen, typischerweise in Form von amplifizierten und/oder klonierten Polynucleotiden, wodurch die ausgewähte(n) Polynucleotidsequenz(en) ein gewünschtes phänotypisches Merkmal besitzt (besitzen) (z. B. codieren sie ein Polypeptid, fördern die Transkription von gebundenen Polynucleotiden, binden ein Protein und dergleichen), nach dem selektiert werden kann. Ein Verfahren zum Identifizieren von Polypeptiden, die eine gewünschte Struktur oder funktionelle Eigenschaft besitzen, wie z. B. das Binden an ein festgelegtes biologisches Makromolekül (z. B. einen Rezeptor), umfasst das Screening einer großen Bank von Polypeptiden nach einzelnen Bankmitgliedern, die die gewünschte Struktur oder die gewünschte funktionelle Eigenschaft besitzen, die durch die Aminosäuresequenz des Polypeptids verliehen wird.
- Die vorliegende Erfindung kann, obwohl dies hier nicht als spezifische Ausführungsform beansprucht wird, an Banken von präsentierten Polypeptiden oder präsentierten Antikörpern angewendet werden, die für ein Screening mittels Affinitäts-Wechselwirkung oder ein phänotypisches Screening geeignet sind.
- Gegebenenfalls umfasst das Verfahren den weiteren Schritt zum Screening der Bankmitglieder des geshuffelten Pools, um einzelne Mitglieder der geshuffelten Bank zu identifizieren, die die Fähigkeit besitzen, an ein festgelegtes Makromolekül, wie z. B. einen proteinartigen Rezeptor, ein Peptid, Oligosaccharid, Virion oder eine andere festgelegte Verbindung oder Struktur, zu binden oder damit auf andere Weise zu interagieren (z. B. als katalytische Antikörper). Die präsentierten Polypeptide, Antikörper, peptidomimetischen Antikörper und Sequenzen der variablen Region, die aus solchen Banken identifiziert werden, können für Therapie, Diagnose, Forschung und damit zusammenhängende Zwecke (z. B. Katalysatoren, gelöste Stoffe zum Erhöhen der Osmolarität einer wässrigen Lösung und dergleichen) eingesetzt und/oder einem oder mehreren Zyklen des Shuffling und/oder der Affinitätsselektion unterworfen werden. Das Verfahren kann so modifiziert werden, dass der Selektionsschritt darin besteht, nach einem phänotypischen Merkmal zu selektieren, das ein anderes ist als die Bindungsaffinität für ein festgelegtes Molekül (z. B. nach einer katalytischen Aktivität, Stabilität, Oxidationsresistenz, Arzneistoffresistenz oder einem nachweisbaren Phänotyp, der einer Wirtszelle verliehen wird).
- In einer Ausführungsform wird die erste Vielzahl von selektierten Mitgliedern der Bank in vitro fragmentiert, die resultierenden Fragmente in eine Wirtszelle oder einen Wirtsorganismus eingeführt und homolog rekombiniert, wodurch geshuffelte Mitglieder der Bank in vivo gebildet werden.
- In einer Ausführungsform wird die erste Vielzahl von selektierten Mitgliedern der Bank auf episomal replizierbaren Vektoren kloniert oder amplifiziert, mehrere Vektoren in eine Zelle eingeführt und homolog rekombiniert, wodurch geshuffelte Mitglieder der Bank in vivo gebildet werden.
- In einer Ausführungsform wird die erste Vielzahl von selektierten Mitgliedern der Bank nicht fragmentiert, sondern auf einem episomal replizierbaren Vektor als eine direkte Wiederholung cloniert oder amplifiziert, wobei jede Wiederholung eine bestimmte Spezies einer ausgewählten Bankmitglied-Sequenz umfasst, der Vektor in eine Zelle eingeführt und durch Rekombination innerhalb des Vektors homolog rekombiniert, wodurch geshuffelte Mitglieder der Bank in vivo gebildet werden.
- Das hier beschriebene in vivo-Shuffling kann mit einem in vitro-Shuffling kombiniert werden, welches die Aufgabe der Europäischen Patentanmeldung Nr. 95 911 826.6 darstellt. Referenzen des in vitro-Shuffling dienen deshalb lediglich der Erläuterung.
- Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung von Polynucleotid-Shuffling in vivo bereit, um Polypeptide-codierende Polynucleotide und/oder Polynucleotide, die transkriptionale regulatorische Sequenzen umfassen, einem Shuffling zu unterwerfen.
- Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung von Polynucleotid-Shuffling bereit, um eine Population viraler Gene (z. B. Kapsidproteine, Spike-Glykoproteine, Polymerasen, Proteasen usw.) oder viraler Genome (z. B. Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Herpesviren, Retroviren, Reoviren, Rhinoviren usw.) einem Shuffling zu unterwerfen. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Shuffling von Sequenzen bereit, die die Gesamtheit oder Teile von immunogenen viralen Proteinen codieren, um neue Kombinationen von Epitopen und außerdem neue Epitope durch Rekombination zu erzeugen; solche geshuffelten viralen Proteine können Epitope oder Kombinationen von Epitopen umfassen, bei denen die Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie in der natürlichen Umgebung als Folge der viralen Evolution auftreten (z. B. als Rekombination von Influenzavirusstämmen).
- Die Erfindung stellt außerdem ein Verfahren bereit, das zum Shuffling von Polynucleotidsequenzen geeignet ist, mit denen Vektoren für die Gentherapie und Replikations-defekte Konstrukte für die Gentherapie erzeugt werden können, die z. B. für eine Gentherapie beim Menschen eingesetzt werden können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Impfvektoren für eine DNA-basierte Impfung, und außerdem eine antineoplastische Gentherpie und andere Formate der Gentherapie.
- Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung, in der das mutagene Shuffling mit der Error-prone-PCR verglichen wird; (a) die anfängliche Bank; (b) Pool der selektierten Sequenzen in der ersten Runde der Affinitätsselektion; (d) in vitro-Rekombination der selektierten Sequenzen ("Shuffling"); (f) Pool der selektierten Sequenzen in der zweiten Runde der Affinitätsselektion nach dem Shuffling; (c) Error-prone-PCR; (e) Pool der selektierten Sequenzen in der zweiten Runde der Affinitätsselektion nach der Error-prone-PCR.
- In Fig. 2 wird der Wiederzusammenbau eines 1,0-kb-großen LacZ-alpha-Genfragments aus 10- bis 50-bp-großen Zufallsfragmenten erläutert. (a) Photo eines Gels eines PCR-amplifizierten DNA-Fragments, das das LacZ-alpha-Gen enthält. (b) Photo eines Gels von DNA-Fragmenten nach dem Spalten mit DNase I. (c) Photo eines Gels von DNA-Fragmenten mit 10 bis 50 bp, gereinigt aus dem gespaltenen LacZ-alpha- Gen-DNA-Fragment; (d) Photo eines Gels der 10- bis 50-bp-großen DNA-Fragmente nach der angegebenen Zahl von Zyklen des DNA-Wiederzusammenbaus; (e) Photo eines Gels des Rekombinationsgemisches nach Amplifikation durch PCR mit Primern.
- In Fig. 3 sind die Stopp-Codon-Mutanten des LacZ-alpha-Gens und ihre DNA- Sequenzen schematisch dargestellt. Die von den Kästchen umgebenen Regionen sind heterologe Bereiche, die als Marker dienen. Die Stopp-Codons liegen in den kleineren Kästchen oder sind unterstrichen. "+" bezeichnet ein Wildtyp-Gen, und "-" bezeichnet einen mutierten Bereich im Gen.
- In Fig. 4 ist das Einführen oder Spiking eines synthetischen Oligonucleotids in den Prozess des Wiederzusammenbaus des LacZ-alpha-Gens schematisch dargestellt.
- In Fig. 5 werden die Homologie-Regionen zwischen einem murinen IL1-B-Gen (M) und einem menschlichen IL1-B-Gen (H) mit E. coll-Codonpräferenz erläutert. Die Heterologie-Regionen sind von Kästchen umgeben. Mit dem Symbol " " sind Crossover bezeichnet, die beim Shuffling der zwei Gene erhalten wurden.
- In Fig. 6 ist das Antikörper-CDR-Shuffling-Modellsystem unter Verwendung des scFv des Anti-Kanichen-IgG-Antikörpers (A1 0B) schematisch dargestellt.
- In Fig. 7 wird die festgestellte Häufigkeit des Auftretens bestimmter Kombinationen von CDRs in der geshuffelten DNA des scFv des Anti-Kanichen-IgG-Antikörpers (A10B) erläutert.
- In Fig. 8 wird die verbesserte Avidität des scFv des Anti-Kanichen-IgG-Antikörpers nach DNA-Shuffling und jedem Selektionszyklus erläutert.
- In Fig. 9 sind pBR322-Sfi-BL-LA-Sfi und eine intraplasmidische in vivo-Rekombination über direkte Wiederholungen und außerdem die Rate der Erzeugung von Ampicillin-resistenten Kolonien durch intraplasmidische Rekombination zum Wiederherstellen eines funktionellen β-Lactamase-Gens schematisch dargestellt.
- In Fig. 10 sind pBR322-Sfi-2Bla-Sfi und eine intraplasmidische in vivo-Rekombination über direkte Wiederholungen und außerdem die Rate der Erzeugung von Ampicillin-resistenten Kolonien durch intraplasmidische Rekombination zum Wiederherstellen eines funktionellen β-Lactamase-Gens schematisch dargestellt.
- In Fig. 11 wird das Verfahren erläutert, mit dem die Wirksamkeit von mehreren Runden einer homologen Rekombination nach dem Einführen von Polynucleotidfragmenten in Zellen zum Erzeugen rekombinanter Proteine getestet wird.
- In Fig. 12 ist das Herstellen einer Bank von Vektoren durch Shuffling von Kassetten an den folgenden Loci schematisch dargestellt: Promotor, Leader-Peptid, Terminator, selektierbares Arzneistoffresistenz-Gen und Replikationsursprung. Die mehreren parallelen Linien an jedem Locus sollen die Multiplizität von Kassetten für diese Kassette darstellen.
- In Fig. 13 sind einige Beispiele von Kassetten schematisch dargestellt, die zum Konstruieren prokaryotischer Vektorbanken durch Shuffling an verschiedenen Loci geeignet sind.
- In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Entwickeln einer Polynucleotidsequenz zum Erwerb einer gewünschten funktionellen Eigenschaft oder eines gewünschten Merkmals bereit, umfassend:
- (1) Bereitstellen einer Ausgangspopulation von Varianten der Polynucleotidsequenz, die aus mindestens ersten und zweiten Formen der Polynucleotidsequenz besteht, wobei mindestens eine der Varianten in einer zellfreien Form vorliegt;
- (2) Rekombinieren der Varianten in einer Wirtszelle, wodurch eine Bank von rekombinanten Polynucleotiden bereitgestellt wird;
- (3) Screenen oder Selektieren der rekombinanten Polynucleotide, wodurch mindestens ein erstes rekombinantes Polynucleotid aus der Bank aufgrund der Entwicklung hin zu der gewünschten Eigenschaft oder dem gewünschten Merkmal identifiziert wird;
- (4) Rekombinieren des (der) selektierten rekombinanten Polynucleotids (Polynucleotide) mit einer weiteren Form der Polynucleotidsequenz, die gleich sein kann wie eine Variante der Ausgangspopulation oder die davon verschieden sein kann, wodurch eine weitere Bank von rekombinanten Polynucleotiden bereitgestellt wird;
- (5) Screenen oder Selektieren weiterer rekombinanter Polynucleotide aus der weiteren Bank aufgrund der weiteren Entwicklung hin zu der gewünschten Eigenschaft oder dem gewünschten Merkmal; und
- (6) gegebenenfalls Wiederholen der Schritte (4) und (5), sofern erforderlich, wodurch ein rekombinantes Polynucleotid erhalten wird, das die gewünschte funktionelle Eigenschaft oder das gewünschte Merkmal aufweist.
- Bevor diese Erfindung genauer diskutiert wird, werden zuerst die folgenden Begriffe definiert.
- Die nachstehenden Begriffe, die hier verwendet werden, haben die folgenden Bedeutungen:
- Der Begriff "DNA-Wiederzusammenbau" wird verwendet, wenn eine Rekombination zwischen identischen Sequenzen erfolgt.
- Im Gegensatz dazu wird der Begriff "DNA-Shuffling" hier verwendet, um eine Rekombination zwischen im wesentlichen homologen, nicht jedoch identischen Sequenzen zu bezeichnen, wobei in einigen Ausführungsformen ein DNA-Shuffling ein Crossover via nicht-homologe Rekombination umfassen kann, z. B. über cre/lox- und/oder flp/frt-Systeme und dergleichen.
- Der Begriff "Amplifikation" bedeutet, dass die Kopienzahl eines Nucleinsäurefragments erhöht wird.
- Der Begriff "identisch" oder "Identität" bedeutet, dass zwei Nucleinsäuresequenzen die gleiche Sequenz oder eine komplementäre Sequenz haben. Somit bedeutet "Bereiche mit Identität", dass Regionen oder Bereiche eines Nucleinsäurefragments oder Polynucleotids mit einem anderen Polynucleotid oder Nucleinsäurefragment identisch oder dazu komplementär sind.
- Der Begriff "entspricht" bedeutet hier, dass eine Polynucleotidsequenz homolog ist (d. h., sie ist identisch, nicht streng evolutionär verwandt) zu einer gesamten oder einem Teil einer Referenz-Polynucleotidsequenz, oder dass eine Polynucleotidsequenz zu einer Referenz-Polypeptidsequenz identisch ist. Im Gegensatz dazu wird der Begriff "komplementär zu" hier verwendet, um die komplementäre Sequenz zu bezeichnen, die zu einer gesamten Referenz-Polynucleotidsequenz oder einem Teil davon homolog ist. Zur Erläuterung wird angemerkt, dass die Nucleotidsequenz "TATAC" einer Referenzsequenz "TATAC" entspricht und komplementär zu einer Referenzsequenz "GTATA" ist.
- Die folgenden Begriffe werden verwendet, um die Beziehungen zwischen Sequenzen aus zwei oder mehreren Polynucleotiden zueinander zu beschreiben: "Referenzsequenz", "Vergleichsfenster", "Sequenzidentität", "Prozentsatz der Sequenzidentität" und "wesentliche Identität". Eine "Referenzsequenz" ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird; eine Referenzsequenz kann eine Untergruppe einer größeren Sequenz sein, z. B. ein Segment einer cDNA der vollen Länge, oder eine Gensequenz, die in einem Sequenzprotokoll angegeben ist, z. B. eine Polynucleotidsequenz von Fig. 1 oder Figur, 2 (b), oder sie kann eine vollständige cDNA oder Gensequenz umfassen. Im allgemeinen weist eine Referenzsequenz eine Länge von mindestens 20 Nucleotiden, häufig eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden und öfters eine Länge von mindestens 50 Nucleotiden auf. Da zwei Polynucleotide jeweils (1) eine Sequenz umfassen können (d. h. einen Teil der vollständigen Polynucleotidsequenz), die zwischen den zwei Polynucleotiden ähnlich ist, und (2) außerdem eine Sequenz umfassen können, die zwischen den zwei Polynucleotiden verschieden ist, werden Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehreren) Polynucleotiden typischerweise durchgeführt, indem die Sequenzen der zwei Polynucleotide in einem "Vergleichsfenster" verglichen werden, um lokale Regionen mit Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen.
- Der hier verwendete Begriff "Vergleichsfenster" bezieht sich auf ein begriffliches Segment von mindestens 20 aneinandergrenzenden Nucleotidpositionen, wobei eine Polynucleotidsequenz mit einer Referenzsequenz von mindestens 20 aneinandergrenzenden Nucleotiden verglichen werden kann und wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d. h. Lücken, "gaps") von 20% oder weniger im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Ausrichten der zwei Sequenzen umfassen kann. Ein optimales Ausrichten von Sequenzen zum Ausrichten eines Vergleichsfensters kann erfolgen durch den Algorithmus der lokalen Homologie von Smith und Waterman. (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482, durch den Algorithmus des Homologie-Ausrichtens von Needleman und Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48: 443, durch das Verfahren zur Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444, durch EDV-Implementierungen dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA in dem Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Inspektion, und das beste Ausrichten (d. h. das den höchsten Prozentsatz an Homologie im Vergleichsfenster ergibt), das durch die verschiedenen Verfahren erzeugt wird, wird ausgewählt.
- Der Begriff "Sequenzidentität" bedeutet, dass zwei Polynucleotidsequenzen im Vergleichsfenster identisch sind (d. h. auf einer Nucleotid-zu-Nucleotid-Basis). Der Begriff »Prozentsatz der Sequenzidentität" wird berechnet, indem zwei optimal ausgerichtete Sequenzen im Vergleichsfenster verglichen werden, die Zahl der Positionen bestimmt wird, an denen in beiden Sequenzen die identische Nucleinsäurebase (z. B., A, T, C, G, U oder I) vorliegt, wodurch die Zahl der übereinstimmenden Positionen erhalten wird, die Zahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster geteilt wird (d. h. die Fenstergröße) und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird, wodurch der Prozentsatz der Sequenzidentität erhalten wird. Der hier verwendete Begriff "wesentliche Identität" bedeutet ein Merkmal einer Polynucleotidsequenz, wobei das Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die im Vergleich zu einer Referenzsequenz in einem Vergleichsfenster von mindestens 20 Nucleotidpositionen, häufig in einem Fester von mindestens 25 bis 50 Nucleotiden, eine Sequenzidentität von mindestens 80%, vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 85% und häufig eine Sequenzidentität von 90 bis 95%, häufiger eine Sequenzidentität von mindestens 99% aufweist, wobei der Prozentsatz der Sequenzidentität berechnet wird, indem die Referenzsequenz mit der Polynucleotidsequenz verglichen wird, die Deletionen oder Additionen umfassen kann, die insgesamt 20% oder weniger der Referenzsequenz im Vergleichsfenster ausmachen.
- Konservative Aminosäuresubstitutionen beziehen sich auf die Austauschbarkeit von Resten mit ähnlichen Seitenketten. Z. B. stellen eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin dar; eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Hydroxyl-Seitenketten stellen Serin und Threonin dar; eine Gruppe von Aminosäuren mit Amid-enthaltenden Seitenketten sind Asparagin und Glutamin; eine Gruppe von Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten sind Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan; eine Gruppe von Aminosäuren mit basischen Seitenketten stellen Lysin, Arginin und Histidin dar; und eine Gruppe von Aminosäuren mit Schwefel-enthaltenden Seitenketten stellen Cystein und Methionin dar. Bevorzugte Gruppen konservativer Aminosäuresubstitutionen sind: Valin-Leucin-Isoleucin, Phenylalanin-Tyrosin, Lysin-Arginin, Alanin-Valin und Asparagin-Glutamin.
- Der Begriff "homolog" oder "homeolog" bedeutet, dass eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz mit einer komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann. Der Hybridisierungsgrad kann von verschiedenen Faktoren abhängen, umfassend das Ausmaß an Identität zwischen den Sequenzen und die Hybridisierungsbedingungen, wie Temperatur und Salzkonzentration wie später besprochen. Vorzugsweise ist die Region mit Identität größer als etwa 5 bp, stärker bevorzugt ist die Region mit Identität größer als 10 bp.
- Der Begriff "heterolog" bedeutet, dass eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz nicht in der Lage ist, mit einer anderen einzelsträngigen Nucleinsäuresequenz oder ihrem Komplement zu hybridisieren. Somit bedeutet der Begriff Bereiche mit Heterologie, dass Nucleinsäurefragmente oder Polynucleotide Bereiche oder Regionen in der Sequenz aufweisen, die nicht in der Lage sind, mit einer anderen Nucleinsäure oder mit einem anderen Polynucleotid zu hybridisieren. Solche Regionen oder Bereiche sind z. B. Bereiche mit Mutationen.
- Der hier verwendete Begriff "verwandt" bezieht sich auf eine Gensequenz, die zwischen Arten evolutionär und funktionell in Beziehung zueinander stehen. Zum Beispiel, jedoch nicht zur Einschränkung kann erwähnt werden, dass im menschlichen Genom das menschliche CD4-Gen das Gen ist, das mit dem CD4-Gen der Maus verwandt ist, da die Sequenzen und Strukturen dieser zwei Gene zeigen, dass sie hoch-homolog sind, und beide Gene ein Protein codieren, das funktioniert, indem es die Aktivierung von T-Zellen über eine MHC-Klasse-II-beschränkte Antigenerkennung signalisiert.
- Der Begriff "Wildtyp" bedeutet, dass das Nucleinsäurefragment keine Mutationen umfasst. Ein "Wildtyp"-Protein bedeutet, dass das Protein in einem Aktivitätsniveau aktiv ist, das in der Natur auftritt, und die in der Natur zu findende Aminosäuresequenz umfasst.
- Der Begriff "verwandte Polynucleotide" bedeutet, dass Regionen oder Bereiche der Polynucleotide identisch sind und Regionen oder Bereiche der Polynucleotide heterolog sind.
- Der Begriff "chimäres Polynucleotid" bedeutet, dass das Polynucleotid Regionen, die Wildtyp-Regionen sind, und Regionen umfasst, die mutiert sind. Er kann außerdem bedeuten, dass das Polynucleotid Wildtyp-Regionen aus dem einen Polynucleotid und Wildtyp-Regionen aus einem anderen verwandten Polynucleotid enthält.
