CN104487581B - 用于苯乙烯合成的酶和方法 - Google Patents

Abstract

本发明的主题技术一般性地涉及生物合成苯乙烯。本发明的主题技术的某些实施方案部分地基于如下认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯，其中反式‑肉桂酸(tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨酶(PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的酶的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物(例如葡萄糖)制备苯乙烯。

Description

用于苯乙烯合成的酶和方法

并入的序列表

本文提供并通过引用并入了一份纸质序列表以及一份计算机可读形式的序列表，所述序列表包含名为“32990-5_ST25.txt”的文件，该文件的大小(在MS–DOS中测得)为151,674字节。该序列表由SEQ ID NO：1-44组成。

背景技术

本发明的主题技术一般性地涉及用于生物合成苯乙烯的酶和方法。

苯乙烯(乙烯基苯)是化学式为C₈H₈的有机化合物。这种环烃是一种无色的、油状液体，其容易蒸发并且具有甜的类似橡胶的气味。在较高浓度下，苯乙烯发出不那么令人愉快的气味。苯乙烯是以苏合香树(Styrax platanifolius)命名的，可以从苏合香树提取汁液(一种安息香树脂)。在几个植物物种中自然存在低水平的苯乙烯。多种食物，例如水果、蔬菜、坚果、饮料和肉类也含有苯乙烯。

在工业上，苯乙烯是聚苯乙烯和几种共聚物的前体。乙烯基的存在使得苯乙烯可以聚合。每年大约生产150亿磅。美国的苯乙烯生产在20世纪40年代期间急剧增加，当时，以苯乙烯作为合成橡胶的原料非常流行。现今，商业上显著产品包括聚苯乙烯、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)、苯乙烯-丁二烯(SBR)橡胶、苯乙烯-丁二烯胶乳、SIS(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)、S-EB-S(苯乙烯-乙烯/丁烯-苯乙烯)、苯乙烯-二乙烯基苯(S-DVB)、苯乙烯-丙烯腈树脂(SAN)和不饱和聚酯。这些材料被用于橡胶、塑料、绝缘材料、玻璃纤维、管材、汽车和船部件、食品容器和地毯背衬。

工业量生产苯乙烯主要来自乙苯，乙苯是由苯与乙烯烷基化而大规模制备的。它是最重要的石油化工产品之一。有几种方法来生产苯乙烯。乙苯脱氢是最常用的生产方法。乙苯在气相中与其10-15倍体积的高温蒸汽混合，并经过一个固体催化剂床。绝大部分乙苯脱氢催化剂基于铁(III)氧化物，由百分之几的氧化钾或碳酸钾促进。蒸汽在这个反应中起到几个作用。它是用于对吸热反应提供动力的热源，并且它通过水汽变换反应消除了在所述氧化铁催化剂上形成焦炭的倾向。钾促进剂增强了这种除焦反应。所述蒸汽也稀释了反应物和产品，使化学平衡的位置向产品转移。一个典型的苯乙烯装置由两个或三个串联反应器组成，所述反应器在真空下运行，以提高转化率和选择性。对于两个反应器，典型的单程转化率是约65％；对于三个反应器，典型的单程转化率是70-75％。对苯乙烯的选择性是93-97％。主要副产物是苯和甲苯。因为苯乙烯和乙苯具有类似的沸点(分别为145和136℃)，它们的分离需要高大的蒸馏塔和高回流比(return/reflux ratio)。在其蒸馏温度，苯乙烯倾向于聚合。为了使这个问题最小化，早期苯乙烯装置添加了元素硫以抑制聚合反应。在20世纪70年代，开发了新的自由基抑制剂，这种新的自由基抑制剂由硝化的苯酚基缓凝剂组成。最近，已经开发了一些添加剂，它们对聚合显示出优良的抑制作用。

由于苯乙烯是用于许多化工产品的基本石油化工产品，所以，迫切需要替代的生产方法，特别是那些不需要化石燃料作为原料的方法。因此，尽管有可用于生产苯乙烯的方法，但是，对于有效并且不那么昂贵的制备苯乙烯单体的新方法存在持续需求。

发明内容

本发明的主题技术一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本发明主题技术的一些实施方案部分地基于如下的认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯，其中反式肉桂酸(tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨酶(PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的酶的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物(例如葡萄糖)制备苯乙烯。

在一个方面，本发明的主题技术涉及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(a)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(b)包含肉桂酸脱羧酶的第二域。

在某些实施方案中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一个示例性实施方案中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6，以及它们的功能性片段或变体。

在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一个示例性实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38，以及它们的功能性片段或变体。例如，所述肉桂酸脱羧酶可以包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36以及SEQID NO：38。

肉桂酸脱羧酶的功能性变体可以包含与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36以及SEQ ID NO：38中任一个有约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％，约99％或甚至100％一致性的氨基酸序列。可选地，或另外，肉桂酸脱羧酶的功能性变体可以包含：对应于SEQ ID NO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ IDNO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ ID NO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶可以包含一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位或它们的组合。例如，所述突变的肉桂酸脱羧酶可以包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第175、190、193位，以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶可以包含一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的选自如下一个位置的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位，以及它们的组合。例如，可以用另一种氨基酸残基取代在以下一个位置中的氨基酸残基：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。在另一个实例中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在以下一个位置的氨基酸残基的缺失、取代或添加：SEQ ID NO：8的第175、190、193位，以及它们的组合。

在一个实施方案中，本发明主题技术的融合蛋白还包含共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。本文所述的融合蛋白的连接体可以是一种肽连接体，例如一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。例如，肽连接体可以包括在表1中所示的那些。

本发明还提供了核酸、载体和宿主细胞，所述核酸编码本文所述的融合蛋白，所述载体包含编码所述融合蛋白的所述核酸，所述宿主细胞包含本文所述的载体。

在一个方面，本发明主题技术涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括(a)使宿主细胞与可发酵底物(优选碳底物或氮底物)接触，所述宿主细胞包含一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。所述方法还可以包括从所述细胞培养物中收获苯乙烯。本文所述的融合蛋白中的任何一种都可以被用于生产苯乙烯。

在一个方面，本发明主题技术涉及一种肉桂酸脱羧酶，所述肉桂酸脱羧酶包含：(a)SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36以及SEQID NO：38中的任一个；(b)与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、以及SEQ ID NO：38中任一个有约85％、约90％、约95％、约97％、约98％，约99％或甚至100％一致性的氨基酸序列，其条件是所述氨基酸序列不是SEQ ID NO：8；或者(c)：(a)或(b)的功能性片段。

在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶包含：对应于SEQ ID NO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ IDNO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ ID NO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

在某些实施方案中，所述肉桂酸脱羧酶包含下列中的任一个：SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、以及SEQ ID NO：38。

本发明的主题技术还涉及一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位，以及它们的组合。例如，所述突变的肉桂酸脱羧酶可以包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ IDNO：8的第175、190、193位以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的选自如下一个位置中的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位，以及它们的组合。在某些实施方案中，所述突变为取代。

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的以下一个位置中的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175、190、193位，以及它们的组合。

本发明还提供了编码本文所述的肉桂酸脱羧酶的核酸、包含本文所述的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞、以及包含本文所述的核酸的宿主细胞。

本发明的主题技术还涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿主细胞与可发酵底物(优选碳底物或氮底物)接触，所述宿主细胞包含(i)本文所述的苯丙氨酸解氨酶和(ii)本文所述的肉桂酸脱羧酶；以及(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

本发明的主题技术还涉及一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)如本文所述的重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b)如本文所述的重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及(c)如本文所述的重组表达的膜结合转运体。所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶可以被表达为两种单独的蛋白质，或者可以通过如本文所述的连接体共价连接。

在一个实施方案中，所述膜结合转运体是ATP结合盒转运体(ABC转运体)。例如，所述ABC转运体是一种细菌ABC转运体，例如源自Pseudomonas putida。优选地，所述ABC转运体是一种耐溶剂性外排泵，例如源自Pseudomonas putida S12的SrpABC泵。

本发明的主题技术还提供了一种用于筛选候选蛋白的突变的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种选自以下的底物：苯丙氨酸、反式肉桂酸、酪氨酸、香豆酸以及它们的组合；(b)将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件为使得突变的肉桂酸脱羧酶将所述底物转化成选自由苯乙烯、4-羟基苯乙烯以及它们的组合组成的组的产品；以及(c)将所述混合物暴露于包括聚合物树脂的检测材料之中，所述聚合物树脂吸收产物蒸气。在一个实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶能够以与野生型酶(例如FDC1)相当的或高于野生型酶的速率将反式肉桂酸转化为苯乙烯。在另一个实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶能够以与野生型酶相当的或高于野生型酶的速率将香豆酸转化为4-羟基苯乙烯。在某些实施方案中，所述候选蛋白包括包含突变的肉桂酸脱羧酶的融合蛋白。

在一个实施方案中，本发明的主题技术还涉及一种用于筛选候选蛋白的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种包含反式肉桂酸的底物样品；(b)将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件为使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化成苯乙烯；以及(c)将所述混合物暴露于包括聚合物树脂的检测材料之中，所述聚合物树脂吸收产物蒸气。

在某些实施方案中，所述检测材料还包括在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检测的标记物。例如，所述可检测的标记物可以是4-硝基苄基-吡啶。可以将所述检测材料附着于固体支持物。在某些实施方案中，所述聚合物树脂包含芳族官能团。

在某些实施方案中，可以通过分光光度法检测颜色的变化。例如，可以通过在约600nm波长下测量样品的吸收率来检测颜色的变化。

本文所述的筛选方法可以用于同时筛选多个候选蛋白。

本发明的主题技术还涉及一种分离重组生成的肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含一种核酸的细菌宿主，所述核酸编码肉桂酸脱羧酶，并可操作地连接至启动子序列；(b)在培养基中培养所述细菌宿主以在宿主细胞中表达所述肉桂酸脱羧酶，其中，在约10℃至约25℃的温度下培养所述宿主细胞；以及(c)将所述肉桂酸脱羧酶从所述宿主细胞分离，其中，在厌氧环境下进行所述分离。

在某些实施方案中，用于分离所述肉桂酸脱羧酶的一种或多种缓冲溶液包含还原剂，例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)、β-巯基乙醇以及它们的组合。

本发明的主题技术还涉及一种结晶肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供浓度为约1mg/ml至约50mg/ml的肉桂酸脱羧酶溶液；(b)将所述肉桂酸脱羧酶溶液与贮存溶液以约1:10至约10:1的体积比混合；以及(c)将所述肉桂酸脱羧酶溶液和贮存溶液的混合物保持在适合所述肉桂酸脱羧酶形成晶体的温度下。

本发明的主题技术还涉及一种肉桂酸脱羧酶的晶体，其中，所述肉桂酸脱羧酶处于与3-羟基肉桂酸的复合物之中。

本发明的主题技术还涉及一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿主细胞与一种可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：(i)苯丙氨酸解氨酶；以及(ii)肉桂酸脱羧酶；以及(b)在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯，其中，通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。

一种用于同时筛选苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；(b)在一定条件下将述融合蛋白和所述底物混合，所述条件为使得所述融合蛋白将所述底物转化成产物；以及(c)检测所述剩余底物的量、或所述产物的量、或它们的组合。在某些实施方案中，所述筛选包括检测所述底物的损失、或产物(例如反式肉桂酸、苯乙烯和苯乙烯的下游衍生物)的量。例如，所述筛选可以包括检测反式肉桂酸、或苯乙烯或它们的组合的量。

例如根据以下描述的多个方面阐明了本发明的主题技术。方便起见，将本发明主题技术的多方面的多个实施例描述为编号的分句(1、2、3等)。这些被作为例子而提供，并不限制本发明的主题技术。应该注意的是：可以将任意从属分句组合成任意组合，并放入至各自的独立分句，例如，第1分句或第17分句。能够以类似的方式表现其它分句。

1、一种融合蛋白，其包括：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及(iii)共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。

2、第1分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

3、第1分句或第2分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、以及它们的功能性片段或变体。

4、第1-3分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

5、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它们的功能性片段或变体。

6、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。

7、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85％一致性的氨基酸序列。

8、第5分句或第7分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性变体包含：对应于SEQ IDNO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ IDNO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

9、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置上的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

10、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置上的突变：SEQ ID NO：8的第175或190位。

11、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

12、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的取代：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

13、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。

14、第1-13分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体为一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。

15、第1-14分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体为一种基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。

16、第1-15分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述连接体包含如在SEQ IDNO：39-44的任一个中所列出的氨基酸序列。

17、一种编码第1-16分句所述的任一种融合蛋白的核酸。

18、一种包含第1-16分句所述的任一种融合蛋白的宿主细胞。

19、一种包含第17分句所述核酸的宿主细胞。

20、一种用于生产苯乙烯的方法，其包括：(a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；以及(iii)共价连接所述第一域和所述第二域的连接体；(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

21、第20分句所述的方法还包括从所述细胞培养物中收获苯乙烯。

22、第20分句或第21分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

23、第20-22分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6，以及它们的功能性片段或变体。

24、第20-23分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

25、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它们的功能性片段或变体。

26、第25分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。

27、第25分句所述的方法，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85％一致性的氨基酸序列。

28、第25分句或第27分句所述的方法，其中，所述功能性变体包含：对应于SEQ IDNO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ IDNO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

29、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

30、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第175或190位。

31、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

32、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的取代：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

33、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。

34、第20-33分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体为一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。

35、第20-34分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体为一种基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。

36、第20-35分句中任一分句所述的方法，其中，所述连接体包含如SEQ ID NO：39-44的任一个所列出的氨基酸序列。

37、一种肉桂酸脱羧酶，其包含：(i)SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的任意一个；(ii)与SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85％一致性的氨基酸序列，条件是所述氨基酸序列不是SEQ ID NO:8；或(iii)：(i)或(ii)的功能性片段。

38、第27分句所述的肉桂酸脱羧酶，其中，所述氨基酸序列包含：对应于SEQ IDNO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ IDNO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

39、第37分句或第38分句所述的肉桂酸脱羧酶，其包含SEQ ID NO：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的任意一个。

40、一种突变的肉桂酸脱羧酶，其包含对应下列一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

41、第40分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含对应于下列一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第175或190位。

42、一种突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO：8的下列一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

43、第42分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO：8的下列一个位置处的氨基酸残基的取代：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

44、第42分句所述的突变的肉桂酸脱羧酶，其包含在SEQ ID NO：8的下列一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。

45、一种编码第37-44分句所述的肉桂酸脱羧酶的核酸。

46、一种包含第37-44分句所述的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞。

47、一种包含第45分句所述是核酸的宿主细胞。

48、一种用于生产苯乙烯的方法，其包括：(a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：(i)苯丙氨酸解氨酶；以及(ii)第37-44分句中任一分句所述的肉桂酸脱羧酶；(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

49、第48分句所述的方法还包括从所述细胞培养物中收获苯乙烯。

50、第48分句或第49分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

51、第48-50分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、以及它们的功能性片段或变体。

52、一种宿主细胞，其包含：(i)重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(ii)重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及(iii)重组表达的ABC转运体。

53、第52分句所述的宿主细胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

54、第52或53分句所述的宿主细胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、以及它们的功能性片段或变体。

55、第52-54分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

56、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、以及它们的功能性片段或变体。

57、第56分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。

58、第56分句所述的宿主细胞，其中，所述功能性变体包含与SEQ ID NO：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一个有约85％一致性的氨基酸序列。

59、第56分句或第58分句所述的宿主细胞，其中，所述功能性变体包含：对应于SEQID NO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQID NO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

60、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

61、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

62、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于以下一个位置的氨基酸残基位置处的突变：SEQ ID NO：8的第175或190位。

63、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

64、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的取代：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440或441位。

65、第52-55分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶是一种突变的肉桂酸脱羧酶，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含在SEQ ID NO：8的如下一个位置处的氨基酸残基的缺失、取代或添加：第175或190位。

66、第52-65分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，通过一种连接体共价连接所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶。

67、第66分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体为一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。

68、第66分句或第67分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体为一种基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。

69、第66-68分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述连接体包含如在SEQ IDNO：39-44中所列出的氨基酸序列。

70、第52-69分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是一种细菌ABC转运体。

71、第52-70分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体源自Pseudomonas putida。

72、第52-71分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是一种耐溶剂性外排泵。

73、第52-72分句中任一分句所述的宿主细胞，其中，所述ABC转运体是源自Pseudomonas putida S12的SrpABC泵。

74、一种用于筛选候选蛋白的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含所述候选蛋白的蛋白质样品以及一种包含反式肉桂酸的底物样品；(b)将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件为使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化成苯乙烯；以及(c)将所述混合物暴露于检测材料之中，所述检测材料包括(i)吸收苯乙烯蒸气的聚合物树脂；以及(ii)一种在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检测的标记物；其中，所述检测材料指示所述候选蛋白具有肉桂酸脱羧酶活性。

