CZ20001963A3 - Peptidy obsahující citrulin rozeznaný sérem revmatické artritidy jako prostředky pro diagnózu a léčbu - Google Patents

Description

Peptidy obsahující citrulin rozeznaný sérem revmatické artritidy jako prostředky pro diagnózu a léčbu.

Předkládaný vynález se vztahuje k určitým peptidům obsahujícím citrulin (citrulline), které tvoří ímunogenní determinanty protilátek přítomných v séru z pacientů s revmatoidní artritidou a • kde je přítomnost alespoň jednoho citrulinu nezbytným předpokladem pro reakci se zmíněnou protilátkou. Tento vynález se také vztahuje k metodě produkce zmíněných peptidů a použití zmíněných protilátek pro diagnózu a léčení revmatické artritidy a souvisejících onemocnění. Předkládaný vynález se také vztahuje k novým filagrinovým alelám (filaggrin alleles).

Revmatická artritida (rheumatoid arthritis, RA) je hlavní, kloub poškozující, onemocnění, které je povahou systémové a má neznámou etiologii. Postihuje 1% populace, muže a ženy s poměrem 2:3. Co se týče nemocnosti je nejdůležitější vlastností RA narušení kloubů, které vede k bolestem, deformitám a v některých případech k vážné invaliditě. U pacientů s vážnou formou této choroby je možné očekávat snížení věku dožití až o deset let. RA má všechny vlastnosti autoimunitního onemocnění, včetně přítomnosti řady autoprotilátek v sérech pacientů a schopnosti vyvolat onemocnění u zvířecích modelů přenosem patogenních T buněk. Klasifikace onemocnění může být obtížná, protože hraniční formy jsou velmi časté; navíc záněty kloubů nevyvolává jenom RA, ale také se objevuje _H u ostatních neautoimunitních onemocnění, jako je osteoartritida,

I reaktivní artritida (reactive arthritis) a dna.

, Protože časná diagnóza umožní přizpůsobit léčbu, což může výrazně zlepšit kvalitu života RA pacientů, je pro revmatology vysoce důležité mít k dispozici spolehlivé diagnostické kritérium. Diagnostika RA je původně založená na klinických příznacích. Sérologie jako základ takovéto diagnózy není zatím zavedená a je založená hlavně na přítomnosti revmatických faktorů (rheumatoid factor, RF). Pozitivní test Waaler-Rose nebo latexový fixační RF test mají prediktivní hodnotu a jsou použitelné u onemocnění se silnějšími projevy. Významné množství RA pacientů je ale RF seronegativní a na druhé straně se RF také vyskytují u jiných revmatických onemocnění včetně Sjógrenova syndromu a systémových lupus erythematosus, u některých chronických bakteriálních a akutních virových infekcí, u některých parazitických onemocněních a chronických zánětlivých onemocněních a kromě toho byly také prokázány v kontrolních sérech ze zdravých pacientů (Walter et al., 1964; Chen et al., 1987). Tato poněkud nízká specifita RF vyžaduje další testování na druhotné (second) RA-specifické protilátky.

• Převaha dříve definovaných protijaderných protilátek, jako SSA, RA33 a RNP je při RA nízká a jejich klinická užitečnost pro diagnózu RA byla doposud limitovaná (Hassfeld et al., 1993). Naproti tomu jak antiperinukleární faktor (APF - antiperinuclear factor), tak antikeratinové protilátky (AKA - antikeratin antibodies) se ukázaly z tohoto hlediska jako užitečné. APF jsou IgG protilátky v séru RA pacientů, vyvolávající typické imunofluorescenční zabarvení lidských lícních sliznicových buněk (human buccal mucosa cells) (Nienhuis a Mandema, 1964). Několik studií se zabývalo diagnostickou užitečností tohoto testu (Westgeest et al., 1987); Janssens et al., 1988; Vivino a Maul, 1989; Zojinou et al., 1992; Feltkamp et al., 1993). Vysoká specifita APF pro RA (80-90%) a dobrá citlivost (50-99%) je činí vskutku vhodným diagnostickým nástrojem. Jeho hodnota je zvláště zřejmá zhruba u jedné třetiny RA pacientů, kteří nevykazují RF aktivitu (Westgeest et al., 1987; Nesher et al., 1992). Druhou specifikou skupinou nalezenou v séru RA pacientů jsou AKA, autoprotilátky, které byly poprvé popsány v práci Young et al.

(1979) a které vyvolávají fluorescenční obrazec u keratinizované vrstvy krysího jícnového epitelia. Přes nedostatek biochemické | charakterizace jejich cílů, se na diskutabilním základě (že , cytokeratiny totiž tvoří hlavní komponentu rohovité vrstvy) usoudilo, že se jedná o antikeratinové protilátky. Tyto protilátky se vyskytují u 36-59% RA sér a zjistilo se, že jsou vysoce specifické pro RA (Johnson et al., 1981; Miossec et al., 1982) Hajiroussou et al., 1985; Vincent et al., 1989). Stejně jako u APF se jedná především o IgG třídu (Johnson et al., 1981; Kataaha et al., 1985; Vincent et al., 1990) a oboje jsou také detekovatelné • ··· · · ·· ·· ·· · ···· ·*· v synoviální tekutině pacientů s RA (Youinou et al., 1985; Kirstein et al., 1989; Vivino a Maul, 1990).

Nedávno byl identifikován lidský epidermální protein filagrin (filaggrin) s přesvědčivým důkazem, že se jedná o jeden z hlavních cílů pro reaktivitu s AKA a APF autoprotilátkami (Simon et al.,

1993; Sebbag et al., 1995). V počáteční studii se ukázalo, že neutrální/kyselá forma lidského filagrinu reaguje s 75% sér ze skupiny 48 RA sér ve Western blotech (Simon et al., 1993). Pozdější údaje (Vincent et al., 1997) ukázala diagnostickou citlivost více • než 50% pro detekci antifilagrinu s odpovídající specifikou 95% uvnitř skupiny 492 sér, která obsahovala 279 RA sér.

Profilagrin (profilaggrin), prekursor filagrinu, je na histidiny bohatý, nerozpustný protein ±400 kDa. Obsahuje 10-12 filagrinových opakování o 324 aminokyselinách, které jsou oddělené heptamerovou spojovací sekvencí. Vysoce fosforylováný polyproteín je uložen v keratohyalinových granulích (keratohyalin granules) granulační vrstvy epidermis. Po konečné diferenciaci těchto buněk je profiligrin defosforylován a proteolyticky zpracován odstraněním spojovací sekvence; vznikne tak základní filagrinová molekula o velikosti 37 kDa (Resing et al., 1989; Gan et al., 1990). V dolních zrohovatělých buňkách se tyto jednotky účastní v agregaci keratinových přechodných vláken (kreatin intermediate filaments), usnadňujících tvorbu mezimolekulárních disulfidových vazeb; vznikne tak intracelulární vláknitá matrix zrohovatělých buněk (Dále et al., 1978; Lynley a Dále, 1983; Harding a Scott, 1983; Mack et al.,

1993). Po spojení vláken se převedou peptidylarginin deiminázou zásadité argininové zbytky na citrulin, což má za následek menší afinitu molekuly pro cytokeratiny (Hading a Scott, 1983). Nakonec je ( filagrin zcela rozložen na volné aminokyseliny, kyselinu urokanovou a karboxylovou pyrolidonovou kyselinu (carboxylic pyrrolidone acid), která hraje roli při udržování optimální hladiny vlhkosti a absorpci UV světla (Scott et al., 1982).

Tandemově uspořádané filagrinové jednotky jsou vysoce polymorfní: existuje značná variace v aminokyselinové sekvenci u jednotlivých individuí a také mezi různými filagrinovými molekulami u jedné osoby, kde se zjistily až 15% rozdíly (McKinley-Grant et al., 1989; Gan et al., 1990; Markova et al., 1993). Většinu • ·· ·

modifikací lze přičíst jednobázovým změnám, ale u mnoha dochází také ke změnám náboje. Lidský profilagrinový genetický systém je vyrovnaně polymorfní co do velikosti vzhledem k alelickým rozdílům v počtu opakováni mezi individui (10, 11 nebo 12), takže u jedné osoby se může objevit až 24 různých filagrinových molekul (McKinley-Grant et al., 1989; Presland et al., 1992). Variace aminokyselin společně s defosforylaci jsou odpovědné za značnou heterogenitu na dvourozměrných gelech; změna argininu za citrulin je další příčinou acidifikace molekul.

Protože použiti přirozeného izolovaného z lidských pletiv je poněkud nepraktické (vzhledem k variabilitě šarži, pracné izolaci a omezené možnosti získat výchozí materiál pro purifikace), testovaly se pro vývoj diagnostických souprav na RA syntetické peptidy a rekombinantní proteiny. Rekombinantní filagrin se exprimoval v eukaryotním COS buněčném systému. Nezdá se ale, že je tento přístup úspěšný, protože žádný ze čtyř klonovaných proteinů nereagoval s APF pozitivními séry pacientů.

Cílem předkládaného vynálezu je poskytnout peptidy, které mají vysokou reaktivitu pro protilátky přítomné v séru pacientů s revmatickou artritidou.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout metody pro přípravu protilátek specificky reagujícími se zmíněnými peptidy.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout metody pro přípravu anti-idiotypových protilátek specificky reagujících s dříve jmenovanými protilátkami a tak napodobujících zmíněné peptidy.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout farmaceutické směsi obsahující tyto peptidy pro léčbu nebo diagnózu.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout diagnostickou soupravu pro revmatickou artritidu.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové filagrinové alely a jejich odpovídající aminokyselinové sekvence.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí biotestu pro identifikaci sloučenin, které mění interakci mezi autoantigenem a autoprotilátkami specifickými pro revmatickou artritidu.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnutí modulátoru, směsi obsahující modulátor, nebo kombinaci modulátorů identifikovaných biotesty popsanými výše.

Všechny tyto cíle předkládaného vynálezu jsou splněny následujícími formami předkládaného vynálezu.

Identifikovaly se imunodomínantní epitopy filagrinu, které v šechny obsahují nezvyklou aminokyselinu citrulin. Připravily se syntetické peptidy, které se ukázaly jako užitečné pro diagnózu RA. Aplikací lidského séra revmatické artritidy na 2D bloty s placentálním extraktem se zjistila další specifita. Identifikovaly se imunoreaktivní místa a kromě dalších neidentifikovaných peptidů se získaly peptidy z lidského vimentinu (vimentin), cytokeratinu 1 a cytokeratinu 9. Všechny tyto proteiny patří ke stejné rodině přechodných vláknitých proteinů (intermediate filament proteins). Protože citrulinové formy vimentinu a cytokeratinu byly již popsány in vivo (Senshu et al., 1992; Senshu et al., 1995; Senshu et al., 1996) je pravděpodobné, že tvoří specifické cíle pro autoprotilátky přítomné v séru revmatické artritidy.

Podle své hlavní formy se předkládaný vynález vztahuje k peptidům obsahujícím méně než 50 aminokyselin, zahrnujícím fragmenty variant filagrinu nebo fragmenty přechodných vláknitých proteinů, kde je alespoň jeden arginin nahrazen citrulinem a které jsou schopné reagovat s protilátkami, kde je přítomnost zmíněného citrulinu rozhodující pro reakci mezi zmíněným peptidem a zmíněnými protilátkami a kde jsou zmíněné protilátky přítomné v sérech z pacientů s revmatickou artritidou.

Podle hlavní formy se předkládaný vynález vztahuje k peptidům jak je uvedeno v nároku 2.

Podle další formy se předkládaný vynález vztahuje také k peptidu a/nebo chemické struktuře zahrnující kterýkoliv z výše uvedených peptidů připojených k molekule spojovníku (linker).

I Předkládaný vynález se také vztahuje k peptidům obsahujícím a/nebo z skládajícím se z tandemových opakování (tandem repeats) alespoň dvou libovolných výše zmíněných peptidů nebo větvených peptidů, které obsahují alespoň jeden z výše zmíněných peptidů.

Další specifickou formou vynálezu je také metoda pro produkci kteréhokoliv z výše zmíněných peptidů klasickou chemickou syntézou, kde je v určité fázi během chemické syntézy alespoň jeden argininový zbytek nahrazen citrulinem. Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě produkce kteréhokoliv z výše zmíněných peptidů, kde se . · · : :

• · · · •••ii • ·· · · · ··· ·· *·· ···· ·· ··· primární aminokyselinová sekvence získá klasickou chemickou syntézou a kde je zmíněný argininový zbytek po chemické syntéze derivatizován na citruliln inkubací s peptidylarginin deiminázou (peptidylarginine deaminase). Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě přípravy kteréhokoliv z výše uvedených peptidů skládající se z následujících kroků: (i) transforamace vhodné hostitelské buňky rekombinantním vektorem, který obsahuje polynukleovou kyselinu se sekvencí, která kóduje zmíněný polypeptid (pod řízením vhodných regulačních prvků, takže dochází k expresi a/nebo sekreci zmíněného peptidů nebo proteinu obsahujícího zmíněný peptid) (ii) kultivací zmíněného transformovaného buněčného hostitele za podmínek umožňujících expresi zmíněného proteinu nebo peptidů a částečnou nebo úplnou změnu zmíněného argininu přítomného ve zmíněném peptidů na citrulinové zbytky a (iii) izolaci zmíněného peptidů. Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě získávání kteréhokoliv z výše uvedených peptidů zahrnující následující kroky (i) transformaci vhodného buněčného hostitele rekombinantním vektorem, který obsahuje polynukleovou kyselinu se sekvencí, která kóduje zmíněný peptid pod řízením vhodných regulačních elementů, takže dochází k expresi a/nebo sekreci zmíněného peptidů nebo zmíněného proteinu obsahujícího zmíněný peptid (ii) kultivaci zmíněného transformovaného buněčného hostitele za podmínek umožňujících expresi zmíněného proteinu nebo peptidů (iii) izolaci zmíněného peptidů nebo proteinu a (iv) změnu argininového zbytku zmíněného proteinu nebo zmíněného peptidů za cítrulinový zbytek. Svojí specifičtější formou se vynález vztahuje také ke kterékoliv výše zmíněné metodě, kde je zmíněnou hostitelskou buňkou bakteriální hostitel nebo kvasinka nebo jakákoliv eukaryotická hostitelská buňka, která je přednostně transformovaná rekombinantním baculovirem.

V preferované formě se vynález vztahuje k protilátce specificky reagující se zmíněnými peptidy nebo přechodnými (intermediate) vláknitými proteiny, které obsahují citrulinová rezidua přičemž zmíněná protilátka je v optimálním případě monoklonální protilátka. Předkládaný vynález se také vztahuje k anti-idiotypové protilátce vytvořené imunizací s kteroukoliv protilátkou definovanou výše, kde zmíněná anti-idiotypová protilátka reaguje se zmíněnou protilátkou a . . · ....

