CN102056944A

CN102056944A - 抗炎症药剂

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Publication number: CN102056944A
Application number: CN2009801210911A
Authority: CN
Inventors: 约瑟夫·玛利亚·亨德里克·拉茨; 雷纳多·杰勒杜斯·希尔瓦诺·齐尔里维
Original assignee: Modiquest BV
Current assignee: Modiquest BV
Priority date: 2008-06-04
Filing date: 2009-06-04
Publication date: 2011-05-11
Also published as: BRPI0913945A2; US20170298146A1; CA2726511A1; JP5528436B2; EP2294086B1; WO2009147201A2; KR101752499B1; EA201001865A1; US20110243945A1; JP2011523555A; DK2294086T3; NO2294086T3; PL2294086T3; EA023302B1; IL209741A0; ES2652127T3; US9718877B2; ZA201008727B; AU2009253923A1; KR20110015035A

Abstract

本发明属于治疗或预防人类和动物炎症的领域，并涉及用于治疗或预防各种炎性病症的药物组合物和方法。具体来说，本发明涉及用于预防或治疗炎性病症例如瓜氨酸相关的炎性疾病的组合物和方法。本发明提供了用于炎性病症的治疗和预防的针对含瓜氨酸表位的特异性结合分子。

Description

抗炎症药剂

发明领域

本发明属于治疗或预防人类和动物炎症的领域，并涉及用于治疗或预防各种炎性病症的药物组合物和方法。具体来说，本发明涉及用于预防或治疗炎性病症例如瓜氨酸相关疾病、优选为炎性疾病的组合物和方法。本发明提供了用于炎性病症的治疗和预防针的对含瓜氨酸表位的特异性结合分子。

发明背景

炎性病症，不论其本质是慢性还是急性的，在医疗保健行业中都是重要的难题。简单来说，慢性炎症被认为持续时间长(数周或数月)的炎症，其中活性炎症、组织破坏和愈合的努力都在同时进行之中(《Robbins疾病病理学基础》(Robbins Pathological Basis of Disease)，R.S.Cotran，V.Kumar和S.L.Robbins主编，W.B.Saunders Co.，p.75，1989)。尽管慢性炎症可以继发于急性炎症发作之后，但是它也能作为隐伏过程开始，随时间而发展，例如作为引起迟发型超敏反应的持续性感染(例如结核病、梅毒、真菌感染)、长时间暴露于内源(例如升高的血脂)或外源(例如二氧化硅、石棉、香烟焦油、外科缝合线)毒素、或抗身体自身组织的自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化、牛皮癣)的结果。

炎性关节炎在发达国家，特别是随着老年个体数量的增加是一种严重的健康问题。例如，一种形式的炎性关节炎——类风湿关节炎(RA)，是一种多系统、慢性、复发性、炎性疾病，影响世界人口的1到2％。

尽管可能影响许多器官，但RA基本上是严重形式的慢性滑膜炎，有时引起患病关节的破坏和关节强直(《Robbins疾病病理学基础》(Robbins Pathological Basis of Disease)，R.S.Cotran，V.Kumar和S.L.Robbins，W.B.Saunders Co.，p.75，1989)。在病理上，这种疾病的特征是滑膜显著增厚从而形成伸出到关节间隙中的绒毛状突起、滑膜细胞内衬多层化(滑膜细胞增殖)、滑膜被白细胞浸润(巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞和淋巴滤泡；被称为“炎性滑膜炎”)，以及纤维蛋白在滑膜内沉积并伴有细胞坏死。作为该过程的结果而形成的组织被称为关节翳(pannus)，并且关节翳最终生长到填满关节间隙。关节翳通过血管发生过程发展出大范围的新血管网，这对于滑膜炎的演化是至关重要的。从关节翳组织的细胞释放出消化酶(基质金属蛋白酶(例如胶原酶、基质溶素))和炎性过程的其他介导物(例如过氧化氢、超氧化物、溶酶体酶和花生四烯酸代谢产物)，导致软骨组织进行性破坏。关节翳侵入关节软骨，导致软骨组织的侵蚀和断裂。最后，所涉及的关节出现软骨下骨骼的侵蚀和纤维性关节强直，并最终出现骨性强直。

一般相信，RA是一种自身免疫疾病，许多不同的关节源性刺激在免疫遗传易感性宿主中激活免疫应答。外源性感染因子(Epstein-Barr病毒、风疹病毒、细胞肥大病毒、疱疹病毒、人类嗜T-淋巴细胞病毒、支原体等)和内源性蛋白例如胶原蛋白、蛋白聚糖、改变的免疫球蛋白和翻译后修饰的蛋白例如瓜氨酸化的蛋白两者，都已被暗示是引发不适当的宿主免疫应答的致病因子。无论引发因子是什么，自体免疫在疾病的发展中都发挥作用。具体来说，相关抗原被抗原呈递细胞(滑膜中的巨噬细胞或树突状细胞)摄入、加工并呈递给T淋巴细胞。T细胞启动细胞免疫应答，并刺激B淋巴细胞增殖和分化成浆细胞。最终结果是产生针对宿主组织的过量的不适合的免疫应答(例如针对II型胶原蛋白的抗体、针对自身IgG的Fc部分的抗体(被称为“类风湿因子”))，以及针对不同的瓜氨酸化表位的抗体(抗CCP抗体)。这进一步放大了免疫应答并加速了软骨组织的破坏。一旦引发这种级联反应，大量软骨破坏的介导物造成了类风湿关节炎的发展。

已经证实，上面提到的抗CCP抗体对于RA高度特异。最近的证据显示，每个对这些抗体血清型阳性的个体要么已经患有RA，要么将在将来发生这种疾病。抗CCP抗体的存在(特别是当高滴度存在时)指示了侵蚀性疾病结果(Nijenhuis等，Clin.Chim.Acta，vol 350，17-34，2004)。此外，已经证实抗CCP抗体在炎症位点处局部产生。在来自RA患者的滑膜材料中发现的抗CCP抗体相对于总IgG的比例，似乎明显高于同样患者的血清中的比例(Masson-Bessière等，Clin Exp Immunol，vol 119，544-552，2000)(Reparon-Schuijt等，Arthritis Rheum，vol 44，41-47，2001)。

滑膜中产抗CCP抗体的浆细胞的存在，表明炎症位点处CCP特异性B细胞的抗原驱动性成熟。抗CCP抗体一旦产生，与滑膜中的瓜氨酸化蛋白形成的免疫复合物可以引发炎性过程的发展。这些以及其他数据支持了这样一种假说，即抗CCP抗体事实上导致了RA的至少一部分疾病症状。抗CCP抗体在RA发病机理中的作用，得到了在患有RA的患者中进行的B淋巴细胞消减实验的结果的支持(Cambridge等，Arthritis Rheum，vol48，2146-2154，2003)。

患有晚期类风湿关节炎的人具有比某些类型的癌症更高的死亡率，因此治疗方案已经转向被设计用于降低不可逆关节损伤的侵占性的早期药物疗法。美国风湿病学会(American College of Rheumatology)最近的推荐意见(Arthritis and Rheumatism 39(5)：713-722，1996)包括对于任何具有确定诊断和进行中的症状的患者早期启动改变疾病的抗风湿病药物(DMARD)疗法。抗癌症药物已变成用于绝大多数患者的一线疗法，其中化疗药物氨甲蝶呤是60到70％的风湿病学家所选的药物。疾病的严重性通常需要无限期地每周使用这种药物进行治疗，并且在尽管使用氨甲蝶呤疗法但疾病仍然发展的患者(超过50％的患者)中，经常使用二线化疗药物例如环孢菌素和硫唑嘌呤(单独或组合地)。

对于能够抑制炎性疾病、特别是其中涉及滑膜的疾病和瓜氨酸相关的炎性疾病的发病机理，用于治疗或预防炎性疾病的化合物，仍存在需求。

发明内容

本发明提供了用于炎性疾病的治疗或预防的与p15和/或p17上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子。

本发明还提供了用于治疗或预防炎性疾病的方法，包含向需要的患者给药治疗有效量的抗炎症组合物的步骤，所述组合物包含与p15和/或p17上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子。

本发明的组合物和方法包括与瓜氨酸残基反应的特异性结合分子的可药用制剂。具体来说，结合分子与本文中所鉴定的被称为p15和p17的两个多肽上的瓜氨酸化表位特异性反应。

在参考了下面的详细描述、图和实施例后，本发明的这些以及其他方面将变得明显。此外，在本文中陈述了各种不同的参考文献，它们对某些过程、装置或组合物进行了更详细描述，因此在此以其全文引为参考。

发明详述

在本文中使用的术语“特异性结合分子”是指能够特异性结合的分子、优选为小分子。就此而言，特异性结合打算是指分子能够与选定的靶分子结合，而它在同样条件下将不结合另一种不相关的靶分子。例如，当结合分子与血清白蛋白结合并且更少或完全不与血清中发现的另一种或优选任何其他蛋白结合时，所述结合分子被称为与血清白蛋白特异性结合。

在本文中，术语“与瓜氨酸特异性反应”或“与瓜氨酸化表位反应”或“与瓜氨酸表位反应”，是指抗体与结构例如含有瓜氨酸残基的肽或肽样分子反应，但是抗体更少或优选完全不与含有精氨酸残基代替瓜氨酸残基的同样结构反应。术语肽或肽样分子应该被解释为这样的结构，其能够将瓜氨酸残基呈递在与本文所述的特异性结合分子具有免疫反应性的正确情形下，优选为其在人类或动物体内所表现出的相同情形下，优选为天然多肽的情形下。

“特异性结合分子”可以是能够特异性结合靶化合物的分子、优选为小分子，由DNA、RNA、肽、蛋白结构域、完整蛋白或其组合或其部分构成。特异性结合分子的优选实例是肽或抗体或其部分，例如单链可变区片段(scFv)、抗原结合区片段(Fab)、单结构域抗体(sdab)也称为VHH抗体、纳米抗体(nanobody)(源自于骆驼的单结构域抗体)、或被称为VNAR的源自于鲨鱼IgNAR的单结构域抗体片段或其其他活性组分、Anticalin或适体(DNA或RNA)。在优选实施方案中，特异性结合分子是包含抗体或适体、例如采取DNA或RNA形式的适体的抗原结合结构域的融合蛋白。在更优选实施方案中，特异性结合分子包含抗体或其衍生物，例如抗体片段、纳米抗体、单结构域抗体或其活性部分。因此，本发明尤其涉及如上所述的作为肽或抗体的特异性结合分子。

术语“抗体”是指能够特异性结合通常被称为“抗原”的靶分子的蛋白或多肽。抗体(也称为免疫球蛋白)是在脊椎动物的血液或其他体液中发现的γ球蛋白，并被免疫系统用来识别和中和外来物体例如细菌和病毒。

抗体典型地由基本结构单元构成，每个结构单元具有两条大的重链和两条小的轻链，以形成例如具有一个单元的单体、具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。抗体由一种被称为B细胞的白细胞产生。存在几种不同类型的抗体重链，以及几种不同类型的抗体，其根据它们所具有的重链分组成不同的同种型。在哺乳动物中已知有五种不同的抗体同种型，它们执行不同功能，并帮助指导针对它们所遇到的每种不同类型的外来物体的适合的免疫应答。某些动物物种例如骆驼(例如美洲驼)和鲨鱼可能具有异常的抗体结构。