75、第74分句所述的方法还包括将所述候选蛋白的活性与对照相比较。

76、第74分句或第75分句所述的方法，其中，将所述检测材料附着于固体支持物。

77、第74-76分句中任一分句所述的方法，所述聚合物树脂包含芳族官能团。

78、第74-77分句中任一分句所述的方法，其中，通过分光光度法检测所述颜色的变化。

79、第74-78分句中任一分句所述的方法，所述可检测的标记物是4-硝基苄基-吡啶。

80、第79分句所述的方法，其中，通过在约600nm波长下测量所述样品的吸收率来检测所述颜色的变化。

81、第74-80分句中任一分句所述的方法，其中，同时筛选多个候选蛋白。

82、一种分离重组生成的肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含一种核酸的细菌宿主，所述核酸编码肉桂酸脱羧酶并可操作地连接至启动子序列；(b)在培养基中培养所述细菌宿主以在所述宿主细胞中表达所述肉桂酸脱羧酶，其中，在约10℃至约25℃的温度下培养所述宿主细胞；以及(c)将所述肉桂酸脱羧酶从所述宿主细胞分离，其中，在厌氧环境下进行所述分离。

83、第82分句所述的方法，其中，用于分离所述肉桂酸脱羧酶的一种或多种缓冲液包含还原剂。

84、第83分句所述的方法，其中，所述还原剂为三(2-羧乙基)膦(TCEP)或β-巯基乙醇。

附图说明

图1A是酵母FDC1的预测结构的示意图。图1B示出了FDC1中四个可能的tCA结合位点(位点A-D)。图1C示出了酵母FDC1中预测的底物(tCA)结合位点。

图2A示出了37℃下FDC1在E.coli中的表达，使用了三种不同的缓冲液。重组生成的FDC1仅累积在不溶性颗粒部分(包涵体)。图2B示出了16℃下FDC1在E.coli中的表达。在上清液中检测可溶性FDC1。

图3示出了纯化的FDC1的SDS-PAGE分析。

图4示出了pH对FDC1活性的影响。酶在pH 6.5时表现出最大活性，并且被认为是具有100％的相对活性。x轴表示不同反应缓冲液的pH值。

图5示出了FDC1的pH稳定性。酶表现出良好的pH稳定性。当在反应前在pH 6.0时培育30分钟时，没有损失任何活性，并且被认为是具有100％的相对活性。x轴表示在酶促反应之前培育蛋白质30分钟时的pH值。

图6示出了温度对FDC1活性的影响。当在50℃下进行反应时，酶表现出最大活性，并且被认为是具有100％的相对活性。x轴表示进行酶促反应时的温度。

图7示出了FDC1的温度稳定性。在50℃时，酶表现出最大活性，并且当在反应前在50℃下培育30分钟时，没有损失任何活性(其被认为是具有100％的相对活性)。x轴表示在酶促反应前培育所述酶的温度。

图8示出了FDC1在50℃下经过不同时间段的温度稳定性。在反应前在50℃下培育30分钟后，酶表现出最大活性，并且被认为是具有100％的相对活性。x轴表示在酶促反应前在50℃时培育所述酶的时间段(以分钟计)。

图9示出了辅因子对FDC1活性的影响。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳摩尔苯乙烯。

图10A示出了金属离子对FDC1活性的影响。图10B示出了Zn²⁺和Fe³⁺对FDC1活性的影响。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳摩尔苯乙烯。

图11示出了FDC1的底物特异性。当反式肉桂酸作为底物时，酶表现出最大活性，并且被认为是具有100％的相对活性。

图12A和12B描绘FDC1的动力学分析。x轴表示使用不同浓度的底物的酶促反应。比活性表示为每分钟每毫克酶生成的纳摩尔苯乙烯。

图13描述了生成FDC突变体的随机诱变的过程，和FDC1突变体的高通量比色筛选。

图14示出了由FDC1突变体生产苯乙烯。Y轴表示通过FDC1突变体生产的苯乙烯的量。X轴表示FDC1突变体的改变的氨基酸。

图15显示FDC-PAL融合蛋白的活性。X轴示出了连接体的长度。

图16是FDC-PAL融合蛋白的预测结构的示意图。

图17示出了ABC转运体的共表达显著提高了苯乙烯的生产。

图18A示出了从葡萄糖生产苯乙烯和tCA。

图18B示出了由反式肉桂酸或苯丙氨酸生产苯乙烯。

图19示出了在培养管(左)的顶部或在96孔培养板(右)的顶部使用

树脂。

图20示出纯化的FDC1的SDS-PAGE分析。

图21A示出了FDC(K190E)的晶体结构的初始模型的典型电子密度图。

图21B示出了FDC(K190E)的晶体结构的不对称单元。

具体实施方案

A.综述

本发明的主题技术一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本发明主题技术的一些实施方案部分地基于如下的认识：苯丙氨酸可通过脱氨和脱羧这样的两步途径转化为苯乙烯，其中反式-肉桂酸(tCA)作为中间物。两种类型的酶直接参与了这一过程，苯丙氨酸解氨酶(PAL)将苯丙氨酸转化为tCA，而肉桂酸脱羧酶将tCA转化为苯乙烯。表达这两种类型的酶的宿主细胞可以在生物反应器中培养，以从可再生的底物(例如葡萄糖)制备苯乙烯。

特别地，已采用几种方法来提高苯乙烯的生物生产。例如，如本文描述和例举的那样，设计融合蛋白使其中苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶通过连接体共价连接。所述融合蛋白利用了“底物通道”现象。底物通道是指一种现象，其中底物被有效地在酶之间递送，而不需要与其它池的相同底物平衡。实际上，这导致相对于在所述细胞的其它区域中所发现的代谢物，局部池的代谢物的浓度高。因为苯丙氨酸解氨酶的产物(反式肉桂酸)被肉桂酸脱羧酶消耗，这两种酶之间的靠近(以融合蛋白的形式通过共价连接两种酶)将更有效地利用底物。因此，连接这两种酶的融合蛋白从底物通道现象获益，并能降低生产成本，增加在给定的时间段中发生的酶促反应的数量。可选地，也可以使用一种蛋白质复合物，其中，苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶通过非共价相互作用形成蛋白质复合物。

因此，在一个方面中，本发明的主题技术提供了一种融合蛋白，其包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域。本发明还提供了包含本文所述的融合蛋白的宿主细胞，以及使用所述融合蛋白生产苯乙烯的方法。

在另一个方面，已经设计了突变的肉桂酸脱羧酶文库，并对它们各自的活性进行了筛选。鉴定出了相对于野生型表现出更高催化活性的突变的肉桂酸脱羧酶。本文所述的一些突变的肉桂酸脱羧酶将苯乙烯生产增加了两到三倍。可以将这些突变的肉桂酸脱羧酶引入到宿主细胞，以促进苯乙烯的生物生产。

在另一个方面，高通量、比色筛选方法可以用于突变的肉桂酸脱羧酶或融合蛋白的大规模筛选。本文所述的比色筛选是高度可重复的，并且可以在一天内筛选约1000个突变的肉桂酸脱羧酶和融合蛋白。这可以提供涉及苯乙烯和相关化合物的生物合成的酶的快速和循环筛选，提供了一种重要的改善苯乙烯生物合成的方法。

因此，在另一个方面，本发明的主题技术提供了突变的肉桂酸脱羧酶、包含突变的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞、以及使用所述突变的肉桂酸脱羧酶生产苯乙烯的方法。本文还提供了突变的肉桂酸脱羧酶文库和筛选候选蛋白质的肉桂酸脱羧酶活性的方法。

限制生物生产苯乙烯的另一个问题是苯乙烯对宿主细胞的毒性。已知疏水芳香族化合物在胞质膜中的积累会破坏其完整性。为了降低苯乙烯的毒性并提高生产，将ABC转运体引入到宿主细胞-一种从细胞去除有机溶剂的外排泵。如本文所述和例举的那样，通过表达ABC转运体的E.coli细胞，苯乙烯的生产增强近四倍。

因此，在另一个方面，本发明的主题技术提供了一种宿主细胞，其包含：(a)重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b)重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及(c)重组表达的ABC转运体。本发明还提供了使用ABC转运体生产苯乙烯的方法。

B.定义

如本文所用的那样，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一种”、“一个”和“所述”包括复数形式。

术语“肉桂酸”和“桂酸”在说明书中是可互换使用的，并缩写为“CA”。反式肉桂酸缩写为tCA。

术语“肉桂酸脱羧酶”是指催化反式肉桂酸转化至苯乙烯的酶。该术语涵盖野生型或天然存在的肉桂酸脱羧酶，以及野生型肉桂酸脱羧酶的功能性片段或变体。本文所述的Saccharomyces cerevisiae肉桂酸脱羧酶也称为阿魏酸脱羧酶(FDC或FDC1)。阿魏酸也是苯基丙烯酸。

如本文所使用的术语“对照”指的是提供了一个比较基础的样品。例如，在确定肉桂酸脱羧酶活性的筛选测试中，“对照”可以是一种包含已被表征了活性的肉桂酸脱羧酶(例如，一种野生型肉桂酸脱羧酶、一种特定的突变的肉桂酸脱羧酶等)的平行样品。可选地，对照可以是一个预先确定的阈值，或一个存在于数据文库(例如，表格、电子数据文库、电子表格等)的值。

“对应于”一个参考位置的一个氨基酸位置是如通过比对所述氨基酸序列所鉴定的、与参考序列比对的位置。可以通过手工或通过使用诸如ClustalW2、Blast2等公知的序列比对程序进行这种比对。

当从蛋白分离自有机体，或使用有机体的蛋白信息修饰或产生(例如，化学合成的或重组产生)时，所述蛋白“源自”所述有机体。

术语“可检测的标记物”是指一种以有效地检测苯乙烯蒸气的量被添加(或涂覆)到苯乙烯吸收材料上的化合物。优选的可检测的标记物是在苯乙烯的存在下经受化学反应，并产生比色种的化合物。可检测的标记物的化学反应优选是浓度依赖的。

术语“可发酵碳底物”是指一种能够被如本文所述的宿主细胞代谢的碳源，具体地，选自由单糖、寡糖、多糖、单碳底物、以及它们的组合组成的组的碳源。

术语蛋白质的“功能性片段”是指一种肽片段，它是全长蛋白质的一部分，并且具有与全长蛋白质基本相同的生物活性，或者执行与全长蛋白质基本相同的功能(例如，进行相同的酶促反应)。例如，PAL的一种功能性片段可以催化苯丙氨酸转化成肉桂酸，而FDC的一种功能性片段可以催化肉桂酸转化成苯乙烯。

术语蛋白质的“功能性变体”是指参考蛋白质中一个或多个氨基酸残基已被改变而参考蛋白质的总体构象和功能未改变的蛋白质。功能性变体包括例如用具有类似性质(例如，极性、氢结合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等)的氨基酸的替换一个氨基酸。具有类似性质的氨基酸是现有技术中公知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水碱性氨基酸，并且可以互换。类似地，异亮氨酸(一种疏水氨基酸)可以被亮氨酸、蛋氨酸或缬氨酸替换。预期这样的变化对表观分子量或者蛋白质或多肽的等电点具有很少的影响或没有影响。

所有的语法形式和拼写变化的术语“同源的”是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或蛋白质之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或蛋白质以及来自不同种的同源的多核苷酸或蛋白质(Reeck等人，Cell 50：667，1987)。不管是就同一性百分比而言或者是就在保守位置的特定氨基酸或基序的存在而言，如它们的序列相似性所反映的那样，这样的多核苷酸或蛋白质具有序列同源性。例如，两种同源蛋白可以具有约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或甚至100％一致性的氨基酸序列。

在这个意义上，用于确定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域公知的。在一般情况下，“相似性”表示两种或多种多肽在适当的位置的确切的氨基酸对氨基酸比较，在所述适当的位置，各氨基酸相同或具有相似的化学和/或物理性质，例如电荷或疏水性。然后可以在相比较的多肽序列之间确定所谓的“百分比相似性”。用于确定核酸和氨基酸序列一致性的技术也是本领域公知的，包括确定基因的mRNA的核苷酸序列(通常通过cDNA中间体)以及确定其编码的氨基酸序列，以及将它与第二种氨基酸序列比较。在一般情况下，“一致性”是指两种多核苷酸或多肽序列的核苷酸对核苷酸或者氨基酸对氨基酸分别确切对应。可以通过测定“百分比一致性”来比较两种或多种多核苷酸序列，同样的也可以比较两种或多种氨基酸序列。第8版威斯康星序列分析包(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8)(在威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机组可用(Genetics Computer Group、Madison、Wis.))中可用的程序(例如，GAP程序)能够分别计算两种多核苷酸之间的一致性以及两种多肽序列之间的一致性和相似性。本领域技术人员已知用于计算序列之间的一致性或相似性的其它程序。

如本文所用的术语“突变”或“突变体”是指野生型序列的核苷酸或氨基酸残基的缺失、插入或取代。野生型序列是指在自然界中发现的最常见的序列，突变体就是针对它定义的。

术语“可操作地连接”是指在单一核酸片段上的核酸序列的联系，使得一个的功能受到另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子与那个编码序列可操作地连接(即，该编码序列处于启动子的转录控制下)。编码序列能够可操作地连接至正义方向或反义方向的调控序列。

术语“苯丙氨酸解氨酶”(缩写PAL)是指催化苯丙氨酸转化为反式肉桂酸的酶。该术语涵盖野生型或天然存在的苯丙氨酸解氨酶，以及野生型苯丙氨酸解氨酶的功能性片段或变体。

术语“突变的肉桂酸脱羧酶”是指催化反式肉桂酸转化为苯乙烯或催化香豆酸转化为4-羟基苯乙烯的酶。

术语“重组体”是指一种生物分子(例如，一种基因或蛋白)，所述生物分子(1)已从其天然存在的环境中取出，(2)与天然发现的基因的核苷酸序列的全部或部分不相关，(3)可操作地连接至其在自然界中未连接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界。术语“重组体”能够用于表示克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或由异源系统生物合成的多核苷酸类似物以及由这样的核酸编码的蛋白和/或mRNA。

除非特别声明，涉及单数形式的元素并不旨在表示“一种(个)且仅一种(个)”，而是“一种(个)或多种(个)”。阳性代词(例如，他的)包括阴性和中性(例如，她的和它的)，反之亦然。术语“一些”是指一种(个)或多种(个)。下划线的、斜体的和/或粗体的标题和副标题仅是出于方便使用，并不限制本发明的主题技术，并且与对于本发明主题技术描述的解释无关。那些本领域的普通技术人员已知或稍后知晓的贯穿本说明书所描述的各种构造要素的所有结构和功能等同物被明确地作为参考引入，并旨在由本发明的主题技术所涵盖。此外，本文所公开的内容无意奉献给公众，无论在上面的描述中是否明确记载这样的公开内容。

除非另有具体说明，两种多肽或多核苷酸序列的百分比一致性是指相同的氨基酸残基或核苷酸与两种序列中的较短的那种的整个长度的百分比。

C.苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶(EC 4.3.1.24；正式地，EC 4.3.1.5)是催化下述化学反应的一种酶：

通常用于这种酶的其它名称包括酪氨酸酶、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸解氨酶、L-酪氨酸解氨酶、苯丙氨酸氨-裂合酶(phenylalanine ammonium-lyase)、PAL和L-苯丙氨酸解氨酶。PAL是一种广泛分布于植物和酵母中的非哺乳动物的酶。

PAL的代表目录包括(由Genbank登录号和种类标明)：Q9ATN7 Agastache rugosa；093967Amanita muscaria(毒蝇伞)；P35510、P45724、P45725、Q9SS45、Q8RWP4Arabidopsisthaliana(鼠耳水芹)；Q6ST23Bambusa oldhamii(斑竹)；Q42609Bromheadiafinlaysoniana(兰花)；P45726Camellia sinensis(茶)；Q9MAX1Catharanthus roseus(长春花)(马达加斯加长春花)；Q9SMK9Cicer arietinum(鹰嘴豆)；Q9XFX5、Q9XFX6Citrusclementina x Citrus reticulate；Q42667Citrus Ziman(柠檬)；Q8H6V9、Q8H6W0Coffeacanephora(罗布斯塔(Robusta)咖啡)；Q852S1Daucus carota(胡萝卜)；O23924Digitalislanata(毛地黄)；O23865Daucus carota(胡萝卜)；P27991Glycine max(大豆)；O04058Helianthus annuus(普通向日葵)；P14166、(Q42858)Ipomoea batatas(甘薯)；Q8GZR8、Q8W2E4Lactuca sativa(菜园莴苣)；O49835、O49836Lithospermumerythrorhizon；P35511、P26600 Lycopersicon esculentum(番茄)；P35512Malusdomestica(苹果)(野生苹果)；Q94C45、Q94F89Manihot esculenta(树薯)(树薯)；P27990Medicago sativa(苜蓿)；P25872、P35513、P45733Nicotiana tabacum(普通烟草)；Q6T1C9Quercus suber(栓皮栎)；P14717、P53443、Q7M1Q5、Q84VE0、Q84VE0Oryza sativa(稻)；P45727Persea americana(鳄梨)；Q9AXI5Pharbitis nil(紫罗兰)(日本牵牛花)；P52777Pinus taeda(厚皮刺果松)；Q01861、Q04593Pisum sativum(豌豆)；P24481、P45728、P45729Petroselinum crispum(欧芹)(欧洲香芹)；Q84L12Phalaenopsis x Doritaenopsis杂交品种；P07218、P19142、P19143Phaseolus vulgaris(菜豆)(法国菜豆)；Q7XJC3、Q7XJC4Pinus pinaster(海岸松)；Q6UD65Populus balsamifera subsp.trichocarpa xPopulus deltoides；P45731、Q43052、O24266Populus kitakamiensis(山杨)；Q8H6V5、Q8H6V6Populus tremuloides(美洲山杨)；P45730Populus trichocarpa(西部香脂白杨)；O64963Prunus avium(樱桃)；Q94ENO Rehmannia glutinosa；P11544Rhodosporidiumtoruloides(酵母)(瘦弱红酵母)；P10248Rhodotorula rubra(酵母)(胶红酵母)；Q9M568、Q9M567Rubus idaeus(木莓)；P31425、P31426Solanum tuberosum(马铃薯)；Q6SPE8Stellaria longipes(长须银柴胡(Longstalk starwort))；P45732Stylosantheshumilis(矮笔花豆)；P45734Trifolium subterraneum(地三叶)；Q43210、Q43664Triticumaestivum(小麦)；Q96V77Ustilago maydis(黑粉菌)；P45735Vitis vinifera(葡萄)；以及Q8VXG7Zea mays(玉米)。