. ...... ; ϊ

... ·· ...

... .. ...·.·· ·· ··· tak napodobuje kterýkoliv z výše zmíněných peptidů a kde je zmíněná protilátka přednostně protilátkou monoklonální.

Podle specifické formy se předkládaný vynález také vztahuje k molekule imunotoxinu obsahující a/nebo skládající se z buňku rozeznávající molekuly, která je peptidem definovaným výše, nebo protilátkou definovanou výše, kovalentně navázané na molekulu toxinu, nebo jeho aktivního fragmentu.

Podle další formy se překládaný vynález vztahuje ke kterémukoliv výše uvedených peptidů nebo protilátek nebo molekulám imunotoxinu nebo přechodným vláknitým proteinům nebo jejich směsi pro použití jako lék. Zmíněné využití může mít za cíl lék pro léčbu nebo diagnostickou látku pro revmatickou artritidu. Předkládaný vynález se také vztahuje k léčení autoimunitních onemocnění indukováním stavu systémové hypo-vnímavosti k autoantigenu po orálním podávání kteréhokoliv z výše zmíněných peptidů nebo protilátek nebo molekul imunotoxinu nebo přechodných vláknitých proteinů nebo jejich směsi a tak zabránění patogenní produkci protilátek proti vlastnímu organismu. Předkládaný vynález se také vztahuje k diagnostické soupravě pro použití při detekci revmatické artritidy, kde daná souprava obsahuje alespoň jeden z výše zmíněných peptidů nebo proteinů nebo protilátek a kde je zmíněný peptid, proteiny nebo protilátka případně navázán na pevnou fázi. Lépe je, když zmíněná souprava obsahuje řadu zmíněných peptidů nebo zmíněných protilátek (případně v kombinaci s jinými epitopy, které můžou charakterizovat auto-imunitní onemocnění), kde jsou zmíněné peptidy, proteiny a/nebo protilátky připojené ke specifickému místu na pevném substrátu. Je vhodné, když je zmíněný pevná fáze membránovým proužkem a zmíněné polypeptidy jsou připojené k membráně ve formě paralelních drah. Mělo by být jasné, že určité peptidy, proteiny nebo protilátky definované výše nemusí být nutně navázané na pevný povrch, ale jsou poskytované ve formě vazebného roztoku pro použití jako kompetitorů a/nebo pro blokování ostatních protilátek, které se vyskytují v séru pacientů s jinými autoimunitními onemocněními než revmatickou artritidou, čímž se sníží nebo eliminují možné křížové reakce a/nebo nespecifické vazby.

Pomocí mapování epitopů se identifikovaly imunodominantní epitopy filagrinu objevující se u pacientů s revmatickoou artritidoul (viz příklad 1). Tyto epitopy jsou dále charakterizovaný přítomností citrulinových zbytků, které vzniknou odvozením od argininových zbytků. Přítomnost daných citrulinových zbytků je předpokladem pro rozpoznání protilátkami přítomnými v sérech z revmatické artritidy. Podle své hlavní formy se předkládaný vynález také vztahuje k těm peptidovým fragmentům přirozených variant filagrinu, které reagují s protilátkami charakteristicky se vyskytujícími v sérech pacientů s revmatickou artritidou a které jsou dále charakterizovány post-translačními modifikacemi, nejlépe záměnou argininu za citrulin. Pro rozpoznání protilátkami, které jsou specificky přítomné v séru pacientů s revmatickou artritidou, je předpokladem přítomnost alespoň jednoho citrulinového rezidua.

Připravily se syntetické peptidy, kde byly argininové zbytky nahrazené citrulinem a tak napodobující epitopy přirozených variant filagrinu. Tyto peptidy se ukázaly být jako užitečné pro diagnózu revmatické artritidy. Podle jiné formy vynálezu se předkládaný vynález vztahuje k peptidům, které imunologicky napodobují imunogenní determinanty vlastních proteinů rozpoznávaných imunitním systémem u pacientů trpícím revmatickou artritidou.

Je tedy možné očekávat, že přítomnost jednoho citrulinu může být dostatečná pro specifické rozpoznání některými protilátkami přítomnými v séru pacientů s revmatickou artritidou.

Termín 'peptid', jak je použitý ve specifikaci a nárocích, se vztahuje k polymeru aminokyselin a nevztahuje se ke specifické délce produktu; do definice 'peptidu'je tak možné včlenit oligopeptidy, polypeptidy a proteiny. Tento termín také nezahrnuje po-expresní modifikaci peptidu, například glykosylaci, acetylaci, fosforylaci, a podobně. V definici jsou zahrnuté například peptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně například nepřirozených aminokyselin, PNA atd.), polypeptidy se substituovanými vazbami a také jiné modifikace známé odborníkům, vyskytující se jak přirozeně, tak pouze uměle.

Když se použije výraz „peptid obsahující méně než 50 aminokyselin, měl by být chápán v širším slova smyslu, jako způsob označení podstatně zkrácené verze celého imunoreaktivního proteinu, který stále obsahuje vysoce reaktivní doménu charakterizovanou

přítomností citrulinových zbytků. Tyto peptidy mají délku přednostně 40, 30, 25, 20 nebo méně aminokyselin.

'Imunogenní determinantou' se rozumí ty chemické skupiny, které obsahují primární aminokyselinovou sekvenci a sekundární modifikace aminokyselinových zbytků v určitém třírozměrném uspořádání, které společně určují specifickou reaktivitu celého antigenu proti produkované protilátce. Takováto protilátka může také rozeznat různé chemické skupiny, které jsou označené jako 'imunologicky napodobující' imunogenní determinanty.

Když jsou druhotné modifikace peptidu označené za 'nezbytné', nebo 'rozhodující' nebo za 'předpoklad' pro reakci s protilátkami, způsobí nepřítomnost druhotné modifikace to, že peptid bude mít disociační konstantu pro interakci s danou protilátkou nejméně o dva řády vyšší (lépe o tři řády vyšší a ještě lépe o čtyři řády vyšší), než disociační konstanta pro interakci mezi danou protilátkou a peptidem s druhotnou modifikací

Pojem 'křížová reakce' se také vztahuje k reakci jednoho antigenu s protilátkami vzniklých proti jinému antigenu nebo proti protilátkám, které se nacházejí v sérech z pacientů s různými onemocněními.

Ve specifické formě se předkládaný vynález také vztahuje k těm peptidům nebo proteinům, které obsahují citrulinová rezidua, kde je přítomnost zmíněných citrulinových zbytků nezbytná pro vysoce afinitní interakci s protilátkami, které se charakteristicky vyskytují v sérech pacientů s revmatickou artritidou.

Ve specifické formě se předkládaný vynález také vztahuje k peptidu, který je charakterizovaný aminokyselinovu sekvencí

HSASQDGQDTIRGHPGSS, nebo

HSGIGHGQASSAVRDSGHRGYS, nebo

DSGHRGYSGSQASDNEGH, nebo

HSTSQEGQDTIHGHRGS, nebo

GGQGSRHQQAR, nebo

QGSRHQQARDSSRHSTSQEGQDTIHGHRGS, nebo

QGSRHQQARDSSRHSASQDGQDTIRGHPGSS, nebo

HSGIGHGQASSAVRDSGHRGYSGSQASDNEGH, nebo

kde je alespoň jeden arginin (a nejlépe všechny) zaměněný za citrulinová rezidua a tak napodobena hlavní imunogenní determinanta filagrínu.

Ve specifičtější formě se předkládaný vynález vztahuje k peptidům obsahujícím sekvenci o méně než 50 aminokyselinách kterékoliv varianty vimentinu (vimentin), cytokeratinu 1 nebo cytokeratinu 9, obsahujícím alespoň jedno citrulinové reziduum, kde je přítomnost zmíněného citrulinu rozhodující pro reakci s protilátkami přítomnými v sérech z pacientů s revmatickou artritidou.

Předkládaný vynález se také vztahuje k molekulárním strukturám kde je alespoň část representovaná peptidem nebo protilátkou definovanými výše. Takovéto molekulární struktury mohou v zniknout po fůzi peptidů předkládaného vynálezu s peptidy a/nebo proteiny a/nebo jinými molekulami, které jsou dále charakterizovány tak, že:

- specificky interagují s jinými peptidy a/nebo proteiny a/nebo molekulárními strukturami. To umožní označení a/nebo připojení fúzního polypeptidu a/nebo proteinu určitého pletiva nebo typu buněk nebo umožní purifikaci zmíněných molekulárních struktur díky přítomnosti například 4, 5 nebo 6 za sebou jdoucích histidinových zbytků, nebo

- jsou cytotoxické k T-buňkám a/nebo B-buňkám jako například toxin cholery, nebo

- umožňují značení pomocí radioaktivní, fluorescenční nebo enzymatické značky, nebo pomocí imunokomplexu se zlatém (imunogold).

V určitých případech může být také žádoucí spojit dva nebo více peptidů dohromady do jedné peptidové struktury, nebo vytvořit větvený polypeptid. Jedna výhoda takovéhoto uspořádání je odborníkům dobře známá a týká se diagnostiky. Když se v testu pro detekci přítomných protilátek použijí antigeny, můžou tandemová opakování nebo větvené peptidy antigenů zvýšit množství imobilizovaných antigenů dostupných pro protilátky a tak zvýšit citlivost testu.

Když se použijí imobilizované antigeny společně se specifickou koncentrací takovýchto antigenů v rozpustné formě, může se citlivost zvýšit exponenciálně tím, že se indukuje tvorba křížově spojených imunoprecipitátů antigenů. Druhá výhoda se vztahuje k léčbě.

Ukládání autoimunitních komplexů proti vlastním antigenům v různých • · » · pletivech je důležitým krokem pro získání patologického stavu. Všeobecně se má za to, že hlavní příčinou zmíněného ukládání je nedostatečné čištění krve játry od antigen-imunitních komplexů díky malému rozměru zmíněných komplexů. Podávání zmíněných peptidů s tandemovými opakováními nebo větvených forem zmíněných peptidů by mohlo zvýšit velikost tvořených antigen-imunitního komplexů, tím zvýšit účinnost odstraňování a tak snížit ukládání zmíněných komplexů.

Předkládaný vynález se také vztahuje ke kruhovým formám zmíněných peptidů. Odborníkům jsou známé výhody - ty se vztahují ke zvýšené afinitě konformačně omezeného (constraint) peptidu ve srovnání s náhodněji stočenými formami lineárních peptidů.

Zkušený pracovník bude schopný navrhnout konzervativní a také nekonzervativní náhrady aminokyslin, nebo náhrady s aminokyselinami, které se nevyskytují přirozeně tak, aby se urovnaly případné negativní vlastnosti nárokovaných peptidů, jako rychlá degradace, rozpustnost, cytotoxické účinky atd. Ty se budou obecně týkat méně než 35% specifické sekvence. Takovéto peptidy také zahrnují peptidy se substituovanými vazbami a také další modifikace známé odborníkům, které se vyskytují jak přirozeně, tak uměle. V případech, kde jsou filagrinové peptidy předkládaného vynálezu vysoce polymorfní, může být žádoucí změnit jednu nebo více aminokyselin a tak lépe napodobit různé epitopy nebo zlepšit rozpoznání protilátkami přítomnými v séru pacientů s revmatickou artritidou.

Podle jiné formy se předkládaný vynález také vztahuje k novým alelickým variantám, které byly izolovány klonovány a sekvenovány; jsou charakterizované DNA sekvencí uvedenou na obrázku 6 a aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obrázku 2. Předkládaný vynález se také vztahuje ke všem analogům peptidů předkládaného vynálezu.

Termín „analog použitý ve specifikacích nebo nárocích pro popis proteinů nebo peptidů předkládaného vynálezu zahrnuje kterýkoliv protein nebo peptid se sekvencí aminokyselinových zbytků významně identickou se sekvencí zde uvedenou, kde je jeden nebo více zbytků konzervativně nahrazen biologicky ekvivalentním zbytkem. Příklady konzervativních substitucí zahrnují náhradu hydrofobního residua jako je isoleucin, valin, leucin nebo metionin za jiné, substituci jednoho hydrofilního residua za jiné, jako například • · · · vzájemnou výměnu argininu za lysin, glutaminu za asparagin, glycinu za serin, substituci jednoho bazického zbytku (např. lysin, arginin, histidín) za jiný, nebo substituci jednoho kyselého zbytku (např. kyselina asparagová, kyslina glutamová) za jiný. Příklady přípustných mutací podle vynálezu jsou uvedené v tabulce 1.

Slovní obrat „konzervativní substituce také zahrnuje použití chemicky změněného zbytku na místě nezměněného zbytku za předpokladu, že je výsledný protein biologicky ekvivalentní proteinu nebo peptidu vynálezu.

„Chemická odvozenina se vztahuje k proteinu nebo peptidu s jedním nebo více zbytky chemicky pozměněnými reakcí funkční ’ postranní skupiny nebo peptidům se substituovanými vazbami a také s jinými modifikacemi známými odborníkům, vyskytujícím se jak přirozeně tak uměle. Příklady takovýchto pozměněných molekul můžou být například ty molekuly, kde byly volné amino skupiny pozměněné tak, aby tvořily amin hydrochloridy, p-toulen sulfonylové skupiny, karbobenzoxy skupiny, t-butyloxylkarbonylové skupiny, chloracetylové skupiny nebo formylové skupiny. Volné karboxylové skupiny můžou být pozměněné tak, aby tvořily sole, metyl a etyl estery, nebo jiné typy esterů nebo hydrazidů. Volné hydroxylové skupiny můžou být pozměněné pro tvorbu O-acyl a O-alkyl derivátů. Imidazolový dusík histidinu se může změnit a vytvořit N-imbenzylhisitidin. Jako chemické odvozeniny jsou také zahrnuté ty proteiny nebo peptidy, které obsahují jednu nebo více odvozenin přirozeně se vyskytujících dvaceti standardních aminokyselin. Například: 4-hydroxyprolin se může nahradit prolinem; 5-hydroxylizin se může nahradit lyzinem; 3-metylhistidin se může nahradit histidinem; homoserin se může nahradit serinem; a ornitin í se může nahradit lysinem. Peptidy předkládaného vynálezu také zahrnují kterýkoliv protein nebo peptid s jednou nebo více adicemi . a/nebo delecemi, nebo zbytky, vztahujícími se k sekvenci peptidu, jehož sekvence je uvedena v tomto dokumentu, pokud je peptid biologicky ekvivalentní proteinům nebo peptidům vynálezu.

aminokyseliny	shodné skupiny
Ser (S)	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg (R)	Arg, His, Lys, Glu, Gin
Leu (L)	Leu; Ile, Met, Phe, Val, Tyr
Pro (P)	Pro, Ala, Thr, Gly
Thr (T)	Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin
Ala (A)	Ala, Pro, Gly, Thr .
Val (V)	Val, Met, Ile, Tyr, Phe, Leu, Val
Gly (G)	Gly, Ala, Thr, Pro, Ser
Ile (I)	Ile, Met, Leu, Phe, Val, Ile, Tyr
Phe (F)	Phe, Met, Tyr, Ile, Leu, Trp, Val
Tyr (Y)	Tyr, Phe, Trp, Met, Ile, Val, Leu
Cys (C)	Cys, Ser, Thr, Met
His (H)	His, Gin, Arg, Lys, Glu, Thr
Gin (Q)	Gin, Glu, His, Lys, Asn, Thr, Arg
Asn (N)	Asn, Asp, Ser, Gin
Lys (K)	Lys, Arg, Glu, Gin, His
Asp (D)	Asp, Asn, Glu, Gin
Glu (E)	Glu, Gin, Asp, Lys, Asn, His, Arg
Met (M)	Met, Ile, Leu, Phe, Val

Tabulka 1

Přehled aminokyselinových substitucí, které by mohly tvořit základ analogů (muteiny) jak je popsáno výše.