- Der Begriff "Spalten" bedeutet das Abbauen des Polynucleotids mit Enzymen oder das Aufbrechen des Polynucleotids.
- Der hier verwendete Begriff "Population" bedeutet eine Sammlung von Komponenten, wie Polynucleotiden, Nucleinsäurefragmenten oder Proteinen. Eine gemischte Population" bedeutet eine Sammlung von Komponenten, die zu der gleichen Familie von Nucleinsäuren oder Proteinen gehören (d. h., die verwandt sind), die sich jedoch in ihrer Sequenz unterscheiden (d. h., die nicht identisch sind) und die sich somit in ihrer biologischen Aktivität unterscheiden.
- Der Begriff "spezifisches Nucleinsäurefragment" bedeutet ein Nucleinsäurefragment mit bestimmten Endpunkten und einer bestimmten Nucleinsäuresequenz. Zwei Nucleinsäurefragmente, von denen das eine Nucleinsäurefragment die identische Sequenz wie ein Teil des zweiten Nucleinsäurefragments, jedoch unterschiedliche Enden hat, umfassen zwei unterschiedliche spezifische Nucleinsäurefragmente.
- Der Begriff "Mutationen" bedeutet Änderungen in der Sequenz einer Wildtyp- Nucleinsäuresequenz oder Änderungen in der Sequenz eines Peptids. Solche Mutationen können Punktmutationen sein, wie Transitionen oder Transversionen. Die Mutationen können Deletionen, Insertionen oder Duplikationen sein.
- In der hier verwendeten Polypeptid-Nomenklatur ist die Links-Richtung die aminoterminale Richtung und die Rechts-Richtung die carboxyterminale Richtung, gemäß herkömmlicher Verwendung und Konvention. Entsprechend, sofern nichts anderes angegeben ist, stellt das linke Ende von einzelstängigen Polynucleotidsequenzen das 5'- Ende dar; und die Links-Richtung von doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen wird als die 5'-Richtung bezeichnet Die Richtung einer 5'-zu-3'-Addition von naszierenden RNA-Transkripten wird als die Transkriptionsrichtung bezeichnet; Sequenzregionen auf dem DNA-Strang, die die gleiche Sequenz wie die RNA aufweisen und die 5' zum 5'- Ende des RNA-Transkripts liegen, werden als Stromaufwärts-Sequenzen" bezeichnet; Sequenzregionen auf dem DNA-Strang, die die gleiche Sequenz wie die RNA aufweisen und die 3' zum 3'-Ende des codierenden RNA-Transkripts liegen, werden als "Stromabwärts-Sequenzen" bezeichnet.
- Der Begriff "natürlich vorkommend", der hier im Zusammenhang mit einem Stoff verwendet wird, bezieht sich auf die Tatsache, dass ein Stoff in der Natur zu finden ist. Z. B. ist ein Polypeptid oder eine Polynucleotidsequenz natürlich vorkommend, das/die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, der aus der Natur isoliert werden kann und der nicht vom Menschen im Labor gezielt modifiziert wurde. Im allgemeinen bezieht sich der Begriff natürlich vorkommend auf einen Stoff, der in einem nicht- pathologischen (nicht-erkrankten) Individuum vorliegt, wie es für die Art spezifisch ist.
- Der Begriff "Agens" wird hier verwendet, um eine chemische Verbindung, ein Gemisch aus chemischen Verbindungen, eine Anordnung von räumlich lokalisierten Verbindungen (z. B. eine VLSIPS-Peptid-Anordnung, Polynucleotid-Anordnung und/oder eine kombinatorische Anordnung kleiner Moleküle), ein biologisches Makromolekül, eine ein Peptid präsentierende Bakteriophagenbank, eine einen Antikörper (z. B. scFv) präsentierende Bakteriophagenbank, eine ein Peptid präsentierende Polysomenbank oder einen Extrakt zu bezeichnen, der aus biologischen Stoffen hergestellt wurde, wie Bakterien-, pflanzlichen-, Pilz- oder tierischen (insbesondere Säuger-) Zellen oder Geweben. Agenzien werden auf eine mögliche Aktivität als antineoplastische Mittel, entzündungshemmende Mittel oder Apoptose-Modulatoren getestet, indem sie in den nachstehend beschriebenen Screeningtests eingesetzt werden. Agenzien werden auf eine mögliche Aktivität als spezifische Inhibitoren einer Protein-Wechselwirkung getestet (d. h. ein Mittel, das selektiv eine Bindungs-Wechselwirkung zwischen zwei festgelegten Polypeptiden hemmt, das jedoch die Lebensfähigkeit der Zelle nicht wesentlich beeinträchtigt), indem sie in den nachstehend beschriebenen Screeningtests eingesetzt werden.
- Der hier verwendete Begriff "im wesentlichen rein" bedeutet, dass ein betreffender Stoff den überwiegend vorliegenden Stoff darstellt (d. h. auf molarer Basis liegt er in der Zusammensetzung in einer größeren Menge vor als beliebige andere einzelne makromolekulare Stoffe), und vorzugsweise ist eine im wesentlichen gereinigte Fraktion eine Zusammensetzung, in der der betreffende Stoff mindestens etwa 50% (auf molarer Basis) aller vorliegenden makromolekularen Stoffe umfasst. Im allgemeinen enthält eine im wesentlichen reine Zusammensetzung mehr als etwa 80 bis 90% aller in der Zusammensetzung vorliegenden makromolekularen Stoffe. Am stärksten bevorzugt ist es, wenn der betreffende Stoff im wesentlichen zur Homogenität gereinigt ist (wobei in der Zusammensetzung durch herkömmliche Nachweisverfahren keine verunreinigenden Stoffe nachgewiesen werden können), wobei die Zusammensetzung im wesentlichen aus einem einzelnen makromolekularen Stoff besteht. Lösungsmittel, kleine Moleküle (< 500 Dalton) und Elementarionen werden nicht als makromolekulare Stoffe bezeichnet.
- Der hier verwendete Begriff "physiologische Bedingungen" bezieht sich auf Temperatur, pH-Wert, Ionenstärke, Viskosität und ähnliche biochemische Parameter, die mit einem lebensfähigen Organismus kompatibel sind und/oder die typischerweise intrazellulär in einer lebensfähigen gezüchteten Hefezelle oder Säugerzelle vorliegen. Z. B. sind die intrazellulären Bedingungen in einer Hefezelle, die unter typischen Kulturbedingungen im Labor gezüchtet wird, physiologische Bedingungen. Geeignete in vitro- Reaktionsbedingungen für in vitro-Transkriptions-Cocktails sind im allgemeinen physiologische Bedingungen. Im allgemeinen umfassen physiologische in vitro-Bedingungen 50 bis 200 mM NaCl oder KCl, pH 6,5 bis 8,5, 20 bis 45ºC und 0,001 bis 10 mM eines zweiwertigen Kations (z. B. Mg&spplus;&spplus; Ca&spplus;&spplus;); vorzugsweise etwa 150 mM NaCl oder KCl, pH 7,2 bis 7,6, 5 mM eines zweiwertigen Kations, außerdem umfassen sie häufig 0,01 bis 1,0% eines unspezifischen Proteins (z. B. BSA). Ein nicht-ionisches Detergens (Tween, NP-40, Triton X-100) kann häufig vorliegen, üblicherweise mit etwa 0,001 bis 2%, typischerweise mit 0,05 bis 0,2% (Vol./Vol.). Bestimmte wässrige Bedingungen können durch den Anwender gemäß herkömmlichen Verfahren ausgewählt werden. Als allgemeine Anleitung können die folgenden gepufferten wässrigen Bedingungen eingesetzt werden: 10 bis 250 mM NaCl, 5 bis 50 mM Tris-HCl, pH 5 bis 8, mit fakultativer Zugabe eines zweiwertigen Kations (von zweiwertigen Kationen) und/oder Metallchelatoren und/oder nicht-ionischen Detergenzien und/oder Membranfraktionen und/oder Antischaummitteln und/oder Szintillatoren.
- Eine spezifische Hybridisierung ist hier als das Entstehen von Hybriden zwischen einem ersten Polynucleotid und einem zweiten Polynucleotid (z. B. einem Polynucleotid, das eine eigene, jedoch im wesentlichen mit dem ersten Polynucleotid identische Sequenz aufweist) definiert, wobei das erste Polynucleotid vorzugsweise mit dem zweiten Polynucleotid unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei im wesentlichen nicht verwandte Polynucleotidsequenzen keine Hybride in dem Gemisch bilden.
- Der hier verwendete Begriff "einzelkettiger Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, das eine VH-Domäne und eine VL-Domäne in Polypeptidbindung umfasst, im allgemeinen verbunden über ein Abstandhalter-Peptid (z. B. [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x), und das weitere Aminosäuresequenzen am Amino- und/oder Carboxyende umfassen kann.
- Z. B. kann ein einzelkettiger Antikörper ein Halteseil-Segment umfassen, um ihn mit dem codierenden Polynucleotid zu verbinden. Ein Beispiel eines einzelkettigen Antikörpers ist scFv. Einzelkettige Antikörper sind im allgemeinen Proteine, die aus einem oder mehreren Polypeptidsegmenten mit mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren bestehen, die im wesentlichen durch Gene der Immunglobulin-Superfamilie codiert werden (z. B., vgl. "The Immunoglobulin Gene Superfamily", A. F. Williams und A. N. Barclay, in "Immunoglobulin Genes", T. Honjo, F. W. Alt und T. H. Rabbitts, Hrsg., (1989), Academic Press, San Diego, CA, S. 361-387), die am häufigsten durch eine Gensequenz einer schweren Kette oder einer leichten Kette von einem Nager, Nicht- Mensch-Primaten, Vogel, Schwein, Rind, Schaf, Ziege oder Menschen codiert werden. Ein funktioneller einzelkettiger Antikörper enthält im allgemeinen einen ausreichenden Teil eines Genprodukts einer Immunglobulin-Superfamilie, so dass er die Eigenschaft zur Bindung an ein spezifisches Zielmolekül, typischerweise an einen Rezeptor oder an ein Antigen (Epitop), beibehält.
- Die hier verwendeten Begriffe "Komplementarität-bestimmende Region" und "CDR" beziehen sich auf den Begriff nach dem Stand der Technik, der von den CDR- Definitionen von Kabat und Chothia beispielhaft beschrieben und auch als hypervariable Regionen oder hypervariable Schleifen allgemein bekannt ist (Chothia und Lesk, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia et al., (1989), Nature 342: 877; E. A. Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD), (1987); und Tramontano et al., (1990), J. Mol. Biol. 215: 175). Domänen der variablen Region umfassen typischerweise die aminoterminalen etwa 105 bis 115 Aminosäuren einer natürlich vorkommenden Immunglobulin-Kette (z. B. die Aminosäuren 1 bis 110), wobei jedoch auch etwas kürzere oder längere variable Domänen zum Herstellen einzelkettiger Antikörper geeignet sind.
- Eine variable Region einer leichten oder schweren Immunglobulin-Kette besteht aus einem "Gerüst"-Bereich, der durch drei hypervariale Regionen, auch CDRs genannt, unterbrochen ist. Das Ausmaß des Gerüstbereichs und der CDRs wurde genau definiert (vgl. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat et al., 4. Aufl., U.S. Department of Health and Human Serives, Bethesda, MD, (1987)). Die Sequenzen der Gerüstbereiche von unterschiedlichen leichten oder schweren Ketten sind innerhalb einer Art relativ konserviert. Der hier verwendete Begriff "menschlicher Gerüstbereich" ist ein Gerüstbereich, der im wesentlichen identisch ist (zu etwa 85% oder mehr, normalerweise 90 bis 95% oder mehr) mit dem Gerüstbereich eines natürlich vorkommenden, menschlichen Immunglobulins. Der Gerüstbereich eines Antikörpers, d. h. die kombinierten Gerüstbereiche der beteiligten leichten und schweren Ketten, dient dazu, die CDRs zu positionieren und auszurichten. Die CDRs sind hauptsächlich für die Bindung an ein Epitop eines Antigens verantwortlich.
- Der hier verwendete Begriff pvariables Segment" bezieht sich auf einen Teil eines naszierenden Peptids, umfassend eine zufällige, pseudozufällige oder definierte Kern-Sequenz. Ein variables Segment kann sowohl veränderliche als auch unveränderliche Rest-Positionen umfassen, und der Grad der Variation eines Restes an einer veränderlichen Rest-Position kann eingeschränkt sein; beide Möglichkeiten werden nach dem Ermessen des Anwenders ausgewählt. Typischerweise haben variable Segmente eine Länge von etwa 5 bis 20 Aminosäureresten (z. B. 8 bis 10), wobei variable Segmente jedoch auch länger sein und Antikörperteile oder Rezeptorproteine umfassen können, z. B. ein Antikörperfragment, ein Nucleinsäure-bindendes Protein, ein Rezeptorprotein und dergleichen.
- Der hier verwendete Begriff "zufällige Peptidsequenz" bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz, die aus zwei oder mehr Aminosäuremonomeren zusammengesetzt ist und durch einen stochastischen oder zufälligen Prozess konstruiert wird. Ein zufälliges Peptid kann Gerüst- oder Rahmenmotive enthalten, die unveränderliche Sequenzen umfassen können.
- Der hier verwendete Begriff "zufällige Peptidbank" bezieht sich auf einen Satz von Polynucleotidsequenzen, die einen Satz von zufälligen Peptiden codieren, und auf einen Satz von zufälligen Peptiden, die durch diese Polynucleotide codiert werden, und außerdem auf die Fusionsproteine, die diese zufälligen Peptide enthalten.
- Der hier verwendete Begriff "pseudozufällig" bezieht sich auf einen Satz von Sequenzen, die eine begrenzte Variabilität aufweisen, so dass z. B. das Ausmaß der Variabilität eines Restes an einer bestimmten Position sich von dem Ausmaß der Variabilität eines Restes an einer anderen Position unterscheidet, wobei jedoch einer pseudozufälligen Position ein gewisses, jedoch umschriebenes Ausmaß an Variation des Restes zugestanden wird.
- Der hier verwendete Begriff "definiertes Sequenz-Gerüst" bezieht sich auf einen Satz von definierten Sequenzen, die auf einer nicht-zufälligen Basis selektiert werden, im allgemeinen auf der Basis von experimentellen Daten oder strukturellen Daten; z. B. kann ein definiertes Sequenz-Gerüst einen Satz von Aminosäuresequenzen umfassen, von denen vorausgesagt werden kann, dass sie eine β-Faltblattstruktur bilden, oder es kann ein Leucin-Reißverschluss-Siebenfach-Wiederholungsmotiv, eine Zink-Finger- Domäne und andere Variationen umfassen. Ein "definierter Sequenz-Kern" ist ein Satz von Sequenzen, die einen begrenzten Umfang an Variabilität aufweisen. Während (1) eine vollständig zufällige, aus zehn Einheiten bestehende Sequenz der 20 herkömmlichen Aminosäuren eine von (20)¹&sup0; Sequenzen sein kann und (2) eine pseudozufällige, aus zehn Einheiten bestehende Sequenz der 20 herkömmlichen Aminosäuren eine von (20)¹&sup0; Sequenzen sein kann, wobei jedoch bestimmte Reste an bestimmten Positionen und/oder überall bevorzugt sind, stellt (3) ein definierter Sequenz-Kern eine Untergruppe von Sequenzen dar, die weniger als die maximale Zahl der möglichen Sequenzen umfasst, bei denen jede Rest-Position eine beliebige der 20 erlaubten herkömmlichen Aminosäuren (und/oder der möglichen nicht-herkömmlichen Amino-/Iminosäuren) darstellt. Ein definierter Sequenz-Kern umfasst im allgemeinen veränderliche und unveränderliche Rest-Positionen, und/oder er umfasst veränderliche Rest-Positionen, die einen Rest enthalten können, der aus einer definierten Untergruppe von Aminosäureresten ausgewählt ist, und dergleichen, entweder in Segmenten oder über die gesamte Länge der einzelnen ausgewählten Sequenz der Bank. Definierte Sequenz-Kerne können entweder Aminosäuresequenzen oder Polynucleotidsequenzen betreffen. Zur Erläuterung, nicht jedoch zur Einschränkung werden die Sequenzen (NNK)&sub1;&sub0; und (NNM)&sub1;&sub0; angegeben, wobei N A, T, G oder C darstellt; K G oder T bedeutet; und M A oder C darstellt, die definierte Sequenz-Kerne sind.
- Der hier verwendete Begriff "Epitop" bezieht sich auf den Teil eines Antigens oder eines anderen Makromoleküls, der in der Lage ist, eine bindende Wechselwirkung auszubilden, die mit der bindenden Tasche der variablen Region eines Antikörpers interagiert. Typischerweise manifestiert sich eine Solche bindende Wechselwirkung als ein intermolekularer Kontakt mit einem oder mehreren Aminosäureresten einer CDR.
- Der hier verwendete Begriff "Rezeptor" bezieht sich auf ein Molekül, das eine Affinität für einen bestimmten Liganden hat. Rezeptoren können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle sein. Rezeptoren können in einem unveränderten Zustand oder als Aggregate mit anderen Stoffen eingesetzt werden. Rezeptoren können kovalent oder nicht-kovalent an einen Bindungspartner gebunden sein, wobei die Bindung entweder direkt oder über eine spezifische Bindungssubstanz erfolgen kann. Beispiele von Rezeptoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Antikörper, einschließlich monoklonaler Antikörper, und Antiseren, die reaktiv sind mit spezifischen antigenen Determinanten (z. B. auf Viren, Zellen oder anderen Materialien), Zellmembran-Rezeptoren, komplexen Kohlenhydraten und Glykoproteinen, Enzymen und Hormon-Rezeptoren.
- Der hier verwendete Begriff "Ligand" bezieht sich auf ein Molekül, z. B. ein zufälliges Peptid oder eine Sequenz eines variablen Segments, das/die durch einen bestimmten Rezeptor erkannt wird. Wie der Fachmann verstehen wird, kann ein Molekül (oder ein makromolekularer Komplex) sowohl ein Rezeptor als auch ein Ligand sein. Im allgemeinen wird der Bindungspartner, der ein kleineres Molekulargewicht aufweist, als der Ligand bezeichnet, und der Bindungspartner, der ein größeres Molekulargewicht aufweist, als ein Rezeptor bezeichnet.
- Die hier verwendeten Begriffe "Linker" oder "Abstandhalter" ("Spacer") beziehen sich auf ein Molekül oder eine Gruppe von Molekülen, das/die zwei Moleküle verbindet, z. B. ein DNA-bindendes Protein und ein zufälliges Peptid, und dient dazu, die zwei Moleküle in einer bevorzugten Konfiguration zu plazieren, z. B. so dass das zufällige Peptid mit einer minimalen sterischen Hinderung durch das DNA-bindende Protein an einen Rezeptor binden kann.
- Der hier verwendete Begriff "funktionell verbunden" bezieht sich auf eine Bindung von Polynucleotid-Elementen in einem funktionellen Zusammenhang: Eine Nucleinsäure ist "funktionell verbunden", wenn sie mit einer anderen Nucleinsäuresequenz in einem funktionelle Zusammenhang steht. Z. B, ist ein Promotor oder Enhancer mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn er die Transkription der codierenden Sequenz beeinflusst. Funktionell verbunden bedeutet, dass die DNA- Sequenzen, die verbunden sind, typischerweise benachbart sind und, sofern es erforderlich ist, um zwei Protein-codierende Regionen zu koppeln, dass sie benachbart sind und in Leserastern liegen.
- Das Nucleinsäure-Shuffling ist ein Verfahren für eine in vitro oder in vivo durchgeführte homologe Rekombination von Pools von Nucleinsäurefragmenten oder Polynucleotiden. Gemische von verwandten Nucleinsäuresequenzen oder Polynucleotiden werden nach dem Zufall fragmentiert und wieder zusammengebaut, wodurch eine Bank oder eine gemischte Population von rekombinanten Nucleinsäuremolekülen oder Polynucleotiden erhalten wird. Wie vorstehend angegeben kann das in vitro-Nucleinsäure-Shuffling, das nachstehend noch weiter erläutert wird, mit dem in vivo-Nucleinsäure-Shuffling kombiniert werden, das hier beansprucht wird, und stellt den Gegenstand der Erfindung des Stammpatents dieses Teils dar (Europäische Patentanmeldung Nr. 95 911 826.6). Die nachstehende Diskussion des in vitro-Nucleinsäure- Shuffling dient deshalb lediglich der Erläuterung.
- Im Gegensatz zu der Kassetten-Mutagenese ist es nur mit dem Shuffling und der Error-prone-PCR möglich, einen Pool von Sequenzen blind zu mutieren (ohne eine andere Sequenzinformation als die Primer).
- Der Vorteil des mutagenen Shuffling gegenüber der Error-prone-PCR alleine für eine wiederholte Selektion kann am besten anhand eines Beispiels aus der Antikörper- Technik erklärt werden. In Fig. 1 ist das hier beschriebene DNA-Shuffling schematisch dargestellt. Die anfängliche Bank kann aus verwandten Substanzen unterschiedlicher Herkunft bestehen (d. h. Antikörper aus naiver mRNA), oder sie kann durch eine beliebige Art von Mutagenese (einschließlich Shuffling) eines einzelnen Antikörper-Gens hergeleitet werden. Nach der ersten Runde der Affinitätsselektion wird eine Sammlung von selektierten Komplementarität-bestimmenden Regionen ("CDRs") erhalten (Fig. 1). In der Darstellung verleihen die dicken CDRs dem Antikörpermolekül eine gesteigerte Affinität für das Antigen. Das Shuffling ermöglicht die freie kombinatorische Assoziation aller CDR1s mit allen CDR2s mit allen CDR3s usw. (Fig. 1).