几种PAL的晶体结构也是已知的(由PDB登录号和种类标明)：1T6J(Rhodosporidium toruloides)；1T6P(Rhodosporidium toruloides)；1W27(Petroselinumcrispum)；1Y2M(Rhodosporidium toruloides)；2NYF(Nostoc punctiforme)；和3nz4(Taxus canadensis)。来自Rhodosporidium toruloides(也称作Rhodotorula glutinis)的PAL是一种同源四聚体，每个亚单元都具有“海马”形状，与其它两个亚单元头尾连锁，从而使相邻亚基的相互作用最大并得到一种紧密配合的四聚体。所述四聚体组装带来四个邻半胱氨酸(残基140、455、467和530)的集群，Cys467与Cys530的硫原子距离为3.62埃。PAL的主体结构具有不同长度的大致平行的α螺旋的中心核。β-片的仅一个部分长于三个残基(残基231-237和240-246的链)；它残留在导致活性位点的漏斗区域(funnel region)。MacDonald等人，苯丙氨酸解氨酶的现代观点(A modern view of phenylalanine ammonialyase)，生化细胞生物学(Biochem Cell Biol.)，2007；85(3)：273-82。

编码来自植物和微生物来源的PAL的基因或多核苷酸是本领域已知的。参见例如EP321488(R.toruloides)；WO 9811205(Eucalyptus grandis和Pinus radiate)；WO9732023(Petunia)；JP 05153978(Pisum sativum)；WO 9307279(马铃薯和稻)。可以从文献、公共数据库(例如，参见

登录号AJ010143和X75967)、或其它商业来源容易地确定各种PAL基因的序列。例如，可以从俄亥俄州立大学的拟南芥生物研究中心(Arabidopsis Biological Resource Center)(ABRC)购买保藏号分别为G10120(在pENTR223.l载体中)、G12256(在pENTR223.l载体中)和U24927(在pENTR/D-TOPO载体中)的Arabidopsis PAL1(At2g37040)、PAL2(At3g53260)和PAL4(At3g10340)的全长cDNA。

在某些实施方案中，本主题技术的苯丙氨酸解氨酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。其它优选来源的有机体包括：例如酵母(例如Rhodotorula、Rhodosporidium和Sporobolomyces)，细菌(例如Streptomyces)，以及植物(例如豌豆、马铃薯、稻、桉树、松树、玉米、矮牵牛、拟南芥、烟草和欧芹)。

本发明的主题技术还包括本文所描述的示例性PAL的同源物(包括直系同源物)、功能性片段或功能性变体。获得PAL的同源物和变体的方法是本领域众所周知的，包括例如序列依赖性规程。示例性的序列依赖性规程包括例如核酸杂交、DNA和RNA扩增(例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR))等。

例如，可以使用本领域技术人员所熟知的技术通过使用已知序列的所有或部分作为DNA杂交探针筛选来自任何期望的植物、真菌、酵母或细菌的文库来直接分离编码PAL同源物的基因。可以通过本领域中已知的方法(Maniatis，下文)设计并合成基于文献的核酸序列的具体的寡核苷酸探针。而且，可以直接使用整个序列通过本领域技术人员已知的方法(例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术)来合成DNA探针，或通过使用可用的体外转录体系来合成RNA探针。此外，可以设计具体的引物，并用于部分或全长的扩增靶序列。可以在扩增反应中直接标记所得的扩增产物，或在扩增反应后标记所得的扩增产物，并在合适的严格条件下将所得的扩增产物用作探针来分离全长cDNA或基因组片段。

此外，可以在聚合酶链式反应方案中使用文献序列的两种短片段来扩增编码来自DNA或RNA的同源基因的较长核酸片段。也可以在克隆的核酸片段文库上进行所述聚合酶链式反应，其中一种引物的序列源自文献序列，另一种引物的序列利用在编码细菌基因的mRNA前体的3'末端存在的多腺苷酸域。可选地，第二引物序列可以基于源自克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE方案(Frohman等人，PNAS USA85：8998(1988))通过使用PCR扩增在转录物中的单点和3'或5'端之间的区域的拷贝来生成cDNA。可以从文献序列设计定向于3'和5'方向的引物。使用商业可用的3'RACE或5'RACE体系，可以分离具体的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5673(1989)；Loh等人，Science243：217(1989))。

可以通过使用“查询序列”针对公众数据库进行搜索以确定其它家族成员或相关序列，从而进一步鉴定同源物或变体的核酸和蛋白质序列。

因此，在一个示例性实施方案中，本发明主题技术的苯丙氨酸解氨酶包括选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、以及它们的功能性片段或变体。SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6分别是拟南芥PAL1、PAL2和PAL4的氨基酸序列。PAL的变体可以包括那些包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、或它们的片段中的任一个有约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、或约98％，约99％、或甚至100％一致性的氨基酸序列的多肽序列。所述片段可以包含全长PAL的约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750个氨基酸残基。

在另一个示例性实施方案中，本发明主题技术的苯丙氨酸解氨酶包括由选自下组中的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、以及它们的片段或变体。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5分别是编码拟南芥PAL1、PAL2和PAL4的核苷酸序列。PAL编码序列的变体可以包括那些与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5、或它们的片段中的任一个有约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％，约99％、或甚至100％一致性的多核苷酸序列。所述片段可以包含全长PAL编码序列的约300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000或2100个核苷酸。

为了确定两种氨基酸序列或两种多核苷酸序列的百分比一致性，为最佳对比的目的，比对所述序列(例如，为与第二氨基酸或核酸序列进行最佳对比可以在第一氨基酸或核酸序列引入空位，并且，为对比的目的可以忽略非同源序列)。除非具体指出，否则比对时全局比对(即两个序列中的较短那个的整个长度上相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比)。如果期望的是局部比对，优选地，用于对比的比对序列的长度为两个序列中的较短那个的长度的约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％。

D.肉桂酸脱羧酶

肉桂酸脱羧酶是催化反式肉桂向苯乙烯转化的酶。

在某些实施方案中，本发明主题技术的肉桂酸脱羧酶源自选自下组的一种有机体：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。

1.FDC1和OHBA1

在一个示例性实施方案中，本发明主题技术的肉桂酸脱羧酶源自Saccharomycescerevisiae。本文所述的Saccharomyces cerevisiae肉桂酸脱羧酶也称为阿魏酸脱羧酶(FDC或FDC1)。在美国专利第5955137号和第6468566号中公开了FDC/FDC1的序列。

如本文所公开和举例说明的那样，来自Saccharomyces cerevisiae的全长肉桂酸脱羧酶包含503个氨基酸(SEQ ID NO：8)。图1A中示出了全长FDC1的计算机模型；图1B中示出了四种可能的tCA结合位点，其中位点C是最可能的位点。位点C的进一步分析表明底物结合涉及I173、A174、R175、V188、I189、K190(为图示的清楚而未示出)、I194、E280、M286、F291和F440(图1C)。编码FDC1的核苷酸序列示为SEQ ID NO：7。

动力学研究表明野生型FDC的Km为约688μM，V_max为约6.17nmol·mg^-1·min^-1。除了tCA，FDC1也结合至底物，所述底物包括阿魏酸、2-甲基肉桂酸和4-羟基肉桂酸。

另一个示例性肉桂酸脱羧酶是来自Aspergillus niger的3-辛异戊烯基-4-羟基苯甲酸乙酯羧基裂解酶(OHBA1；SEQ ID NO：10)。编码OHBA1的核苷酸序列示为SEQ ID NO：9。

本发明主题技术还包括本文所述的示例性肉桂酸脱羧酶的同源物(包括直系同源物)、功能性片段或功能性变体。可以使用上述方法来获得肉桂酸脱羧酶的同源物和变体。

例如，功能性变体可以是这样的序列：(i)与SEQ ID NO：8有约50％、约60％、约70％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或甚至100％一致性，(ii)包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个下列残基：对应于SEQ ID NO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基280位置的E、对应于SEQID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ ID NO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ IDNO：8的残基440位置的F；以及(i)和(ii)的组合。

可以通过比对靶序列与SEQ ID NO：8来确定“对应于”SEQ ID NO：8的特定位置的氨基酸残基。作为一个实例，下文示出了FDC1和OHBAl的比对(FDC1是查询序列(Query)；OHBAl是主题序列(sbjct)。

在示例性实施方案中，本发明主题技术的肉桂酸脱羧酶包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、以及它们的功能片段或变体。肉桂酸脱羧酶的变体可以包括那些包含与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10或它们的片段中的任一个有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或甚至100％一致性的氨基酸序列的多肽序列。所述片段可以包含全长肉桂酸脱羧酶的约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750个氨基酸残基。

在另一个示例性实施方案中，本发明主题技术的肉桂酸脱羧酶包含由选自下组中的多核苷酸序列编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、以及它们的片段或变体。肉桂酸脱羧酶编码序列的变体可以包括那些与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、或它们的片段中的任一个有约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或甚至100％一致性的多核苷酸序列。所述片段可以包含全长编码序列的约300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000或2100个核苷酸。

2.示例性FDC1突变

基于对酵母FDC1的结构分析，确定FDC1(SEQ ID NO：8)的残基155-156、159、162-164、172-175、187-196、226-227、280、285-287、291、326、331、360-361、395-396、398和440-441为潜在的诱变位点。因此，在另一个方面中，本发明主题技术提供了一种突变的肉桂酸脱羧酶，其中在对应于下列一个位置的氨基酸残基位置上引入突变：SEQ ID NO：8的第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位、以及它们的组合。所述突变可以是一种缺失、插入或取代突变。

在一个示例性实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于SEQ ID NO：8的残基190的氨基酸残基位置处的突变。优选地，用以下一个氨基酸替换对应于190的残基：E、C、D、V、N、L、H。在另一个示例性实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含对应于SEQ IDNO：8的残基175的氨基酸残基位置处的突变。优选地，用I替换对应于175的残基.

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶为突变的FDC1，其中，在SEQ ID NO：8中的下列一个位置中引入突变：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441位、以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶为突变的FDC1，其中，在SEQ ID NO：8中的下列一个位置中引入突变：第175、190、193位、以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶为突变的FDC1，其包含SEQ ID NO：8中的一个突变：K190E、K190C、K190H、K190P、K190L、K190R、K190D、K190V、K190S、K190N、R175I、H193P、以及它们的组合。

在某些实施方案中，所述突变的肉桂酸脱羧酶包含选自下列组的序列中的任一个：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、以及SEQ ID NO:38。

本发明主题技术的肉桂酸脱羧酶还可以包含本文所述突变的肉桂酸脱羧酶的功能性片段或变体。肉桂酸脱羧酶的变体可以包括那些包含与SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、以及它们的片段中任一个有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、或甚至100％一致性的氨基酸序列的多肽序列。所述片段可以包含全长肉桂酸脱羧酶的约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750个氨基酸残基。

可选地或另外地，所述变体可以包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、或至少10个下列残基：对应于SEQ ID NO：8的残基173位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基174位置的A、对应于SEQ ID NO：8的残基175位置的R、对应于SEQ ID NO：8的残基188位置的V、对应于SEQ ID NO：8的残基189位置的I、对应于SEQ ID NO：8的残基190位置的K、对应于SEQ ID NO：8的残基194位置的I、对应于SEQ IDNO：8的残基280位置的E、对应于SEQ ID NO：8的残基286位置的M、对应于SEQ ID NO：8的残基291位置的F、以及对应于SEQ ID NO：8的残基440位置的F。

本发明还提供了肉桂酸脱羧酶突变体文库。所述文库包含多种突变的肉桂酸脱羧酶。例如，所述文库可以包含代表在特定的目标位置的约15种、约16种、约17种、约18种、或约19种不同突变的肉桂酸脱羧酶突变体。例如，所述文库可以包含大约19种不同的突变体，其中FDC1(SEQ ID NO：8)的K190被其它19种氨基酸的每一种所替换。可选地，所述文库可以包含代表在不同位置的约5种、约6种、约7种、约8种、约9种、约10种、约11种、约12种、约13种、约14种、约15种、约16种、约17种、约18种、或约19种不同突变的肉桂酸脱羧酶突变体。例如，可以使用丙氨酸筛选来创建突变体文库，其中，在不同的位置处的氨基酸残基用丙氨酸替换。

可以通过改变编码氨基酸序列的核酸序列来产生氨基酸序列的改变。可以通过本领域已知的方法使用本说明书中对于特定序列的指导来制备编码突变的肉桂酸脱羧酶的核酸序列。这些方法包括但不限于通过定点(或寡核苷酸介导的)诱变(Coombs等人，Proteins(1998)，259-311，1版。编者：Angeletti，Ruth Hogue。出版商：Academic，圣迭戈，加利福尼亚州)；PCR诱变或易错PCR(Melnikov等人，Nucleic Acids Research，(1999年2月15日)第27卷，第4期，第1056页至1062页)；较早制备的核酸序列的盒式诱变；“基因改组”(美国专利第5,605,793号；美国专利第5811238号；美国专利第5830721号；以及美国专利第5837458号)；所有这些都是本领域中公知的技术。

可选地，可以使用商业可购买的材料来施行体内诱变，例如STRATAgene(STRATAgene，拉霍亚，加利福尼亚州，Greener和Callahan，策略7：32-34)(1994))的E.coliXL 1-Red菌株和Epicurian coli XL 1-Red突变菌株。这种菌株缺失三个主要的DNA修复途径(mutS、mutD和MutT)，得到比野生型高5000倍以上的突变率。

3.筛选方法

在另一个方面，本发明主题技术提供了一种用于筛选候选蛋白的肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种包含候选蛋白的蛋白质样品以及一种包含反式肉桂酸的底物样品；(b)将所述蛋白质样品和所述底物样品结合以形成混合物，并在一定条件下培育所述混合物，所述条件使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化成苯乙烯；以及(c)将所述混合物暴露于检测材料之中，所述检测材料包括(i)吸收苯乙烯蒸气的聚合物树脂；以及(ii)一种在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检测的标记物。所述检测材料的颜色变化指示出所述候选蛋白具有肉桂酸脱羧酶活性。

在筛选FDC突变体中，已经发展了高通量筛选测定。筛选大量的蛋白质文库是蛋白质分子进化的瓶颈。脱羧酶的功能特性经常依赖于分析手段，例如HPLC或LC-MS。尽管HPLC是高度敏感的，但它也是费时的、昂贵的，并且会产生废物，例如甲醇或乙腈，因此不适合高通量应用。

为了克服这些技术障碍，本发明的主题技术提供了一种基于分光的比色测定方法。首先，在使得肉桂酸脱羧酶将反式肉桂酸转化为苯乙烯的条件下培育候选蛋白和tCA。通常情况下，培育条件应使得肉桂酸脱羧酶表现出最佳酶活性(例如，在约10℃至约65℃、约25℃至约55℃、约35℃至约60℃、或约35℃至约55℃的温度下；在6-10之间、6-8之间、或5.5-7.5之间的pH下；在约1mM至约20mM的金属离子存在下；等等)。可以培育候选蛋白和tCA约30分钟、约1小时；约90分钟、约2小时、约2.5小时、约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约6小时、约7小时、或约8小时，以产生足够量的苯乙烯。

其次，将反应混合物暴露于检测材料之中，所述检测材料包括(i)吸收苯乙烯蒸气的聚合物树脂；以及(ii)一种在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检测的标记物。由于苯乙烯蒸发，可以将所述检测材料放置在所述反应混合物的顶部以吸收苯乙烯蒸气(实际上不浸入到反应混合物之中)。相应地，可以将所述检测材料附着至固体支撑物，并且可以在检测过程翻转以吸收苯乙烯蒸气。参见例如图19。