Kromě toho se můžou k amino- nebo karboxy- konci přidat další aminokyseliny nebo chemické skupiny s cílem vytvořit „spojovací raménko („linker arm), pomocí kterého se může peptid vhodně připojit k nosiči. Spojovací raménko bude tvořené alespoň jednou aminokyselinou, ale také až 60 aminokyselinami; nejčastěji bude mít velikost 1 až 10 aminokyselin. Připojení k pevné fázi nebo nosiči může být kovalentní nebo nekovalentní. Možná uspořádání jsou dobře popsané v odborné literatuře. Aby se získaly funkční skupiny pro připojení k pevné fázi nebo nosiči se můžou přidat k amino- konci nebo karboxy- konci přirozené aminokyseliny, jako např. histidin, cystein, lysin, tyrosin, kyselina glutamová nebo kyselina • 9 asparagová. Pro zajištění požadovaných chemických nebo fyzikálních vlastností peptidů se ale můžou použít i jiné chemické skupiny, jako například biotin nebo kyselina thioglykolová. Modifikovat se můžou také konce peptidů, například N-konec může být acetylován nebo koncová karboxykyselina se může upravit amidací. V každém případě je žádoucí, aby byl polypeptid co nejmenší a zároveň si v podstatě podržel citlivost velkého peptidu.

Peptidy vynálezu a zejména jejich fragmenty se můžou připravit klasickou chemickou syntézou. Syntéza se může provádět v homogenním roztoku nebo na pevné fázi. Například jedna technika, která se může použít pro syntézu v homogenním roztoku, je popsaná Houbenweylem v knize s názvem „Methode der organischen chemie (Method of organic chemistry) editor E. Wunsch, vol. 15 - I et II. THIEME, Stuttgart 1974. Polypeptidy vynálezu se také můžou připravit na pevné fázi podle metod popsaných autory Atherton a Shepard v jejich knize s názvem „Solid phase peptide synthesis (IRL Press, Oxford, 1989). Podoby nárokovaných peptidů se může dosáhnout náhradou citrulinových zbytků na místa původních argininových derivátů během klasické chemické syntézy, nebo post-syntetickou reakcí peptidů s peptidylarginin deaminázou jakéhokoliv eukaryotického původu.

Polypeptidy tohoto vynálezu se můžou také připravit technikami rekombinantní DNA, které jsou popsané v manuálu Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Provede se vložení sekvence polynukleové kyseliny kódující nárokované peptidy nebo část nárokovaných peptidů do vhodného vektora a transformace vhodného hostitele tímto vektorem. Tento rekombinantní expresní vektor obsahuje polynukleovou kyselinu definovanou výše nebo její část jak je uvedeno výše operačně připojenou k prokaryotickým, eukaryotickým nebo virálním transkripčním a translačním řídícím prvkům. Tato sekvence může být navíc operačně připojená k sekvencím, které umožní sekreci nárokovaných peptidů. Termín „vektor může zahrnovat plasmid, kosmid, fága nebo virus nebo transgenní organismus. Zejména užitečné můžou být BCG nebo adenovirové vektory a také rekombinantní viry ptačích neštovic (avipox).

Rekombinantní peptidy se můžou odvodit in vitro, reakcí exprimovaných a/nebo sekretovaných peptidů s libovolným • · · · eukaryotickým původem, nebo in vivo výběrem vhodného hostitele, jako jsou kvasinky, nebo jakákoliv eukaryotická buňka, nebo lépe využitím bakulovirového transformačního systému, nebo současnou expresí zmíněných peptidů s rekombinantní peptidylarginin deiminázou.

Pro produkci rekombinantních peptidů vynálezu se může použít také kterákoliv ze známých purifikačních metod pro rekombinantní peptidy.

Předkládaný vynález se také vztahuje k rekombinantnímu expresnímu vektoru, který obsahuje polynukleovou kyselinu nebo její část jak jsou definovány výše, operačně připojenou k prokaryotickým, eukaryotickým nebo virovým transkripčním a translačním řídícím prvkům.

Zmíněný rekombinantní vektor bude obecně obsahovat sekvenci vektora, vhodnou prokaryotickou, eukaryotickou nebo virovou promotorovou sekvenci následovanou nukleotidovou sekvencí kódující peptid definovaný výše. Je-li zmíněný rekombinantní vektor injikován jako samotná DNA, umožní expresi a/nebo sekreci kteréhokoliv z peptidů definovaných výše v prokaryotických, nebo eukaryotických hostitelech nebo v živých savcích.

Pro produkci rekombinantních polypeptidů předkládaného vynálezu se může také využít jakákoliv známá metoda pro purifikaci rekombinantních proteinů.

Výraz „vektor může zahrnovat plazmid, kozmid, fága nebo virus nebo transgenní zvíře. Zejména užitečné pro vývoj vakcíny můžou být BCG nebo adenovirové vektory a také rekombinantní viry ptačích neštovic.

Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě pro produkci rekombinantních polypeptidů definovaných výše, která zahrnuje:

- transformaci vhodného buněčného hostitele rekombinantím vektorem, do kterého byla vložena polynukleová kyselina definovaná výše nebo její část a která je pod řízením vhodných řídících elementů,

- pěstováním zmíněného transformovaného buněčného hostitele za podmínek umožňujících expresi a/nebo sekreci zmíněného inzertu a,

- získáním zmíněného polypeptidu.

Výraz „rekombinantně exprimovaný používaný v kontextu předkládaného vynálezu se vztahuje ke skutečnosti, že proteiny • · · ·

předkláddaného vynálezu jsou produkovány metodami rekombinantni exprese v prokaryotech či nižších nebo vyšších eukaryotech, jak je detailně diskutováno níže.

Termín „nižší eukaryoty se vztahuje k hostitelským buňkám jako jsou kvasinky, houby a podobně. Nižší eukaryoty jsou obecně (ale ne nezbytně) jednobuněčné. Mezi preferované nižší eukaryoty patří Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (např.

Pichia pastoris), Hansenula (např. Hansenula polymorpha) Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces a další. Nejpoužívanějšími kvasničnými hostiteli jsou Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis and K. lactis a jsou vhodnými houbovými hostiteli.

Termín „prokaryota se vztahuje k hostitelům jako E.coli, Lactobacillus, hactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis or Streptomyces. Také tyto hostitelé jsou uvažováni v předkládaném vynálezu.

Termín „vyšší eukaryoty se vztahuje k hostitelským buňkám odvozeným od vyšších zvířat, jako například savců, plazů, hmyzu a podobně. V současné době se preferují hostitelské buňky vyšších eukaryot odvozené od čínských křečků (Chinese hamster) (například CHO), opic (např. COS nebo Věro buňky), ledvin mláďat křečků (BHK), prasečích ledvin (PK15), králičích ledvinových buněk 13 (RK13), buněčné linie lidského osteosarkomu 143 B, lidské buněčné linie HeLa a buněčné linie lidského hepatomu jako Hep G2 a hmyzí buněčné linie (např. Spodoptera frugiperda). Hostitelské buňky můžou být ve formě suspenze nebo kultur pěstovaných v lahvích (flask cultures), tkáňových kultur, orgánových kultur a podobně. Hostitelskými buňkami můžou být také transgenní zvířata.

Termínem „rekombinantni polynukleotid nebo „nukleová kyselina se myslí polynukleotid nebo nukleová kyselina s genomovým, cDNA, semisyntetickým nebo syntetickým původem, která na základě svého původu nebo díky manipulaci: (1) není spojená s celým nebo částí polynukleotidu se kterým je spojena přirozeně (2) je připojená k jinému polynukleotidu než ke kterému je připojena přirozeně, nebo (3) nevyskytuje se přirozeně.

Termín „rekombinantní hostitelské buňky, „hostitelské buňky, „buňky, „buněčné linie, „buněčné kultury a jiné podobné termíny označují mikroorganismy nebo vyšší eukaryotní buněčné linie pěstované jako jednobuněčné entity a vztahuje se k buňkám, které můžou být nebo které byly použité jako příjemci rekombinantního vektora nebo jiného přeneseného polynukleotidu a zahrnují potomstvo původní buňky, která byla transfekována. Je jasné, že potomstvo jedné rodičovské buňky nemusí být nutně úplně identické co se týče morfologie, genomové nebo celkové DNA jako původní rodič, vzhledem k přirozeným, náhodným nebo záměrným mutacím.

Výraz „replikon se používá pro jakýkoliv genetický element, jako např. plazmid, chromozom, virus, kosmid atd., který se chová jako autonomní jednotka polynukleotidu replikujícího se v buňce, tj. je schopný replikace pod svou vlastní kontrolou.

Termín „vektor označuje replikon dále obsahující sekvence zajišťující replikaci a/nebo expresi požadovaného otevřeného čtecího rámce.

Výraz „řídící sekvence se vztahuje k polynukleotidovým sekvencím, které jsou nezbytná pro uskutečnění exprese kódujících sekvencí, ke kterým jsou přiligovány. Povaha takovýchto řídících sekvencí se liší v závislosti na hostitelském organismu;

v prokaryotech takovéto řídící sekvence obecně zahrnují promotor, místo pro navazování ribozómu, sestřihová místa a terminátory; v eukaryotech takovéto řídící sekvence obecně zahrnují promotory, sestřihová místa, terminátory a v některých případech zesilovače. Předpokládá se, že výraz „řídící sekvence zahrnuje minimálně všechny komponenty, jejichž přítomnost je nezbytná pro expresi a že může také zahrnovat dodatečné složky, jejichž přítomnost je výhodná, například zaváděcí (leader) sekvenci, která řídí sekrecí.

Výraz „promotor označuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje konsensuální sekvence, které umožňují navázání RNA polymerázy k DNA templátu takovým způsobem, že se inicializuje tvorba mRNA pro přilehlý strukturní gen na normálním místě zahájení transkripce.

Výraz „operačně připojená se vztahuje k takovému postavení vedle sebe (juxtaposition), kde složky takto označené jsou ve vzájemném vztahu, který jim umožňuje fungovat zamýšleným způsobem.

Řídící sekvence „operačně připojenáke kódující sekvenci je přiligována tak, že za podmínek hodících se pro řídící sekvence se dosáhne exprese kódující sekvence.

Polynukleové kyseliny kódující peptidy předkládaného vynálezu a vložené do sekvence vektora můžou být připojené k signální sekvenci. Zmíněná signální sekvence může být z jakéhokoliv zdroje, např. IgG, nebo to může být úvodní sekvence pletivového plasminogenového aktivátoru (tpa) pro expresi v savčích buňkách, nebo sekvence alfa konjugačního faktoru pro expresi do kvasničných buněk.

Pro získání peptidů předkládaného vynálezu se může použít řada vektorů. Nižší eukaryoty jako například kvasinky a glykosilační mutantní kmeny jsou typicky transformovány plasmidy nebo rekombinantním virem. Vektory se můžou replikovat v hostiteli nezávisle, nebo se můžou integrovat do genomu hostitelské buňky.

Vyšší eukaryoty se můžou transformovat vektory, nebo se můžou infikovat rekombinantními viry, například rekombinantním virem kravských neštovic. Techniky a vektory pro vložení cizorodé DNA do viru kravských neštovic jsou odborníkům dobře známé a využívají například homologní rekombinanci. Dostupná je celá řada virových promotorových sekvencí, možných terminátorových sekvencí a dodatečných póly(A) sekvencí, možných zesilovacích sekvencí a možných amplifikačních sekvencí, všechny nezbytné pro savčí expresi. Zvláště preferovaný je virus kravských neštovic, protože zastaví expresi proteinů hostitelské buňky. Také se velmi preferuje proto, že umožňuje expresi f.i. peptidů předkládaného vynálezu v buňkách nebo jedincích, které/kteří jsou imunizování živými rekombinantními viry kravských neštovic. Pro vakcinaci lidí jsou zvláště vhodné virus ptačích neštoviv (avipox) a Ankara Modified Virus (AMV).

Známé jsou také hmyzí expresní přenosové vektory odvozené od bakuloviru Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), který je virovým expresním vektorem nezávislým na pomocné komponentě (helper-independent viral expression vector). Expresní vektory odvozené od tohoto systému obvykle používají pro řízení exprese heterologního genu silný virový promotor polyedrového genu (strong viral polyhedrin gene promotor). Odborníci zběhlí v problematice bakulovirové exprese budou znát různé vektory a metody vnesení heterologní DNA do požadovaného místa bakuloviru.

Odborníci znají také různé signály pro postranslační modifikace rozeznávané v hmyzích buňkách.

Předkládaný vynález se také vztahuje k hostitelské buňce transformovaném rekombinantním vektorem definovaným výše.

Předkládaný vynález se také vztahuje k protilátkám, které byly specificky připravené proti peptidům předkládaného vynálezu, přednostně proti těm peptidům, kde jsou argininy změněny na citrulin. Tyto protilátky můžou být polyklonální nebo monoklonální. Pro přípravu protilátek se imunizuje hostitelské zvíře peptidy předkládaného vynálezu ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž alespoň jeden arginin je nahrazen citrulinem. Mezi farmaceuticky akceptovatelný nosič patří kterýkoliv nosič, který sám neindukuje tvorbu protilátek, které by škodily jedinci, kterému se aplikuje směs. Vhodnými nosiči jsou typicky velké, pomalu metabolizované makromolekuly, jako proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny (polylactic acids), polyglykolové kyseliny, polymerní aminokyseliny, kopolymery aminokyselin; a inaktivní virové částice. Takovéto nosiče jsou odborníkům běžně známé.