尽管所有抗体的通用结构非常相似，但是位于蛋白顶端的小区域极端可变，使数百万具有轻微差异的顶端结构的抗体得以存在。该区域被称为高变区。每个这些变体能够与不同的被称为抗原的靶结合。抗体的这种巨大的多样性允许免疫系统识别同样广泛的抗原多样性。抗原被抗体所识别的独特部分被称为表位。这些表位与它们的抗体以高度特异性的相互作用结合，这允许抗体只识别和结合它们在构成有机体的数百万种不同分子中的独特抗原。抗原被抗体的识别使其带上标签，用于被免疫系统的其他部分攻击。抗体也可以直接中和靶，例如与病原体引起感染所需的部分结合。

抗体的大量和多样性群体，由一组编码不同抗原结合位点(或互补位)的基因区段的随机组合产生，并继之通过该抗体基因区域中的随机突变产生进一步的多样性。抗体基因也在被称为类别转换的过程中重新组织，该过程将重链的基础改变成另一种，产生保留有抗原特异性可变区的不同的抗体同种型。这允许单个抗体被免疫系统的几个不同部分以几种不同的同种型使用。

本文中使用的术语“抗体”包括单链抗体、抗原结合区片段、重组产生的抗体、单克隆抗体、单结构域抗体等。

在抗体或其他特异性结合分子的情形下，术语“或其部分”是指抗体或特异性结合分子，其构成抗体或特异性结合分子的特异性结合位点的部分，并可以被解释为是抗体或特异性结合分子仍然能够与整个抗体或特异性结合分子所反应的相同表位进行反应的部分。

在本发明中可以使用所有种类的特异性结合分子及其衍生物，例如抗体、包含抗体的特异性结合结构域的融合蛋白、适体、抗体片段、单结构域抗体片段、其他蛋白类结合结构域例如anticalin，以及特异性结合瓜氨酸化表位的小分子。但是，人类抗体或其片段是本发明的优选实施方案。优选使用具有IgG1重链和λ轻链的IgG1(例如IgG1λ)抗体。但是，其他人类抗体同种型也被本发明所涵盖，包括与κ或λ轻链组合的IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。此外，所有源自动物的各种不同同种型的抗体也可用于本发明。抗体可以是全尺寸抗体或抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab’)2、单链Fv片段或单结构域VHH、VH或VL单结构域。

“与瓜氨酸化表位反应的特异性结合分子”应该被解释为是在较大结构例如肽或肽核酸或适体或肽模拟结构的情形下，与瓜氨酸残基特异性反应的特异性结合分子。

瓜氨酸是在翻译过程中不掺入到蛋白质中的一种氨基酸，但是，它可以通过精氨酸残基被肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)的翻译后修饰所产生。

瓜氨酸化是由肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD)催化的精氨酸残基向瓜氨酸残基的翻译后转化。肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD；EC 3.5.3.15)催化蛋白中精氨酸残基向瓜氨酸残基的转化。对于瓜氨酸来说不存在tRNA，蛋白中瓜氨酸残基的存在完全是翻译后修饰的结果。在哺乳动物(人类、小鼠和大鼠)中已经鉴定到5种PAD同种型(PAD1-PAD6；“PAD4”和“PAD5”被用于同一个同种型)，各由不同基因编码(Vossenaar等，Bioessays 25，1106-1118，2003)。所有这些酶的活性强烈地依赖于Ca2+的存在，并且不能将游离L-精氨酸转变成游离L-瓜氨酸。游离L-精氨酸可以被真核生物中的氧化氮合酶(EC 1.14.13.39)或细菌中的精氨酸脱亚氨酶(EC 3.5.3.6)转化成游离L-瓜氨酸。这些酶不是Ca2+依赖性的。

高度同源的PAD酶之间的最显著差异是它们的组织特异性表达。在表皮中，PAD1(异名：PAD I、I型PAD)在角质细胞分化的最后阶段中参与角蛋白丝的瓜氨酸化，其对于角质化包膜的重新组织是重要的。表皮中的另一个瓜氨酸化位点是毛囊，其含有PAD3(异名为PAD III、III型PAD)及其天然底物毛透明蛋白(THH)。THH是毛囊的内根鞘细胞和髓质层以及较低程度上其他特化表皮的主要结构蛋白。最近鉴定到的PAD同种型PAD6(异名：ePAD)被发现在小鼠卵母细胞的细胞质片层中，其在早期胚胎发生中发挥重要作用。其人类直系同源物的表达被发现仅限于卵巢、睾丸和外周血白细胞(Chavanas等，Gene vol 330；19-27，2004)。最初，这种PAD同种型被命名为ePAD，但是根据其他PAD的系统编号，这种同种型被重新命名为PAD6(Vossenaar等，Bioessays vol 25 1106-1118，2003)。最广泛表达的同种型PAD2(异名：PAD II、II型PAD、PAD-H19)存在于许多不同组织，例如骨骼肌、脑、脾、分泌腺和巨噬细胞中。尽管具有这种广泛的表达样式，但鉴定到的天然底物只有髓鞘碱性蛋白(MBP)和波形蛋白。在多发性硬化(MS)中，患者发生针对MBP的自身免疫应答。MBP是髓鞘的一种丰富蛋白，其瓜氨酸化发生在中枢神经系统的发育过程中。在钙离子载体诱导的人类和小鼠巨噬细胞的凋亡过程中，观察到了波形蛋白的瓜氨酸化，并且如上所述，已显示瓜氨酸化的波形蛋白是RA特异性抗Sa自身抗体的靶。与上面讨论的都主要位于细胞的胞质中的PAD相反，PAD4同种型(异名：PAD IV、IV型PAD、HL-60PAD、PAD V、V型PAD、PADI4)定位于核中。在PAD4蛋白的N-末端区域中发现了PAD4的核定位信号。PAD4主要表达在外周血粒细胞和单核细胞中。PAD4在核中的底物是组蛋白核心蛋白(H2A、H3和H4)和核仁磷酸蛋白/B23，一种在核糖体组装、核细胞质运输和中心体复制中发挥作用的核仁蛋白。

本发明的特异性结合分子针对p15和/或p17上的瓜氨酸化表位，这两种多肽的特征为其分子量分别为15kDa和17kDa。

已发现这种特异性结合分子特别适合于炎性疾病的治疗或预防。

本文中使用的“炎性病症”或“炎性疾病”是指众多病症或疾病中的任一种，其特征在于血管性变化：浮肿和嗜中性细胞浸润(例如急性炎性反应)；组织被单核细胞浸润；组织被炎性细胞、结缔组织细胞及其细胞产物破坏；以及尝试通过结缔组织替换进行修复(例如慢性炎性反应)。

这种病症的代表性实例包括与瓜氨酸相关的炎性疾病和自身免疫疾病。在本文中，与瓜氨酸相关的炎性疾病被定义为其中瓜氨酸化在疾病的发病机理中发挥作用的疾病。瓜氨酸化在疾病的发病机理中是否发挥作用，可以由本领域技术人员使用本技术领域中可用的常规测试容易地确定。例如，这些疾病的特征可能是在受影响或患病的相关组织中存在异常水平的瓜氨酸化蛋白。这可以通过在其中使用患病组织作为抗原的免疫测试例如western印迹或ELISA来完成，并且抗原的瓜氨酸化可以使用本文所述的抗瓜氨酸化抗体来检测。

或者，本领域技术人员可以使用蛋白质组学应用例如质谱分析来比较来自患病患者的患病和健康组织的瓜氨酸化水平和类型。

疾病也可以通过针对含瓜氨酸的肽或蛋白的免疫应答的存在来定性。这可以是体液或细胞免疫应答，例如由T-细胞或B-细胞介导的应答。用于检测抗瓜氨酸抗体的测试在本技术领域中已被描述并可商购。

因此，本发明涉及用于治疗或预防与瓜氨酸相关的炎性疾病的特异性结合分子。

这样的疾病是例如炎性关节炎包括类风湿关节炎和骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。因此，本发明涉及用于治疗或预防疾病的特异性结合分子，所述疾病选自关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。

具体来说，本发明涉及用于自身免疫疾病、更具体为类风湿关节炎或骨关节炎的治疗或预防的特异性结合分子。

多发性硬化或MS是CNS的慢性炎性病症，其特征为自体免疫介导的髓鞘的破坏。髓鞘的细胞在轴突周围形成由比例约为3∶1的脂类-蛋白复合物构成的多个双层结构。两种主要蛋白MBP和蛋白脂质蛋白，占蛋白部分的85％。MBP是高度阳离子性蛋白，能够与带负电荷的磷脂例如磷脂酰丝氨酸形成强的相互作用。在健康成年人的约18％的MBP分子中，(19个中的)6个精氨酸被瓜氨酸化(Wood等，J Biol Chem，vol264，5121-5127，1989，Wood等，Ann Neurol，vol40，18-24，1996)。剩余的MBP分子不含瓜氨酸。在MS患者中，MBP-cit6的比例增加到总MBP的45％。MBP-cit6的净正电荷减少引起MBP分子的部分解折叠，并减弱了它们与磷脂的相互作用(Boggs等，J Neurosci Res，vol57，529-535，1999，Pritzker等，Biochemistry，vol39，5374-5381，2000)。尽管MBP-cit6与未瓜氨酸化的MBP相比能够更快地形成脂类复合物，但形成的复合物不像未瓜氨酸化的MBP所形成的复合物那样紧密堆积(Boggs等，J Neurosci Res，vol57，529-535，1999，Beniac等，J Struct Biol，vol129，80-95，2000)。与未瓜氨酸化的MBP相比，MBP-cit6被组织蛋白酶D降解的速度快4倍(Cao等，Biochemistry，vol38，6157-6163，1999)。在罕见的急性爆发性MS(Marburg型)病例中，80％的MBP蛋白被严重瓜氨酸化(MBPcit18)(Wood等，Ann Neurol，vol40，18-24，1996)。严重解折叠的MBP-cit18与正常MBP相比被组织蛋白酶D降解的速度快45倍(Cao等，Biochemistry，vol38，6157-6163，1999)。使用抗癌药物紫杉醇(taxol)的活性成分多西紫杉醇(paclitaxel)的临床试验正在进行之中(O’Connor等，Ann Neurol，vol46，470，1999)。低剂量的多西紫杉醇能够在体外抑制MBP被PAD2的瓜氨酸化(Pritzker等，Biochim Biophys Acta，vol1388，154-160，1998)。用多西紫杉醇治疗减弱了临床症状，并诱导受损髓鞘的髓鞘重新形成(Moscarello等，Mult Scler，vol8，130138，2002)，强调了PAD作为脱髓鞘疾病中的候选因子的可能的重要性(Moscarello等，JNeurochem，vol81，335-343，2002)。