用于吸收苯乙烯蒸气的优选聚合物树脂包括例如反相疏水树脂，其具有烃或芳族官能团(例如，芳族苯环)，所述官能团可以与极性和非极性化合物结合。更优选地，所述疏水性树脂具有烃或芳族官能团，但不具有任何极性基团。反相疏水树脂的实例包括C18、C8、苯基、SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。

可用于吸收挥发性有机化合物(例如苯乙烯蒸气)的示例性聚合物树脂包括例如

聚合物树脂(Phenomenex)、Amberlite聚合物树脂(Sigma-Aldrich)、DOWEX^TM聚合物树脂或AMBERJET^TM聚合物树脂(陶氏化学公司)、Macronet^TM聚合物树脂、PuroSorb^TM聚合物树脂、或

树脂(PuroLite)等等。所述树脂的表面积和孔尺寸分布应该适于吸收挥发性有机化合物。因为聚合物树脂具有很少的官能团(通常是赋予表面其吸附特性的单一主导官能团)，所以，可以基于热力学确定亲和力(例如，汉森溶解度参数)并预测吸附能力。各种研究已经显示：多种溶质以及聚合物树脂的吸附能力可以与溶解度参数相关。

其它适合吸收苯乙烯蒸气的材料包括活性炭和纤维素材料。例如，US 2002/0151622中公开的棉毛刺(burr)作为纤维素材料可以用于本发明中来吸收挥发性有机化合物。

所述检测材料还包括在苯乙烯的存在下导致颜色变化的可检测的标记物。一种示例性可检测的标记物为4-硝基苄基-吡啶(NBP)。NBP的不成对电子与苯乙烯氧化物的环氧乙烷环反应得到了蓝色的生色团。

如果需要的话，可以通过定量测定法(例如通过分光光度法)测定可检测材料的颜色变化。也可以定性确定所述颜色的变化。有时，对于观察者，颜色变化是显而易见的。

如果需要的话，可以将候选蛋白质的活性与对照相比。对照可以是一种包含已表征了活性的肉桂酸脱羧酶(例如，野生型肉桂酸脱羧酶，或一种具体的突变的肉桂酸脱羧酶，其为进一步的突变提供基础序列)的平行样品。可选地，对照可以是一个预先确定的阈值，或数据库中存在的一个值(例如，表、电子数据库、电子表格等)。

如在图13中所示，可以进行一轮以上的筛选试验，并且可以与计算机建模结合来合理地设计和改进肉桂酸脱羧酶的活性。

在某些实施方案中，可以通过本文描述的方法筛选能够将反式-肉桂酸转化为苯乙烯或将香豆酸转化为4-羟基苯乙烯的突变的肉桂酸脱羧酶。在某些实施方案中，被筛选的候选蛋白可以是包含突变的肉桂酸脱羧酶的融合蛋白。

4.肉桂酸脱羧酶的重组生产和纯化

在另一个方面，本发明的主题技术还提供了一种重组生产和纯化肉桂酸脱羧酶(例如FDC)的方法。特别地，本发明的主题技术提供了一种分离重组生产的肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(i)提供一种包含一种核酸的细菌宿主，所述核酸编码肉桂酸脱羧酶，并可操作地连接至启动子序列；(ii)在培养基中培养所述细菌宿主以在宿主细胞中表达所述肉桂酸脱羧酶，其中，在约10℃至约25℃的温度下培养所述宿主细胞；以及(iii)将所述肉桂酸脱羧酶从所述宿主细胞分离，其中，在厌氧环境下进行所述分离。

在一些实施方案中，在较低温度下培养细菌宿主细胞(例如，E.coli)可以显著促进重组生产的肉桂酸脱羧酶(例如FDC1)的正确折叠。降低培养温度也有利于将聚集的或错误折叠的蛋白转化为功能上可溶的形式。在某些实施方案中，细胞培养物在约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25℃的温度下成长。

也可以将还原剂(例如三(2-羧乙基)膦(TCEP)或β-巯基乙醇)用在重组生产肉桂酸脱羧酶(例如FDC1)的方法中。因此，用于分离所述肉桂酸脱羧酶的一种或多种缓冲溶液可以包含还原剂，例如浓度为约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或100mM的TCEP；或者，浓度为约5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM或100mM的β-巯基乙醇；以及它们的组合。

保持在厌氧环境中的含有所述重组肉桂酸脱羧酶(例如FDC1)的样品和细胞提取物也含有肉桂酸脱羧酶活性。

重组生产的肉桂酸脱羧酶(例如FDC1)在金属离子存在下保持肉桂酸脱羧酶活性。合适的金属离子包括例如钙、锌、镁、铁、锰离子、或它们的组合。所述金属离子可以以以下浓度存在：约0.1mM至约100mM，例如约0.1mM、约0.2mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM；约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约25mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM至约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM或约1mM至约10mM。优选地，金属离子为碱土金属离子或过渡金属离子。

本文所述的纯化的肉桂酸脱羧酶适合结晶。

5.制备结晶形式的肉桂酸脱羧酶

为了深入了解肉桂酸脱羧酶的结构，开发了一种结晶这种蛋白质的方法。传统上，使用悬滴和座滴蒸气扩散方法来结晶。这两种方法都需要封闭的系统，也就是说，必须使用气密性容器或在玻璃表面之间使用高真空润滑脂将所述系统从外界密封。

本发明的主题技术提供了一种结晶肉桂酸脱羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供浓度为约1mg/ml至约50mg/ml的肉桂酸脱羧酶溶液；(b)将所述肉桂酸脱羧酶溶液与贮存溶液以约1:10至约10:1的体积比混合；以及(c)将步骤(b)的混合物保持在适合所述肉桂酸脱羧酶形成晶体的温度下。

优选地，步骤(a)中的蛋白质浓度是约2mg/ml至约20mg/ml，更优选约5mg/ml至约10mg/ml。肉桂酸脱羧酶溶液与贮存溶液的体积比优选为约1:5至约5:1，更优选为约1:2至约2:1。通常情况下，1至2μl的肉桂酸脱羧酶溶液(蛋白浓度为约5.0至10.0mg/ml)与1至2μl的贮存溶液在玻璃上以液滴混合。将所述混合物倒置放置在一个孔上，其含有所述贮存溶液(通常为约500μl)，并将所述体系在约1℃至约20℃、优选约4℃至约12℃的温度下培育。最初，蛋白质溶液的液滴含有沉淀剂的浓度不足以结晶，但随着水分从液滴蒸发并转移到贮存溶液中，沉淀剂的浓度增加至结晶的水平。由于所述所述体系处于平衡，保持这些条件直到结晶完成。

当蛋白质形成具有小分子的复合物时可以改善肉桂酸脱羧酶的结晶。例如，可以将小分子在步骤(a)添加至所述蛋白质溶液或在步骤(b)添加至所述蛋白质/贮存混合物以使得形成蛋白质-小分子复合物。典型地，步骤(b)的混合物中的小分子的最终浓度为约0.01％(w/v)至约1％(w/v)，优选约0.05％(w/v)至约0.5％(w/v)，更优选约0.08％(w/v)至约0.2％(w/v)。

合适的小分子包括肉桂酸脱羧酶和它的类似物的以下底物(例如反式-肉桂酸)：例如3-羟基肉桂酸、阿魏酸、2-甲基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、2,5-二甲氧基肉桂酸、以及它们的组合。

可以通过将一种或多种添加剂包括在溶液中来进一步改善结晶方法，所述添加剂例如浓度为约0.001M至约0.1M、优选约0.005M至约0.02M的MnCl₂；浓度为约0.1％(w/v)至约2.5％(w/v)、优选约0.25％(w/v)至约1％(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮K15；浓度为约0.02M至约1M、优选约0.1M至约0.3M的非洗涤剂磺基甜菜碱201(NDSB-201，C₈H₁₁NO₃S)；浓度为约0.2％(w/v)至约10％(w/v)、优选约1％(w/v)至约3％(w/v)的苯甲脒盐酸盐；在步骤(b)的蛋白质-贮存溶液混合物中测定所有浓度。

E.融合蛋白和蛋白质复合物

在另一个方面，本发明的主题技术提供了一种融合蛋白，其包含：(a)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(b)包含肉桂酸脱羧酶的第二域。可选地，苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶可以通过(多个)非共价相互作用形成一种蛋白质复合物。

本文所述的融合蛋白或蛋白质复合物利用了“底物通道”现象。底物通道是指一种现象，其中底物被有效地在酶之间递送，而不需要与其它池的相同底物平衡。所述融合蛋白或蛋白质复合物可以在顺序酶之间传导中间体，并控制底物流进入所述途径的竞争分支之中。实际上，这导致相对于在所述细胞的其它区域中所发现的代谢物，局部池的代谢物的浓度高。

可以使用本文所述的苯丙氨酸解氨酶或肉桂酸脱羧酶的任何一种来生产融合蛋白。在某些实施方案中，所述融合蛋白还包含共价连接第一域(PAL)和第二域(肉桂酸脱羧酶)的连接体。所述连接体优选包含一种或多种氨基酸残基(例如，氨基酸连接体或肽连接体)。所述连接体的氨基酸残基可以包含(多种)L-氨基酸、(多种)D-氨基酸、氨基酸类似物、或它们的组合。其它可能的连接体包括例如共价键、C1-C6烷基、环烷基(例如环戊基或环己基)、环烯基、芳基、或杂芳基部分。连接体还可以包含一种或多种氨基酸与另一种连接部分(例如C1-C6烷基、环烷基(C5、C6)、芳基、或杂芳基部分)的组合。

在某些实施方案中，所述连接体是肽连接体。所述肽连接体可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40个氨基酸长。优选地，所述连接体的长度为2至15个氨基酸。

在某些实施方案中，所述连接体是甘氨酸/丝氨酸连接体，即基本上由甘氨酸和丝氨酸组成的肽连接体。在一个示例性实施方案中，所述连接体包含GS或GSG。在另一个示例性实施方案中，所述连接体包含Gly-Ser-Gly(GSG)基序，例如如下表1所述的GGSG(SEQ IDNO:39)、(GS)×3(SEQ ID NO:40)、(GGSG)×2(SEQ ID NO:41)、SGGSGGSGG(SEQ ID NO:42)、GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:43)、(GGGGS)×3(SEQ ID NO:44)。

表1.甘氨酸/丝氨酸连接体

连接体	氨基酸序列
		GS连接体	GS
GSG连接体	GSG
		SEQ ID NO:39	GGSG
SEQ ID NO:40	GSGSGS
		SEQ ID NO:41	GGSGGGSG
SEQ ID NO:42	SGGSGGSGG
		SEQ ID NO:43	GGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO:44	GGGGSGGGGSGGGGS

可以使用本领域中公知的技术来生产本文所述的融合蛋白。例如，当所述连接体是肽连接体时，可以使用标准的重组DNA技术来生产所述融合蛋白。其它类型的连接体可以通过例如标准的缀合技术来附加。参见例如Hermanson等人，Bioconjugate Techniques，2nd Ed.，2008；Academic Press。

所述融合蛋白可以包含多个单元的苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶。在某些实施方案中，所述融合蛋白可以是PAL-FDC、PAL-FDC-PAL-FDC或PAL-FDC-FDC-PAL等等。例如，所述FDC可以在编码所述融合蛋白的DNA的5'末端，所述PAL可以在编码所述融合蛋白的DNA的3'末端。在另一个实施例中，所述PAL可以在编码所述融合蛋白的DNA的5'末端，所述FDC可以在编码所述融合蛋白的DNA的3'末端。此外，所述融合蛋白的肉桂酸脱羧酶单元可以是野生型(WT)或突变的蛋白质，例如任意上述突变的FDC蛋白质。例如，所述融合蛋白可以是PAL-FDC(WT)或PAL-FDC(K190E)。

可选地或另外地，所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶可以通过(多个)非共价相互作用形成一种蛋白质复合物。一种“蛋白质复合物”是指多于一种蛋白质的联合。可以通过例如功能性的、立体化学的、构象的、生化的或静电的联合来联合所述复合物的蛋白质。其意图是：此术语涵盖任何数量的蛋白质的联合。

可选择地，或另外地，可以将所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶修饰成包括“相互作用部分”。例如，一种酶可以包含一种抗体，而另一种可以包含相关抗原；或一种酶可以包含配体，而另一种可以包含相关受体；或一种酶可以包含生物素，而另一种可以包含抗生物素蛋白，等等。所述相互作用部分可以彼此相互作用，从而使所述两种酶彼此接近。可以使用任何相互作用部分对。

F.宿主细胞和细胞培养

本文所述方法使用宿主细胞来生产苯乙烯。所述宿主细胞可以源自细菌、真菌(例如酵母)、原生生物(例如藻类)、植物、昆虫、两栖动物、鱼类、爬行动物、鸟类、哺乳动物(包括人类)，或者所述宿主细胞可以是杂交瘤细胞。宿主细胞可以是未经修饰的细胞或细胞系、或已被基因修饰的细胞系(例如，以促进生产苯乙烯)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是已被修饰以使得在期望的条件下(例如在较低的温度下)生长的细胞系。

如本文所述的那样，可以培养表达苯丙氨酸解氨酶或肉桂酸脱羧酶的合适的宿主细胞，有时以大规模(即约1升、10升、至少100升等)来生产商业上有用量的苯乙烯或其它苯乙烯下游的化合物(在这些微生物中将通过酶促或生物途径进一步处理苯乙烯得到的化合物)。

本文所述的方法可以应用于任何尺寸的细胞培养瓶和/或生物反应器。例如，可以在1L、10L、30L、50L、100L、150L、200L、300L、500L、1000L、2000L、3000L、4000L、5000L、10,000L或更大的生物反应器或细胞培养物中应用所述方法。

可以将所述液体培养基的pH保持恒定(也就是说在培养期间控制)或者不保持。培养物可以分批、半批或连续地生长。可以在发酵开始时提供养分，或半连续或连续地加入。

培养基成分包括例如缓冲剂、氨基酸、维生素、盐、矿物质、血清、碳源、脂质、核酸、激素、微量元素、氨、辅因子、指示剂、小分子、水解物和酶调节物。

所使用的培养基必须适当地满足所涉及的菌株的要求。可以在美国细菌学会的教科书“一般细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)”(美国华盛顿特区，1981；在此通过引用将其全部并入本文)中找到用于各种微生物的培养基的描述。可以根据本发明的主题技术采用的这些培养基通常可以包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。

所述宿主细胞的培养基中所使用的碳源包括糖，例如单糖、二糖或多糖。碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可以通过复杂化合物(例如糖蜜或其它制糖副产物)将糖加入到培养基。加入多种碳源的混合物也可以是有利的。其它可能的碳源是油和脂肪(例如，如大豆油、葵花籽油、花生油和/或椰子脂)、脂肪酸(例如，如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸)、醇和/或多元醇(例如，如甘油、甲醇和/或乙醇)和/或有机酸(例如，如乙酸和/或乳酸)。

氮源通常是有机或无机氮化合物或包括这些化合物的材料。氮源的实例包括液态或气态形式的氨或铵盐(例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源(例如玉米浆、豆渣、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等)。氮源可以单独或作为混合物使用。

在一个实施方案中，存在于所述培养基中的无机盐化合物包括约一种钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜或铁的氯化物、磷化物和硫酸盐。

可以将无机含硫化合物(例如，如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物)、或其它有机硫化合物(例如硫醇和巯基)用作生产苯乙烯的含硫衍生物的硫的来源。

可以将磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐用作磷源。

可以加入到培养基中以保持溶液中的金属离子的其它组分包括二羟基酚(例如儿茶酚或原儿茶酸)和有机酸(例如柠檬酸)。

所述培养基可以包含一种或多种金属离子，例如钙、锌、镁、铁、锰离子、以及它们的组合。所述金属离子的浓度可以为约0.1mM至约100mM，例如约0.1mM、约0.2mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM；约0.1mM至约50mM、约0.1mM至约25mM、约0.1mM至约20mM、约0.1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM到约25mM、约1mM至约20mM、约1mM至约15mM、或约1mM至约10mM。优选地，所述金属离子为碱土金属离子或过渡金属离子。

用于培养本发明主题技术的宿主细胞的根据本发明主题技术所使用的发酵培养基通常还包含其它生长因子(例如维生素)或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常源自复杂的培养基组分(例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等)。此外，也可以将合适的前体添加到培养基中。所述培养基化合物的确切组成在很大程度上取决于特定的实验，并由每种特定情况单独决定。培养基的信息可以在教科书“Applied Microbial.Physiology,A Practical Approach”(编辑：P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)第53-73页，在此通过引用将其全部并入本文)中找到。也可从商业供应商获得生长培养基，例如Standard1(Merck)或者BHI(脑心浸液，DIFCO)，等等。

通过加热(在1.5巴和121℃下加热20分钟)或通过过滤消毒对所有培养基组分进行灭菌。所述组分可以一起灭菌，或者如果需要的话分别灭菌。可以按所需在培养开始时即存在所有的培养基组分，或者连续或分批加入所有的培养基组分。