Preferovanými adjuvans pro zvýšení účinnosti složení jsou například: hydroxid hlinitý (alum), N-acetyl-muramyl-L-threonyl-Disoglutamin (thr-MDP) jak je uvedeno v U.S. Patent No. 4 606 918, Nacetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramylL-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1’-2’-dipalmitoyl-sn-glycero3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine (MTP-PE) a RIBI, který obsahuje tři složky extrahované z baktérií, monofosforyl lipid A, trehalóza dimikolát (trehalose dimycolate) a skeleton buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) v emulzi 2% skvalenu/Tween 80. Kterákoliv ze tří složek MPL, TDM nebo CWS se může použít samostatně nebo v kombinaci 2 na 2. Můžou se použít i jiná adjuvans, jako Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) nebo SAF-1 (Syntex). Pro nehumánní aplikace a výzkumné účely se může také využít Freundovo úplné adjuvans (CFA) a neúplné Freundovo adjuvans (IFA) .

Imunogenní směsy budou typicky obsahovat farmaceuticky akceptovatelné rozpouštědla (vehicles), jako vodu, fyziologický roztok, glycerol, etanol atd. Kromě toho můžou takováto rozpouštědla obsahovat pomocné substance, jako zvlhčovači nebo emulsifikační činidla, látky udržující pH, konzervační látky a podobně.

• ft · ftftftft • ftft · ····· • ftft ·· ftftft •ftft ·· ft······ ·· ···

Imunogenní směsi jsou typicky připravené ve formě injekcí buď jako tekuté roztoky nebo jako suspenze; můžou se také připravit v pevné formě vhodné pro rozpuštění nebo přípravu suspenzí v tekutině před injekcí. Pro zvýšení adjuvačního účinku se přípravek může také emulsifikovat nebo opouzdřit v liposomech. Do imunitního stimulačního komplexu (Immune Stimulating Complex) se můžou také začlenit proteiny společně se saponiny, jako například Quil Ά (ISCOMS).

Imunogenní směsi použité pro přípravu protilátek obsahují jednak „dostatečné množství nebo „imunologicky účinné množství peptidů předkládaného vynálezu a také podle potřeby kteroukoliv další výše zmíněnou složku. „Imunologicky účinné množství znamená, že podání tohoto množství jednotlivci (ať už v jedné dávce nebo jako část série) je účinné k vyvolání imunologické odpovědi a pro tvorbu protilátek, jak je uvedeno výše. Toto množství je různé v závislosti na zdravotním a tělesném stavu jedince, taxonomické skupině použitého jedince (tj. nehumání primát, primát, králík apod.), kapacitě imunního systému jedince syntetizovat protilátky, imunogenicitě antigenního peptidu, způsobu jeho podávání a dalších příslušných faktorech. Dá se očekávat, že množství bude ležet v relativně širokém rozsahu, který se může určit rutinními pokusy. Obvykle se množství bude pohybovat od 0,01 do 1000 ug/dávku, nejspíše od 0,1 do 100 ug/dávku.

Imunogenní směsi jsou obvykle podávány parenterálně, typicky injekčně, například subkutánně nebo intrámuskulárně. Mezi další doplňkové preparáty vhodné pro jiné metody podávání patří perorální přípravky a čípky. Může se použít jedna dávka nebo více dávek. Vakcína se může podávat v kombinaci s jinými imunoregulačními dávkami.

Za vhodný časový úsek se odebere plasma nebo sérum hostitele obsahující protilátky reagující s peptidy předkládaného vynálezu.

S využitím nasyceného síranu amonného, DEAE Sephadexu nebo jiných technik známých odborníkům se získá gamaglobulinová frakce nebo IgG. Tyto protilátky jsou v podstatě bez mnoha nepříznivých postranních dopadů, které můžou být spojené s jinými antivirálními látkami, jako léčivy pro léčení infekční, chronické nebo opakující se mononukleózy. Takovéto protilátky se můžou také použít pro diagnózu • · · · některých onemocnění, jako Burkittův lymfom (když se použil virus Epstein-Barrové).

Výraz imunogenní se vztahuje k schopnosti látky vyvolat humorální a/nebo buněčnou odpověď ať už samotné nebo při připojení k nosiči, společně s adjuvans nebo bez adjuvans.

Protilátky předkládaného vynálezu můžou také být monoklonální, které jsou připravené tak, že zmíněná protilátka specificky reaguje s kterýmkoliv ze zmíněných peptidů a tato přičemž zmíněná protilátka je přednostně monoklonální protilátkou.

Monoklonální protilátka vynálezu se může připravit z jakéhokoliv hybridomu připraveného klasickými metodami z buněk sleziny zvířat (zejména krysy nebo myši) imunizovaných nárokovanými peptidy předkládaného vynálezu na jedné straně a buněk myelomové buněčné linie na straně druhé. Hybridom se vybere na základě schopnosti produkovat monoklonální protilátky rozpoznávající citrulinové formy peptidů, které se použily původně pro imunizaci zvířat.

Protilátky zahrnuté do vynálezu se můžou označit vhodnou enzymatickou, fluorescenční nebo radioaktivní značkou.

Monoklonální protilátky v této preferované formě vynálezu můžou být humanizované myší monoklonální protilátky připravené technikami rekombinantní DNA, přičemž se vychází z částí myší a/nebo lidské DNA sekvence kódující H a L řetězce, nebo z cDNA klonů kódujících H a L řetězce.

Monoklonální protilátky podle této preferované formy vynálezu můžou být také lidskými monoklonálními protilátkami. Tyto protilátky můžou být podle této předkládané formy vynálezu také odvozené z lidských lymfocitů periferní krve pacientů s revmatickou artritidou. Takovéto lidské monoklonální protilátky se můžou připravit například novým obsazením myší s vážnou kombinovanou imunodeficiencí (SCID, severe combined immune deficiency) lidskými lymfocity periferní krve (PBL) (nedávný přehled viz Duchosal et al. 1992), nebo vyšetřením vakcinovaných jedinců na přítomnost reaktivních B-buněk s využitím antigenů prezentovaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také vztahuje k anti-idiotypovým protilátkám, které vznikají při imunizaci protilátkami definovanými • · · ·· · · ·

9·9 ·· »·· ···· ·· ··· výše a které specificky reagují se zmíněnými protilátkami, napodobujíc tak peptidy předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také vztahuje ke zkráceným formám nebo jednořetězcovým formám protilátek a anti-idiotypových protilátek definovaným výše, které si ponechaly svojí původní specifitu pro reakci s antigeny.

Předkládaný vynález se také vztahuje k proteinům nebo peptidům, které napodobují protilátky definované výše, jako jsou mikroproteiny, které se můžou získat pomocí metody „phage display, nebo vysoce variabilní doména rekombinantní protilátky získané vyhledáváním možnosti klonování (screening upon repertoire cloning).

Předkládaný vynález se také vztahuje k metodě pro detekci protilátek, které specificky reagují s peptidy nebo antiidiotypovými protilátkami předkládaného vynálezu přítomnými v biologickém materiálu, která zahrnuje:

(i) reakci biologického vzorku analyzovaného na přítomnost zmíněných protilátek s peptidem nebo anti-idiotypovou protilátkou definovanými výše, (ii) detekci imunologických komplexů vytvořených mezi zmíněnými protilátkami a zmíněným peptidem nebo anti-idiotypovou protilátkou.

Předkládaný vynález se také vztahuje k opačné metodě pro detekci peptidů a/nebo anti-idiotypových protilátek předkládaného vynálezu protilátkami přítomnými v biologickém vzorku, které specificky reagují se zmíněnými peptidy a/nebo anti-idiotypovými protilátkami, které napodobují takovéto peptidy, obsahující:

(i) reakci biologického vzorku analyzovaného na přítomnost zmíněných peptidů nebo anti-idiotypových protilátek s protilátkami definovanými výše, (ii) detekci imunologického komplexu tvořeného mezi zmíněnými protilátkami a zmíněným peptidem nebo anti-idiotypovou protilátkou.

Metody definované výše se můžou využít v diagnóze revmatické artritidy.

Ve specifické formě se předkládaný vynález také vztahuje k vývoji diagnostických technik, které umožňují rozlišení těmi autoimunitními onemocněními, kdy charakteristické protilátky často křížově reagují s tím samým antigenem, z čehož vyplývá těžká a pomalá diagnóza. Takovéto diagnostické techniky se můžou dosáhnout současným použitím několika antigenů a/nebo anti-idiotypových protilátek předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také vztahuje k diagnostické soupravě pro použití při detekci přítomnosti zmíněných protilátek, kdy zmíněná souprava obsahuje alespoň jeden peptid nebo anti-idiotvpovou protilátku nebo mikroprotein definované výše, kdy jsou zmíněný peptid nebo anti-idiotypová protilátka nebo mikroprotein přednostně navázané na pevnou fázi.

Předkládaný vynález se také vztahuje k diagnostické soupravě pro určení typu autoimunitního onemocnění, kdy zmíněná souprava obsahuje alespoň jeden peptid nebo anti-idiotypovou protilátku nebo mikroprotein definované výše, kdy jsou zmíněný peptid nebo antiidiotypová protilátka nebo mikroprotein přednostně navázané na pevnou fázi.

Předkládaný vynález se také vztahuje k diagnostické soupravě definované výše, kdy zmíněná souprava zahrnuje řadu zmíněných peptidů a/nebo anti-idiotipových protilátek protilátkou nebo mikroprotein, které jsou navázané na určitá místa pevného podkladu.

Předkládaný vynález se také vztahuje k diagnostické soupravě definované výše, kde je zmíněný pevný podklad membránový proužek a zmíněné peptidy a/nebo anti-idiotypové protilátky nebo mikroproteiny jsou připojené k membráně ve formě souběžných drah.

Metody imunotestů podle předkládaného vynálezu můžou používat například jednotlivé nebo specifické oligomerní antigeny, dimérní antigeny a také kombinaci jednotlivých nebo specifických oligomerních antigenů. Peptidy předkládaného vynálezu se můžou využít v prakticky kterémkoliv formátu testů, které využívají známý antigen pro detekci protilátek, které charakterizují určité onemocnění nebo infekci. Běžnou znakem všech těchto testů je to, že antigenní peptid nebo anti-idiotypová protilátka nebo mikroprotein reagují s částí těla podezřelou, že obsahuje protilátky za podmínek, které umožní vazbu antigenu na jakoukoliv takovou protilátku přítomnou v (podezřelé) části. Typicky budou takovýmito podmínkami fyziologická teplota, pH a iontová síla při nadbytku antigenu. Po • ··» 4 4 94 44 · • 4 4 4 4 4 4 4 9 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 · · · · * · · » 4 4 4 4 4

444 44 «·· ·«·· ·· 4·· inkubaci antigenu se vzorkem následuje detekce imunitních komplexů obsahujících antigen.

Provedení imunotestů podléhá velkým odchylkám a odborníci znají mnoho různých úprav. Protokoly můžou například využívat pevný povrch nebo imunoprecipitaci. Většina testů zahrnuje použití značených protilátek nebo peptidů; značkami můžou být například enzymatické, fluorescenční, chemiluminiscenční, radioaktivní nebo barvivové molekuly. Známé jsou také testy, které zesilují signály z imunitního komplexu; příklady můžou být testy využívající biotin a avidin nebo streptavidín a imunotesty využívající enzymatické značky, jako třeba ELISA testy.

Imunotest může být například v heterogenním nebo homogenním formátu a standardního nebo kompetitivního typu. U heterologního formátu jsou peptid nebo auto-idiotypová protilátka nebo mikroprotein typicky navázané na pevný povrch nebo nosič pro usnadnění oddělení vzorku od peptidů nebo auto-idiotypové protilátky nebo mikroproteinu po inkubaci. Příkladem pevného povrchu může být nitrocelulóza (např. ve formě membrány nebo mikrotitrační jamky), polyvinyl chlorid (např. ve formě fólie nebo mikrotitračních jamek), polystyrénový latex (např. jako kuličky nebo mikrotitrační jamky), polyvinyliden fluorid (známý jako Immnolon™), diazovaný (diazotized) papír, nylonové membrány, aktivované kuličky a Protein A kuličky.

V heterologním formátu se můžou použít například mikrotitrační destičky Dynateh Immulon™ 1 nebo Immulon™ 2, nebo 0,25 palcové polystyrénové kuličky (Precision Plastic Balí). Pevný povrch obsahující antigenní peptidy nebo anti-idiotypové protilátky nebo mikroprotein se po oddělení od testovaného vzorku zpravidla před detekcí navázaných protilátek opláchnou. Jak standardní tak kompetitivní formáty jsou v oboru známé.

V homogenním formátu je testovaný vzorek inkubován s kombinací antigenů v roztoku. Například může být za podmínek, kdy vyprecipituji všechny vytvořené komplexy antigen-protilátka, nebo anti-idiotypová protilátka-protilátka, nebo mikroprotein-protilátka. Jsou známé jak standardní, tak kompetitivní formáty těchto testů. Například pro charakterizaci revmatické artritidy standardním formátem se přímo sleduje množství protilátek revmatické artritidy v komplexech antigen-protilátka. Může se to provést určením, jestli druhý typ značených anti-xenogenetických (např.proti-lidských) protilátek, které rozeznávají epitop na prvním typu protilátek revmatické artritidy, se bude vázat díky tvorbě komplexů. U kompetitivního uspořádání se množství protilátek revmatické artritidy ve vzorku určí sledováním kompetitivního účinku na navazování známého množství značené protilátky (nebo jiného kompetujíčího ligandu) v komplexu. Detekce protilátek revmatické artritidy pro diagnózu revmatické artritidy je použitá jako ilustrace. Kdykoliv se použije v této specifikaci termín „protilátky revmatické artritidy, neměl by být chápán jako omezení. Stejně tak jsou ostatní autoimunitní choroby diagnostikované detekcí jiných protilátek a mononukleóza se diagnostikuje detekcí protilátek proti viru Epsteina-Barrové.

Vytvořené komplexy obsahující protilátky revmatické artritidy (nebo v případě kompetitivního testu množství kompetující protilátky) jsou detekovány kteroukoliv z řady známých technik v závislosti na formátu. Například neznačené protilátky revmatické artritidy v komplexu se můžou detekovat použitím konjugátu antixenogenetických Ig s připojenou značkou (např. enzymovou značkou).

V imunoprecipitačním nebo aglutinačním testovacím formátu vytvoří reakce mezi antigeny revmatické artritidy a protilátkami revmatické artritidy síťovou strukturu, která vyprecipituje z roztoku nebo suspenze a tvoří viditelnou vrstvu nebo film precipitátu. Když v testovaném vzorku není přítomná protilátka revmatické artritidy nedojde k vytvoření viditelného precipitátu.