- Dieses Verfahren unterscheidet sich von der PCR dadurch, dass es eine umgekehrte Kettenreaktion ist. Bei der PCR nehmen die Anzahl der Polymerase-Startstellen und die Anzahl der Moleküle exponentiell zu. Die Sequenz der Polymerase-Startstellen und die Sequenz der Moleküle bleiben jedoch im wesentlichen gleich. Im Gegensatz dazu nehmen beim Nucleinsäure-Wiederzusammenbau oder Shuffling von zufälligen Fragmenten die Anzahl der Startstellen und die Anzahl (nicht jedoch die Größe) der zufälligen Fragmente über die Zeit ab. Bei Fragmenten, die aus ganzen Plasmiden hergeleitet wurden, ist der theoretische Endpunkt ein einzelnes großes Konkatemer- Molekül.
- Da die Crossover an homologen Bereichen erfolgen, wird eine Rekombination vorwiegend zwischen Mitgliedern der gleichen Sequenzfamilie zustande kommen. Dies verhindert Kombinationen von CDRs, die größtenteils inkompatibel sind (die z. B. gegen unterschiedliche Epitope des gleichen Antigens gerichtet sind). Es ist so gemeint, dass mehrere Sequenzfamilien in der gleichen Reaktion einem Shuffling unterworfen werden können. Außerdem konserviert ein Shuffling die relative Reihenfolge, so dass z. B. CDR1 nicht an der Position von CDR2 zu finden sein wird.
- Seltene Shuffling-Produkte ("Shufflants") werden eine große Anzahl der besten CDRs (z. B. mit der höchsten Affinität) enthalten, und diese seltenen Shuffling-Produkte können aufgrund ihrer herausragenden Affinität selektiert werden (Fig. 1).
- CDRs aus einem Pool von 100 unterschiedlichen selektierten Antikörpersequenzen können auf bis zu 100&sup6; verschiedene Arten permutiert werden. Es ist nicht möglich, diese große Zahl von Permutationen in einer einzelnen Bank von DNA-Sequenzen darzustellen. Demgemäß ist es so gemeint, dass mehrere Zyklen mit DNA- Shuffling und Selektion erforderlich sein können, abhängig von der Länge der Sequenz und der gewünschten Diversität der Sequenz.
- Bei der Error-prone-PCR verbleiben im Gegensatz dazu alle selektierten CDRs in der gleichen relativen Sequenz (Fig. 1), so dass eine viel kleinere Mutanten-Wolke erzeugt wird.
- Das Matrizen-Polynucleotid, das in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, kann eine DNA oder eine RNA sein. Es kann verschiedene Längen aufweisen, abhängig von der Größe des Gens oder DNA-Fragments, das rekombiniert oder wieder zusammengesetzt werden soll. Vorzugsweise weist das Matrizen-Polynucleotid 50 bp bis 50 kb auf. Es ist so zu verstehen, dass in den Verfahren der vorliegenden Erfindung vollständige Vektoren eingesetzt werden können, die die Nucleinsäure enthalten, welche das Protein von Interesse codiert, und sie wurden tatsächlich mit Erfolg verwendet.
- Das Matrizen-Polynucleotid kann durch Amplifikation unter Verwendung der PCR-Reaktion (US-Patent Nr. 4 683 202 und 4 683 195) oder durch andere Amplifikations- oder Clonierungsverfahren erhalten werden. Zu einem besseren Ergebnis kann man jedoch kommen, wenn man die freien Primer vor dem Fragmentieren aus dem PCR-Produkt entfernt. Wenn die Primer nicht richtig entfernt werden, kann dies zu einer geringen Häufigkeit von Crossover-Klonen führen.
- Das Matrizen-Polynucleotid sollte meist doppelsträngig sein. Ein doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül ist erforderlich, um sicherzustellen, dass Regionen der resultierenden einzelsträngigen Nucleinsäurefragmente komplementär zueinander sind und somit hybridisieren können, so dass ein doppelsträngiges Molekül gebildet wird.
- Es ist so gemeint, dass einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäurefragmente, die Regionen mit Identität zum Matrizen-Polynucleotid und Regionen mit Heterologie zum Matrizen-Polynucleotid aufweisen, in diesem Schritt zu dem Matrizen- Polynucleotid zugegeben werden können. Es ist außerdem so gemeint, dass in diesem Schritt zwei unterschiedliche, jedoch verwandte Polynucleotid-Matrizen gemischt werden können.
- Die doppelsträngige Polynucleotid-Matrize und beliebige zugegebene doppel- oder einzelsträngige Fragmente werden nach dem Zufall in Fragmente von etwa 5 bp bis 5 kb oder mehr gespalten. Vorzugsweise beträgt die Größe der zufälligen Fragmente etwa 10 bp bis 1000 bp, stärker bevorzugt beträgt die Größe der DNA-Fragmente etwa 20 bp bis 500 bp.
- Andererseits ist es auch so gemeint, dass in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eine doppelsträngige Nucleinsäure mit mehreren "Nicks" eingesetzt werden kann. Ein Nick ist ein Bruch in einem Strang der doppelsträngigen Nucleinsäure. Der Abstand zwischen solchen Nicks beträgt vorzugsweise 5 bp bis 5 kb, stärker bevorzugt zwischen 10 bp und 1000 bp.
- Das Nucleinsäurefragment kann durch eine Reihe unterschiedlicher Verfahren gespalten werden. Das Nucleinsäurefragment kann mit einer Nuclease gespalten werden, z. B. DNase I oder RNase. Die Nucleinsäure kann durch Beschallungsverfahren oder mittels Passage durch ein Röhrchen mit einer kleinen Öffnung nach dem Zufall geschert werden.
- Außerdem ist es so gemeint, dass die Nucleinsäure mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen partiell gespalten werden kann, so dass bestimmte Punkte eines Crossovers statistisch erhalten werden können.
- Die Konzentration eines beliebigen spezifischen Nucleinsäurefragments wird nicht größer als 1 Gew.-% der Gesamt-Nucleinsäure sein, stärker bevorzugt wird die Konzentration einer beliebigen spezifischen Nucleinsäuresequenz nicht größer als 0,1 Gew.-% der Gesamt-Nucleinsäure ausmachen.
- Die Anzahl unterschiedlicher spezifischer Nucleinsäurefragmente in dem Gemisch wird mindestens etwa 100, vorzugsweise mindestens etwa 500 und stärker bevorzugt mindestens etwa 1000 betragen.
- In diesem Schritt können einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäurefragmente, entweder synthetische oder natürliche, zu den zufälligen doppelsträngigen Nucleinsäurefragmenten zugegeben werden, um die Heterogenität des Gemisches von Nucleinsäurefragmenten zu erhöhen.
- Außerdem ist es so gemeint, dass in diesem Schritt Populationen von doppelsträngigen zufällig gespaltenen Nucleinsäurefragmenten gemischt oder kombiniert werden können.
- Wenn die Insertion von Mutationen in das Matrizen-Polynucleotid gewünscht wird, können einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäurefragmente, die eine Region mit Identität zum Matrizen-Polynucleotid und eine Region mit Heterologie zum Matrizen-Polynucleotid aufweisen, in einem 20 fachen Gewichts-Überschuss im Vergleich zur Gesamt-Nucleinsäure zugegeben werden, stärker bevorzugt können die einzelsträngigen Nucleinsäureframente in einem 10 fachen Gewichts-Überschuss im Vergleich zur Gesamt-Nucleinsäure zugegeben werden.
- Wenn ein Gemisch aus unterschiedlichen, jedoch verwandten Matrizen-Polynucleotiden gewünscht wird, können Populationen von Nucleinsäurefragmenten aus jedem der Matrizen in einem Verhältnis von weniger als etwa 1 : 100 kombiniert werden, stärker bevorzugt beträgt das Verhältnis weniger als etwa 1 : 40. Z. B. kann eine Rückkreuzung des Wildtyp-Polynucleotids mit einer Population eines mutierten Polynucleotids gewünscht sein, um neutrale Mutationen zu eliminieren (z. B. Mutationen, die eine unwesentliche Änderung der phänotypischen Eigenschaft, nach der selektiert wird, ergeben). In einem solchen Beispiel beträgt das Verhältnis von zufällig gespaltenen Wildtyp-Polynucleotidfragmenten, die zugegeben werden können, zu den zufällig gespaltenen mutierten Polynucleotidfragmenten etwa 1 : 1 bis etwa 100 : 1, und stärker bevorzugt 1 : 1 bis 40 : 1.
- Die gemischte Population von zufälligen Nucleinsäurefragmenten wird denaturiert, wodurch einzelsträngige Nucleinsäurefragmente gebildet werden, die anschließend wieder aneinandergelagert werden. Nur diejenigen einzelsträngigen Nucleinsäurefragmente werden sich aneinanderlagern, die Regionen aufweisen, die zu anderen einzelsträngigen Nucleinsäurefragmenten homolog sind.
- Die zufälligen Nucleinsäurefragmente können durch Erhitzen denaturiert werden. Der Fachmann kann die Bedingungen bestimmen, die erforderlich sind, um die doppelsträngige Nucleinsäure vollständig zu denaturieren. Vorzugsweise liegt die Temperatur bei 80 bis 100ºC, stärker bevorzugt liegt die Temperatur bei 90 bis 96ºC. Andere Verfahren, die zum Denaturieren der Nucleinsäurefragmente eingesetzt werden können, umfassen Druck (36) und pH-Wert.
- Die Nucleinsäurefragmente können durch Abkühlen wieder aneinandergelagert werden. Vorzugsweise liegt die Temperatur bei 20 bis 75ºC, stärker bevorzugt liegt die Temperatur bei 40 bis 65ºC. Wenn eine große Häufigkeit von Crossover erforderlich ist, die nur auf durchschnittlich vier aufeinander folgenden homologen Basen beruhen, kann die Rekombination durch Verwendung einer niedrigen Anelierungstemperatur gesteigert werden, wobei das Verfahren jedoch schwieriger wird. Das Ausmaß der erfolgenden Renaturierung wird davon abhängen, wie groß die Homologie zwischen der Population der einzelsträngigen Nucleinsäurefragmente ist.
- Die Renaturierung kann durch Zugabe von Polyethylenglykol ("PEG") oder Salz beschleunigt werden. Die Salzkonzentration liegt vorzugsweise bei 0 bis 200 mM, stärker bevorzugt beträgt die Salzkonzentration 10 bis 100 mM. Das Salz kann KCl oder NaCl sein. Die Konzentration von PEG beträgt vorzugsweise 0 bis 20%, stärker bevorzugt 5 bis 10%.
- Als nächstes werden die aneinandergelagerten Nucleinsäurefragmente in Gegenwart einer Nucleinsäure-Polymerase und dNTPs (d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) inkubiert. Die Nucleinsäure-Polymerase kann das Klenow-Fragment, die Taq- Polymerase oder eine andere DNA-Polymerase sein, die dem Fachmann bekannt ist.
- Das Verfahren, das für den Zusammenbau verwendet wird, hängt ab von dem Mindestmaß an Homologie, das noch Crossover ergeben sollte. Wenn die identischen Bereiche groß sind, kann die Taq-Polymerase mit einer Anelierungstemperatur zwischen 45 und 65ºC eingesetzt werden. Wenn die identischen Bereiche klein sind, kann die Klenow-Polymerase mit einer Anelierungstemperatur von 20 bis 30ºC verwendet werden. Der Fachmann kann die Anelierungstemperatur variieren, um die Zahl der entstehenden Crossover zu erhöhen.
- Die Polymerase kann zu den zufälligen Nucleinsäurefragmenten vordem Anelieren, gleichzeitig damit oder danach zugegeben werden.
- Der Zyklus aus Denaturieren, Renaturieren und Inkubieren in Gegenwart einer Polymerase wird hier als Shuffling oder Wiederzusammenbau der Nucleinsäure bezeichnet. Dieser Zyklus wird so oft wie gewünscht wiederholt. Vorzugsweise wird der Zyklus zwei- bis 50-mal wiederholt, stärker bevorzugt wird er zehn- bis 40-mal wiederholt.
- Die resultierende Nucleinsäure ist ein größeres doppelsträngiges Polynucleotid von etwa 50 bp bis etwa 100 kb, vorzugsweise weist das größere Polynucleotid 500 bp bis 50 kb auf.
- Dieses größere Polynucleotidfragment kann mehrere Kopien eines Nucleinsäurefragments, das die gleiche Größe wie das Matrizen-Polynucleotid aufweist, in Tandemanordnung enthalten. Anschließend wird dieses konkatamere Fragment in Einzelkopien des Matrizen-Polynucleotids gespalten. Das Ergebnis ist eine Population von Nucleinsäurefragmenten mit etwa der gleichen Größe wie das Matrizen-Polynucleotid. Die Population stellt eine gemischte Population dar, wobei vor dem Shuffiling einzel- oder dopppelsträngige Nucleinsäurefragmente, die einen identischen Bereich und einen heterologen Bereich aufweisen, zu dem Matrizen-Polynucleotid zugegeben wurden.
- Diese Fragmente werden sodann in den geeigneten Vektor kloniert, anschließend werden Bakterien mit dem Ligierungsgemisch transformiert.
- Es ist so zu verstehen, dass die einzelnen Nucleinsäurefragmente aus dem größeren konkatameren Nucleinsäurefragment erhalten werden können, indem die einzelnen Nucleinsäurefragmente vor dem Klonieren durch verschiedene Verfahren, einschließlich PCR, amplifiziert werden (US-Patente Nr. 4 683 195 und 4 683 202), und nicht indem das Konkatamer gespalten wird.
- Der zum Klonieren verwendet Vektor ist nicht kritisch, mit der Maßgabe, dass er ein DNA-Fragment der gewünschten Größe aufnehmen kann. Wenn die Expression des DNA-Fragments gewünscht wird, sollte das Klonierungsvehikel außerdem Transkriptions- und Translationssignale in der Nähe der Insertionsstelle des DNA-Fragments umfassen, um die Expression des DNA-Fragments in der Wirtszelle zu ermöglichen. Bevorzugte Vektoren umfassen die Plasmide der pUC-Reihe und der pBR-Reihe.
- Die resultierende bakterielle Population umfasst mehrere rekombinante DNA- Fragmente mit zufälligen Mutationen. Diese gemischte Population kann getestet werden, um das gewünschte rekombinante Nucleinsäurefragment zu identifizieren. Das Selektionsverfahren hängt von dem gewünschten DNA-Fragment ab.
- Wenn z. B. ein DNA-Fragment gewünscht wird, das ein Protein codiert, das mit erhöhter Effizienz an einen Liganden bindet, können die Proteine, die durch jedes der DNA-Fragmente in der Population oder Bank exprimiert werden, auf ihre Fähigkeit, an den Liganden zu binden, durch Verfahren getestet werden, die dem Fachmann bekannt sind (d. h. Panning, Affinitätschromatographie). Wenn ein DNA-Fragment gewünscht wird, das ein Protein mit erhöhter Arzneistoffresistenz codiert, können die Proteine, die durch jedes der DNA-Fragmente in der Population oder Bank exprimiert werden, auf ihre Fähigkeit getestet werden, die Arzneistoffresistenz auf den Wirtsorganismus zu übertragen. Der Fachmann kann anhand des gegebenen Wissens über das gewünschte Protein die Population einfach testen und auf diese Weise DNA-Fragmente identifizieren, die dem Protein die gewünschten Eigenschaften verleihen.
- Es ist so gemeint, dass der Fachmann ein Phagen-Präsentationssystem verwenden kann, in dem Fragmente des Proteins als Fusionsproteine auf der Phagenoberfläche exprimiert werden (Pharmacia, Milwaukee, WI). Die rekombinanten DNA-Moleküle werden an einer Stelle in die Phagen-DNA kloniert, so dass es zur Transkription eines Fusionsproteins kommt, von dem ein Teil durch das rekombinante DNA-Molekül codiert wird. Der Phage, der das rekombinante Nucleinsäuremolekül enthält, durchläuft in der Zelle die Replikation und Transkription. Die Leader-Sequenz des Fusionsproteins steuert den Transport des Fusionsproteins zu der Spitze des Phagenpartikels. Auf diese Weise wird das Fusionsprotein, das zum Teil durch das rekombinante DNA-Molekül codiert wird, auf dem Phagenpartikel präsentiert, wo es durch die vorstehend beschriebenen Verfahren nachgewiesen und selektiert werden kann.
- Außerdem ist es so gemeint, dass mehrere Zyklen des Nucleinsäure-Shuffling mit Nucleinsäurefragmenten aus einer Subpopulation der ersten Population durchgeführt werden können, wobei die Subpopulation eine DNA enthält, die das gewünschte rekombinante Protein codiert. Auf diese Weise können Proteine mit noch höheren Bindungsaffinitäten oder mit einer noch höheren enzymatischen Aktivität erhalten werden.
- Ferner ist es so zu verstehen, dass mehrere Zyklen des Nucleinsäure-Shuffling mit einem Gemisch aus Wildtyp-Nucleinsäurefragmenten und einer Subpopulation von Nucleinsäure aus der ersten oder den folgenden Runden des Nucleinsäure-Shuffling durchgeführt werden können, um die stummen Mutationen aus der Subpopulation zu entfernen.
- Als Nucleinsäure-Ausgangsmaterial kann eine Nucleinsäure jeder beliebigen Herkunft in gereinigter Form verwendet werden. Somit kann bei dem Verfahren DNA oder RNA, einschließlich Messenger-RNA, eingesetzt werden, wobei die DNA oder die RNA einzel- oder doppelsträngig sein kann. Außerdem kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, das von jedem einen Strang enthält. Die Nucleinsäuresequenz kann verschiedene Längen aufweisen, abhängig von der Größe der Nucleinsäuresequenz, die mutiert werden soll. Vorzugsweise besteht die spezifische Nucleinsäuresequenz aus 50 bis 50 000 Basenpaaren. Es ist so zu verstehen, dass in den Verfahren der vorliegenden Erfindung ganze Vektoren eingesetzt werden können, die die Nucleinsäure enthalten, welche das Protein von Interesse codiert.
- Die Nucleinsäure kann aus jeder beliebigen Quelle stammen, z. B. aus Plasmiden, wie pBR322, aus klonierter DNA oder RNA oder aus natürlicher DNA oder RNA jeder beliebigen Herkunft, einschließlich Bakterien, Hefen, Viren und höherer Organismen, wie Pflanzen oder Tiere. DNA oder RNA kann aus Blut oder Gewebematerial extrahiert werden. Das Matrizen-Polynucleotid kann durch Amplifikation unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erhalten werden (US-Patente Nr. 4 683 202 und 4 683 195). Andererseits kann das Polynucleotid in einem Vektor enthalten sein, der in einer Zelle vorliegt, und ausreichend Nucleinsäure kann erhalten werden, indem die Zelle gezüchtet und die Nucleinsäure aus der Zelle durch Verfahren extrahiert wird, die dem Fachmann bekannt sind.
- Eine beliebige spezifische Nucleinsäuresequenz kann eingesetzt werden, um durch das vorliegende Verfahren die Population von Mutanten zu erzeugen. Es ist lediglich erforderlich, dass eine kleine Population von mutierten Sequenzen der spezifischen Nucleinsäuresequenz vorhanden ist oder hergestellt wird, bevor das vorliegende Verfahren durchgeführt wird.
- Die anfängliche kleine Population der spezifischen Nucleinsäuresequenzen mit Mutationen kann durch eine Reihe unterschiedlicher Verfahren hergestellt werden. Mutationen können durch die Error-prone-PCR erzeugt werden. Bei der Error-prone- PCR werden für die Polymerisation Bedingungen für eine niedrige Übereinstimmung verwendet, um eine kleine Anzahl von Punktmutationen nach dem Zufall in eine lange Sequenz einzuführen. Als Alternative können Mutationen durch eine Oligonucleotid-gesteuerte Mutagenese in das Matrizen-Polynucleotid eingeführt werden. Bei einer Oligonucleotid-gesteuerten Mutagenese wird eine kurze Sequenz des Polynucleotids aus dem Polynucleotid anhand einer Restriktionsenzym-Spaltung entfernt und durch ein synthetisches Polynucleotid ersetzt, in dem verschiedene Basen der ursprünglichen Sequenz verändert wurden. Die Polynucleotidsequenz kann auch durch eine chemische Mutagenese verändert werden. Chemische Mutagene umfassen z. B. Natriumbisulfit, salpetrige Säure, Hydroxylamin, Hydrazin oder Ameisensäure. Andere Stoffe, die Analoga von Nucleotid-Vorläufern sind, umfassen Nitrosoguanidin, 5-Bromuracil, 2- Aminopurin oder Acridin. Im allgemeinen werden diese Stoffe anstelle des Nucleotid- Vorläufers zu der PCR-Reaktion zugegeben, wodurch die Sequenz mutiert wird. Außerdem können interkalierende Mittel, wie Proflavin, Acriflavin, Mepacrin ("quinacrine") und dergleichen, verwendet werden. Eine Zufallsmutagenese der Polynucleotidsequenz kann auch durch Bestrahlen mit Röntgenstrahlen oder ultraviolettem Licht erreicht werden. Im allgemeinen wird die auf diese Weise mutagenisierte Plasmid-DNA oder die auf diese Weise mutagenisierten DNA-Fragmente in E. coli eingeführt und als Pool oder Bank mutierter Plasmide vermehrt.