主要根据如下温度范围选择细胞培养基的温度：在该温度范围内，细胞培养基保持存活，生产高水平的多肽，减少多肽的错误折叠和/或聚集，所述多肽显示出更广泛的或者更理想的翻译后修饰(例如糖基化，磷酸化等)，或者这些因素的任意组合物，或者实践者认为重要的其它因素。在一般情况下，大多数的宿主细胞在约15℃至45℃的范围内生长良好，并可以生产高水平的蛋白或多肽。在某些实施方案中，在细胞培养过程中，细胞培养基在约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃的温度下以一倍或多倍生长。根据细胞的需要和生产的要求，本领域的普通技术人员将能够选择合适的细胞生长温度。

此外，所述培养基可以在培养过程中经受一次或多次温度变化。当改变培养基温度时，所述温度变化可以相对平缓。例如，可以用几个小时或几天来完成温度变化。可选地，温度变化可以是相对突然。可以在培养过程中稳定地增加或降低温度。另外地或可选地，在培养过程中，可以在不同时间点通过不连续的量来增加或降低温度。随后的(多个)温度或(多个)温度范围可以低于或高于初始或先前的(多个)温度或(多个)温度范围。本领域的普通技术人员将理解：本发明主题技术涵盖多个温度变化。例如，可以变换一次温度(变换到更高或更低的温度或温度范围)，在该温度或温度范围中保持所述细胞一段时间，在此之后，可以再次将温度改变至一个新的温度或温度范围，这个温度或温度范围可以高于或低于前面的温度或温度范围。每次不连续的变化之后，培养基的温度可以是恒定的或者可以保持在一定的温度范围之内。

对于初始温度或温度范围，温度变化后的细胞培养基的温度或温度范围通常主要基于下列来选择：在此(多个)温度下，细胞培养基保持存活，在此温度范围内，生产高水平的蛋白质。例如，细菌细胞培养基在接种后可以在37℃下生长，以鼓励细胞增殖；一旦细胞达到所希望的密度，重组蛋白质的表达被诱导，将温度变化至25℃以减少重组产生的蛋白的错误折叠或者聚集。

也可以考虑厌氧条件。示例性的厌氧细菌宿主包括例如类菌体、梭杆菌属、梭菌属、丙酸杆菌属、乳酸杆菌属、消化球菌属、消化链球菌属和韦荣球菌属。

如果需要的话，在宿主细胞中产生的苯乙烯可以进一步进行酶促反应并转化为苯乙烯的下游衍生物，例如甲苯、二甲苯、聚苯乙烯、ABS、苯乙烯-丁二烯(SBR)橡胶、苯乙烯-丁二烯胶乳、SIS(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)、S-EB-S(苯乙烯-乙烯/丁烯-苯乙烯)、苯乙烯-二乙烯基苯(S-DVB)、苯乙烯-丙烯腈树脂(SAN)和不饱和聚酯等等。因此，在一些实施方案中，本发明主题技术的宿主细胞可以将一定百分比的生成的苯乙烯转换为苯乙烯的下游衍生物。例如，所述宿主细胞可以将5％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约5％至约15％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约10％至约25％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约20％至约35％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约30％至约45％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约40％至约55％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约50％至约65％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约60％至约75％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约70％至约85％的苯乙烯转换为下游衍生物，或将约80％至约95％的苯乙烯转换为下游衍生物。

1.微生物宿主

用于生产苯乙烯的微生物可以包括细菌，例如肠道细菌(例如大肠杆菌和沙门氏菌)、杆菌、不动杆菌属、放线菌(例如链霉菌属)、棒状杆菌属、甲烷氧化菌(例如甲基弯曲菌)、甲基单胞菌、红球菌、假单胞菌、蓝藻(例如Rhodobacter和集胞藻属)、克雷伯氏菌属、泛菌属、棒状杆菌属、梭菌属等；酵母，例如酵母属、结合酵母属、克鲁维酵母、念珠菌、汉逊酵母、德巴利酵母、毛霉属、毕赤酵母和球拟酵母；丝状真菌，例如曲霉、节丛孢菌；藻类等。

尽管任何上述微生物都可以用于生产苯乙烯，优选过量生产苯丙氨酸的突变体菌株。“苯丙氨酸过量生产”菌株是指与不具有突变的野生型菌株相比生产更高水平的苯丙氨酸的突变体微生物菌株。苯丙氨酸天然地存在于微生物之中。然而，对于最佳的苯乙烯合成，宿主细胞优选过量生产苯丙氨酸，使得底物水平不限制宿主细胞生产苯乙烯。在微生物中增加芳族氨基酸合成的方法是本领域已知的。

E.coli苯丙氨酸过量生产者的一个具体实例是E.coli菌株NST74(美国专利第4681852号)。其它合适的苯丙氨酸过量生产菌株包括例如Corynebacterium glutamicum(Ikeda,M.和Katsumata,R。Metabolic engineering to produce tyrosine orphenylalanine in a tryptophan-producing Corynebacterium glutamicum strain,Appl.Environ.Microbial.(1992)，58(3)，第781-785页)；嗜氨小杆菌ATCC 10155；Corynebactrium lillium NRRL-B-2243；散枝短杆菌NRRL-B-2311；柠檬节杆菌ATCC11624。其它合适的苯丙氨酸过量生产菌株可以在下列中找到：例如Maiti等人，同上以及Metabolic Engineering For Microbial Production Of Aromatic Amino Acids AndDerived Compounds,J.Bongaertes et al,Metabolic Engineering第3卷，289-300，2001。

也可以选择对芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸)的毒性类似物具有增加的抗性的宿主细胞。例如，可以选择对苯丙氨酸的毒性(间-氟-)类似物具有抗性的突变的微生物。这些不敏感突变体往往会产生高水平的苯丙氨酸和酪氨酸(GB 1071935；美国专利第3709785号)。

也可以通过在苯丙氨酸的生物合成中的一种或多种关键基因的过度表达来得到具有提高的苯丙氨酸生产的重组宿主细胞(Ikeda 2003.Amino acid productionprocesses.P.1-35.，T.Scheper(Ed.),Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Vol.79.Springer-Verlag,Berlin Heidelberg)。

可以使用一套标准重组DNA方法来获得编码本文所述的蛋白质(例如，苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸脱羧酶或融合蛋白)的核酸，将所述核酸合并至表达载体，并将所述载体引入宿主细胞，例如那些在下列中所描述的：Sambrook等人(编辑)，Molecular Cloning；ALaboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor，(2001)；Ausubel,F.M.等人(编辑)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1995)。可以将编码蛋白质的核酸插入到一种表达载体或多种表达载体之中，使得所述核酸可操作地连接至转录和翻译控制序列(例如启动子序列、转录终止序列，等等)。通常选择与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。

可以通过密码子优化来进一步改善本文所述的微生物宿主中的蛋白质的表达。例如，用一个更常见的密码子修改一个不太常见的密码子可以影响mRNA的半衰期，或通过引入干扰所述信息翻译的二级结构来改变其结构。可以优化全部编码区或编码区的一部分。在一些情况中，通过优化基本上整个基因来实现所需的表达的调节。在其它情况中，通过优化所述基因的部分序列但不是完整序列来实现所需的调节。

可以调整任何编码序列的密码子利用率以得到期望的特性，例如在一种特定细胞类型中的高水平的表达。这种优化的起点可以是具有100％常见密码子的编码序列，或者包含常见和非常见密码子的混合物的编码序列。

可以生成并测试密码子利用率不同的两个或更多个候选序列以确定它们是否具有所期望的性质。可以通过使用计算机来搜索调控元件(例如沉默子或增强子)的存在并搜索可以通过改变密码子利用率而被转化为这种调控元件的编码序列的区域的存在，对候选序列进行评估。额外的标准可以包括特定核苷酸(例如A、C、G或U)的富集、特定氨基酸的密码子偏好、或存在或不存在特定mRNA二级或三级结构。可以基于若干这样的标准来调整候选序列。

在某些实施方案中，密码子优化的核酸序列表达蛋白质的水平是由密码子未优化的核酸序列所表达的蛋白质水平的约110％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％或约500％。

除了编码蛋白的核酸，所述表达载体可另外携带控制宿主细胞中的蛋白质表达的调控序列，例如启动子、增强子或控制(多个)核酸的转录或翻译的其它表达控制元件。这样的调控序列是本领域已知的(参见例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology 185,Academic Press(1990))。本领域技术人员会理解：表达载体的设计(包括调控序列的选择)可以取决于如将被转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等这样的因素。

除了编码所述蛋白质的序列和调控序列，本发明主题技术的重组表达载体可以携带额外的序列，例如调控宿主细胞中载体复制的序列(例如，复制的起点)以及可选的标记基因序列。

可以通过标准技术(例如电穿孔、磷酸钙沉淀、或DEAE-葡聚糖转染)将编码蛋白质的(多个)表达载体转化或转染至宿主细胞中。

当需要商业生产苯乙烯时，可以应用各种发酵方法。例如，可以通过分批或连续发酵进行大规模生产。

经典的分批发酵是一个封闭系统，其中，在发酵开始时设置培养基的组合物，并且，在发酵过程中，不进行人为改变。因此，在发酵开始时，培养基中接种所需微生物或多种微生物，并且，允许不向该系统添加任何东西而发生发酵。然而，通常，限制一“批”发酵中碳源的浓度，并常常试图控制因素例如pH值和氧浓度。在分批处理系统中，该系统的代谢物和生物质组成不断变化直至发酵停止。在分批培养基中，细胞缓和通过静态延滞期到高生长对数期，并最后达到静止期，此时生长速率减缓或终止。如果未处理，在静止期的细胞将最终死亡。在对数期的细胞通常负责批量生产终产物或中间体。

标准分批系统的一种变化是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明的主题技术，并且包括典型的分批系统，除了随发酵的进行递增添加底物。当代谢物阻遏倾向于抑制细胞的代谢时，并且期望培养基中具有限制量的底物时，可以使用补料分批系统。补料分批系统中的实际底物浓度的测量是困难的，因此，基于可测量参数(例如pH、溶解氧和废气(例如CO₂)的分压)的变化来估计。分批发酵和补料分批发酵是本领域中常见和熟知的技术，实例可以见于Brock,T.D.；Biotechnology:A Textbook of IndustrialMicrobiology,2nd ed.；Sinauer Associates:Sunderland,Mass.,1989；或Deshpande,M.V.Appl.Biochem.Biotechnol.36:227,(1992)。

也可以用连续发酵实现商业生产苯乙烯。连续发酵一个开放系统，其中，将确定的发酵培养基连续地加入到生物反应器，并同时将等量的被调整的培养基移除用于处理。连续发酵通常将培养基维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于它们的生长对数期。

连续发酵允许调节任何数量的影响细胞生长或最终产物浓度的因素。例如，一种方法将以固定速率维持限制性营养物(例如碳源或氮水平)，并且允许所有其它参数适度。在其它系统中，一些影响生长的因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳态生长条件，因而由于移除培养基而带来的细胞损失必须与发酵中的细胞生长速率平衡。调节用于连续发酵工艺的营养物和生长因子的方法，以及将产物形成速率最大化的技术是工业微生物学领域所熟知的，Brock(同上)详述了多种方法。

2.植物宿主

植物细胞也可以用作生产苯乙烯的宿主。优选的植物宿主是维持高表达水平的苯丙氨酸解氨酶和/或肉桂酸脱羧酶的任何品种。合适的绿色植物包括例如大豆、油菜籽(甘蓝型油菜、白菜型油菜)、向日葵(Helianthus annus)、棉花(Gossypium hirsutum)、玉米、烟草(Nicotiana tabacum)、苜蓿(Medicago sativa)、小麦(Triticumsp)、大麦(Hordeumvulgare)、燕麦(Avena sativa,L)、高粱(Sorghum bicolor)、稻(Oryza sativa)、拟南芥、十字花科蔬菜(甘蓝、花椰菜、卷心菜、欧洲防风草等)、甜瓜、胡萝卜、芹菜、欧芹、番茄、马铃薯、草莓、花生、葡萄、草籽作物、糖用甜菜、甘蔗、豆子、豌豆、黑麦、亚麻、阔叶树、针叶树和饲料草。藻类物种包括例如商业显著宿主例如螺旋藻、Haemotacoccus和Dunalliela。合适的植物还包括生物燃料、生物质、和生物能源作物植物。典型的植物包括拟南芥、稻(Oryzasativa)、柳枝稷(Panicum virgatum)、Brachypodium spp、Brassica spp以及海甘蓝。

在一些实施方案中，植物细胞是拟南芥植物细胞、烟草植物细胞、矮牵牛植物细胞、或来自油料种子作物的细胞(包括例如大豆植物细胞、芥花籽植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞等)。

合适的宿主细胞可以被基因改造以表达苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脱羧酶。例如，编码苯丙氨酸解氨酶或肉桂酸脱羧酶的核酸可以可操作地连接于能够在所需的发展阶段引导期望组织中蛋白质表达的启动子。可以使用能够诱导编码区表达的任何合适的启动子和/或终止子。启动子和终止子的一些合适的实例包括来自胭脂碱合酶(nos)、章鱼碱合酶(ocs)和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的那些。

可以使用的有效植物启动子的一种类型是一种高水平植物启动子。可以用于本发明主题技术的高水平植物启动子包括例如来自大豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子(Berry-Lowe等人，J.Molecular and App.Gen.,1:483-498)(1982))，以及叶绿素a/b结合蛋白的启动子。这两种启动子已知在植物细胞中是光诱导的(参见例如Genetic Engineering of Plants,an Agricultural Perspective,A.Cashmore,Plenum,N.Y.(1983)，第29-38页；Coruzzi,G.等人，The Journal of Biological Chemistry,258:1399(1983)，以及Dunsmuir,P.等人，Journal of Molecular and Applied Genetics,2:285(1983))。

可以使用标准的重组DNA方法来获得编码本文所述的蛋白质的核酸，将所述核酸并入至表达载体，并将所述载体引入宿主细胞。载体的选择取决于将要用于转化宿主植物的方法。技术人员熟知必须存在于质粒载体以便成功地转化、选择和繁殖包含所述载体的宿主细胞的遗传元件。技术人员还将认识到：不同的独立转化事件将导致不同水平和模式的表达(Jones等人，EMBO J.4：2411-2418)(1985)；De Almeida等人，Mol.Gen.Genetics218:78-86)(1989))，因此，必须筛选多个事件以获得显示所需表达水平和模式的程序。可以通过DNA印迹的Southern分析(Southern,J.Mol.Biol.98,503,(1975))、mRNA表达的Northern分析(Kroczek,J.Chromatogr.Biomed.Appl.,618(12):133-145)(1993))、蛋白质表达的Western分析、或表型分析来完成这样的筛选。

如上所述，可以通过密码子优化进一步改善本文所述的植物宿主中蛋白质的表达。在某些实施方案中，密码子优化的核酸序列表达蛋白质的水平是密码子未优化的核酸序列所表达的蛋白质水平的约110％、约150％、约200％、约250％、约300％、约350％、约400％、约450％或约500％。

本发明的主题技术还提供了转基因宿主细胞或已被本文所公开的一种或多种核酸转化的宿主细胞。所述核酸分子可以被稳定整合到细胞的基因组中，或者所述核酸分子也可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子可以自主复制。将转化的细胞、组织或主体理解为不仅包括转化过程的最终产品，还包括它们的转基因后代。

可以通过多种本领域的普通技术人员公知的方法来将本发明主题技术的核酸导入至植物细胞，所述方法包括但不限于将感兴趣的核酸序列插入一种发根农杆菌Ri或根癌农杆菌Ti质粒、显微注射、电穿孔或直接沉淀。在一些实施方案中，通过提供一个实例的方式，可通过农杆菌浸润法进行感兴趣的核酸序列或基因的瞬时表达。在这方面，含有感兴趣的核酸序列或基因的根癌农杆菌的悬浊液可以在培养基中生长，然后通过将注射器的尖端对着叶的背面放置同时向叶的另一面施加温和的反压力将所述悬浊液注射到植物中。然后，将农杆菌溶液通过气孔注入到叶内的空域中。一旦进入叶子，农杆菌会将感兴趣的基因转化为植物细胞的一部分，然后在这里所述基因被瞬时表达。

作为另一个实例，可以通过粒子枪轰击技术将感兴趣的载体或核酸转化至植物细胞中。在这方面，植物胚的悬浊液可以在液体培养基中生长，然后用附着至金颗粒的质粒或核酸轰击，其中，可以通过植物组织的膜(例如胚组织)推进所述结合至感兴趣的质粒或核酸的金颗粒。轰击后，可以使用适当的抗生素选择所述转化的胚以产生新的、无性繁殖的、转化的胚性悬浮培养基。

有关转化和生产转基因植物细胞的方法的额外的指导，请参见美国专利4459355、4536475、5464763、5177010、5187073、4,945,050、5036006、5100792、5371014、5478744、5179022、5565346、5484956、5508468、5538877、5554798、5489520、5510318、5204253、5405765；EP 267159、604662、672752、442174、486233、486234、539563、674725；以及国际专利申请公开号WO 91/02071和WO 95/06128。