V současné době existují tři specifické typy testů s aglutinací částic (PA - particle agglutination). Tyto testy se používají pro detekci protilátek proti různým antigenům pokrývajících nosič. Jeden typ tohoto testu je hemaglutinační test využívající červené krvinky (red blood cells, RBC), které jsou senzibilované pasivní adsorpcí antigenu (nebo protilátky) k RBC. Přidáním protilátek proti specifickému antigenu přítomnému v tělním složce (je-li v ní) způsobí aglutinaci RBC pokrytými purifikovaným antigenem.

Pro eliminaci případných nespecifických reakcí v hemaglutinačním testu se můžou použít dva umělé nosiče místo RBC v PA. Nejběžnější jsou latexové částice. Můžou se ale také použít želatinové částice. Testy využívající kterýkoliv z těchto nosičů jsou založené na pasivní aglutinaci částic pokrytých purifikovanými antigeny.

Antigenní peptidy předkládaného vynálezu budou typicky balené ve formě soupravy pro využití v těchto imunotestech. Souprava bude normálně obsahovat v oddělených lahvičkách antigenní peptid nebo anti-idiotypovou protilátku, preparát kontrolní protilátky (pozitivní a/nebo negativní), značenou protilátku (když to uspořádání testu vyžaduje) a když značka nevyvolává přímo signál tak činidla vyvolávající signál (např. enzymový substrát). Antigenní peptid nebo anti-idiotypová protilátka může být už navázaná na pevný povrch nebo samostatně s činidly pro navázání na matrix. Souprava bude většinou obsahovat i instrukce pro provedení testu (např. psaný text, pásku, CD-ROM a podobně).

Vybraná pevná fáze může zahrnovat polymerní nebo skleněné kuličky, nitrocelulózu, mikročástice, mikrojamky reakční misky, testovací zkumavky a magnetické kuličky. Sloučenina produkující signál může být enzym, luminiscenční sloučenina, chromogen, radioaktivní prvek a chemiluminiscenční sloučenina. Příkladem enzymu může být alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza a beta-galaktosidáza. Mezi zesilovače patří třeba biotin, anti-biotin a avidin. Mezi sloučeniny vázající zesilovače patří například biotin, anti-biotin a avidin. Aby se blokoval účinek substancí podobných revmatickému faktoru, působí se na testovaný vzorek takovými podmínkami, které dostatečně blokují účinek látek podobných revmatickému faktoru. Tyto podmínky zahrnují reakci testovaného vzorku s množstvím například králičích lg nebo proti-lidských IgG, nejlépe agregovaných, aby se vytvořila směs a inkubaci této směsi po určitou dobu a za podmínek dostatečných pro tvorbu produktu reakční směsi v podstatě bez substancí podobných revmatickému faktoru.

Předkládaný vynález se zejména vztahuje k formátu imunotestů, kde je několik peptidů vynálezu připojeno k membráně ve formě souběžných drah. Tento testovací formát je zejména vhodný pro rozlišení odlišných autoimunitních onemocnění.

V další formě se předkládaný vynález vztahuje k biotestum pro identifikaci sloučenin, které mění vazbu mezí autoantigenem a protilátkou specifickou pro revmatickou artritidu a které zahrnují;

i) - reakci autoprotilátek specifických pro revmatickou artritidu s kterýmkoliv z výše zmíněných peptidů nebo přechodných vláknitých proteinů nebo jejích kombinací.

- určením vazby protilátek specifických pro revmatickou artritidu s kterýmkoliv z výše uvedených peptidů, přechodných vláknitých proteinů nebo jejich kombinací.

ii) - reakci sloučeniny nebo kombinace sloučenin a protilátek specifických pro revmatickou artritidu (současně nebo jednu po druhé) s kterýmkoliv z výše zmíněných peptidů, přechodných vláknitých proteinů nebo jejich kombinací.

- určením vazby protilátek specifických pro revmatickou artritidu s kterýmkoliv z výše uvedených peptidů,přechodných vláknitých proteinů nebo jejich kombinací.

iii) - určením ovlivnění vazby protilátek specifických pro revmatickou artritidu s kterýmkoliv z výše uvedených peptidů, přechodných vláknitých proteinů nebo jejich kombinací, indukované sloučeninou nebo kombinací sloučenin porovnáním výsledků I) a II).

V další formě se předkládaný vynález vztahuje k modulátoru interakce mezi autoantigenem a protilátkou specifickou pro revmatickou artritidu a metodě pro produkci zmíněného modulátoru, kdy se tento modulátor identifikuje biotestem popsaným výše.

Zde použitý pojem „sloučenina (compound) se musí interpretovat v širším významu a můžou to být proteiny, peptidy, polypeptidy, mimetické peptidy (peptidomimetics), glycidy, lipidy nebo jiné organické či anorganické molekuly, nebo protilátky, které může vytvářet sám hostitel po vakcinaci.

Zde používaný výraz „vazba naznačuje, že je výše popsaný peptid je fyzicky připojený k protilátkám, se kterými se vzájemně ovlivňuje. Vazba peptidu k protilátce se může demonstrovat kteroukoliv metodou známou odborníkům, jako např. vazebným, ELISA a RIA testem, nebo kompetitivními testy (příklady viz sekce Příklady a Current protocols in immunology).

Výrazy „modulace nebo „modulovat se vztahují jak k regulaci na začátku (upregulation) (např. aktivace nebo stimulace (např.

agonizovánim (agonizing) nebo potenciace (potentiating))) tak k regulaci na konci (downregulation) (tj. inhibice nebo suprese (např. antagonizováním, snížením nebo inhibici)) vazby mezi peptidem a anti-HCV protilátkou.

Zde použitý termín „modulátor se vztahuje ke schopnosti sloučeniny popsané výše ovlivňovat jak je popsáno výše.

Zde používaný výraz „peptidy napodobující (mimetické peptidy, peptidomimetics) se vztahuje k molekulám, které se můžou připravit a které můžou napodobit ty rezidua peptidů, které mění interakci protilátky s peptidem, jak je popsáno výše. Například nehydrolyzovatelná peptidová analoga takovýchto zbytků se můžou připravit použitím benzodiazepinu (benzodiazepine) (např. Freidinger et al. v Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), azepinu (azepine) (např. Huffman et al. v Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), PNA, substituovaných gama laktamových kruhů (Garvey et al. v Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), ketometylenových pseudopeptidů (ketomethylene pseudopeptides) (Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29:295: a Ewenson et al. v Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, III., 1985), dipeptidových jader s beta otáčením (beta-turn dipeptide cores) (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26:647; and Sáto et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231), a beta-aminoalkoholů (betaaminoalcohols) (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun, 126:419; a Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71).

Popisy obrázků

Obr 1: HPLC profil tryptického štěpení lidského přirozeného kyselého (a) a neutrálního (b) filagrinu.

Peptidy se rozdělily pomocí HPLC na reverzní fázi na C-4 Vydac koloně (2,1 x 250 mm, Hesperia, CA) s využitím 140B Solvent Delivery System (ABI, Foster City, CA); vymývání z kolony se provedlo 8-70% lineárním gradientem 70% acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině (TFA). Detekce se prováděla při 214 nm detektorem s diodovým polem 1000S.

Obr2: Vzájemné srovnání sekvencí filagrinového proteinu a přehled sekvenovaných peptidů. Klony HB2641, HB2642, HB2648 a HB2650 jsme izolovali sami; všechny ostatní sekvence jsou získané z literatury.

Znak naznačující, že pozice je zcela konzervovaná:*

Znak naznačující, že pozice je hodně konzervovaná:.

Obr. 3: Reaktivita 26 lidských RA sér se syntetickými peptidy na LIA.

Peptidy IGP1155, 1156, 1157 a 1158 obsahují všechny citrulin; IGP1179, 1180, 1181 a 1182 byly odpovídajícími protějšky bez zabudovaného citrulinu. Peptidy se aplikovaly po tvorbě komplexu se streptavidinem v koncentraci 400 ug/ml. IGP1154 se skládal z vedlejšího (irrelevant) syntetického peptidu.

Obr. 4: Inhibice ELISA při využití přirozeného filagrinu jako inhibiční látky.

Plotny se potáhly purifikovaným lidským přirozeným filagrinem v koncentraci 1 ug/ml. Séra byla zředěná 1/50 a přidala se do jamek s nebo bez preinkubace s přirozeným filagrinem v koncentraci 1 nebo 10 ug/ml. Hodnoty OD se měřily při 450 nm.

Obr. 5: Inhibice ELISA při využití syntetických, citrulin obsahujících filagrinových peptidů jako inhibičních látek.

····· · · · ·· · • · · · · · · ···· • · · · · · · • ·· · ····· • · · ·· · · · •·· · · ······· ·· ···

Plotny se potáhly purifikovaným lidským přirozeným filagrinem v koncentraci 4 ug/ml. Séra byla zředěná 1/50 a přidala se do jamek s nebo bez preinkubace s jednotlivými peptidy (IGP1155, 1156, 1157, 1158) nebo se směsí těchto čtyř peptidů (mix), každý v koncentraci 100 ug/ml. Hodnoty OD se měřily při 450 nm.

Obr. 6: Vzájemné srovnání sekvencí klonů HB2641, HB2642, HB2648 a HB2650 s HFL1 sekvencí získanou z literatury (McKinley-Grant et al., 1989).

Znak naznačující, že pozice je zcela konzervovaná:*

Znak naznačující, že pozice je hodně konzervovaná:.

Obr. 7: 2D imunobloty placentálních extraktů.

200 ug frakce získané vymytím placentálního extraktu pomocí 200mM sole se rozdělilo na 2D elektroforéze s využitím IPG 4-7 pro první rozměr a 10% Laemli gelu pro druhý rozměr. Proteiny byly elektricky přeblotovány na nitrocelulózovou membránu a poté se na bloty aplikovaly a) lidské sérum revmatické artritidy (zředěné 1/200) nebo b) monoklonální protilátka proti lidskému vimentinu (Sigma) při ředění 1/5000. Šipka naznačuje umístění referenčního PDI proteinu, označeného jehlou po obarvení všech proteinů Ponceau S.

• · · · • · · • · ·

Příklady

Příklad 1: Mapování epitopů filagrinu

1.1 Séra

Lidská séra se získala z Revmatologického oddělení Universitní nemocnice v Gentu (Belgie). Celkem 265 sér, z nichž 75 splňovalo měřítka ARA pro RA (Arnett et al., 1987), 155 bylo pozitivních v APF • fluorescenčním testu (De Keyser et al., v tisku), 98 reagovalo s přirozeným filagrinem na Western blotech, 80 bylo APF negativních * a 16 bylo odvozených ze zdravých kontrol.

1.2 Příprava lidského filagrinu

Přírodní filagrin se purifikoval z lidské kůže získané krátce po abdominoplastii (abdominoplasaty) protokolem popsaným v Simon et al. (1983). Pokožka se oddělila od škáry inkubací kousků kůže při 56 °C v PBS s 5 mM EDTA. Materiál se uskladnil suchý při -20 °C až do použití. Pokožka se rozdělila na malé kousky, které se homogenizovaly v 40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA,

0,5% NP-40, 0,1% NaN₃, 0,1 mM PMSF (0,2 ml/cm²) a míchaly přes noc při 4 °C. Homogenát se centrifugoval po dobu 15 minut při 15 000 g a proteiny extrahované v supernatantu se precipitovaly přes noc při 20 °C přidáním 5 objemů absolutního alkoholu. Po 15minutové centrifugaci při 10 000 g se proteinové pelety vakuově vysušily a následně resuspendovaly ve vodě. Tento částečně purifikovaný proteinový přípravek se označuje jako filagrin. Množství proteinu se « určilo Bradfordovým proteinovým testem modifikovaným podle Petersona (1983) s využitím kalibračních křivek BSA.

1.3 Imunologická detekce antifilagrinových protilátek v lidském séru

S nečištěným filagrinovým preparátem se provedla 10% Tricin

SDS-PAGE elektroforéza na mini-gel přístroji firmy Bio-Rad. Do velké štěrbiny se nanesly 2 ug proteinu/cm a podrobily elektroforéze za standardních podmínek. Pak se gel přeblotoval (elektroblot) během 40 minut na nitrocelulózovou membránu v 10% metanolu, 10 mM CAPS, pH • ·· • « · · ·

11,0. Blot se blokoval v PBS s 0,05% Tween 20 a 1% želatiny a rozřezal na 3mm proužky. Na ty se potom aplikovalo přes noc lidské sérum zředěné 1/100 v PBS s 0,05% Tween 20 a 0,1% želatiny. Jako druhotná protilátka se přidal konjugát proti-lidských IgG-AP (Sigma, St Louis, MI) v ředění 1/1000; vizualizace se provedla s využitím chromogenního substrátu NBT/BCIP.

1.4 Dvourozměrná elektroforéza filagrinu

Filagrinový materiál se separoval 2D elektroforézou s využitím Immobiline DryeStrips pH 3-10 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) pro první rozměr a 10% Tricin SDS-PAGE pro druhý rozměr za standardních podmínek. Na preparativní gely se naneslo 300 ug proteinu a obarvily se Coomassie R-250. Imunoreakcí s antifilagrinovou mohoklonální protilátkou (BTI, Stoughton, MA) se identifikovala velká filagrinová čárkovitá skvrna, pí tohoto heterogenního proteinu se pohybovalo v rozmezí 6,7 - 8,5 (7,1 - 8,5 na gelu) a molekulové hmotnosti se detekovaly v rozsahu 35-68 kDa, přičemž kyselejší izoformy reprezentovaly vyšší hmotnosti.

1.5 Elektro eluce filagrinu

Velká filagrinová skvrna se vyřízla z gelu a rozdělila na tři části: i) kyselá forma s pí 7,1-7,5; neutrální frakci s pí 7,5-8,1; iii) zásaditou frakci s pí 8,1-8,5. Každá frakce se izolovala elektroelucí, metodou kterou popsal Hunkapiller et al. (1983) s použitím 50 mM (NH₄)HCO₃, 0,1% SDS jako elučního pufru. Coomassie barvivo a SDS se odstranily z vymytých proteinů extrakcí iotových párů (by ion pair extraction) podle popisu v práci Kónigsberg and Henderson (1983). Vakuově vysušené proteinové pelety se rozpustily ve vhodném pufru pro další analýzu.

1.6 Mapování peptidů

Purifikované filagrinová frakce získané elektroelucí o hmotnosti ±100 ug se rozpustily v 10 ul 100 mM (NH₄)HCO₃, pH 8,0 s 10% acetonitrilem a rozštěpeny trypsinem (poměr E/S 1/40). Po inkubaci při 37 °C přes noc byla směs uskladněna před použitím při °C.