- Als Alternative kann eine kleine gemischte Population von spezifischen Nucleinsäuren auch aus der Natur stammen, wobei sie aus unterschiedlichen Allelen des gleichen Gens oder aus dem gleichen Gen aus unterschiedliche verwandte Arten (d. h. verwandten Genen) bestehen können. Andererseits kann es sich auch um verwandte DNA-Sequenzen handeln, die in einer bestimmten Art zu finden sind, z. B. die Immunglobulin-Gene.
- Sobald die gemischte Population der spezifischen Nucleinsäuresequenzen erzeugt ist, können die Polynucleotide direkt verwendet oder in einen geeigneten Klonierungsvektor eingefügt werden, wobei Techniken eingesetzt werden können, die dem Fachmann bekannt sind.
- Die Auswahl des Vektors hängt von der Größe der Polynucleotidsequenz und von der Wirtszelle ab, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll. Die Matrizen der vorliegenden Erfindung können Plasmide, Phagen, Cosmide, Phagemide, Viren (z. B. Retroviren, Parainfluenzavirus, Herpesviren, Reoviren, Paramyxoviren und dergleichen) oder ausgewählte Teile davon sein (z. B. Hüllprotein, Spike-Glykoprotein, Kapsidprotein). Z. B. sind Cosmide und Phagemide bevorzugt, wenn die spezifische Nucleinsäuresequenz, die mutiert werden soll, größer ist, da mit diesen Vektoren große Nucleinsäurefragmente stabil vermehrt werden können.
- Wenn die gemischte Population der spezifischen Nucleinsäuresequenz in einen Vektor kloniert wird, kann sie klonal amplifiziert werden, indem jeder Vektor in eine Wirtszelle eingefügt und die Vermehrung des Vektors durch die Wirtszelle zugelassen wird. Dies wird als klonale Amplifikation bezeichnet, da die absolute Zahl der Nucleinsäuresequenzen zwar zunimmt, die Zahl der Mutanten jedoch nicht ansteigt.
- Das Verfahren des DNA-Shuffling der vorliegenden Erfindung kann an einem Pool unbekannter Sequenzen blind durchgeführt werden. Ein beliebiges Sequenzgemisch kann in ein anderes Sequenzgemisch an jeder spezifischen Position eingebaut werden, indem zum Wiederzusammenbau-Gemisch Oligonucleotide zugegeben werden (mit Enden, die zu den Sequenzen homolog sind, die wieder zusammengebaut werden). Somit ist es so zu verstehen, dass Gemische von synthetischen Oligonucleotiden, PCR-Fragmente oder sogar ganzen Gene in eine andere Sequenzbank an definierten Positionen eingemischt werden können. Die Insertion der einen Sequenz (Gemisch) ist unabhängig von der Insertion einer Sequenz in einen anderen Teil der Matrize. Somit können der Rekombinationsgrad, die erforderliche Homologie und die Diversität der Bank unabhängig voneinander und gleichzeitig über die Länge der wiederzusammengebauten DNA variiert werden.
- Diese Vorgehensweise zum Mischen zweier Gene kann eingesetzt werden, um Antikörper aus murinen Hybridomen zu humanisieren. Die Vorgehensweise zum Mischen zweier Gene oder Einfügen mutierter Sequenzen in Gene kann für ein beliebiges therapeutisch genutztes Protein verwendet werden, z. B. Interleukin I, Antikörper, tPA, Wachstumshormon usw.. Das Verfahren eignet sich auch für eine beliebige Nuoleinsäure, z. B. Promotoren oder Introns oder 3'-untranslatierte Regionen oder 5'- untranslatierte Regionen von Genen, um die Expression zu steigern oder die Spezifität der Expression von Proteinen zu verändern. Das Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Ribozyme oder Aptamere zu mutieren.
- Für das Shuffling ist es erforderlich, dass homologe Regionen vorliegen, die die Regionen, die verschieden sind, voneinander trennen. Besonders geeignet für das Shuffling können gerüstartige Proteinstrukturen sein. Das konservierte Gerüst bestimmt durch Selbstassoziation die Gesamtfaltung, während es relativ wenig eingeschränkte Schleifen präsentiert, die die spezifische Bindung vermitteln. Beispiele solcher Gerüste sind das Immunglobulin-Beta-Fass und das Vier-Helix-Bündel (24). Dieses Shuffling kann verwendet werden, um gerüstartige Proteine mit verschiedenen Kombinationen von mutierten Sequenzen für eine Bindung herzustellen.
- In einer Ausführungsform des in vivo-Shuffling wird die gemischte Population der spezifischen Nucleinsäuresequenz in bakterielle oder eukaryotische Zellen unter Bedingungen eingeführt, so dass in jeder Wirtszelle mindestens zwei verschiedene Nucleinsäuresequenzen vorliegen. Die Fragmente können durch viele verschiedene Verfahren in die Wirtszellen eingeführt werden. Die Wirtszellen können mit den Fragmenten transformiert werden, wobei Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. das Behandeln mit Calciumchlorid. Wenn die Fragmente in ein Phagengenom eingefügt sind, kann die Wirtszelle mit dem rekombinanten Phagengenom transfiziert werden, das die spezifischen Nucleinsäuresequenzen umfasst. Andererseits können die Nucleinsäuresequenzen in die Wirtszelle auch anhand von Elektroporation, Transfektion, Lipofektion, Partikelpistolen, Konjugation und dergleichen eingeführt werden.
- Im allgemeinen liegen die spezifischen Nucleinsäuresequenzen in dieser Ausführungsform in Vektoren vor, die befähigt sind, die Sequenz in der Wirtszelle stabil zu replizieren. Außerdem ist es so zu verstehen, dass die Vektoren ein Markergen codieren, so dass Wirtszellen, die den Vektor enthalten, selektiert werden können. Hierdurch wird sichergestellt, dass die mutierte spezifische Nucleinsäuresequenz nach dem Einführen in die Wirtszelle gewonnen werden kann. Jedoch ist es so gemeint, dass nicht die gesamte gemischte Population der spezifischen Nucleinsäuresequenzen auf einer Vektorsequenz vorliegen muss. Vielmehr muss nur eine ausreichende Zahl von Sequenzen in Vektoren kloniert werden, um sicherzustellen, dass nach Einführen der Fragmente in die Wirtszellen jede Wirtszelle einen Vektor enthält, in dem mindestens eine spezifische Nucleinsäuresequenz vorliegt. Außerdem ist es so zu verstehen, dass eine Untergruppe der Population der spezifischen Nucleinsäuresequenzen nicht kloniert in Vektoren vorliegen muss, sondern dass diese Untergruppe bereits stabil in die Wirtszelle integriert sein kann.
- Wenn zwei Fragmente mit identischen Bereichen in die Wirtszellen eingefügt werden, wurde gefunden, dass eine homologe Rekombination zwischen den zwei Fragmenten erfolgt. Eine solche Rekombination zwischen den zwei mutierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen führt in einigen Fällen dazu, dass Doppel- oder Dreifach-Mutanten entstehen.
- Außerdem wurde gefunden, dass die Rekombinationshäufigkeit erhöht ist, wenn einige der mutierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen auf linearen Nucleinsäuremolekülen vorliegen. Aus diesem Grund liegen in einer bevorzugten Ausführungsform einige der spezifischen Nucleinsäuresequenzen auf linearen Nucleinsäurefragmenten vor.
- Nach der Transformation werden die Transformanten der Wirtszellen einer Selektion unterworfen, um diejenigen Transformanten der Wirtszellen zu identifizieren, die mutierte spezifische Nucleinsäuresequenzen mit den gewünschten Merkmalen enthalten. Wenn z. B. eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem bestimmten Arzneistoff gewünscht wird, können die transformierten Wirtszellen erhöhten Konzentrationen des bestimmten Arzneistoffs ausgesetzt werden, wobei die Transformanten selektiert werden, die mutierte Proteine erzeugen, die eine erhöhte Arzneistoffresistenz verleihen können. Wenn die gesteigerte Fähigkeit eines bestimmten Proteins, an einen Rezeptor zu binden, gewünscht wird, kann die Expression des Proteins aus den Transformanten induziert und das resultierende Protein in einem Ligand-Bindungstest durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, getestet werden, wodurch die Untergruppe der mutierten Population identifiziert werden kann, die eine erhöhte Bindung an den Liganden zeigt. Andererseits kann das Protein auch in einem anderen System exprimiert werden, so dass die richtige Prozessierung sichergestellt werden kann.
- Sobald eine Untergruppe der ersten rekombinierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen (Tochtersequenzen) mit den gewünschten Merkmalen identifiziert sind, werden sie anschließend einer zweiten Rekombinationsrunde unterworfen.
- In dem zweiten Rekombinationszyklus können die rekombinierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen mit den ursprünglichen mutierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen (Eltersequenzen) gemischt und der Zyklus wie vorstehend beschrieben wiederholt werden. Auf diese Weise kann ein Satz von zweiten rekombinierten spezifischen Nucleinsäuresequenzen identifiziert werden, die verbesserte Merkmale aufweisen oder Proteine mit verbesserten Eigenschaften codieren. Dieser Zyklus kann nach Wunsch mehrere Male wiederholt werden.
- Außerdem ist es so gemeint, dass in dem zweiten oder anschließenden Rekombinationszyklus eine Rückkreuzung erfolgen kann. Eine molekulare Rückkreuzung kann durchgeführt werden, indem die gewünschten spezifischen Nucleinsäuresequenzen mit einer großen Zahl von Exemplaren der Wildtyp-Sequenz gemischt werden, so dass nach der Transformation in der gleichen Wirtszelle mindestens eine Wildtyp- Nucleinsäuresequenz und eine mutierte Nucleinsäuresequenz vorliegen. Durch Rekombination mit der spezifischen Wildtyp-Nucleinsäuresequenz werden diejenigen neutralen Mutationen eliminiert, die möglicherweise nicht-selektierte Merkmale, wie Immunogenität, nicht jedoch die selektierten Merkmale beeinflussen.
- In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dargestellt, dass eine Untergruppe der spezifischen Nucleinsäuresequenzen während der ersten Runde vor dem Einführen in die Wirtszelle fragmentiert werden kann. Die Größe der Fragmente muss groß genug sein, so dass sie einige Bereiche enthalten, die mit den anderen Sequenzen identisch sind, wodurch eine Rekombination mit den anderen Sequenzen erfolgen kann. Die Größe der Fragmente liegt im Bereich von 0,03 bis 100 kb, stärker bevorzugt von 0,2 bis 10 kb. Außerdem ist es so gemeint, dass in anschließenden Runden alle spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die nicht die aus der vorherigen Runde selektierten Sequenzen sind, vor dem Einführen in die Wirtszellen in Fragmente gespalten werden können.
- Das Fragmentieren der Sequenzen kann durch verschiedene Verfahren erfolgen, die dem Fachmann bekannt sind. Die Sequenzen können zufällig fragmentiert werden, oder sie können an spezifischen Stellen in der Nucleinäsuresequenz fragmentiert werden. Zufällige Fragmente können erhalten werden, indem die Nucleinsäure aufgebrochen oder einer harten physikalischen Behandlung unterworfen wird (z. B. einem Scheren oder Bestrahlen) oder indem sie mit strengen chemischen Mitteln behandelt wird (z. B. mit freien Radikalen; Metallionen; Säurebehandlung, zum Depurinieren und Spalten). Zufällige Fragmente können im Fall von DNA auch durch die Verwendung von DNase oder ähnlichen Nucleasen erhalten werden. Die Sequenzen können durch die Verwendung von Restriktionsenzymen an spezifischen Stellen gespalten werden. Die fragmentierten Sequenzen können einzel- oder doppelsträngig sein. Wenn die Sequenzen ursprünglich einzelsträngig waren, können sie vor dem Einführen in die Wirtszelle mit Hitze, Chemikalien oder Enzymen denaturiert werden. Die Reaktionsbedingungen, die zum Trennen der Nucleinsäurestränge eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bekannt.
- Die Schritte des vorliegenden Verfahrens können unbegrenzt oft wiederholt werden, nur eingeschränkt durch die Zahl der möglichen Mutanten, die erhalten werden können. Nach einer bestimmten Anzahl von Zyklen hat man alle möglichen Mutanten erhalten, und weitere Zyklen sind überflüssig.
- In einer Ausführungsform wird die gleiche mutierte Matrizen-Nucleinsäure wiederholt rekombiniert und die resultierenden Rekombinanten nach dem gewünschten Merkmal selektiert.
- Deshalb wird der anfängliche Pool oder die anfängliche Population der mutierten Matrizen-Nucleinsäure in einen Vektor kloniert, der sich in einem Bakterium wie E. coli replizieren kann. Der bestimmte Vektor ist nicht essentiell, so lange er sich in E. coli autonom replizieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor so gestaltet, dass er die Expression und Produktion eines beliebigen Proteins möglich macht, das durch die mit dem Vektor verbundene, mutierte spezifische Nucleinsäure codiert wird. Außerdem ist bevorzugt, dass der Vektor ein Gen enthält, das einen selektierbaren Marker codiert.
- Die Population von Vektoren, die den Pool der mutierten Nucleinsäuresequenzen enthalten, wird in E. coli-Wirtszellen eingeführt. Die Nucleinsäuresequenzen des Vektors können durch Transformation, Transfektion oder im Fall eines Phagen durch Infektion eingeführt werden. Die Konzentration der zur Transformation von Bakterien verwendeten Vektoren ist so groß, dass in jede Zelle mehrere Vektoren eingeführt werden. Sobald die verschiedenen Vektoren in der Zelle vorliegen, ist die Effizienz der homologen Rekombination so groß, dass zwischen ihnen eine homologe Rekombination stattfindet. Dies führt zur Erzeugung von Mutanten (Töchtern), die eine Kombination von Mutationen aufweisen, die sich von den ursprünglichen mutierten Eltersequenzen unterscheiden.
- Anschließend werden die Wirtszellen klonal repliziert und auf das auf dem Vektor vorliegende Markergen selektiert. Unter den Selektionsbedingungen wachsen nur diejenigen Zellen, die ein Plasmid besitzen.
- Die Wirtszellen, die einen Vektor enthalten, werden sodann auf das Vorliegen von günstigen Mutationen getestet. Ein solches Testen kann z. B. daraus bestehen, die Zellen einem selektiven Druck zu unterwerfen, wenn das zu selektierende Gen ein Gen für eine verbesserte Arzneistoffresistenz ist. Wenn der Vektor die Expression des durch die mutierte Nucleinsäuresequenz codierten Proteins bewirken kann, kann eine solche Selektion das Exprimieren des auf diese Weise codierten Proteins, das Isolieren des Proteins und das Testen des Proteins umfassen, wodurch bestimmt werden kann, ob es z. B. mit einer gesteigerten Effizienz an den Liganden von Interesse bindet.
- Sobald eine bestimmte mutierte Tochter Nucleinsäuresequenz identifiziert wurde, die die gewünschten Merkmale verleiht, wird die Nucleinsäure entweder bereits an den Vektor gebunden oder vom Vektor getrennt isoliert. Diese Nucleinsäure wird anschließend mit der ersten oder Elterpopulation der Nucleinsäuren gemischt und der Zyklus wiederholt.
- Es wurde gezeigt, dass durch dieses Verfahren Nucleinsäuresequenzen selektiert werden können, die verbesserte gewünschte Eigenschaften besitzen.
- In einer anderen Ausführungsform wird die erste Generation von Mutanten in den Zellen zurückgehalten und die elterlichen mutierten Sequenzen erneut zu den Zellen zugegeben. Demgemäß wird der erste Zyklus der Ausführungsform I wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Nachdem die Tochter-Nucleinsäuresequenzen identifiziert wurden, werden jedoch die Wirtszellen, die diese Sequenzen enthalten, zurückbehalten.
- Die elterliche mutierte spezifische Nucleinsäurepopulation, entweder als Fragmente oder in den gleichen Vektor kloniert, wird in die Wirtszellen eingeführt, die bereits die Tochter-Nucleinsäuren enthalten. Die Rekombination wird in den Zellen zugelassen, und die nächste Generation von Rekombinanten oder die Enkelinnen werden durch die vorstehend beschriebenen Verfahren selektiert.
- Dieser Zyklus kann mehrmals wiederholt werden, bis die Nucleinsäure oder das Peptid mit den gewünschten Merkmalen erhalten wird. Es ist so zu verstehen, dass in den folgenden Zyklen die Population der mutierten Sequenzen, die zu den bevorzugten Mutanten zugegeben werden, aus den Eltermutanten oder aus einer beliebigen folgenden Generation stammen können.
- In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen einer "molekularen" Rückkreuzung der erhaltenen rekombinanten spezifischen Nucleinsäure bereit, wodurch beliebige neutrale Mutationen eliminiert werden können. Neutrale Mutationen sind Mutationen, die der Nucleinsäure oder dem Peptid nicht die gewünschten Eigenschaften verleihen. Solche Mutationen können jedoch unerwünschte Merkmale auf die Nucleinsäure oder das Peptid übertragen. Demgemäß ist es wünschenswert, solche neutralen Mutationen zu entfernen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt eine Vorschrift bereit, wie dies erreicht werden kann.
- Nachdem die mutierte Nucleinsäure, die die gewünschten Merkmale besitzt, durch die Verfahren der Ausführungsformen erhalten wurde, wird in dieser Ausführungsform die Nucleinsäure, der Vektor mit der Nucleinsäure oder die Wirtszelle, die den Vektor und die Nucleinsäure enthält, isoliert.
- Die Nucleinsäure oder der Vektor wird sodann zusammen mit einem großen Überschuss der Wildtyp-Nucleinsäure in die Wirtszelle eingeführt. Die Rekombination der Nucleinsäure der Mutante und der Nucleinsäure der Wildtyp-Sequenz wird zugelassen. Die resultierenden Rekombinanten werden der gleichen Selektion unterworfen wie die mutierte Nucleinsäure. Nur diejenigen Rekombinanten werden selektiert, bei denen die gewünschten Merkmale bestehen bleiben. Jegliche stumme Mutationen, die keine gewünschten Merkmale bereitstellen, gehen bei der Rekombination mit der Wildtyp-DNA verloren. Dieser Zyklus kann mehrmals wiederholt werden, bis alle stummen Mutationen eliminiert sind.
- Somit können die Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer molekularen Rückkreuzung eingesetzt werden, um unnötige oder stumme Mutationen zu eliminieren.
- Das in vivo-Rekombinationsverfahren der vorliegenden Erfindung kann mit einem Pool unbekannter Mutanten oder Allele eines spezifischen Nucleinsäurefragments oder einer spezifischen Nucleinsäuresequenz blind durchgeführt werden. Es ist jedoch nicht erforderlich, die tatsächliche DNA- oder RNA-Sequenz des spezifischen Nucleinsäurefragments zu kennen.
- Das Verfahren unter Verwendung der Rekombination innerhalb einer gemischten Population von Genen kann zum Herstellen beliebiger nützlicher Proteine eingesetzt werden, z. B. von Interleukin I, Antikörpern, tPA, Wachstumshormon usw.. Dieses Verfahren kann zum Herstellen von Proteinen verwendet werden, die eine veränderte Spezifität oder Aktivität aufweisen. Das Verfahren kann auch zum Herstellen von mutierten Nucleinsäuresequenzen eingesetzt werden, z. B. von Promotorregionen, Introns, Exons, Enhancersequenzen, 3'-untranslatierten Regionen oder 5'-untranslatierten Regionen von Genen. Somit kann dieses Verfahren zum Herstellen von Genen eingesetzt werden, die erhöhte Expressionsraten aufweisen. Dieses Verfahren kann sich auch zum Untersuchen repetitiver DNA-Sequenzen eignen. Schließlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um Ribozyme oder Aptamere zu mutieren.
- Gerüstartige Regionen, die in Proteinen die Regionen, die verschieden sind, voneinander trennen, können für die Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders geeignet sein. Das konservierte Gerüst bestimmt durch Selbstassoziation die Gesamtfaltung, während relativ wenig eingeschränkte Schleifen präsentiert werden, die die spezifische Bindung vermitteln. Beispiele solcher Gerüste sind das Immunglobulin- Beta-Fass und das Vier-Helix-Bündel. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um gerüstartige Proteine mit verschiedenen Kombinationen von mutierten Sequenzen für die Bindung herzustellen.
- Anhand der Vorgehensweisen der vorliegenden Erfindung können auch Verfahren durchgeführt werden, die einigen herkömmlichen genetischen Paarungen entsprechen. Z. B. kann eine "molekulare" Rückkreuzung erfolgen, indem die Mutanten- Nucleinsäure wiederholt mit der Wildtyp-Nucleinsäure gemischt wird, während nach den Mutationen von Interesse selektiert wird. Wie beim traditionellen Züchten kann diese Vorgehensweise dazu verwendet werden, um Phänotypen unterschiedlicher Herkunft miteinander in einem Hintergrund der Wahl zu kombinieren. Dies kann z. B. zum Entfernen neutraler Mutationen eingesetzt werden, die nicht-selektierte Merkmale (z. B. die Immunogenität) beeinflussen. Somit kann es nützlich sein, zu bestimmen, welche Mutationen in einem Protein an der verbesserten biologischen Aktivität beteiligt sind und welche nicht.