3.降低苯乙烯毒性

在另一个方面，本发明的主题技术提供了一种宿主细胞，其包含：(a)一种重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b)一种重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及(c)一种重组表达的膜结合转运体。

限制生物生产苯乙烯的一个显著问题是苯乙烯对宿主细胞的毒性。已知疏水芳烃在胞质膜中的积累会破坏其完整性。为了降低苯乙烯的毒性并提高生产，可以将膜结合转运体(例如，外排泵)引入到宿主细胞以从细胞去除有机溶剂。因此，宿主细胞对疏水性溶剂显示出耐受的表现型。

在一个实施方案中，所述膜结合转运体可以是ABC转运体(ATP结合盒转运体)，其是利用三磷酸腺苷(ATP)水解的能量以进行某些生物过程的跨膜蛋白，所述生物过程包括多种底物跨膜的易位以及非转运相关的过程，例如RNA的翻译和DNA修复。它们横跨细胞膜外和细胞膜内传输广泛多种底物，包括代谢产物、脂质和甾醇和药物。基于ATP结合盒(ABC)域的序列和构造将蛋白分为类ABC转运体。

本文提供了表达ABC转运体的宿主细胞，其使得所述宿主细胞分泌苯乙烯到培养基之中。具体地，ABC转运体是一种耐溶剂泵。赋予针对有机溶剂具有抗性或耐受性的耐溶剂泵已显示具有非常广泛的特异性，耐溶剂泵由于它们的化学-物理特性(例如，在细菌膜堆积)将有机化合物(例如芳族、醇、烷烃等)作为底物(Kieboom等1998.J.Biol.Chem.273:85-91)。芳族化合物还有效地划分到细胞膜，其中它们充当耐溶剂泵的底物。

在本发明主题技术的一个实施方案中，宿主细胞包含质子依赖的抗性/结瘤/细胞分裂(RND)家族的外排泵的成员。RND型外排泵属于多药抗性(MDR)泵。它们具有非常广泛的底物特异性，并在细胞质膜的两侧保护细菌细胞免受抗生素的作用。已证明这个族的成员涉及涉及结瘤信号转导的抗生素、金属和低聚糖的输出。RND型外排泵通常以横跨所述革兰氏阴性细菌的外部和细胞质膜和周质空间的三组分组合起作用。可以在Tseng,T.T.,Gratwick,K.S.,Kollman,J.,Park.,D.,Nies,D.H.,Goffeau,A.,&Saier Jr.,M.H.(1999),J.Mol.Microbial.Biotechnol.1:107-125中找到用于本发明主题技术的方法中的合适的RND型外排泵的实例。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包括P.putida S12的耐溶剂泵srpABC(Isken等，1996J.Bacterial.178:6056；Kieboom等，1998.J.Biol.Chem.273:85-91)。由srpABC基因编码的蛋白质的推测的氨基酸序列与RND家族的外排泵序列具有广泛的同源性。它是由三种蛋白质组分组成，所述三种蛋白质一起跨越了革兰氏阴性菌的内膜和外膜：内膜转运体(SrpB类似物)、外膜通道(SrpC类似物)、以及周质连接体蛋白(SrpA类似物)。显示SrpA、SrpB和SrpC与涉及多药抗性的其它蛋白的种系发生关系的树状图示于Kieboom等人(1998生物化学杂志，273：85-91)。所述srpABC编码的蛋白质展现出与那些在铜绿假单胞菌中发现的mexAB/oprM编码的多药抗性泵的最同源。SrpA、SrpB和SrpC与MexA、MexB和OprM分别有57.8％、64.4％和58.5％的一致性。在一个实施方案中，宿主细胞包含外排泵，所述外排泵由内部膜转运、外膜通道、以及属于RND家族外排泵的周质连接体蛋白组成，其中，所述蛋白表现出与P.putida S12的SrpA、SrpB或SrpC有约50％、约55％、约60％、约70％、约80％、约85％、约95％、约98％、约99％或甚至100％序列一致性的同源性。可以使用能够使用芳族化合物作为底物的已知溶剂外排泵的任何功能等价物。

在一个实施方案中，宿主细胞可以将可发酵碳底物转化为芳族氨基酸(例如苯丙氨酸)，其随后被转化成苯乙烯。一旦产生，苯乙烯通过外排泵主动地被运出所述宿主细胞，优选由质子依赖的抗性/结瘤/细胞分裂(RND)家族的外排泵的成员运出，例如srpABC。

细菌P.putida S12也被改造作为生物合成对-羟基苯甲酸和对-羟基苯乙烯的溶剂耐受性平台(Verhoef等人，2007,Bioproduction of p-hydroxybenzoate fromrenewable feed stockby solvent-tolerant Pseudomonas putida S12.Journal ofBiotechnology 132,49-56；Verhoef等人,2009,Bioproduction of p-hydroxystyrenefrom glucose by the solvent-tolerant bacterium Pseudomonas putida S12in atwo-phase water-decanol fermentation.Appliedand Environmental Microbiology75,931-936)。改造的菌株可以被用于苯乙烯的生物生产。可以以类似的方式改造其它宿主以增加对有机化合物的耐受性。

G.从细胞培养基收获苯乙烯

可以使用常规方法从细胞培养基收获苯乙烯。例如，可以通过过滤或离心除去宿主细胞。可以通过离心或色谱法分离油相和水相。可以使用额外吸附、蒸馏和微滤技术来进一步纯化苯乙烯。纯化的一般方案涉及用碱性水溶液(通常为5-10％的NaOH)除去聚合抑制剂，用蒸馏水洗涤，干燥并减压分馏，微滤气体状态的苯乙烯单体，以及它们的组合。

因此，本发明的主题技术提供了一种廉价的生物途径来生产苯乙烯，而苯乙烯可以用于多种商业材料，包括聚苯乙烯、ABS、苯乙烯-丁二烯(SBR)橡胶、苯乙烯-丁二烯胶乳、SIS(苯乙烯-异戊二烯-苯乙烯)、S-EB-S(苯乙烯-乙烯/丁烯-苯乙烯)、苯乙烯-二乙烯基苯(S-DVB)、苯乙烯-丙烯腈树脂(SAN)和不饱和聚酯。这些材料被用于橡胶、塑料、绝缘材料、玻璃纤维、管道、汽车和船部件、食品容器、以及地毯背衬。

H.苯乙烯的生物合成

典型地，可以通过用包含本文所述的任意肉桂酸脱羧酶或本文所述的任意融合蛋白的宿主细胞孵育本文所述的底物(例如葡萄糖、苯丙氨酸、或反式-肉桂酸)来生产苯乙烯。在孵育中葡萄糖的浓度典型地是约0.02％至约3％、优选约0.05％至约1.5％、更优选约0.1％至约1％。在孵育中反式肉桂酸的浓度通常为约0.02％至约0.5％、优选约0.05％至约0.2％。在孵育中苯丙氨酸的浓度通常为约0.02％至约0.5％、优选约0.05％至约0.2％。在一个实施方案中，在加入底物后，所述宿主细胞在约16℃至约37℃、优选22℃至约30℃的温度下，连续培养约10至约72小时、优选约15至约36小时。

基于上述内容，本发明的主题技术提供了一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括(a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含一种如上所述的融合蛋白；以及(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

本发明的主题技术还提供了一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括(a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：(i)一种苯丙氨酸解氨酶；以及(ii)一种如上所述的突变的肉桂酸脱羧酶；以及(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

本发明的主题技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：(a)一种重组表达的苯丙氨酸解氨酶；(b)一种重组表达的肉桂酸脱羧酶；以及(c)一种重组表达的膜结合转运体。因此，本发明的主题技术还提供了一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使上述宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及(b)在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

在传统的方法中，苯乙烯生物合成都是在密闭容器中完成的，以防止苯乙烯从容器蒸发。这种封闭系统不能维持用于生物系统产生苯乙烯的兼性厌氧条件(最佳条件)。因此，使用传统方法，苯乙烯产物在密闭容器中积聚，并且，所述苯乙烯合成最终由于苯乙烯对生物合成系统(例如宿主细胞)所施加的毒性作用而停止。令人惊奇地，包含吸收材料以将苯乙烯蒸气从生物合成过程中除去，不仅能够可靠地检测苯乙烯产物(例如，通过如上所述的筛选FDC突变体活性的方法)，还改善了生物合成苯乙烯的产率。

因此，本发明的主题技术还提供了一种用于生产苯乙烯的方法，所述方法包括(a)使宿主细胞与可发酵碳底物接触，所述宿主细胞包含：(i)一种苯丙氨酸解氨酶；以及(ii)一种肉桂酸脱羧酶；以及(b)在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯，其中，通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。

在这方面，所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶可以包括野生型蛋白和突变蛋白。例如，所述肉桂酸脱羧酶可以是一种如上所述的突变的FDC蛋白。此外，所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脱羧酶可以作为单独的蛋白或作为融合蛋白存在，例如上述的PAL-FDC(WT)融合蛋白或PAL-FDC(K190E)融合蛋白。

在一个实施方案中，通过聚合树脂吸收苯乙烯蒸气，所述聚合树脂能够吸收有机分子，同时允许空气自由流入生物合成系统(例如，宿主细胞)。也可以将在上述高通量筛选肉桂酸脱羧酶活性的方法中使用的任何吸收材料用在具有类似设备的苯乙烯生物合成过程中(图19)。例如，STRATA-X柱(含有反相聚合物树脂)可被用于吸收自宿主细胞产生的苯乙烯蒸气(从而降低对宿主细胞的毒性)，同时允许氧气穿过树脂以保持用于细胞生长的兼性厌氧条件。通常，此方法允许以大于1g/L的水平来制备苯乙烯。

也可以使用上述制备苯乙烯的所有方法来生产4-羟基苯乙烯，所述制备苯乙烯的所有方法包括涉及融合蛋白的方法、涉及突变的肉桂酸脱羧酶的方法、涉及膜结合转运体的方法、以及涉及通过吸收材料除去苯乙烯蒸气的方法。在一个实施方案中，酪氨酸或香豆酸或二者皆可在上述方法中被用作底物来生产4-羟基苯乙烯。

构建融合蛋白以及在大量样品中迅速地检测肉桂酸脱羧酶活性的能力使得可以同时筛选融合蛋白中PAL和肉桂酸脱羧酶单元的活性，从而可以获得一个改善的总体苯乙烯收率。与在构建融合蛋白之前分别检测PAL和肉桂酸脱羧酶活性的方法相比，这种方法是有利的。

因此，本发明的主题技术提供了一种用于同时筛选苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；(b)在一定条件下将述融合蛋白和底物混合，所述条件为使得所述融合蛋白将所述底物转化成产物；以及(c)检测剩余底物的量、或所述产品的量、或二者。

在一个实施方案中，本发明的主题技术还提供了一种用于同时筛选苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸脱羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：(i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及(ii)包含肉桂酸脱羧酶的第二域；(b)提供选自下组的底物：苯丙氨酸、反式-肉桂酸、酪氨酸、香豆酸、以及它们的组合；(c)在一定条件下培育所述融合蛋白和所述底物，所述条件为使得所述融合蛋白将所述底物转化成选自下组的产物：苯乙烯、4-羟基苯乙烯、以及它们的组合；以及(d)检测剩余底物的量、或所述产品的量、或二者。

可以使用任意上述PAL和肉桂酸脱羧酶制备所述融合蛋白，例如PAL-FDC或PAL-FDC(K190E)。通常情况下，将底物(例如苯丙氨酸或反式-肉桂酸)与融合蛋白混合，可以通过测量剩余底物的量、或所述产品的量、或这两者同时检测融合蛋白中的PAL的活性和肉桂酸脱羧酶的活性。例如，当苯基丙氨酸作为底物与融合蛋白混合时，可以测量反式-肉桂酸和苯乙烯作为产物的量。在这个实例中，肉桂酸的浓度反映了从苯丙氨酸(通过PAL)生成肉桂酸和其(通过肉桂酸脱羧酶)转化为苯乙烯，并且，苯乙烯的浓度反映了总体的通过融合蛋白从任意底物生产的苯乙烯(图18)。类似地，当反式肉桂酸与融合蛋白混合用于转换为苯乙烯时，可以测量反式-肉桂酸底物的余量和苯乙烯产物的量。

在一个实施方案中，可以在与本文所述的高通量筛选肉桂酸脱羧酶活性的测定中所使用的相似的条件下同时筛选苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸脱羧酶活性。在一个示例性实施方案中，苯乙烯的检测包括将所述融合蛋白和底物的混合物暴露于一种吸收苯乙烯蒸气的聚合物树脂。合适的树脂包括疏水性树脂，例如C18、C8、苯基、SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。

实施例

在下面的实施例中将进一步定义本发明的主题技术。应当理解的是：虽然这些实施例表明了本发明主题技术的优选实施方案，但是这些实施例仅是以例证的方式给出的。从上面的讨论和这些实施例，本领域的技术人员可以确定本发明主题技术的本质特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明的主题技术进行多种变化和修改以使其适应多种用途和条件。

实施例I.酵母FDC1的重组生产、纯化和表征。

1.酵母FDC1在E.coli中的表达

通过阿魏酸脱羧酶(FDC1)的反式肉桂酸(tCA)的脱羧是苯乙烯生物合成途径得到苯乙烯的最后一步。虽然有报道说FDC1单独表达不足以将tCA转换为苯乙烯(Jiang等人,2005,Applied and Environmental Microbiology,71:2962-2969；Clausen等人,1994,Gene,142:107-112.)，但是，最近有报道说FDC1的单独表达就足以在体内将tCA转换为苯乙烯(McKenna等人，2011,Metabolic Engineering,13(5):544-554)。McKenna推测：其它蛋白质(例如与FDC1体内相关联的E.coli Ubix)能够使tCA转化为苯乙烯。没有报导清楚地表明不与任何其它蛋白质关联，FDC1单独就足以将tCA转换为苯乙烯。

为了在体外检测纯化的FDC1的活性，构建了一种表达载体，并且在E.coli中在多种条件下表达了FDC1。将质粒pDESTl 7-FDC1转化至E.coli菌株BL2l(DE3)感受态细胞。在补充有氨苄青霉素(100μg/mL)的Terrific-broth培养基中接种1000倍稀释的过夜培养基。在37℃下培养细菌直到OD₆₀₀达到0.8-1.0，在该点加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至0.2mM的终浓度，并在相同的温度下继续培养3小时。使用三种不同的裂解缓冲液来检查FDC 1的表达。缓冲液A含有25mM磷酸钾缓冲液pH 7.5、500mM的氯化钠、10mM咪唑、20mM的βME、0.5mM的PMSF、10mM的MgCl₂、2μg/mL的DNA酶、2μg/mLRNA酶、以及4μg/mL的溶菌酶。缓冲液B含有50mM磷酸钾pH 7.0缓冲液、1mM的DTT、50mM的硫代硫酸钠、20％甘油、500mM的NaCl、10mM的MgCl₂、20mM的咪唑、2μg/mL的DNA酶、2μg/mL的RNA酶、以及4μg/mL的溶菌酶。缓冲液C由含50mM的硫代硫酸钠的缓冲液A和20％甘油组成

如图2A所示那样，在37℃下，重组FDC1在大肠杆菌中并不表达为的可溶物，而是形成包涵体。用于表达重组蛋白的标准方案不适用于FDC1。

为在E.coli中产生功能性FDC1，在多种浓度(0.2mM、0.5mM)的IPTG的存在下，在不同温度下(37℃、30℃、25℃、18℃和16℃)诱导FDC1的表达。IPTG的浓度对表达无显著影响；然而，较低的温度改善了该蛋白质的表达和溶解度。在用0.2mM的IPTG在16℃下诱导16小时后得到了最佳FDC1表达(图2B)。通过在4℃下以4500rpm离心收获细胞，并用l×PBS缓冲液洗涤一次，然后在-80℃储存。

使用Laemmli方案通过SDS-PAGE(10％丙烯酰胺平板凝胶，0.75mm厚)检查了FDC1的表达。使用考马斯亮蓝R-250为蛋白质带染色。

我们的结果表明：在较低温度及较低IPTG浓度下FDC1的表达在所述酶的正确折叠以及将聚集的或错误折叠的形式转化为可溶的、功能性的形式中发挥了作用。

2.酵母FDCl的纯化

没有关于酵母FDC1的纯化和表征的报道。为检测FDC1的活性和性质，将自大肠杆菌重组生成的功能性FDC1纯化。

在厌氧环境中，在4℃下，进行纯化。将细胞悬浮于含10mM的MgCl₂、0.2％的TritonX-100、2μg/mL的DNA酶、2μg/mL的RNA酶、以及4μg/mL溶菌酶的缓冲液A(由50mM的含有50mMNa₂S₂O₃的Tris-HCl pH 8.0、25mM的TCEP、500mM的氯化钠、0.5mM的PMSF、20mM的β-巯基乙醇、20％甘油、以及10mM的咪唑组成)中。通过超声处理裂解细胞，并通过在4℃下以15000g离心20分钟收集上清液。将得到的上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，然后将其施加于用所述缓冲液A平衡的Ni⁺-琼脂糖亲和柱(GE Healthcare)。用缓冲液A将所述柱充分洗涤，直到将所有非特异性结合的蛋白质从所述柱中洗脱。用含有250mM咪唑的缓冲液A洗脱所述蛋白质。通过分光光度计在280nm测定所述蛋白质含量。所述蛋白质是相当纯的(图3)。