• 444· 4 44 ·· « • · e ··«· ···· • 4 · · · · · • ·4 4 4 « C · « • · · · · ··· ••4 4« ··· ···· ·« »··

Peptidy se separovaly pomocí HPLC na reverzní fázi (C-4 Vydac kolona, 2,1x250 mm, Hesperia, CA) s využitím systému 140B Solvent Delivery System (ABI,Foster City, Ca) a vymyta 8-70% lineárním gradientem 70% acetonitrilu v 0,1% kyselině trifluoroctové (TFA). Detekce se prováděla při 214 nm detektorem s diodovým polem 1000S a manuálně se odebraly peptidy.

1.7 Analýza a mikrosekvenování skvrn (dot spot)

Devadesát procent frakce každého píku se vakuově vysušilo a následovně resuspendovalo v malém množství pufru 10% acetonitrilu, mM NaCO₃, pH 9,5. Peptidy se nanesly jako skvrny (dot spotted) na Immunodyne ABC membrány (Pall BioSupport, UK), které se nechaly reagovat s lidským sérem, aby se určily imunoreaktivní epitopy. Nejprve se membrány blokovaly PBS s 0,5% kaseinem a inkubovaly přes noc se sérem zředěném 1/50 s PBS s těmito přídavky - 0,5% kasein, 0,1% TritonX705, 10 mM MgCl₂.6H₂O. Po opláchnutí (PBS, 0,5% Tween20) se aplikovaly na 90 minut proti-lidské IgG (Promega) rozředěné v PBS, 0,1% kasein, 0,2% TritonX705. Pak se na membránu aplikoval chromogenní substrát NBT/BCIP v substrátovém pufru o složení lOOmM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9,8, 50 mM MgCl₂.6H₂O. Reakce se zastavila přidáním 0,2 N H₂SO₄.

Zbývajících 10% imunoreaktivních frakcí se použilo pro mikrosekvenování. Frakce se analyzovaly přímo na sekvenceru model 477A vybaveném on-line připojeným 120 fenylthiohydantoinovým analyzátorem (ABI).

1.8 Výsledky

Kyselý filagrin

Každá frakce tryptického štěpení kyselého filagrinu (obr. la) se nanesla v tripikátech na ABC membrány. Pro imunoreakci se použila čtyři APF pozitivní séra reagující s lidkým filagrinem na western blotu (IG24395, IG35247 a směs IG24183/24184)a jedno APF negativní kontrolní sérum. Frakce T2, T9, T16 a T66 vykázaly slabou reakci se sérem IG24395, zatímco peptidové frakce z řady od T30 do T44, zejména T34 a T38 vykázaly jasnou pozitivní reakci. APF sérum také reagovalo pozitivně s T34 a T38, zatímco IG35247 reagovalo pozitivně • c • · β Λ 1 jenom s T4. Kontrolní negativní APF sérum zřetelně nereagovalo s peptidovými frakcemi.

V každé frakci se získaly následující aminokyselinové sekvence:

T2 :

R!AGHGHSADSSR

T4:

R!QGSRHQQAR

R'AGHGHSADSSR

R|HGSHHQQSADSSR

T9:

R|HSQVGQGESSGPR

T16:

R!HSASQDGQDTIRGHPG

T33:

R!HSASQDGQDTIRGH

R!HSGIGHGQASSAVR

T34:

R1HSASQDGQDTI

T35:

R!HSGIGHGQASSAVR

R!DSGHRGYSGSQASDNEGH

R J HSTSQEGQDTIHGHRGS

R!HSASQDGQDTIRGHPG

T38, T39:

Stejné peptidy jako ve frakci T35

T40, T41:

Stejný peptid jako ve frakci T34

T66:

Nepodařilo se získat signály.

R představuje aminokyselinu citrulin, která se nacházela v určitém retenčním čase odlišném od argininu. Dalším důkazem přítomnosti citrulinu byla fakta i), že se sekvence nerozštěpila v určité oblasti (jak by se dalo očekávat v případě přítomnosti argininu) a ii) při sekvenování se nenašel argininový zbytek.

• · · ·

Neutrální filagrin

Podobný postup se provedl s neutrálním filagrinem (obr. lb) skvrny se inkubovaly s APF séry IG24395 a IG24184 a pro negativní kontrolu se použilo stejné sérum jako při mapování kyselého filagrinu. Frakce T28, T65, T81 a série od T30 do T40 (zejména T32, T35 a T36) reagovaly pozitivně s jedním APF sérem IG24395. Ostatní séra vykázaly slabou reakci s T4, T28, T45 a T8T. Jedna frakce (T48) vykázala specifickou reaktivitu se všemi séry, včetně séra pro negativní kontrolu.

Získaly se následující sekvence:

T32, T36, T37, T48 a T65 neposkytly splehlivé sekvenační signály.

T35 :

R'HSGIGHGQASSAVR

R!DSGHRGYSGSQASDNEGH

R!HSTSQEGQDTIHGHRGS

R!HSASQDGQDTIRGHPG

R1GYSGSQASDNEGHSE

Pátý peptid byl zcela jasně odvozen od druhého peptidů, pravděpodobně díky faktu, že neutrální filagrin existuje ve dvou stavech, s a bez citrulinové modifikace. Tyto výsledky naznačují, že se znovu získaly ty samé čtyři peptidy jako ty identifikované ve kyselé T35frakci.

Druhé mapování neutrálního filagrinu

Pro mapování s peptidy neutrálního filagrinu, získaného z jiného kožního zdroje, se použila směs dvou dalších sér IG35038/35041, které byly obě negativní se syntetickými peptidy IGP1155, 1156, 1157 nebo 1158 (viz příklad 2). Výsledkem byla specifická reaktivita s frakcemi T28, T31, T34 a T35, zatímco APF sérum nevykazovalo žádnou reakci.

Výsledky sekvenování

T28, T31, T34 neposkytly signály dostatečné pro sekvenování

T35:

R!NDEQSGDGSR

Přehled sekvenovaných imunoreaktivních částí filagrinových molekul je uveden na obr. 2.

Příklad 2: Reaktivita syntetických peptidů v systému Líne Immuno Assay (LIA)

2.1 Syntetické peptidy

Výsledky aminokyselinového sekvenování popsané v příkladu použily pro tvorbu syntetických peptidů. Pro některé peptidy obsahující citrulin se syntetizoval i nemodifikovaný protějšek s argininem, aby se mohly porovnat jejich příslušné reaktivity. Připravily se následující peptidy.

se

IGP1155	IGP1179
HSASQDGQDTIRGHPGSS	HSASQDGQDTIRGHPGSS
IGP1156	IGP11889
HSGIGHGQASSAVRDSGH$GYS	HSGIGHGQASSAVRDSGHRGYS
IGP1157	IGP1181
DSGHRGYSGSQASDNEGH	DSGHRGYSGSQASDNEGH
IGP1158	IGP1182
HSTSQEGQDTIHGHRGS IGP1249 GGQGSRHQQAR IGP1250 GGAGHGHSADSSR IGP1251 GGHGSHHQQSADSSR IGP1252 GGNDEQSGDGSRHSGS IGP1326 SRHSQVGQGESSGPR	HSTSQEGQDTIHGHRGS

R představuje citrulin

2.2 Analýza Line Immuno Assay

Peptidy v komplexu se streptavidinem se aplikovaly přímo na nylonovou membránu s plastickým nosným podkladem. Blokované proužky se inkubovaly přes noc s lidkým sérem zředěným 1/100 v 1 ml PBS 0,5% kasein, 0,1 % Triton X705, 10 mM MgCl₂.6H₂O. Po opláchnutí (PBS, 0,05% Twen 20) se přidal na 90 minut konjugát kozí proti-lidský IgG-ΑΡ (Promega) zředěný v PBS, 0,1% kasein, 0,2 % Triton X705. Pak se na proužky aplikoval chromogenní substrát NBT/BCIP v substrátovém pufru o složení 100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 9,8, 50 mM MgCl₂.6H₂O. Reakce se zastavila po 30 minutách přidáním 0,2 N H₂SO₄.

2.3 Výsledky

LIA systémem se testovala reaktivita skupiny 107 jednotlivých sér odvozených z pacientů splňujících ARA kritéria pro RA s 13 syntetickými peptidy ze seznamu v 2.1. Reaktivita se zjistila u IGP1155, 1156, 1157, 1158 a 1249 (tabulka 2) s kombinovanou citlivostí v této skupině 48%. Když se vezmou do úvahy pouze séra, která reagovala s lidským přírodním filagrinem na western blotech, dosáhlo se výrazně vyšších citlivostí pro každý syntetický peptid v porovnání s filagrin negativními RA séry.

v

Fg blot pozitivní: CI=63-87% APF pozitivní: CI=45-67%

Fg blot negativní: CI=10-33% APF negativní: CI=l-32%

Ol dp

N •-t «-»

Í1 o

ω (Τ-

o	W	N
LQ	3	CL
rt	M	h
(D		P
0		<
P		flh
H
rt
h
H-
CŤ
H-
a
P
σ»	σ\	Cn
to	1—1	H2
w	w	W
___.	._.
F—1	h4	NJ
σ»	σ\	O
dP	dP	dP
		CO
Η*	O	cn
σ>		OJ
dP		dP
H*	t—1	t-1
H-j	F—1	NJ
9	•	•
cn	σ>	O
dP	oP	dP
		F-4
o	o	NJ
		O
		dP
l·-»	NJ
___	,___,	___
F-1	CO	NJ
	co	O
dP	dP	dP
NJ	tt*	CO
_	_	_
CO	CN	cn
NJ		OJ
oP	dP	dP

>	>	3	*1	*3	*n	2?	W
•Ό		(D	04	O	iq
		KQ		N			c
		P	cr	H’	tr	ϋ)	•3
3	t!	rt	H	rt	1—1	(D'	H’
(0	0	Η-	O	H’	0	n	3
03	N		rt		rt	P	P
P	H-			□
rt	rt	H'		H'			ca
H-	H-						Φ'
<							h
3							P
H'	H'
							«3
							0
							n<
NJ	CO		σ«		cn	(—1	(D
O	-4		cn		NJ	~4
							ca
							db
							K
	NJ				w	NJ
NJ	O		Cn			N>	H O W P-1
(10	(23		oj		(32	(20
dP	O		dP		σ\	O	55
	dP				dP	cP
NJ	NJ OJ		-J		NJ	31	M O
(10	co CO dP		12.		μ£> σ*	NJ CO	hú F4
dP		dP		.2%)	O oP	56
	£»		I-4		CO	tU	IGP1
O	Φ»		I—1		σ	CO
	σ>		co		co	-4	t—1
	dP		dP		oP	dP
	NJ				NJ	NJ
NJ	»C>		Cn		F-1	σ>	IGP1158
(%or)	27.6		9.1%		40.4	24.3
	dP		·—'		oP	dP
	W					P-1
	σ>		co		13	σι	ig;
O	M co		σ cn		(25	M (n	Ό F-1 NJ
	£*		dP		op	o	OJ
	oP					oP
	Jb.		F2		t£*	Cn
NJ	OJ		F-1		O	F-*	3 0
							» a
F4 O	cn CN		N> O		-4 -4	»fc> -J	bin pti
dP	CO		O		O	-4	CL B) 3“ O 3
	dP		dP		dP	dP

Η c

O fl>

OJ

Λrt

3<

3rt

OJ

3CL

M x·

O'

O cn

O'

OJ cn

Ol

3’

N

ΡΩ

3rt l·-¹

3·

O σ

cn

OJ

3“

LJ3'

Ω

3'

Ω

3cn

3Í rt (D rt

3Ω

3tJ

CD

Ό rt

3a

Tabulka ro

Podobné výsledky se získaly při dělení provedeném mezi APF pozitivními a negativními séry. Kontrolní séra z 51 zdravých osob,

SLE a 62 pacientů s osteoartritidou vykázala s těmito peptidy pouze malé reakce.

Ve všech skupinách se jevily IGP1156 a 1158 jako nejlépe reagující peptidy, zatímco imunoreakce s IGP 1157 byla vždy velmi slabá a nezlepšovala sensitivitu RA diagnózy.

Vztah mezi filagrinovou pozitivitou na western blotu a reaktivitou se syntetickými peptidy v rámci RA skupiny je znázorněna v tabulce 3. Po statistické analýze se zaznamenala mírná korelace mezi reaktivními vzory (hodnota kappa 0,57 s 95%CI 0,41-0,73; koeficient shody 78,5%).

Pozitivní LIA signály pozorované u peptidů obsahujících citrulin IGP1155, IGP1156, IGP1157 a IGP 1158 se nezaznamenaly při testování s nemodifikovanými protějšky IGP1179, IGP1180, IGP1181 a IGP1182 (obr. 3). Pouze u 2 sér se vyvinulo slabé zabarvení u všech nemodifikovaných peptidů, což se by se mohlo považovat jako specifické obarvení pozadí vztažené k určitým sérům. Tyto výsledky naznačují, že přítomnost citrulinu je nezbytná pro imunoreaktivitu a že tato neobvyklá aminokyselina tvoří důležitý epitop pro antifilagrinové protilátky.

Tabulka 3: Korelace mezi anti-filagrinovou pozitivitou na western blotech a reaktivita s 5 syntetickými peptidy IGP1155, 1156, 1157, 1158 a 1249 u LIA.

RA séra (N=107)	peptidy kombinované
+	—
Filagrinový blok	+	40	12
-	11	44

Příklad 3: Reaktivita syntetických peptidů v ELISA

3.1 ELISA

Elektricky vymytý přírodní filagrin se navázal na Maxisorp polystyrénové desky v koncentraci 1 nebo 4 ug/ml v 50 mM karbonátovém pufru, pH 9,6 přes noc při 4 °C. Séra se zředila 1/50 v PBS a preinkubovala 2 hodiny s příslušnými peptidy o koncentraci 100 ug/ml, s izolovaným přírodním filagrinem o koncentraci 1 nebo 10 ug/ml (pozitivní kontrola) nebo s PBS (negativní kontrola). Destičky se dále blokovaly 1 hodinu (PBS s 0,1% kaseinu) při 37 °C a následně se inkubovala séra, během 2 hodin při 37 °C = Po pětinásobném promvtí destiček s PBS, 0,05% Tween 20 se inkubovaly s proti-lidskými IgG-HRP v PBS, 0,1% kasein, 0,1 mM K₃Fe(CN)₆. Substrátem byl tetrametylbenzidin zředěný 1/100 v 0,1 M Na₂HPO₄, 0,1 M kyselina citrónová, 0,006% H₂O₂, pH 4,3. Reakce se zastavila přidáním 2N H₂SO₄ a OD hodnoty se měřily při 450 nm pomocí ELISA readru Bio-tek.