- Das Shuffling kann auch eingesetzt werden, um einen Pool von selektierten Bankmitgliedern rekombinatorisch zu variieren, die durch das Screening eines Zwei- Hybrid-Screeningsystems erhalten wurden, wobei Bankmitglieder identifiziert wurden, die an eine festgelegte Polypeptidsequenz banden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die selektierten Bankmitglieder vereinigt und einem Shuffling durch in vivo- Rekombination unterworfen. Der geshuffelte Pool kann anschließend in einem Zwei- Hybrid-Hefesystem gescreent werden, um Bankmitglieder zu selektieren, die an die festgelegte Polypeptidsequenz (z. B. eine SH2-Domäne) binden oder die an eine andere festgelegte Polypeptidsequenz binden (z. B. eine 5H2-Domäne aus einer anderen Proteinart).
- Ein Verfahren zum Identifizieren von Polypeptidsequenzen, die an eine festgelegte Polypeptidsequenz binden, bestand darin, ein sogenanntes "Zwei-Hybrid"-System zu verwenden, bei dem die festgelegte Polypeptidsequenz in einem Fusionsprotein vorliegt (Chien et al., (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 9578). Mit diesem Verfahren werden Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo identifiziert, indem ein transkriptionaler Aktivator wiederhergestellt wird (Fields, S., und Song, O., (1989), Nature 340: 245), das Gal4-Transkriptionsprotein der Hefe. Typischerweise beruht das Verfahren auf den Eigenschaften des Gal4-Proteins der Hefe, das aus trennbaren Domänen besteht, die für dis DNA-Bindung und die transkriptionale Aktivierung verantwortlich sind. Polynucleotide, die zwei Hybridproteine codieren, von denen das eine aus der Gal4-DNA- bindenden Domäne der Hefe besteht, fusioniert mit einer Polypeptidsequenz eines bekannten Proteins, und von denen das andere aus der Gal4-Aktivierungsdomäne besteht, fusioniert mit einer Polypeptidsequenz eines zweiten Proteins, werden konstruiert und in eine Hefe-Wirtszelle eingeführt. Die intermolekulare Bindung zwischen den zwei Fusionsproteinen stellt die Gal4-DNA-bindende Domäne mit der Gal4-Aktivierungsdomäne wieder her, wodurch es zur transkriptionalen Aktivierung eines Reportergens (z. B. lacZ, HIS3) kommt, das mit einer Gal4-Bindungsstelle funktionell verbunden ist. Typischerweise wird das Zwei-Hybrid-Verfahren eingesetzt, um neue Polypeptidsequenzen zu identifizieren, die mit einem bekannten Protein interagieren (Silver, S. C., und Hunt, S. W., (1993), Mol. Biol. Rep. 17: 155: Durfee et al., (1993), Genes Devel. 7: 555; Yang et al., (1992), Science 257: 680; Luban et al., (1993), Cell 73: 1067; Hardy et al., (1992), Genes Devel. 6: 801; Bartel et al., (1993), Biotechniques 14: 920; und Vojtek et al., (1993), Cell 74: 205). Jedoch wurden auch Modifikationen des Zwei-Hybrid- Verfahrens eingesetzt, um Mutationen eines bekannten Proteins zu identifizieren, die seine Bindung an ein zweites bekanntes: Protein beeinflussen (Li, B., und Fields, S., (1993), FASEB J. 7: 957; Lalo et al., (1993), Proc. Natl: Acad. Sci. (USA) 90: 5524; Jackson et al., (1993), Mol. Cell. Biol. 13: 2899; und Madura et al., (1993), J. Biol. Chem. 268: 12046). Zwei-Hybrid-Systeme würden auch eingesetzt; um interagierende Strukturdomänen von zwei bekannten Proteinen (Bardwell et al., (1993), Med. Microbiol. 8: 1177; Chakraborty et al., (1992), J. Biol. Chem. 267: 17498; Staudinger et al., (1993), J. Biol. Chem. 268: 4608; und Milne, G. T., und Weaver, D. T., (1993), Genes Devel. 7: 1755) oder Domänen zu identifzieren, die für die Oligomerisierung eines einzelnen Proteins verantwortlich sind (Iwabuchiet al., (1993), Oncogene 8: 1693; Bogerd et al., (1993), J. Virol. 67: 5030). Modifikationen von Zwei-Hybrid-Systemen wurden verwendet, um die in vivo-Aktivität eines proteolytischen Enzyms zu untersuchen (Dasmahapatra et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4159). Als Alternative kann ein E. coli/BCCP-interaktives Screeningsystem verwendet werden (Germino et al., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 933; Guarente, L., (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 1639), um interagierende Proteinsequenzen zu identifizieren (d. h. Proteinsequenzen, die heterodimerisieren oder Heteromultimere höherer Ordnung bilden). Die durch ein Zwei-Hybrid-System selektierten Sequenzen können vereinigt und einem Shuffling unterworfen werden, und sie können für eine oder mehrere weitere Screeningrunden in ein Zwei-Hybrid-System eingeführt werden, um Polypeptidsequenzen zu identifzieren, die an das Hybrid binden, das die festgelegte Bindungssequenz enthält. Die auf diese Weise identifizierten Sequenzen können verglichen werden, um eine Konsensus-Sequenz (Konsensus-Sequenzen) und Konsensus-Sequenz-Kerne zu identifizieren.
- Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, hat die vorliegende Erfindung ein großes Anwendungsspektrum. Die folgenden Beispiele sollen lediglich zur Erläuterung des Sequenz-Shuffling dienen. In den Beispielen 8 bis 13 sind in vivo- Shuffling-Formate gemäß den vorliegenden Patentansprüchen dargestellt. Die weiteren Beispiele dienen lediglich der Erläuterung.
- In den nachstehenden Beispielen haben die folgenden Abkürzungen die folgende Bedeutung: Wenn die Abkürzungen nachstehend nicht definiert sind, haben sie die Bedeutung nach dem Stand der Technik.
- ml Milliliter
- ul = Mikroliter
- uM = Mikromolar
- nM = Nanomolar
- PBS = Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
- ng = Nanogramm
- ug = Mikrogramm
- IPTG = Isopropylthio-β-D-galactosid
- bp = Basenpaare
- kb = Kilobasenpaare
- dNTP = Desoxynucleosidtriphosphate
- PCR = Polymerasekettenreaktion
- X-gal = 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid
- DNase I = Desoxyribonuclease
- PBS = Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung
- CDR = Komplementarität-bestimmende Regionen
- MIC = minimale Hemmkonzentration
- scFv = einzelkettiges Fv-Fragment eines Antikörpers
- Die herkömmlichen Verfahren der DNA-Rekombinations-Technik werden in verschiedenen Veröffentlichungen allgemein beschrieben, z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 1 und 2 und Ergänzungen; und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Bd. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987), Academic Press, Inc., San Diego; CA. Restriktionsenzyme und Polynucleotid-modifizierende Enzyme wurden gemäß den Anweisungen der Hersteller eingesetzt. Oligonucleotide wurden auf einem DNA-Synthesizer von Applied Biosystems Inc., Modell 394, unter Verwendung von ABI-Chemikalien synthetisiert. Der Fachmann kann nach Wunsch PCR-Amplimer zum Amplifizieren einer festgelegten DNA-Sequenz auswählen.
- Das Substrat für die Wiederzusammenbau-Reaktion war das dsDNA-Produkt der Polymerasekettenreaktion (PCR) des Wildtyp-Gens von LacZ-alpha aus pUC18 (Fig. 2) (28; Gene Bank Nr. XO2514). Die Primersequenzen waren 5' AAAGCGTCGATTTTTGTGAT 3' (SEQ ID NO: 1) und 5' ATGGGGTTCCGCGCACATTT 3' (SEQ ID NO: 2). Die freien Primer wurden aus dem PCR-Produkt durch Wizard PCR prep (Promega, Madison, WI) nach den Anweisungen des Herstellers entfernt. Es zeigte sich, dass das Entfernen der freien Primer wichtig war.
- Etwa 5 ug des DNA-Substrats wurden mit 0,15 Einheiten DNase I (Sigma, St. Louis, MO) in 100 ul [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgCl&sub2;] 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 2% Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt laufen gelassen. Fragmente mit 10 bis 70 Basenpaaren (bp) wurden aus dem 2% Agarose-Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese auf DE81-Ionenaustauscherpapier (Whatman, Hillsborough, OR) gereinigt. Die DNA-Fragmente wurden aus dem Papier mit 1 M NaCl eluiert und mit Ethanol gefällt.
- Die gereinigten Fragmente wurden mit einer Konzentration von 10 bis 30 ug/pl in einem PCR-Gemisch resuspendiert (0,2 mM von jedem dNTP, 2,2 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 0,3 ul Taq-DNA-Polymerase, Gesamtvolumen 50 ul). Zu diesem Zeitpunkt wurden keine Primer zugegeben. Ein Wiederzusammenbau-Programm mit 60 Sek. bei 94ºC, 30 bis 45 Zyklen mit [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 50 bis 55ºC, 30 Sekunden bei 72ºC] und fünf Minuten bei 72ºC wurde in einem Thermocycler, PTC-150, MJ Research (Watertown, MA), durchgeführt. Der PCR-Wiederzusammenbau kleiner Fragmente zu größeren Sequenzen wurde verfolgt, indem nach 25, 30, 35, 40 und 45 Wiederzusammenbau-Zyklen Proben aus der Reaktion entnommen wurden (Fig. 2).
- Während der Wiederzusammenbau von 100- bis 200-bp-Fragmenten zu einem einzelnen PCR-Produkt der korrekten Größe führen kann, ergeben 10- bis 50-Basen- Fragmente typischerweise einen gewissen Anteil des Produkts der korrekten Größe und außerdem Produkte mit heterogenen Molekulargewichten. Diese Heterogenität in der Größe scheint hauptsächlich auf einzelsträngige Sequenzen an den Enden der Produkte zurückzuführen zu sein, da nach der Restriktionsenzym-Spaltung eine einzelne Bande der korrekten Größe erhalten wird.
- Nach dem Verdünnen des Wiederzusammenbau-Produkts in dem PCR- Gemisch zusammen mit 0,8 uM von jedem der vorstehenden Primer (SEQ ID NO: 1 und 2) und etwa 15 Zyklen PCR, wobei jeder Zyklus aus [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 50ºC und 30 Sekunden bei 72ºC] bestand, wurde ein einzelnes Produkt mit der korrekten Größe erhalten (Fig. 2).
- Das PCR-Produkt aus dem vorstehenden Schritt 4 wurde mit den terminalen Restriktionsenzymen BamHI und Eco0109 gespalten und Gel-gereinigt, wie im vorstehenden Schritt 2 beschrieben. Die wiederzusammengebauten Fragmente wurden in das mit BamHI und Eco0109 gespaltene pUC18 ligiert. E. coli-Zellen wurden mit dem Ligierungsgemisch unter Standardbedingungen transformiert, wie vom Hersteller (Stratagene, San Diego, CA) empfohlen, und auf Agarplatten mit 100 ug/ml Ampicillin, 0,004% X-gal und 2 mM IPTG plattiert. Die resultierenden Kolonien, die das HindIII- Nhel-Fragment aufwiesen, das für die ++ Rekombinanten charakteristisch ist, wurden aufgrund ihrer blauen Farbe identifiziert.
- In diesem Beispiel wird erläutert, dass eine 1,0-kb-Sequenz, die das LacZ-alpha- Gen enthält, in 10- bis 70-bp-Fragmente gespalten werden kann und dass diese Gelgereinigten 10- bis 70-bp-Fragmente zu einem einzelnen Produkt mit der korrekten Größe wiederzusammengebaut werden können, so dass 84% (N = 377) der resultierenden Kolonien LacZ&spplus; sind (gegenüber 94% ohne Shuffling; Fig. 2).
- Die DNA, die das LacZ-Gen aus den resultierenden LacZ&supmin;-Kolonien codiert, wurde mit einem Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) nach den Anweisungen des Herstellers sequenziert, und dabei wurde gefunden, dass die Gene Punktmutationen aufwiesen, die auf den Wiederzusammenbau-Prozess zurückzuführen waren (Tabelle 1). 11/12 Arten von Substitutionen und keine Verschiebungen des Leserasters ("frameshifts") wurden gefunden. Tabelle 1 Mutationen, die durch mutagenes Shuffling eingeführt wurden
- Insgesamt wurden 4 437 Basen der geshuffelten lacZ-DNA sequenziert.
- Die Rate der Punktmutagenese während des Wiederzusammenbaus der DNA aus 10- bis 70-bp-Stücken wurde aus der DNA-Sequenzierung bestimmt und betrug 0,7 % (N = 4 473), dies ist ähnlich wie bei der Error-prone-PCR. Ohne sich auf eine Theorie beschränken zu wollen, wird angenommen, dass die Rate der Punktmutagenese niedriger sein kann, wenn für den Wiederzusammenbau größere Fragmente verwendet werden oder wenn eine "proof-reading" Polymerase (Polymerase mit Reparaturmechanismus) zugegeben wird.
- Wenn die Plasmid-DNA aus 14 dieser punktmutierten LacZ--Kolonien kombiniert und erneut durch das vorstehend beschriebene Verfahren wiederzusammengebaut/einem Shuffling unterworfen wurde, waren 34% (N = 291) der resultierenden Kolonien LacZ&spplus;, wobei diese Kolonien vermutlich durch die Rekombination der DNA aus unterschiedlichen Kolonien zustande kamen.
- Die erwartete Umkehrrate einer einzelnen Punktmutation durch die Error-prone- PCR wäre bei einer angenommenen Mutageneserate von 0,7% (10) vermutlich < 1%.
- Somit können große DNA-Sequenzen aus einem zufälligen Gemisch kleiner Fragmente durch eine Reaktion wiederzusammengebaut werden, die erstaunlich effizient und einfach ist. Eine Anwendungsmöglichkeit dieser Technik besteht in der Rekombination oder dem Shuffling verwandter Sequenzen aufgrund von Homologie.
- Das Crossover zwischen zwei Markern, die durch 75 Basen getrennt waren, wurde unter Verwendung von LacZ-Gen-Konstrukten gemessen. Stopp-Codons wurden in zwei getrennte Bereiche des LacZ-alpha-Gens eingefügt, um als negative Marker zu dienen. Jeder Marker ist eine 25-bp-große nicht-homologe Sequenz mit vier Stopp-Codons, von denen zwei im Leseraster des LacZ-Gens liegen. Die 25-bp-große nicht-homologe Sequenz ist in Fig. 3 mit einem großen Kästchen bezeichnet. Die Stopp-Codons sind entweder von einem Kästchen umgeben oder unterstrichen. Ein 1 : 1-Gemisch der zwei 1,0-kb-LacZ-Matrizen, enthaltend die +- und -+ Versionen des LacZ-alpha-Gens (Fig. 3), wurde mit DNase I gespalten, und 100- bis 200-bp- Fragmente wurden gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Shuffling-Programm wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich waren wie die für den Wiederzusammenbau in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, mit der Ausnahme, dass 0,5 ul Polymerase zugeben wurde und das Gesamtvolumen 100 ul betrug.
- Nach dem Klonieren betrug die Zahl der erhaltenen blauen Kolonien 24% (N = 386), dies liegt nahe beider theoretischen maximalen Anzahl der blauen Kolonien (d. h. 25%) und zeigt, dass die Rekombination zwischen den zwei Markern vollständig abgelaufen war. Alle zehn blauen Kolonien enthielten das erwartete HindIII-NheI-Restriktionsfragment.
- Außerdem wurden ganze 2,7-kb-Plasmide (pUC18 -+ und pUC18 +-) getestet. Ein 1 : 1-Gemisch der zwei 2,9-kb-Plasmide, enthaltend die Versionen +- und -+ des LacZ-alpha-Gens (Fig. 3), wurde mit DNase I gespalten, und 100- bis 200-bp- Fragmente wurden gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Shuffling-Programm wurde unter Bedingungen durchgeführt, die ähnlich waren wie die vorstehend für den Wiederzusammenbau in Schritt (1) beschriebenen Bedingungen, mit der Ausnahme, dass das Programm mit 60 Zyklen [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 55ºC, 30 Sekunden bei 72ºC] durchgeführt wurde. Die Gelanalyse zeigte, dass nach dem Shuffling-Programm der größte Teil des Produkts größer als 20 kb war. Somit wurden ganze 2,7-kb-Plasmide (pUC18 -+ und pUC18 +-) aus zufälligen 100- bis 200-bp-Fragmenten effizient wiederzusammengebaut, ohne dass Primer zugegeben wurden.
- Nach dem Spalten mit einem Restriktionsenzym, für das auf dem Plasmid eine einmalige Stelle vorlag (Eco0109), bestand das Produkt größtenteils aus einer einzelnen Bande der erwarteten Größe. Diese Bande wurde Gel-gereinigt, erneut ligiert und die DNA zum Transformieren von E. coli eingesetzt. Die Transformanten wurden auf 0,004% X-gal-Platten plattiert, wie in Beispiel 1 beschrieben. 11% (N = 328) der resultierenden Plasmide waren blau und somit ++ Rekombinanten.
- Oligonucleotide, die in das Shuffling-Gemisch zugemischt werden, können aufgrund der Homologie der flankierenden Sequenzen des Oligonucleotids zu der Matrizen-DNA in das Endprodukt eingebaut werden (Fig. 4). Die vorstehend beschriebene LacZ&supmin;-Stopp-Codon-Mutante (pUC18 -+) wurde als die mit DNase I gespaltene Matrize verwendet. Ein aus 66 Nucleotiden bestehendes Oligonucleotid, einschließlich 18 Basen mit Homologie zum Wildtyp-LacZ-Gen an beiden Enden, wurde in einem vierfachen molaren Überschuss zur Reaktion zugegeben, um die in dem ursprünglichen Gen vorliegenden Stopp-Codon-Mutationen zu korrigieren. Die Shuffling-Reaktion wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt wie im vorstehenden Schritt 2. Das resultierende Produkt wurde gespalten, ligiert und in E. coli eingefügt, wie vorstehend beschrieben.
- Kontrolle 0,0 (N > 1000)
- Spike oberer Strang 8,0 (N = 855)
- Spike unterer Strang 9,3 (N = 620)
- Spike oberer und unterer Strang 2,1 (N = 537)
- Die ssDNA erwies sich als wirksamer als die dsDNA, vermutlich aufgrund einer kompetitiven Hybridisierung. Das Ausmaß den Einbaus kann in einem großen Bereich variiert werden, indem man den molaren Überschuss, die Anelierungstemperatur oder die Länge der homologen Bereiche entsprechend einstellt.
- Das Plasmid pUC18 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI, Eco0109, XmnI und AIwNI gespalten, wodurch Fragmente mit etwa 370, 460, 770 und 1080 bp erhalten wurden. Diese Fragmente wurden einer Elektrophorese unterworfen und getrennt aus einem 2%-Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt (wobei die 370- und 460-Basenpaar Banden nicht getrennt werden konnten), wodurch ein großes Fragment, ein mittleres Fragment und ein Gemisch aus zwei kleinen Fragmenten in drei getrennten Röhrchen erhalten wurden.
- Jedes Fragment wurde mit DNase I wie in Beispiel 1 beschrieben gespalten, anschließend wurden für jedes der ursprünglichen Fragmente Fragmente mit 50 bis 130 bp aus einem 2% Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt.
- Das PCR-Gemisch (wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben) wurde zu den gereinigten gespaltenen Fragmenten bis zu einer Endkonzentration von 10 ng/ul der Fragmente zugegeben. Keine Primer wurden zugefügt. Eine Wiederzusammenbau- Reaktion wurde getrennt mit jedem der drei gespaltenen DNA-Fragmentgemische 75 Zyklen lang durchgeführt [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 60ºC], und die Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert.
- Die Ergebnisse zeigten klar, dass sich die 1080-, 770- und die 370- und 460-bp- Banden aus den gereinigten Fragmenten effizient erneut bildeten, dies macht deutlich, dass für das Shuffling überhaupt keine Primer erforderlich sind.
- In diesem Beispiel wird gezeigt, dass Crossover erhalten werden können, die auf Homologien von weniger als 15 Basen beruhen. Als Beispiel wurden ein menschliches und ein murines IL1-β-Gen dem Schuffling unterworfen.
- Ein murines IL1-β-Gen (BBG49) und ein menschliches IL1-β-Gen mit E. coli- Codonpräferenz (BBG2; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) wurden in der Shuffling- Reaktion als Matrizen verwendet. Die Bereiche mit vollständiger Homologie zwischen der menschlichen und der murinen IL1-β-Sequenz sind im Durchschnitt lediglich 4,1 Basen lang (Fig. 5, Regionen mit Heterologie sind mit Kästchen umgeben).
- Das Herstellen der dsDNA-PCR-Produkte für jedes der Gene, das Entfernen der Primer, das Spalten mit DNase I und das Reinigen von 10- bis 50-bp-Fragmenten wurden ähnlich durchgeführt wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben. Die Sequenzen der Primer, die in der PCR-Reaktion eingesetzt wurden, waren 5' TTAGGCACCCCAGGCTTT 3' (SEQ ID NO: 3) und 5' ATGTGCTGCAAGGCGATT 3' (SEQ ID NO: 4).