纯化可以将tCA转化为苯乙烯的重组FDC1。然而，在纯化过程中蛋白质会非常快地失去其活性。当在厌氧条件下进行纯化时，可以保持蛋白质的活性，例如通过在所述缓冲液中加入更高量的还原剂(50mM Na₂S₂O₃、25mM TCEP和20mMβ-巯基乙醇)。

3.重组生产的FDC1的活性测定

为了研究体外重组FDC1的功能，测试了多种条件(例如，在宽pH范围内的缓冲液、多种底物浓度、以及用于产品提取的多种有机溶剂)对FDC1的酶活性的影响。

首先，开发了非常准确且可重复的酶测定，其能在低底物浓度下测量FDC1活性。

用于脱羧的标准反应混合物由最终体积为1.0mL的含有5mM二硫苏糖醇的25mM的磷酸钾缓冲液(pH 6.5)、1.4mM的反式肉桂酸和酶(0.50mg)组成。通过加入酶启动所述反应并在30℃下培育5分钟。加入24μL的冰醋酸(17.4N)停止反应，之后，将等体积的2-丙醇加入反应混合物以溶解产物。使用装配有自动进样器、二极管阵列(紫外/可见光)检测器、以及反相Acclaim 120C18柱的Dionex Ultimate3000UHPLC(2.1x150mM Dionex美国)通过HPLC测量生成的苯乙烯的量。将样品(10μL)以0.6ml/min的总恒定流速注入进行分析。在1ml/min的流速下，将样品溶解于0.15％的乙酸(A)和含有0.15％乙酸的增长的浓度梯度的乙腈(B)中0至4分钟，5％；4至5分钟，5至40％；5至7分钟，40至45％；7至8分钟，45至85％；8至12分钟，85至95％；12至14分钟，95至5％。具体的活性表示为U(nmol苯乙烯)·mg^-1·min^-1。

4.pH值对FDC1活性的影响

缓冲液pH值是可以影响酶促反应的主要因素之一。分别在pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5下的缓冲液中进行反应来评估对于FDC1活性的最佳pH值。磷酸钾缓冲液用于6.0至7.5的pH值，Tris-HCl缓冲液用于8.0和8.5的pH值。1mL的最终体积的反应混合物由200μM的肉桂酸、5mM的DTT、100mM的多种pH缓冲剂、以及150μL的FDC1粗提取物组成。将反应混合物在30℃下培育30分钟。用100μL的丁醇萃取苯乙烯。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。发现对于FDC1粗提取物脱羧的最佳pH为约6.5。我们的结果表明：缓冲液对FDC1活性有显著影响，在pH 6.5时，FDC1显示出最高活性(图4)。此信息对于工业生产苯乙烯是有用的。

5.FDC1的pH稳定性

缓冲液也影响FDC1的稳定性和反应速率。为研究FDC1的稳定性，在不同pH值(5.0-11.0)的缓冲液中培育蛋白质。

向pH值为5、6、7、8、9、10和11的112μL的500mM缓冲液中加入所述的蛋白质(粗提取物，586μL)，并在30℃下培育30分钟。经多种pH缓冲液处理后，将等分蛋白质(42mg)添加至终浓度为100mM的磷酸钾缓冲液pH 6.5、5mM的DTT、1.4mM的肉桂酸，并调整至2mL的最终体积。然后将反应混合物在30℃下培育8分钟。通过加入250μL的丁醇萃取苯乙烯。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。发现在pH范围为6至10时，所述FDC1粗提取物是稳定的(图5)。该蛋白质在宽的pH范围内是稳定的并有活性，并且可以用于工业生产苯乙烯。

6.温度对FDC1活性的影响

温度可以影响FDC1的稳定性和反应速率。Arrhenius方程描述了温度对反应速率的影响。作为一个经验法则，每升高10摄氏度，许多反应的反应速率将上升一倍或两倍，虽然温度的影响可能比这更大或更小。

为了评估为FDC1的最佳温度，分别在25℃、30℃、32℃、35℃、40℃、50℃和60℃的温度下进行反应30分钟。将蛋白质(FDC 1粗提取物，13mg)加入至含25mM磷酸钾pH 6.5、5mM的DTT和1.4mM肉桂酸的反应混合物中至1mL的体积。在反应后，将1mL的丙醇加入至反应混合物以溶解苯乙烯。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。FDC1活性的最佳温度为50℃(图6)。

出乎意料地，与其它酵母酶相比，所述酶在更高温度下显示出最大活性。此信息对于工业生产苯乙烯是有用的，因为与发酵相关的大量的成本是用于冷却发酵系统的。由于FDC酶在较高的反应温度有活性，可以控制发酵的温度范围来增加产量并降低冷却成本。

7.FDC1的温度稳定性

为研究FDC1的温度稳定性，分别在30℃、50℃、60℃和70℃的温度下进行反应30分钟。在多个温度下培育后，将等分蛋白质(42mg)添加至25mM的磷酸钾缓冲液pH 6.5、5mM的DTT、1.4mM的肉桂酸，至1mL的最终体积。将反应混合物在30℃下培育8分钟。用250μL丁醇萃取苯乙烯，并用C18柱通过HPLC定量。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。所述酶在50℃下是稳定的(图7)。

通过在50℃下分别培育FDC1的粗提取物10、30、60和120分钟来测试所述粗提取物在50℃下的稳定性。在培育蛋白质不同时间后，将等分(42mg)蛋白质添加至25mM的磷酸钾缓冲液pH 6.5、5mM的DTT、1.4mM的tCA，至1mL的最终体积。然后将反应混合物在30℃下培育8分钟。通过向反应混合物添加250μL丁醇来萃取苯乙烯，并通过HPLC定量。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。所述蛋白质在50℃下稳定2小时(图8)。该结果证明，即使在培育后约2个小时，所述蛋白质依然保留了100％的活性。由于FDC1的热稳定性，这条信息对于工业生产苯乙烯是有用的。

8.辅因子对FDC1活性的影响

为检测辅因子对FDC1酶活性的影响，用多种辅因子进行反应。测试几种辅因子对FDC1活性的影响，所述辅因子包括硫胺素焦磷酸(TPP)、生物素和磷酸吡哆醛(PLP)。1mL体积的含25mM磷酸钾缓冲液pH 6.5、5mM的DTT、0.5mM的tCA、0.5mM的辅因子、以及0.5mg纯化FDC1的反应混合物在30℃下被培育30分钟。用250μL丁醇萃取苯乙烯。实验的对照使用相同的条件，除了反应混合物不含辅因子。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。

无辅因子增加了FDC1的活性。事实上，发现它们降低了FDC1活性(图9)。这一结果表明：对于其活性，这种酶不需要任何通常已知的辅因子。

9.金属离子对FDC1活性的影响

为研究金属离子对FDC1活性的影响，用多种金属离子进行反应，所述金属离子包括ZnSO₄、FeCl₃、MnCl₂、MgSO₄、CaCl₂、MnSO₄、以及FeSO₄。将调整至1mL的最终体积的含有1.4mM的tCA、5mM的DTT、10mM的金属离子、以及0.5mg纯化FDC1的25mM磷酸钾缓冲液pH 6.5的反应混合物在30℃下培育5分钟。反应后，将1μL丙醇加入所述反应混合物以溶解苯乙烯。实验的对照使用相同的条件，除了反应混合物不含金属离子。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、以及Fe³⁺离子提高了FDC1的活性(图10A)。

用EDTA来消除金属离子的影响来进一步研究Zn²⁺和Fe³⁺对FDC1活性的影响。将含有1.4mM的tCA、5mM的DTT、10mM的金属离子、10mM的EDTA以及0.5mg纯化FDC1的25mM磷酸钾缓冲液pH 6.5的反应混合物调整至1mL的最终体积，并在30℃下培育5分钟。反应后，将1μL丙醇加入所述反应混合物以溶解苯乙烯。实验的对照使用相同的条件，除了反应混合物不含金属离子或EDTA。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。与对照相比，含金属离子和EDT A的反应具有相似的活性(图10B)，显示Zn²⁺和Fe³⁺增加FDC1活性。基于在图10A和10B中所呈现的结果，可以通过金属离子提高FDC1的酶的活性，这不是由于实验假象。对于工业生产苯乙烯，这条信息表明：在培养基中包含某些金属离子可以有利于苯乙烯合成。

10.底物特异性

为检测是否FDC1对tCA是高度特异性的(或者它是否显示底物混杂性)，测试了tCA及其底物类似物，例如阿魏酸、2-甲基肉桂酸、2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、4-羟基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、以及2,5-二甲氧基肉桂酸。将含有5mM的DTT、0.2mM的底物、以及0.5mg纯化FDC1的25mM磷酸钾缓冲液pH 6.5的反应混合物调整至1mL的最终体积。随后在30℃下培育反应混合物5分钟。反应后，将1μL丙醇加入所述反应混合物以溶解苯乙烯。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。与tCA相比，底物阿魏酸、2-甲基肉桂酸、以及4-羟基肉桂酸分别示出57％、35％和68％的活性(图11)。对于底物2-羟基肉桂酸、3-羟基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、以及2,5-二甲氧基肉桂酸，所述酶未显示出任何活性(图11)。所述酶对tCA未表现出严格的特异性；相反，对于阿魏酸、2-甲基肉桂酸和4-羟基肉桂酸，它显示出中等活性。

底物特异性的分析将有助于阐明底物结合位点和酶的活性的机理。此外，这种底物光谱表明：可以使用相同的发酵体系来产生不同的工业单体。除了将肉桂酸转化为苯乙烯之外，现在可以进行下列生产：自阿魏酸转化为4-羟基，3-甲氧基-苯乙烯(又名4-乙烯基愈创木酚，4VG)；自2-甲基肉桂酸转化为2-甲基-苯乙烯；以及自4-羟基肉桂酸转化为4-羟基苯乙烯(又名4-乙烯基苯酚)。

11.动力学

为检测这种蛋白质的催化效率，使用tCA作为底物进行FDC1的动力学研究。为测量野生型FDC1稳态动力学常数，用不同浓度的tCA(100-2000μM)测定酶活性。在含有0.5mg的纯化蛋白质的总计1.0mL的标准反应混合物中进行反应，并且使反应在30℃下进行5分钟。用250μL丁醇萃取苯乙烯。实验的阴性对照使用相同的条件，除了反应混合物不含有底物。通过标准检测方法定量活性。进行重复测定并平均。通过速度-浓度数据拟合至米氏方程(Michaelis-Menten equation)的非线性回归分析来确定所述的V_max和K_m。

发现野生型FDC1的Km是688μM并且V_max是6.17nmol·mg^-1·min^-1。发现这种蛋白质的催化效率是8.4M^-1S^-1，这与其它天然酶相比是较低的。FDC1的较低的催化效率是生产苯乙烯的主要障碍。结构指导的蛋白质工程将是增加FDC1活性的分子进化的好方法。

实施例II.FDC1突变体和突变体文库

1.FDC1结构模型

没有可用于底物结合位点的分析的FDC1的三级结构。同源蛋白质结构(3-辛异戊烯-4-羟基苯脱羧酶，PDB代码：2IDB)显示与FDC1只有20％一致性。为分析底物结合位点，通过SWISMODEL程序对截断的FDC1建模并通过I-TASSER程序对全长FDC1建模。这两个模型都是可靠的，因为它们重叠得很好。由于FDC1的较低的催化效率是生产更高量的苯乙烯的一个瓶颈，我们应用分子生物学和结构生物学的组合方法进行全长野生型FDC1的蛋白基础模型的实验室进化(图1A)。

将底物对接至FDC1之中。为了蛋白质的实验室进化，检测了FDC1的底物结合位点。没有关于FDC1的底物结合位点的报道。使用计算机程序SWISDOCK进行tCA与FDC1对接。对接后，给出了4种可能的结合位点(图1B)。

分析结构之后，研究位点C的分子进化以提高活性。在不限制本发明的主题技术范围的情况下，假设：I173、A174、R175、V188、I189、K190(为图示的清楚而未示出)、I194、E280、M286、F291和F440对底物结合作出贡献(图1C)。因此，疏水性残基(A174、I194和V188)为结合tCA的苯基环建立了一个口袋；带正电的R175与tCA的羧基和带负电的E280形成氢键。

2.FDC1的饱和诱变

因为常规诱变没有改善FDC1活性，所述，施加了定点饱和诱变。饱和诱变允许一种氨基酸转变至19种其它的替代的氨基酸残基。通过遵循QuickChang定点诱变策略(STRATAGENE，加利福尼亚州)使用NNK简并引物(N代表A、T、G、C的混合物，K代表G/T)在FDC1的位点155-156、159、162-164、172-175、187-196、226-227、285-287、291、326、331、360-361、395-396、398和440-441进行饱和诱变。密码子NNK具有32倍的简并，并编码所有没有稀有密码子的20种氨基酸。通过琼脂糖凝胶电泳检测QuikChange PCR产物，然后用1μl的Dpnl(New England Biolabs)在37℃下消化15μl的PCR产物4小时以除去模板质粒。将等分的(2μl)消化产物转化至BL21-Gold(DE3)感受细胞(STRATAGENE，加利福尼亚州)，并在含有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂板上培养。通过DNA测序确认文库的质量。所述文库涵盖了90％的突变(19种突变体中的17种)。为覆盖100％(19种突变体中的19种)，我们对每个位点筛选了150个突变体。

3.用于FDC1突变体文库的高通量筛选的比色法

筛选大群体的蛋白质文库内容是蛋白质的分子进化的瓶颈。脱羧酶的功能特性经常依赖于分析手段，像HPLC或LC-MS。尽管HPLC是高度敏感的，但它也是费时的、昂贵的，并且会产生废物，例如甲醇或乙腈，不适合高通量应用。为了克服这些技术障碍，开发了一种基于分光的比色测定方法，其主要基于检测自tCA酶促产生的苯乙烯。已经在下面给出了详细方法。

将转化体(实施例II.2)接种至每孔含有100μl LB培养基的96孔板(NUNC，Roskilde，丹麦)，并在37℃下培养，过夜。然后，将所述培养物与等量的50％甘油混合，并在-80℃下储存作为样板。等分的10μl培养物接种至每孔有1ml TB培养基的2ml深孔板(USAscientific)并在37℃下培养，直至OD₆₀₀达到1.0。然后用0.2mM的IPTG诱导培养物，并在18℃下以250rpm振荡培养20小时。

收获细胞并用0.25ml的pH为7.0的PBS缓冲液悬浮，并以1g/L的终浓度加入底物(tCA)。在30℃下培育培养物4小时，并使用在培养板顶部含有10mg聚合物基树脂(Phenomenex)的96孔

反相板收集挥发产物苯乙烯(图19)。为了避免苯乙烯蒸气扩散，在96-孔培养板和96孔

反相板之间使用具有预切口的96-方孔硅酮密封垫。通过每孔200μl丙醇收集产物并通过比色法测定法测量产物的量。

测试了多种化学品作为苯乙烯检测的指标剂，包括NBP(4-硝基苄基-吡啶)作为优选的指示剂。将苯乙烯与细胞色素P450BM-3在50mM磷酸盐缓冲液pH 8.0中混合。通过加入0.2mM的NADPH开始苯乙烯氧化反应，并将反应混合物在室温下振荡培育5分钟。将NBP溶液加入到混合物，在室温下振荡培养5分钟，得到白色沉淀物。将含反应混合物的管或板在70℃加热30分钟，并在冰上冷却5分钟。在加入二甲基甲酰胺(150μl)和25μl的1M K₂CO₃后，反应混合物显示蓝色的颜色，对这种颜色立即可以通过分光光度计在600nm进行测定。NBP的不成对电子与苯乙烯氧化物的环氧乙烷环反应得到蓝色发色团，蓝色，可以用分光光度法在600nm监测。

使用这种高通量方法直接监测含有苯乙烯的96孔板培养物(图13)。这种方法可以检测低至1.0mM的苯乙烯。这种比色方法非常快、较便宜、可重复，并且可以在一天内测量1000菌落。

使用ACQUITY UPLC BEH C18柱(1.7-μm，2.1x50-mm，美国Waters)通过HPLC确认显示较高活性的突变体。在1ml/min的流速下，将样品溶解于30％的乙腈(A)和增高的浓度梯度的乙腈(B)中1分钟，95％；随后1分钟，30％。在254-、280-和310-nm监测紫外吸收。通过DNA序列证实了表现出较高活性的突变体中改变的氨基酸残基。