Procento inhibice se vypočítalo následovně:

(OD bez inhibice - OD s inhibici) x 100 ⁷ OD bez inhibice

3.2 Výsledky

Na filagrinem pokrytých destičkách, s a bez přidaného inhibičního filagrinu, se analyzovalo pět APF pozitivních sér vykazujících silnou imunoreaktivitu s přirozeným filagrinem na biotech (obr. 4; tabulka 4). Při preinkúbaci s koncentrací 10 ug/ml klesnul signál na 64-79%, což bylo významně více než při použití 1 ug/ml (4-45%). APF negativní sérum IG24805, které nereagovalo s filagrinem na western biotech, vyvolalo signál pouze na úrovni pozadí v tomto ELISA testu a nebyla pozorovatelná významná inhibice.

Když se použil některý ze syntetických, citrulin obsahujících peptidů IGP1155, 1156, 1157, 1158 nebo směs těchto čtyř peptidů jako kompetitor, každý v koncentraci 100 ug/ml, 2 ze 4 sér by mohly být významně inhibovány IGP1155 a 1 sérum IGP1158, což bylo ve shodě s výsledky LIA (obr. 5, tabulka 4). Peptidová směs byla schopná inhibovat navazování anti-filagrinu čtyř sér v rozsahu 37-92%, zatímco s APF negativním sérem nedocházelo k inhibici.

Přiklad 4: Klonování a exprese lidského filagrinu

S využitím technologie PCR se klonovaly čtyři kandidátské filagrinové sekvence; jako templát se použila genomová DNA izolovaná z lidských lymfocytů. PCR primery vypadaly následovně:

Antikódující (sense) PCR primer:

EcoRI

5' CC GAA TTC GCC ACC ATG GGG TCT TTC CTC TAC CAG GTC 3' Met Gly Ser Phe Leu Tyr Gin Val

Antikódující (sense) primer se vybral tak, aby přesahoval filagrinovou spojovací sekvenci a byl navrhnut tak, aby vnesl funkční iniciační kodón (Kozákovu sekvenci) před sekvencí linkeru (Phe Leu Tyr Gin Val Ser Thr). Do amplifikovaného filagrinového úseku se včlenila sekvence linkeru, protože se možná účastní správného zaměření upraveného proteinu. Kvůli subklonování PCR fragmentu se včlenilo restrikční místo pro EcoRI.

Kódující (antisense) PCR primer

Thr Ser Gly His Ser Gly Ser Pro Gly His STOP

3' TGC AGA CCT GTA AGT CCT AGA GGG CCC GAG ATC TGG 5'

Smál Xbal

24805	35055	35049	35044	35038	35037	35036	Sérum
1	+	4-			+		APF test
1	+	+	+		-l·		Anti- filaggrinový blot
0,058	0,332	688 '0	1	0,335	1	0,754	OD bez inhibitoru
-93%	28%	79%	1	32%	I	kD ro dP	% inhib. IGP1155
0%	22%	J5» dP	1	29%	I	19%	% inhib. IGP1156
O dP	5%	12%	1	13%	i	w VO	% inhib. IGP1157
-2%	23%	72%	1	10%	1	ÍO 45» dP	% inhib. IGP1158
-12%	37%	00 dP	1	45%	t	92%	% inhib. směs
0,056	0,318	1	1,957	0,344	o o co	0,887	OD bez inhibitor
tn óp	18%	1	18%	45%	»£* dP	38%	1 ug/ml	% inhibice filagrin
tn oP	dP	1	77%	74%	σ» dP	78%	10 ug/ml

Inhibice anti-filagrinové aktivity

Kódující (antisense) primer je umístěn před další filagrinovou spojovací sekvencí a vnáší stop kodón pro translaci TAG. Amplifikovaná filagrinová sekvence se tak skládá z filagrinového linkeru následovaného celou filagrinovou sekvencí a třemi dalšími aminokyselinami (Pro/Gly/His) vyplývajícími z klonovací strategie. Amplifikovaná PCR fragmenty se klonovaly ve vektoru pBLSK (Stratagene) jako EcoRI-Xbal fragment, umožňující sekvenování amplifikované cDNA.

Sekvenováním se charakterizovaly čtyři individuální klony, pojmenované HB2641, HB2642, HB2648 a HB2650 (obr. 6). cDNA inzerty se reklonovaly jako EcoRI/EcI 136II fragmenty (1030 bp) v E. coli expresním vektoru pIGRHISA linearizovaném Hsil (tupé konce). Filagrinové proteiny se exprimovaly jako rekombinantní filagrin-His6 fůzní proteiny ve třech různých kmenech E. coli - výsledkem byly vysoké exprese obarvitelné Coomassie blue. His6 konec fůzního proteinu umožňuje snadnou purifikaci proteinu použitím afinitní chromatografie s kovy.

Příklad 5: Vimentin jako značka pro diagnózu revmatické artritidy

5.1 Izolace antigenu

Metodou popsanou v Després et al. (1994) se připravil placentální extrakt. Placentové pletivo skladované pří -70 °C se homogenizovalo v 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 120 mM NaCI, 1,5 mM DTT, 0,02% NaN₃, lmM PMSF a 5 ug/ml chymostatinu, leupeptinu, antipainu a pepstatinu. Po vyčeření se homogenát podrobil iontově výměnné chromatografii na DE52; frakce vymyté 200, 250 a 300 mM soli se dále analyzovaly pomocí jednorozměrné a dvourozměrné gelové elektroforézy.

5.2 dvourozměrná gelová elektroforéza a blotovací procedura

Proteiny přítomné v různých chromatografických frakcích se separovaly 2-D elektroforézami. Vzorky se rozpustily v rehydratačním pufru se 7 M močovinou, 2M thiomočovinou, 4% CHAPS, 0,5% Triton

X-100, 1% Pharmalyt 3-10, 10 mM DTT, 0,01% Orange G. Padesát 500 ug • · · ·

dávek proteinu se aplikovalo na IPG4-7 izo-elektrofokusační proužky (Pharmacia) metodou rehydratace v gelu popsanou v Rabilloud et al. (1997). Proužky prvního rozměru se nanesly na 10% Laemmli gely nebo SDS gradientově 12-14 ExcelGels gely (Pharmacia) pro rozdělení v druhém rozměru za standardních podmínek. Gely se během dvou hodin elektricky přeblotovaly na nitrocelulózovou membránu v 10% metanolu, 10 mM CAPS, pH 11,0. Imunodetekce s lidskými séry a monoklonálními protilátkami se provedla postupem popsaným postupem v 1.3. Monoklonální protilátky proti vimentinu (Sigma) se zředily 1/5000. Polyklonální protilátky proti kalretikulinu (calreticulin) a monoklonální protilátky anti-PDI od Affinity BioReagents lne.

(Golden, CO) se použily při ředění 1/1000.

5.3 Identifikace proteinů analýzou hmotnostní spektrografií (MS)

Skvrny obarvené Coomasie se vyřízly z 2-D gelu, omyly vodou a 50% acetonitril/1% TFA a inkubovaly s 0,08 ug trypsinu v 10 ul 25 mM NH₄HCO₃/10% acetonitril, pH 8,0 po dobu 20 hodin při 37 °C. Peptidy se extrahovaly 60% acetonitrilem/0,1% TFA, vakuově vysušily a rozpustily v 10 ul 30% MeOH/1% kyselina mravenčí. Asi 5% rozložené směsi se podrobilo DE-MALDI-RETOF-MS analýze na přístroji

Voyager-DE STR (Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Zbývající materiál se vyčistil na nosiči PorosR2; navázané peptidy se vymyly v 4 ul 60%MeOH/l% kyselina mravenčí a 65% se jich použilo pro ESI-MS analýzu na Q-TOF hmotnostním spektrometru (Micromass, UK).

5.4 Výsledky

Na 2-D blotech obsahujících placentální extrakty se analyzovalo 25 lidských RA sér, 3 osteoartritická séra a 20 negativních kontrol. Velice nápadná imunoreaktivita se pozorovala u 14 RA sér s více skvrnami lokalizovanými v oblasti ±60kDa (rozsah mezi 56 a 61 kDa podle systému gelu) a s pí 4,5-4,8 (obr. 7a). Žádná z kontrol nevykázala jakoukoliv reaktivitu s tímto proteinem. Aby se lokalizovaly tyto důležité placentální proteiny bloty se analyzovaly s polyklonálními protilátkami proti kalretikulinu, monoklonálními protilátkami proti PDI a antivimentunu. Kalretikulin se nalezl v bohaté skvrně o 56-61 kDa, pí 4,3, zatímco PDI se nacházel v oblasti • · • ·

58-64 kDa, pí 4,6-4,8 což v obou případech odpovídá očekávaným teoretickým 2-D pozicím. Druhá skvrna byla dále identifikována jako PDI tandemovou MS analýzou.

Na obr. 7b je vidět, že monoklonální protilátky proti vimentinu silně reagovaly s řadou proteinů mezi 40 a 61 kDa. Tento vzor je velmi reprodukovatelný u různých dávek purifikovaného materiálu i když pochází od různých osob a když je testován v rozdílnou dobu.

Při vzájemném překrytí blotů analyzovaných s RA séry s anti-vimentinovými bloty se stalo zřejmým, že RA-specifická aktivita byla lokalizována stejně s MW formou vimentinu. Zájmové skvrny se dále identifikovaly MALDI-TOF a tandemovou hmotnostní spektrometrií. S využitím obou technik se kromě jiných neidentifikovaných peptidů získaly peptidy z lidského vimentinu, cytokeratinu 1 a cytokeratinu 9. Všechny tyto proteiny patří do jedné rodiny přechodných vláknitých proteinů. Protože jsou již in vivo popsané citrulinované formy vimentinu a cytokeratinu (Senshu et al., 1992; Senshu et al., 1995; Senshu et al., 1996) je pravděpodobné, že tvoří cíle pro autoprotilátky přítomné v sérech revmatické artritidy. Ukázalo se, že citrulinované proteiny (při srovnání s necitrulovanými formami) způsobují změnu pohyblivosti na SDS-PAGE směrem k oblastem s vyšší molekulovou hmotností (Senshu et al.,

1995; Tarcsa et al., 1996). To by mohlo vysvětlit selektivní imunoreaktivitu lidského séra s s vimentinovými formami s nejvyšší molekulovou hmotností. Specifické formy přechodného vláknitého proteinu by tak mohly být použity jako markér pro diagnózu revmatologických potíží.

• ·

Seznam odkazů

Arnett F.C., Edworthy S.M., Bloch D.A., McShane D.J., Fries J.F., Cooper N.S., Healy L.A., Kaplan S.R., Liang M.H., Luthra H.S., Medsger T.A.. Mitchell D.M., Neustadt D.H., Pinals R.S., Schaller J.G., Sharp J.T., Wilder R.L., Hunder G.G. (1987) The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 31: 315-324

Chen P.P., Fong S., Carson D.A. (1987) Rheumatoid factor.

Rheum. Dis. North Am., 13: 545-568

Dále B.A., Holbrook K.A., Steinert P.M. (1978) Assembly of stratům corneum basic protein and keratin filaments in macrofibrils. Nátuře, 276: 729-731 Després N., Boire G., Lopez-Longo F.J., Ménard H.A. (1994) The Sa systém: a novel antigen-antibody systém specific for rheumatoid arthritis. J. Rheumatol.,21 : 1027-1033

Feltkamp T.E., Berthelot J.M., Boerbooms A.M., Geertzen H.G., Hoet R., De Keyser F. (1993) Interlaboratory variability of the antiperinuclear factor (APF) test for rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Rheumatol., 1 1: 57-59

Gan S.Q., McBride O.W., Idler W.W., Markova N., Steinert P.M. (1990) Organization, structure, and polymorphisms of the human profilaggrin gene. Biochemistry, 29: 9432-9440

Hajiroussou V.J., Skingle J., Gillett A.P., Webley M. (1985) Significance of antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis. J. Rheumatol., 12: 57-59

Harding C.R., Scott I.R. (1983) Histidine-rich proteins (filaggrins): structural and functional heterogeneity during epidermal differentiation. J. Mol. Biol., 170: 651-673

Hassfeld W., Steíner G., Graninger W., Witzmann G., Schweitzer H., Smolen J.S. (1993) Autoantibodies to the nuclear antigen RA33: a markér for early rheumatoid arthritis. Br. J. Rheumatol., 32: 199203

Janssens X._ř Veys E.M., Verbruggen G._f Declercq L. (1988) The diagnostic significance of the antiperinuclear factor for rheumatoid arthritis. J. Rheumatol., 15: 1364-1350

Johnson G.D., Carvalho A., Holborow E.J., Goddard D.H., Russell G. (1981) Antiperinuclear factor and antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis., 40: 263-266

Kataaha P.K., Mortazavi-Milani S.M., Russell G., Holborow E.J. (1985) Antiintermediate filament antibodies, antikeratin antibodies, and perinuclear factor in rheumatoid arthritis and infectious mononucleosis. Ann. Rheum. Dis., 44: 446-449

Kirstein H., Hjarvard K., Mosrk Hansen T.( 1989) Antikeratin antibodies in synovial fluid in rheumatoid arthritis. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 97: 185-189

Kóningsberg W.H., Henderson L. (1983) Removal of Sodium Dodecyl Sulfáte from proteins by ion-pair extraction. Meth. Enzymol., 91: 254-259

Lynley A.M., Dále B.A. (1983) The caracterization of human epidermal filaggrin, a histidine-rich, keratin filament-aggregating protein. Biochem. Biophys. Acta, 744: 28-35

Mack J.W., Steven A.C., Steinert P.M. (1993) The mechanism of interaction of filaggrin with intermediate fílaments. J. Mol. Biol., 232: 50-66

Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. (1982) Molecular cloning:

a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, NY.

Markova N.G., Marekov L.N., Chipev C.C., Gan S.-Q., Idler W.W., Steinert P.M. (1993) Profilaggrin is a major epidermal calciumbinding protein. Mol. Cell. Biol., 13: 613-625

McKinley-Grant L.J., Idler W.W., Bernstein I.A., Parry D.A.D., Cannizzaro L., Croce C.M., Huebner K., Lessin S.R., Steinert P.M. (1989) Characterization of a cDNA cloně encoding human filaggrin and localization of the gene to chromosome region 1 q21. Proč. Nati.