在牛皮癣中，角质细胞非常快地增殖，并在仅仅约4天内就从基底层转移到表面。皮肤不能足够快地脱去这些细胞，因此它们积累成厚的、干燥的碎片或斑点。在正常的角质细胞中，角蛋白K1在终端分化过程中被PAD1瓜氨酸化。该过程导致角蛋白丝变得更加紧凑，这对于表皮的正常角质化过程是必需的。在牛皮癣过度增殖性斑中的角质细胞不含瓜氨酸化的角蛋白K1(Ishida-Yamamoto等，J Invest Dermatol，vol1 14，701-705，2000)。还不清楚是增加的细胞增殖阻止了被PAD充分地瓜氨酸化，还是PAD的失活允许角质细胞过度增殖和积累。尽管机制还不了解，但牛皮癣表皮中异常的瓜氨酸化显然与PAD1相关。

在优选实施方案中，本发明的组合物所采用的形式选自水性溶液、凝胶、水凝胶、薄膜、糊剂、霜剂、喷剂、软膏或包扎物。在其他实施方案中，上述方法被用于通过选自关节内、腹膜内、表面、直肠、静脉内、口腔、眼部或肿瘤的切除边缘的途径给药本文所述的组合物。

在某些实施方案中，可药用载体包含至少一种选自下列的载体：助溶剂溶液、脂质体、胶团、胶束、纳晶、纳粒、乳液、微粒、微球、纳球、纳胶囊、聚合物或聚合载体、表面活性剂、悬浮剂、络合剂例如环糊精或吸附性分子例如白蛋白、表面活性粒子和螯合剂。在其他实施方案中，多糖包含透明质酸及其衍生物、葡聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物(例如甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维、醋酸邻苯二甲酸纤维素、醋酸琥珀酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素)、壳聚糖及其衍生物、β-葡聚糖、阿糖基木聚糖、卡拉胶、果胶、糖原、岩藻聚糖(fucoidan)、软骨素、皮肤素、乙酰肝素、肝素、戊聚糖、角质素、藻酸盐、环糊精及其盐和衍生物，包括其酯和硫酸盐。

另一方面，本发明的方法包含将本发明的组合物投送到靶位点、尤其是滑膜关节。

在本发明的一个具体实施方案中，特异性结合分子与单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107竞争与p15和/或p17的结合。

单克隆抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103和RhmAb2.104、RmmAb1.101、RmmAb1.103和RmmAb1.104的可变区的一级mRNA序列已经公开，并在表1中所示的登记号下保存在EMBL数据库中。单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.105和RhmAb2.107的可变区的一级序列在本文中公开在SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42中。

因此，本发明涉及包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的可变区重链或轻链的多肽。本发明还涉及SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42的多肽的编码核酸。

在另一个优选实施方案中，特异性结合分子是选自单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的抗体。

在另一个优选实施方案中，特异性结合分子包含源自于抗体的VH和/或VL结构域，所述抗体选自单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107。

本发明的特异性结合分子基本上可以通过两种方式产生。首先，它们可以源自于本文提出的抗体及其序列。甚至可以通过定点突变、链改组、有性PCR(sexual PCR)或通过本领域技术人员已知的用于抗体衍生和最适化的其他手段，来增加抗体的反应性。或者，特异性结合分子、特别是抗体，可以通过使用任何本文所述的特异反应性表位、特别是PAD4处理的组蛋白2A、肽1(SEQ ID NO：21)和其他特定的反应性肽进行淘选来获得。

就此而言，术语“衍生”是指鉴定到特定抗体中造成VH和/或VL结构域的特异性结合性质的必需残基，然后将这些必需残基转移到另一个肽的背景中。

本领域技术人员可以使用本文描述的序列克隆或产生cDNA或基因组序列，例如在下面的实施例中所描述的。将这些序列克隆在适合的真核表达系统例如pcDNA3(InVitrogen)或其衍生物中，然后与含有适合的轻链和重链的载体相组合双重转染哺乳动物细胞(例如CHO细胞)，将导致所列抗体RhmAb2.101、2.102、2.103、2.104、2.105和/或2.107以及RmmAb1.101、1.102、1.103、1.104的表达和分泌。

通过使用抗体序列的特异性结合结构域并将它们表达在不同背景例如多肽、例如融合蛋白中，本领域技术人员也可以制造本文所描述的特异性结合分子的类似物。这在本技术领域中是众所周知的。

重组的人类和小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体按照实施例1和15中的描述获得。获得的单克隆抗体具有人类IgG1 Fc区(RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107)和小鼠IgG2a Fc区(RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103和RmmAb1.104)。人类和小鼠重组抗体对(RhmAb2.101与RmmAb1.102，RhmAb2.102与RmmAb1.102，RhmAb2.103与RmmAb1.103，以及RhmAb2.104与RmmAb1.104)含有一致的VH和VL结构域，但是分别含有人类IgG1(SEQ ID NO：14)或小鼠IgG2a Fc结构域(SEQ ID NO：20)。在western印迹上对三对小鼠和人类单克隆抗体进行了分析，并发现每对抗体对它们相应的抗原都具有相同的特异性。

小鼠单克隆抗瓜氨酸肽抗体RmmAb13.101、RmmAb13.102和RmmAb13.103从商业来源获得(ModiQuest Research BV Nijmegen，荷兰；目录号MQ13.101、MQ13.102和MQ13.103)。

抗瓜氨酸抗体在实验模型中进行测试，在该模型中通过将抗胶原蛋白抗体注入小鼠诱导了炎症。该模型被称为胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)(Nandakumar和Holmdahl，J Immunol Methods，vol304，126-136，2005)。抗胶原蛋白抗体从商业来源获得(ModiQuest Research BV Nijmegen，荷兰；目录号MQ18.101)。

小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体RmmAb13.101、RmmAb13.102和RmmAb13.103被证实增加了胶原蛋白抗体诱导的关节炎的严重性，正如也被Kuhn等(J.Clin.Invest，vol116，961-871，2006)和Hill等(J Exp Med，vol 205，967-979，2008)所描述的。这显示在图1a和1b中。

此外，在人类患者中进行了几项研究表明，针对瓜氨酸化表位的抗体增加了RA的病理发生(Masson-Bessière等，J.Immunol，vol166，4177-4184，2001；Vossenaar和van Venrooij，Arthritis Res Ther，vol6，107-111，2004)。这显示在图1a和b中，其分别显示了同一个实验的“平均关节炎分值”和“关节炎发生率”。

但是，令人吃惊的是，人类单克隆抗体RhmAb2.104和RhmAb2.105在实验CAIA模型中减轻了关节炎的临床征兆，而RhmAb2.103、RhmAb2.102和RhmAb2.107在实验CAIA模型中甚至消除了关节炎的临床征兆。

RhmAb2.103和RhmAb2.102的表现相同，只有使用RhmAb2.102获得的结果显示在图1c和1d中。使用RhmAb2.105和RhmAb2.107获得的结果显示在图10中。

人类单克隆抗体RhmAb2.101在所使用剂量下对关节炎的临床征兆完全没有影响。在该实验中，使用可商购抗体RhmAb2.201作为无关的抗体对照(ModiQuest Research B.V.，目录号：MQR2.201)。该抗体不识别瓜氨酸化的表位。

也使用等价的小鼠Fc IgG2a单克隆抗体RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103和RmmAb1.104进行了同样的实验，这些抗体含有与它们的人类对应物相同的VH和VL结构域，并且也识别与它们的人类对应物相同的表位。获得了与它们的人类对应物相同的结果。RmmAb1.102、RmmAb1.103和RmmAb1.104消除(RmmAb1.102、RmmAb1.103)或减轻(RmmAb1.104)关节炎的临床征兆，而RmmAb1.101完全没有影响。

图1e和1f显示了独立的CAIA实验，在其中对RhmAb2.102的临床剂量进行了评估。提供最大抑制的最低剂量是0.5mg Ab/小鼠，其对应于IP注射时28mg/kg。

从这些实验可以得出结论，被选自RhmAb2.102、RhmAb2.103、RhmAb2.104、RmmAb1.102、RmmAb1.103、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的单克隆抗体所识别的特异性表位，在炎性疾病的治疗或预防中发挥重要作用。

为了进一步分析这些单克隆抗体所识别的抗原或多种抗原，测试了它们对实施例3中所描述的使用肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD酶)脱亚氨的细胞提取物的反应性。将含有裂解后脱亚氨的hPAD2或hPAD4转染的COS-1裂解物的Western印迹，与单克隆抗体RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104温育。观察到只有与RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104温育的条板，才显示出与分子量约为15和17千道尔顿的双重蛋白的反应性。

WO 2004/078098公开了对瓜氨酸化肽/II类MHC复合物特异的抗体，用于抑制T细胞活化。这些抗体不结合单独的肽或II类MHC分子，而是只结合肽与II类MHC分子的复合物。本文公开的抗体与WO2004/078098中公开的抗体不同，因为正如本文中所公开，它们识别单独的肽和蛋白。此外，抗体识别western印迹中可能不是肽与II类MHC分子之间的复合物的多肽，因为MHC分子与瓜氨酸化肽之间的复合物在免疫印迹过程中使用的SDS凝胶的还原性条件下永远不能残存。因此，本文公开的结合分子所识别的表位与WO 2004/078098中公开的抗体不同。此外，本文公开的抗体不与肽和II类MHC分子的复合物特异性反应。

上面描述的实验和考虑引导我们得出结论，在预防炎性疾病的临床征兆的能力和与p15和p17上瓜氨酸化表位的反应性之间，存在明显的相关性。

当在免疫沉淀实验中使用人类单克隆抗体RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104以及小鼠单克隆抗体RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103和RmmAb1.104时获得了类似的数据，正如在实施例5中详细描述的。

使用RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103和RmmAb1.103在人类PAD2和PAD4脱亚氨的COS-1裂解物上进行的免疫沉淀显示出了明显的p15和p17蛋白条带。当使用RhmAb2.104和RmmAb1.104进行免疫沉淀时，这些条带的显著性略微降低。

因此，识别p15和p17蛋白的强度似乎与这些抗体的治疗性质很好地相关(图1a-d)。

抗体与p15或p17是否反应，可以通过如实施例4和5中所详述的进行免疫沉淀或western印迹分析容易地确定。或者，可以使用如实施例6中所述的含有脱亚氨的COS-1裂解物的Western印迹或纯化的脱亚氨p15和/或p17蛋白，在Western印迹或ELISA中进行与RhmAb2.102、RhmAb2.103或RhmAb2.104的竞争实验。

正如在实施例7中详述的，通过基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对蛋白p15和p17进行了进一步表征。因为非洲绿猴的基因组还没有完全测序，因此我们筛选了所有其他哺乳动物基因组寻找与使用MALDI-TOF MS所发现的肽的同源性。所发现的具有高度同源性的蛋白被证明是组蛋白。这显示在表3(实施例7)中。

因此，本发明还涉及与组蛋白上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，用于炎性疾病的治疗或预防。

通过PAD的酶学作用使组蛋白瓜氨酸化已被证实，因此可以在体外非常好地生产瓜氨酸化组蛋白。然后可以将这些瓜氨酸化组蛋白在酶结合测定法中用作底物，以筛选和选择其他与瓜氨酸化p15和p17、即组蛋白上的表位反应的特异性结合分子，例如肽和抗体。优选情况下，选择与抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104和RhmAb2.105和RhmAb2.107竞争与p15和/或p17结合的特异性结合分子。