- Die ersten 15 Zyklen der Shuffling-Reaktion wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I durchgeführt, wobei eine Einheit frisches Enzym zu jedem Zyklus zugegeben wurde. Die DNA wurde zum PCR-Gemisch von Beispiel 1 zugefügt, wobei dem Gemisch die Polymerase fehlte. Das Hand-Programm bestand aus einer Minute bei 94ºC und anschließend 15 Zyklen mit [einer Minute bei 94ºC, 10 Sekunden auf Trockeneis/Ethanol (bis gefroren), etwa 20 Sekunden Inkubieren bei 25ºC, Zugeben von 1 U Klenow-Fragment und zwei Minuten Inkubieren bei 25ºC]. In jedem Zyklus wurde das Röhrchen nach dem Denaturierungsschritt rasch in Trockeneis/Ethanol abgekühlt und wieder auf die Anelierungstemperatur erhitzt. Anschließend wurde die hitzelabile Polymerase zugefügt. Das Enzym muss zu jedem Zyklus zugegeben werden. Bei dieser Vorgehensweise wurde ein hohes Niveau von Crossover erhalten, die auf einer ununterbrochenen Homologie von nur einigen wenigen Basen basierten (Fig. 5, die Positionen der Crossover sind mit " " bezeichnet).
- Nach diesen 15 Hand-Zyklen wurde die Taq-Polymerase zugegeben und weitere 22 Zyklen der Shuffling-Reaktion [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 35ºC] ohne Primer durchgeführt.
- Anschließend wurde die Reaktion zwanzigfach verdünnt. Die folgenden Primer wurden bis zu einer Endkonzentration von 0,8 uM zugegeben:
- 5' AACGCCGCATGCAAGCTTGGATCCTTATT 3' (SEQ ID NO: 5) und 5' AAAGCCCTCTAGATGATTACGAATTCATAT 3' (SEQ ID NO: 6), und eine PCR- Reaktion wie im vorstehenden Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das zweite Primerpaar unterschied sich vom ersten Paar nur deshalb, weil eine Änderung der Restriktionsstellen für erforderlich gehalten wurde.
- Nach dem Spalten des PCR-Produkts mit XbaI und SphI wurden die Fragmente in ein mit Xbal und Sphl gespaltenes pUC18 ligiert. Die Sequenzen der Inserte aus verschiedenen Kolonien wurden durch ein Didesoxy-DNA-Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical Co., Cleveland OH) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
- Bei der DNA-Sequenzierung von neun Kolonien wurden insgesamt 17 Crossover gefunden. Einige der Crossover basierten auf einer ununterbrochenen Homologie von lediglich bis zu zwei Basen.
- Es wurde gefunden, dass eine sehr wenig effektive Anelierungstemperatur erforderlich ist, um effiziente Crossover zu erzielen, die auf kurzen Homologien basieren. Bei Verwendung einer hitzestabilen Polymerase hat die Abkühlzeit der PCR-Maschine (von 94ºC auf 25ºC mit ein bis zwei Grad pro Sekunde) zur Folge, dass die tatsächliche Anelierungstemperatur höher ist als die festgesetzte Anelierungstemperatur. Deshalb ergab keines der auf Taq-Polymerase beruhenden Protokolle Crossover, auch wenn von dem einen der IL1-β-Gene ein zehnfacher Überschuss verwendet wurde. Im Gegensatz dazu kann unter Verwendung einer hitzelabilen Polymerase, z. B. des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase I, eine niedrige Anelierungstemperatur genau eingehalten werden.
- Der Nutzen des mutagenen DNA-Shuffling für eine gezielte molekulare Evolution wurde an einem β-Lactamase-Modellsystem getestet. Die TEM-1-β-Lactamase ist ein sehr effizientes Enzym, dessen Reaktionsrate hauptsächlich durch die Diffusion eingeschränkt wird. Mit diesem Beispiel kann bestimmt werden, ob es möglich ist, seine Reaktionsspezifität zu veränderen und eine Resistenz gegenüber dem Arzneistoff Cefotaxim zu erhalten, den es normalerweise nicht hydrolysiert.
- Die minimale Hemmkonzentration (MIC) von Cefotaxim auf Bakterienzellen, die kein Plasmid aufweisen, wurde bestimmt, indem 10 ul einer 10&supmin;² Verdünnung einer Übernacht-Bakterienkultur (etwa 1000 cfu) von E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene, San Diego, CA) auf Platten mit verschiedenen Cefotaxim-Konzentrationen (Sigma, St. Louis, MO) plattiert wurden, worauf eine Inkubation von 24 Stunden bei 37ºC folgte.
- Das Wachstum auf Cefotaxim ist gegenüber der Zelldichte empfindlich, weshalb es erforderlich ist, dass auf jeder Platte ähnliche Zellzahlen plattiert werden (erhalten durch Plattieren auf glatten LB-Platten). Die Zellen wurden durchweg mit 1000 Zellen plattiert.
- Ein pUC18-Derivat wurde verwendet, das das bakterielle TEM-1-β-Lactamase- Gen enthielt (28). Das TEM-1-β-Lactamase-Gen verleiht den Bakterien eine Resistenz gegen etwa 0,02 ug/ml Cefotaxim. Sfi1-Restriktionsstellen wurden 5' des Promotors und 3' des Endes des Gens durch PCR der Vektorsequenz mit den zwei Primern:
- Primer A (SEQ ID NO: 7):
- 5' TTCTATTGACGGCCTGTCAGGCCTCATATATACTTTAGATTGATTT 3'
- und Primer B (SEQ ID NO: 8):
- 5' TTGACGCACTGGCCATGGTGGCCAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTT 3', und durch PCR der β-Lactamase-Gensequenz mit den zwei anderen Primem eingefügt:
- Primer C (SEQ ID NO: 9):
- 5' AACTGACCACGGCCTGACAGGCCGGTCTGACAGITACCAATGCTT 3'
- und Primer D (SEQ ID NO: 10):
- 5' AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT 3'.
- Die zwei Reaktionsprodukte wurden mit Sfil gespalten, gemischt, ligiert und zum Transformieren von Bakterien verwendet.
- Das resultierende Plasmid war pUC182Sfi. Dieses Plasmid enthält ein Sfi1- Fragment, das das TEM-1-Gen und den P-3-Promotor umfasst.
- Die minimale Hemmkonzentration von Cefotaxim betrug bei E. coli XL1-Blue- Zellen (Stratagene, San Diego, CA), die dieses Plasmid enthielten, nach 24 Stunden bei 37ºC 0,02 ug/ml.
- Die Fähigkeit, die Resistenz des β-Lactamase-Gens gegen Cefotaxim ohne Shuffling zu verbessern, wurde bestimmt, indem ein verdünnter Pool von Zellen (etwa 10&sup7; cfu) auf zweifach steigenden Arzneistoffkonzentrationen schrittweise wiederplattiert wurde. Die Resistenz gegenüber bis zu 1,28 ug/ml konnte ohne Shuffling erreicht werden. Dies stellte eine 64-fache Steigerung der Resistenz dar.
- Das Substrat für die erste Shuffling-Reaktion war eine dsDNA mit 0,9 kb, die durch eine PCR von pUC182Sfi mit den Primern C und D erhalten wurde, von denen beide eine SfiI-Stelle enthalten.
- Die freien Primer wurden in jedem Zyklus aus dem PCR-Produkt durch Wizard PCR prep (Promega, Madison, WI) entfernt.
- Etwa 5 ug des DNA-Substrats (der DNA-Substrate) wurden mit 0,15 Einheiten DNase I (Sigma, St. Louis, MO) in 100 ul 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM MgCl&sub2;, zehn Minuten bei Raumtemperatur gespalten. Die Fragmente mit 100 bis 300 Basenpaaren wurden aus 2% Agarose-Gelen mit niedrigem Schmelzpunkt durch Elektrophorese auf DE81-Ionenaustauscherpapier (Whatman, Hillsborough, OR) gereinigt, mit 1 M NaCl eluiert und mit Ethanol gefällt, wobei das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren verwendet wurde.
- Die gereinigten Fragmente wurden in einem PCR-Gemisch (0,2 mM von jedem dNTP, 2,2 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100) bei einer Konzentration von 10 bis 30 ng/ul resuspendiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden keine Primer zugegeben. Anschließend wurde das Wiederzusammenbau-Programm von 60 Sekunden bei 94ºC und anschließend 40 Zyklen mit [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 50 bis 55ºC, 30 Sekunden bei 72ºC] und danach fünf Minuten bei 72ºC in einem Thermocycler, PTC-150, MJ Research (Watertown, MA), durchgeführt.
- Nach dem Verdünnen des Wiederzusammenbau-Produkts in dem PCR-Gemisch mit 0,8 uM jedes Primers (C und D) und 20 PCR-Zyklen [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 50ºC, 30 Sekunden bei 72ºC] wurde ein einzelnes Produkt mit einer Größe von 900 bp erhalten.
- Nach dem Spalten des 900-bp-Produkts mit dem terminalen Restriktionsenzym Sfil und der Agarose-Gel-Reinigung wurde das 900-bp-Produkt an der einmaligen SfiI- Stelle mit T4-DNA-Ligase (BRL, Gaithersburg, MD) in den Vektor pUC182Sfi ligiert. Das Gemisch wurde durch Elektroporation in E. coli XL1-Blue-Zellen gebracht und diese auf LB-Platten mit 0,32 bis 0,64 ug/ml Cefotaxim plattiert (Sigma, St. Louis, MO). Die Zellen wurden bis zu 24 Stunden bei 37ºC gezüchtet und die resultierenden Kolonien als Pool von der Platte abgeschabt und als PCR-Matrize für die nächste Shuffling-Runde verwendet.
- Die nach jeder von drei Shuffling-Runden erhaltenen Transformanten wurden mit steigenden Konzentrationen von Cefotaxim plattiert. Die Kolonien (> 100, um die Diversität beizubehalten) aus der Platte mit der höchsten Cefotaxim-Konzentration wurden vereinigt und in der nächsten Runde als Matrize für die PCR-Reaktion verwendet.
- Ein Gemisch der im vorstehenden Schritt (5) bei 0,32 bis 0,64 ug/ml erhaltenen Cefotaxim-Kolonien wurde als Matrize für die nächste Shuffling-Runde verwendet. 10 ul der Zellen in LB-Brühe wurden als Matrize in einem Wiederzusammenbau-Programm eingesetzt, das wie vorstehend beschrieben aus zehn Minuten bei 99ºC, anschließend 35 Zyklen mit [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 52ºC, 30 Sekunden bei 72ºC] und danach fünf Minuten bei 72ºC bestand.
- Die Wiederzusammenbau-Produkte wurden gespalten und in pUC1825f1 ligiert, wie im vorstehenden Schritt (5) beschrieben. Das Gemisch wurde durch Elektroporation in E. coli XL1-Blue-Zellen eingeführt und auf LB-Platten plattiert, die 5 bis 10 ug/ml Cefotaxim enthielten.
- Die bei 5 bis 10 ug/ml erhaltenen Kolonien wurden für eine dritte Runde eingesetzt, die ähnlich war wie die erste und die zweite Runde, mit der Ausnahme, dass die Zellen auf LB-Platten mit 80 bis 160 ug/ml Cefotaxim plattiert wurden. Nach der dritten Runde wurden die Kolonien bei 80 bis 160 ug/ml erhalten, und nach dem erneuten Plattieren auf steigenden Cefotaxim-Konzentrationen konnten nach 24 Stunden bei 37ºC Kolonien bei bis zu 320 ug/ml erhalten werden (MIC = 320 ug/ml).
- Das Wachstum auf Cefotaxim ist von der Zelldichte abhängig, weshalb alle MICs standardisiert werden müssen (in unserem Fall auf etwa 1000 Zellen pro Platte). Bei höheren Zelldichten wurde bei bis zu 1280 ug/ml Wachstum erhalten. Die fünf größten der bei 1280 ug/ml gewachsenen Kolonien wurden zweimal plattiert, um Einzelkolonien zu isolieren, und die Sfi1-Inserte wurden analysiert, indem die Kolonie-PCR-Produkte einer Restriktionskartierung unterworfen wurden.
- Eine Mutante wurde erhalten, die eine 16 000-fach erhöhte Resistenz gegen Cefotaxim aufwies (MIC = 0,02 ug/ml gegenüber MIC = 320 ug/ml).
- Nach dem Selektieren wurde das Plasmid der selektierten Klone zurück in Wildtyp-E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene, San Diego, CA) überführt, um sicherzustellen, dass keine der gemessenen Arzneistoffresistenz auf chromosomale Mutationen beruhte.
- Drei Zyklen mit Shuffling und Selektieren ergaben einen 1,6 · 10&sup4;-fachen Anstieg der minimalen Hemmkonzentration des erweiterten Breitband-Antibiotikums Cefotaxim für die TEM-1-β-Lactamase. Im Gegensatz dazu führte das wiederholte Plattieren ohne Shuffling lediglich zu einem 16-fachen Anstieg der Resistenz (Error-prone-PCR oder Kassetten-Mutagenese).
- Alle fünf der bei 1280 ug/ml gewachsenen größten Kolonien wiesen eine Restriktionskarte auf, die mit dem Wildtyp-TEM-1-Enzym identisch war. Das SfiI-Insert des Plasmids, das aus einer dieser Kolonien erhalten wurde, wurde durch Didesoxy-DNA- Sequenzierung (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Alle Basennummem entsprechen der überarbeiteten pBR322-Sequenz (29), und die Aminosäurenummem entsprechen dem Numerierungsschema nach ABL-Standard (30). Die Aminosäuren sind mit ihren Drei-Buchstaben- Codes und die Nucleotide mit ihren Ein-Buchstaben-Codes bezeichnet. Die Bezeichnung G4205A bedeutet, dass das Nucleotid 4205 von Guanidin zu Adenin geändert wurde.
- Neun einzelne Basensubstitutionen wurden gefunden. G4205A liegt zwischen den Positionen -35 und -10 des β-Lactamase-P3-Promotors (31). Die von Chen und Clowes (31) festgestellte Promotor-Aufwärts-Mutante liegt außerhalb des hier verwendeten Sfi1-Fragments und konnte somit nicht nachgewiesen worden sein. Vier Mutationen waren stumm (A3689 G, G3713A, G3934A und T3959A), und vier führten zu einer Aminosäureänderung (wobei C3448T Gly238Ser zur Folge hatte, A3615 G Met182Thr zur Folge hatte, C3850T Glu104Lys zur Folge hatte und G4107A Ala18Val ergab).
- Anschließend erfolgte die molekulare Rückkreuzung mit einem Überschuss der Wildtyp-DNA, um nicht-essentielle Mutationen zu eliminieren.
- Die molekulare Rückkreuzung wurde auf einem selektierten Plasmid aus der dritten DNA-Shuffling-Runde durch ein Verfahren durchgeführt, das mit dem vorstehend beschriebenen Shuffling identisch war, mit der Ausnahme, dass das Spalten mit der DNase I und die Shuffling-Reaktion in Gegenwart eines 40-fachen Überschusses des Wildtyp-TEM-1-Genfragments durchgeführt wurden. Um die Rückkreuzung effizienter zu machen, wurden in der Shuffling-Reaktion sehr kleine DNA-Fragmente (30 bis 100 bp) eingesetzt. Die rückgekreuzten Mutanten wurden wieder auf LB-Platten mit 80 bis 160 ug/ml Cefotaxim selektiert (Sigma, St. Louis, MO).
- Dieses Rückkreuzungs-Shuffling wurde mit DNA aus Kolonien aus der ersten Rückkreuzungsrunde in Gegenwart eines 40 fachen Überschusses an Wildtyp-TEM-1- DNA wiederholt. Kleine DNA-Fragmente (30 bis 100 bp) wurden eingesetzt, um die Wirksamkeit der Rückkreuzung zu steigern. Die rückgekreuzten Mutanten der zweiten Runde wurden erneut auf LB-Platten mit 80 bis 160 ug/ml Cefotaxim selektiert.
- Die resultierenden Transformanten wurden auf 160 ug/ml Cefotaxim plattiert und ein Pool von Kolonien erneut auf steigenden Cefotaxim-Konzentrationen von bis zu 1280 ug/ml plattiert. Die größte bei 1280 ug/ml erhaltene Kolonie wurde erneut plattiert, um Einzelkolonien zu isolieren.
- Diese rückgekreuzte Mutante war 32 000-fach resistenter als der Wildtyp (MIC = 640 ug/mt). Der Mutantenstamm ist 64-fach resistenter gegenüber Cefotaxim als früher beschriebene klinische oder technisch hergestellte, von TEM-1 hergeleitete Stämme.
- Somit wird deutlich, dass das DNA-Shuffling ein schnelles und effektives Verfahren für mindestens mehrere Zyklen der gezielten molekularen Evolution darstellt.
- Die DNA-Sequenz des SfiI-Inserts der rückgekreuzten Mutante wurde bestimmt, indem ein Didesoxy-DNA-Sequenzierungs-Kit (United States Biochemical Co., Cleveland, OH) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Die Mutante wies neun einzelne Basenpaarmutationen auf. Wie erwartet waren alle vier vorher nachgewiesenen stummen Mutationen verloren gegangen und die Sequenz des Wildtyp-Gens wiederhergestellt. Die Promotor-Mutation (G4205A) und auch drei der vier Aminosäuremutationen (Glu104Lys, Met182Thr und Gly238Ser) blieben in dem rückgekreuzten Klon erhalten, dies legt nahe, dass sie für die Resistenz gegen hohe Cefotaxim-Konzentrationen essentiell sind. Jedoch wurden zwei neue stumme Mutationen (T3842C und A3767 G) und außerdem drei neue Mutationen gefunden, die zu Aminosäureänderungen führten (C344T hat Arg241 His zur Folge, C3886T hat Gly92Ser zur Folge, und G4035C hat Ala42Gly zur Folge). Während diese zwei stummen Mutationen keinen Einfluss auf die Primärsequenz des Proteins haben, können sie jedoch die Expressionsrate des Proteins (z. B. durch die mRNA-Struktur) und möglicherweise sogar die Faltung des Proteins beeinflussen (indem sie die Codonpräferenz und deshalb die "Pause"-Position verändern, die mit der Proteinfaltung in Zusammenhang gebracht wurde). Tabelle 3 Mutationen in der β-Lactamase
- Sowohl die rückgekreuzten als auch die nichtrückgekreuzten Mutanten besitzen eine Promotor-Mutation (die selbst oder in Kombination zu einem zwei- bis dreifachen Anstieg der Expressionsrate führt) und außerdem drei herkömmliche Aminosäureänderungen (Glu104Lys, Met182Thr und Gly238Ser). Glu104Lys und Gly238Ser sind Mutationen, die in verschiedenen Cefotaxim-resistenten oder anderen TEM-1-Derivaten vorliegen (Tabelle 4).
- Die Expressionsraten des β-Lactamase-Gens im Wildtyp-Plasmid, in der nichtrückgekreuzten Mutante und in der rückgekreuzten Mutante wurden verglichen, indem eine SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (4 bis 20%; Novex, San Diego, CA) von periplasmatischen Extrakten durchgeführt wurde, die durch osmotischen Schock nach dem Verfahren von Witholt, B., (32) hergestellt wurden.
- Gereinigte TEM-1-β-Lactamase (Sigma, St. Louis, MO) wurde als Molekulargewicht-Standard verwendet, und E. coli XL1-Blue-Zellen, die kein Plasmid aufwiesen, dienten als negative Kontrolle.
- Es zeigte sich, dass die Mutante und die rückgekreuzte Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Gen einen zwei- bis dreifach höheren Spiegel des β-Laetamase-Proteins produzierten. Die Promotor-Mutation führte zu einem zwei- bis dreifachen Anstieg der β-Lactamase.
- Um die Resistenz verschiedener Kombinationen von Mutationen zu bestimmen und die neuen Mutanten mit veröffentlichten Mutanten zu vergleichen, wurden mehrere Mutanten in einem identischen Plasmid-Hintergrund konstruiert. Von zwei der Mutationen, Glu104Lys und Gly238Ser, weiß man, dass sie Cefotaxim-Mutanten sind. Alle konstruierten Mutanten-Kombinationen wiesen die Promotor-Mutation auf, so dass ein Vergleich mit selektierten Mutanten durchgeführt werden konnte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
- Spezifische Kombinationen von Mutationen wurden in den Wildtyp-pUC182Sfi durch PCR eingeführt, wobei pro Mutation zwei Oligonucleotide verwendet wurden.
- Die Oligonucleotide, mit denen die folgenden Mutationen erhalten wurden, waren:
- Diese getrennten PCR-Fragmente wurden von den synthetischen Oligonucleotiden Gel-gereinigt. 10 ng jedes Fragments wurden kombiniert und eine Wiederzusammenbau-Reaktion wie folgt durchgeführt mit einer Minute bei 94ºC und danach 25 Zyklen [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 50ºC, 45 Sekunden bei 72ºC]. Die PCR erfolgte am Wiederzusammenbau-Produkt 25 Zyklen lang in Gegenwart der SfiI- enthaltenden Außen-Primer (Primer C und D aus Beispiel 5). Die DNA wurde mit Sfi1 gespalten und in den Wildtyp-pUC182Sfi-Vektor eingefügt. Die folgenden Mutanten- Kombinationen wurden erhalten (Tabelle 4). Tabelle 4
- * Alle diese Mutanten enthalten außerdem die G4205A-Promotor-Mutation.
- Daraus wurde gefolgert, dass konservierte Mutationen für neun von 15 Verdopplungen der MIC verantwortlich sind.