Acad. Sci. USA, 86: 4848-4852

Miossec P., Youinou P., Le Goff P., Moineau M.P. (1982)

Clinical relevance of antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis. Clin. Rheumatol., 1: 185-189

Nesher G., Moore T.L., Gristani M.W., El-Najdawi E., Osborn T.G. (1992) Antiperinuclear factor in juvenile rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis., 51: 350-352

Nienhuis R.L.F., Mandema E. (1964) A new sérum factor in patients with rheumatoid arthritis. The antiperinuclear factor. Ann. Rheum. Dis., 23: 302-305 Peterson G.L. (1983) Determination of total protein. Meth. Enzymol., 91 : 95-119

Presland R.B., Haydock P.V., Fleckntan P., Nirunsuksiri W., Dále B.A. (1992) Genomic organization and Identification of an S-100-like calcium binding domain at the amino terminus. J. Biol. Chem., 267: 23772-23781

Rabilloud T., Adessi C., Giraudel A., Lunardi J. (1997) Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis, 18: 307-316

Resing K.A., Walsh K.A., Haugen-Scofield J., Dále B.A. (1989)

Identification of proteolytic cleavage sites in the conversion of • · • · · ·

profilaggrin to filaggrin in mammalian epidermis. J. Biol. Chem.,

264: 1837-1845

Resing K.A., Johnson R.S., Walsh K.A. (1993) Characterization of protease sites during conversion of rat profilaggrin to filaggrin. Biochemistry, 32: 10036-10045

Scott I.R., Harding C.R., Barrett J.G. 11982) Histidine-rich protein of the keratohyalin granules. Source of the free amino acids, urocanic acid and pyrrolidone carboxylic acid in the stratům corneum. Biochem. Biophys. Acta, 719: 110-117

Sebbag M., Simon M., Vincent C., Masson-Bessiére C., Girbal E., Durieux J.-J., Serre G. (1995) The antiperinuclear factor and the so-called antikeratin antibodies are the same rheumatoid arthritisspecific autoantibodies. J. Clin. Invest., 95: 2672-2679

Senshu T., Sáto T., Inoue T., Akiyama K., Asaga H. (1992) Detection of citrulline residues in deiminated proteins on polyvinylidene difluoride membrane. Anal. Biochem., 203: 94-100

Senshu T., Akiyama K., Kan S., Asaga H., Ishigami A., Manabe M. (1995) Detection of deiminated proteins in rat skin: probing with a monospecific antibody after modification of citrulline residues. J. Invest. Dermatol., 105: 163-169

Senshu T., Kan S., Ogawa H-, Manabe M., Asaga H. (1996) Preferential deimination of keratin KI and filaggrin during the terminál differentiation of human epidermis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 225: 712-719

Simon M., Girbal E., Sebbag M., Gomés-Daudrix V., Vincent C.,

Salama G., Serre G. (1993) The cytokeratin filament-aggregating protein filaggrin is the target of the so-called 'antikeratin antibodies', autoantibodies specific for rheumatoid arthritis. J.

Clin. Invest., 92: 1387-1393

Simon M., Vincent C., Haftek M., Girbal E., Sebbag Μ., GoměsDaudrix V., Serre G. (1995) The rheumatoid arthritis-associated autoantibodies to filaggrin label the fibrous matrix of the cornified celis but not the profilaggrin-containing keratohyalin granules in human epidermis. Clin. Exp. Immunol., 100: 90-98

Tarcsa E., Mařekov L., Mei G., Melino G., Lee S.-C., Steinert P. (1996) Protein unfolding by peptidylarginine deiminase. Substráte specificity and structural relationships of the natural substrates trichohyalin and filaggrin. J. Biol. Chem., 271: 30709-30716

Vincent C., Serre G., Lapeyre F. , Fournié B., Ayrolles C., Fournié A., Soleilhavoup J.-P. (1989) High diagnostic value in rheumatoid arthritis of antibodies to the stratům corneum of rat oesophagus epithelium, so-called 'antikeratin antibodies'. 1989.

Ann. Rheum. Dis., 48: 712-722

Vincent C., Serre G., Basile J.-P., Lestra H.C., Girbal E., Sebbag M., Soleilhavoup J.-P. (1990) Subclass distribution of IgG antibodies to the rat oesophagus stratům corneum (so-called antikeratin antibodies) in rheumatoid arthritis. Clin. Exp. Immunol.,

81: 83-89

Vincent C., De Keyser F., Veys E.M., Serre G. (1997) Comparative study of APF, AKA and anti-filaggrin autoantibodies in rheumatoid arthritis and other arthritides. Ann. Med. Interne, 148: 52

Vivino F.B., Maul G. G. (1989) Antiperinuclear factor prevalence for rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 32: S95

Vivino F.B., Maul G.G. (1990) Histologie and electron microscopic characterization of the antiperinuclear factor antigen. Arthritis Rheum., 33: 960-969

Waller M.V., Toone E.C., Vaughan E. 11964) Study of rheumatoid factor in a normál population. Arthr. Rheum., 7: 513-520

Westgeest Α.Α.Α. , Boerbooms A.M.Th., Jongmans M., Vandenbroucke J.P., Vierwinden G., van de Putte L.B.A. (1987) Antiperinuclear factor: Indicator of more severe disease in seronegative rheumatoid arthritis. J. Rheumatol., 14: 893-897

Youinou P. , Le Goff P., Colaco C.B., Thivolet J., Tater D.,

Viac J., Shipley M. (1985) Antikeratin antibodies in sérum and synovial fluid show specificity for rheumatoid arthritis in a study of connective tissue diseases. Ann. Rheum. Dis., 44: 450-454

Youinou P., Berthelot J.M. , Peron A., Leroux A.M. , Le Goff P. (1992) Antiperinuclear antibodies and corresponding antigens. Rev. Rhum. Mal. Osteoartic., 59: 43S-51S

Young B.J.J, Mallya R.K., Leslie R.D.G., Clark C.J.M., Hamblin T.J. 11979) Anti-keratin antibodies in rheumatoid arthritis. Br.

Med. J., 2: 97-99

Claims (27)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Peptid obsahující sekvenci méně než 50 aminokyselin kterékoliv varianty přirozeného filagrinu nebo jakákoliv varianty přechodných vláknitých proteinů obsahující alespoň jeden citrulinový zbytek, kde je přítomnost daného citrulinu rozhodující pro reakci s protilátkami, které jsou přítomné v sérech z pacientů s revmatickou artritidou.
2. 2. Peptid podle nároku 1, obsahující sekvenci méně než 50 aminokyselin jakékoliv varianty vimentinu, nebo cytokeratinu 1, nebo cytokeratinu 9, obsahující alespoň jeden citrulinový zbytek a kde je přítomnost zmíněného citrulinu rozhodující pro reakci s protilátkami, které jsou přítomné v sérech z pacientů s revmatickou artritidou.
3. 3. Peptidy podle nároku 1 obsahující aminokyselinovu sekvenci

   HSASQDGQDT1XGHPGSS, nebo

   HSGIGHGQASSAVRDSGHXGYS, nebo

   DSGHXGYSGSQASDNEGH, nebo

   HSTSQEGQDTIHGHXGS, nebo

   GGQGSXHQQAR, nebo

   QGSXHQQARDSSRHSTSQEGQDTIHGHXGS, nebo

   QGSXHQQARDSSRHSASQDGQDTIXGHPGSS, nebo

   HSGIGHGQASSAVRDSGHXGYSGSQASDNEGH, nebo analog zmíněných peptidů obsahující náhrady aminokyseliny, které jsou charakteristické pro alelické varianty filagrinu, kde X představuje citrulinový zbytek.
4. 4. Peptid a/nebo chemická struktura obsahující kterýkoliv z peptidů podle nároků 1 až 3 zfázované s molekulou spojovníku.
5. 5. Kruhovitý peptid, který obsahuje alespoň jeden z peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. 6. Peptid obsahující a/nebo skládající se z tandemových opakování alespoň dvou jakýchkoliv peptidů nároků 1 až 5.
7. 7. Větvený peptid, který obsahuje alespoň jeden z peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6=
8. 8. Metoda pro produkci peptidů podle kteréhokoliv nároku 1 až 7 klasickou chemickou syntézou, kde jsou při určitých krocích během chemické syntézy citrulinové zbytky nahrazeny za argininové zbytky.
9. 9. Metoda pro produkci peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde se primární aminokyselinová sekvence získá klasickou chemickou syntézou a kde jsou argininové zbytky následovně změněny na citrulinové zbytky reakcí zmíněného peptidů s peptydylarginin deaminázou.
10. 10. Metoda pro produkci peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 zahrnující následující kroky:

    - transformování vhodného buněčného hostitele rekombinantním vektorem, do kterého je vložená polynukleové kyselina obsahující sekvenci, která kóduje zmíněný peptid pod řízením vhodných regulačních elementů, takže zmíněný peptid nebo protein obsahující zmíněný peptid je exprimován a/nebo sekretován,

    - kultivaci zmíněného transformovaného buněčného hostitele za podmínek umožňujících expresi zmíněného proteinu nebo peptidů a umožňujících změnu argininových zbytků na citrulinové zbytky,

    - získání zmíněného peptidů.
11. 11. Metoda pro produkci peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 zahrnující následující kroky:

    - transformování vhodného buněčného hostitele rekombinantním vektorem, do kterého je vložená polynukleové kyselina obsahující sekvenci, která kóduje zmíněný peptid pod řízením vhodných regulačních elementů, takže zmíněný peptid nebo protein obsahující zmíněný peptid je exprimován a/nebo sekretován, <3 ··· ·· ··· ···· ·· ···

    - kultivaci zmíněného transformovaného buněčného hostitele za podmínek umožňujících expresi zmíněného proteinu nebo peptidu

    - získání zmíněného proteinu nebo zmíněného peptidu

    - změnu argininových zbytků zmíněného proteinu nebo zmíněného peptidu reakcí s peptydylarginin deaminázou
12. 12. Metoda podle nároku 10 nebo 11, kde je zmíněná hostitelská buňka bakteriální hostitel, nebo jakákoliv jiná eukaryotická hostitelská buňka, která je přednostně transformovaná rekombinantním bakulovirem.
13. 13. Protilátka specificky reagující s citrulinovými zbytky peptidové formy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo specificky reagující s citrulinovými zbytky přechodných vláknitých proteinů, přičemž zmíněná protilátka je přednostně monoklonální protilátka.
14. 14. Anti-idiotypová protilátka připravená imunizací protilátkou podle nároku 13, přičemž zmíněná anti-idiotypová protilátka specificky reaguje s protilátkou nároku 13 a tak napodobuje peptid obsahující citrulin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, přičemž zmíněná protilátka je přednostně monoklonální protilátkou.
15. 15. Molekula imunotoxinu obsahující a/nebo skládající se z molekuly peptidu rozpoznávajícího buňku kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo protilátka podle nároků 13 nebo 14, kovalentně připojené k molekule toxinu nebo jeho aktivnímu fragmentu.
16. 16. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo protilátka podle nároků 13 nebo 14, nebo molekula imunotoxinu podle nároku 15, nebo jejich směs pro použití jako lék.
17. 17. Použití peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo protilátky podle nároků 13 nebo 14, nebo molekuly imunotoxinu podle nároku 15, nebo jejich směsi, pro přípravu léku nebo diagnostika pro revmatickou artritidu.

    4'V&

    • · * · · · · ···· • · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    999 99 999 9999 99 999
18. 18. Použití přechodných vláknitých proteinů, přednostně vimentinu, nebo cytokeratinu 1, nebo cytokeratinu 9, nebo protilátek připravených imunizací přechodnými vláknitými proteiny, nebo jejich směsí pro přípravu léku nebo diagnostika pro revmatickou artritidu.
19. 19. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, nebo jejich směsi, pro přípravu léku pro léčení revmatické artritidy zvýšením velikosti antigen-imunitních komplexů a tak zlepšení odstraňování formovaných imunitních komplexů.
20. 20. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, nebo jejich směsi, pro přípravu léku pro orální podávání pro léčení revmatické artritidy indukováním stavu systémové hypovnímavosti ke zmíněnému polypeptidu ('perorální tolerance')
21. 21. Diagnostická souprava pro použití při detekci auto-imunitních onemocnění, jako:

    - revmatická artritida,

    - systémová lupus erythematodes,

    - diskoidní lupus erythematodes,

    - sklerodermie,

    - dermatomyozitida,

    - Sjógrenův syndrom, kdy zmíněná souprava obsahuje alespoň jeden peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo protilátku podle kteréhokoliv z nároků 13 nebo 15, nebo přechodný vláknitý protein, přičemž zmíněný peptid, protilátka nebo protein můžou být navázány na pevný povrch.
22. 22. Diagnostická souprava podle nároku 21, přičemž zmíněná souprava zahrnuje řadu peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo protilátky podle kteréhokoliv z nároků 13 až 15, nebo přechodné vláknité proteiny v možné kombinaci s antigeny, které vytváří imunogení determinanty pro jiné autoimunitní onemocnění, kde jsou zmíněné peptidy, protilátky a/nebo proteiny připojené k určité oblastí na pevném substrátu.
23. 23. Diagnostická souprava podle nároků 21 nebo 22, kde je zmíněný pevný povrch membránový proužek a zmíněné polypeptidy jsou připojené k membráně ve formě souběžných řad.
24. 24. Diagnostická souprava podle nároků 21 nebo 22, kde nejsou určité peptidy nebo proteiny připojené k pevnému povrchu, ale jsou poskytované ve formě vazebných roztoků použitých jako kompetitory a/nebo pro blokování jiných protilátek, které jsou přítomné v sérech z pacientů s jiným autoimunitním onemocněním, než je revmatická artritida a tak snižující nebo eliminující možnou křížovou reakci a/nebo nespecifické vázání.
25. 25. Biotest pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují interakci mezi autoantigenem a specifickými autoprotilátkami revmatické artritidy, přičemž zmíněný biotest zahrnuje:

    i) - reakci specifických autoprototilátek revmatické artritidy s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo s přechodnými vláknitými proteiny, nebo jejich kombinací.

    - určením vazby protilátek specifických pro revmatickou artritidu s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo s přechodnými vláknitými proteiny nebo jejich kombinací.

    ii) -současnou nebo postupnou reakci sloučeniny nebo kombinaci sloučenin a specifických autoprotilátek revmatické artritidy s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo s přechodnými vláknitými proteiny nebo jejich kombinací.

    - určením vazby protilátek specifických pro revmatickou artritidu s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo s přechodnými vláknitými proteiny, nebo jejich kombinací.

    iii) určením modulace vazby autoprotilátek specifických pro revmatickou artritidu s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, nebo s přechodnými vláknitými proteiny, nebo jejich kombinací, způsobené sloučeninou, nebo kombinací sloučenin porovnáním výsledků i) a ii)
26. 26. Modulátor pro interakci mezi autoantigenem a autoprotilátkou specifickou pro revmatickou artritidu, kde může být zmíněný modulátor získaný metodou podle nároku 25.
27. 27. Metoda pro produkci modulátoru podle nároku 26.