在本文件及其权利要求书中，动词“包含”及其各个变化形式以其非限制性的意义使用，意味着包括了该词之后的条目，但是并不排除没有具体提到的条目。此外，由单数形式指称的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个并且只有一个要素。因此，单数形式的指称通常意味着“至少一个”。

为了进一步分析哪种或哪些脱亚氨组蛋白参与RhmAb2.102和RhmAb2.104的治疗作用，使用人类肽酰精氨酸脱亚氨酶(PAD，EC3.5.3.15)(huPAD2或huPAD4)对可商购的组蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4)进行了脱亚氨。将脱亚氨以及未脱亚氨的组蛋白包被在96孔ELISA板上，并与连续稀释的RhmAb2.101、RhmAb2.102和RhmAb2.104温育。结果显示在表6和图2中。

从图2中显示的结果可以明显看出，huPAD4脱亚氨的组蛋白2A(H2A/p4)被治疗性抗体RhmAb2.102和RhmAb2.104最好地识别，但是不被RhmAb2.101识别(图2a、2b和2c)。此外，如果与RhmAb2.104相比，RhmAb2.102对H2A/p4具有较高亲和性(图2b和2c)。这些数据与这些抗体在实验CAIA模型中对关节炎的临床征兆的影响关联性良好，其中RhmAb2.102消除、RhmAb2.104减轻了关节炎的临床征兆，而RhmAb2.101对其没有影响(图1c和1d)。

因此，我们显示，H2A/p4上的脱亚氨表位或其结构模拟物在RA炎性级联反应中发挥关键作用。对于H3/p2、H4/p2和H4/p4上的脱亚氨表位也同样如此，因为RhmAb2.102与RhmAb2.104和RhmAb2.101相比，显示出对这些组蛋白的更高的亲和性(图2a、2b和2c)。

模拟物是例如具有可接受水平的等效活性的分子，所述等效活性在这种情况下包括以与RhmAb2.104和RhmAb2.101相比更高的亲和性被RhmAb2.102识别。

因此，本发明涉及如上所述的特异性结合分子，其与人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A或组蛋白4或人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4或组蛋白H3上的瓜氨酸化表位反应。

为了进一步精确定位H2A上被RhmAb2.102和RhmAb2.104识别的精确瓜氨酸化表位，合成了含有所有13种可能的组蛋白2A脱亚氨位点的生物素标记的肽(表4)。将这些肽包被在96孔中性链亲和素-ELISA板上，并与连续稀释的RhmAb2.101、RhmAb2.102和RhmAb2.104温育。结果显示在图3中。

已经观察到肽1(AAASGXGKQGGK)被治疗性抗体RhmAb2.102和RhmAb2.104识别，但是不被RhmAb2.101识别(表4和图3a、3b和3c)。同样地，如果与RhmAb2.104相比，RhmAb2.102显示了更高的亲和性(图3b和3c)。对于肽4和6上的脱亚氨化表位也同样如此(表4)，因为与RhmAb2.104和RhmAb2.101相比，RhmAb2.102对这些肽显示出更高的亲和性(图2a、2b和2c)。此外，我们显示，肽1、4和6上的脱亚氨化表位或其结构等效物或模拟物在RA炎性级联反应中发挥重要作用。该抗体识别样式与H2A/p4的识别样式非常相似。因此，我们得出结论，本发明的特异性结合分子也可以由它们对肽1、4和6、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：26的反应性分别定义。每种这些肽单独地可以用于产生特异性结合分子，例如本发明的抗体。然后对这些抗体针对如本文所公开的任何其他抗原进行筛选以使反应性最适化。

表4：组蛋白2A含瓜氨酸肽

肽编号	序列ID NO：	氨基酸序列
			1	SEQ ID NO：21	A A A S G X G K Q G G K
2	SEQ ID NO：22	A K A K S X S S R A G L
			3	SEQ ID NO：23	K S R S S X A G L Q F P
4	SEQ ID NO：24	Q F P V G X V H R L L R
			5	SEQ ID NO：25	V G R V H X L L R K G N
6	SEQ ID NO：26	V H R L L X K G N Y S E
			7	SEQ ID NO：27	G N Y S E X V G A G A P
8	SEQ ID NO：28	A G N A A X D N K K T R
			9	SEQ ID NO：29	D N K K T X I I P R H L
10	SEQ ID NO：30	T R I I P X H L Q L A I
			11	SEQ ID NO：31	L Q L A I X N D E E L N
12	SEQ ID NO：32	N K L L G X V T I A Q G

X表示瓜氨酸残基

也试验了生物素标记的并含有瓜氨酸的纤维蛋白原和波形蛋白肽(表5)与治疗性抗体的反应性。将肽包被在96孔中性链亲和素-ELISA板上。随后向包被的板施加RhmAb2.101、RhmAb2.102和RhmAb2.104的连续稀释液。结果显示在表8和图4中。

表5：纤维蛋白原和波形蛋白含瓜氨酸肽

肽名称	SEQ ID NO：	氨基酸序列
			msFibαXH	SEQ ID NO：33	LSEGGGVRGPRVVEXHQSQCKD
msFibαXG	SEQ ID NO：34	LSEGGGVXGPRVVERHQSQCKD
			huFibαXH	SEQ ID NO：35	LAEGGGVRGPRVVEXHQSACKD
huFibαXG	SEQ ID NO：36	LAEGGGVXGPRVVERHQSACKD
			msFibβXG	SEQ ID NO：37	EPTDSLDAXGHRPVDRR
msVim XS/XL	SEQ ID NO：38	YVTXSSAVXLXSSVP

X＝瓜氨酸

观察到了小鼠纤维蛋白原β肽(SEQ ID NO：37)被RhmAb2.101、RhmAb2.102和RhmAb2.104(图4a、4b和4c)所识别。同样，如果与RhmAb2.104相比，RhmAb2.102显示出更高的亲和性，并且RhmAb2.104的性能比RhmAb2.101略好(图4a、4b和4c)。该抗体识别样式与上样有huPAD2和HuPAD4脱亚氨化的人类纤维蛋白原的Western印迹上所观察到的样式相似。此外，只有RhmAb2.102识别小鼠波形蛋白肽(实施例10)。很有可能除了上面提到的肽之外，肽msFibβ(SEQ ID NO：37)和msVim(SEQ ID NO：38)上的脱亚氨化表位也在RA炎性级联反应中发挥重要作用。但是，由此不能排除纤维蛋白原和波形蛋白上的其他表位也在我们的治疗性抗体的抗炎效应中发挥作用。

因此，本发明还涉及如上所述的与肽msFibβ或msVim(SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38)上的表位特异性反应的特异性结合分子及其应用。

此外，我们显示，在发炎组织中瓜氨酸化表位似乎是从无到有的。在类风湿关节炎的实验小鼠模型中，我们能够显示，来自患病小鼠的发炎前爪的瓜氨酸化的肽可以使用人类单克隆抗体102(RhmAb2.102)进行免疫沉淀。

因此，进行了典型的CAIA实验，其中在第0天对小鼠(每组3只小鼠)腹膜内注射8种抗胶原蛋白抗体(2.8mg/小鼠)的混合物。三天后，小鼠接受另一次含有25μg LPS的腹膜内注射。如上所述进行打分。在该实验过程中，每天处死一组小鼠，并通过Western印迹分析和免疫组织化学技术分析爪中瓜氨酸的存在。

对于每组小鼠，收集前爪并制备提取物。对这些提取物进行免疫沉淀(IP)，每个IP使用20微克RhmAb2.102。对沉淀物进行SDS-PAGE电泳，并通过Western印迹技术转移到硝酸纤维素膜上。将印迹首先用丽春红S染色以检测全部蛋白。进行丽春红S染色以验证对于每个IP来说使用了同样量的抗体。可以观察到同样量的显著的抗体重链和轻链。

随后，将印迹上出现的瓜氨酸残基按照Senshu等的方法进行化学修饰(Senshu等，Anal Biochem，vol 203，94-100，1992)。然后可以使用识别瓜氨酸残基的化学修饰的抗体使化学修饰可视化(Senshu等，Anal Biochem，vol 203，94-100，1992)。在本实验中使用脱亚氨化的纤维蛋白原作为阳性对照。在这些实验中，使用无提取物的免疫沉淀作为阴性对照。

从第4天起，在印迹上对应于分子量为50、15和17千道尔顿的蛋白的位置处出现显著条带。这些条带在第5天变得更明显，在第6天最强。

实验的关节炎发病率是100％，在第6天时小鼠的常规关节炎分值达到5+(图5A和5B)。沉淀的蛋白的量随时间增加，这可以从第4到6天时观察到。根据RhmAb2.102的瓜氨酸特异性以及使用抗化学修饰瓜氨酸抗体获得的印迹上的信号的出现，我们可以得出结论，进行CAIA的小鼠在它们的发炎关节中具有可检测的瓜氨酸水平。

对于同样小鼠的后爪也进行了免疫组织化学分析。将玻片与RhAb2.104温育。结果与Western印迹分析相符。在第4到6天的样品中可以在表观分子量约为50、15和17千道尔顿的蛋白上检测到修饰的瓜氨酸，这允许我们得出结论，在发炎的关节中、在这种情况下是实验诱导的关节炎小鼠的后爪中，与RhmAb2.102反应并可免疫沉淀的瓜氨酸化表位似乎是从无到有的。

在上述的CAIA实验中，在抗胶原蛋白抗体注射后第3天，当小鼠爪中的炎症仍然未出现或非常低时，注射抗瓜氨酸抗体。这阻止了临床症状的发生，因此可用作肿胀的治疗、特别是预防性治疗。

因此，我们想研究RhmAb2.102是否也能在临床症状已经发生后治愈它们。这通过在抗胶原蛋白抗体注射后第7天，当所有小鼠的所有4只爪的平均关节炎分值达到约为4的任意值时治疗动物来进行。正如图6A和6B中所示，RhmAb2.102不能消除观察到的肿胀，而是使已有的炎症/肿胀稳定。对动物跟踪35天，这以后安慰剂和RhmAb2.102治疗的小鼠中的炎性分值相等(图6B和实施例12)。图6A显示了每个组的所有爪的平均关节炎分值，而图6B显示了在第35天时已被用于组织学分析的动物的右后爪的平均关节炎分值。

对所有动物的右后爪进行了组织学分析，以便研究在第7天时的RhmAb2.102治疗是否能够保护小鼠免于永久性关节损伤(图7)。图7A显示了在实验的第35天时，右后爪中肉眼可见的炎症在实验组之间是相似的。但是，最令人吃惊的是，关节侵蚀的所有已知参数都降低了。当对炎性细胞流入(D)、软骨侵蚀(B)、软骨PG消耗(E)、软骨细胞死亡(F)和骨侵蚀(C)进行打分时，在第7天时用RhmAb2.102处理过的实验组中观察到了显著降低，表明RhmAb2.102对于在炎症过程中防止关节损伤具有强的治疗性潜力(实施例12)。因此，本发明涉及通过向需要这种治疗的患者给药本文所述的结合分子来预防或治疗关节损伤的方法。