- Es wurde gezeigt, dass Glu104Lys alleine nur zu einer Verdopplung der MIC auf 0,08 ug/ml führte und dass Gly238Ser (in verschiedenen Ausführungen in Kombination mit einer weiteren Aminosäureänderung) nur eine MIC von 0,16 ug/ml zur Folge hatte (26). Die Doppelmutante Glu104Lys/Gly238Ser weist eine MIC von 10 ug/ml auf. Diese Mutante entspricht TEM-15.
- Diese gleichen Glu104Lys- und Gly238Ser-Mutationen in Kombination mit Gln39Lys (TEM-3) oder Thr263Met (TEM-4) führen zu einer Resistenz auf hohem Niveau (2 bis 32 ug/ml für TEM-3 und 8 bis 32 ug/ml für TEM-4) (34, 35).
- Eine Mutante, die die drei Aminosäureänderungen enthielt, die nach der Rückkreuzung konserviert waren (Glu104Lys/Met182Thr/Gly238Ser), wies auch eine MIC von 10 ug/ml auf. Dies bedeutete, dass die Mutationen, die jede der selektierten Mutanten zusätzlich zu den drei bekannten Mutationen besaß, für einen weiteren 32- bis 64- fachen Anstieg der Resistenz des Gens gegen Cefotaxim verantwortlich waren.
- Die natürlich vorkommenden, klinisch von TEM-1 hergeleiteten Enzyme (TEM-1- 19) enthalten jeweils eine unterschiedliche Kombination von nur fünf bis sieben identischen Mutationen (Reviews). Da die Positionen dieser Mutationen in dem Gen deutlich voneinander getrennt sind, kann eine Mutante mit einer hohen Cefotaxim-Resistenz nicht durch Kassetten-Mutagenese eines einzelnen Bereichs erhalten werden. Dies kann erklären, warum die maximale MIC, die durch das herkömmliche Verfahren der Kassetten-Mutagenese erhalten wurde, nur 0,64 ug/ml beträgt (26). z. B. wurde in dieser Studie unabhängig voneinander gefunden, dass sowohl die Glu104Lys-Mutation als auch die Gly238Ser Mutation MICs unter 0,16 ug/ml aufwiesen. Durch die Verwendung des DNA-Shuffling konnten diese Mutationen miteinander kombiniert werden, und auf diese Weise wurde die Glu104Lys/Gly238Ser-Kombination mit einer MIC von 10 ug/ml gefunden.
- Eine wichtige Einschränkung dieses Beispiels besteht darin, dass ein einzelnes Gen als Ausgangspunkt verwendet wird. Man kann davon ausgehen, dass man bessere Kombinationen finden könnte, wenn eine große Zahl von verwandten, natürlich vorkommenden Genen einem Shuffling unterworfen wird. Die Diversität, die in einem solchen Gemisch vorliegt, ist wichtiger als die Zufallsmutationen, die durch das mutagene Shuffling erzeugt werden. Z. B. ist es so gemeint, dass man ein Repertoire von verwandten Genen aus einer einzigen Art, z. B. die bereits vorliegende Diversität des Immunsystems, verwenden könnte oder dass man verwandte Gene einsetzen könnte, die aus vielen verschiedenen Arten erhalten wurden.
- Der scFv-Antikörper A10B, ein Anti-Kaninchen IgG der Maus, war ein Geschenk von Pharmacia (Milwaukee, WI). Das im Handel verfügbare Phagen-Präsentationssystem von Pharmacia wurde eingesetzt, bei dem der Phagen-Präsentationsvektor pCANTAB5 verwendet wird.
- Der ursprüngliche Antikörper A10B hatte reproduzierbar nur eine niedrige Avidität, da Klone erhalten wurden, die nur schwach an ein immobilisiertes Antigen (Kaninchen-IgG) banden (gemessen durch Phagen-ELISA (Testkit von Phamacia) oder durch Phagentiter). Die Konzentration des Kaninchen-IgG, die in einem Kompetitionstest eine Hemmung der A10B-Antikörper-Bindung von 50% ergab, war 13 pMol. Die beobachtete niedrige Avidität ist möglicherweise auch auf eine Instabilität des A10B- Klons zurückzuführen.
- Die A10B-scFv-DNA wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert (United States Biochemical Co., Cleveland, OH). Die Sequenz war ähnlich wie bei vorliegenden Antikörpern, diese Aussage beruht auf einem Vergleich mit Kabat (33).
- Phagen-DNA, die das A10B-Wildtyp-Antikörper-Gen enthielt (10 ul), wurde zehn Minuten bei 99ºC und anschließend zwei Minuten bei 72ºC inkubiert. Das PCR-Gemisch (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 uM von jedem dNTP, 1,9 mM MgCl), 0,6 uM von jedem Primer und 0,5 ul Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI) wurden zu der Phagen-DNA zugegeben. Ein PCR-Programm wurde 35 Zyklen durchgeführt [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 45 Sekunden bei 72ºC]. Die folgenden Primer wurden verwendet:
- 5' ATGATTACGCCAAGCTTT 3' (SEQ ID NO: 26) und
- 5' TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3' (SEQ ID NO: 27).
- Anschließend wurde das 850-bp-große PCR-Produkt einer Elektrophorese unterworfen und aus einem 2%-Agacose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt.
- 300 ng der Gelgereinigten 805-bp-Bande wurden mit 0,18 Einheiten DNAse I (Sigma, St. Louis, MO) in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl, 20 Minuten bei Raumtemperatur gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf einem 2% Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt aufgetrennt und die Banden zwischen 50 und 200 bp aus dem Gel gereinigt.
- Der Zweck dieses Experiments bestand darin, zu testen, ob die Insertion der CDRs effizient war.
- Die folgenden CDR-Sequenzen, die inneren Restriktionsenzymstellen enthielten, wurden synthetisiert. "CDR H" bedeutet eine CDR in der schweren Kette, und "CDR L" bedeutet eine CDR in der leichten Kette des Antikörpers. CDR-Oligos mit Restriktionsstellen:
- Die CDR-Oligos wurden zu den gereinigten DNA-Fragmenten des Antikörpers A10B mit 50 bis 200 bp aus dem vorstehenden Schritt (2) mit einem zehnfachen molaren Überschuss zugegeben. Das PCR-Gemisch (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,9 mM MgCl, 200 uM von jedem dNTP, 0,3 ul Taq-DNA- Polymerase (Promega, Madison, WI), Gesamtvolumen von 50 ul) wurde zugegeben und das Shuffling-Programm durchgeführt mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 72ºC und anschließend 35 Zyklen: 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 55ºC, 30 Sekunden bei 72ºC.
- Ein ul des geshuffelten Gemisches wurde mit 100 ut eines PCR-Gemisches (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100; 200 uM von jedem dNTP, 1,9 mM MgCl, 0,6 ul von jedem der zwei äußeren Primer (SEQ ID NO: 26 und 27, vgl. nachstehend), 0,5 ul Taq-DNA-Polymerase) gemischt und das PCR-Programm 30 Zyklen durchgeführt [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 45 Sekunden bei 72ºC]. Das resultierende Gemisch von DNA-Fragmenten mit der Größe von 850 Basenpaaren wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
- Die äußeren Primer waren:
- Äußerer Primer 1: (SEQ ID NO: 27) 5' TTGTCGTCTTTCCAGACGTT 3',
- Äußerer Primer 2: (SEQ ID NO: 26) 5' ATGATTACGCCAAGCTTT 3'.
- Das 850-bp-große PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Sfil und NotI gespalten, aus einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und in den von Pharmacia, Milwaukee, WI, bezogenen Expressionsvektor pCANTABS ligiert. Der ligierte Vektor wurde gemäß dem von Invitrogen (San Diego, CA) beschriebenen Verfahren durch Elektroporation in TG1-Zellen (Pharmacia, Milwaukee, WI) eingeführt und zum Isolieren von Einzelkolonien plattiert.
- Die DNA aus den resultierenden Kolonien wurde zu 100 ul eines PCR-Gemisches (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 uM von jedem dNTP, 1,9 mM MgCl, 0,6 u) äußerer Primer 1 (SEQ ID NO: 27, vgl. nachstehend), sechs innere Primer (SEQ ID NO: 40 bis 45; vgl. nachstehend), und 0,5 ul Taq-DNA- Polymerase) zugegeben und ein PCR-Programm 35 Zyklen durchgeführt [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 45 Sekunden bei 72ºC]. Die Größen der PCR- Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese bestimmt, und auf diese Weise wurde festgestellt, welche CDRs mit Restriktionsstellen eingebaut waren. CDR innere Primer:
- H1 (SEQ ID NO: 40) 5' AGAATTCATCTAGATTTG 3',
- H2 (SEQ ID NO: 41) 5' GCTTATCCTTTATCTCAGGTC 3',
- H3 (SEQ ID NO: 42) 5' ACTGCAGTCTTATACGAGGAT 3',
- L1 {SEQ ID NO: 43) 5' GACGTCTVAAGCGATCG 3',
- L2 (SEQ ID NO: 44) 5' TAAGGGAGATCTAAACAG 3',
- L3 (SEQ ID NO: 45) 5' TCTGCGCGCTTAAAGGAT 3'.
- Die sechs synthetischen CDRs wurden an den erwarteten Stellen in die Wildtyp- DNA des Antikörpers A10B eingefügt (Fig. 7). Während jede der sechs CDRs in einem spezifischen Klon eine kleine Chance hat, eine CDR mit einer Restriktionsstelle darzustellen, zeigten diese Untersuchungen, dass die meisten Klone mindestens eine CDR mit einer Restriktionsstelle enthielten und dass jede mögliche Kombination von CDRs mit Restriktionsstellen erzeugt wurde.
- Auf Basis unserer Sequenzdaten wurden sechs Oligonucleotide hergestellt, die den sechs CDRs entsprachen. Die CDRs (Kabat-Definition) wurden bei einem Verhältnis von 70 (vorliegende Base) : 10 : 10 : 10 synthetisch mutagenisiert, und sie wurden auf der 5'- und auf der 3'-Seite von etwa 20 Basen einer flankierenden Sequenz flankiert, wodurch die Homologie für den Einbau der CDRs bereitgestellt wird, wenn sie in ein Gemisch nicht-mutagenisierter Antikörper-Genfragmente in einem molaren Überschuss eingemischt werden. Die resultierenden mutierten Sequenzen sind nachstehend angegeben: Oligos für eine CDR-Bank
- Die fett gedruckten und die unterstrichenen Sequenzen waren die mutierten Sequenzen, die unter Verwendung eines Gemisches von Nucleosiden von 70 : 10 : 10 : 10 synthetisiert wurden, wobei 70% das Wildtyp-Nucleosid darstellte.
- Ein zehnfacher molarer Überschuss der CDR-Mutanten-Oligos wurde zu den gereinigten DNA-Fragmenten des Antikörpers A10B mit einer Länge zwischen 50 und 200 bp aus dem vorstehenden Schritt (2) zugegeben. Das PCR-Gemisch (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 1,9 mM MgCl, 200 uM von jedem dNTP, 0,3 ul Taq-DNA-Polymerase (Promega, Madison, WI), Gesamtvolumen von 50 u() wurde zugegeben und das Shuffling-Programm durchgeführt mit einer Minute bei 94ºC, einer Minute bei 72ºC und anschließend 75 Zyklen: [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 55ºC, 30 Sekunden bei 72ºC].
- Ein ul des geshuffelten Gemisches wurde zu 100 ul eines PCR-Gemisches (50 rnM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,1% Triton X-100, 200 uM von jedem dNTP, 1,9 mM MgCl, 0,6 ul von jedem der zwei äußeren Primer (SEQ ID NO: 26 und 27, vgl. nachstehend), 0,5 ul Taq-DNA-Polymerase) zugegeben und das PCR-Programm 30 Zyklen durchlaufen [30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 45ºC, 45 Sekunden bei 72ºC]. Das resultierende Gemisch von DNA-Fragmenten mit der Größe von 850 Basenpaaren wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
- Die äußeren Primer waren:
- Äußerer Primer 1: (SEQ ID NO: 27) 5' TTGTCGTCTTTCCAGAGTT 3',
- Äußerer Primer 2: (SEQ ID NO: 26) 5' ATGATTACGCCAAGCTTT 3'.
- Das 850-bp-große PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen SfiI und NotI gespalten, aus einem Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und in den von Pharmacia, Milwaukee, WI, bezogenen Expressionsvektor pCANTAB5 ligiert. Der ligierte Vektor wurde gemäß dem von Invitrogen (San Diego, CA) beschriebenen Verfahren durch Elektroporation in TG1-Zellen (Pharmacia, Milwaukee, WI) eingeführt und die Phagenbank unter Verwendung eines Helferphagen gemäß den vom Hersteller empfohlenen Anweisungen gezüchtet.
- Die Bank, die auf diese Weise erzeugt wurde, wurde auf das Vorliegen verbesserter Antikörper gescreent, wobei sechs Selektionszyklen eingesetzt wurden.
- 15 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden mit Kaninchen- IgG (Jackson Immunoresearch, Bar Harbor, ME) mit 10 ug/Vertiefung eine Stunde bei 37ºC beschichtet und anschließend mit einer 2-%igen Trockenmagermilch in PBS eine Stunde bei 37ºC blockiert.
- 100 ul der Phagenbank (1 · 10¹&sup0; cfu) wurden mit 100 ul der 2%igen Milch 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und anschließend zu jedem der 15 Vertiefungen zugegeben und eine Stunde bei 37ºC inkubiert.
- Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS, enthaltend 0,5% Tween-20, bei 37ºC zehn Minuten pro Waschgang gewaschen. Gebundene Phagen wurden mit 100 ul Elutionspuffer (Glycin-HCl, pH 2,2) eluiert, worauf eine sofortige Neutralisation mit 2 M Tris, pH 7,4, und die Transfektion zur Phagenproduktion folgten. Dieser Selektionszyklus wurde sechsmal wiederholt.
- Nach dem sechsten Zyklus wurden einzelne Phagenklone herausgegriffen und die relativen Affinitäten durch Phagen-ELISA verglichen, und die Spezifität für den Kaninchen-IgG wurde mit einem Kit von Pharmacia (Milwaukee, WI) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Methoden getestet.
- Der beste Klon hat im Vergleich zum Wildtyp-A10B eine etwa 100-fach verbesserte Expressionsrate, wenn mit dem Western-Test getestet wurde. Die Konzentration des Kaninchen-IgG, die im Kompetitionstest mit dem besten Klon eine Hemmung von 50% ergab, betrug 1 pMol. Der beste Klon war für Kaninchen-Antigen reproduzierbar spezifisch. Dabei zeigt sich, dass die Anzahl der auf dem Phagen präsentierten Antikörperkopien erhöht ist.
- Ein Plasmid mit zwei partiellen inaktiven Kopien des gleichen Gens (β- Lactamase) wurde konstruiert, um zu zeigen, dass die Rekombination zwischen den gemeinsamen Bereichen dieser zwei direkten Wiederholungen zu aktiven rekombinanten Genen der vollen Länge führt.
- Ein pUC18-Derivat wurde verwendet, das das bakterielle TEM-1-β-Lactamase- Gen enthielt (Yanish-Perron et al., 1985, Gene 33: 103-119). Das TEM-1-β-Lactamase- Gen ("Bla") verleiht den Bakterien eine Resistenz gegen etwa 0,02 ug/ml Cefotaxim. Sfi1-Restriktionsstellen würden 5' des Promotors und 3' des Endes des β-Lactamase- Gens durch PCR der Vektorsequenz mit den zwei Primern:
- Primer A (SEQ ID NO: 46)
- 5' TTCTATTGACGGCCTGTCAGGCCTCATATATACTTTAGATTGATTT 3',
- Primer B (SEQ ID NO: 47)
- 5' TTGACGCACTGGCCATGGTGGCCAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTT 3',
- und durch PCR der β-Lactamase-Gensequenz mit den zwei anderen Primern zugefügt:
- Primer C (SEQ ID NO: 48)
- 5' AACTGACCACGGCCTGACAGGCCGGTCTGACAGTTACCAATGCTT 3'
- Primer D (SEQ ID NO: 49)
- 5' AACCTGTCCTGGCCACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT 3'
- Die zwei Reaktionsprodukte wurden mit Sfi1 gespalten, gemischt, ligiert und zum Transformieren kompetenter E. coli-Bakterien durch das nachstehend beschriebene Verfahren eingesetzt. Das resultierende Plasmid war pUC182Sfi-Bla-Sfi. Dieses Plasmid enthält ein Sfi1-Fragment, das das Bla-Gen und den P-3-Promotor umfasst.
- Die minimale Hemmkonzentration von Cefotaxim für E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene, San Diego, CA), die pUC182Sfi-Bla-Sfi enthielten, betrug nach 24 Stunden bei 37ºC 0,02 ug/ml.
- Das Tetracyclin-Gen von pBR322 wurde unter Verwendung der homologen Bereiche in pUC18Sf1-Bla-Sfi kloniert, wodurch pBR322TetSfi-Bla-Sfi erhalten wurde. Anschließend wurde das TEM-1-Gen durch Restriktionsspalten des pBR322TetSfi-Bla-Sfi mit SspI und FspI und durch Ligieren der glatten Enden entfernt, wodurch pUC322TetSfi-Sfi erhalten wurde.
- Überlappende Regionen des TEM-1-Gens wurden unter Verwendung herkömmlicher PCR-Techniken und der folgenden Primer amplifiziert:
- Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) 5' TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3',
- Primer 2493 (SEQ ID NO: 51) 5' TTT TAA ATC AAT CTA AAG TAT 3',
- Primer 2651 (SEQ ID NO: 52)
- 5' TGCTCATCCACGAGTGTGGAGAAGTGGTCCTGCAACTTTAT 3' und
- Primer 2652 (SEQ ID NO: 53)
- ACCACTTCTCCACACTCGTGGATGAGCACTTTTAAAGTT:
- Die zwei resultierenden DNA-Fragmente wurden mit Sfi1 und BstX1 gespalten und in die Sfi-Stelle von pBR322TetSfi-Sfi ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit pBR322Sfi-BL-LA-Sfi bezeichnet. Eine Karte des Plasmids und eine schematische Darstellung der intraplasmidischen Rekombination und Wiederherstellung der funktionellen β-Lactamase finden sich in Fig. 9.
- Das Plasmid wurde durch Elektroporation entweder in TG-1-Zellen oder in E. coli-JC8679-Zellen eingeführt. E. coli-JC8679 ist RebBC sbcA (Oliner et al., 1993, NAR 21: 5192). Die Zellen wurden auf Tetracyclin-enthaltende Festagarplatten plattiert. Anschließend wurden die Kolonien, die wuchsen, auf Festagarplatten plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten, und die lebensfähigen Kolonien gezählt. Die Inserte des β- Lactamase-Gens in den Transformanten, die eine Ampicillin-Resistenz zeigten, wurden durch herkömmliche PCR-Techniken amplifiziert, wobei der Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) 5' TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3' und der Primer 2493 (SEQ ID NO: 51) 5' TTTTAAATCAATCTAAAGTAT 3' verwendet wurden, und die Länge des Inserts gemessen. Das Vorliegen eines 1-kb-Inserts zeigt, dass das Gen erfolgreich rekombiniert wurde, wie in Fig. 9 und Tabelle 5 zu sehen ist. Tabelle 5
- Etwa 17 bis 25% der Tetracyclin-resistenten Kolonien waren auch gegen Ampicillin resistent, und alle Ampicillin-resistenten Kolonien wurden korrekt rekombiniert, wie durch Kolonie-PCR bestimmt wurde. Deshalb werden partielle Gene, die auf dem gleichen Plasmid liegen, sich erfolgreich rekombinieren, so dass ein funktionelles Gen hergestellt wirden.
- Ein Plasmid mit zwei Kopien in voller Länge von unterschiedlichen Allelen des β- Lactamase-Gens wurde konstruiert. Die homologe Rekombination der zwei Gene führte zu einer einzigen rekombinanten Kopie der vollen Länge dieses Gens.
- Die Konstruktion von pBR322TetSfi-Sfi und pBR322TetSfi-Bla-Sfi wurde vorstehend beschrieben.
- Die zwei Allele des β-Lactamase-Gens wurden folgendermaßen konstruiert.
- Zwei PCR-Reaktionen wurden mit pUC18Sfi-Bla-Sfi als Matrize durchgeführt. Die eine Reaktion wurde mit den folgenden Primern durchgeführt:
- Primer 2650 (SEQ LD NO: 50) 5' TTCTTAGACGTCAGGTGGCACTT 3',
- Primer 2649 (SEQ ID NO: 51)
- 5'ATGGTAGTCCACGAGTGTGGTAGTGACAGGCCGGTCTGACAGTTACCAATGCTT3'
- Die zweite PCR-Reaktion wurde mit den folgenden Primern durchgeführt:
- Primer 2648 (SEQ ID NO: 54)
- 5' TGTCACTACCACACTCGTGGACTACCATGGCCTAAATACATTCAAATATGTAT 3',
- Primer 2493 (SEQ ID NO: 51) 5' TTT TAA ATC AAT CTA AAG TAT 3'
- Hierdurch wurden zwei Bla-Gene erhalten, von denen das eine eine 5'-Sfi1- Stelle und eine 3'-BstX1-Stelle und das andere eine 5'-BstX1-Stelle und eine 3'-Sfi1- Stelle aufwies.