鉴定了一些潜在的单突变体(例如K190E、K190C、K190D、K190V、K190N、K190L、K190H和R175I)，相比于野生型，它们生产出明显更高量的苯乙烯(图14)。相比于野生型，突变体K190E、K190C、K190V生产了3倍以上的苯乙烯，突变体R175I生产了1.5倍以上的苯乙烯。这样，相比于野生型，FDC1突变体生产了明显更高量的苯乙烯。在不同位点的诱变显示出对甲基转移酶的蛋白质进化的累加或协同效应(Bhuiya等，2010,Journal ofBiological Chemistry,285:277-285)。在FDC1的K190和R175位点的诱变可以进一步提高苯乙烯的生产。

通过将培养物维持在有氧环境下进行苯乙烯的生产。相比于需氧条件，野生型FDC1在厌氧条件下生产了一半量的苯乙烯。使用

柱，我们可以捕获挥发苯乙烯并能保持有氧条件。

实施例III.FDC1-PAL融合蛋白

FDC-PAL2融合蛋白在E.coli中的表达。苯乙烯生产包括人工通道。为使用Gateway技术构建PAL2和FDC的融合蛋白，设计四种引物用于PCR扩增。FDC-5'引物含有CACC序列，FDC-3'引物具有9-氨基酸的连接体，并在3’末端具有两个限制位性点NcoI和PstI。为将PAL2与FDC融合，PAL2-5'引物相应地具有一个Ncol位点而PAL2-3'引物具有PstI位点。用上述引物扩增FDC基因(～1.5kb)和PAL2基因(2.2kb)并克隆到Gateway载体pDEST17之中。将PAL2和FDC的融合蛋白的构建体转移至BL2L(DE3)。还可以通过上述方法来获得FDC突变体和PAL的融合蛋白。

基于白藜芦醇生物合成途径的信息评估连接体对于融合蛋白的用途。以前的结果表明：与两种单独蛋白的表达相比，融合蛋白产生15倍以上的产物(Yechun Wang等(2011),JACS,133:20684-20687)。结果表明：连接体在融合蛋白的生物合成途径改善中起重要作用。用GSG基序设计了不同长度的连接体2、3、4、6、8、9、12和15个氨基酸长度，并检查了连接体对白藜芦醇生物合成途径的影响。我们发现：与其他连接体相比，9个氨基酸的连接体显示出最高的产量(图15)。根据我们的发现，我们为PAL-FDC融合蛋白设计了9个氨基酸的连接体。

基于以上观察，构建了一个计算机模型来证明人工连接体确实增加了代谢通道。所述9个氨基酸的连接体以如下方式连接两种蛋白质(图16)：防止了中间体扩散(在本例中是肉桂酸)，从而中间体可被第二酶(FDC)有效地吸收，并最终增加了最终产物苯乙烯。所述计算机模型预测两个反应中心(由两个箭头标注)之间的距离都在70埃之内，形成一个代谢通道。

表达分析表明：在培养基中发现约615mg/L的苯乙烯。这种融合蛋白制备的苯乙烯的量比大肠杆菌中FDC表达的量(在介质中95mg/L)高约6倍。这个量的苯乙烯也远高于PAL2和FDC的非融合蛋白(在酵母中表达，检测出69mg/L的苯乙烯)的量。这些分析表明：PAL2和FDC的融合蛋白可被用于改善苯乙烯的生物生产。

实施例IV.一种ABC转运体在大肠杆菌中的表达

有些细菌已经发展出多种机制来适应不利的条件。例如，假单胞菌属菌株具有约三种策略来解决有机溶剂的毒性，即修饰的膜结构、主动外排泵、以及酶促解毒。这里，制备表达一种外排泵(被称为抗溶剂泵)的重组大肠杆菌宿主。所述泵是ABC转运体家族中的一员，是由三个亚基组成：srpA，周质连接体；srpB，膜内转运体；以及srpC，膜外通道。从恶臭假单胞菌的基因组DNA克隆全长的srpABC序列(～6kb)。所述克隆体被首先插入到具有Zeocin抗性的pENTR载体，随后插入到具有卡那霉素抗性的大肠杆菌表达载体pCONA-2-DEST。

最后，所述泵被转化到含有PAL2和FDC融合蛋白的耐氨苄青霉素的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。在培养瓶中检测5个克隆体的表达之后，选择一个克隆体用于进一步的发酵罐实验。将五十毫升的过夜培养物接种于1.5L的含适当的抗生素的LB培养基中。当细胞达到OD₆₀₀～0.8时，将5mM的IPTG加入到培养物来诱导。2小时后，将底物Phe加入到终浓度为5g/L的细胞培养物中。在含有250毫升丁醇的瓶子中追踪苯乙烯蒸气。自过夜发酵(～16小时)的样品中取样，并通过耦合了Acclaim RSLC C18柱的HPLC分析，并在280nm检测。经过16小时的发酵，在培养基中几乎没有发现苯乙烯，但在丁醇中可找到高浓度的苯乙烯。相较于只包含PAL2和FDC的融合蛋白的对照例，包含三重基因(PAL2和FDC的融合蛋白，加上srpABC)的克隆体能够生产近四倍多的产物，即521mg/L对139mg/L(参见图17)。

实施例V.苯乙烯的生物合成。

从葡萄糖生产苯乙烯。构建一种包含融合蛋白FDC1(K190E)-PAL的载体，将它转化到苯丙氨酸生产菌株(ATCC 31884和HG)中，并在含有氨苄青霉素和/或卡那霉素的LB中生长。所述培养物在30℃下生长12小时，在这之后，收获培养物，并将一等分培养物接种至M9培养基中。培养物在30℃生长，直至OD₆₀₀达到0.8，然后用0.2mM的IPTG诱导，继续在30℃或37℃下培养48小时。用

柱收集挥发性苯乙烯。通过HPLC测定苯丙氨酸、tCA和苯乙烯的量。ATCC 31884菌株在30℃下从葡萄糖生产出177mg/L的苯乙烯；未观察到tCA或苯丙氨酸的积累(图18A)。HG菌株在30℃下从葡萄糖生产出13.1mg/L的苯乙烯和5.0mg/L的tCA，未观察到苯丙氨酸的积累(图18A)。

有趣的是，BL-21(DE3)菌株通过FDC-PAL融合蛋白和苯丙氨酸产生载体(HGTM)的共表达在37℃下从葡萄糖生产出182mg/L的苯乙烯。从葡萄糖生产苯乙烯的整个系统可以转移到任何宿主系统。

当FDC-PAL从苯丙氨酸生产苯乙烯苯时，与在厌氧条件且无

柱的情况(5mg/L)相比，

柱生产出25倍的苯乙烯(125mg/L)。

柱保持有氧条件，捕获挥发性苯乙烯，并去除苯乙烯，最终提高了苯乙烯生产，并去除对培养物的毒性作用。

从反式肉桂酸或L-苯丙氨酸制备苯乙烯。将编码FDC野生型、FDC突变体(K190E)、FDC(WT)-PAL融合蛋白和FDC(K190E)-PAL融合蛋白的核苷酸转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中。细胞在30℃下在LB中过夜生长。收获细胞，并用M9培养基清洗。将细胞接种到2.0ml的初始OD₆₀₀为0.3的M9培养基中，并在30℃下培养直到培养物的OD₆₀₀达到0.6至0.8。然后在30℃下用0.2mM的IPTG诱导细胞8.0小时。向转化有FDC野生型和FDC(K190E)的细胞供养0.1％的反式肉桂酸。向转化有FDC(WT)-PAL和FDC(K190E)-PAL融合蛋白的细胞供养0.1％的反式肉桂酸或0.1％的L-苯丙氨酸。连续培养所供养的细胞36小时。使用STRATA X柱收集苯乙烯。用丁醇从柱中洗脱产物，并通过HPLC定量。

如图18B所示，用FDC(K190E)突变体转化的细胞生产出的苯乙烯的量(758mg/L)高于FDC野生型的量(175mg/ml)。相比较而言，与PAL融合的FDC(K190E)自反式肉桂酸或L-苯丙氨酸生产出的苯乙烯的量略低于与PAL融合的FDC野生型生产出的量。

实施例VI.用于结晶的肉桂酸脱羧酶的纯化

构建在N-末端具有6-组氨酸和SUMO的FDC1的表达载体。将编码FDC1的DNA转化到大肠杆菌(Rosetta 2)感受细胞，并在含有氨苄青霉素的LB中生长。培养物在37℃下在LB中过夜生长。将培养物接种至TB培养基，并在37℃下生长直到OD₆₀₀达到0.8至1.0，在该点加入IPTG至0.2mM的终浓度，并在在16℃下继续培养16小时。通过在4℃下4500rpm离心15分钟收获细胞。将细胞沉淀物悬浮于含有0.1％的Triton X-100和2μg/mL的DNA酶、RNA酶以及4μg/mL溶菌酶的缓冲液A(50mM磷酸钾缓冲液、50mM的硫代硫酸钠、50mM的TCEP-HCl、500mM的NaCl、0.5mM的PMSF、10mM的MgCl₂、10mM咪唑、20mM的βME、以及20％甘油调节至pH 7.5)。通过进行10次振幅15、处理时间5秒、1秒脉冲开/关的超声处理裂解细胞。通过在4℃下15000rpm离心15分钟收集上清液。将上清液通过0.45μm PES过滤器过滤，然后施加于Ni⁺-琼脂糖亲和柱(GE Healthcare)。用缓冲液A洗涤所述柱，直到将非特异性结合的蛋白质从所述柱中洗脱。用50mM磷酸钾、50mM的硫代硫酸钠、50mM的TCEP-HCl、500mM的氯化钠、0.5mM的PMSF、10mM的氯化镁、250mM咪唑、20mM的βME、以及20％甘油调节至pH 8.0洗提FDC1。在Ni⁺-琼脂糖亲和柱之后，共发现45.0mg蛋白质。

加入水解酶(0.5mg)以从FDC1裂解SUMO。在4℃下通过将蛋白质在1L的25mM磷酸钾、50mM的硫代硫酸钠、500mM NaCl、5mM的DTT和20％甘油将pH调至7.5透析过夜来进行消化反应。第二天早上，继续在新的1L透析缓冲液中透析2-4小时。

消减纯化。用水洗涤Ni⁺-琼脂糖亲和柱，在将蛋白加载于柱中之前，再次填充硫酸镍，并用缓冲液A平衡。将蛋白加载于柱中，收集流过物，加载作为流过物收集的额外15ml的缓冲液A。在已收集所有FDC1之后，用洗提缓冲液洗涤所述柱以从柱中除去SUMO和水解酶。合并含有FDC1的流过物，并测定蛋白质的量。在消减纯化后共发现27.5mg蛋白质。在1L的Q-柱缓冲液A(25mM的磷酸钾、5mM的DTT、以及25mM硫代硫酸钠调节至pH 7.5)中过夜透析所述蛋白质。

阴离子交换层析。用Q-柱缓冲液A平衡阴离子交换Q-柱(GE Healthcare)。将蛋白质装入柱中，并用缓冲液A洗涤，直到将所有非特异性结合蛋白质从柱中洗脱。用含有1M氯化钠的Q-柱的缓冲液A洗提所述蛋白质。洗提开始于27％的Q-柱缓冲液B。将含有FDC1的级分用于SDS-PAGE来检查蛋白质的纯度。在阴离子交换层析后，共发现5.0mg蛋白质。在尺寸排阻缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.5、150mM的NaCl、5mM的DTT和25mM的硫代硫酸钠)中过夜透析所述蛋白质。

尺寸排阻色谱法。将蛋白质加载到尺寸排阻柱(GE Healthcare)上，并用50mM磷酸钠pH 7.5、150mM的氯化钠、5mM的DTT和25mM的硫代硫酸钠洗脱。合并含FDC1的级分(管33至38)并浓缩。在尺寸排阻色谱法后，共发现3.5mg纯化的蛋白质。通过SDS-PAGE检测纯度(图20)。蛋白质纯度高于98％，能够进行结晶。

这里使用的标准重组DNA和克隆技术是本领域所熟知的技术，并描述于Sambrook,J.,Fritsch,E.F和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2^nd ed.；ColdSpring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1989(此后为“Maniatis“)；以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.Experiments with Gene Fusions；ColdSpring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.,1984；和Ausubel,F.M.等,InCurrent Protocols in Molecular Biology,published by Greene Publishing andWiley-Interscience,1987之中。

可以通过与如上所述的纯化FDC1的方法相同的方法纯化FDC突变体，例如具有如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的FDC(K190E)。

实例VII.肉桂酸脱羧酶的结晶

通过蒸气扩散法生长突变的肉桂酸脱羧酶FDC(K190E)与3-羟基肉桂酸的复合物的晶体。使用商业筛选试剂盒(Hampton research,Qiagen,Emerald Biosystems)筛选结晶条件。不同体积的蛋白质和贮存溶液进行了结晶测试。将含有1:1、1:2或2:1的蛋白质(5-10mg/ml)和结晶缓冲液(10％(w/v)聚乙二醇(PEG)6000、5％(w/v)2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、0.1M HEPES，pH 7.5、以及2mM的DTT)的混合物的悬滴保持在4℃下。具体地，在7-11％(w/v)聚乙二醇(PEG)6000、3％(w/v)2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)，pH 6.5-7.5、以及具有0.1％3-羟基肉桂酸的2mM的DTT中生长孔衍射的晶体。通过加入0.01M的MnCl2、0.5％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K15、0.2M NDSB-201或2％(w/v)苄脒盐酸盐作为添加剂进一步改善晶体条件。

FDC(K190E)晶体在空间群C2生长，每个不对称单元具有3条链。晶体的晶胞尺寸为

β＝94.9°。从置于冷冻环中在100K的氮气流中急速冷冻的并用HKL套件浓缩的单晶收集衍射数据。在

分辨率下衍射晶体。使用3-辛异戊烯基-4-羟基苯甲酸酯脱羧酶(2IDB)结构作为模板，使用CCP4i套件中的分子置换(移相器)来解决FDC(K190E)突变体的结构。使用COOT手动构建结构的初始模型，并使用REFMAC5完善模型。目前的初步FDC模式的典型电子密度提供于图21A中。含有3条链的晶体结构的不对称单元示于图21B中。如图21B所示，FDC(K190E)分子A和B形成具有生物活性的二聚体，并且FDC(K190E)分子

与它的另一不对称单元同伴形成另一二聚体(未示出)。

基于本说明书中所引用的参考文献的教导，最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了本发明主题技术的实施方案的说明，而不应被解释为限制本发明主题技术的范围。本领域技术人员容易地认识到：本发明主题技术涵盖许多其它实施方案。通过引用将本申请中引用的所有出版物、专利、序列(包括由GenBank登记号指明的序列)整体并入本文。对于通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致的范围，本说明书将优先于任何这样的材料。本文的任何参考文献的引证并非承认这样的参考文献是本发明的现有技术。

本领域的技术人员将认识到或使用不超过常规的实验能够确定许多等同于本文所描述的主题技术的具体实施方案。此类等同旨在由所述实施方案所涵盖。

Claims (12)

1.一种包含重组表达的肉桂酸脱羧酶的宿主细胞，其中重组表达的肉桂酸脱羧酶是氨基酸序列示于SEQ ID NO：8的肉桂酸脱羧酶的突变体，所述突变体选自为对应于SEQ IDNO：8第175、190或193位的氨基酸残基突变，其中对应于SEQ ID NO：8的第175位的氨基酸残基位置的突变是异亮氨酸，对应于第193位的氨基酸残基位置的突变是脯氨酸，对应于第190位的氨基酸残基位置的突变选自：谷氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，缬氨酸，天冬酰胺，亮氨酸，组氨酸，脯氨酸和丝氨酸。

2.一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：

（a）使权利要求1的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及

（b）在培养基中培养所述宿主细胞足够时间以产生苯乙烯。

3.权利要求1的宿主细胞，其中重组表达的肉桂酸脱羧酶是重组表达的融合蛋白的部分，所述重组表达的融合蛋白包含含有苯丙氨酸解氨酶的第一域和含有所述肉桂酸脱羧酶的第二域，所述宿主细胞进一步包含膜结合转运蛋白。

4.权利要求3的宿主细胞，其中膜结合转运蛋白为一种细菌ABC转运体。

5.根据权利要求2所述的方法，还包括通过吸收材料吸收所述苯乙烯产物的蒸汽。

6.一种生产苯乙烯的方法，所述方法包括：

（a）使根据权利要求3所述的宿主细胞与可发酵碳底物接触；以及

（b）在培养基中培养所述细胞足够时间以产生苯乙烯。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述吸收材料选自下组：聚合物树脂、活性炭、纤维素材料、以及它们的组合。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述聚合物树脂是一种疏水树脂。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述聚合物树脂选自下组：C18、C8、SDB-L吸附剂树脂、以及它们的组合。

10.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中，所述融合蛋白进一步包括共价连接所述第一域和所述第二域的连接体。

11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中，所述连接体是一种包含2-15个氨基酸的肽连接体。

12.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中，所述肉桂酸脱羧酶由SEQ ID NO:16，SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ IDNO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36或SEQ IDNO: 38所示的序列组成。

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