此外，进行了CAIA实验以调查分别在第5、6和7天时用RhmAb2.102治疗的治疗性效应(图8)。在本实验中，RhmAb2.102通过静脉内注射，以便将抗体快速投送到炎症位点。在本实验中，包含了在第3天时的预防性治疗和未治疗的对照组。实验步骤如实施例12中所述进行，唯一的区别是在第3、5和6天对每只小鼠注射1mgRhmAb2.102。正如预期，第3天时的RhmAb2.102抑制了炎性反应。与图6中所看到的相同，在第5、6或7天通过静脉内注射RhmAb2.102治疗小鼠，使炎症稳定(图8)。值得注意的是，炎症的征兆没有减轻，而关节侵蚀的所有参数降低。这显示关节侵蚀和炎症是两个独立的实体，可以分开进行治疗。

在接下来的一系列CAIA实验中，我们调查了使用地塞米松降低炎症水平，以及在地塞米松治疗停止后通过在第5、6或7天(图9)与地塞米松同时注射RhmAb2.102来防止炎症复发的可能性。

地塞米松是通用炎症抑制剂，需要在每日基础上给药。一旦治疗中断，炎症就复发。实验步骤如实施例12中所述进行，区别在于在抗胶原蛋白抗体注射后第5天(图9A)、第6天(图9B)和第7天(图9C)静脉内注射1mg RhmAb2.102，并同时腹膜内注射地塞米松(2mg/kg)。地塞米松连续给药2或3天，直到爪中的肿胀消失。其他组的动物只接受地塞米松腹膜内注射。如图9中所示，在没有接受RhmAb2.102的小鼠中炎症重新消失。但是，形成强烈对比的是，当地塞米松与RhmAb2.102组合时，与只用地塞米松治疗的小鼠相比，炎症复发更加温和并发生得更晚。这在第6或7天时(图9B和C)开始RhmAb2.102/地塞米松组合治疗的情况下最为明显。图9中显示的实验证实了炎性疾病的一种新的治疗方法，其中可以使用炎症抑制剂例如地塞米松来治疗炎症的爆发，并可以使用RhmAb2.102阻止炎症复发，以及更重要的是防止组织/关节损伤的发生。因此，本发明涉及通过与本文所述的结合分子一起同时给药炎症抑制剂，来治疗炎症和关节损伤的方法。

在另一个CAIA实验中，对于2种新的与RhmAb2.102在其与RhmAb2.101的鉴别抗原上显示出交叉反应性的抗瓜氨酸抗体(RhmAb2.105和RhmAb2.107)的抗炎症效果，进行了测试。在独立的实验组中，在抗胶原蛋白抗体注射后第3天静脉内注射(1mg/小鼠)RhmAb2.105、RhmAb2.107和RhmAb2.102(阳性对照)(图10)。实验步骤如实施例12中所述进行。图10显示了每个组的所有爪的平均关节炎分值。

看起来，RhmAb2.102显示出最高的抗炎症效应。RhmAb2.107的性能几乎与RhmAb2.102相同，并且RhmAb2.105显示出与以前对RhmAb2.104(图1C)所观察到的类似的中等效果。

通过质谱分析鉴定到了优选与RhmAb2.102结合的其他脱亚氨化蛋白。此外，通过其他质谱分析，鉴定到了优选与RhmAb2.102结合并且不或在较低程度上与RhmAb2.101结合的脱亚氨化蛋白。将人类PAD4脱亚氨化的人类胚胎肾细胞(HEK293)裂解液用RhmAb2.101或RhmAb2.102免疫沉淀(实施例13)，然后进样到与先进的高效LTQ傅里叶变换离子回旋共振质谱偶联的高通量纳米LC系统(nLC LTQ FTMS ULTRA)(实施例14)。它的超高质量分辨率、质量准确性和灵敏度与指数修正的蛋白丰度指数(emPAI)计算的组合，使我们能够鉴定(优选)与RhmAb2.102结合的脱亚氨化蛋白。这显示在表7(实施例13和14)中。

因此，本发明还涉及用于炎性疾病的预防或治疗的与表7中所显示的任何蛋白或多肽特异性反应的结合分子。

概括来说，我们在本文中显示，与选自p15、p17的分子上的表位，更具体为人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，或选自表7的蛋白的蛋白、更具体为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽表位特异性反应的结合分子，可用于治疗或预防本文中所指定的炎性疾病。给定的结合分子是否与上面提到的分子特异性反应，可以通过分析结合分子与选自RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的抗体竞争与p15或p17上的表位或任何上面提到的瓜氨酸化表位的结合的能力，来容易地确定。

在显示了本发明的结合组合物的效能之后，对于本领域技术人员来说，显然也可以通过在患者自己身体内(在体内)引发产生本发明的特异性结合分子的免疫应答，来治疗或预防炎性疾病。可以产生这样的免疫应答以防止炎性疾病的发生(预防、预防性疫苗)或改善或降低炎性疾病的结果，即治疗。

因此，本发明还涉及通过在体内引发免疫应答来预防或治疗炎性疾病的方法，其中产生了与选自下列的表位反应的特异性结合分子：p15、p17上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

本发明的疫苗或疗法可以有效地包含与本发明的结合分子特异性反应的瓜氨酸化表位。更具体来说，瓜氨酸化表位可以是人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A或组蛋白4、或人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，或选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

因此，可以治疗或预防许多与瓜氨酸相关的炎性疾病。因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中炎性疾病选自自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。特别优选的是预防或治疗自身免疫疾病例如类风湿关节炎。

因为本发明的实施方案涉及体内免疫应答，因此优选的特异性结合分子是抗体。

附图说明

图1：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型测试了8种单克隆抗体对关节炎症状的严重性的影响。显示了平均关节炎分值(图1a、1c和1e)和关节炎发病率(图1b、1d和1f)。对每组5-6只小鼠在第0天时通过腹膜内注射抗胶原蛋白抗体进行处理。在图1a和1b中显示的实验中使用的小鼠接受了1.6mg抗胶原蛋白抗体混合物，而在图1c-f中使用的小鼠接受2.4mg。在第3天，通过腹膜内注射将LPS(25μg/小鼠)与抗瓜氨酸抗体或对照抗体(RhmAb2.201)一起给药。除非在图中另有说明，否则所有抗体以1mg/小鼠的量给药。对动物每天进行评分，直到第13天。抗体RhmAb2.102和RhmAb2.103的性能相同地良好，因此只显示了RhmAb2.102。对于抗体RmmAb1.102和RmmAb1.103也是如此；它们的性能相同地良好，因此只显示了RmmAb1.102。

图2：使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试了a)RhmAb2.101、b)RhmAb2.102和c)RhmAb2.104对用huPAD2或huPAD4脱亚氨化的人类重组组蛋白(H1、H2A、H2B、H3和H4)的亲和性。将脱亚氨化以及未脱亚氨化的组蛋白固定化在96孔ELISA板上(0.3μg/孔)。将CFC-1和CFC-0以同样浓度包被，分别用作特异性抗瓜氨酸抗体反应性的阳性和阴性对照，并作为包被对照。未包被的孔被用于测试抗体的非特异性结合。将包被的孔与范围从10μg/孔向下直到0.000128μg/孔的抗体系列稀释液在室温下温育1小时(z-轴)。通过将孔与兔抗人HRP抗体(1∶2000)在室温下温育1小时，然后与TMB底物温育，来进行结合的抗瓜氨酸抗体的检测。得到的OD(y-轴)是抗体结合的度量。H1＝重组组蛋白1；H1/p2＝huPAD2重组组蛋白1；H1/p4＝huPAD4重组组蛋白1，依此类推(x-轴)。

图3：使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试了a)RhmAb2.101、b)RhmAb2.102和c)RhmAb2.104对源自于人类组蛋白H2A的含瓜氨酸肽的亲和性。将生物素和源自于组蛋白2A的含瓜氨酸肽固定化在中性链亲和素包被的96孔ELISA板上(0.3μg/孔)。将CFC-1和CFC-0以同样浓度包被，分别用作特异性抗瓜氨酸抗体反应性的阳性和阴性对照，并作为包被对照。未包被的孔被用于测试抗体的非特异性结合。将包被的孔与范围从10μg/孔向下直到0.000128μg/孔的抗体系列稀释液在室温下温育1小时(z-轴)。通过将孔与兔抗人HRP抗体(1∶2000)在室温下温育1小时，然后与TMB底物温育，来进行结合的抗瓜氨酸抗体的检测。得到的OD(y-轴)是抗体结合的度量。

图4：使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测试了a)RhmAb2.101、b)RhmAb2.102和c)RhmAb2.104对源自于纤维蛋白原和波形蛋白的含瓜氨酸肽的亲和性。将生物素和源自于纤维蛋白原和波形蛋白的含瓜氨酸肽固定化在中性链亲和素包被的96孔ELISA板上(0.3μg/孔)。将CFC-1和CFC-0以同样浓度包被，分别用作特异性抗瓜氨酸抗体反应性的阳性和阴性对照，并作为包被对照。未包被的孔被用于测试抗体的非特异性结合。将包被的孔与范围从10μg/孔向下直到0.000128μg/孔的抗体系列稀释液在室温下温育1小时(z-轴)。通过将孔与兔抗人HRP抗体(1∶2000)在室温下温育1小时，然后与TMB底物温育，来进行结合的抗瓜氨酸抗体的检测。得到的OD(y-轴)是抗体结合的度量。

图5：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型研究了瓜氨酸在爪中的出现。将每组3只小鼠在第0天通过腹膜内注射2.8mg抗胶原蛋白抗体进行处理，然后在第3天附加地腹膜内注射LPS(25μg/小鼠)。在图5A和5B中分别显示了平均关节炎分值和关节炎发病率。

图6：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型测试了在抗胶原蛋白抗体注射后第7天提供RhmAb2.102的治疗效果。显示了所有爪的平均关节炎分值(图6A)和右后爪的平均关节炎分值(图6B)。将每组5只小鼠在第0天通过腹膜内注射2.8mg抗胶原蛋白抗体进行处理。在第3天通过腹膜内注射给药LPS(25μg/小鼠)，并且在第7天通过同样途径注射RhmAb2.102(1mg/小鼠)或安慰剂。对动物每天进行评分，直到第35天。观察到RhmAb2.102至少使已存在的炎症稳定。

图7：对在第7天用RhmAb2.102或安慰剂进行处理的所有CAIA动物的右后爪的苏木精/曙红和番红O染色的组织玻片进行组织学分析(图7)。在染色的组织玻片上对下列参数进行评分(0-3的任意等级)：软骨侵蚀(B)，骨侵蚀(C)，炎性细胞流入(D)，软骨PG消耗(E)和软骨细胞死亡(F)。图7A显示了在实验的最后一天(第35天)时，实验组之间的右后爪中肉眼可见的炎症。每个点表示单个动物。水平线指示实验组内的平均分值。可以得出结论，RhmAb2.102注射保护小鼠免于永久性关节损伤。

图8：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型测试了在抗胶原蛋白抗体注射后第3、5、6和7天提供RhmAb2.102的治疗效果。将每组5只小鼠在第0天通过腹膜内注射2.8mg抗胶原蛋白抗体进行处理。在第3天通过腹膜内注射给药LPS(25μg/小鼠)。在第3、5、6或7天静脉内注射RhmAb2.102(1mg/小鼠)。对动物每天进行评分，直到第19天。图显示了每个实验组的平均关节炎分值。可以再次得出结论，RhmAb2.102至少使炎症稳定在治疗开始时的水平。菱形：对照，圆形：第7天，空心圆形：第6天，正方形：第5天，三角形：第3天。