- Nach dem Spalten dieser zwei Gene mit BstX1 und Sfi1 und dem Ligieren in das mit Sfi1 gespaltene Plasmid pBR322TetSfi-Sfi wurde ein Plasmid mit einer Wiederholung des Bla-Gens in Tandemstellung erhalten (vgl. Fig. 10).
- Das Plasmid wurde durch Elektroporation in E. coli-Zellen eingeführt. Die Zellen wurden auf Festagarplatten plattiert, die 15 ug/ml Tetracyclin enthielten. Anschließend wurden die Kolonien, die wuchsen, auf Festagarplatten plattiert, die 100 ug/ml Ampicillin enthielten, und die lebensfähigen Kolonien gezählt. Die Bla-Inserte in den Transformanten, die eine Ampicillin-Resistenz zeigten, wurden durch herkömmliche PCR-Techniken amplifiziert, wobei das Verfahren und die Primer wie in Beispiel 8 beschrieben verwendet wurden. Das Vorliegen eines 1-kb-Inserts zeigte, dass sich die doppelten Gene rekombiniert hatten, wie in Tabelle 6 zu sehen ist. Tabelle 6
- Die Kolonie-PCR bestätigte, dass die Tandem-Wiederholung effizient rekombiniert wurde, wodurch ein einzelnes rekombinantes Gen hergestellt wurde.
- Um zu bestimmen, ob mehrere Rekombinationszyklen eingesetzt werden können, um resistente Zellen schneller herzustellen, wurden mehrere Zyklen des im Beispiel 9 beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
- Die Minus-Rekombinationskontrolle bestand aus einer Einzelkopie des β-Lactamase-Gens, wohingegen das Plus-Rekombinationsexperiment daraus bestand, dass zwei Kopien der β-Lactamase als direkte Wiederholung eingefügt wurden. Anhand des Tetracyclin-Markers wurde die Zahl der in jeder Runde auf Cefotaxim-Resistenz selektierten Kolonien gleichgesetzt, auf diese Weise wurde die Wirksamkeit der Ligierung kompensiert.
- in der ersten Runde wurde pBR322TetSfi-Bla-Sfi mit EcrI gespalten und einer PCR mit einem 1 : 1-Gemisch (1 ml) aus dem normalen und dem Cadwell-PCR-Gemisch (Cadwell und Joyce, 1992, PCR Methods and Applications 2: 28-33) für eine Errorprone-PCR unterworfen. Das PCR-Programm bestand aus anfangs zwei Minuten bei 70ºC und danach 30 Zyklen mit 30 Sekunden bei 94ºC, 30 Sekunden bei 52ºC und drei Minuten und sechs Sekunden bei 72ºC pro Zyklus, gefolgt von zehn Minuten bei 72ºC.
- Die Primer, die in der PCR-Reaktion zum Herstellen des einen Bla-Gen- Kontrollplasmids verwendet wurden, waren der Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) und der Primer 2719 (SEQ ID NO: 55) 5' TTAAGGGATTTTGGTCATGAGATT 3'. Hierdurch wurde eine gemischte Population von amplifzierten DNA-Fragmenten erhalten, die insgesamt als Fragment # 59 bezeichnet wurde. Diese Fragmente wiesen mehrere unterschiedliche Mutationen auf.
- Die Primer, die in zwei unterschiedlichen PCR-Reaktionen zum Herstellen des Zwei-Bla-Gen-Plasmids eingesetzt wurden, waren der Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) und der Primer 2649 (SEQ ID NO: 51) für das erste Gen und der Primer 2648 (SEQ ID NO: 54) und der Primer 2719 (SEQ ID NO: 55) für das zweite Gen. Hierdurch wurde von jedem der zwei amplifizierten DNA-Fragmente eine gemischte Population erhalten: Fragment # 89 (amplifiziert mit den Primern 2648 und 2719) und Fragment # 90 (amplifiziert mit den Primern 2650 und 2649). In jedem Fall wurden in die gemischte Population von jedem der Fragmente mehrere unterschiedliche Mutationen eingeführt.
- Nach der Error-prone-PCR wurde die Population des amplifizierten DNA- Fragments # 59 mit Sfil gespalten und anschließend in pBR322TetSfi-Sfi kloniert, um eine gemischte Population des Plasmids pBR322Sfi-Bla-Sfi¹ herzustellen.
- Nach der Error-prone-PCR wurde die Population der amplifizierten DNA- Fragmente # 90 und # 89 mit Sfil und BstXI bei 50ºC gespalten und in pBR322TetSfi-Sfi ligiert, um eine gemischte Population des Plasmids pBR322TetSfi-2BIa-Sfi¹ herzustellen (Fig. 10).
- Die Plasmide pBR322Sfi-Bla-Sfi¹ und pBR322Sfi-2Bla-Sfi¹ wurden durch Elektroporation in E. coli JC8679 eingeführt und diese auf Agarplatten mit verschiedenen Cefotaxim-Konzentrationen plattiert, um resistente Stämme zu selektieren, und auf Tetracyclin-Platten aufgebracht, um den Titer zu bestimmen.
- Eine gleiche Anzahl von Kolonien (auf Basis der Anzahl von Kolonien, die auf Tetracyclin wuchsen) wurde herausgegriffen, in LB-tet gezüchtet und die DNA aus den Kolonien extrahiert. Dies war eine Runde der Rekombination. Diese DNA wurde mit EcrI gespalten und für eine zweite Runde der Error-prone-PCR wie vorstehend beschrieben verwendet.
- Nach fünf Runden betrug die MIC (minimale Hemmkonzentration) für Cefotaxim für das eine Fragment-Plasmid 0,32, wohingegen die MIC für das zweite Fragment- Plasmid 1,28 betrug. Die Ergebnisse zeigen, dass nach fünf Zyklen die durch Rekombination erhaltene Resistenz bei Vorliegen einer in vivo-Rekombination viermal höher war.
- Kompetente E. coli-Zellen, die pUC18Sfi-Bla-Sfi enthielten, wurden wie beschrieben hergestellt. Das Plasmid pUC18Sfi-Bla-Sfi enthält das Standard-TEM-1-β- Lactamase-Gen, wie vorstehend beschrieben.
- Ein von TEM-1-stammendes Cefotaxim-Resistenz-Gen aus pUC18Sfi-cef-Sfi (Klon ST2) (Stemmer, WPC, (1994), Nature 370: 389-391, hier durch Bezugnahme eingeschlossen) wurde erhalten, das E. coli-Zellen, die das Plasmid enthalten, eine MIC für Cefotaxim von 640 ug/ml verleiht. In einem Experiment wurde die DNA des vollständigen Plasmids pUC18Sfi-cef-Sfi durch Elektroporation in E. coli-Zellen eingeführt, die das Plasmid pUC18Sfi-Bla-Sfi enthielten.
- In einem anderen Experiment wurde das DNA-Fragment, das das Cefotaxim- Gen aus pUC18Sfi-cef-Sfi enthielt, durch PCR unter Verwendung der Primer 2650 (SEQ ID NO: 50) und 2719 (SEQ ID NO: 55) amplifiziert. Das resultierende 1-kb-große PCR-Produkt wurde durch DNase in DNA-Fragmente mit < 100 bp gespalten, und diese Fragmente wurden durch Elektroporation in die kompetenten E. coli-Zellen eingeführt, die bereits pUC18Sfi-Bla-Sfi enthielten.
- Die transformierten Zellen aus beiden Experimenten wurden sodann auf ihre Resistenz gegen Cefotaxim getestet, indem die transformierten Zellen auf Agarplatten mit verschiedenen Cefotaxim-Konzentrationen plattiert wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Kolonien/Cefotaxim-Konzentration
- Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass das ganze St-2-Cef-Gen nach der Elektroporation entweder in das bakterielle Genom oder in das Plasmid eingefügt wurde. Da die meisten Insertionen homolog sind, ist zu erwarten, dass das Gen in das Plasmid eingefügt wurde, indem das Wildtyp-Gen ersetzt wurde. Auch die Fragmente des Cef-Gens aus St-2 wurden effizient in das Wildtyp-Gen im Plasmid eingebaut. Beim Einführen des Wildtyp-Gens (im Ganzen oder in Fragmenten) und keiner DNA konnte keine deutliche Zunahme der Cefotaxim-Resistenz festgestellt werden. Somit wurde gezeigt, dass die ST-2-Fragmente eine viel größere Cefotaxim-Resistenz ergaben als die Wildtyp-Fragmente. Man kann davon ausgehen, dass die wiederholten Insertionen von Fragmenten, die aus Genpools mit steigender Resistenz hergestellt wurden, zu einer steigenden Resistenz führen.
- Demgemäß wurden diejenigen Kolonien isoliert, die mit den St-2-Genfragmenten eine steigende Cefotaxim-Resistenz erzeugten, und die Plasmid-DNA extrahiert. Diese DNA wurde anhand der PCR nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde mit DNase in Fragmente gespalten (< 100 bp) und 2 bis 4 ug der Fragmente durch Elektroporation in kompetente E. coli-Zellen eingeführt, die bereits wie vorstehend beschrieben pUC322Sfi-Bla-Sfi enthielten. Die transformierten Zellen wurden auf Agar plattiert, der verschiedene Cefotaxim-Konzentrationen enthielt.
- Als Kontrolle wurden außerdem kompetente E. coli-Zellen verwendet, die das Plasmid pUC18Sfi-Kan-Sfi enthielten. DNA-Fragmente aus der Spaltung des PCR- Produkts von pUC18Sfi-cef-Sfi wurden durch Elektroporation in diese Zellen eingeführt. Es liegt keine Homologie zwischen dem Kanamycin-Gen und dem β-Lactamase-Gen vor, und somit sollte keine Rekombination stattfinden.
- Dieses Experiment wurde zwei Runden wiederholt, die Ergebnisse hiervon sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8
- Mit diesem Experiment sollte bestimmt werden, welches Rekombinations-Format pro Zyklus die meisten Rekombinanten ergab.
- Im ersten Verfahren wurde der Vektor pUC18Sfi-Bla-Sfi mit PCR-Primern amplifiziert, wodurch ein großes und ein kleines Fragment erzeugt wurden. Das große Fragment wies das Plasmid und Enden auf, die Teile des Bla-Gens enthielten, und das kleine Fragment codierte den Mittelteil des Bla-Gens. Ein drittes Fragment, das das vollständige Bla-Gen aufwies, wurde unter Verwendung der PCR durch das Verfahren von Beispiel 8 hergestellt. Das größere Plasmid-Fragment und das Fragment, das das vollständige Bla-Gen enthielt, wurden gleichzeitig durch Elektroporation anhand des vorstehend beschriebenen Verfahrens in E. coli JC8679-Zellen eingeführt und die Transformanten auf verschiedene Cefotaxim-Konzentrationen plattiert.
- Im zweiten Verfahren wurde der Vektor pUC18Sfi-Bla-Sfi amplifiziert, wodurch das große Plasmid-Fragment produziert wurde, das wie im vorstehenden ersten Verfahren isoliert wurde. Die zwei Fragmente, die jeweils einen Teil des vollständigen Bla- Gens enthielten, so dass die zwei Fragmente zusammen das vollständige Bla-Gen überspannten, wurden auch durch PCR erhalten. Das große Plasmid-Fragment und die zwei Bla-Gen-Fragmente wurden alle durch Elektroporation in kompetente E. coli JC8679-Zellen eingeführt und die Transformanten auf verschiedenen Cefotaxim- Konzentrationen plattiert.
- Im dritten Verfahren wurden sowohl der Vektor als auch das Plasmid durch Elektroporation in E. coli JC8679-Zellen eingeführt und die Transformanten auf verschiedenen Cefotaxim-Konzentrationen plattiert.
- Im vierten Verfahren wurde das komplette Bla-Gen durch Elektroporation in E. coli JC8679-Zellen eingeführt, die bereits den Vektor pUCSfi-Sfi enthielten, und die Transformanten auf verschiedenen Cefotaxim-Konzentrationen plattiert. Als Kontrollen dienten die E. coli-JC8679-Zellen, in die entweder das vollständige Bla-Gen oder der Vektor alleine durch Elektroporation eingeführt wurde.
- Die Ergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Die Wirksamkeit der Insertion von zwei Fragmenten in den Vektor ist 100-mal niedriger als in dem Fall, wenn ein einziges Fragment mit dem vollständigen Bla-Gen verwendet wird. Das dritte Verfahren zeigte, dass die Wirksamkeit der Insertion vom Vorliegen freier DNA-Enden abhängt, da bei diesem Verfahren keine Rekombinanten erhalten wurden. Die Ergebnisse des dritten Verfahrens beruhten jedoch auch auf der geringen Wirksamkeit der Elektroporation des Vektors. Wenn der Expressionsvektor bereits in den kompetenten Zellen vorliegt, stellt die Wirksamkeit der Elektroporation des Vektors keinen Faktor mehr dar, und eine effiziente homologe Rekombination kann auch mit einem ungespaltenen Vektor erhalten werden.
- Um einen Vektor bereitzustellen, der einen optimierten Phänotyp verleihen kann (z. B. die maximale Expression einer Vektor-codierten Sequenz, z. B. eines klonierten Gens), wird ein Kit bereitgestellt, das verschiedene Kassetten umfasst, die einem Shuffling unterworfen werden können, und optimierte Suffilng-Produkte können selektiert werden. In Fig. 12 ist eine Ausführungsform schematisch dargestellt, wobei die jeweiligen Loci eine Vielzahl von Kassetten aufweisen. Z. B. zeigt Fig. 13 bei einem bakteriellen Expressionssystem Beispielkassetten, die an den entsprechenden Loci eingesetzt werden. Jede Kassette eines bestimmten Locus (z. B. alle Promotoren in diesem Beispiel) werden von im wesentlichen identischen Sequenzen flankiert, die in der Lage sind, die flankierende(n) Sequenz(en) von Kassetten eines benachbarten. Locus zu überlappen, und die vorzugsweise außerdem in der Lage sind, sich an einer homologen Rekombination oder an einer nicht-homologen Rekombination zu beteiligen (z. B. lox/cre- oder flp/frt-Systeme), so dass ein Shuffling von Kassetten innerhalb eines Locus, im wesentlichen jedoch nicht zwischen den Loci zugelassen wird.
- Die Kassetten werden in dem Kit als PCR-Fragmente geliefert, wobei jeder Kassettentyp oder jede einzelne Kassettenart in einem getrennten Röhrchen verpackt ist. Vektorbanken werden hergestellt, indem die Inhalte der Röhrchen kombiniert werden, so dass ganze Plasmide oder wesentliche Teile davon durch Hybridisierung der überlappenden flankierenden Sequenzen der Kassetten an jedem Locus mit den Kassetten am benachbarten Locus zusammengebaut werden. Der zusammengebaute Vektor wird mit einem festgelegten Gen von Interesse ligiert, wodurch eine Vektorbank hergestellt wird, in der jedes Mitglied der Bank das festgelegte Gen von Interesse und eine Kombination von Kassetten enthält, die durch die Assoziation der Kassetten bestimmt wird. Die Vektoren werden in eine geeignete Wirtszelle überführt und die Zellen unter Bedingungen gezüchtet, die für die Expression geeignet sind, und anschließend wird der gewünschte Phänotyp selektiert.
- Die folgenden Referenzen werden in dieser Anmeldung im entsprechenden Teil der Anmeldung zitiert.
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Claims (28)
1. Verfahren zur Entwicklung oder Evolution einer
Polynucleotidsequenz zur Aufnahme einer gewünschten
funktionellen Eigenschaft oder eines gewünschten Merkmals umfassend,
dass man
(1) eine Ausgangspopulation von Varianten der
Polynucleotidsequenz bereitstellt, die aus mindestens
ersten und zweiten Formen der Polynucleotidsequenz
besteht, wobei mindestens eine dieser Varianten in
einer zellfreien Form ist;
(2) die Varianten in einer Wirtszelle rekombiniert, um
eine Bibliothek rekombinanter Polynucleotide zu
schaffen;
(3) diese rekombinanten Polynucleotide screent oder
selektiert, um mindestens ein erstes rekombinantes
Polynucleotid aus dieser Bibliothek auf Basis der
Entwicklung hin zu der gewünschten Eigenschaft
oder der gewünschten Merkmal identifiziert;
(4) das selektierte rekombinante Polynucleotid/die
selektierten rekombinanten Polynucleotide in einer
Wirtszelle mit einer weiteren Form der
Polynucleotidsequenz rekombiniert, die einer Variante
dieser Ausgangspopulation gleichen kann oder davon
verschieden sein kann, um eine weitere Bibliothek
rekombinanter Polynucleotide zu schaffen;
(5) weitere rekombinante polynucleotide aus der
weiteren Bibliothek screent oder selektiert auf
Basis der weiteren Entwicklung hin zu der
gewünschten Eigenschaft oder dem gewünschten
Merkmal; und
(6) gegebenenfalls die Stufen (4) und (5), nach
Bedarf, wiederholt, um ein rakombinantes
Polynucleotid mit der gewünschten funktionellen
Eigenschaft oder dem gewünschten Merkmal zu erhalten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die
Polynucleotidsequenz ein Polypeptid codiert und die Selektionsstufen das
Screenen auf Polypeptide, die von den rekombinanten
Polynucleotiden codiert werden, die sich zu einer gewünschten
funktionellen Eigenschaft oder einem gewünschten Merkmal
entwickelt haben, umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die
Ausgangspopulation von Varianten durch Error-prone-POR-
Amplifikation dar Polynucleotidsequenz gebildet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die
Ausgangspopulation von Varianten gebildet wird, indem eine
mutagene Kassette in die Polynucleotidsequenz insertiert
wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die
Ausgangspopulation von Varianten allelische oder
Artvarianten einer Polynucleotidsequenz umfasst,
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiter
umfassend dass man Variantenformen des Polynucleotids in der
Ausgangsbibliothek fragmentiert, bevor die Varianten in
Wirtszellen eingeführt werden.
7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem eine
Zufallsfragmentierung von Variantenformen des Polynucleotids durchgeführt
wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin
mindestens eine Rekombinationsstufe umfasst, dass man in
einer Wirtszelle verschiedene Varianten der
Polynucleotidsequenz rekombiniert, wobei mindestens eine Variante oder
eine Untergruppe von Varianten in einem Vektor vorliegt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin
mindestens eine Rekombinationsstufe umfasst, dass man in
einer Wirtszelle eine erste Variante der
Polynucleotidsequenz in einem Wirtszellchromosom und eine zweite Variante
der Polynucleotidsequenz, die in einem linearen Fragment
oder einem Vektor vorhanden ist, rekombiniert.
10. Verfahren nach Anspruch 8, worin einige der
Ausgangspopulation von Variantenformen als Komponenten eines
Vektors, und einige der Ausgangspopulation von Variantenformen
nicht als Komponenten eines Vektors bereitgestellt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 8, worin jede der
Ausgangspopulation von Variantenformen eine Komponente eines Vektors
ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin der
oder jeder Vektor ein Plasmidvektor ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin der
oder jeder Vektor ein Phagenvektor ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, weiter
umfassend das Shuffling eines rekombinanten Polynucleotids mit
der gewünschten Eigenschaft oder dem gewünschten Merkmal mit
einem natürlich vorkommenden Polynucleotid, um Variationen
zwischen dem rekombinanten Polynucleotid und dem natürlich
vorkommenden Polynucleotid, die nicht zu der gewünschten
Eigenschaft oder dem gewünschten Merkmal des rekombinanten
Polynucleotids beitragen, zu eliminieren.
15. Verfahren nach Anspruch 2, wobei ein rekombinantes
Polynucleotid mit der gewünschten Eigenschaft oder dem
gewünschten Merkmal exprimiert wird, um ein gewünschtens
Polygeptid zu schaffen, und das gewünschte Polypeptid isoliert
wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Polypeptid ein
Enzym, ein virales Protein oder eine Antikörperkette ist.
17. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 15, wobei die
gewünschte Eigenschaft oder das gewünschte Merkmal die
Fähigkeit, an einen Rezeptor zu binden oder die Hindung an
einen Rezeptor zu verbessern, ist.
18. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 15, wobei die
gewünschte Eigenschaft oder das gewünschte Merkmal eine
verbesserte
Arzneimittelresistenz ist.
19. Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 15, wobei die
gewünschte Eigenschaft eine therapeutische Aktivität ist.
20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinanten
Polynucleotide auf ihre Eignung als Mittel für die
Gentherapie gescreent werden.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die rekombinanten
Polynucleotide auf ihre Eignung als Mittel für eine
antineoplastische Gentherapie gescreent werden.
22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die rekombinanten
Polynucleotide auf ihre Eignung als Mittel für die DNA-
Impfung gescreent werden.
23. Verfahren nach Anspruch 1 oder Ansprach 5, wobei die
Polynucleotidsequenz eine tierische Polynucleotidsequenz
ist.
24. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, wobei die
Polynucleotidsequenz eine pflanzliche Polynucleotidsequenz
ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, wobei die
Polynucleotidsequenz eine Hefepolynucleotidsequenz ist.
26. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, wobei die
Polynucleotidsequenz eine bakterielle Polynucleotidsequenz
ist.
27. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, wobei die
Polynucleotidsequenz eine virale Polynucleotidsequenz ist.
28. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein
Variantenpolynucleotid zu einem zweiten Polynucleotid wenigstens 80%
Sequenzidentität über die Länge des zweiten Polynucleotids
zeigt.
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