图9：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型测试了在抗胶原蛋白抗体注射后第5、6和7天(分别为图A、B和C)在地塞米松治疗的同时提供RhmAb2.102的治疗效果。将每组5只小鼠在第0天通过腹膜内注射2.8mg抗胶原蛋白抗体进行处理。在第3天通过腹膜内注射给药LPS(25μg/小鼠)。在第5、6或7天，与第一剂地塞米松同时静脉内注射RhmAb2.102(1mg/小鼠)，其中地塞米松(2mg/kg)被连续地(腹膜内)给药2-3天，直到肉眼可见的肿胀消失。其他动物组只腹膜内注射地塞米松。

对动物每天进行评分，直到第21天。图显示了每个实验组的平均关节炎分值。

可以发现，RhmAb2.102与地塞米松的组合治疗导致肿胀的急剧降低，并且与没有接受RhmAb2.102的小鼠相比，炎症仅仅缓慢并轻度地重新出现。形成强烈对比的是，当只向动物给药地塞米松时，与地塞米松/RhmAb2.102组合治疗的小鼠相比，炎症的复发要强烈和快得多。

菱形：对照，三角形：从第5天起每天只使用地塞米松，正方形：从第5天起每天使用地塞米松加RhmAb2.102。

图10：使用胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)模型测试了在抗胶原蛋白抗体注射后第3天提供RhmAb2.102、RhmAb2.105和RhmAb2.107的抗炎症效果。显示了所有爪的平均关节炎分值(图10A)和仅仅后爪的平均关节炎分值(图10B)。将每组5只小鼠在第0天通过腹膜内注射2.8mg抗胶原蛋白抗体进行处理。在第3天通过腹膜内注射给药LPS(25μg/小鼠)，并且在同一天通过静脉内注射进行了RhmAb2.102、RhmAb2.105和RhmAb2.107(1mg/小鼠)或安慰剂注射。对动物每天进行评分，直到第14天。

RhmAb2.102引起了最高的抗炎症效果。当只检查后爪的平均关节炎分值时，RhmAb2.102、RhmAb2.105和RhmAb2.107在抗炎症效果方面性能相似。

菱形：对照，三角形：RhmAb2.102，正方形：RhmAb2.105，圆形：RhmAb2.107。

实施例

实施例1：重组人类和小鼠单克隆抗体

针对RA患者的瓜氨酸化抗原的单克隆抗体，最初通过噬菌体展示按照文献描述进行筛选(Raats等，J Reumatology，vol30，1696-711，2003)。简单来说，从三位RA患者的所有B-细胞组成部分分离出其自身抗体全部组成部分，并用于产生抗体片段文库。按照WO98/22503中的描述，将这些文库针对瓜氨酸化环肽CFC1-cyc进行四轮亲和筛选。基于与CFC1-cyc的强反应性和与未瓜氨酸化的CFC0-cyc的反应性缺失来筛选抗体克隆(WO98/22503)。

按照Stemmer等的描述(Gene，vol164，49-53，1995)合成了Raats等(J Reumatology，vol30，1696-711，2003)所述的抗体编码序列，然后将其克隆到编码人类和小鼠抗体同种型的哺乳动物表达载体中。人类抗体是IgG1λ同种型的，并被命名为RhmAb2.101、RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104。小鼠抗体是IgG2aκ同种型的，并被命名为RmmAb1.101、RmmAb1.102、RmmAb1.103和RmmAb1.104。

RhmAb2.101按照Stemmer等的方案(Gene，voll64，49-53，1995)根据克隆Ra3的序列(Raats等，J Reumatology，vol30，1696-711，2003)合成，并由源自于种系家族3-21的VH与源自于种系家族λ1b的VL组合构成。RhmAb2.103按照Stemmer等的方案(Gene，vol164，49-53，1995)根据克隆A2-2的序列(Raats等，J Reumatology，vol30，1696-711，2003)合成，并由源自于种系家族3-23的VH与源自于种系家族λ1a的VL组合构成。RhmAb2.104按照Stemmer等的方案(Gene，vol164，49-53，1995)合成，并由源自于种系家族4-b的VH与源自于种系家族λ1c的VL组合构成。

RhmAb2.102按照Stemmer等的方案(Gene，vol164，49-53，1995)合成，并包含SEQ ID NO：8编码的免疫球蛋白重链与SEQ ID NO：9编码的免疫球蛋白轻链的组合。SEQ ID NO：8编码的免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO：12的小鼠前导球蛋白，然后是SEQ ID NO：13的抗体重链可变区，然后是SEQ ID NO：14的免疫球蛋白恒定结构域人类IgG1。SEQ ID NO：9编码的免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO：12的小鼠前导球蛋白，然后是SEQ ID NO：15的抗体轻链可变区，然后是SEQID NO：16的免疫球蛋白人类λ恒定结构域。

RmmAb1.102按照Stemmer等的方案(Gene，vol164，49-53，1995)合成，并包含SEQ ID NO：10编码的免疫球蛋白重链与SEQ ID NO：11编码的免疫球蛋白轻链的组合。SEQ ID NO：10编码的免疫球蛋白重链包含SEQ ID NO：12的小鼠前导球蛋白，然后是SEQ ID NO：19的抗体重链可变区，然后是SEQ ID NO：20的免疫球蛋白恒定结构域小鼠IgG2a。SEQ ID NO：11编码的免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO：12的小鼠前导球蛋白，然后是SEQ ID NO：17的抗体轻链可变区，然后是SEQ ID NO：18的免疫球蛋白小鼠κ恒定结构域。

单克隆抗体RhmAb2.101、RhmAb2.103和RhmAb2.104、RmmAb1.101、RmmAb1.103和RmmAb1.104的可变结构域(VH和VL)的一级mRNA序列已经公布，并在表1中所显示的登记号下保存在EMBL数据库中。使用与抗体RhmAb2.102和RmmAb1.102相同的前导和恒定区人类或小鼠结构域，产生了全尺寸的人类和小鼠抗体序列。

表1

抗瓜氨酸化纤维蛋白原的对照抗体RmmAb13.101、RmmAb13.102和RmmAb13.103，以及抗人类U1-70k蛋白的凋亡40kD切割产物的对照抗体RhmAb2.201，从Modiquest Research BV公司(Schoutstraat 58，6525 XV Nijmegen，荷兰)商购(目录号为MQ13.101、MQ13.102、MQ13.103和MQR2.201)。

实施例2：用于炎症的实验模型

使用来自ModiQuest Research B.V公司(目录号MQ18.101)的可商购的胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型，按照制造商的说明书在小鼠中诱导了关节炎(http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG％20_2007.08 .22.pdf)。为此，在第0天，对8周龄的雄性DBA/J1小鼠(5-6只小鼠/组)腹膜内注射8种抗胶原蛋白抗体的混合物。(在图1a和1b中使用的小鼠接受1.6mg抗胶原蛋白抗体混合物，而在图1c-f中使用的小鼠接受2.4mg)。在第3天，小鼠接受另一次腹膜内注射，包含25μgLPS与1mg抗瓜氨酸抗体的混合物(除非另有指明)。LPS激起炎症。每天对动物爪中炎症的征兆进行评分，直到实验的第13天。评分按照表2进行。每只小鼠的最大关节炎分值是8。

小鼠单克隆抗瓜氨酸抗体RmmAb13.101、RmmAb13.102和RmmAb 13.103被证实能够增加胶原蛋白抗体诱导的关节炎的严重性。这些抗体的混合物具有甚至更显著的反应。这基本上证实了抗瓜氨酸抗体能够增强/诱导关节炎的较早期结果(Kuhn等，J.Clin.Invest，vol116，961-871，2006；Hill等，J Exp Med，vol205，967-979，2008)。这些结果显示在图1a和b中，它们分别显示了同样实验的“平均关节炎分值”和“关节炎发病率”。

但是，人类单克隆抗体RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104令人吃惊地在实验CAIA模型中减轻或甚至消除了关节炎的临床征兆(图1c和1d)。RhmAb2.102和RhmAb2.103减轻关节炎征兆的效果最好，而RhmAb2.104将炎症减轻约50％。RhmAb2.101在试验剂量下完全没有影响。

表2

1-2个肿胀的脚趾	0.25
		3-4个肿胀的脚趾	0.50
轻微肿胀的脚垫或脚踝	0.50-0.75
		肿胀的脚垫或脚踝+/-脚趾	1.00
肿胀的脚趾+轻微肿胀的脚垫	1.25
		肿胀的脚趾+肿胀的脚垫	1.5
肿胀的脚垫+肿胀的脚踝	2.00

在抗胶原蛋白抗体注射后第3天给药抗瓜氨酸抗体的决定是基于本文上面描述的实验的结果，这些实验显示，在患有实验诱导的关节炎的小鼠的爪中，瓜氨酸化表位约在第4天出现。

实施例3：脱亚氨化细胞提取物的制备、SDS-page电泳和western 印迹

使用AMAXA核转染装置(程序D-005)与V-试剂盒一起，将COS-1细胞(8·10⁵)用2μg huPAD2或huPAD4表达载体瞬时转染，并将细胞接种在T75中的20ml培养基中。

72小时后，将细胞用PBS洗涤两次，用胰蛋白酶处理，离心下来，并重悬浮在15μl冰冷的裂解缓冲液中(20mM Tris pH7.4，10mM β-巯基乙醇，100mM NaCl，10％甘油，蛋白酶抑制剂)。

将细胞样品在冰上超声4次，每次15秒。将裂解液以3.000rpm离心5分钟，将上清液转移到干净的管中。通过加入CaCl₂和DTE至终浓度分别为10和5mM，将细胞裂解液在37℃下脱亚氨化30分钟到2小时。将脱亚氨化的细胞裂解物储存在-20℃。

向脱亚氨化的细胞裂解液加入10x样品缓冲液(0.25M Tris pH6.8，8％SDS，35％甘油，2.5％β-巯基乙醇，溴酚蓝)并煮沸5分钟。将对应于约5·10⁵个细胞的裂解液上样到SDS-PAGE(15％凝胶)的每个道中并进行分离，然后电印迹到Hybond C extra硝酸纤维素膜上(Amersham Biosciences)。印迹和上样通过丽春红S染色进行检查。

实施例4：治疗性抗瓜氨酸抗体识别p15和p17

将实施例3中制备的印迹膜切成条，并用5％(w/v)低脂奶粉在PBS-吐温(清洗缓冲液)中的溶液在室温下阻断2小时，以阻断所有非特异性位点。然后将印迹膜用清洗缓冲液清洗5次，每次5分钟，并将条与含有20μg抗瓜氨酸抗体的4ml清洗缓冲液在室温继续温育1小时。然后，将条用清洗缓冲液清洗5次，每次10分钟，并与过氧化物酶偶联的兔抗人IgG(Dako)在清洗缓冲液(1∶2000)中温育(室温下1小时)。然后将条用清洗缓冲液清洗3次，每次10分钟，然后用PBS洗两次，以洗掉所有未结合的抗体。

免疫反应性条带使用化学发光底物(PIERCE)显现，并暴露于Kodak BioMax XAR放射自显影胶片(Eastman Kodak Company，Rochester，NY，USA)。

观察到与RhmAb2.102、RhmAb2.103和RhmAb2.104温育的条显示出与双重蛋白的反应性，所述蛋白具有约15和17千道尔顿的分子量。

实施例5：抗原的免疫沉淀

为了免疫沉淀的目的，将20μg抗瓜氨酸抗体与30μL蛋白A-琼脂糖快速凝胶(Protein A-Sepharose fast flow)(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)一起添加到330μL细胞裂解物中，并在4℃下温育2小时，同时转动。然后将带有免疫结合的蛋白的琼脂糖珠子在IPP150(10mM Tris/Hcl pH8，150mM NaCl，0.1％NP40，0.1％吐温20)中洗涤4次。向珠子加入2×样品缓冲液(100mm Tris-HCl，pH 6.8，200mm二硫苏糖醇，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，然后将蛋白上样到15％SDS-PAGE。将凝胶在室温下，在染色溶液(10％w/v硫酸铵，2％w/v磷酸(85％)，0.1％w/v CBB G-250，20％v/v甲醇)中染色过夜，同时轻柔摇动。将所有染色盘用石蜡封口膜密封以防止甲醇蒸发。第二天，通过将凝胶在milli-Q H₂O中温育进行背景脱色，直到可以看见所需染色带。将脱色溶液(milli-Q H₂O)更换2-3次，然后获取凝胶图像。

使用RhmAb2.102、RhmAb2.103、RmmAb1.102和RmmAb1.103在人类PAD2和PAD4脱亚氨化的COS-1裂解液二者上进行的免疫沉淀，显示出明显的p15和p17蛋白条带。当使用RhmAb2.104和RmmAb1.104进行免疫沉淀时，这些蛋白条带稍微弱一些。因此，p15和p17蛋白的识别率与这些抗体的治疗性质相关性良好(图1a-d)。

实施例6：p15和p17的抗体竞争分析

与p15和p17结合的竞争分析在实施例3中所述的免疫印迹上进行。允许小鼠单克隆抗体RmmAb1.102和RmmAb1.103在分别存在和不存在RhmAb2.102和RhmAb2.103的情况下，与含有p15和p17的免疫印迹条结合。结合使用抗小鼠抗体偶联物检测。进行适合的对照实验以确保偶联物不与人类抗体反应。可以看出，当RhmAb2.102和RhmAb2.103分别用作竞争性抗体时，RmmAb1.102和RmmAb1.103与p15和p17的结合可以被降低。对照抗体RmmAb13.101、RmmAb13.102和RmmAb13.103不与RmmAb1.102或RmmAb1.103竞争与p15或p17的结合。

这些发现使这种分析法成为出色的测试，用于筛选能够抑制炎性疾病临床征兆的抗体。

实施例7：p15和p17的质谱分析

将实施例3的SDS-PAGE凝胶的p15和p17处的条带从凝胶上切下，并通过MALDI-TOF MS进行分析。简单来说，将切下的凝胶小块用50μl 25mM碳酸氢铵洗涤两次，每个洗涤步骤温育30分钟。添加30％v/v乙腈，如上重复一次15分钟的洗涤。除去所有液体，加入25μl25mM碳酸氢铵+25μl乙腈，并温育15分钟。再一次除去所有液体，并将凝胶与50μl乙腈温育30分钟。除去所有液体，通过在37℃温育2小时使小块脱水。脱水后，通过加入5μl胰蛋白酶溶液(～15ng胰蛋白酶/μl，在25mM碳酸氢铵/5mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷中)并在冰上温育1小时，使凝胶小块重新溶胀。除去过量的胰蛋白酶溶液，并将凝胶小块与5μl 25mM碳酸氢铵/5mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷在37℃下温育14小时。通过与4μl 50％乙腈/0.5％三氟乙酸(TFA)/5mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷在室温下温育1小时来提取蛋白。将样品在超声水浴中超声2分钟，将液体转移到新的管中，并重复提取步骤。将样品在真空离心机中干燥，并进行MALDI-TOF MS。

在MALDI-TOF MS分析中鉴定到的所有片段都可归于组蛋白(表3)。

表3：MALDI-TOF数据

实施例8：治疗性抗瓜氨酸抗体识别H2A/p4

将人类重组组蛋白H1、H2A、H2B、H3和H4(100μg)与或不与53.4mU huPAD2或huPAD4在37℃下温育3小时。通过在4℃温育过夜，将脱亚氨化以及未脱亚氨化的组蛋白包被在96孔ELISA板上(0.3μg/孔)。将孔用PBS-吐温20(PBS-T)洗涤5次，并通过与PBS-T+1％牛血清白蛋白(BSA)在室温下温育(RT)1小时进行阻断。在用PBS-T再洗涤5次后，将孔与RhmAb2.101、RhmAb2.102或RhmAb2.104在PBS-T+1％BSA中的连续稀释液在室温下温育1小时，稀释液从10μg/孔的浓度开始。将孔用PBS-T洗涤5次，并与兔抗人抗体-HRP(1∶2000)在室温下温育1小时，然后用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次。将与RhmAb2.101和RhmAb 2.104温育的孔与TMB底物温育15分钟，与RhmAb2.102温育的孔与TMB底物温育10分钟，然后使用2M H₂SO₄终止反应。在450nm处测量光密度，它是所用抗体的亲和性的度量。

实施例9：治疗性抗瓜氨酸抗体识别肽1

通过在4℃温育过夜，将96孔ELISA板用中性链亲和素包被(0.1μg/孔)。将孔用PBS-吐温20(PBS-T)洗涤5次，并通过与PBS-T+1％牛血清白蛋白(BSA)在室温(RT)下温育1小时进行阻断。在用PBS-T再洗涤5次后，将孔与含有组蛋白衍生的瓜氨酸和含生物素的肽(0.3μg/孔)在室温下温育1小时。在用PBS-T再洗涤5次后，将孔与RhmAb2.101、RhmAb2.102或RhmAb2.104在PBS-T+1％BSA中的连续稀释液在室温下温育1小时，稀释液从10μg/孔的浓度开始。将孔用PBS-T洗涤5次，并与兔抗人抗体-HRP(1∶2000)在室温下温育1小时，然后用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次。将孔与TMB底物温育5分钟，然后使用2M H₂SO₄终止反应。在450nm处测量光密度，它是所用抗体的亲和性的度量。

实施例10：脱亚氨化的人类血浆纤维蛋白原的制备、SDS-page电泳和Western印迹、以及用抗瓜氨酸抗体的检测

将100μg人类血浆纤维蛋白原溶解在100μl脱亚氨缓冲液(PBSpH7.6，10mM CaCl2，5mM二硫苏糖醇)中，并使用53.4mU huPAD2或huPAD4在37℃脱亚氨化3小时。加入10x样品缓冲液(0.25M TrispH6.8，8％SDS，35％甘油，2.5％β-巯基乙醇，溴酚蓝)，并将7.5μg脱亚氨化或未脱亚氨化的纤维蛋白原上样到SDS-PADE(12.5％)的每个道中并进行分离，然后电印迹到Hybond C extra硝酸纤维素膜上(Amersham Biosciences)。印迹和上样通过丽春红S染色进行检查。

将印迹膜用5％(w/v)低脂奶粉在PBS-吐温(清洗缓冲液)中的溶液在室温下阻断2小时，以阻断所有非特异性位点。然后将印迹膜用清洗缓冲液清洗5次，每次5分钟，并将条与含有20μg抗瓜氨酸抗体的4ml清洗缓冲液在室温继续温育1小时。然后，将条用清洗缓冲液清洗5次，每次10分钟，并与过氧化物酶偶联的兔抗人IgG(Dako)在清洗缓冲液(1∶2000)中温育(室温下1小时)。然后将条用清洗缓冲液清洗3次，10分钟，然后用PBS洗两次，以洗掉所有未结合的抗体。

观察到与RhmAb2.102和RhmAb2.104温育的印迹，与RhmAb2.101相比显示出与脱亚氨化的人类血浆纤维蛋白原的更高的反应性。同样，与RhmAb2.104相比，RhmAb2.102显示出较高亲和性。

实施例11：治疗性抗瓜氨酸抗体识别纤维蛋白原和波形蛋白衍生的瓜氨酸肽

通过在4℃温育过夜，将96孔ELISA板用中性链亲和素包被(0.1μg/孔)。将孔用PBS-吐温20(PBS-T)洗涤5次，并通过与PBS-T+1％牛血清白蛋白(BSA)在室温(RT)下温育1小时进行阻断。在用PBS-T再洗涤5次后，将孔与含有纤维蛋白原和波形蛋白衍生的瓜氨酸和含生物素的肽(0.3μg/孔)在室温下温育1小时。在用PBS-T再洗涤5次后，将孔与RhmAb2.101、RhmAb2.102或RhmAb2.104在PBS-T+1％BSA中的连续稀释液在室温下温育1小时，稀释液从10μg/孔的浓度开始。将孔用PBS-T洗涤5次，并与兔抗人抗体-HRP(1∶2000)在室温下温育1小时，然后用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次。将孔与TMB底物温育5分钟，然后使用2M H₂SO₄终止反应。在450nm处测量光密度，它是所用抗体的亲和性的度量。

实施例12：RhmAb2.102的治疗潜力

使用来自ModiQuest Research B.V公司(目录号MQ18.101)的可商购的胶原蛋白抗体诱导的关节炎(CAIA)小鼠模型，按照制造商的说明书在小鼠中诱导关节炎(http://www.modiquestresearch.nl/shop/files/18.101-50MG％20_2007.08 .22.pdf)。为此，在第0天，对8周龄的雄性DBA/J1小鼠(5-6只小鼠/组)腹膜内注射8种抗胶原蛋白抗体的混合物(2.8mg/小鼠)。在第3天，小鼠接受另一次包含25μg LPS的腹膜内注射。LPS激发炎症。在第7天，当平均关节炎分值约为4时(图6A)，一个组接受含有1mgRhmAb2.102的静脉内注射，而其他组接受含有安慰剂的静脉内注射。

每天对动物爪中炎症的征兆进行评分。评分按照表2进行。每只小鼠的最大关节炎分值是8。RhmAb2.102使炎症稳定(图6A)。

所有右后爪用于组织学分析。将组织在4％甲醛中固定4天，在5％甲酸中脱钙质，然后脱水并包埋在石蜡中。将7μm的标准正面切片固定在SuperFrost载片上(

Braunschweig，德国)。进行苏木精和曙红(H&E)染色以研究关节炎症(细胞流入，图7D)。关节中炎症的严重性以0-3的分值进行计分(0＝无细胞，1＝轻度细胞性，2＝中度细胞性，3＝最大细胞性)。图7A显示了第35天时肉眼可见的炎症。为了研究蛋白聚糖(PG)从软骨基质的消耗(图7E)，将切片用番红O(SO)染色，然后用固绿复染。PG的消耗使用0-3的任意分值确定，其范围从正常、完全染色的软骨到脱色软骨、完全消耗PG。软骨细胞死亡(图7F)按照0-3的分值计分，其范围从软骨细胞核没有损失到全空的软骨表面。软骨和骨侵蚀(图7B和C)按照0-3的分值分级，其范围从软骨或骨结构没有损伤到完全丧失。在5个相隔70μm的关节的半连续切片上，对关节中的组织病理学变化进行计分。计分在盲的、不了解以前的实验条件的情况下进行。

尽管在第35天时在各组中鉴定到了右后爪中肉眼可见的炎症(图6A和7A)，但在接受RhmAb2.102的实验组中，与对照组相比，在关节侵蚀的任何下列参数方面观察到了急剧降低：炎性细胞流入(图7D)，软骨侵蚀(图7B)，软骨PG消耗(图7E)，软骨细胞死亡(图7F)和骨侵蚀(图7C)。该结果强力支持RhmAb2.102的治疗潜力。

实施例13：huPAD4脱亚氨化的HEK293提取液的制备以及与 RhmAb2.101或RhmAb2.102的免疫沉淀

收获HEK293细胞，用PBS洗涤一次，离心下来，并将5.10⁵个细胞重悬浮在15μl冰冷的裂解缓冲液中(20mM Tris pH7.4，10mM β-巯基乙醇，100mM NaCl，10％甘油，蛋白酶抑制剂)。

将细胞样品在冰上超声4次，每次15秒。将裂解液以3.000rpm离心5分钟，将上清液转移到干净的管中。通过加入每2mg蛋白1U人类PAD4(ModiQuest Research B.V.；目录号：MQ16.203)、10mMCaCl₂和5mM DTT，将细胞裂解液在37℃下脱亚氨化2小时。

通过将脱亚氨化的HEK293裂解液进行SDS-Page(12.5％凝胶)电泳，然后进行Western印迹，证实了裂解液的脱亚氨化。Western印迹用抗体RhmAb2.101或RhmAb2.102进行免疫染色，并发现是阳性的。用不相关抗体处理的印迹不显示任何染色。

随后，使用抗体RhmAb2.101或RhmAb2.102，在脱亚氨化的HEK293裂解液上进行了免疫沉淀(IP)。简单来说，将30μL蛋白A-琼脂糖快速凝胶(Protein A-Sepharose fast flow)用1ml IPP500(10mMTris/HCl pH8.0，500mM NaCl，0.1％NP40和0.1％吐温-20)洗涤5次，并与20μg RhmAb2.101、20μg RhmAb2.102偶联或不偶联(阴性对照)。将蛋白A-琼脂糖珠子/抗体混合物在恒定旋转下，在室温下温育1小时。将珠子进行三次1ml IPP500的清洗，一次1ml IPP150(10mM Tris/HClpH8.0，150mM NaCl，0.1％NP40和0.1％吐温-20)的清洗，然后在恒定旋转下，在室温下与300μl脱亚氨化的HEK293裂解物温育2小时。将珠子用1ml IPP150清洗三次，然后将一小部分用于SDS-PAGE电泳，以确定使用HEK293细胞的IP步骤是否成功。将在RhmAb2.101、RhmAb2.102和对照珠子上免疫沉淀的蛋白用50μl洗脱缓冲液(100mM柠檬酸钠，pH3.0)洗脱，用10μl 1M Tris/HCl pH9.04中和，并储存在-20℃下，直到进行nLC LTQ FTMS ULTRA质谱(实施例14)。

实施例14：RhmAb2.101和RhmAb2.102免疫沉淀的huPAD4脱亚氨化HEK293蛋白的质谱分析

为了从免疫沉淀的蛋白上除去PEG，将它们上样到15％SDS-PAGE凝胶上并短时间电泳。从凝胶上切出蛋白，并按照实施例7中的描述用胰蛋白酶进行凝胶内消化。然后将样品稀释50倍，将它们进行nLC LTQ FTMS ULTRA分析。

利用搜索程序Mascot，使用带有人类分类学的NCBInr_20081022数据库，从数据中提取肽和蛋白身份。在搜索中允许下列修饰：半胱氨酸(C)的氨甲酰甲基化(固定)，甲硫氨酸(M)的氧化(可变)和天冬酰胺(N)、精氨酸(R)和谷氨酰胺(Q)的脱酰胺化(可变)。脱亚氨化不能用作搜索工具。这个问题可以被消除，因为脱酰胺化和脱亚氨化二者都导致与未修饰的精氨酸相比1道尔顿的质量差异。

蛋白身份验证通过内部开发的脚本执行。简单来说，软件根据独特鉴定到的肽序列的数量对蛋白身份进行分类，将共有同样肽组的蛋白聚类，并通过下列标准验证蛋白：

具有1个肽的蛋白必须具有肽分值：＞49

具有一个以上肽的蛋白必须具有肽分值：＞29

利用所使用的验证标准，在所有三个样品中鉴定了肽(样品1：HEK293沉淀物与RhmAb2.101；样品2：HEK293沉淀物与Rhm2.102；样品3：HEK293沉淀物与空白珠子)。

对于所有已验证的蛋白计算emPAI(指数修正的蛋白丰度指数)。emPAI基于数据库搜索结果中的肽匹配的蛋白覆盖度，提供混合物中蛋白的粗略的、无标记物的相对定量。该技术使我们能够鉴定(优选)与RhmAb2.102结合的脱亚氨化的蛋白。这显示在表7中。

实施例15.抗炎症抗体家族的产生/筛选

按照与Raats等，2003(Raats，J.M.H.，Wijnen，E.W，Pruijn，G.J.M.，Van den Hoogen，F.H.M.和W.J.van Venrooij.2003.J.Rheum.30，1696-1711)中描述的相似的方法，将源自人类的scFv文库针对PAD2-或PAD4-脱亚氨化形式的人类组蛋白-2A、组蛋白-4、肽1(AAASGXGKQGGK，SEQ ID NO：21)以及CFC-1肽进行淘选。

对于所选的与CFC-1和/或肽1(AAASGXGKQGGK，SEQ ID 21)和/或PAD-脱亚氨化的组蛋白2a和/或组蛋白4显示出瓜氨酸依赖性反应性的抗体，针对一组瓜氨酸化蛋白和/或其衍生肽(实施例14，表7)、针对PAD2和PAD4脱亚氨化的人类组蛋白同种型和针对脱亚氨化的人类组蛋白衍生的肽进行筛选。同时，在来自RA患者的PAD2和PAD4脱亚氨化的人类细胞提取物和滑液上进行了免疫沉淀。

然后将免疫沉淀p15和/或p17条带的抗体，和/或与RhmAb2.102具有相当的抗瓜氨酸化表位(PAD2和PAD4脱亚氨化的人类组蛋白同种型，和/或CFC-1和/或肽1(AAASGXGKQGGK，SEQ ID 21，和/或源自于表7中列出的蛋白的瓜氨酸化表位)的ELISA反应性情况的抗体，克隆到人类IgG1格式中。按照本文所述，在CAIA小鼠模型中测试全尺寸人类IgG抗体的预防和/或治疗性抗炎症潜力。

该筛选过程以高的频率产生了在CAIA小鼠模型中具有预防和/或治疗性抗炎症潜力的抗体。

按照上述方法筛选的新抗体的实例是RhmAb2.105(SEQ ID 39和40)和RhmAb2.107(SEQ ID NOs 41和42)。编码这些抗体的核苷酸序列列于SEQ ID NOs 43到46中。

Claims

1.与p15和/或p17上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，其用于炎性疾病的预防或治疗。

2.权利要求1的结合分子，其与人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A或组蛋白4、或人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4或组蛋白H3上的瓜氨酸化表位特异性反应。

3.权利要求1或2的结合分子，其与选自SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽特异性反应。

4.权利要求1-3的结合分子，其用于治疗或预防与瓜氨酸相关的炎性疾病。

5.权利要求1-4的结合分子，其用于预防或治疗选自下列的疾病：自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症、克罗恩病和格林巴利综合征。

6.权利要求1-5的结合分子，其用于预防或治疗自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。

7.权利要求1-6的结合分子，其是抗体或肽。

8.权利要求7的结合分子，其是选自单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的抗体。

9.权利要求1-7的结合分子，其与选自RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的单克隆抗体竞争与选自p15、p17的分子，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，选自表7的名单的蛋白和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽结合。

10.权利要求1-7的结合分子，其包含源自于抗体的特异性结合结构域，所述抗体选自单克隆抗体RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107。

11.权利要求10的结合分子，其是抗体或多肽。

12.权利要求11的结合分子，其是重组肽或单链抗体。

13.权利要求10-12的结合分子，其包含单链可变区片段(scFv)、抗原结合区片段(Fab)、单结构域抗体(sdab)或VHH抗体或纳米抗体(nanobody)，例如源自于骆驼的单结构域抗体或源自于鲨鱼IgNAR的单结构域抗体片段(VNAR)、Anticalin或适体。

14.一种用于预防或治疗炎性疾病的方法，包括向需要的患者给药治疗有效量的抗炎症组合物，所述组合物包含结合分子，所述结合分子与选自p15、p17分子上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽特异性反应。

15.权利要求14的方法，其中结合分子与选自RhmAb2.102、RmmAb1.102、RhmAb2.103、RmmAb1.103、RhmAb2.104、RmmAb1.104、RhmAb2.105和RhmAb2.107的单克隆抗体竞争与选自p15、p17的分子，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，选自表7的名单的蛋白和SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽结合。

16.一种多肽，其包含SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、EQ ID NO：19、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示的可变重链或可变轻链。

17.编码权利要求16的多肽的核酸。

18.一种通过引发体内免疫应答来预防或治疗炎性疾病的方法，其中产生了与选自下列的表位反应的特异性结合分子：p15、p17上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

19.权利要求18的方法，其中向需要的患者给药组合物，所述组合物包含选自下列的活性成分：p15，p17上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

20.权利要求18或19的方法，其中炎性疾病选自自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。

21.权利要求20的方法，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。

22.权利要求18-21的方法，其中特异性结合分子是抗体。

23.一种用于炎性疾病的治疗或预防的组合物，其能够在体内引起针对选自下列的瓜氨酸化表位的特异性免疫应答：p15和/或p17上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

24.权利要求23的组合物，其包含选自下列的活性成分：p15，p17上的瓜氨酸化表位，人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白2A、人类PAD4脱亚氨化的人类组蛋白4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H4、人类PAD2脱亚氨化的人类组蛋白H3上的瓜氨酸化表位，以及SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的肽。

25.权利要求23或24的组合物，其中炎性疾病选自自身免疫疾病、关节炎、类风湿关节炎、骨关节炎、多发性硬化、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、阿茨海默氏病、自体免疫性肝炎、幼年特发性关节炎、脊柱关节病、唐氏综合征、多系统萎缩症、帕金森氏症和路易体痴呆症。

26.权利要求25的组合物，其中炎性疾病是自身免疫疾病，例如类风湿关节炎。

27.权利要求23-26的组合物，其中特异性结合分子是抗体。

28.与p15和/或p17上的瓜氨酸化表位特异性反应的结合分子，其用于预防或治疗关节损伤。

29.权利要求28的结合分子，与炎症抑制剂联合给药。